CN102170905B - 骨关节炎治疗剂及预防剂 - Google Patents

骨关节炎治疗剂及预防剂 Download PDF

Info

Publication number
CN102170905B
CN102170905B CN200980138584.6A CN200980138584A CN102170905B CN 102170905 B CN102170905 B CN 102170905B CN 200980138584 A CN200980138584 A CN 200980138584A CN 102170905 B CN102170905 B CN 102170905B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
osteoarthritis
type anti
igm type
fas antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980138584.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102170905A (zh
Inventor
西冈久寿树
游道和雄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Axis Inc
Original Assignee
Axis Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Axis Inc filed Critical Axis Inc
Priority to CN201510417168.7A priority Critical patent/CN105169389A/zh
Publication of CN102170905A publication Critical patent/CN102170905A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102170905B publication Critical patent/CN102170905B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

本发明的目的在于提供对骨关节炎及骨关节炎性关节炎(滑膜炎)的治疗剂及预防剂。本发明基于通过使用IgM型抗Fas抗体能够缓和骨关节炎的症状的认知。具体而言，本发明基于通过使用IgM型抗Fas抗体能够抑制软骨基质分解酶产生的认知。另外，本发明基于通过使用IgM型抗Fas抗体能够改善软骨基质产生能力。

Description

骨关节炎治疗剂及预防剂
技术领域
本发明涉及含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的骨关节炎及由骨关节炎引发的关节炎(滑膜炎)的治疗剂及预防剂等。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis(OA))是因年龄增长或机械性应力，发生关节软骨表面退变、随之在关节边缘增殖新的软骨、关节变形、适合性的破绽，进而发展成关节滑膜炎症的疾病。另一方面，作为代表性的关节症的风湿性关节炎(rheumatoidarthritis(RA))，因免疫异常或感染症的原因，炎症性细胞湿润滑膜，进而随着血管新生，滑膜纤维芽细胞增殖亢进，形成炎症性滑膜肉芽组织，骨或软骨被破坏，关节发生不可逆的障碍。因此，风湿性关节炎(RA)是称为炎症性疾病的自身免疫疾病，而骨关节炎(OA)被称为非炎症性疾病。因此，通常认为风湿性关节炎的治疗中使用的治疗药对骨关节炎没有治疗效果。
目前，正在以风湿性关节炎(RA)的治疗为目的开发各种医药组合物。作为其中之一，可以举出抗Fas抗体(特开2004-59582号公报(参见专利文献1))。但是，报告了虽然抗Fas抗体对采自风湿性关节炎(RA)患者的滑膜细胞有凋亡诱导效果，但对从骨关节炎(OA)患者采集的滑膜细胞没有凋亡诱导效果(NAKAJIMAetal.，“APOPTOSISANDFUNCTIONALFASANTIGENINRHEUMATOIDARTHRITISSYNOVICYTES”，ARTHRITIS&RHEUMATISM，38(4)，1995，p485-p491(参见非专利文献1)。
另一方面，骨关节炎的治疗中开始使用有抗炎症·镇痛效果的非甾体类药剂(NSAIDs)。另外，除此之外，进行通过注射等减少关节液或注射肾上腺皮质激素剂或硫酸软骨素钠、透明质酸(hyaluronicacid(HA))等关节软骨的保护剂的治疗。
另外，作为对上述关节变性疾病的治疗药，使用作为信号级联放大体系拮抗剂的p21活性化激酶(PAK)拮抗剂(特表2007-537134号公报(参见专利文献2))或包含反义聚核苷酸、核酶及小分子干扰RNA等的医药组合物(特表2008-516593号公报(参见专利文献3))，但现状是无法得到充分的效果。
除此之外，在现在进行的治疗药开发中，开发以软骨再生促进因子(白介素(IL)-1等)为目的的治疗药、尝试将诱导软骨修复·再生的因子用作药剂，但现状是没有得到满意的结果。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开2004-59582号公报
专利文献2：特表2007-537134号公报
专利文献3：特表2008-516593号公报
专利文献4：特开平8-40897号公报
专利文献5：特开2006-151843号公报
专利文献6：特开2007-51077号公报
非专利文献
非专利文献1：NAKAJIMAetal.，“APOPTOSISANDFUNCTIONALFASANTIGENINRHEUMATOIDARTHRITISSYNOVICYTES”，ARTHRITIS&RHEUMATISM，38(4)，1995，p485-p491
非专利文献2：ARTHRITISRHEUM，2001，VOL.44，NO.8，P.1800-1807
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供对骨关节炎及骨关节炎性关节炎(滑膜炎)的治疗剂及预防剂。进而，本发明的目的在于提供参与关节病的软骨基质分解酶产生抑制剂、软骨基质合成改善剂及对骨关节炎中诱导的巨噬细胞的凋亡诱导剂。
用于解决课题的手段
本发明基于通过使用IgM型抗Fas抗体能够抑制骨关节炎中软骨变性的发现。具体而言，本发明基于通过使用IgM型抗Fas抗体能够抑制软骨基质分解酶产生的发现。另外，本发明基于通过使用IgM型抗Fas抗体能够改善软骨基质产生能力的发现。另外，本发明基于能够促进骨关节炎诱导的巨噬细胞的凋亡的发现。能够对骨关节炎使用IgM型抗Fas抗体是本次首次得到的发现。
