ES2537017T9 - Anticuerpo dirigido contra el receptor EP4 de la prostaglandina E2 humano - Google Patents

Description

Anticuerpo dirigido contra el receptor EP4 de la prostaglandina E2 humano.

5 Campo técnico

[0001] La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal dirigido contra un receptor de la prostaglandina E2 humano del subtipo EP4.

10 Técnica anterior

[0002] Las prostaglandinas (PG), al igual que los tromboxanos, son sustancias fisiológicamente activas conocidas como “prostanoides” y son lípidos con un esqueleto de ácido prostanoico. Los prostanoides tales como las prostaglandinas se sintetizan a partir del ácido araquidónico que se produce a partir de un fosfolípido de la

15 membrana por la acción de la fosfolipasa A2. Las prostaglandinas se clasifican en los grupos A a J, sobre la base de diferencias en el tipo de átomo de oxígeno unido al anillo de cinco miembros de las mismas y un enlace doble. Además, las prostaglandinas se clasifica en los grupos 1 a 3 según el número de enlaces dobles en la cadena lateral del esqueleto de ácido prostanoico. Por ejemplo, la prostaglandina E (PGE) incluye PGE1, PGE2 y PGE3, que se diferencian entre sí en el número de enlaces dobles en la cadena lateral del esqueleto de ácido prostanoico.

20 [0003] Con respecto a las PG, PGH2 se genera a partir de PGG2, que se biosintetiza a partir del ácido araquidónico por la acción de la ciclooxigenasa I (COX-I) o la ciclooxigenasa II (COX-II) y después, PGD2, PGE2, PGF2α y similares se generan por diferencias en la escisión del enlace entre los átomos de oxígeno. A continuación, PGA2, PGC2 y similares se generan a partir de PGE2. Cada reacción de generación de PG tiene lugar por la acción

25 de una enzima específica y se considera que tal enzima es específica del tejido y genera una PG adecuada para la función de cada tejido.

[0004] Entre las diversas PG, se considera que PGE desempeña diversas actividades biológicas importantes y que, a través de la mediación de su receptor específico, PGE está asociada con la regulación del sistema

30 inmunitario, así como la vasodilatación, la disminución de la presión sanguínea y la contracción uterina. El receptor de PGE2 es un receptor con siete dominios transmembranales acoplado a la proteína G, al igual que otros receptores de PG. El receptor de PGE2 se abrevia como EP y se ha demostrado que EP tiene cuatro subtipos diferentes (EP1, EP2, EP3 y EP4). Cada subtipo está asociado con diversos fenómenos in vivo. Esto es, EP1 está asociado con el aumento de la concentración intracelular de Ca2+, EP2 y EP4 están asociados con un aumento del

35 nivel de AMPc y EP3 está asociado con una disminución del nivel de AMPc (documento no de patente 1). Los cuatro subtipos tienen gran homología entre sí en cuanto a su estructura proteínica.

[0005] Se ha descrito que cuando se administra un compuesto antagonista de bajo peso molecular con alta selectividad para EP4 a ratones inducidos para presentar encefalomielitis autoinmunitaria experimental o

40 hipersensibilidad de contacto, se reduce la acumulación de las células TH1 y TH17 en los ganglios linfáticos regionales y se suprime la progresión de la enfermedad (documento no de patente 2). Se ha demostrado que PGE2 estimula la producción de IL-23 en las células dendríticas como resultado de un aumento del nivel de AMPc mediado por la activación de EP4. Además, también se ha demostrado que, en las células TH17, PGE2 está implicada en la proliferación de las células TH17 en coordinación con IL-23. Por lo tanto, se ha demostrado que un aumento del

45 nivel de AMPc mediado por la activación de EP4 desempeña un papel importante en la señalización intracelular en las células TH17 (documento no de patente 3). Estas publicaciones sugieren que el antagonista del receptor de PGE2, en particular un antagonista selectivo para EP4, sería eficaz para el tratamiento de enfermedades causadas por una anormalidad inmunitaria con la que estén asociadas las células TH1 o TH17, tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias intestinales y dermatitis de contacto (documento no de patente 2).

50 [0006] Se ha descrito que muchos tipos de células cancerosas expresan COX-II en exceso en comparación con las células normales. Además, también se ha descrito que PGE2 actúa sobre los tejidos cancerosos o tejidos alrededor de los tejidos cancerosos y que está implicada en la progresión del cáncer. Por ejemplo, se ha descrito que PGE2 está implicada en la infiltración de células de cáncer de mama inflamatorio resistente o células de cáncer

55 de pulmón en un tejido metastásico (documentos no de patente 4 y 5). Adicionalmente, se sabe que PGE2 está asociada con la proliferación de las células de cáncer de pulmón no microcítico, las células de cáncer de colon, las células de cáncer de mama inflamatorio, los linfocitos B, las células de cáncer de próstata y el melanoma a través de EP4.

[0007] Se sabe que PGE2 inhibe la función de las células NK, cuya acción es atacar directamente a las células cancerosas. Uno de los mecanismos de PGE2 para inhibir la función de las células NK es un aumento del nivel intracelular de AMPc mediado por la activación de EP4 (documento no de patente 6). También se sabe que las células Treg, que posiblemente suprimen la inmunidad al cáncer, se activan a través de EP4 y se ha sugerido la 5 posibilidad de una disminución del sistema inmunitario contra las células cancerosas in vivo (documento no de patente 7). De acuerdo con estas publicaciones, es evidente que PGE2 es importante para la progresión del cáncer. Por consiguiente, se han llevado a cabo estudios clínicos con inhibidores no selectivos de la COX implicada en la generación de PGE2. Sin embargo, no han podido obtenerse resultados terapéuticos suficientes a causa de los efectos secundarios de los inhibidores. Un antagonista del receptor de PGE2, en particular un antagonista selectivo

10 para EP4, suprime directamente la proliferación de las células cancerosas y refuerza el sistema inmunitario del hospedador contra el cáncer. En consecuencia, se anticipa que un anticuerpo que se una selectivamente al receptor EP4 será eficaz para el tratamiento de diversos tipos de cáncer, tales como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de piel y linfoma B.

15 [0008] Convencionalmente, se han utilizado inhibidores inespecíficos de la COX para el alivio del dolor. Sin embargo, se sabe que tales inhibidores inespecíficos causan efectos secundarios tales como pirosis, indigestión, náusea, distensión abdominal, diarrea, gastralgia, úlcera péptica o hemorragia gastrointestinal. En los últimos años, se han desarrollado inhibidores selectivos de COX-II (por ejemplo, celecoxib y rofecoxib) para el tratamiento del dolor. Sin embargo, se ha sugerido que tales inhibidores selectivos de COX-II producen graves trastornos

20 cardiovasculares en pacientes específicos y, por lo tanto, se desea desarrollar un fármaco para alivio del dolor con un modo de acción diferente. Entre las PG generadas por la COX, se sabe que PGE2 aumenta la hipersensibilidad a la sensación de dolor. En múltiples experimentos con animales se ha demostrado que, entre los receptores de PGE2, EP4 está especialmente asociado con el aumento de la hipersensibilidad a la sensación de dolor. Por ejemplo, se sabe que la expresión de EP4 aumenta en el ganglio radicular dorsal (GRG) en un modelo de dolor inflamatorio en

25 rata y que un antagonista comparativamente selectivo para EP4 (AH23848) reduce la sensibilidad al dolor en el modelo mencionado anteriormente (documento no de patente 8). Además, en un análisis en el que también se usaron ratones con EP4 inactivado pudieron obtenerse los mismos resultados (documento no de patente 9). Estas publicaciones sugieren que un producto farmacéutico para bloquear selectivamente la función de EP4 sería eficaz para el tratamiento de enfermedades asociadas con una anormalidad inmunitaria, el cáncer y el dolor, y tendría

30 menos efectos secundarios.

[0009] Como procedimientos para bloquear selectivamente la función de EP4, se han descrito varios compuestos antagonistas de bajo peso molecular. Sin embargo, ninguno de tales compuestos antagonistas ha tenido éxito como producto farmacéutico. Tales compuestos antagonistas de bajo peso molecular podrían mejorarse

35 en cuanto a la selectividad de la unión a los subtipos de receptores de PGE2 (EP1-4) o a la reducción de la afinidad de unión a los receptores de tromboxano u otros prostanoides. Existe la preocupación de que se generen los mismos efectos secundarios que con los inhibidores de la COX, a menos que se asegure la suficiente selectividad para el receptor.

40 [0010] Se espera que un anticuerpo que se una selectivamente al receptor EP4 tenga mayor selectividad que los compuestos de bajo peso molecular. Además, dado que un fármaco de anticuerpos tiene generalmente una mayor semivida en la sangre que los compuestos de bajo peso molecular, se espera que los efectos del fármaco duren más tiempo con una única administración. Tal fármaco de anticuerpos es eficaz para enfermedades crónicas (por ejemplo, artritis reumatoide, colitis, cáncer, etc.).

45 [0011] En general, como principal mecanismo de acción de un fármaco de anticuerpos dirigido a una proteína de membrana (receptor), el anticuerpo reconoce las células que expresan la proteína y entonces elimina dichas células por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Sin embargo, dado que CDC o ADCC están asociadas con la activación de células

50 inflamatorias tales como los macrófagos, tal fármaco de anticuerpos no es necesariamente adecuado para el tratamiento de enfermedades causadas por anormalidad inmunitaria o el dolor. Por consiguiente, al administrar un anticuerpo monoclonal capaz de inhibir selectivamente EP4 para el tratamiento de enfermedades causadas por anormalidad inmunitaria o el dolor, se desea un anticuerpo funcional que no dependa de CDC ni ADCC. Es decir, se desea un anticuerpo para bloquear selectivamente la señalización intracelular dependiente de EP4.

55 [0012] Hasta la fecha, la patente japonesa n.° 3118460 (documento de patente 1) desvela un procedimiento para la obtención de un anticuerpo dirigido contra EP4. Sin embargo, todavía no hay ninguna publicación relativa a un anticuerpo específico que suprima la función de EP4 de manera específica para EP4 a una dosis baja y que no se una a EP1, EP2 ni EP3. Además, se sabe que es difícil obtener un anticuerpo funcional dirigido contra un

receptor con siete dominios transmembranales por el procedimiento general de obtención de anticuerpos monoclonales descrito en la patente japonesa n.° 3118460.

Lista de referencias 5 Documentos de patente

[0013] Documento de patente 1: patente japonesa n.° 3118460

10 Documentos no de patente

[0014]

Documento no de patente 1: Sugimoto y col., J. Biol. Chem., 282: 11613-11617, 2007

15 Documento no de patente 2: Yao y col., Nat. Med., 15: 633-640, 2009 Documento no de patente 3: Sakata y col., J. Pharmacol. Sci., 112(1):1-5, 2010 Documento no de patente 4: Robertson F. M., Cancer, 1 de junio de 2010, 116 (supl.11): 2806-14 Documento no de patente 5: Martinet L., Biochem. Pharmacol., 15 de septiembre de 2010, 80(6): 83845

20 Documento no de patente 6: Sharma S. D., Mol. Cancer Ther., marzo de 2010, 9(3): 569-80 Documento no de patente 7: Sharma S. y col., Cancer Res., 15 de junio de 2005, 65(12): 5211-20 Documento no de patente 8: Lin C.-R. y col., J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2006,

319: 3 (1096-1103) Documento no de patente 9: Popp L. y col., European Journal of Pain., 2009, 13: 7 (691-703)

25 [0015] El documento WO 2004/073589 expone que es posible generar anticuerpos inhibidores (tanto monoclonales como policlonales) dirigidos contra el receptor EP4 de PGE2 humano que pueden analizarse en cuanto a su función inhibidora. El documento no lleva a cabo este procedimiento en realidad y no describe el aislamiento con éxito de ningún anticuerpo inhibidor.

30 [0016] Kashiwagi B. y col.: “Positive effect of prostaglandin on regulation of prostatic blood flow", Urology, Belle Mead, NJ, EE. UU. vol. 68, n.° 3, 1 de septiembre de 2006 (2006-09-01), páginas 682-686, desvela el uso de un anticuerpo inhibidor dirigido contra un receptor de PGE2. No se mencionan el subtipo ni la fuente del anticuerpo.

35 [0017] El documento WO 2003/099857 A1 desvela inhibidores del receptor EP4 de PEG2 a base de péptidos.

Resumen de la invención

Problema técnico

40 [0018] Es un objetivo de la presente invención proporcionar un anticuerpo dirigido contra un receptor de PGE2 humano del subtipo EP4 que sea útil como agente terapéutico para enfermedades causadas por una anormalidad inmunitaria, tumores y el dolor, una composición farmacéutica que comprenda el anticuerpo dirigido contra el EP4 humano mencionado anteriormente y similares.

45 Solución al problema

[0019] Los presentes inventores han intentado producir un anticuerpo monoclonal contra un receptor de PGE2 humano del subtipo EP4. Como resultado, los inventores han conseguido obtener un anticuerpo que se une 50 específicamente al dominio extracelular del subtipo EP4 y suprime la función del receptor EP4 de PGE2 (por ejemplo, la función de aumento del nivel intracelular de AMPc), lo que completa la presente invención.

[0020] Específicamente, la presente invención incluye los siguientes (1) a (13).

55 [1] Un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo, cada uno de los cuales se une al dominio extracelular de un receptor de PGE2 del subtipo EP4 e inhibe la función de dicho receptor EP4 de PGE2 de aumento del nivel intracelular de AMPc.

[2] El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la realización 1, en que el anticuerpo está

producido por hibridomas con los números de acceso de depósito internacional FERM BP-11402 (NBG016-mAb14) y FERM BP-11403 (NBG016-mAb21).

[3] El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 o 2, en

5 que el anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular de EP4 y comprende uno cualquiera de los siguientes (A), (B), o (C), con respecto a las secuencias aminoacídicas de sus regiones determinantes de complementariedad 1-3 (CDR1-3):

(A) el anticuerpo tiene

10 una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 6, una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO:

15 7, una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 8, una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 10;

(B) el anticuerpo tiene

20 una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 15, una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 16, una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO:

25 17, una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 18, una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 20; o

30 (C) el anticuerpo tiene una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 45, una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 46,

35 una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 47, una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 48, una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 49 y una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO:

40 50.

[4] El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 3, en que el anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular de EP4 y comprende uno cualquiera de los siguientes (a), (b) o (c), con respecto a las secuencias aminoacídicas de la región variable de la cadena pesada y de

45 la región variable de la cadena ligera:

(a) el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 2 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 4;

50 (b) el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 12 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 14; o

(c) el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia

aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende la 55 secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 44.

[5] El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

[6] El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 3 o 4, en que la región variable de la cadena pesada o la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo o fragmento del mismo está codificada por un ácido nucleico según se muestra en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42.

[7] Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 5.

[8] La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 7, para uso en un procedimiento para el tratamiento 10 de una enfermedad inmunitaria.

[9] La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 7, para uso en un procedimiento para el tratamiento de un tumor.

15 [10] La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 7 para uso en un procedimiento para el tratamiento del dolor.

[11] Un anticuerpo inmovilizado en un vehículo, en que el anticuerpo dirigido contra EP4 o un fragmento funcional

del mismo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 5 está inmovilizado en un vehículo. 20

[12] Un procedimiento para la eliminación de las células que expresan el receptor EP4 de PGE2 de la sangre, en el que un anticuerpo inmovilizado en un vehículo de acuerdo con la reivindicación 11 se pone en contacto ex vivo con sangre que contiene células que expresan EP4, con la subsiguiente eliminación de dichas células que expresan EP4 de dicha sangre.

[13] Un kit para la medición del nivel de expresión del receptor EP4 de PGE2 en una superficie celular, que comprende el anticuerpo dirigido contra EP4 de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 5.

Efectos ventajosos de la invención

30 [0021] De acuerdo con la presente invención, se ha proporcionado por primera vez un anticuerpo que suprime la función de EP4 de manera específica para EP4.

[0022] De acuerdo con la presente invención, el medicamento relacionado con EP4 de la presente invención

35 es capaz de tratar o prevenir enfermedades inmunitarias relacionadas con EP4, tumores y el dolor. En particular, mediante el anticuerpo de la presente invención, que tiene mayor selectividad de unión al subtipo EP4 que los compuestos de bajo peso molecular, pueden proporcionarse efectos terapéuticos con menos efectos secundarios.

[0023] Mediante el vehículo con el anticuerpo inmovilizado de la presente invención, pueden eliminarse 40 selectivamente las células que expresan EP4 de la sangre de un paciente que padece cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o similar.

[0024] Mediante el kit para la medición del nivel de expresión de EP4 de la presente invención, pueden detectarse células que expresan EP4 en la sangre de un paciente que padece cáncer, una enfermedad 45 autoinmunitaria o similar y, después, por medio de las células detectadas, puede evaluarse el estado de la enfermedad.

Breve descripción de los dibujos

50 [0025]

[Figura 1] La figura 1 muestra los resultados de una citometría de flujo que analizó la unión de un anticuerpo de control de isotipo de ratón, NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 a la línea celular parental Flp-In-CHO y a la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable.

55 [Figura 2] La figura 2 muestra los resultados de una citometría de flujo que analizó la unión de un anticuerpo de control de isotipo de ratón y NBG016-mAb9 a la línea celular parental Flp-In-CHO y a la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable. [Figura 3] La figura 3 muestra los resultados obtenidos al analizar los efectos supresores de un anticuerpo de control de isotipo de ratón, NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 sobre el aumento del

nivel de AMPc inducido por PGE2. [Figura 4] La figura 4 muestra los resultados obtenidos al analizar los efectos supresores de un anticuerpo de control de isotipo y NBG016-mAb9 sobre el aumento del nivel de AMPc inducido por PGE2.

5 [Figura 5] La figura 5 muestra los resultados de una citometría de flujo que analizó la unión de NBG016-mAb14 a células 293FT, en las que se habían introducido los genes de EP1-4 humanos y de EP1-4 de ratón. [Figura 6] La figura 6 muestra los resultados de una citometría de flujo que analizó la unión de NBG016-mAb9 a células 293FT, en las que se habían introducido los genes de EP1-4 humanos y de

10 EP1-4 de ratón. [Figura 7] La figura 7 muestra los resultados de una citometría de flujo que analizó la unión de un anticuerpo de control de isotipo de ratón, NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 a subpoblaciones de linfocitos en sangre periférica humana. [Figura 8] La figura 8 muestra los resultados de una citometría de flujo que analizó la unión de un

15 anticuerpo de control de isotipo de ratón y NBG016-mAb9 a subpoblaciones de linfocitos en sangre periférica humana. [Figura 9] La figura 9 muestra los resultados de la inmunotinción de la línea celular monocítica humana THP1 tratada con PMA con un anticuerpo dirigido contra EP4. [Figura 10] La figura 10 muestra los resultados de una citometría de flujo que analizó la unión del

20 sobrenadante de un cultivo de células sin genes de anticuerpos introducidos y el sobrenadante de un cultivo de células que expresaban el anticuerpo recombinante NBG016-mAb9 a la línea celular parental Flp-In-CHO y a la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable. [Figura 11] La figura 11 muestra los resultados de una citometría de flujo que analizó la unión de un anticuerpo de control de isotipo de ratón, el anticuerpo recombinante NBG016-mAb14 y el anticuerpo

25 recombinante NBG016-mAb21 a la línea celular parental Flp-In-CHO y a la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable. [Figura 12] La figura 12(A) muestra los resultados de una citometría de flujo que analizó la unión de un anticuerpo de control de isotipo de ratón y el anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 a la línea celular parental Flp-In-CHO y a la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable.

30 La figura 12(B) muestra los resultados obtenidos al analizar los efectos supresores de un anticuerpo de control de isotipo y el anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 sobre el aumento del nivel de AMPc inducido por PGE2. [Figura 13] La figura 13 muestra los resultados de una citometría de flujo que analizó la unión del sobrenadante de un cultivo de células sin genes de anticuerpos introducidos, el sobrenadante de un

35 cultivo de células que expresaban el anticuerpo quimérico humano NBG016-mAb14 y el sobrenadante de un cultivo de células que expresaban el anticuerpo quimérico humano NBG016-mAb21 a la línea celular parental Flp-In-CHO y a la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable.

Descripción de las realizaciones

40 [0026] La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une al dominio extracelular de un receptor de PGE2 humano del subtipo EP4 y suprime la función de EP4, o a un fragmento funcional del mismo, y a un medicamento que comprende el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

45 Definición de la proteína EP4

[0027] Como proteína EP4 para servir como antígeno en la presente invención, puede usarse una proteína recombinante preparada a partir de un ADNc que codifique la proteína EP4 o similar. Alternativamente, puede usarse como antígeno una célula adecuada que exprese EP4 en la superficie de la misma. Una secuencia de ácido 50 nucleico codificante de una proteína EP4 humana puede obtenerse en bases de datos publicadas tales como GenBank (por ejemplo, número de acceso: NM_000958). El ADN (por ejemplo, ADNc) codificante de EP4 puede prepararse a partir de un banco de ADN adecuado con una sonda, un par de cebadores para amplificación por PCR

o similar, producidos a partir de la secuencia génica mencionada anteriormente o similar. Alternativamente, puede prepararse ADNc total por un procedimiento de síntesis de ADN artificial. Como ejemplo, en SEQ ID NO: 21 se

55 muestra una secuencia aminoacídica que corresponde a la EP4 humana. Se sabe que la EP4 humana presenta diversos tipos de variantes tales como variantes con aminoácidos sustituidos, además de la mostrada en SEQ ID NO: 21. El término “EP4 humana” se usa en la presente invención para incluir las variantes mencionadas anteriormente, siempre y cuando tengan la función de EP4.

[0028] Se considera que los dominios intracelular y extracelular de la EP4 humana corresponden a las porciones mencionadas a continuación de la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 21. El término a la izquierda indica los números de los aminoácidos y el término a la derecha el dominio relevante. Ha de señalarse que la zona limítrofe entre los dominios individuales puede incluir algún intervalo (uno a cinco restos aminoacídicos,

5 preferentemente uno a tres restos aminoacídicos y con mayor preferencia uno o dos restos aminoacídicos).

1 a 19: dominio N-terminal 44 a 54: dominio del primer bucle intracelular 80 a 96: dominio del primer bucle extracelular

10 116 a 135: dominio del segundo bucle intracelular 161 a 184: dominio del segundo bucle extracelular 212 a 267: dominio del tercer bucle intracelular 296 a 312: dominio del tercer bucle extracelular 333 a 488: dominio C-terminal

15 Definición de anticuerpo o anticuerpo funcional

[0029] El anticuerpo de la presente invención que suprime la actividad del EP4 es un anticuerpo monoclonal. Los fragmentos funcionales del presente anticuerpo incluyen fragmentos de anticuerpo tales como Fab o F(ab’)2 y

20 anticuerpos de cadena sencilla. Siempre que sea un polipéptido (o complejo polipeptídico) que conste de una parte de un anticuerpo y suprima la función de EP4, todos los tipos de polipéptidos están incluidos en el alcance de la presente invención.

Definición de anticuerpo funcional específico para EP4 y procedimiento para su evaluación

25 [0030] Algunos ejemplos de la función de EP4 incluyen el aumento del nivel intracelular de AMPc y la activación de la fosfoinositida-3-cinasa (PI3K). Se sabe que estos cambios intracelulares regulan la proliferación de las células cancerosas, la proliferación de los linfocitos T y la generación de citocinas. La unión específica del anticuerpo de la presente invención al dominio extracelular de un receptor de PGE2 humano del subtipo EP4 puede

30 demostrarse de la manera siguiente. Una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína EP4 humana se inserta en un vector de expresión y el vector se introduce después en células hospedadoras adecuadas (por ejemplo, células de mamífero tales como las células CHO, células de levadura, células de insecto, etc.). De manera no destructiva, se deja que las células hospedadoras que expresan EP4 o las células hospedadoras que no expresan EP4, que no comprenden ninguna inserción, deleción, sustitución o similar de aminoácidos, entren en

35 contacto con el anticuerpo de la presente invención y reaccionen entre sí durante un cierto periodo de tiempo. Después de eliminar por el exceso de anticuerpo, las células se someten a ELISA, RIA o citometría de flujo, para medir la cantidad de anticuerpo unido a las mismas. Si se une una mayor cantidad del anticuerpo de la presente invención a las células que expresan EP4 que a las células que no lo expresan, los resultados pueden demostrar la unión específica del anticuerpo de la presente invención al dominio extracelular de EP4. Además, se construye un

40 vector de expresión en el que se ha insertado una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína EP1, EP2, EP3 o EP4 de origen humano o de ratón. Después, las células hospedadoras que expresan el receptor se analizan de la misma manera descrita anteriormente. De este modo puede demostrarse que el anticuerpo de la presente invención se une a las células que expresan el EP4 humano en mayor medida que a las células que expresan los otros receptores y preferentemente no puede detectarse una unión del anticuerpo de la presente invención a las

45 células que expresan receptores distintos del EP4 humano.

[0031] El hecho de que el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo que inhibe la función de EP4 puede explicarse de la manera siguiente. Una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína EP4 humana se inserta en un vector de expresión y el vector se introduce después en células hospedadoras adecuadas (por

50 ejemplo, células de mamífero tales como las células CHO, células de levadura, células de insecto, etc.). Se permite que las células hospedadoras que expresan la EP4 humana entren en contacto con el anticuerpo a una concentración de 0,01 a 30 µg/ml y después se permite que las células entren además en contacto con PGE2 a una concentración de 10-12 a 10-6 M. A continuación, se mide el aumento del nivel intracelular de AMPc por un procedimiento adecuado. Cuando se añade a las células el anticuerpo de la presente invención, este es capaz de

55 suprimir el aumento del nivel de AMPc inducido por PGE2 de manera dependiente de la dosis.

[0032] Además, se permite que el presente anticuerpo entre en contacto, a una concentración de 0,01 a 10 µg/ml, con una línea celular que expresa la EP4 humana de manera natural (por ejemplo, células macrofágicas humanas) y también se permite que PGE2 entre en contacto con las células a una concentración de 10-12 a 10-6 M. A

continuación, se examina la generación de citocinas o quimiocinas por un estímulo inflamatorio (por ejemplo, lipopolisacárido (LPS)). Se sabe que PGE2 suprime la generación de citocinas estimulada por LPS a través de la mediación de EP4 o EP2. La actividad del anticuerpo de la presente invención de inhibición de la función de EP4 puede evaluarse usando como indicador el hecho de que el presente anticuerpo revierte la supresión de la

5 generación de citocinas por PGE2 a través de la mediación de EP4. Igualmente, la actividad del presente anticuerpo de inhibición de la función de EP4 puede evaluarse también usando como indicador el efecto del presente anticuerpo de inhibición de la generación de IL-23 por células dendríticas de sangre periférica humanas potenciada por la PGE2.

10 [0033] Adicionalmente, cuando se permite que una línea celular cancerosa derivada de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer esofágico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer bucal, cáncer de próstata o mieloma múltiple humanos (por ejemplo, células MDA-MB231, células HCA-7, células HT-29) entre en contacto con PGE2, aumenta la actividad proliferativa de las células. Después de que previamente se haya permitido que el anticuerpo de la presente invención entre en contacto con

15 estas células, la actividad del presente anticuerpo para inhibir la función de PGE2 puede evaluarse usando como indicador el hecho de que se reduce el aumento de la actividad proliferativa de las células causado por PGE2.

[0034] El anticuerpo de la presente invención se une solo a la proteína EP4 humana y no reacciona con la EP4 de ratón. Por consiguiente, es difícil evaluar en ensayos con animales los efectos como fármaco del anticuerpo 20 de la presente invención con respecto a anormalidades inmunitarias o el dolor. Por otro lado, con respecto a los efectos antitumorales del presente anticuerpo, las células con elevada expresión de EP4, que se han establecido a partir de los tejidos cancerosos humanos mencionados anteriormente, se injertan en ratones inmunodeficientes en una cantidad de 106 a 107 células por ratón. Inmediatamente después del injerto de las células, el anticuerpo de la presente invención se administra a los ratones por vía intraperitoneal o subcutánea en una dosis de 0,1 a 0,5

25 mg/ratón. En comparación con un grupo de administración de un anticuerpo de control de isotipo, la formación de tumores o frecuencia de metástasis puede reducirse significativamente en el grupo de administración del anticuerpo de la presente invención. Por lo tanto, puede demostrarse que el anticuerpo de la presente invención tiene un efecto antitumoral.

30 Definición detallada del anticuerpo de la presente invención

[0035] Algunos ejemplos del anticuerpo de la presente invención y un fragmento funcional del mismo incluyen: anticuerpos monoclonales producidos a partir de los hibridomas con los números de acceso de depósito internacional FERM BP-11402 (NBG016-mAb14) y FERM BP-11403 (NBG016-mAb21) y anticuerpos monoclonales

35 preparados por los procedimientos descritos en los ejemplos mencionados más adelante.

[0036] Además, otros ejemplos del anticuerpo de la presente invención y un fragmento funcional del mismo incluyen: un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 2 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia 40 aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 4; un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 12 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 44; un anticuerpo que tiene 45 una cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 23 y una cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 25; un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 29; un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 56 y una cadena ligera que comprende la secuencia 50 aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 57; fragmentos funcionales de los anticuerpos mencionados anteriormente; un anticuerpo que consta de una cadena pesada y/o una cadena ligera con una secuencia aminoacídica o secuencias aminoacídicas que comprenden una deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos, con respecto a la secuencia aminoacídica o secuencias aminoacídicas de la cadena pesada y/o la cadena ligera de que constan los anticuerpos mencionados anteriormente; y fragmentos funcionales de los mismos que suprimen la

55 función de EP4.

Definición de epítopo idéntico al del anticuerpo de la presente invención

[0037] Además, un ejemplo especialmente preferido del anticuerpo de la presente invención y un fragmento

funcional del mismo es un anticuerpo con un epítopo que se solapa con (o es idéntico al) epítopo de uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales aislados en los ejemplos. En la presente invención, se hace mención de tal anticuerpo como un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo sitio. Si dos anticuerpos se unen sustancialmente al mismo sitio o no puede determinarse, por ejemplo, llevando a cabo un experimento de

5 competición. Específicamente, cuando la unión a EP4 del anticuerpo dirigido contra EP4 descrito en los ejemplos se inhibe competitivamente mediante un anticuerpo secundario dirigido contra EP4, queda determinado que el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario se unen sustancialmente al mismo sitio antigénico. Por lo tanto, un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo sitio que el sitio de unión a EP4 del anticuerpo aislado en los ejemplos, que tiene un efecto de inhibición de la función de EP4, se incluye en la presente invención.

10 Procedimiento para la obtención del anticuerpo de la presente invención

[0038] El anticuerpo dirigido contra EP4 de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo. El anticuerpo monoclonal puede producir de manera estable un anticuerpo que es 15 homogéneo como composición farmacéutica. El término “monoclonal” sugiere las propiedades de un anticuerpo obtenido de un grupo de anticuerpos sustancialmente homogéneos. Por lo tanto, este término no se usa para indicar que el anticuerpo se produce por un procedimiento específico. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal usado en la presente invención puede producirse, por ejemplo, por un procedimiento de hibridomas (Kohler y Milstein, Nature

256: 495 (1975)) o un procedimiento de recombinación (patente de los EE. UU. n° 4.816.567). El anticuerpo

20 monoclonal usado en la presente invención puede aislarse también a partir de un banco de anticuerpos en fagos (Clackson y col., Nature 352: 624-628 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)). Algunos ejemplos concretos del anticuerpo monoclonal usado en la presente invención incluyen: un anticuerpo “quimérico” (inmunoglobulina), en el que una porción de la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo monoclonal usado en la presente invención se deriva de una especie específica o una clase o subclase específica de anticuerpos y la

25 parte restante de la cadena o cadenas se deriva de otra clase o subclase de anticuerpos; una variante del anticuerpo; y un fragmento funcional del mismo (patente de los EE. UU. n° 4.816.567; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).

[0039] El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede prepararse, por ejemplo, por un 30 procedimiento de hibridomas.

[0040] Este procedimiento incluye las cuatro etapas siguientes de: (i) inmunización de un animal hospedador o de células derivadas de un animal hospedador con una proteína EP4 humana; (ii) recogida de los linfocitos que secretan (o potencialmente secretan) anticuerpos monoclonales; (iii) fusión de los linfocitos con células

35 inmortalizadas; y (iv) selección de las células que secretan un anticuerpo monoclonal deseado. Como animal para la inmunización, se seleccionan un ratón, una rata, una cobaya, un hámster u otro animal hospedador adecuado y entonces se inyecta un inmunógeno en el animal seleccionado.

[0041] Después de llevar a cabo la inmunización, los linfocitos obtenidos del animal hospedador se fusionan

40 con una línea celular inmortalizada mediante un agente de fusión tal como polietilenglicol, para establecer las células del hibridoma. Cómo células para la fusión se usa, por ejemplo, una línea celular de mieloma de rata o de ratón. Después de llevar a cabo la fusión celular, las células se dejan crecer en un medio adecuado que contiene uno o más sustratos que inhiben el crecimiento o la supervivencia de los linfocitos sin fusionar y la línea celular inmortalizada. De acuerdo con una técnica habitual, se usan células parentales que carecen de la enzima

45 hipoxantinaguanina-fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT). En este caso, se añaden hipoxantina, aminopterina y timidina a un medio que inhibe el crecimiento de las células deficientes en HGPRT y permite el crecimiento de los hibridomas (medio HAT). A partir de los hibridomas así obtenidos, pueden seleccionarse aquellos que producen los anticuerpos deseados y, después, puede obtenerse un anticuerpo monoclonal de interés a partir de un medio en el que se cultivan hibridomas de acuerdo con un procedimiento habitual.

50 [0042] Los hibridomas así preparados se cultivan in vitro o se cultivan in vivo en la ascitis de un ratón, una rata, una cobaya, un hámster, etc., de modo que, a partir del sobrenadante del cultivo o la ascitis, puede prepararse el anticuerpo de interés.

55 [0043] El ácido nucleico de la presente invención codifica la región variable de la cadena pesada o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención que codifica la región variable de la cadena pesada o la región variable de la cadena ligera puede insertarse en un vector y, después, el vector puede expresarse en células.

[0044] El tipo de vector no está particularmente limitado y puede seleccionarse según sea apropiado, dependiendo del tipo de la célula hospedadora en la que ha de introducirse el vector y similar. Además, el vector puede introducirse en células hospedadoras adecuadas para la expresión de un anticuerpo (por ejemplo, células de mamífero tales como las células CHO, células de levadura, células de insecto, etc.) para poder preparar un

5 anticuerpo recombinante.

Definición del anticuerpo quimérico de la presente invención y procedimiento para la producción del mismo

[0045] La realización del anticuerpo dirigido contra EP4 de la presente invención incluye un anticuerpo

10 genéticamente recombinante. El tipo de tal anticuerpo genéticamente recombinante no está particularmente limitado. Algunos ejemplos del anticuerpo genéticamente recombinante incluyen un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. El término “anticuerpo quimérico” se usa en este documento para indicar un anticuerpo en el que una región variable derivada de un animal se une a una región constante derivada de un animal diferente y, especialmente, un anticuerpo en el que una región variable de anticuerpo derivada de ratón se une a una

15 región constante de anticuerpo de origen humano (véase Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855, (1984), etc.). A la hora de producir un anticuerpo quimérico, un anticuerpo que comprenda una unión tal de una región variable y una región constante puede construirse fácilmente de acuerdo con técnicas de recombinación genética bien conocidas por el experto en la materia. En este caso, con respecto a las regiones variables de anticuerpo derivadas de ratón, la región variable de la cadena pesada consta preferentemente de la secuencia aminoacídica mostrada,

20 por ejemplo, en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12 y la región variable de la cadena ligera consta preferentemente de la secuencia aminoacídica mostrada, por ejemplo, en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 14. La cadena pesada quimérica

o la cadena ligera quimérica de la presente invención se inserta en un vector. El tipo de vector no está particularmente limitado. El vector puede seleccionarse según sea apropiado, dependiendo del tipo de la célula hospedadora en la que ha de introducirse y similar. Además, el vector puede introducirse en células hospedadoras

25 adecuadas para la expresión de un anticuerpo (por ejemplo, células de mamífero tales como las células CHO, células de levadura, células de insecto, etc.) para poder preparar un anticuerpo recombinante.

Definición del anticuerpo humanizado de la presente invención y procedimiento para la producción del mismo

30 [0046] El anticuerpo quimérico de la presente invención incluye un anticuerpo human(izad)o. El anticuerpo humanizado es un anticuerpo en el que la región estructural es de origen humano y la región CDR deriva de ratón. El anticuerpo humanizado puede producirse insertando primeramente la CDR de la región variable de un anticuerpo de ratón en una región variable humana para reconstituir las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera y uniendo después la región variable humana reconstituida así humanizada con una región constante humana.

35 Un procedimiento tal para la producción de un anticuerpo humanizado es bien conocido en el presente campo técnico (véase, por ejemplo, Nature, 321: 522-525 (1986); J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); Queen C. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)). En este documento, el tipo de secuencia CDR derivada de ratón usada para el anticuerpo dirigido contra EP4 de la presente invención no está limitado. Por ejemplo, algunos ejemplos de CDR 1 a 3 de la cadena pesada incluyen las secuencias aminoacídicas mostradas en SEQ ID NO: 5 a 7

40 y algunos ejemplos de CDR 1 a 3 de la cadena ligera incluyen las secuencias aminoacídicas mostradas en SEQ ID NO: 8 a 10 y las secuencias aminoacídicas mostradas en SEQ ID NO: 18 a 20.

[0047] Con el fin de permitir la expresión de la cadena pesada de un anticuerpo humanizado o la cadena ligera de un anticuerpo humanizado en células hospedadoras, la cadena pesada del anticuerpo humanizado o la 45 cadena ligera del anticuerpo humanizado pueden insertarse en un vector. El tipo de vector tal no está particularmente limitado y puede seleccionarse según sea apropiado, dependiendo del tipo de la célula hospedadora en la que ha de introducirse y similar. Además, el vector puede introducirse en células hospedadoras adecuadas para la expresión de un anticuerpo (por ejemplo, células de mamífero tales como las células CHO, células de levadura, células de insecto, etc.) y el anticuerpo se reconstituye en las células hospedadoras, para poder preparar

50 el anticuerpo recombinante.

Definición del anticuerpo humano de la presente invención y procedimiento de producción del mismo

[0048] El anticuerpo humano (anticuerpo totalmente humano) es un anticuerpo en el que la región

55 hipervariable que es el sitio de unión antigénica de la región variable, el resto de la región variable y la región constante tienen la misma estructura que en un anticuerpo humano. Sin embargo, la región hipervariable puede derivar también de otro animal. Un anticuerpo tal puede ser producido fácilmente por un experto en la materia de acuerdo con técnicas conocidas. El anticuerpo humano puede obtenerse, por ejemplo, por un procedimiento que usa un ratón productor de un anticuerpo humano que tiene un fragmento cromosómico que comprende los genes de la

cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo humano (véase Tomizuka, K. y col., Nature Genetics, (1997) 16: 133-143; Kuroiwa, Y. y col., Nucl. Acids Res., (1998) 26: 3447-3448; Yoshida, H. y col., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, (1999) 10: 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. e Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97: 722-727, etc.) o por un procedimiento de

5 obtención de un anticuerpo humano procedente de exposición en fagos, seleccionado de un banco de anticuerpos humanos (Wormstone, I. M. y col, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002) 43(7): 2301-8; Carmen, S. y col., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1(2): 189-203; Siriwardena, D. y col., Opthalmology, (2002) 109(3): 427-431, etc.).