本发明的第1方面涉及一种含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的治疗剂或预防剂，用于骨关节炎分类为初期阶段到发展期阶段的疾病的治疗或预防。从骨关节炎的初期阶段到发展期阶段的各阶段根据骨关节炎的ICRS(英国综合医疗记录服务)分类、Kellgren-Lawrence分类、Outerbridge分类或修正Mankin评分分类。如果根据上述分类从骨关节炎的初期阶段到发展期阶段进行分类，则本发明的药剂的目标疾病为(1)骨关节炎的ICRS分类中分类为等级1～3的疾病，(2)骨关节炎的Kellgren-Lawrence分类中分类为等级1～3的疾病，(3)骨关节炎的Outerbridge分类中分类为等级1～3的疾病，或(4)骨关节炎的修正Mankin评分中分类为评分1～7的疾病。
在骨关节炎中，分类为上述等级或评分的疾病作为病状伴随软骨变性。如后所述，本发明的IgM型抗体能够抑制软骨变性。因此，含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的本发明的药剂能够有效地治疗或预防伴随软骨变性的疾病。即，本发明的药剂能够有效地治疗或预防分类为从骨关节炎的初期阶段到发展期阶段的疾病。
另外，如后述的实施例所示，IgM型抗Fas抗体能够抑制作为软骨变性的介质的基质金属蛋白酶(MMP)-1及MMP-3的产生。MMP是软骨基质分解酶的1种。软骨基质分解酶使得关节软骨分解，所以能够成为引发骨关节炎或使骨关节炎的症状恶化的原因。因此，因为IgM型抗Fas抗体能够抑制MMP的产生，所以能够有效用作伴随软骨变性的疾病的治疗剂或预防剂。另外，如后述的实施例所示，IgM型抗Fas抗体能够改善软骨基质蛋白聚糖的合成能力。骨关节炎中，关节软骨被破坏也构成骨关节炎的原因。通过改善作为软骨基质的蛋白聚糖的合成能力，被破坏的关节软骨再生。因此，本发明的药剂能够有效地预防或治疗伴随软骨变性的分类为从骨关节炎的初期阶段到发展期阶段的疾病。即，本发明还提供含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的软骨破坏抑制剂。
本发明的第1方面的优选方案是上述药剂，其中IgM型抗Fas抗体是肽的抗体，所述肽由与Fas抗原的细胞外结构域(序列编号1的第26～173位的氨基酸序列)相同或取代、缺失、附加或插入了1个氨基酸残基的氨基酸序列构成。
本发明的第1方面的优选方案是上述任一项所述的药剂，其中，IgM型抗Fas抗体为CH11或7C11。如后述的实施例所示，CH11或7C11能够有效果地抑制MMP1及MMP3的产生。CH11能够改善作为软骨基质的蛋白聚糖的合成能力。因此，包含IgM型抗Fas抗体的本发明的药剂能够优选作用于治疗或预防伴随软骨变性的分类为从骨关节炎的初期阶段到发展期阶段的疾病的治疗剂或预防剂。
本发明的第2方面涉及含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的骨关节炎性关节炎治疗剂或预防剂。如后述的实施例所示，IgM型抗Fas抗体能够抑制巨噬细胞导致的炎症性细胞因子的产生。另外，IgM型抗Fas抗体抑制参与免疫应答的MMP1及3的产生。因此，第2方面的药剂优选用作软骨细胞骨关节炎性关节炎的治疗剂及预防剂。
本发明的第2方面的优选方案是上述药剂，其中，IgM型抗Fas抗体是肽的抗体，所述肽由与Fas抗原的细胞外结构域(序列编号1的第26～173位的氨基酸序列)相同或取代、缺失、附加或插入了1个氨基酸残基的氨基酸序列构成。
本发明的第2方面的优选方案是上述任一项所述的药剂，其中，IgM型抗Fas抗体为CH11或7C11。如后述的实施例所示，CH11或7C11抑制由巨噬细胞导致的炎症性细胞因子的产生。另外，CH11或7C11抑制参与免疫应答的MMP1及MMP3的产生。因此，上述药剂能够优选用作软骨细胞骨关节炎性关节炎的治疗剂及预防剂。
本发明的第3方面是含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的软骨基质分解酶产生抑制剂。如后述的实施例所示，IgM型抗Fas抗体优选为CH11或7C11。如实施例所证实，本发明的IgM型抗Fas抗体能够有效地抑制软骨基质分解酶的产生。因此，本发明的药剂能够优选用作软骨基质分解酶产生抑制剂。
本发明的第4方面是含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的软骨基质产生剂。如后述的实施例所示，IgM型抗Fas抗体优选为CH11。如实施例所证实，本发明的IgM型抗Fas抗体能够改善软骨基质(蛋白聚糖)的再生能力。因此，本发明的药剂能够优选用作软骨基质产生剂。
本发明的第5方面是含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的对骨关节炎诱导的巨噬细胞的凋亡诱导剂。如后述的实施例所示，IgM型抗Fas抗体优选为CH11或7C11。如实施例所证实，本发明的IgM型抗Fas抗体能够诱导由骨关节炎诱导的巨噬细胞的凋亡。因此，本发明的药剂能够优选用作对由骨关节炎诱导的巨噬细胞的凋亡诱导剂。
发明效果
根据本发明，能够提供对骨关节炎及骨关节炎性关节炎(滑膜炎)的治疗剂及预防剂。进而，本发明能够提供参与关节病等的软骨基质分解酶产生抑制剂、软骨基质合成改善剂及由骨关节炎诱导的巨噬细胞的凋亡诱导剂。
附图说明
[图1]图1是表示每个ICRS等级的关节软骨的病态的图。图1A表示等级0的正常状态的软骨。图1B表示等级1的软骨表层出现缓和的凹坑的状态的软骨。图1C表示在等级1的软骨的表层出现裂纹或龟裂的状态。图1D表示等级2的软骨缺损扩张至软骨的50％以下深度的状态。图1E表示等级3的软骨缺损扩张至软骨的50％以上深度的状态。图1F表示等级3的软骨缺损扩张至钙化层的状态。图1H表示发生等级3的肿胀的状态。图1I及图1J表示等级4的病变扩张至软骨下骨的状态。
[图2]图2是代表IgM型抗Fas抗体对软骨细胞的基质金属蛋白酶(MMP)的产生能力的影响图表。图2A是代表IgM型抗Fas抗体对软骨细胞的MMP1产生能力的影响的图表。图2B是代表IgM型抗Fas抗体对软骨细胞的MMP3产生能力的影响的图表。
[图3]图3是代表IgM型抗Fas抗体产生的对软骨基质(蛋白聚糖)产生能力下降的效果的图表。
[图4]图4是代表IgM型抗Fas抗体的凋亡抑制效果的图表。