10 Fragmento funcional del anticuerpo de la presente invención

[0049] El fragmento funcional del anticuerpo de la presente invención indica una región parcial del anticuerpo dirigido contra EP4. Algunos ejemplos de un tal fragmento funcional incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv (un fragmento variable de anticuerpo), un anticuerpo de cadena sencilla (una cadena pesada, una cadena ligera, una región

15 variable de la cadena pesada, una región variable de la cadena ligera, etc.), scFv, un diacuerpo (un dímero de scFv), dsFv (una región variable estabilizada por disulfuro) y un péptido que comprende una CDR como al menos una porción del mismo. Fab es un fragmento de anticuerpo con actividad de unión antigénica obtenido por digestión de una molécula de anticuerpo con la proteasa papaína, en que aproximadamente la mitad N-terminal de la cadena pesada se une a la totalidad de la cadena ligera por medio de un enlace disulfuro.

20 [0050] Fab puede producirse por la digestión de una molécula de anticuerpo con papaína para obtener un fragmento de la misma. Fab puede producirse también, por ejemplo, construyendo un vector de expresión adecuado en el que se inserta el ADN codificante de Fab, introduciendo el vector en las células hospedadoras adecuadas (por ejemplo, células de mamífero tales como las células CHO, células de levadura, células de insecto, etc.) y

25 permitiendo después su expresión en las células.

[0051] F(ab’)2 es un fragmento de anticuerpo con actividad de unión antigénica obtenido por la digestión de una molécula de anticuerpo con la proteasa pepsina, que es ligeramente mayor que Fab y que se une a otro Fab por medio de un enlace disulfuro en la región de bisagra. F(ab’)2 puede obtenerse por la digestión de una molécula de

30 anticuerpo con la proteasa pepsina o también puede producirse por unión del Fab mencionado a continuación con otro Fab por medio de un enlace tioéter o un enlace disulfuro. Alternativamente, F(ab’)2 también puede producirse de acuerdo con un procedimiento de ingeniería genética, al igual que Fab.

[0052] Fab’ es un fragmento de anticuerpo con actividad de unión antigénica obtenido por escisión del enlace

35 disulfuro en la región de bisagra del F(ab’)2 descrito anteriormente. Fab’ puede producirse también de acuerdo con un procedimiento de ingeniería genética, al igual que en el caso de Fab y similares.

[0053] scFv es un fragmento de anticuerpo con actividad de unión antigénica que es un polipéptido VHconector-VL o VL-conector-VH, en el que una única región variable de la cadena pesada (VH) se une a una única

40 región variable de la cadena ligera (VL) mediante un péptido conector adecuado. Tal scFv puede producirse mediante la obtención de los ADNc codificantes de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo y su tratamiento posterior de acuerdo con un procedimiento de ingeniería genética.

[0054] Un diacuerpo es un fragmento de anticuerpo con una actividad de unión antigénica divalente, en el que

45 scFv se dimeriza. Con respecto a la actividad de unión antigénica divalente, esta puede ser una actividad de unión a dos antígenos idénticos o a dos antígenos diferentes. El diacuerpo puede producirse mediante la obtención de los ADNc codificantes de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo, la construcción posterior de un ADNc que expresa scFv en el que la región variable de la cadena pesada se une a la región variable de la cadena ligera mediante un péptido conector y, a continuación, el tratamiento del

50 ADNc de acuerdo con un procedimiento de ingeniería genética.

[0055] dsFv es un polipéptido que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, cada una de las cuales incluye la sustitución de un resto aminoacídico por un resto de cisteína, en el que VH se une a VL por medio de un enlace disulfuro entre los restos de cisteína. El resto aminoacídico que ha

55 de sustituirse por el resto de cisteína puede seleccionarse a partir de la predicción de la estructura del anticuerpo de acuerdo con el procedimiento de Reiter y col. o similar. Tal dsFv puede producirse mediante la obtención de los ADNc codificantes de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del anticuerpo y la construcción posterior del ADN codificante de dsFv de acuerdo con un procedimiento de ingeniería genética.

[0056] Un péptido que comprende una CDR se construye de manera que comprenda al menos una región CDR (CDR1-3) de la cadena pesada o la cadena ligera. Un péptido que comprende múltiples regiones CDR es capaz de unirse a otro péptido directamente o por medio de un péptido conector adecuado. En el caso de un péptido que comprende una CDR, se construye el ADN codificante de la CDR de la cadena pesada o la cadena ligera del 5 anticuerpo y después se inserta en un vector de expresión. El tipo del vector no está particularmente limitado y puede seleccionarse, según sea apropiado, dependiendo del tipo de células hospedadoras en las que ha de introducirse el vector y similar. El vector se introduce en células hospedadoras adecuadas para la expresión de un anticuerpo (por ejemplo, células de mamífero tales como las células CHO, células de levadura, células de insecto, etc.) para poder producir el péptido. Alternativamente, un péptido tal que contiene una CDR también puede

10 producirse por procedimientos de síntesis química tales como el procedimiento Fmoc (procedimiento del fluorenilmetiloxicarbonilo) y el procedimiento tBoc (procedimiento del t-butiloxicarbonilo).

Purificación del anticuerpo de la presente invención

15 [0057] El procedimiento para la purificación del anticuerpo de la presente invención no está particularmente limitado y puede adoptarse un procedimiento conocido. Por ejemplo, se recoge el sobrenadante del cultivo de las células de hibridoma o las células recombinantes descritas anteriormente y después el anticuerpo de la presente invención puede purificarse del sobrenadante del cultivo mediante el uso combinado de procedimientos conocidos tales como los diversos tipos de cromatografía, precipitación salina, diálisis y separación por membrana. Cuando el

20 isotipo del anticuerpo es IgG, el anticuerpo puede purificarse simplemente por cromatografía de afinidad con la proteína A.

Medicamento que comprende el anticuerpo de la presente invención

25 [0058] El anticuerpo de la presente invención o un fragmento funcional del mismo pueden usarse en un medicamento que comprenda como principio activo el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo. El medicamento de la presente invención puede usarse para tratar o prevenir enfermedades inmunitarias relacionadas con EP4, tumores y el dolor.

30 [0059] Algunos ejemplos de enfermedades inmunitarias relacionadas con EP4 incluyen: psoriasis, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedades inflamatorias intestinales tales como la enfermedad de Crohn, diabetes de tipo I y complicaciones de la misma (por ejemplo, retinopatía diabética, microangiopatía diabética, nefropatía diabética, degeneración macular, etc.), polimiositis, síndrome de Sjogren, asma, dermatitis atópica y dermatitis de contacto, trastornos de inmunodeficiencia y trasplantes de órganos.

35 [0060] El medicamento de la presente invención puede usarse para el tratamiento o la prevención del dolor, es decir, dolor nociceptivo y dolor neuropático. Algunos ejemplos de dolor nociceptivo incluyen: el dolor causado por la activación de nociceptores somáticos y viscerales, tal como la deformación patológica de las articulaciones y la artralgia crónica (por ejemplo, artritis, incluida la artritis reumatoide, osteoartritis, espondilitis reumatoide,

40 osteoartritis, artritis gotosa y artritis juvenil) (incluido el alivio de la enfermedad y el mantenimiento de la estructura articular), lumbago y dolor de cuello, dolor musculoesquelético, miositis, roturas de huesos, distorsión, hematoma, dolor que acompaña al síndrome fibromiálgico, dolor asociado con tumores y su tratamiento, dolor que acompaña a una infección gripal u otras enfermedades infecciosas virales (resfriado común, etc.), fiebre reumática, dolor visceral, dolor que acompaña a enfermedades intestinales funcionales (por ejemplo, síndrome de intestino irritable, dolor

45 pectoral no cardíaco, dispepsia no ulcerosa, etc.), dolor que acompaña a la isquemia miocárdica; dolor dental, dolor postoperatorio y tras un tratamiento odontológico, dolor postparto, trastornos cefálicos primarios (por ejemplo, migraña, cefalea tensional, cefalea en brotes y otros trastornos cefálicos primarios), trastornos cefálicos secundarios (por ejemplo, cefalea causada por la lesión de la cabeza y el cuello, cefalea causada por un trastorno vascular de la cabeza y el cuello, cefalea causada por enfermedades intracraneales no vasculares, cefalea causada por consumo

50 de drogas o retirada de drogas, cefalea causada por enfermedades infecciosas, cefalea causada por trastornos homeostáticos, cefalea o prosopalgia causada por trastornos del cráneo, cuello, ojos, oído, nariz, senos, dientes, boca u otros tejidos constituyentes de la cara y el cráneo, cefalea inducida por fármacos y dolor que acompaña a la migraña).

55 [0061] Algunos ejemplos de dolor neuropático incluyen: lesión física o ablación, dolor fantasma de miembros, dolor causado por síntomas inflamatorios crónicos. neuralgia postherpética, neuropatía diabética, lumbago inespecífico, dolor de espalda, ciática, neuropatía asociada a tumores y su tratamiento, neuropatía asociada al VIH, síndrome del túnel carpiano, alcoholismo crónico, hipotiroidismo, neuralgia del trigémino, cefalea autónoma del trigémino, uremia, avitaminosis, esclerosis múltiple, síndrome fibromiálgico y dolor que acompaña a toxinas.

[0062] El medicamento de la presente invención es eficaz para el tratamiento o la prevención de tumores. El objetivo del tratamiento de tumores incluye no solo la inhibición total o parcial del crecimiento, difusión o metástasis del tumor o la eliminación total o parcial de las células tumorales, sino que también incluye la eliminación total o

5 parcial de los síntomas que acompañan al tumor (dolor, anorexia, pérdida de peso, etc.).

[0063] El tratamiento o la prevención de tumores se dirige a la proliferación de tumores y pólipos benignos, la proliferación de tumores y pólipos malignos y a los neoplasmas.

10 [0064] Algunos ejemplos de proliferación de tumores y pólipos benignos incluyen: papiloma de células escamosas, papiloma de células basales, papiloma de células de transición, adenocarcinoma, gastrinoma, adenoma colangiocelular, adenoma hepatocelular, adenoma nefridial, oncocitoma, tumor glómico, nevo melanocítico, fibroma, mixoma, lipoma, leiomioma, rabdomioma, teratoma benigno, angioma, osteoma, condroma y meningioma.

15 [0065] Algunos ejemplos de proliferación de tumores y pólipos malignos incluyen: carcinoma de células hepáticas, colangiocarcinoma, carcinoma de células renales, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, carcinoma de células de transición, adenocarcinoma, gastrinoma maligno, melanoma maligno, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, teratoma maligno, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, osteosarcoma, condrosarcoma, linfangiosarcoma, meningioma maligno, linfoma no de Hodgkin,

20 linfoma de Hodgkin, leucemia y encefaloma.

[0066] Algunos ejemplos de neoplasma incluyen: neoplasma derivado de células epiteliales (carcinoma epitelial), carcinoma de células basales y adenocarcinoma, cáncer labial, cáncer bucal, cáncer esofágico, cáncer gastrointestinal tal como el cáncer de intestino delgado y cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer

25 de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de pulmón y cáncer de mama, cáncer de piel tal como el cáncer de células escamosas y el cáncer de células basales, cáncer de próstata y cáncer de células renales, y otros cánceres que afectan a células sistémicas epiteliales, mesenquimatosas o sanguíneas.

30 [0067] Puede proporcionarse un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprenda el anticuerpo de la presente invención y un compuesto con actividad antitumoral y/o citotóxica. El gen de la toxina proteínica usada como compuesto con actividad antitumoral y/o citotóxica se fusiona, de acuerdo con técnicas de recombinación genética, con el gen de un anticuerpo de modo que pueda expresarse como una proteína única. La proteína así obtenida se denomina generalmente inmunotoxina. Algunos ejemplos del compuesto con actividad antitumoral

35 incluyen doxorrubicina y mitomicina C. El procedimiento para la producción de un conjugado de anticuerpo y fármaco no está particularmente limitado. Un ejemplo del procedimiento es un procedimiento de acoplamiento de un anticuerpo con un fármaco por medio de un enlace disulfuro o un enlace hidrazona.

Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención

40 [0068] La presente invención incluye un medicamento o una composición farmacéutica. Además del anticuerpo de la presente invención descrito anteriormente o un fragmento funcional del mismo, también puede usarse una sal fisiológicamente aceptable del mismo como principio activo del medicamento de la presente invención. Cuando hay un grupo ácido presente, algunos ejemplos de una sal semejante incluyen: sales de metales

45 alcalinos y metales alcalinotérreos tales como litio, sodio, potasio, magnesio o calcio; sales de aminas tales como amonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, diciclohexilamina, tris(hidroximetil)aminometano, N,Nbis(hidroxietil)piperazina, 2-amino-2-metil-1-propanol, etanolamina, N-metilglucamina o L-glucamina; y sales formadas con aminoácidos básicos tales como lisina, δ-hidroxilisina o arginina. Cuando hay un grupo básico presente, algunos ejemplos de una sal semejante incluyen: sales formadas con ácidos minerales tales como ácido

50 clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico o ácido fosfórico; sales formadas con ácidos orgánicos tales como ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido acético, ácido propiónico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido málico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido mandélico, ácido cinámico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido glucurónico, ácido ascórbico, ácido nicotínico o ácido salicílico; y sales formadas con aminoácidos ácidos tales como ácido aspártico o ácido glutámico.

55 [0069] Como medicamento de la presente invención, el anticuerpo de la presente invención o un fragmento funcional del mismo, que es un principio activo del medicamento, puede administrarse directamente. Sin embargo, en general, el medicamento de la presente invención se administra de manera deseable en forma de una composición farmacéutica que comprende uno o dos o más aditivos farmacéuticos, además del anticuerpo de la

presente invención o un fragmento funcional del mismo usado como principio activo. Como principio activo del medicamento de la presente invención, puede usarse una combinación de dos o más tipos de anticuerpos de la presente invención o fragmentos funcionales de los mismos. También pueden añadirse otros agentes conocidos a la composición farmacéutica mencionada anteriormente.

5 [0070] El tipo de composición farmacéutica no está particularmente limitado. Algunos ejemplos de la forma de dosificación incluyen un comprimido, una cápsula, un granulado, un polvo, un jarabe, una suspensión un supositorio, una pomada, una crema, un gel, un parche, un inhalante y una inyección. Estas preparaciones farmacéuticas se preparan de acuerdo con procedimientos habituales. En el caso de un agente líquido, puede adoptar una forma en la

10 que el agente se disuelve o suspende en agua u otro medio adecuado antes de su uso. Además, en el caso de un comprimido o granulado, puede recubrirse de acuerdo con un procedimiento bien conocido. En el caso de una inyección, se prepara por disolución del compuesto de la presente invención en agua. El presente compuesto también puede disolverse en una disolución salina normal o una disolución de dextrosa, según sea necesario, y también puede añadírsele un tampón o un conservante a dicha disolución. La composición farmacéutica puede

15 proporcionarse en cualquier forma farmacéutica dada usada para administración por vía oral o parenteral. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede prepararse en forma de una composición farmacéutica usada para administración por vía oral, tal como un granulado, una píldora, un polvo, una cápsula dura, una cápsula blanda, un jarabe, una emulsión, una suspensión o un agente líquido, o puede preparase en forma de una composición farmacéutica usada para administración por vía parenteral (administración por vía intravenosa, administración por

20 vía intramuscular o administración por vía subcutánea), tal como una inyección, un goteo, un agente de absorción percutánea, un agente de absorción transmucosal, un agente transnasal, un inhalante o un supositorio. En el caso de una inyección o un goteo, estos pueden preparase en una forma pulverulenta tal como una forma liofilizada y pueden después disolverse en un medio acuoso adecuado tal como una disolución salina normal antes de su uso. Además, una preparación de liberación mantenida recubierta con un polímero o similar puede administrarse

25 directamente al cerebro.

[0071] Los tipos de aditivos farmacéuticos usados en la producción de la composición farmacéutica, la proporción de los aditivos farmacéuticos con respecto al principio activo y un procedimiento para la producción de la composición farmacéutica pueden ser determinados apropiadamente por un experto en la materia, dependiendo de 30 la forma de la composición farmacéutica que ha de producirse. Como tales aditivos farmacéuticos, pueden usarse sustancias orgánicas o inorgánicas o sustancias sólidas o líquidas. En general, tales aditivos farmacéuticos pueden añadirse en un porcentaje en peso del 1 % al 90 %, con respecto al peso del principio activo. Algunos ejemplos específicos de tales sustancias usadas como aditivos farmacéuticos incluyen lactosa, glucosa, manitol, dextrina, ciclodextrina, almidón. sacarosa, aluminometasilicato de magnesio, silicato de aluminio sintético, 35 carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilalmidón, carboximetilcelulosa de calcio, resina de intercambio iónico, metilcelulosa, gelatina, goma arábiga, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, ácido silícico anhidro ligero, estearato de magnesio, talco, tragacanto, bentonita, Veegum, óxido de titanio, éster de ácido graso de sorbitano, laurilsulfato de sodio, glicerina, éster de ácido graso de glicerina, lanolina purificada, gelatina glicerinada, polisorbato, macrogol, aceite vegetal, cera, parafina líquida, vaselina blanca,

40 fluorocarbono, un tensioactivo no iónico, propilenglicol y agua.

[0072] Con el fin de producir una preparación sólida usada para administración por vía oral, el principio activo se mezcla con un ingrediente excipiente tal como lactosa, almidón, celulosa cristalina, lactato de calcio o anhídrido de ácido silícico para preparar un polvo. Por lo demás, a la mezcla obtenida anteriormente se añaden un aglutinante 45 tal como sacarosa, hidroxipropilcelulosa o polivinilpirrolidona, un desintegrante tal como carboximetilcelulosa o carboximetilcelulosa de calcio u otros aditivos, según sea necesario y la mezcla obtenida se somete entonces a granulación en húmedo o granulación en seco, para preparar un granulado. Con el fin de producir un comprimido, un polvo o un granulado tal puede someterse a una operación de producción de comprimidos, bien directamente o con la adición de un lubricante tal como estearato de magnesio o talco. El granulado o comprimido preparado puede 50 recubrirse con una base de recubrimiento entérico tal como ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa o un polímero de ácido acrílico y metacrilato de metilo para preparar un fármaco con recubrimiento entérico. Por lo demás, puede recubrirse con etilcelulosa, cera de carnauba o aceite hidrogenado para preparar una preparación de acción prolongada. Además, con el fin de producir un cápsula, un polvo o un granulado se introducen en una cápsula dura o el principio activo se recubre con una película de gelatina, bien directamente o después de su disolución en glicerina,

55 polietilenglicol, aceite de sésamo, aceite de oliva o similar, con lo que se produce una cápsula blanda.

[0073] Con el fin de producir una inyección, el principio activo, junto con un agente de ajuste del pH tal como ácido clorhídrico, hidróxido de sodio, lactosa, ácido láctico, sodio, monohidrogenofosfato de sodio o dihidrogenofosfato de sodio y un agente isotonizante tal como cloruro de sodio o glucosa, según sea necesario, se

disuelven en agua destilada para inyección y la disolución obtenida se somete a filtración aséptica y después se introduce en una ampolla. Por lo demás, a la disolución obtenida anteriormente pueden añadirse también manitol, dextrina, ciclodextrina, gelatina o similares y la mezcla obtenida puede someterse entonces a liofilización al vacío para preparar una inyección que se disuelve antes de su uso. Además, se añaden lecitina, polisorbato 80, aceite de

5 ricino hidrogenado polietoxilado o similares al principio activo, que se emulsiona en agua para preparar una emulsión para inyección.

[0074] Con el fin de producir un agente de administración por vía rectal, el principio activo se humedece y se funde junto con una base para supositorios tal como manteca de cacao, tri, di y monoglicérido de ácido graso o

10 polietilenglicol, y la mezcla resultante se vierte en un molde que después se enfría. Por lo demás, el principio activo puede disolverse en polietilenglicol o aceite de soja o similar y puede recubrirse después con una película de gelatina o similar.

[0075] La dosis y la frecuencia de administración del medicamento de la presente invención no están

15 particularmente limitadas. Estos factores pueden seleccionarse apropiadamente a juicio del médico, dependiendo de condiciones tales como la finalidad de prevención y/o tratamiento del deterioro y/o la progresión de la enfermedad que se trata, el tipo de enfermedad, el peso corporal y la edad del paciente y la gravedad de la enfermedad. En general, la dosis del presente medicamento es de aproximadamente 0,01 a 1.000 mg (el peso del principio activo) por adulto al día para administración por vía oral. El medicamento puede administrarse una vez o distribuirse en

20 varias administraciones al día o cada varios días. Cuando el medicamento se usa como inyección, es deseable su administración continuada o intermitente en una dosis de 0,001 a 400 mg (el peso del principio activo) por adulto al día.

[0076] El medicamento de la presente invención puede preparase como una preparación de liberación

25 mantenida, tal como un comprimido implantable y un sistema de liberación encapsulado en una microcápsula, mediante un vehículo capaz de evitar que la preparación de liberación mantenida se elimine inmediatamente del cuerpo. Algunos ejemplos del vehículo que puede usarse en este documento incluyen polímeros biodegradables y biocompatibles tales como acetato de etilenvinilo, polianhídrido, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoéster y ácido poliláctico. Tales materiales pueden ser preparados fácilmente por un experto en la materia. Además, también puede

30 usarse una suspensión de liposomas como vehículo farmacéuticamente aceptable. El tipo de liposomas útiles no está limitado. Tales liposomas se preparan como una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanol inducido por PEG (PEG-PE) mediante el paso a través de un filtro con un tamaño de poro adecuado, de modo que tienen un tamaño adecuado para su uso y después se purifican por un procedimiento de evaporación en fase inversa.

35 [0077] El medicamento de la presente invención puede prepararse como composición farmacéutica en forma de kit y puede incluirse en un recipiente o envase junto con un manual de instrucciones para su administración. Cuando la composición farmacéutica de la presente invención se proporciona en forma de kit, los distintos componentes de la composición se envasan en recipientes diferentes y se mezclan después inmediatamente antes

40 de su uso. Por lo tanto, los distintos componentes se envasan separadamente porque ello hace posible preservar los componentes activos durante un periodo de tiempo más largo sin que se pierdan las funciones de dichos componentes activos.

[0078] Un reactivo contenido en el kit se suministra en un recipiente hecho de un material que mantiene

45 eficazmente la actividad de los componentes durante un largo periodo de tiempo, no adsorbe los componentes sobre su superficie interior y no altera la calidad de los componentes. Por ejemplo, una ampolla de vidrio sellada puede comprender un tampón encerrado en presencia de un gas no reactivo neutro como nitrógeno. La ampolla está hecha de vidrio, un polímero orgánico como policarbonato o poliestireno, cerámica, metal o cualquier otro material adecuado usado comúnmente para guardar reactivos.

50 [0079] Además, el kit puede comprender también un manual de instrucciones. El manual de instrucciones para el presente kit puede estar impreso en papel y/o puede estar grabado en un soporte legible eléctrica o electromagnéticamente tal como un disco floppy (marca registrada), CD-ROM, DVD-ROM, un disco Zip, una cinta de vídeo o una cinta de audio y puede proporcionarse entonces al usuario en una forma tal. Un manual de instrucciones

55 detallado puede incluirse de hecho en el kit o puede publicarse en la página web designada por el fabricante o el distribuidor del kit o indicada a través de un correo electrónico o similar.

[0080] Además, la presente invención incluye un procedimiento para la prevención o el tratamiento de enfermedades inmunitarias relacionadas con EP4, tumores y el dolor, que comprende la administración a un

paciente y similares del medicamento o composición farmacéutica de la presente invención.

[0081] El término “tratar” se usa en este documento para indicar la inhibición o la reducción de la progresión y el deterioro del estado patológico de un mamífero que padece una enfermedad que aparece debido a una

5 anormalidad en la función de EP4 (por ejemplo, un aumento anormal de la función, etc.). Por lo tanto, este es un tratamiento llevado a cabo con el fin de inhibir o reducir la progresión y el deterioro de la enfermedad mencionada anteriormente.

[0082] Por otro lado, el término “prevenir” se usa en este documento para indicar la inhibición previa de la

10 aparición o el padecimiento de una enfermedad que aparece debido a una anormalidad en la función de EP4 (por ejemplo, un aumento anormal de la función, etc.) en un mamífero con probabilidad de padecer la enfermedad mencionada anteriormente. Por lo tanto, este es un tratamiento llevado a cabo con el fin de inhibir previamente la aparición de diversos síntomas de la enfermedad.

15 [0083] El “mamífero” que ha de tratarse indica cualquier animal dado que pertenezca a los mamíferos y el tipo de mamífero no está particularmente limitado. Algunos ejemplos de mamíferos usados en este documento incluyen humanos, animales de compañía como un perro, un gato o un conejo y animales de granja como una vaca, un cerdo, una oveja o un caballo. El “mamífero” especialmente preferido es un humano.

20 El vehículo con el anticuerpo inmovilizado de la presente invención

[0084] La presente invención incluye un vehículo con un anticuerpo inmovilizado. El vehículo con el anticuerpo inmovilizado de la presente invención está formado por la inmovilización del anticuerpo dirigido contra el EP4 humano de la presente invención en un vehículo. En una realización preferida, se permite que el vehículo con el

25 anticuerpo inmovilizado de la presente invención entre en contacto con sangre que contiene células que expresan EP4, de manera que puede usarse para eliminar las células que expresan EP4 del líquido corporal. El anticuerpo dirigido contra el EP4 humano inmovilizado en un vehículo puede ser de un solo tipo o de dos o más tipos.

[0085] Una forma específica del vehículo con el anticuerpo inmovilizado de la presente invención es, por

30 ejemplo, el anticuerpo de la presente invención inmovilizado sobre un vehículo insoluble en agua que después se introduce en un recipiente. En este documento, puede usarse todo tipo de materiales como tales vehículos insolubles en agua. Con respecto a la moldeabilidad, esterilización y baja toxicidad, los materiales preferidos incluyen: polímeros sintéticos tales como polietileno, polipropileno, poliestireno, resina acrílica, nailon, poliéster, policarbonato, poliacrilamida o poliuretano; polímeros naturales tales como agarosa, celulosa, acetato de celulosa,

35 quitina, quitosano o alginato; materiales inorgánicos tales como hidroxiapatito, vidrio, alúmina o titania; y materiales metálicos tales como acero inoxidable o titanio.

[0086] Algunos ejemplos de la forma del vehículo incluyen una forma granular, una forma floculenta, una tela tejida, una tela no tejida, una forma de esponja porosa y una forma plana. Desde el punto de vista de una gran área

40 superficial por volumen, se prefieren una forma granular, una forma floculenta, una tela tejida, una tela no tejida y una forma de esponja porosa. Por ejemplo, se suministra sangre periférica a través de un filtro poroso a un recipiente que se ha llenado previamente con un vehículo insoluble en agua con el anticuerpo inmovilizado, de manera que las células que expresan el EP4 asociado con la enfermedad pueden eliminarse eficientemente.

45 [0087] El vehículo con el anticuerpo inmovilizado de la presente invención puede combinarse con otros componentes para producir un kit para la eliminación de las células que expresan EP4. Algunos ejemplos de otros componentes incluyen un anticoagulante y un circuito de circulación extracorpórea.

Kit de diagnóstico que comprende el anticuerpo dirigido contra EP4 de la presente invención

50 [0088] El anticuerpo dirigido contra EP4 de la presente invención puede proporcionarse en forma de un kit de diagnóstico. El kit de diagnóstico de la presente invención comprende un anticuerpo y puede comprender también una sustancia marcadora o un anticuerpo secundario o una sustancia marcada del mismo. La sustancia marcada del anticuerpo indica un anticuerpo marcado con una enzima, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un

55 compuesto quimioluminiscente, etc. Además de los componentes mencionados anteriormente, el kit de diagnóstico de la presente invención puede comprender otros reactivos usados para llevar a cabo la detección de la presente invención, por ejemplo, si la sustancia marcada es una sustancia marcada con una enzima, el kit de diagnóstico puede comprender también un sustrato de la enzima (un sustrato coloreado, etc.), una disolución del sustrato de la enzima, una disolución de terminación de la reacción enzimática, un diluyente del analito y similares. Además, el

presente kit de diagnóstico puede comprender también diversos tipos de tampones, agua esterilizada, diversos tipos de recipientes de cultivo, diversos tipos de reactores (por ejemplo, tubos Eppendorf, etc.), un agente bloqueante (albúmina de suero bovino (BSA), leche desnatada y componentes del suero tales como suero de cabra), un agente de lavado, un tensioactivo, diversos tipos de placas, un agente antiséptico tal como azida de sodio, un manual de

5 operación experimental (manual de instrucciones) y similares. Algunos ejemplos del procedimiento de medición aplicado incluyen ELISA, EI, RIA, inmunoensayo de fluorescencia (FIA), inmunoensayo de luminiscencia y citometría de flujo. Entre estos procedimientos, se prefiere especialmente la citometría de flujo por su simplicidad y alta sensibilidad. Además, el kit de diagnóstico de la presente invención puede usarse en combinación con otro kit de anticuerpos que comprende un anticuerpo que reconoce un antígeno celular superficial.

10 [0089] Se permite que el kit de diagnóstico de la presente invención reaccione con las células de la sangre de un paciente que padece cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o similar, para poder detectar la proporción de células que expresan EP4 en la sangre. Mediante la combinación del presente kit de diagnóstico con otro anticuerpo dirigido contra antígenos celulares superficiales, puede detectarse la proporción de células que expresan EP4 en

15 una población celular específica (por ejemplo, células dendríticas, células TH17 o células Treg). Mediante la evaluación del aumento o la disminución de la proporción de células que expresan EP4, puede evaluarse el estado de la enfermedad.

[0090] A continuación, la presente invención se describirá con más detalle en los ejemplos siguientes.

20 Ejemplos

(1) Producción del vector de expresión del EP4 humano pcDNA-DEST40-hEP4

25 [0091] La secuencia 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGAGA-CAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC-3’ (SEQ ID NO: 30) se añadió al extremo 5’ de una secuencia que se había preparado por eliminación del codón de parada de la secuencia ORF del gen EP4 humano registrada en GenBank (n.° de acceso NM_000958) y la secuencia 5’-GACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCC-3’ (SEQ ID NO: 31) se añadió al extremo 3’ de la misma para la

30 síntesis de ADN. El ADN así sintetizado se incorporó en el vector pDONR221 (producido por Invitrogen) mediante el sistema Gateway (Invitrogen) para preparar pDONR-hEP4. La secuencia nucleotídica del inserto se determinó de acuerdo con un procedimiento habitual y se confirmó que la secuencia no contenía errores. Seguidamente, la secuencia que contenía el gen EP4 humano se incorporó en el vector pcDNA-DEST40 (producido por Invitrogen) mediante el sistema Gateway para obtener pcDNA-DEST40-hEP4. El EP4 humano expresado a partir de este

35 plásmido es una proteína de fusión con la etiqueta V5 y 6 etiquetas HIS añadidas al extremo C. El ADN plasmídico de pcDNA-DEST40-hEP4 se preparó tras la transformación de Escherichia coli (DH5α) de acuerdo con un procedimiento habitual y su posterior amplificación, mediante el kit PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep (producido por Invitrogen) de acuerdo con el manual de instrucciones incluido en el mismo.

40 (2) Preparación de células 293FT que expresan el EP4 humano

[0092] Se introdujeron 10 µg de ADN del plásmido pcDNA-DEST40-hEP4 descrito anteriormente en células 293FT (producidas por Invitrogen) sembradas en placas de cultivo celular recubiertas con 100 mm de colágeno I mediante 25 µl de Lipofectamine 2000 (producida por Invitrogen) de acuerdo con el manual de instrucciones incluido 45 con la misma. A las 24 horas de la introducción del gen, las células se lavaron con HBSS (disoluciones salinas equilibradas de Hanks, producidas por Invitrogen) y después se retiraron de la placa de cultivo celular mediante un tampón de disociación sin enzimas (producido por Invitrogen) y se recogieron por centrifugación. Las células 293FT en las que se había introducido el gen EP4 y células 293FT en las que no se había introducido el gen se sometieron a permeabilización de la membrana celular con el kit Cytofix/Cytoperm (producido por BD). Las células resultantes 50 se mezclaron con un anticuerpo dirigido contra la etiqueta V5 (producido por Invitrogen) y la mezcla se incubó a continuación (4 °C, una hora). Seguidamente, la mezcla resultante se lavó tres veces con un tampón de lavado (PBS (tampón de fosfato salino, producido por Invitrogen) con suero bovino fetal al 0,1 %) y después se tiñó con un anticuerpo dirigido contra IgG de ratón marcado con Alexa488 (producido por Invitrogen) usado como anticuerpo secundario (4 °C, una hora). Después, la mezcla resultante se lavó de nuevo tres veces con un tampón de lavado y

55 a continuación se analizó con el citómetro de flujo Quanta SC MPL (producido por BECKMAN COULTER). Como resultado, dado que la señal fluorescente de Alexa488 solo se detectó en las células 293FT en las que se había introducido el gen, pudo confirmarse que el EP4 humano se expresaba en dichas células.

[0093] Por lo tanto, estas células 293FT que expresaban el EP4 humano se usaron como antígeno

sensibilizante.

(3) Inmunización

5 [0094] La inmunización antigénica se llevó a cabo en ratones hembra del fondo genético 129/OIa de siete semanas de edad. Las células 293FT que expresaban el EP4 humano descritas anteriormente en (2) se suspendieron en una disolución salina normal y, a continuación, la suspensión se administró cinco veces por vía intraperitoneal a los ratones mencionados anteriormente con intervalos de administración de 10 a 14 días.

10 (4) Producción de hibridomas

[0095] Tres días después de la quinta inmunización, se extirpó el bazo de todos los animales y se prepararon las células esplénicas. Las células esplénicas y las células P3X63Ag8.653 de mieloma de ratón (obtenidas de la colección ECACC) se sometieron a fusión celular de acuerdo con un procedimiento habitual mediante polietilenglicol

15 4000 (producido por Merck). Las células fusionadas se suspendieron en el medio GIT (producido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) que contenía 100 unidades/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, el aminoácido no esencial L-glutamina 2 mM y el medio NCTC-109 (todos ellos producidos por Invitrogen). La suspensión obtenida se sembró seguidamente en una placa de 96 pocillos a una densidad de 100 µl/pocillo y entonces se cultivó a 37 °C con CO2 al 5 %. A partir del día siguiente a la fusión celular, el medio se sustituyó por un medio formado por la

20 adición de HAT Supplement (producido por Invitrogen) al medio mencionado anteriormente, y el cultivo se continuó durante 13 días después de la fusión. Como resultado, se obtuvo una colonia de hibridomas (aproximadamente 700 clones).

(5) Construcción de una línea celular NS0 que expresa el EP4 humano de manera estable

25 [0096] Mediante el sistema Gateway, se llevó a cabo una reacción de recombinación entre pDONR-hEP4 descrito anteriormente en (1) y el vector pEF-DEST51 (producido por Invitrogen) para obtener el plásmido pEFDEST51-hEP4. El EP4 humano expresado por este plásmido es una proteína de fusión con la etiqueta V5 y 6 etiquetas HIS añadidas al extremo C.

30 [0097] Se introdujeron 14 µg del plásmido pEF-DEST51-hEP4 en 1 x 107 células NS0 de mieloma de ratón (obtenidas del banco de células RIKEN BioResource Center) que se habían cultivado en el medio RPMI con suero bovino fetal al 10 %, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (producidas por Invitrogen), mediante 35 µl de Lipofectamine LTX (producida por Invitrogen) y 14 µl del reactivo PlusReagent (producido por

35 Invitrogen) de acuerdo con el manual de instrucciones incluido con los mismos. A partir del día siguiente a la introducción del gen, el medio se sustituyó por medio RPMI enriquecido con 2,5 µg/ml del antibiótico blasticidina (producido por Invitrogen) cada tres días y el cultivo se llevó a cabo de manera continua durante dos semanas. Las células NS0 resistentes a blasticidina se clonaron a partir de las colonias formadas de acuerdo con el procedimiento del cilindro de la penicilina.

40 [0098] Las células NS0 resistentes a blasticidina se bloquearon con FcBlock (producido por Becton, Dickinson and Company) a 4 °C durante 15 minutos y después, se confirmó la expresión de una proteína EP4 de fusión con el citómetro de flujo por el mismo procedimiento descrito anteriormente en (2). Como resultado, pudo confirmarse que las células NS0 resistentes a blastomicina expresaban el EP4 humano de manera estable.

(6) Selección de hibridomas productores de anticuerpos dirigidos contra EP4

[0099] La línea celular NS0 que expresaba EP4 de manera estable (2 x 105 células) producida anteriormente en (5) se tiñó por el mismo procedimiento descrito anteriormente en (2) y después se analizó con un citómetro de

50 flujo. No se llevó a cabo ninguna permeabilización de la membrana y como anticuerpo primario se usaron 50 µl del sobrenadante del cultivo del hibridoma obtenido anteriormente en (4). Como resultado, se observó una reacción positiva de fluorescencia de Alexa488 en los sobrenadantes en 21 pocillos. Las células en los pocillos positivos se clonaron por dilución limitante. El sobrenadante de un cultivo después de dos semanas de cultivo también se sometió a un ensayo de unión con la línea celular NS0 que expresaba el EP4 humano de manera estable con un

55 citómetro de flujo. Se volvió a repetir el mismo ensayo de clonación y unión y finalmente se obtuvieron dos clones de hibridomas productores de anticuerpos dirigidos contra EP4. Estos hibridomas se denominaron NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21.

[0100] Las células de los hibridomas obtenidos NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 se depositaron en el

International Patent Organism Depositary, en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, una institución administrativa independiente perteneciente al Ministerio de Economía, Comercio e Industria japonés, AIST Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japón (código postal: 305:8566) con los números de acceso FERM P-21978 y FERM P-21979, respectivamente, el 29 de junio de 2010 (fecha del depósito original). A

5 continuación, el depósito original se transfirió a un depósito internacional conforme a lo dispuesto en el Tratado de Budapest (fecha de notificación del “Certificado de recepción del depósito original” y del “Certificado de viabilidad”: 5 de septiembre de 2011). Los números de acceso son FERM BP-11402 y FERM BP-11403, respectivamente.