[图5]图5是代表IgM型抗Fas抗体或IgG型抗Fas抗体对软骨细胞的基质金属蛋白酶(MMP)的产生能力的影响的图表。图5A是代表IgM型抗Fas抗体或IgG型抗Fas抗体对软骨细胞的MMP1产生能力的影响的图表。图5B是代表IgM型抗Fas抗体或IgG型抗Fas抗体对软骨细胞的MMP3产生能力的影响的图表。
[图6]图6是代表IgM型抗Fas抗体或IgG型抗Fas抗体的凋亡抑制效果的图表。
[图7]图7是代表骨关节炎模型大鼠的关节症病理组织评分的图表。图7A是表示番红O染色的结果。图7B表示软骨细胞缺损的结果。图7C表示软骨结构的结果。
[图8]图8是代表处置后第12周的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本的照片。图8A～图8F表示骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本的对照。图8G～图8J表示CH-11低用量给药组(CH-11：1.0ng/ml给药)的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图8K～图8N表示CH-11高用量给药组(CH-11：10.0ng/ml给药)的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图8O表示骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本的对照。图8P表示CH-11低用量给药组(CH-11：1.0ng/ml给药)的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。
[图9]图9是代表处置后第24周的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本的图的照片。图9A～图9H表示对照的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图9I～图9L表示CH-11低用量给药组(CH-11：1.0ng/ml给药)的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图9M～图9P表示CH-11高用量给药组(CH-11：10.0ng/ml给药)的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图9B、图9D、图9F、图9H、图9I、图9K、图9M及图9O分别是在图9A、图9C、图9E、图9G、图9J、图9L、图9N及图9P中将被四角包围的部分的放大照片。
具体实施方式
以下说明本发明。本发明的第1方面涉及含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的用于治疗或预防分类为骨关节炎的初期阶段至发展期阶段的疾病的治疗剂或预防剂。骨关节炎是在指间关节、第1腕掌关节、颈椎或腰椎的椎间板、第1中足趾节关节、髋关节、膝关节发生的疾病。本发明的药剂能够用于上述部位。上述部位中，本发明的药剂优选用于髋关节、膝关节或膝软骨。
本发明的药剂的目标疾病在骨关节炎中是分类为伴随软骨变性的发病初期阶段至发展期阶段的疾病。骨关节炎的阶段基于其病态如下表1～4所示进行分类。以下，对于骨关节炎的阶段，使用下述表1～表4所示的骨关节炎的进行度分类基准进行说明。
表1在骨关节炎中根据ICRS(InternationalCartilageRepairSociety)的软骨缺损分级(以下也称为“ICRS分类”)。
[表1]
表1ICRS分类
ICRS分类中，骨关节炎被分类为等级0～4。ICRS分类中，等级0是骨关节炎没有发病的阶段。等级1是骨关节炎的初期阶段。等级2～3是骨关节炎的发展期阶段。等级4是骨关节炎的末期阶段。如上所述，本发明的药剂的目标是分类为骨关节炎的初期阶段至发展期阶段的疾病。即，本发明的药剂的目标是骨关节炎的ICRS分类中等级1～3中的任一种的疾病。
骨关节炎的ICRS分类的各等级所表示的软骨状态示于图1。软骨形成由表层、中间层、深层及钙化层构成的层状结构(图1A)。软骨经由钙化层与骨(软骨下骨)连接。图1A表示等级0的正常状态的软骨。图1B表示在等级1的软骨表层出现缓和的凹坑的状态的软骨。图1C表示等级1的软骨表层出现裂纹或龟裂的状态。图1D表示等级2的软骨缺损扩张至软骨的50％以下深度的状态。图1E表示等级3的软骨缺损扩张至软骨的50％以上深度的状态。图1F表示等级3的软骨缺损扩张至石灰化层的状态。图1H表示引起等级3的肿胀的状态。图1I及图1J是表示等级4的病变扩张至软骨下骨的状态。如上所述，本发明的药剂治疗及预防软骨变性。如后述的实施例所示，本发明的药剂抑制在根据ICRS的软骨缺损分类中相当于等级1～等级3(骨关节炎的初期阶段至发展期阶段)的骨关节炎的病状。因此，本发明的药剂能够用于治疗或预防分类为变形关节症的初期阶段至发展期阶段的疾病。
表2表示骨关节炎的Kellgren-Lawrence分类(以下也称为“K-L分类”)。
[表2]
表2Kellgren-Lawrence分类
K-L分类中，骨关节炎分类为等级0～4。KL分类中，等级0是骨关节炎没有发病的阶段。等级1是骨关节炎的初期阶段。等级2～3是骨关节炎的发展期阶段。等级4是骨关节炎的末期阶段。需要说明的是，K-L分类中，关节裂隙的狭窄化是软骨细胞消失等软骨变性引起的。如上所述，本发明的药剂的目标是分类为伴随软骨变性的骨关节炎的初期阶段至发展期阶段的疾病。即，本发明的药剂的目标是骨关节炎的K-L分类中等级1～3中的任一级的疾病。需要说明的是，表2中，K-L分类的等级0～4分别相当于ICRS分类的等级0～4。
表3表示骨关节炎的Outerbridge分类(以下也称为“OB分类”)。
[表3]
表3Outerbridge分类
OB分类中，骨关节炎分类为等级0～4。OB分类中，等级0是骨关节炎没有发病的阶段。等级1是骨关节炎的初期阶段。等级2～3是骨关节炎的发展期阶段。等级4是骨关节炎的末期阶段。如上所述，本发明的药剂的目标是分类为骨关节炎的初期阶段至发展期阶段的疾病。即，本发明的药剂的目标是分类为骨关节炎的OB分类中等级1～3中的任一等级的疾病。需要说明的是，表3中，OB分类的等级0～4分别相当于ICRS分类的等级0～4。
表4表示根据骨关节炎的修正Mankin评分的分类。
[表4]
表4修正Mankin评分