(7) Purificación del anticuerpo dirigido contra EP4

10 [0101] Para la producción de los anticuerpos, las células de los hibridomas NBG016-mAb14 y NBG016mAb21se cultivaron de manera continua en un medio CD para hibridomas sin suero (producido por Invitrogen) hasta que hubo muerto aproximadamente el 90 % de las células. Las células de 100 ml de sobrenadante del cultivo se recogieron por centrifugación (1.500 rpm, 15 minutos) y el residuo se hizo pasar a través de una columna HiTrap

15 Protein G HP (producida por GE Healthcare Japón) para purificar y concentrar las IgG. Para determinar el subtipo de IgG y el tipo de cadena ligera, las IgG así purificadas se examinaron con un kit de isotipificación de anticuerpos monoclonales de ratón Iso Strip (producido por Roche Diagnostics). Las dos resultaron ser (IgG1, κ). En lo que sigue, los términos “NBG016-mAb14" y "NBG016-mAb21” indican estos anticuerpos purificados. Cuando se usa el término “hibridoma” o “célula”, dicho término indica un hibridoma que produce estos anticuerpos.

20 [0102] Como en los casos anteriores (2), (3), (4) y (6), se obtuvieron células de hibridoma que producían un anticuerpo dirigido contra EP4 de un subtipo diferente. A partir del sobrenadante de un cultivo de este hibridoma, se obtuvo una IgG purificada, cuyo subtipo y tipo de cadena ligera era (IgG1, κ), de la misma manera que se describe anteriormente en (7). Este anticuerpo purificado se denominó NBG016-mAb9.

(8) Producción de la línea celular CHO que expresa el EP4 humano de manera estable

[0103] El gen EP4 humano se incorporó a partir de pDONR-hEP4 en el vector pEF5/FRT/V5-DEST (producido por Invitrogen) para obtener pEF-FRT-hEP4 mediante el sistema Gateway. El EP4 humano expresado por este

30 plásmido es una proteína de fusión con la etiqueta V5 y seis etiquetas HIS añadidas al extremo C.

[0104] Los plásmidos pEF-FRT-hEP4 y pOG44 (producido por Invitrogen) se introdujeron simultáneamente en células Flp-In-CHO (producidas por Invitrogen) que habían sido cultivadas en el medio F-12 de Ham (producido por Invitrogen) con suero bovino fetal al 10 %, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina, mediante

35 Lipofectamine 2000. A partir del día siguiente a la introducción del gen, el medio se sustituyó por medio F-12 de Ham enriquecido con 500 µg/ml del antibiótico higromicina (producido por Invitrogen) y las células se cultivaron durante dos semanas sustituyendo el medio por medio fresco cada tres días. A partir de las colonias formadas se clonaron células resistentes a higromicina de acuerdo con el procedimiento del cilindro de la penicilina.

40 [0105] Un anticuerpo dirigido contra IgG de ratón marcado con ficoeritrina (PE) (BECKMAN COULTER) se usó como anticuerpo secundario y se analizó la unión de las células resistentes a higromicina obtenidas a un anticuerpo dirigido contra la etiqueta V5 mediante un citómetro de flujo por el procedimiento descrito anteriormente en (2). Como resultado, las células Flp-In-CHO resistentes a higromicina obtenidas mostraron la señal positiva de PE y, por lo tanto, pudo confirmarse que las células expresaban el EP4 humano de manera estable. En lo que sigue, se

45 hace referencia a estas células como la línea celular CHO que expresa el EP4 humano de manera estable.

(9) Ensayo de unión de un anticuerpo dirigido contra el EP4 humano a células que expresan el EP4 humano

[0106] El ensayo de unión de un anticuerpo dirigido contra el EP4 humano a la línea celular CHO que

50 expresaba el EP4 humano de manera estable se llevó a cabo mediante citometría de flujo por el procedimiento descrito anteriormente en (6). Se usaron la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable o la línea parental Flp-In-CHO (5 x 105 células). Como anticuerpo primario se usó 1 µg de NBG016-mAb14, NBG016mAb21 o un anticuerpo de control de isotipo de ratón (producido por BioRegend). Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo dirigido contra IgG de ratón marcado con PE.

55 [0107] Los resultados se muestran en la figura 1. La línea celular parental Flp-In-CHO se indica con el histograma relleno de color gris, mientras que las células que expresan el EP4 humano de manera estable se indican con la línea continua negra. Los dos NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 se unen solo a la línea celular CHO que expresa el EP4 humano de manera estable. Por lo tanto, los resultados demostraron que estos anticuerpos se

unen específicamente al EP4 humano.

[0108] Igualmente, NBG016-mAb9 también se sometió a un ensayo de unión con la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable. Los resultados se muestran en la figura 2. Los resultados 5 demostraron que NBG016-mAb9 también se une específicamente al EP4 humano.

(10) Ensayo de inhibición por anticuerpos de la producción de AMPc inducida por PGE2

[0109] La línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable o la línea celular parental Flp

10 In-CHO se cultivó en un medio que contenía ácido acetilsalicílico 1 mM durante 18 horas y después se recogió de la placa de cultivo celular mediante un tampón de disociación celular. Las células recogidas se distribuyeron entonces en una placa de cultivo de 96 pocillos (producida por PerkinElmer) a una densidad de 2.500 células por pocillo. A cada pocillo se le añadió NBG016-mAb14, NBG016-mAb21 o un anticuerpo de control de isotipo de ratón en una concentración de 0,05 a 30 µg/ml y la placa se dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Seguidamente, se

15 le añadió PGE2 (producida por Cayman) a cada pocillo hasta una concentración de 5 x 10-11 M y la mezcla obtenida se dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos más. Mediante el kit LANCE Ultra para AMPc (producido por PerkinElmer) se llevó a cabo una reacción de acuerdo con el manual de instrucciones incluido en el kit. A continuación, se midió el nivel de AMPc producido en las células con el lector de placas ARVO 1420 HTS (fabricado por PerkinElmer).

20 [0110] Los resultados se muestran en la figura 3. Al añadir el anticuerpo de control de isotipo de ratón, no se obtuvo un efecto inhibidor significativo sobre el nivel de producción de AMPc inducida por PGE2. Por el contrario, al añadir NBG016-mAb14 o NBG016-mAb21, se observó un efecto inhibidor sobre la producción de AMPc de manera dependiente de la concentración del anticuerpo. Mediante el software de análisis de datos OriginPro 8.1 (producido

25 por OriginLab), se llevó a cabo un análisis de regresión logística. Como resultado, el valor de CI50 de NBG016mAb14 resultó ser 0,15 µg/ml (aproximadamente 1,0 nM) y el valor de CI50 de NBG016-mAb21 resultó ser 0,24 µg/ml (aproximadamente 1,6 nM). A partir de estos resultados, se demostró que NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 eran anticuerpos funcionales con actividad antagonista sobre el EP4 humano y que estos anticuerpos tienen una actividad inhibidora de la función del receptor que es equivalente o superior a la de las sustancias existentes (por

30 ejemplo, compuestos de bajo peso molecular) que tienen actividad antagonista sobre el EP4 humano.

[0111] Igualmente, NBG016-mAb9 también se sometió a un ensayo que implicó la adición de PGE2 1,5 x 1010 M. Los resultados se muestran en la figura 4. Como resultado del análisis descrito anteriormente, el valor de CI50 de NBG016-mAb9 resultó ser 4,6 µg/ml (aproximadamente 28,8 nM). Estos resultados demuestran que NBG016

35 mAb9 es también un anticuerpo funcional con actividad antagonista sobre el EP4 humano.

(11) Producción de vectores de expresión para EP1-4 humanos y EP1-4 de ratón.

[0112] Al extremo 5’ de una secuencia que se había formado por la eliminación de un codón de parada de la

40 secuencia ORF del EP1 humano (n.° de acceso de GenBank NM_000955), EP2 humano (n.° de acceso de GenBank NM_000956), EP3al humano (n.° de acceso de GenBank X83857), EP1 de ratón (n.° de acceso de GenBank NM_013641), EP2 de ratón (n.° de acceso de GenBank NM_008964), EP3 de ratón (n.° de acceso de GenBank NM_011196) y EP4 de ratón (n.° de acceso de GenBank NM_008965), se le añadió la secuencia CACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC (SEQ ID

45 NO: 32), para preparar un fragmento de ADN. Este fragmento de ADN se amplificó por PCR con KOD FX (producida por Toyobo Co., Ltd.) de acuerdo con un procedimiento habitual. El ADN amplificado se incorporó en el vector pENTR/D-TOPO (producido por Invitrogen) para preparar pENTR-hEP1, pENTR-hEP2, pENTR-hEP3, pENTRmEP1, pENTR-mEP2, pENTR-mEP3 y pENTR-mEP4. La secuencia nucleotídica de los insertos se determinó de acuerdo con un procedimiento habitual y se confirmó que las secuencias no incluían errores. A partir de estos siete

50 tipos de plásmidos y el plásmido pDONR-hEP4 producido anteriormente en (1), se incorporaron insertos individuales en el vector pcDNA-DEST47 (producido por Invitrogen) mediante el sistema Gateway. Como resultado, se obtuvieron los plásmidos siguientes: pcDNA-DEST47-hEP1, pcDNA-DEST47-hEP2, pcDNA-DEST47-hEP3, pcDNADEST47-hEP4, pcDNA-DEST47-mEP1, pcDNA-DEST47-mEP2, pcDNA-DEST47-mEP3 y pcDNA-DEST47-mEP4. Estos plásmidos expresan una proteína de fusión con la proteína verde fluorescente (GFP) Cycle 3 añadida al

55 extremo C de cada receptor de PGE2.

(12) Ensayo de especificidad de unión del anticuerpo dirigido contra EP4

[0113] Los plásmidos pcDNA-DEST47-hEP1, pcDNA-DEST47-hEP2, pcDNA-DEST47-hEP3, pcDNA

DEST47-hEP4, pcDNA-DEST47-mEP1, pcDNA-DEST47-mEP2, pcDNA-DEST47-mEP3 y pcDNA-DEST47-mEP4 producidos anteriormente en (11) (10 µg de cada uno) se introdujeron en células 293FT mediante Lipofectamine 2000. Al día siguiente, las células se lavaron con HBSS y se retiraron de la placa de cultivo celular mediante un tampón de disociación celular sin enzimas. Las células se recogieron después por centrifugación. Las células así

5 recogidas se denominan células 293FT que expresan EP de manera transitoria.

[0114] El ensayo de unión del anticuerpo dirigido contra EP4 de la presente invención a las células 293FT que expresaban EP de manera transitoria se llevó a cabo con un citómetro de flujo de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en (6). Se usaron las células 293FT (5 x 105 células) que expresaban transitoriamente cada

10 uno de los ocho subtipos de receptores de PGE2. Como anticuerpo primario, se usó 1 µg de los anticuerpos NBG016-mAb14 o NBG016-mAb21dirigidos contra EP4 o un anticuerpo de control de isotipo de ratón (producido por BioRegend). Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo dirigido contra IgG de ratón marcado con PE.

[0115] Como ejemplo, los resultados de NBG016-mAb14 se muestran en la figura 5. Había presentes células

15 que mostraban la señal positiva de fluorescencia derivada de GFP y, por lo tanto, pudo confirmarse que cada uno de los receptores de PGE2 se expresaba en las células 239FT. Sin embargo, entre los ocho tipos de células, las que mostraron la señal de fluorescencia de PE fueron solamente las células que expresaban el EP4 humano. Los mismos resultados se obtuvieron para NBG016-mAb21. Por lo tanto, se encontró que el anticuerpo dirigido contra EP4 de la presente invención tiene una fuerte especificidad para el EP4 humano. Se demostró que el presente

20 anticuerpo dirigido contra EP4 tiene una especificidad de unión para el subtipo de receptor de PGE2 superior a la de las sustancias existentes con actividad antagonista sobre el EP4 humano.

[0116] Igualmente, también se examinó la especificidad de unión de NBG016-mAb9. Los resultados se muestran en la figura 6. Entre los ocho tipos de células que expresaban uno cualquiera de los ocho tipos de subtipos

25 de receptores de PGE2, aquellos que mostraron una señal positiva de fluorescencia de PE fueron solamente las células que expresaban el EP4 humano. A partir de estos resultados se encontró que NBG016-mAb9 también tiene una fuerte especificidad para el EP4 humano.

(13) Ensayo de unión con linfocitos humanos y el anticuerpo dirigido contra EP4

30 [0117] Se descongelaron células mononucleares de sangre periférica humanas congeladas (producidas por Cellular Technology Ltd.) con el aditivo CTL-Anti-Aggregate-Wash (producido por Cellular Technology Ltd.), de acuerdo con el manual de instrucciones incluido con el mismo.

35 [0118] El ensayo de unión del anticuerpo dirigido contra EP4 de la presente invención a linfocitos humanos se llevó a cabo con un citómetro de flujo de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en (6). Las células mononucleares de sangre periférica humanas (9 x 105 células) se mezclaron con 1,5 µg de NBG016-mAb14, NBG016-mAb21 o un anticuerpo de control de isotipo de ratón, respectivamente, como anticuerpo primario y después se mezclaron con un anticuerpo dirigido contra IgG de ratón marcado con Alexa488 como anticuerpo

40 secundario. Al llevar a cabo el análisis con el citómetro de flujo, la población celular se dividió en una subpoblación de linfocitos y una subpoblación de monocitos/macrófagos a partir de las gráficas de puntos de la luz dispersada hacia delante y la luz dispersada lateralmente y entonces se examinó la intensidad de la fluorescencia de Alexa488 de la subpoblación de linfocitos.

45 [0119] Los resultados del análisis con el citómetro de flujo se muestran en la figura 7. Los resultados del anticuerpo de control de isotipo de ratón se muestran en el histograma relleno de color gris, mientras que los resultados del anticuerpo dirigido contra EP4 se muestran con la línea continua negra. Dado que la mayor parte de la subpoblación de linfocitos humanos mostró una señal positiva de fluorescencia de Alexa488 solo en el caso de la reacción de los linfocitos humanos con el anticuerpo dirigido contra EP4, se encontró que los linfocitos humanos se

50 unían al anticuerpo dirigido contra EP4. A partir de estos resultados, fue evidente que el anticuerpo dirigido contra EP4 de la presente invención tiene capacidad de unirse al EP4 endógeno humano.

[0120] Igualmente, NBG016-mAb9 también se sometió a un experimento de confirmación de la unión con linfocitos humanos. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humanas a partir de sangre periférica 55 humana fresca mediante Lymphoprep (producido por AXIS SHIELD) de acuerdo con el manual de instrucciones incluido con el mismo y, a continuación, se separó una fracción celular negativa para CD14 mediante microesferas AntiHuman CD14 (producidas por Milteny Biotec), que se usó como subpoblación de linfocitos humanos. El experimento subsiguiente de confirmación de la unión se llevó a cabo según se describe anteriormente, con un anticuerpo dirigido contra IgG de ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (producido por BECKMAN

COULTER) como anticuerpo secundario. Según se muestra en la figura 8, la mayoría de los linfocitos humanos se unió a NBG016-mAb9 y, por lo tanto, se encontró que NBG016-mAb9 también podía unirse al EP4 endógeno humano.

5 (14) Inmunotinción de células THP1 estimuladas por PMA con el anticuerpo dirigido contra EP4

[0121] La línea celular monocítica humana THP1 se sembró en un portaobjetos de cultivo con cuatro pocillos (producido por Becton, Dickinson and Company) a una densidad de 1,5 x 105 células por pocillo en un medio RPMI que contenía PMA (12-miristato, 13-acetato de forbol, producido por Sigma-Aldrich) 100 mM y se cultivó durante tres 10 días, de manera que las células se diferenciaron en células similares a macrófagos. Después de retirar el medio, las células se lavaron tres veces con PBS y después se inmovilizaron con 200 µl de una disolución de paraformaldehído al 1 % (en la que las células se dejaron a 4 °C durante 30 minutos). Las células se volvieron a lavar tres veces con PBS. A continuación, se añadieron 300 µl de BSA al 1 % (albúmina de suero bovino, producida por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) con 1 mg/ml de gammaglobulina humana (producida por Wako Pure Chemical Industries, 15 Ltd.) a las células resultantes para bloquearlas (y las células se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos). Posteriormente, las células resultantes se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween 20 (producido por MP-Bio) al 0,1 % (denominado en adelante tampón de lavado para inmunotinción). A continuación, se añadieron a las células 200 µl de NBG016-mAb14, NBG016-mAb21 o un anticuerpo de control de isotipo de ratón que se habían ajustado a 1 mg/ml y la mezcla obtenida se incubó a 4 °C durante una hora. Seguidamente, la mezcla

20 resultante se lavó tres veces con el tampón de lavado para inmunotinción y después se tiñó con un anticuerpo dirigido contra IgG de ratón marcado con FITC usado como anticuerpo secundario (4 °C, una hora). El portaobjetos se lavó tres veces con el tampón de lavado para inmunotinción y finalmente se selló con el medio de montaje VECTASHIELD (producido por Vector Laboratories) que contenía yoduro de propidio (PI). El portaobjetos preparado se observó con un microscopio de fluorescencia.

25 [0122] Las imágenes de microscopía de fluorescencia de las células THP1 teñidas se muestran en la figura 9. La vista izquierda es una imagen teñida con el anticuerpo de control de isotipo, en la que solo puede observarse el núcleo celular (gris) teñido con PI en el centro. La vista derecha es una imagen de tinción con el anticuerpo dirigido contra EP4, en la que se observa fluorescencia de FITC (blanca) en estado granular rodeando al núcleo celular. A

30 partir de estos resultados se encontró que el anticuerpo de la presente invención se une al EP4 nativo en la superficie de la membrana celular de las células similares a macrófagos diferenciadas a partir de la línea celular THP1 por la acción de PMA.

(15) Inhibición del efecto supresor de citocinas de PGE2 por el anticuerpo dirigido contra EP4.

35 [0123] Se sabe que PGE2 suprime, a través de EP4 o EP2, la producción de citocinas estimulada por LPS en micrófagos. Se examinó si el anticuerpo de la presente invención era capaz o no de revertir la supresión de la producción de citocinas por parte de PGE2 mediante células THP1 diferenciadas por PMA que expresaban el receptor EP4. La línea celular THP1 se sembró en una placa de cultivo de 48 pocillos a una densidad de 2,5 x 105

40 células por pocillo en medio RPMI que contenía PMA 100 nM. Después de llevar a cabo el cultivo durante tres días, el medio se sustituyó por medio RPMI que contenía 3,0 µg/ml de NBG016-mAb14, NBG016-mAb21 o un anticuerpo de control de isotipo de ratón y la mezcla obtenida se incubó después durante 30 minutos. Seguidamente, a la mezcla resultante se le añadió PGE2 en una concentración de 20 nM y la mezcla obtenida se siguió incubando durante 30 minutos. Después, a la mezcla resultante se le añadió LPS en una concentración de 100 ng/ml y la

45 mezcla obtenida se cultivó durante 18 horas más. A continuación, se recogió el sobrenadante del cultivo y se midió la cantidad de THFα en dicho sobrenadante del cultivo mediante el kit TNFα Human DuoSet (producido por R & D Systems) de acuerdo con el manual de instrucciones incluido en el mismo.

[0124] Entretanto, después de recoger el sobrenadante del cultivo, se añadieron 0,5 ml de AlamarBlue

50 (producido por MorphoSys) diluido 10 veces en volumen con el medio RPMI a las células. La mezcla obtenida se incubó durante cuatro horas y después se midió la intensidad de la fluorescencia con el lector de placas ARVO 1420 HTS en las condiciones siguientes: una longitud de onda de excitación de 535 nm y una longitud de onda de detección de 595 nm. A partir de los resultados de las mediciones con AlamarBlue, se obtuvo la relación de los recuentos relativos de células supervivientes entre los pocillos individuales y se calculó la cantidad de TNFα

55 producido por relación de recuento de células supervivientes. El grado en que el anticuerpo de la presente invención era capaz de revertir la supresión de la producción de citocinas por PGE2 se calculó a partir del siguiente estándar. Específicamente, la cantidad de TNFα en un pocillo en el que solo se había aplicado la estimulación con LPS se definió como un porcentaje de recuperación del 100 % y la cantidad de TNFα en un pocillo en el que se había aplicado la estimulación con LPS y PGE2 se definió como un porcentaje de recuperación del 0 %. En tales

condiciones, se obtuvo el porcentaje de recuperación en el caso de aplicación de la estimulación con LPS, PGE2 y el presente anticuerpo.