在修正Mankin评分中，在番红O-快绿染色方面，根据关节软骨组织染色时的染色程度分类骨关节炎。软骨细胞缺损中，根据被染色的软骨细胞量分类骨关节炎。结构方面，根据关节软骨上出现的裂缝的程度分类骨关节炎。表4中，评分1～3是骨关节炎的初期阶段，相当于ICRS分类的等级1。评分4～5是骨关节炎的发展期阶段，相当于ICRS分类的等级2。评分6～8也是骨关节炎的发展期阶段，相当于ICRS分类的等级3。如上所述，本发明的药剂的目标是分类为骨关节炎的初期阶段至发展期阶段的疾病。即，本发明的药剂的目标是在骨关节炎的修正Mankin评分中分类为等级1～7中的任一等级的疾病。
如后述的实施例所示，IgM型抗Fas抗体能够抑制修正Mankin评分2～7的骨关节炎的症状(软骨变性)。另外，如后述的实施例所示，IgM型抗Fas抗体能够抑制软骨基质的缺损。另外，IgM型抗Fas抗体能够改善软骨基质产生能力。如上所述，Mankin评分2～7是作为其病态伴随软骨变性的骨关节炎的初期至发展期阶段。因此，IgM型抗Fas抗体能够有效果地用作分类为骨关节炎的初期阶段至发展期阶段的疾病的治疗剂或预防剂。
如后述的实施例所示，IgM型抗Fas抗体能够抑制修正Mankin评分2～7的骨关节炎的症状(软骨变性)。另外，如后述的实施例所示，IgM型抗Fas抗体能够抑制软骨基质的缺损。另外，IgM型抗Fas抗体能够改善软骨基质产生能力。如上所述，Mankin评分2～7是作为其病态伴随软骨变性的骨关节炎的初期至发展期阶段。因此，IgM型抗Fas抗体能够有效果地用作分类为骨关节炎的初期阶段至发展期阶段的疾病的治疗剂或预防剂。
本发明的第2方面涉及含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的骨关节炎性关节炎的治疗剂或预防剂。骨关节炎性关节炎是由骨关节炎引发的2次炎症反应。骨关节炎中，因关节软骨表面的破坏或随之发生的关节边缘的新软骨的增殖、关节的变形等，周边细胞受刺激，发生2次炎症反应。本发明的药剂能够优选用作该骨关节炎性关节炎的治疗剂或预防剂。
进而，本发明的药剂能够用作含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的软骨基质分解酶产生抑制剂、软骨基质产生剂及由骨关节炎诱导的巨噬细胞的凋亡诱导剂。IgM型抗Fas抗体优选为CH11、AGR098或7C11。如后述的实施例所示，该IgM型抗Fas抗体能够有效果地用作软骨基质分解酶产生抑制剂、软骨基质产生剂及由骨关节炎诱导的巨噬细胞的凋亡诱导剂。
本说明书中，抗体是指在生物体内诱导的蛋白质。上述生物例是哺乳类及鸟类。本发明的抗体例是来自人、小鼠及大鼠等哺乳动物的抗Fas抗体。本发明的抗体除了人以外，也可以用作狗或猫等的动物药。为了避免给药后的副作用，优选来自给药的生物的抗体。对人给药的抗体类型例为小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体及(完全)人抗体。
上述抗体可以通过公知方法制造(例如竹绳忠臣编，蛋白质实验手册，2003，p86-p105，(株)羊土社出版)。将作为与抗体结合的抗原的蛋白质或肽注射给产生抗体的免疫动物。免疫动物可以使用小鼠、大鼠、豚鼠、兔子及山羊等用作免疫动物的公知动物。对免疫动物注入抗原按1次或2次以上定期(例如每2～4周)进行。抗原注入后，每隔一定期间(例如1～2周)，进行采血，确认产生作为目标的抗体(检查抗体效价)。检查抗体效价的方法可以使用公知方法。例如可以诸如免疫印迹法、ELISA等。通过使用上述方法，能够得到来自免疫动物的抗体(如果是小鼠，则为小鼠抗体)。
嵌合抗体是指将小鼠抗体的可变区域连接到人抗体的恒定区域的抗体，可以通过公知的方法(例如特开平7-194384号公报等)进行制造。人源化抗体是指将小鼠抗体的互补决定区(complementaritydeterminingregion：CDR)移植到人抗体的可变区域的抗体，可以通过公知方法(专利2828340号公报，特开平11-4694号公报等)制造。人抗体是在破坏了免疫动物本来具有的免疫球蛋白的敲除(Knock-out)动物中导入人免疫球蛋白基因而产生的抗体，可以通过公知方法(特开平10-146194号公报，特开平10-155492号公报等)制造。完全人抗体是指由人的细胞产生的抗体，可以通过公知的方法(特开2007-141号公报，特开2005-034154号公报等)制造。只要是本领域技术人员，就能够适当采用上述抗体的公知制造方法制造本发明的抗体。
Fas抗原是细胞膜贯通型糖蛋白质，也称为APO-1、CD95、ALPS1A、APT1、Fas1、FasL受体、TNF受体超家族成员6(TNFreceptorsuperfamilymember6)、TNFR6等。已知在细胞表面上表达的Fas抗原被Fas配体(FasL)或抗Fas抗体等刺激，作为诱导该细胞凋亡的受体发挥功能(Fas介入性凋亡)。Fas抗原广泛分布在构成生体内的各组织的细胞内。另外，Fas抗原也在巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、T细胞、粒细胞、单核细胞等炎症关联细胞中表达。有报告说FasL在T细胞、NK细胞、效应细胞等中表达。如果Fas配体或抗Fas抗体结合在Fas抗原上，则Fas抗原形成3聚体(trimer)。进而，已知Fas抗原的细胞内结构域也3聚体化时，难以将凋亡信号传递到细胞内。另外，有报告说在生物体内中，Fas配体形成3聚体，通过3聚体化的Fas配体结合在Fas抗原上，Fas抗原的细胞内结构域发生3聚体化，传递凋亡信号。
作为抗Fas抗体，有诱导Fas介入性凋亡的抗体(激动剂抗体)或阻碍Fas介入性凋亡的抗体(拮抗剂抗体)等。本发明中优选的抗Fas抗体是诱导Fas介入性凋亡的抗体(激动剂抗体)。作为上述抗Fas抗体，例如可以举出对肽类的抗体，所述肽由与序列编号1中记载的氨基酸序列相同或取代、缺失、附加或插入了1～10个氨基酸残基的氨基酸序列构成。序列编号1是表示人的Fas抗原的氨基酸序列。序列编号1中记载的氨基酸序列中，被取代、缺失、附加或插入的氨基酸残基数可以举出1～10个，优选为1～5个，更优选为1～2个，进一步优选为1个。本发明的包含抗Fas抗体的药剂除了人以外，也能够以狗或猫等动物为对象。作为上述动物药使用本发明的包含抗Fas抗体的药剂时，抗Fas抗体为来自人的Fas抗原的序列编号1中记载的氨基酸序列相同或取代、缺失、附加或插入了1～10个氨基酸残基的氨基酸序列构成的肽的抗体，更优选为来自给药的动物的Fas抗原的氨基酸序列相同或取代、缺失、附加或插入了1～10个氨基酸残基的氨基酸序列构成的肽的抗体。构成来自上述动物的Fas抗原的氨基酸序列例如只要利用GenBank等公知渠道购买即可。
本发明的优选方案为抗Fas抗体是识别Fas抗原的细胞外结构域的抗体。具体为肽类的抗体，所述肽由与序列编号1的第26～173位的氨基酸序列相同或取代、缺失、附加或插入了1～5个氨基酸残基的氨基酸序列构成。序列编号1的第26～173位的氨基酸序列中，被取代、缺失、附加或插入的氨基酸残基数可以举出1～5个，优选为1～2个，更优选为1个。作为上述被取代等的氨基酸残基例，可以举出UniProt(theuniversalproteinresource(http://www.pir.uniprot.org/))登记No.P25445中记载的氨基酸残基。序列编号1的第26～173位的氨基酸序列是表示Fas抗原的细胞外结构域的序列。本发明中优选的抗Fas抗体是诱导Fas介入性凋亡的抗体。即，本发明的抗Fas抗体优选为能够与Fas抗原结合，引起Fas抗原的3聚体化，将凋亡信号传递到细胞内的抗体。通过使本发明的抗Fas抗体为对Fas抗原的细胞外结构域的抗体，在给予包含抗Fas抗体的药剂时，能够适当地与Fas抗原结合，引起其3聚体化，促进细胞内信号级联放大。因此，能够有效果地得到治疗效果。
本发明的抗Fas抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。但是，多克隆抗体难以稳定抗体效价。因此，优选使用抗体效价稳定的单克隆抗体。作为抗体(免疫球蛋白(Ig)分子)的亚型，可以举出IgG、IgM、IgA、IgE、IgD，本发明的抗体优选为IgG型抗体、IgA型抗体或IgM型抗体，更优选为IgA型抗体或IgM型抗体，进一步优选为IgM型抗体。上述抗体可以通过后述方法制造，但不限定于后述制造方法，可以通过公知制造方法制造。
抗体(免疫球蛋白(Ig)分子)具有各亚型(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD)共同的基本结构，由分子量5～7万的H链(Heavychain)和分子量2～2.5万的L链(Lightchain)构成。H链每种亚型具有特征结构，对应于IgG、IgM、IgA、IgD及IgE，分别称为γ、μ、α、δ及ε链。已知L链也有L型和K型2种，分别称为λ、κ链。基本结构的肽链结构分别相同的2条H链及L链通过二硫键(S-S键)及非共价键键合。2种L链与哪个H链都可成对。例如为IgM型时，μ、λ、κ链的组合成为μ2λ2及μ2κ2。链内的二硫键在H链中有4个(μ、ε链为5个)，L链有2个，每100～110个氨基酸残基形成1个环，将该单位称为结构域。H链及L链中，在位于N末端侧的结构域中存在称为可变区域(V)的结构域(表示为VH及VL)。与其相比，C末端侧的氨基酸序列具有在各亚型中具有基本一定的氨基酸序列的称为恒定区域(C)的结构域(表示为CH1、CH2、CH3、CL)。抗体的抗原结合部位(表位)由VH及VL构成，根据该部位的序列，抗原的特异性发生变化。上述抗体具有因亚型而不同的聚合结构。例如IgM型抗体是由2条Hμ链和2条L链构成的抗体，进而与称为J链的聚肽结合，以5聚体或6聚体的形式存在。IgA型抗体是由2条Hα和2条L链构成的抗体，以单体、2聚体或3聚体形式存在。IgA型抗体的2聚体或3聚体通过J链或分泌片(secretorypiece)结合。IgG型抗体以单体形式存在。作为本发明的抗Fas抗体，可以使用上述各类型的抗体。另外，如上所述，Fas介入性凋亡通过3聚体的Fas配体与Fas抗原结合，促进Fas抗原的细胞内结构域的3聚体化，传递凋亡信号。如上所述，因为IgM型抗体形成聚合结构(5聚体或6聚体)，所以IgM型抗体与3个以上的Fas抗原结合。由此使得Fas抗原的3聚体化有效率地发生，传递凋亡信号。因此，从该观点考虑，作为本发明中的抗Fas抗体，优选使用IgM型抗体。
[多克隆抗体]
以下列举多克隆抗体的制造方法例，但本领域技术人员可以使用公知方法适当变更。多克隆抗体可以通过在上述免疫动物中注入抗原(免疫原)进行制作。作为注入免疫动物的抗原(免疫原)，可以使用抗原表达细胞、(粗)精制蛋白质、重组蛋白质或合成肽等。作为该抗原，可以举出由与上述序列编号1中记载的氨基酸序列相同或取代、缺失、附加或插入了1～10个氨基酸残基的氨基酸序列构成的肽。如上所述，本发明的抗Fas抗体是诱导Fas介入凋亡的抗体，所以抗原优选为由与序列编号1的第26～173位的氨基酸序列相同或取代、缺失、附加或插入了1～5个氨基酸残基的氨基酸序列构成的肽，在上述氨基酸序列中被取代、缺失、附加或插入的氨基酸残基数更优选为1～2个，进一步优选为1个。另外，因为本发明的抗Fas抗体是与Fas抗原结合，诱导Fas介入性凋亡的抗体，所以制造抗体时使用的肽(抗原)可以使用比由序列编号1的第26～173位的氨基酸序列构成的肽短的肽。肽的长度只要是本领域技术人员就能适当调整。
制造多克隆抗体时，抗原与佐剂混合，注入免疫动物。此处，佐剂是指为了强化对抗原的免疫应答的目的而使用的物质，例如为铝佐剂、弗氏完全(不完全)佐剂、百日咳菌佐剂等。对免疫动物注入抗原每2～4周进行一次。注入2次以上后，在注入日后1～2周后进行采血，检查抗体效价(antibodytitercheck)。对免疫动物的注入量、注入次数(免疫次数)根据每个免疫动物的种类或其个体而不同。如果是本领域技术人员，则可以对应于抗体效价检查结果进行适当调整。免疫结束后，取全血，使用离心分离等公知方法，分离血清。为了除去血清中包含的内源性抗体等而进行血清精制。精制方法可以使用例如亲和色谱等公知方法。由此能够制作多克隆抗体。
[抗原表达细胞]
作为抗原使用的抗原表达细胞优选在培养细胞等的细胞膜上表达了成为抗原的蛋白质的细胞。上述抗原表达细胞可以通过公知方法制备。具体地，只要将编码作为抗原的蛋白质的DNA导入培养细胞内使其表达即可。使抗原表达的培养细胞(以下也称为“宿主”)没有特别限定，只要使用公知细胞即可。例如可以举出作为抗原递呈细胞已知的B细胞或树状细胞等。作为使上述细胞表达作为抗原的蛋白质的方法，制备导入了编码作为抗原的蛋白质的DNA的抗原表达载体，导入使抗原表达的细胞。导入表达载体中的DNA不包含细胞膜结构域序列时，优选使其预先包含导入表达载体的宿主具有的细胞膜结构域的序列。通过包含该序列，能够有效率地在细胞膜上表达蛋白质(抗原)。上述细胞膜结构域序列只要是本领域技术人员就能够适当取得，将其包含在接入表达载体内的DNA序列中。作为上述表达载体，可以使用含有启动子、增强子、剪接信号、ployA加尾信号、选择标记物、SV40复制起点等的表达载体。宿主为动物细胞时，作为启动子，例如可以举出SRα启动子、SV40启动子、HIV·LTR启动子、CMV启动子、HSV-TK启动子等。作为选择标记物，例如可以举出二氢叶酸还原酶基因(甲氨蝶呤(MTX)抗性)、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因(G418抗性)、潮霉素B(HygromycinB)抗性基因、灭瘟素抗性基因等。上述表达载体只要使用公知表达载体即可，只要是本领域技术人员，就能够对应于宿主进行适当选择。作为导入抗原表达载体的方法，可以使用磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法等公知方法。作为确认细胞中表达抗原的方法只要适当使用免疫染色法等公知方法即可。由此使抗原表达的细胞可以通过公知方法回收，作为注入免疫动物的抗原使用。