[0125] Los resultados del ensayo se muestran en la tabla 1. Al añadir el anticuerpo de control de isotipo de

5 ratón, no se obtuvo ningún cambio en la supresión de la producción de TNFα por PGE2. Sin embargo, se encontró que al añadir NBG016-mAb14 o NBG016-mAb21 la producción de TNFα suprimida por PGE2 se recuperaba hasta aproximadamente el 50 %. Los mismos resultados se obtuvieron en dos ensayos independientes. A partir de estos resultados, fue evidente que NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 son anticuerpos funcionales con actividad antagonista sobre el EP4 endógeno humano.

10 [Tabla 1] Ensayo 1

LPS

PGE2 Anticuerpo (3,0 µg/ml) Nivel de TNFα ± DE (pg/ml) Tasa de recuperación ± DE (%)

-

-

-

177,1

+

- - 550,0 ± 21,8

+

+

- 286,1 ± 16,7

+

+

NBG016-mAb14 423,4 ± 33,95 2,0 ± 12,9

+

+

NBG016-mAb 211 ± 48,1 69,3 ± 18,2

+

+

control de isotipo 275,9 ± 11,1 -3,9 ± 4,2

Ensayo 2

Tasa de

Anticuerpo (3,0 Nivel de TNFα ± DE

LPS PGE2 recuperación ± DE

µg/ml) (pg/ml)

(%)

--

68,2 ± 8,5 + --403,5 ± 37,1 + --166,8 ± 15,7 + + NBG016-mAb1 4281,5 ± 10,7 48,5 ± 4,5 + + NBG016-mAb21 286,1 ± 19,5 50,4 ± 8,3 + + control de isotipo 148,9 ± 15,4 -7,6 ± 6,5

(16) Aislamiento y análisis del ADNc codificante de la región variable del anticuerpo dirigido contra EP4

[0126] Se aisló el ARN total de aproximadamente 1 x 107 células de hibridomas productores de anticuerpos dirigidos contra EP4 (NBG016-mAb14 y NBG016-mAb14) mediante el kit Rneasy Mini (producido por QIAGEN) de 20 acuerdo con el manual de instrucciones incluido en el kit. Se llevó a cabo una PCR de acuerdo con un procedimiento 5’-RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc) mediante un kit 5’/3’ RACE de 2.a generación (producido por Roche Diagnostics) para amplificar la región variable de la cadena pesada o de la cadena ligera. Como cebadores 3’ se usaron cebadores correspondientes a las regiones constantes γ1y κ de ratón. Es decir, los cebadores 3’ usados para amplificar la región variable de la cadena pesada fueron 5’-AGGGGCCAGTGGATAGACCGATG-3’ (SEQ ID 25 NO: 33) y 5’-GGCTGTTGTTTTGGCTGCAGAGAC-3’ (SEQ ID NO: 34). Por otra parte, los cebadores 3’ usados para amplificar la región variable de la cadena pesada fueron 5’-ACTGGATGGTGGGAAGATGGATAC-3’ (SEQ ID NO: 35) y and 5’-TGGATACAGTTGGTGCAGCATCAG-3’ (SEQ ID NO: 36). A continuación, los fragmentos amplificados obtenidos se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa y se extrajeron las bandas obtenidas. El ADN se purificó por fusión del gel. El ADN purificado se incorporó en el vector T pMD20 (producido por Takara Bio Inc.). 30 Seguidamente, se analizó la secuencia nucleotídica y después se determinó su secuencia aminoacídica. La reacción de secuenciación se llevó a cabo con los kits de reacciones listas para secuenciación cíclica ABI Prism BigDye Terminator, versión 3.1 (Applied Biosystems) y la secuencia nucleotídica se determinó mediante un analizador genético Applied Biosystems 3130x1 (Applied Biosystems). Como resultado del análisis de la secuencia nucleotídica, la secuencia de ácido nucleico codificante de la región variable de la cadena pesada de NBG016

35 mAb14 fue según se muestra en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de ácido nucleico codificante de la región variable de la cadena ligera del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 3. Además, la secuencia aminoacídica de la región variable de la cadena pesada del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 2 y la secuencia aminoacídica de la región variable de la cadena ligera del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 4.

40 [0127] Asimismo, la secuencia de ácido nucleico codificante de la región variable de la cadena pesada de NBG016-mAb21 fue según se muestra en SEQ ID NO: 11 y la secuencia de ácido nucleico codificante de la región

variable de la cadena ligera del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 13. Además, la secuencia aminoacídica de la región variable de la cadena pesada del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 12 y la secuencia aminoacídica de la región variable de la cadena ligera del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 14.

5 [0128] A partir de los resultados descritos anteriormente, se clarificaron las secuencias aminoacídicas de las regiones CDR definidas por Kabat y col. ((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU., Oficina de Impresión del Gobierno de los EE. UU.).

[0129] Las secuencias CDR1-3 de la cadena pesada de NBG016-mAb14 fueron SEQ ID NO: 5 a 7,

10 respectivamente. Las secuencias CDR1-3 de la cadena ligera del mismo fueron SEQ ID NO: 8 a 10, respectivamente. Adicionalmente, las secuencias CDR1-3 de la cadena pesada de NBG016-mAb21 fueron SEQ ID NO: 15 a 17, respectivamente. Las secuencias CDR1-3 de la cadena ligera del mismo fueron SEQ ID NO: 18 a 20, respectivamente. Las secuencias CDR de la cadena pesada de los dos clones fueron totalmente idénticas entre sí.

15 [0130] Con respecto igualmente a NBG016-mAb9, la región variable de la cadena pesada se amplificó con los cebadores mostrados en SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 y la región variable de la cadena ligera se amplificó con los cebadores mostrados en SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Después se determinaron las secuencias de las regiones variables. La secuencia de ácido nucleico codificante de la región variable de la cadena pesada de NBG016-mAb9 fue según se muestra en SEQ ID NO: 41 y

20 la secuencia de ácido nucleico codificante de la región variable de la cadena ligera del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 42. Adicionalmente, la secuencia aminoacídica de la región variable de la cadena pesada fue según se muestra en SEQ ID NO: 43 y la secuencia aminoacídica de la región variable de la cadena ligera del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 44.

25 [0131] Las secuencias CDR1-3 de la cadena pesada de NBG016-mAb9 fueron SEQ ID NO: 45 a 47, respectivamente. Las secuencias CDR1-3 de la cadena ligera del mismo fueron SEQ ID NO: 48 a 50, respectivamente.

(17) Clonación de los genes del anticuerpo dirigido contra EP4

30 [0132] Mediante el uso de un cebador de oligo-dT incluido en un kit de síntesis de la primera hebra de ADNc para RT-PCR (AMV) (producido por Roche Diagnostics), se sintetizó ADNc de acuerdo con el manual de instrucciones incluido en el mismo. Usando el ADNc sintetizado como molde, se amplificaron por PCR los genes de longitud completa de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo dirigido contra EP4 de la presente invención. Las

35 regiones 5’-terminales de las cadenas pesada y ligera se diseñaron usando la secuencia nucleotídica determinada por 5’-RACE como referencia, mientras que las regiones 3’-terminales de las mismas se diseñaron usando una secuencia específica de la región constante como referencia. El cebador 5’ usado para amplificar el gen de la cadena pesada fue 5’-CACTGACCCTACGCGTATGGAATGGAGATGGATCTTTCTCTTC-3’ (SEQ ID NO: 37) y el cebador 3’ para dicha amplificación fue 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAG-3’ (SEQ

40 ID NO: 38). Los cebadores 5’ usados para amplificar la región variable de la cadena ligera fueron 5’-TTGCAGCC-AGGAACGCGTATGGACATGAGGACCCCTGCT-3’ (SEQ ID NO: 39) y 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAACAC-TCATTCCTGTTGAAGCT-3’ (SEQ ID NO: 40). Los fragmentos de amplificación de las cadenas pesada y ligera obtenidos se cortaron con las enzimas de restricción MluIy NotI. Después, la cadena pesada se insertó en pEHX1.1 (producido por Toyobo Co., Ltd.) y la cadena ligera se insertó en el sitio MluI-NotI de pELX2.1 (producido por

45 Toyobo Co., Ltd.). A continuación, se analizaron sus secuencias nucleotídicas y después se determinaron las secuencias aminoacídicas de las mismas.

[0133] Como resultado del análisis de las secuencias nucleotídicas, la secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena pesada de NBG016-mAb14 fue según se muestra en SEQ ID NO: 22 la secuencia de ácido nucleico

50 codificante de la cadena ligera del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 24. Además, la secuencia aminoacídica de la cadena pesada del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 23 y la secuencia aminoacídica de la cadena ligera del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 25.

[0134] Asimismo, la secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena pesada de NBG016-mAb21 fue

55 según se muestra en SEQ ID NO: 26 la secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena ligera del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 28. Además, la secuencia aminoacídica de la cadena pesada del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 27 y la secuencia aminoacídica de la cadena ligera del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 29.

[0135] Las secuencias aminoacídicas de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera fueron idénticas a las secuencias aminoacídicas analizadas por el procedimiento 5’-RACE anteriormente descrito.

[0136] Con respecto igualmente a NBG016-mAb9, se sintetizó ADNc de acuerdo con el procedimiento

5 descrito anteriormente y, usando el ADNc sintetizado como molde, se amplificaron por PCR los genes de longitud completa de las cadenas pesada y ligera de NBG016-mAb9. El cebador 5’ usado para amplificar el gen de la cadena pesada fue 5’-CACTAGAGCCCCCATACGCGTATGGCTGTCCTGGTGCTGTTCC-3’ (SEQ ID NO: 51) y el cebador 3’ para dicha amplificación fue 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGAGTGGGAGAG-3’ (SEQ ID NO: 52). Los cebadores 5’ usados para amplificar el gen de la cadena ligera fueron 5’-TCCTCAGGTTGC

10 CTCACGCGTAT-GAAGTTGCCTGTTAG-3’ (SEQ ID NO: 53) y 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAACACTCATTCC-TGTTGAAGCT-3’ (SEQ ID NO: 40). Los fragmentos de amplificación de las cadenas pesada y ligera obtenidos se cortaron con las enzimas de restricción MluIy NotI. Después, la cadena pesada se insertó en pEHX1.1 (producido por Toyobo Co., Ltd.) y la cadena ligera se insertó en el sitio MluI-NotI de pELX2.1 (producido por Toyobo Co., Ltd.). A continuación, se analizaron sus secuencias nucleotídicas y después se determinaron las secuencias

15 aminoacídicas de las mismas.

[0137] La secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena pesada de NBG016-mAb9 fue según se muestra en SEQ ID NO: 54 y la secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena ligera del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 55. Además, la secuencia aminoacídica de la cadena pesada del mismo fue según se

20 muestra en SEQ ID NO: 56 y la secuencia aminoacídica de la cadena ligera del mismo fue según se muestra en SEQ ID NO: 57.

(18) Confirmación de que las secuencias génicas de anticuerpo obtenidas codifican el anticuerpo dirigido contra EP4.

25 [0138] Los anticuerpos recombinantes de NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 se produjeron mediante el sistema Mammalian PowerExpress (producido por Toyobo Co., Ltd.). Esto es, pELX2.1, en el que se había insertado el gen de la cadena ligera, se cortó con las enzimas de restricción EcoRIy BglII y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa para purificar un fragmento que comprendía el gen de la cadena ligera. El fragmento con el gen de la

30 cadena ligera purificado se insertó en el sitio EcoRI-BglII de pEHX1.1, en el que se había insertado el gen de la cadena pesada, para producir un plásmido con los genes de la dos cadenas, pesada y ligera. Este plásmido se introdujo en células 293FT mediante Lipofectamine 2000, de modo que las células expresaran el anticuerpo de manera transitoria.

35 [0139] A las 72 horas de llevar a cabo la transducción, se recogió el sobrenadante del cultivo celular, que después se sometió a un ensayo de unión a la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable por citometría de flujo, de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en (6). Como control se usó el sobrenadante de un cultivo de células 293FT sin genes de anticuerpos introducidos. Como resultado, los anticuerpos recombinantes NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 secretados en el sobrenadante de un cultivo tal mantuvieron la

40 capacidad de unirse al EP4 humano. A partir de estos resultados, pudo confirmarse que las secuencias génicas de anticuerpo obtenidas anteriormente en (17) codifican el anticuerpo dirigido contra EP4.

[0140] También se produjo un anticuerpo recombinante de NBG016-mAb9 por el procedimiento descrito anteriormente. Esto es, pELX2.1, en el que se había insertado el gen de la cadena ligera, se cortó con las enzimas

45 de restricción SalIy SpeI y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa para purificar un fragmento que comprendía el gen de la cadena ligera. El fragmento con el gen de la cadena ligera purificado se insertó en el sitio SalI-SpeI de pEHX1.1, en el que se había insertado el gen de la cadena pesada, para producir un plásmido con los genes de las dos cadenas, pesada y ligera. Este plásmido se introdujo en células 293FT, de modo que las células expresaran el anticuerpo de manera transitoria.

50 [0141] A las 72 horas de llevar a cabo la transducción, se recogió el sobrenadante del cultivo celular, que después se sometió a un ensayo de unión con la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable por citometría de flujo de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en (6). Como control se usó el sobrenadante de un cultivo de células 293FT en las que no se había introducido ningún gen. Los resultados se

55 muestran en la figura 10. En la figura 10, la línea parental Flp-In-CHO se indica con el histograma relleno de color gris, mientras que la línea células CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable se indica con la línea negra continua. Dado que el anticuerpo recombinante NBG016-mAb9 secretado en el sobrenadante del cultivo mantuvo la capacidad de unirse al EP4 humano, pudo confirmarse que las secuencias génicas de NBG016-mAb19 obtenidas anteriormente en (17) codifican el anticuerpo dirigido contra EP4.

(19) Producción de células CHO que expresan el anticuerpo recombinante dirigido contra EP4 de manera estable

[0142] Un vector que comprendía los genes de las cadenas pesada y ligera de NBG016-mAb14 o NBG016

5 mAb21, respectivamente, producido anteriormente en (18), se cortó con la enzima de restricción SspI y después se purificó por precipitación con etanol. El material resultante se transdujo en células CHO-K1 (banco de células RIKEN BioResource Center) mediante Lipofectamine 2000 y las células obtenidas se cultivaron después en el medio F-12 de Ham con suero bovino fetal al 10 % durante 24 horas. A las 24 horas, el medio mencionado anteriormente se sustituyó por otro medio F-12 de Ham con suero bovino fetal al 10 % y 10 µg/ml de puromicina y después las células

10 se cultivaron durante 12 días, sustituyendo el medio por medio fresco cada tres días. A los 12 días se separó una colonia por el procedimiento del cilindro de la penicilina.

[0143] Las células CHO-K1 separadas se sembraron en una placa de 24 pocillos y se cultivaron en el medio F-12 de Ham con 10 µg/ml de puromicina durante tres días. A los tres días, el medio se sustituyó por otro medio F

15 12 de Ham con 10 µg/ml de puromicina (al que no se había añadido suero bovino fetal) y el cultivo se siguió llevando a cabo durante 72 horas. A continuación se recogió el sobrenadante del cultivo.

[0144] La IgG de ratón en el sobrenadante del cultivo se detectó mediante ELISA. Se prepararon una serie de diluciones del sobrenadante del cultivo en PBS que después se distribuyeron en una placa Maxisorp de 96 pocillos 20 (producida por Nunc) y se dejaron a 4 °C durante la noche. Al día siguiente se añadió al cultivo PBS con BSA (producido por Sigma) al 3 % y la mezcla obtenida se dejó una hora a temperatura ambiente para el bloqueo. La mezcla resultante se lavó con PBS que contenía Tween 20 al 0,1 % y se le añadió un anticuerpo dirigido contra IgG de ratón marcado con peroxidasa de rábano (HRP) (producido por Millipore ) diluido 4.000 veces con PBS con BSA al 1 %. La mezcla obtenida se dejó a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, el producto de la 25 reacción se lavó con BPS con Tween 20 al 0,1 % y después se le añadieron 100 µl del reactivo colorante (substrato de la peroxidasa Sureblue TMB microwell, producido por Kirkegaard & Perry Laboratories). La mezcla obtenida se dejó a temperatura ambiente durante cinco minutos y después se le añadieron 100 µl de ácido sulfúrico 1 N para terminar la reacción. A continuación, se midió la absorbancia a 450 nm. Como resultado, se confirmó la expresión de la IgG en el sobrenadante de un cultivo de células CHO-K1 establecido por introducción de un vector que

30 comprendía los genes de las cadenas pesada y ligera.

(20) Ensayo de unión de los anticuerpos recombinantes dirigidos contra EP4 a la línea celular CHO que expresa el EP4 humano de manera estable

35 [0145] Los anticuerpos recombinantes NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 se purificaron a partir del sobrenadante de un cultivo de la línea celular establecida anteriormente en (19) de la misma manera que anteriormente en (7). Con cada uno de los anticuerpos recombinantes dirigidos contra EP4 purificados obtenidos se llevó a cabo un ensayo de unión a la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable mediante un citómetro de flujo por el procedimiento descrito anteriormente en (6). El anticuerpo recombinante dirigido contra

40 EP4 purificado o el anticuerpo de control de isotipo de ratón se usaron en una cantidad de 1 µg por 5 x 105 células. Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo dirigido contra IgG de ratón marcado con PE.

[0146] Los resultados se muestran en la figura 11. La línea celular parental Flp-In-CHO se indica con el histograma relleno de color gris, mientras que la línea celular CHO que expresaba EP4 de manera estable se indica

45 con la línea negra continua. Tanto el anticuerpo recombinante NBG016-mAb14 como el anticuerpo recombinante NBG016-mAb21 solo se unieron a la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable. Como resultado, se confirmó que los anticuerpos recombinantes dirigidos contra EP4 purificados mantenían la capacidad de unirse al EP4 humano.

50 (21) Vector de expresión para el anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21

[0147] La subclase del NBG016-mAb21 purificado anteriormente en (7) era IgG2a. Por lo tanto, la subclase del NBG016-mAb21 se modificó a IgG1 para producir el anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21. El anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 se produjo de la manera siguiente por PCR solapante. El gen de la región variable de 55 NBG016-mAb21 se amplificó por PCR usando el gen de la cadena pesada de NBG016-mAb21 como molde y además las secuencias 5’-CACTGACCCTACGCGTATGGAATGGAGATGGATCTTTCTCTTC-3’ (SEQ ID NO: 37) y 5’-GACAGATGGGGGTGTCGTTTTAGCGCTAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3’ (SEQ ID NO: 58). Al mismo tiempo, usando el ADNc sintetizado a partir del ARN total de un hibridoma que producía IgG1 de ratón como molde y además las secuencias 5’-GGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGCGCTAAAACGACACCCCCATCTGTC-3’ (SEQ ID

NO: 59) y 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAG-3’ (SEQ ID NO: 38), se amplificó por PCR una porción de IgG1 de ratón que se extendía desde CH1 hasta la región constante. El gen de la región variable de la cadena pesada así amplificado se mezcló con el fragmento amplificado CH1-región constante del gen y la mezcla obtenida se amplificó seguidamente por PCR con los cebadores SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38. El

5 fragmento así amplificado se cortó con las enzimas de restricción MluIy NotI y el fragmento cortado se insertó seguidamente en el sitio MluI-NotI del vector de expresión pEHX1.1. El vector de expresión obtenido se cortó con las enzimas de restricción EcoRIy BglII y después se insertó aquí un fragmento del gen de la cadena ligera (fragmento EcoRI-BglII) de NBG016-mAb21 para producir un vector de expresión para el anticuerpo IgG1 de ratón NBG016mAb21.

(22) Procedimiento para la producción de una línea celular que expresa el anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 de manera estable

[0148] Se distribuyeron células CHO-K1 flotantes (producidas por Toyobo Co., Ltd.) (2,5 x 105 células/ml)

15 cultivadas en el medio EXCELL CD CHO (producido por SAFC Bioscience) con glutamina 8 mM en una cantidad de 1 ml en cada uno de dos pocillos de una placa de 24 pocillos. A continuación, se mezclaron 136 µl de Opti-MEM, 15 µl de Lipofectamine 2000 y 4 µg del vector de expresión del anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 cortado con la enzima de restricción SspI y la mezcla obtenida se dejó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Seguidamente, el producto de la reacción se añadió en una cantidad de 68 µl a cada uno de los pocillos que contenían CHO-K1 y la

20 mezcla obtenida se incubó después en un incubador de CO2 durante 24 horas. A las 24 horas, las células se suspendieron en 8 ml del medio EXCELL CD CHO con glutamina 8 mM y la suspensión obtenida se distribuyó en una cantidad de 4 ml en cada uno de dos pocillos de una placa de seis pocillos. A continuación se añadieron 3 µl de puromicina a 10 mg/ml a un pocillo y 4 µl de puromicina a 10 mg/ml al otro pocillo. Las células se cultivaron durante 18 días con una sustitución del medio por medio fresco cada tres o cuatro días. Seguidamente se recogieron las

25 células proliferantes del pocillo y las células recogidas se suspendieron en medio acondicionado (un medio que contenía por ml: 700 ml de EXCELL CD CHO, 300 ml del sobrenadante de un cultivo de las células CHO-K1 y 1 ml o 0,75 ml de puromicina a 10 mg/ml). La suspensión obtenida se distribuyó en una cantidad de 200 µl en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Una semana después, se añadieron 100 µl del medio acondicionado y la mezcla obtenida se cultivó durante una semana más. A continuación, las células se subcultivaron varias veces y después se

30 añadieron 500 µl de células resistentes al fármaco (4 x 104 células/ml) a una placa de 24 pocillos que se cultivó durante cinco días. A los cinco días se cuantificó la cantidad de anticuerpo en el sobrenadante del cultivo mediante un kit de EIA para IgG de ratón (producido por Takara Bio Inc.) y se seleccionaron las células productoras del anticuerpo. Las células así obtenidas se definieron como la línea celular CHO que expresaba el anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 de manera estable.

(23) Purificación del anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21

[0149] La línea celular CHO que expresaba el anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 de manera estable se cultivó en el medio EXCELL CD CHO con glutamina 8 mM y 7,5 µg/ml de puromicina durante 10 días para

40 permitirle producir el anticuerpo. A partir de 200 ml de sobrenadante de este cultivo se obtuvo una IgG purificada de la misma manera que se describe anteriormente en (7). En lo que sigue, la IgG purificada obtenida se denomina como el anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21.

(24) Ensayo de unión del anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 al EP4 humano

45 [0150] Se llevó a cabo un ensayo de unión del anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 a la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable del mismo modo que se describe anteriormente en (9). Los resultados se muestran en la figura 12(A) La línea parental Flp-In-CHO se indica con el histograma relleno de color gris, mientras que la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable se indica con la línea

50 negra continua. El anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 se unió solo a la línea celular que expresaba el EP4 humano de manera estable. Como resultado, se confirmó que el anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 mantenía la capacidad de unirse al EP4 humano.

(25) Ensayo de inhibición de la producción de AMPc inducida por PGE2 por el anticuerpo IgG1 de ratón NBG01655 mAb21

[0151] Se examinó si la producción de AMPc inducida por PGE2 sería inhibida o no por el anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 de la misma manera que se describe anteriormente en (10). Se permitió que las células reaccionaran con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 15 minutos y después se añadió PGE2 a la mezcla

de reacción a una concentración de 1,5 x 10-10 M. La mezcla así obtenida se dejó a temperatura ambiente durante otros 30 minutos. Para medir el nivel de AMPc, se llevó a cabo una reacción con el kit LANCE Ultra para AMPc (producido por PerkinElmer) de acuerdo con el manual de instrucciones incluido en dicho kit.

5 [0152] Los resultados se muestran en la figura 12(B). Al añadir un anticuerpo de control de isotipo no se obtuvo ningún efecto inhibidor significativo sobre el nivel de producción de AMPc inducido por PGE2. Por el contrario, al añadir el anticuerpo IgG1 de ratón NBG016-mAb21 se observó un efecto inhibidor de la producción de AMPc de manera dependiente de la concentración. El valor de CI50 resultó ser de 1,1 µg/ml (aproximadamente 6,9 nM). A partir de estos resultados, se demostró que incluso si NBG016-mAb21 se modificaba a un anticuerpo IgG1 de ratón,

10 podría mantener su actividad antagonista sobre EP4.

(26) Producción de los anticuerpos quiméricos humanos NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21

[0153] Mediante el sistema Mammalian PowerExpress (producido por Toyobo Co., Ltd.), se produjeron

15 anticuerpos quiméricos humanos en los que la región CH1 y la región constante de NBG016-mAb14 o NBG016mAb21 se habían sustituido por las del gen de un anticuerpo humano. El gen de la región variable de la cadena pesada de cada uno de NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 se amplificó por PCR con las secuencias 5’-CACTGACCCTAAGCTTATGGAATGGAGATGGATCTTTCTCTTC-3’ (SEQ ID NO: 60) y 5’-GGCTGTTGTGCTAG-CTGCAGAGACAGTGACCAGAGT-3’ (SEQ ID NO: 61). El fragmento del gen de la cadena pesada obtenido se cortó

20 con las enzimas de restricción HindIII y NheI y el fragmento cortado se insertó seguidamente en el sitio HindIII-NheI del vector de expresión pEHγX1.1. Al mismo tiempo, el gen de la región variable de la cadena ligera de cada uno de NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 se amplificó por PCR con las secuencias 5’-ATTGCAGCC-AGGAGAATTCATGGACATGAGGACCCCTGCT-3’ (SEQ ID NO: 62) y 5’-GGTGCAGCATCCGTACGTTTTATT-TCCAACTTTGTCCCC-3’ (SEQ ID NO: 63). El fragmento del gen de la cadena ligera obtenido se cortó con las

25 enzimas de restricción BsiWI y EcoRI y el fragmento cortado se insertó seguidamente en el sitio BsiWI-EcoRI del vector de expresión pELκX2.1.

[0154] El plásmido pELκX2.1 con el gen de la cadena ligera insertado se cortó con las enzimas de restricción BglII, NotIy ScaI y el fragmento cortado se sometió a electroforesis en un gel de agarosa para purificar el fragmento

30 que contenía el gen de la cadena ligera. El fragmento del gen de la cadena ligera purificado se incorporó en el sitio BgIII-NotI de pEHγX1.1, en el que se había insertado el gen de la cadena pesada, con lo que se produjo un plásmido que mantenía los genes de las dos cadenas, ligera y pesada. Este plásmido se introdujo en células 293FT mediante Lipofectamine 200 de modo que las células expresaran el anticuerpo de manera transitoria.

35 [0155] A las 72 horas de llevar a cabo la introducción, se recogió el sobrenadante del cultivo celular, que después se sometió a un ensayo de unión a la línea celular CHO que expresaba el EP4 humano de manera estable por citometría de flujo, de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en (6). Como control se usó el sobrenadante de un cultivo de células 293FT sin genes introducidos. Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo dirigido contra IgG humana marcado con PE (producido por Abcam). Los resultados se muestran en la

40 figura 13. En la figura 13, la línea celular parental Flp-In-CHO se indica con el histograma relleno de color gris, mientras que la línea celular que expresaba el EP4 humano de manera estable se indica con la línea negra continua. A partir de los resultados mostrados en la figura, pudo confirmarse que los anticuerpos quiméricos humanos NBG016-mAb14 y NBG016-mAb21 secretados en el sobrenadante del cultivo mantenían la capacidad de unirse al EP4 humano.

45 [0156] Estos resultados demostraron que la secuencia de ácido nucleico codificante del anticuerpo proporcionado por la presente invención puede usarse para producir un anticuerpo recombinante (por ejemplo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, etc.) que mantiene la función del anticuerpo de la presente invención.

50 Aplicabilidad industrial

[0157] Dado que el anticuerpo proporcionado por la presente invención suprime específicamente la función de un receptor de PGE2 humano del subtipo EP4, se anticipa que el presente anticuerpo desempeñará un papel

55 importante para proporcionar un procedimiento para la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con EP4 o para el desarrollo de un agente preventivo o terapéutico para las enfermedades mencionadas anteriormente.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0158]

<110> NB Health Laboratory Co. Ltd. National University Corporation Kumamoto University

<120> anticuerpo contra hEP4

<130> TPC0033NBK 10 <140> JP2010-218158

<141> 2010-09-29

<160> 63 15 <170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 435

<212> ADN 20 <213> Mus musculus

<400> 1 atggaatgga gatggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctacaggtgt ccactctgag 60 25 atccagctgc agcagtctgg acctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaaggtatca 120

tgcaaggctt ctggttttcc attttctacc tacaacatat actgggtgat ccagagccat 180 ggaaagcgcc ttgagtggat tggatatatt gatccttaca atggtggtac ttcctacaac 240

cagaagttca ggggcaaggc cacattgact gttgacaagt cctccagcac agcctacatg 300 catctcaaca gactgacttc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag aagatggtat 360

35 acttacgacg gggactggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 420 gccaaaacaa cagcc 435

40 <210> 2

<211> 145

<212> PRT

<213> Mus musculus 45 <400> 2

Met Glu Trp Arg Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Thr Gly 15 10 15

50 Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Pro Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30

55 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Pro Phe 35 40 45

Ser Thr Tyr Asn Ile Tyr Trp Val Ile Gln Ser His Gly Lys Arg Leu 60 50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

5 Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

10 Thr Ala Tyr Met His Leu Asn Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Trp Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp Trp Phe Ala 115 120 125 15

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr 130 135 140 20

Ala 145

25 <210> 3 <211> 415 <212> ADN <213> Mus musculus 30 <400> 3 atggacatga ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc

60

aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgtatctct aggagagaga 35 gtcactatca cttgcaaggc gagtcaggac attaataggt atttaagctg gttccagcag

120 180

aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgcaa acagattgtt agatggagtc

240

ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg ctagattatt ctctcaccat cagcagcctg 40

300

gagtatgaag atatgggaaa ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc attcacgttc

360

ggctcgggga caaagttgga aataaaacgg gctgatgctg caccaactgt atcca 45

415

<210> <211> <212> <213> 50

4 138 PRT Mus musculus

<400>

4

Met Asp Met Arg Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 55

Phe Pro Gly Ile Lys Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 60

Met Tyr Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 35 40 45

5 Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60

Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val 10 65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp Tyr Ser Leu Thr 85 90 95

Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110

20 Tyr Asp Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125

25 Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 130 135

<210> 5 30 <211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Thr Tyr Asn Ile Tyr

40 <210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

45 <400> 6

Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 15 10 15

Gly

55 <210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

60 <400> 7

Arg Trp Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp Trp Phe Ala Tyr

15 10

5 <210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

10 <400> 8

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Ser

15 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp

<210> 10

<211> 9

<212> PRT 30 <213> Mus musculus

<400> 10

Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe Thr 35 15

<210> 11

<211> 435 40 <212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 11 atggaatgga gatggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctacaggtgt ccactctgag 60

atccagctgc agcagtctgg acctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaaggtatca 120

tgcaaggctt ctggttttcc attctctacc tacaacatat actgggtgat ccagagccat 180

50 ggaaagagcc ttgagtggat tggatatatt gatccttaca atggtggtac ttcctacaac 240

cagaaattca ggggcaaggc cacattgact gttgacaagt cctccagcac agcctacatg 300

catctcaaca gcctgacttc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag aagatggtat 360

acttacgacg gggactggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 420

gccaaaacaa cagcc 435

<210> 12

<211> 145

<212> PRT

<213> Mus musculus

5 <220>

<221> DOMINIO

<222> (50)..(54)

<223> CDR1

<220>

<221> DOMINIO

<222> (69)..(85)

<223> CDR2

<220>

<221> DOMINIO

<222> (118)..(129) 20 <223> CDR3

<400> 12

25 Met Glu Trp Arg Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 30 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Pro Phe 35 40 45

Ser Thr Tyr Asn Ile Tyr Trp Val Ile Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

45 Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 50 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Trp Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp Trp Phe Ala 115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr

130

135 140

60

Ala

<210> 13 5 <211> 415

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 13 10 atggacatga ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc

aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgtatctct aggagagaga

gtcactatca cttgcaaggc gagtcaggac attaatagat atttaagctg gttccagcag

aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgcaa acagaatgtt agatggggtc

ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattatt ctctcaccat cagcagcctg

20 gaatacgaag atatgggaaa ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc tttcacgttc

ggctcgggga caaagttgga aataaaacgg gctgatgctg caccaactgt atcca

25 <210> 14

<211> 138

<212> PRT

<213> Mus musculus

30 <220>

<221> DOMINIO

<222> (46)..(56)

<223> CDR1

<220>

<221> DOMINIO

<222> (72)..(78)

<223> CDR2

<220>

<221> DOMINIO

<222> (111)..(119) 45 <223> CDR3

<400> 14

50 Met Asp Met Arg Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp 15 10 15

Phe Pro Gly Ile Lys Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 55 20 25 30

Met Tyr Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 35 40 45

60 120 180 240 300 360 415

Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60

5 Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Met Leu Asp Gly Val 65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr 10 85 90 95

Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110

Tyr Asp Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125

20 Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 130 135

25 <210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

30 <400> 15

Thr Tyr Asn Ile Tyr

1 5

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16

Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 15 10 15

Gly

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

Arg Trp Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp Trp Phe Ala Tyr 15 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Ser 15 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT 15 <213> Mus musculus

<400> 19

Arg Ala Asn Arg Met Leu Asp 20 15

<210> 20

<211> 9 25 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 20

30 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe Thr 15

<210> 21 35 <211> 488

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Met Ser Thr Pro Gly Val Asn Ser Ser Ala Ser Leu Ser Pro Asp Arg 15 10 15

45 Leu Asn Ser Pro Val Thr Ile Pro Ala Val Met Phe Ile Phe Gly Val 20 25 30

Val Gly Asn Leu Val Ala Ile Val Val Leu Cys Lys Ser Arg Lys Glu 50 35 40 45

Gln Lys Glu Thr Thr Phe Tyr Thr Leu Val Cys Gly Leu Ala Val Thr 50 55 60

Asp Leu Leu Gly Thr Leu Leu Val Ser Pro Val Thr Ile Ala Thr Tyr 65 70 75 80

Met Lys Gly Gln Trp Pro Gly Gly Gln Pro Leu Cys Glu Tyr Ser Thr

85 90 95

Phe Ile Leu Leu Phe Phe Ser Leu Ser Gly Leu Ser Ile Ile Cys Ala 5 100 105 110

Met Ser Val Glu Arg Tyr Leu Ala Ile Asn His Ala Tyr Phe Tyr Ser 115 120 125

His Tyr Val Asp Lys Arg Leu Ala Gly Leu Thr Leu Phe Ala Val Tyr 130 135 140

Ala Ser Asn Val Leu Phe Cys Ala Leu Pro Asn Met Gly Leu Gly Ser 145 150 155 160

20 Ser Arg Leu Gln Tyr Pro Asp Thr Trp Cys Phe Ile Asp Trp Thr Thr 165 170 175

Asn Val Thr Ala His Ala Ala Tyr Ser Tyr Met Tyr Ala Gly Phe Ser 25 180 185 190

Ser Phe Leu Ile Leu Ala Thr Val Leu Cys Asn Val Leu Val Cys Gly 195 200 205

Ala Leu Leu Arg Met His Arg Gln Phe Met Arg Arg Thr Ser Leu Gly 210 215 220

Thr Glu Gln His His Ala Ala Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Arg Gly 225 230 235 240

40 His Pro Ala Ala Ser Pro Ala Leu Pro Arg Leu Ser Asp Phe Arg Arg 245 250 255

Arg Arg Ser Phe Arg Arg Ile Ala Gly Ala Glu Ile Gln Met Val Ile 45 260 265 270

Leu Leu Ile Ala Thr Ser Leu Val Val Leu Ile Cys Ser Ile Pro Leu 275 280 285

Val Val Arg Val Phe Val Asn Gln Leu Tyr Gln Pro Ser Leu Glu Arg 290 295 300

Glu Val Ser Lys Asn Pro Asp Leu Gln Ala Ile Arg Ile Ala Ser Val 305 310 315 320

60 Asn Pro Ile Leu Asp Pro Trp Ile Tyr Ile Leu Leu Arg Lys Thr Val 325 330 335

Leu Ser Lys Ala Ile Glu Lys Ile Lys Cys Leu Phe Cys Arg Ile Gly 340 345 350 5

Gly Ser Arg Arg Glu Arg Ser Gly Gln His Cys Ser Asp Ser Gln Arg 355 360 365

10 Thr Ser Ser Ala Met Ser Gly His Ser Arg Ser Phe Ile Ser Arg Glu 370 375 380

15 Leu Lys Glu Ile Ser Ser Thr Ser Gln Thr Leu Leu Pro Asp Leu Ser 385 390 395 400

Leu Pro Asp Leu Ser Glu Asn Gly Leu Gly Gly Arg Asn Leu Leu Pro 405 410 415 20

Gly Val Pro Gly Met Gly Leu Ala Gln Glu Asp Thr Thr Ser Leu Arg 420 425 430 25

Thr Leu Arg Ile Ser Glu Thr Ser Asp Ser Ser Gln Gly Gln Asp Ser 435 440 445

30 Glu Ser Val Leu Leu Val Asp Glu Ala Gly Gly Ser Gly Arg Ala Gly 450 455 460

35 Pro Ala Pro Lys Gly Ser Ser Leu Gln Val Thr Phe Pro Ser Glu Thr 465 470 475 480

Leu Asn Leu Ser Glu Lys Cys Ile 485 40

<210> <211> <212> 45 <213>

22 1413 ADN Mus musculus

<400> 22 atggaatgga gatggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctacaggtgt ccactctgag 50 atccagctgc agcagtctgg acctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaaggtatca

60 120

tgcaaggctt ctggttttcc attttctacc tacaacatat actgggtgat ccagagccat

180

ggaaagcgcc ttgagtggat tggatatatt gatccttaca atggtggtac ttcctacaac 55

240

cagaagttca ggggcaaggc cacattgact gttgacaagt cctccagcac agcctacatg

300

catctcaaca gactgacttc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag aagatggtat 60 acttacgacg gggactggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca

360 420

gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca ctggcccctg tgtgtggaga tacaactggc

480

tcctcggtga ctctaggatg cctggtcaag ggttatttcc ctgagccagt gaccttgacc 5 tggaactctg gatccctgtc cagtggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac

540 600

ctctacaccc tcagcagctc agtgactgta acctcgagca cctggcccag ccagtccatc

660

acctgcaatg tggcccaccc ggcaagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgagcccaga 10