[(粗)精制蛋白质]
作为抗原使用的(粗)精制蛋白质是培养细胞等表达的蛋白质的精制品。上述蛋白质只要通过作用于细胞的信号级联放大通路或作用于转录因子的药剂或因子刺激培养细胞等使其表达即可。表达的蛋白质可以通过公知方法精制，作为精制蛋白质使用。例如为分泌蛋白质，则可以回收培养上清，例如通过盐析或柱色谱、膜处理等进行精制。作为柱色谱，可以举出离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱、疏水性色谱等，只要是本领域技术人员，就可以对应于蛋白质的性质适当使用。如果是没有分泌到细胞外的蛋白质，则可以回收培养细胞，通过超声波处理等破碎细胞，回收蛋白质。然后只要通过上述方法精制蛋白质即可。上述取得精制蛋白质的方法是公知的，只要是本领域技术人员，就能够对应蛋白质特性适当使用。
[重组蛋白质]
作为抗原使用的重组蛋白质可以通过公知方法制作。具体地将编码用作抗原的重组蛋白质的DNA通过公知方法插入载体，导入使重组蛋白质表达的宿主。载体只要使用公知载体即可，只要是本领域技术人员，就可以对应于导入的宿主进行选择。作为上述宿主，可以使用细菌、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞等公知宿主。在宿主内导入载体的方法可以是电穿孔法、磷酸钙法、脂质转染法等，对应于宿主适当使用公知方法。重组蛋白质可以是GST(glutathionStransferase)，HA(hemagglutinin)或(寡聚)组氨酸等与标签融合的蛋白质。上述标签只要与编码作为目标的抗原的DNA的N末端或C末端结合即可。通过结合上述标签的融合蛋白质，能够简单地精制表达的蛋白质。在宿主中表达的蛋白质例如为分泌蛋白质，可以通过回收培养上清进行回收，如果是非分泌蛋白质，则可以通过超声波处理等破碎宿主细胞等进行回收。蛋白质的精制方法如上所述例如可以使用HPLC或亲和色谱等。另外，也可以使用体外的蛋白表达体系或昆虫、动物、植物等生物体得到重组蛋白质。上述方法是公知的，只要是本领域技术人员，就可以适当变更。
[合成肽]
作为合成肽的方法，可以举出固相法或液相法等。肽合成中，可以举出将作为目标的氨基酸序列从N末端或C末端开始逐次结合的阶梯式延长法或将氨基酸序列分成适当的片段，使上述片段缩合，合成目标肽的片段缩合法。另外，作为肽合成法，可以举出在不溶性树脂上结合氨基酸，基于氨基酸序列信息，在该树脂上一个一个地结合氨基酸，使链延长的固相法；不使用树脂等载体的液相法。进而，也可以组合上述方法有效率地合成。上述方法是公知的，只要是本领域技术人员，就可以为了合成目标氨基酸序列而适当使用。另外，合成的肽可以进行精制。合成肽的精制可以使用沉淀法、HPLC、离子交换色谱、凝胶过滤色谱等公知方法。作为抗原使用合成肽时，因为原状态下缺乏抗原性，所以可以使用交联剂(例如，MBS(m-maleimidobenxoicacid)酯，DMS(dimethylsuberimidate)等)使其共价结合在BSA(BovineSerumAlbumin)或KLH(KeyholeLimpetHemocyanin)等载体上进行使用。
[单克隆抗体]
单克隆抗体可以通过公知方法制造。具体地可以间隔2～4周在1～6个月期间将上述抗原注入(免疫)免疫动物(例如小鼠等)，与多克隆抗体的制造方法同样地进行抗体效价检查。一旦检查得到所希望的抗体效价，就从免疫动物分离脾脏。分离的脾脏悬浮在无血清培养基(例如Iscove’s培养基(GIBCO社制))中，制成脾脏细胞悬浮液。将脾脏细胞和骨髓瘤细胞(骨髓瘤细胞)混合，加入聚乙二醇(PEG)，使细胞融合。然后，通过用次黄嘌呤(hypoxanthine)-氨基喋呤(aminopterine)-胸苷(thymidine)(HAT)选择培养基培养，仅使杂交瘤细胞(脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合的细胞)增殖。进而，为了选择产生作为目标的抗体的杂交瘤细胞，在检查有无作为目标的抗体的同时，进行检查阳性杂交瘤细胞的克隆。通过多次重复该操作，能够得到产生作为目标的抗体的克隆化杂交瘤细胞。然后，可以将克隆化杂交瘤细胞注射到免疫动物的腹腔内，2～4周后回收腹水，进行精制，由此得到单克隆抗体。将腹水精制的方法只要使用公知的方法即可，例如可以举出亲和色谱或凝胶过滤色谱等。
[重组抗体的制造方法]
另外，本发明的抗体可以为重组抗体。重组抗体是指在抗体产生工序中没有使用杂交瘤细胞的重组型单克隆抗体。作为例，可以举出仅具有最小的抗原结合部位的重组型单克隆抗体、具有多价型的抗原结合部位的重组型单克隆抗体、组合IgG和IgA制成分泌型的重组型单克隆抗体、实施了异种动物间的嵌合或人源化(humanization)的重组型单克隆抗体等。上述重组抗体可以通过使各亚型的免疫球蛋白基因在宿主内表达而得到。作为使用上述宿主的产生体系，可以举出使用大肠杆菌的方法、使用培养细胞的方法、使其在植物中产生的方法、在转基因小鼠中产生的方法等。
上述重组抗体的制造只要使用公知方法即可。作为具体例，可以举出噬菌体表面展示技术系统(例如Ricombinantantibodyexpressionsystem(AmershamBiosciences)等)。噬菌体表面展示技术系统是在作为大肠杆菌病毒的一种的M13等丝状噬菌体的外壳蛋白质上不丧失噬菌体的感染能力地使外来基因作为融合蛋白表达的系统。噬菌体是指感染细菌的病毒，具有在该DNA内接入外源性基因后感染并侵入宿主内进行增殖的能力。
[噬菌体表面展示技术系统]
以下列举通过噬菌体表面展示技术系统制作单克隆抗体的方法之一例，但本发明并不限定于以下的制作方法，本领域技术人员可以使用其他公知方法适当变更各工序。另外，只要是本领域技术人员，就可以在各工序中，适当设定温度、反应时间、使用溶液浓度、使用溶液量等参数，并加入变更进行实施。噬菌体表面展示技术系统中，首先制作噬菌体抗体文库，然后筛选抗体产生噬菌体，由此制作单克隆抗体。
制作噬菌体抗体文库
(1)从B细胞中提取mRNA，进行RT-PCR，制作cDNA文库。