720

gggcccacaa tcaagccctg tcctccatgc aaatgcccag cacctaacct cttgggtgga

780

ccatccgtct tcatcttccc tccaaagatc aaggatgtac tcatgatctc cctgagcccc 15 atagtcacat gtgtggtggt ggatgtgagc gaggatgacc cagatgtcca gatcagctgg

840 900

tttgtgaaca acgtggaagt acacacagct cagacacaaa cccatagaga ggattacaac

960

agtactctcc gggtggtcag tgccctcccc atccagcacc aggactggat gagtggcaag 20

1020

gagttcaaat gcaaggtcaa caacaaagac ctcccagcgc ccatcgagag aaccatctca

1080

aaacccaaag ggtcagtaag agctccacag gtatatgtct tgcctccacc agaagaagag 25 atgactaaga aacaggtcac tctgacctgc atggtcacag acttcatgcc tgaagacatt

1140 1200

tacgtggagt ggaccaacaa cgggaaaaca gagctaaact acaagaacac tgaaccagtc

1260

ctggactctg atggttctta cttcatgtac agcaagctga gagtggaaaa gaagaactgg 30

1320

gtggaaagaa atagctactc ctgttcagtg gtccacgagg gtctgcacaa tcaccacacg

1380

actaagagct tctcccactc tcctggtaaa tga 35

1413

<210> <211> <212> <213> 40

23 470 PRT Mus musculus

<400>

23

Met Glu Trp Arg Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Thr Gly 1 5 10 15 45

Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 50

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Pro Phe 35 40 45

55 Ser Thr Tyr Asn Ile Tyr Trp Val Ile Gln Ser His Gly Lys Arg Leu 50 55 60

60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met His Leu Asn Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Trp Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp Trp Phe Ala 115 120 125

15 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr 130 135 140

Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly 20 145 150 155 160

Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175

Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr 180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val 195 200 205

35 Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val 210 215 220

Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg 40 225 230 235 240

Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn 245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp 260 265 270

Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285

55 Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn 290 295 300

Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn 60 305 310 315 320

Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp 325 330 335

5 Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro 340 345 350

10 Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala 355 360 365

Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys 370 375 380 15

Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile 385 390 395 400 20

Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn 405 410 415

25 Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys 420 425 430

30 Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys 435 440 445

Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe 450 455 460 35

Ser His Ser Pro Gly Lys 465 470 40

<210> <211> <212> <213> 45

24 711 ADN Mus musculus

<400> 24 atggacatga ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc

60

aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgtatctct aggagagaga 50

120

gtcactatca cttgcaaggc gagtcaggac attaataggt atttaagctg gttccagcag

180

aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgcaa acagattgtt agatggagtc 55 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg ctagattatt ctctcaccat cagcagcctg

240 300

gagtatgaag atatgggaaa ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc attcacgttc

360

ggctcgggga caaagttgga aataaaacgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 60

420

ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac

480

ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc

540

gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc 5

600

ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac

660

aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgtta a 10

711

<210> <211> <212> <213> 15

25 236 PRT Mus musculus

<400>

25

Met Asp Met Arg Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 20

Phe Pro Gly Ile Lys Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 25

Met Tyr Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 35 40 45

30 Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60

35 Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val 65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp Tyr Ser Leu Thr 85 90 95 40

Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 45

Tyr Asp Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125

50 Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser 130 135 140

55 Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn 145 150 155 160

Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu 165 170 175 60

Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr 195 200 205

10 Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr 210 215 220

Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 15 225 230 235

<210> 26

<211> 1413 20 <212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 26 atggaatgga gatggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctacaggtgt ccactctgag 60

atccagctgc agcagtctgg acctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaaggtatca 120 tgcaaggctt ctggttttcc attctctacc tacaacatat actgggtgat ccagagccat 180 30 ggaaagagcc ttgagtggat tggatatatt gatccttaca atggtggtac ttcctacaac 240 cagaaattca ggggcaaggc cacattgact gttgacaagt cctccagcac agcctacatg 300 catctcaaca gcctgacttc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag aagatggtat 360

acttacgacg gggactggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 420 gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca ctggcccctg tgtgtggaga tacaactggc 480 40 tcctcggtga ctctaggatg cctggtcaag ggttatttcc ctgagccagt gaccttgacc 540 tggaactctg gatccctgtc cagtggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 600 ctctacaccc tcagcagctc agtgactgta acctcgagca cctggcccag ccagtccatc 660

acctgcaatg tggcccaccc ggcaagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgagcccaga 720 gggcccacaa tcaagccctg tcctccatgc aaatgcccag cacctaacct cttgggtgga 780 50 ccatccgtct tcatcttccc tccaaagatc aaggatgtac tcatgatctc cctgagcccc 840 atagtcacat gtgtggtggt ggatgtgagc gaggatgacc cagatgtcca gatcagctgg 900 tttgtgaaca acgtggaagt acacacagct cagacacaaa cccatagaga ggattacaac 960

agtactctcc gggtggtcag tgccctcccc atccagcacc aggactggat gagtggcaag 1020 gagttcaaat gcaaggtcaa caacaaagac ctcccagcgc ccatcgagag aaccatctca 1080 60 aaacccaaag ggtcagtaag agctccacag gtatatgtct tgcctccacc agaagaagag 1140

atgactaaga aacaggtcac tctgacctgc atggtcacag acttcatgcc tgaagacatt

1200

tacgtggagt ggaccaacaa cgggaaaaca gagctaaact acaagaacac tgaaccagtc

1260

ctggactctg atggttctta cttcatgtac agcaagctga gagtggaaaa gaagaactgg 5

1320

gtggaaagaa atagctactc ctgttcagtg gtccacgagg gtctgcacaa tcaccacacg

1380

actaagagct tctcccactc tcctggtaaa tga 10

1413

<210> <211> <212> <213> 15

27 470 PRT Mus musculus

<400>

27

Met Glu Trp Arg Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Thr Gly 1 5 10 15 20

Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 25

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Pro Phe 35 40 45

30 Ser Thr Tyr Asn Ile Tyr Trp Val Ile Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60

35 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 40

Thr Ala Tyr Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 45

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Trp Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp Trp Phe Ala 115 120 125

50 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr 130 135 140

55 Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly 145 150 155 160

Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 60

Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr 180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val 195 200 205

10 Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val 210 215 220

Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg 15 225 230 235 240

Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn 245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp 260 265 270

Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285

30 Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn 290 295 300

Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn 35 305 310 315 320

Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp 325 330 335

Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro 340 345 350

Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala 355 360 365

50 Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys 370 375 380

Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile 55 385 390 395 400

Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn 405 410 415

Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys 420 425 430

5 Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys 435 440 445

Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe 450 455 460 10

Ser His Ser Pro Gly Lys 465 470 15

<210> <211> <212> <213> 20

28 711 ADN Mus musculus

<400> 28 atggacatga ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc

60

aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgtatctct aggagagaga 25

120

gtcactatca cttgcaaggc gagtcaggac attaatagat atttaagctg gttccagcag

180

aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgcaa acagaatgtt agatggggtc 30 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattatt ctctcaccat cagcagcctg

240 300

gaatacgaag atatgggaaa ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc tttcacgttc

360

ggctcgggga caaagttgga aataaaacgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 35

420

ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac

480

ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc 40 gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc

540 600

ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac

660

aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgtta a 45

711

<210> <211> <212> 50 <213>

29 236 PRT Mus musculus

<400>

29

55 Met Asp Met Arg Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15

Phe Pro Gly Ile Lys Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 60

Met Tyr Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 35 40 45

Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60

10 Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Met Leu Asp Gly Val 65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr 15 85 90 95

Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110

Tyr Asp Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125

Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser 130 135 140

30 Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn 145 150 155 160

Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu 35 165 170 175

Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr 195 200 205

Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr 210 215 220

50 Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235

<210> 30 55 <211> 109

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 60 <223> ADN sintético

<400> 30 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggagat agaaccatgg agacagacac

60

actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc actggtgac 5

109

<210> <211> <212> <213> 10

31 30 ADN Artificial

<220> <223>

ADN sintético

<400> 31 15 gacccagctt tcttgtacaa agtggtcccc

30

<210> <211> 20 <212> <213>

32 67 ADN Artificial

<220> <223> 25

ADN sintético

<400> 32 caccatggag acagacacac tcctgctatg ggtactgctg ctctgggttc caggttccac

60

tggtgac 30

67

<210> <211> <212> 35 <213>

33 23 ADN Artificial

<220> <223> ADN sintético 40 <400> 33 aggggccagt ggatagaccg atg

23

<210> 45 <211> <212> <213>

34 24 ADN Artificial

<220> 50 <223>

ADN sintético

<400> 34 ggctgttgtt ttggctgcag agac 55

24

<210> <211> <212> <213> 60

35 24 ADN Artificial

<220> <223>

ADN sintético

<400> 35 actggatggt gggaagatgg atac 5

24

<210> <211> <212> 10 <213>

36 24 ADN Artificial

<220> <223> ADN sintético 15 <400> 36 tggatacagt tggtgcagca tcag

24

<210> 20 <211> <212> <213>

37 43 ADN Artificial

<220> 25 <223>

ADN sintético

<400> 37 cactgaccct acgcgtatgg aatggagatg gatctttctc ttc 30

43

<210> <211> <212> <213> 35

38 40 ADN Artificial

<220> <223>

ADN sintético

<400> 38 40 ataagaatgc ggccgctcat ttaccaggag agtgggagag

40

<210> <211> 45 <212> <213>

39 39 ADN Artificial

<220> <223> 50

ADN sintético

<400> 39 ttgcagccag gaacgcgtat ggacatgagg acccctgct

39

55 <210> <211> <212> <213> 60 <220>

40 40 ADN Artificial

<223> ADN sintético

<400> 40 ataagaatgc ggccgcttaa cactcattcc tgttgaagct 40

<210> 41

<211> 429

<212> ADN 10 <213> Mus musculus

<400> 41 atggctgtcc tggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag 60 15 gtgcagctga aggagtcagg gcctggcctg gtggcgccct cacagagcct ttccatcact 120 tgcactgtct ctgggttttc attaagcagc tatactatac actgggttcg ccagcctcca 180 ggaaggggtc tggagtggct gggagtgata tgggctggtg gaagcacaaa ctataattcg 240

gctctcatgt ctagactgcg catcagcaaa gacacctcca ggagccaagt tttcctaaaa 300 gtgaacagtc tgcaaactga tgactcagcc atatactact gtgccagaaa tgacttcggc 360

25 tacgggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc caaaacaaca 420 gccaatcgg 429

30 <210> 42

<211> 420

<212> ADN

<213> Mus musculus 35 <400> 42 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagcgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 40 tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacat actactggaa acacctattt agaatggtat 180 ttgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttcccg ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcactgga tcagggacag atttcacact caggatcagc 300

agagtggagg ctgcggatct gggaatttat tactgctttc agggttcaca tattcctcct 360 acgttcggtg ctgggaccaa actggagcgg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

<210> 43

<211> 143

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 43

Met Ala Val Leu Val Leu Phe Leu Cys Leu Val Ala Phe Pro Ser Cys 15 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala 20 25 30

5 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45

Ser Ser Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu 10 50 55 60

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80

Ala Leu Met Ser Arg Leu Arg Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Ser Gln 85 90 95

Val Phe Leu Lys Val Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Ser Ala Ile Tyr 100 105 110

25 Tyr Cys Ala Arg Asn Asp Phe Gly Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Asn Arg 30 130 135 140

<210> 44

<211> 140 35 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 44

40 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 15 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 45 20 25 30

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45

Val His Thr Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Arg Arg Phe Ser 65 70 75 80

60 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95

Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Ala Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys 100 105 110

Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125

Glu Arg Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 130 135 140

15 <210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

20 <400> 45

Ser Tyr Thr Ile His 15

<210> 46

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 46

Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser 15 10 15

<210> 47

<211> 9

<212> PRT 40 <213> Mus musculus

<400> 47

Asn Asp Phe Gly Tyr Gly Phe Ala Tyr 45 15

<210> 48

<211> 16 50 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 48

55 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Thr Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 15 10 15

<210> 49 60 <211> 7

<212> PRT

<213>

Mus musculus

<400>

49

5 Lys Val Ser Arg Arg Phe Ser 1 5

<210> <211> 10 <212> <213>

50 9 PRT Mus musculus

<400> 50 15 Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Pro Thr 1 5

<210> 20 <211> <212> <213>

51 43 ADN Artificial

<220> 25 <223>

ADN sintético

<400> 51 cactagagcc cccatacgcg tatggctgtc ctggtgctgt tcc 30

43

<210> <211> <212> <213> 35

52 40 ADN Artificial

<220> <223>

ADN sintético

<400> 52 40 ataagaatgc ggccgctcat ttacccggag agtgggagag

40

<210> <211> 45 <212> <213>

53 38 ADN Artificial

<220> <223> 50

ADN sintético

<400> 53 tcctcaggtt gcctcacgcg tatgaagttg cctgttag

38

55 <210> <211> <212> <213> 60 <400>

54 1383 ADN Mus musculus 54

atggctgtcc tggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag 60 gtgcagctga aggagtcagg gcctggcctg gtggcgccct cacagagcct ttccatcact 120 5 tgcactgtct ctgggttttc attaagcagc tatactatac actgggttcg ccagcctcca 180 ggaaggggtc tggagtggct gggagtgata tgggctggtg gaagcacaaa ctataattcg 240 gctctcatgt ctagactgcg catcagcaaa gacacctcca ggagccaagt tttcctaaaa 300

gtgaacagtc tgcaaactga tgactcagcc atatactact gtgccagaga tgacttcggc 360 tacgggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc caaaacgaca 420 15 cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc 480 ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga 540 tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg 600

agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt 660 gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac aagaaaattg tgcccaggga ttgtggttgt 720 25 aagccttgca tatgtacagt cccagaagta tcatctgtct tcatcttccc cccaaagccc 780 aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct aaggtcacgt gtgttgtggt agacatcagc 840 aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg tttgtagatg atgtggaggt gcacacagct 900

cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac agcactttcc gctcagtcag tgaacttccc 960 atcatgcacc aggactggct caatggcaag gagttcaaat gcagggtcaa cagtgcagct 1020 35 ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag gcagaccgaa ggctccacag 1080 gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag atggccaagg ataaagtcag tctgacctgc 1140 atgataacag acttcttccc tgaagacatt actgtggagt ggcagtggaa tgggcagcca 1200

gcggagaact acaagaacac tcagcccatc atggacacag atggctctta cttcgtctac 1260 agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg gaggcaggaa atactttcac ctgctctgtg 1320 45 ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact gagaagagcc tctcccactc tccgggtaaa 1380 tga 1383

50 <210> 55

<211> 717

<212> ADN

<213> Mus musculus 55 <400> 55 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagcgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 60 tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacat actactggaa acacctattt agaatggtat 180

ttgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aaatttcccg ccgattttct

240

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caggatcagc

300

agagtggagg ctgcggatct gggaatttat tactgttttc agggttcaca tattcctcct 5

360

acgttcggtg ctgggaccaa actggagcgg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc

420

atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 10 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa

480 540

aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc

600

agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 15

660

actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttaa

717

<210> 20 <211> <212> <213>

56 460 PRT Mus musculus

<400> 25

56

Met Ala Val Leu Val Leu Phe Leu Cys Leu Val Ala Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15

30 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala 20 25 30

35 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45

Ser Ser Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 60 40

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80 45

Ala Leu Met Ser Arg Leu Arg Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Ser Gln 85 90 95

50 Val Phe Leu Lys Val Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Ser Ala Ile Tyr 100 105 110

55 Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Phe Gly Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 130 135 140 60

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 165 170 175

10 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 15 195 200 205

Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 210 215 220

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys 225 230 235 240

Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe 245 250 255

30 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val 260 265 270

Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 35 275 280 285

Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro 290 295 300

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 305 310 315 320

Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val 325 330 335

50 Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 340 345 350

Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys 55 355 360 365

Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp 370 375 380

Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400

5 Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser 405 410 415

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala 10 420 425 430

Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His 435 440 445

His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 460

<210> 57

<211> 238

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 57

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 15 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30

35 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45

40 Val His Thr Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Arg Arg Phe Ser 45 65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95

Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Ala Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys 100 105 110

55 Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125

60 Glu Arg Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 145 150 155 160 5

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 165 170 175

10 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 180 185 190

15 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 195 200 205

Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 210 215 220 20

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 25

<210> <211> <212> <213> 30

58 48 DNA Artificial

<220> <223>

ADN sintético

<400> 58 35 gacagatggg ggtgtcgttt tagcgctaga gacagtgacc agagtccc

48

<210> <211> 40 <212> <213>

59 48 ADN Artificial

<220> <223> 45

ADN sintético

<400> 59 gggactctgg tcactgtctc tagcgctaaa acgacacccc catctgtc

48

50 <210> <211> <212> <213> 55 <220> <223>

60 43 ADN Artificial ADN sintético

<400> 60 cactgaccct aagcttatgg aatggagatg gatctttctc ttc 60

43

<210> <211> <212> <213> 5

61 36 ADN Artificial

<220> <223>

ADN sintético

<400> 61 10 ggctgttgtg ctagctgcag agacagtgac cagagt

36

<210> <211> 15 <212> <213>

62 40 ADN Artificial

<220> <223> 20

ADN sintético

<400> 62 attgcagcca ggagaattca tggacatgag gacccctgct

40

25 <210> <211> <212> <213> 30 <220> <223>

63 39 ADN Artificial ADN sintético

<400> 63 ggtgcagcat ccgtacgttt tatttccaac tttgtcccc 35

39

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo, cada uno de los cuales se une al

   dominio extracelular de un receptor de PGE2 del subtipo EP4 e inhibe la función de dicho receptor EP4 de PGE2 de 5 aumento del nivel intracelular de AMPc.
2. 2. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en que el anticuerpo está producido por hibridomas con los números de acceso de depósito internacional FERM BP-11402 (NBG016-mAb14) y FERM BP11403 (NBG016-mAb21).
3. 3. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en que el anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular de EP4 y comprende uno cualquiera de los siguientes (A), (B), o (C), con respecto a las secuencias aminoacídicas de sus regiones determinantes de complementariedad 1-3 (CDR1-3):

   15 (A) el anticuerpo tiene una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 6,

   20 una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 7, una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 8, una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 10;

   25 (B) el anticuerpo tiene una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 15, una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 16,

   30 una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 17, una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 18, una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO:

   35 20;o

   (C) el anticuerpo tiene una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 45, una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO:

   40 46, una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 47, una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 48, una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 49

   45 y una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO:
4. 50.
5. 4. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que el anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular de EP4 y comprende uno

   50 cualquiera de los siguientes (a), (b) o (c), con respecto a las secuencias aminoacídicas de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera:

   (a) el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 2 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 4;

   55 (b) el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 12 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 14;

   (c) el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 44.

6. 5.

   El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

7. 6.

   El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en que la región variable de la cadena pesada o la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo o fragmento del mismo está codificada por un ácido nucleico según se muestra en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42.

8. 7.

   Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. 8.

   La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, para uso en un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad inmunitaria.

10. 9.

    La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, para uso en un procedimiento para el tratamiento de un tumor.

11. 10.

    La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 para uso en un procedimiento para el tratamiento del dolor.

12. 11.

    Un anticuerpo inmovilizado en un vehículo, en que el anticuerpo dirigido contra EP4 o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 está inmovilizado en un vehículo.

13. 12.

    Un procedimiento para la eliminación de las células que expresan el receptor EP4 de PGE2 de la sangre, en el que un anticuerpo inmovilizado en un vehículo de acuerdo con la reivindicación 11 se pone en contacto ex vivo con sangre que contiene células que expresan EP4, con la subsiguiente eliminación de dichas células que expresan EP4 de dicha sangre.

14. 13.

    Un kit para la medición del nivel de expresión del receptor EP4 de PGE2 en una superficie celular, que comprende el anticuerpo dirigido contra EP4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.