B细胞只要使用由小鼠或人等采集的细胞即可。B细胞的RNA提取例如可以使用AGPC法(Acid-Guanidinium-Phenol-Chloroform法)等。AGPC法中，首先在B细胞中加入异硫氰酸胍溶液，进行匀浆。然后，在细胞的匀浆溶液中加入乙酸钠、苯酚、氯仿，进行混合，进行离心。离心后，回收溶液的水层。在回收的水层中加入异丙醇，混合后，进行离心，使RNA沉淀。沉淀物(RNA)再次溶解在异硫氰酸胍溶液中后，加入乙酸钠、苯酚、氯仿，进行振荡。振荡后，进行离心，再回收水层。在回收的水层中再加入异丙醇，进行离心，使RNA沉淀。在沉淀的RNA中加入70％乙醇，进行悬浮，再次离心，使RNA沉淀，由此能够得到总RNA(totalRNA)。然后，由总RNA提取mRNA可以使用结合在存在于mRNA的C末端侧的聚A序列上的引物(寡聚dT引物)，通过PCR使mRNA扩增，用寡聚dT柱(例如QIAGEN社制)等提取·精制。另外，也可以通过使用覆盖了寡聚dT的磁珠(例如NacalaiTesque社制)的亲和色谱等进行提取和精制。精制的mRNA可以在包含逆转录酶的反应溶液中通过PCR制作cDNA文库。
(2)在L链(Lightchain)和H链(Heavychain)的可变区域使用特异的引物分别通过PCR进行扩增。
作为抗体(免疫球蛋白(Ig)分子)的H链及L链的可变区域的VH及VL的序列可以由例如GenBank等购入。例如为了得到IgA型的人抗体，只要购买人的IgA的VL及VH序列，进行用于增加上述序列的引物设计，作为模板使用上述cDNA，通过PCR使两序列扩增即可。只要是本领域技术人员，就能够根据想要得到哪一种抗体，适当进行引物设计，另外也可以适当确定PCR等的条件。扩增的VL和VH只要通过公知方法精制即可。
(3)文库的构筑
精制的VL和VH分别通过连接臂连接成为单链，插入噬菌体载体，构建单链Fv(可变区域片段)基因文库。连接臂是连接各片段的序列。作为该连接臂，只要使用公知的序列作为连接臂即可。噬菌体载体是指组合了M13噬菌体或f1噬菌体的生成单链DNA所需的复制起点(IG区域)的质粒载体。噬菌体载体具备作为质粒的特性和作为单链DNA噬菌体的特性，不仅能够作为通常的双链DNA质粒进行操作，而且可以产生包含质粒中的一条DNA链的线状噬菌体粒子。作为噬菌体载体，只要使用公知的噬菌体载体即可(例如pCANTAB5E(AmershamBiosciences社制))。另外，作为其他方法，可以在抗体H链Fd部分(VH及CH1区域)及L链部分使用特异的引物，通过PCR扩增抗体基因片段，将上述基因片段插入噬菌体载体，由此构建与抗体Fab对应的基因文库。
筛选抗体产生噬菌体
(4)抗体表达噬菌体文库的浓缩
将使用噬菌体载体构建的抗体基因文库导入大肠杆菌，使辅助噬菌体(M13KO7，VCSM13等)感染，由此制作抗体表达噬菌体文库。作为该抗体表达噬菌体文库的浓缩方法，可以举出盘选法(淘选，panning)。通过该方法，可以使用精制的抗原(通过上述方法等精制的抗原)，通过固相法，从噬菌体文库中浓缩表达作为目标的抗体的噬菌体集团。盘选法中，将固相化抗原和噬菌体文库的反应、清洗(除去没有与固相化抗原结合的噬菌体文库)、溶出抗原结合噬菌体、通过对大肠杆菌感染的扩增之类步骤重复几次(例如4～5次)。由此能够浓缩抗原特异性噬菌体(抗体产生噬菌体)。
(5)抗原特异性噬菌体克隆的选择及单克隆抗体的取得
作为抗原特异性噬菌体克隆的选择法，例如可以使用ELISA法等。在以精制抗原为外壳的ELISA平板上，使抗体产生噬菌体反应，研究与精制抗原的反应性(结合性)。重复该工序，筛选克隆，由此能够得到产生单克隆抗体的噬菌体。然后通过使该噬菌体在大肠杆菌中增殖，回收抗体，能够取得单克隆抗体。上述抗体能够使用例如亲和色谱等公知的精制方法进行精制。
作为本发明的优选方案，可以举出为了制作骨关节炎或骨关节炎性关节炎的治疗剂或预防剂、软骨基质分解酶产生抑制剂、软骨基质产生剂及由骨关节炎诱导的巨噬细胞的凋亡诱导剂而使用本发明的抗体。即，本发明还提供骨关节炎治疗方法；骨关节炎性关节炎治疗方法；IgM型抗Fas抗体在制造软骨基质分解酶产生抑制剂中的用途；IgM型抗Fas抗体在制造软骨基质产生剂中的用途；IgM型抗Fas抗体在制造对被骨关节炎诱导的巨噬细胞的凋亡诱导剂中的用途。该IgM型抗Fas抗体的用途中，可以组合使用之前说明的各方案。
本发明的药剂对本领域技术人员来说只要通过公知方法制造即可。本发明的药剂可以作为口服用制剂及非口服用制剂制造，优选为非口服用制剂。该非口服用制剂可以是液剂(水性液剂、非水性液剂、悬浮性液剂、乳浊性液剂等)，也可以是固体剂(粉末填充制剂、冷冻干燥制剂等)。另外，本发明的药剂还可以是缓释制剂。
制造液剂的方法可以通过公知方法制造。例如可以通过将抗体溶解在药学上允许的溶剂中，填充到灭菌的液剂用容器中进行制造。作为药学上允许的溶剂，例如可以举出注射用水、蒸馏水、生理盐水、电解质溶液剂等，优选使用灭菌的溶剂。作为灭菌的液剂用容器，可以举出安瓿、药水瓶、袋等。上述容器可以使用玻璃制或塑料制等公知容器。具体地作为塑料制容器，可以举出使用了聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、乙烯·乙酸乙烯基酯·共聚物等材质的容器。上述容器或溶剂的灭菌法可以举出加热法(火焰法、干燥法、高温蒸汽法、流通蒸汽法、煮沸法等)、过滤法、照射法(放射线法、紫外线法、高频法等)、气体法、药液法等。上述灭菌法只要是本领域技术人员就能够对应于容器的材质、溶剂的性质适当选择使用。
制造固体剂的方法可以使用冷冻干燥法、喷雾干燥(喷雾干燥)法、无菌重结晶法等公知方法。例如冷冻干燥剂可以经过以下工序制造。(1)将结晶化的抗体在室温4℃、常压下放置2～3小时，进行冷却(冷却工序)。(2)在室温-50℃、常压下放置12～15小时，使其冷冻(冷冻工序)。(3)在室温-20℃、常压下放置4～6小时，使其重结晶(重结晶化工序)。(4)在室温-50℃、常压下放置14～16小时，使其再冷冻(再冷冻工序)。(5)在室温-13℃、压力10～20kPa下(高真空下)放置24～26小时(第1干燥工序)。(6)在室温24℃、压力10～20kPa下(高真空下)放置10～121小时(第2干燥工序)。(7)在室温24℃、常压下放置。由此冷冻干燥法使其在低温下冷冻，在高真空下使水分(冰)升华除去。本发明的冷冻干燥剂可以通过上述方法制造，但对其制造方法没有限定，只要是本领域技术人员，就可以适当变更。另外，各工序的温度、压力、时间等参数可以适当变更。
另外，本发明也能够提供组合了本发明的包含IgM型抗Fas抗体的药剂和医疗用具的试剂盒制品。例如可以举出将本发明的包含IgM型抗Fas抗体的药剂预先填充在注射筒等医疗用具中的制品，在1个软袋中隔着间隔壁一边填充固体剂，另一边填充溶剂，使用时打开间隔壁就能够混合的制品等。由此不仅能够减轻使用时医疗从业者调制的负担，而且能够防止细菌污染或异物混入等，能够优选使用。因为上述注射筒或软袋是公知的，所以只要是医疗从业者就能够适当使用。
本发明的包含IgM型抗Fas抗体的药剂可以采用静脉内给药、动脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、腹腔内给药、鼻腔内给药等公知给药方法进行给药。优选通过注射给药，也可通过点滴注入。另外，本发明的药剂可以直接注射到患部(例如关节)，另外也可以通过外科手术将患部开口进行给药。本发明的药剂可以调制成口服用制剂及非口服用制剂，优选为非口服用制剂。上述非口服用制剂可以制成液剂(水性液剂、非水性液剂、悬浮性液剂、乳浊性液剂等)，也可以制成固体剂(粉末填充制剂、冷冻干燥制剂等)。固体剂在进行给药时，用药学上允许的溶剂在使用时溶解或悬浮成所希望的浓度进行使用。上述非口服用制剂可以通过注射或点滴等给药方法使用。
将本发明的包含IgM型抗Fas抗体的药剂制剂化时，可以适当组合药学上允许的载体或介质等制成制剂。进而，也可以包含药剂。另外，本发明的包含IgM型抗Fas抗体的药剂可以包含白蛋白、脂蛋白、球蛋白等不影响本发明抗体的作用的蛋白质。由此通过包含蛋白质，能够提高液剂中包含的抗体的稳定性。上述蛋白质在将本发明的药剂制成液剂时只要包含在液剂中即可。制成固体剂时，可以在将本发明的抗Fas抗体固形化时包含上述蛋白质，也可以在溶剂固体剂的溶剂中包含上述蛋白质。上述蛋白质的含量在使给药时的液量为100重量份时，可以举出0.01重量份～5重量份，只要是本领域技术人员，就能够对应于给药的抗体量或包含的其他物质进行适当调整。
[药学上允许的载体或介质]
药学上允许的载体或介质例如可以举出赋型剂、稳定化剂、溶解助剂、乳化剂、悬浮化剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂或保存剂等药学上允许的物质。另外，也可以使用聚乙二醇(PEG)等高分子材料或环糊精等抱合化合物。以下列举具体例，但本发明并不限定于此，可以使用公知物质。作为赋型剂，优选淀粉或乳糖等本身不具有药理作用的赋形剂。作为稳定化剂，可以举出白蛋白、明胶、山梨糖醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、葡萄糖等。上述物质中，优选为蔗糖或海藻糖。作为溶解助剂，可以举出乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇等。作为乳化剂，可以举出卵磷脂、硬脂酸铝或倍半油酸失水山梨糖醇酯等。作为悬浮化剂，可以举出聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)或羧甲纤维素(CMC)等。作为等渗剂，可以举出氯化钠、葡萄糖等。作为缓冲剂，可以举出柠檬酸盐、乙酸盐、硼酸或磷酸盐等。作为抗氧化剂，可以举出抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等。作为保存剂，可以举出苯酚、硫柳汞、苯扎氯铵等。
作为与本发明的抗体组合的药剂，可以举出关节疾病治疗剂、抗炎症剂、镇痛剂、骨再生剂、骨吸收抑制剂、抗生物质或成长剂等，可以举出关节疾病中使用的公知药剂。另外，将本发明的包含抗Fas抗体的药剂通过注射等进行给药时，因为能引起注射导致的疼痛，所以也可以包含无痛化剂。上述药剂可以组合1种或2种以上。
作为关节疾病治疗剂，例如可以举出关节软骨细胞外基质分解拮抗剂(WO2004/017996号说明书)、肾上腺皮质激素剂或硫酸软骨素钠、透明质酸(hyaluronicacid(HA))等关节软骨的保护剂或作为信号级联放大体系拮抗剂的p21活性化激酶(PAK)拮抗剂(特表2007-537134号公报)等。
作为抗炎症剂，可以举出甾体性抗炎症剂或非甾体性抗炎症剂(NSAIDs)等。甾体性抗炎症剂例如可以举出地塞米松、可的松，氢可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、倍他米松、去炎松、曲安奈德、肤轻松、氟轻松、倍氯米松、乙柳酰胺等。作为非甾体性抗炎症剂，例如可以举出阿司匹林、布洛芬、萘普生、二氯芬酸、吲哚美辛、萘丁美酮、苯基丁氮酮、罗非昔布、塞来昔布、昔康、吡罗昔康、吡唑啉酮、阿扎丙酮等。
作为镇痛剂，除了也是消炎镇痛药的NSAIDs，还可以举出阿片类镇痛药等。作为阿片类镇痛药，例如可以举出内啡肽、强啡肽、脑啡肽、可待因、二氢可待因、右旋丙氧芬等。
作为骨吸收抑制剂，可以举出雌激素剂、降钙素及双磷酸盐中的任意1种或2种以上的混合物。
作为抗生物质，可以举出青霉素类抗生物质、头孢烯类抗生物质、氨基糖苷类抗生物质、大环内酯类抗生物质、四环素类抗生物质、肽类抗生物质等抗生物质。作为青霉素类抗生物质，可以举出苄基青霉素、苯氧基甲基青霉素、甲氧西林、氟氯西林、阿莫西林、氨苄青霉素、哌拉西林、阿洛西林、替卡西林等。作为头孢烯类抗生物质，可以举出头孢唑林、头孢呋辛、头孢羟唑、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢匹胺、头孢氨苄、头孢克洛、头孢克肟、头孢特仑等。作为氨基糖苷类抗生物质，可以举出庆大霉素、奈替米星、妥布霉素、链霉素、新霉素、卡那霉素、阿米卡星等。作为大环内酯类抗生物质，可以举出红霉素、克拉霉素、罗红霉素、罗他霉素、克林霉素、阿奇霉素等。作为四环素类抗生物质，可以举出四环素、米诺环素、强力霉素等。此外，作为β-内酰胺类抗生物质，可以举出拉氧头孢、氟氧头孢、氨曲南、亚胺培南、帕尼培南。另外，此外可以举出万古霉素、利福平、氯霉素等。
作为生长因子，可以举出成骨因子(BMP)、骨增殖因子(BGF)、来自血小板的增殖因子(PDGF)、碱性纤维芽细胞增殖因子(bFGF)、胰岛素、胰岛素样增殖因子(IGF)、激素、细胞因子或转化增殖因子(TGF)等。上述成长剂可以包含1种或2种以上，进而可以与具有其他药效的公知药剂组合。
根据注射导致的疼痛而使用不同的无痛化剂，所述疼痛是因为液剂的pH及渗透压与体液显著不同或是因药剂本身的作用而引起的。疼痛因pH、渗透压而发生时，优选制成包含缓冲剂或等渗剂等的液剂。另一方面，因药剂本身的作用引起疼痛时，可以使用局部麻醉剂等。作为局部麻醉剂，例如可以举出苄基醇、氯丁醇、盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因、盐酸二丁卡因、盐酸甲哌卡因等，只要使用公知药剂即可。
如上所述制造的本发明的含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的药剂可以用作对骨关节炎或骨关节炎性关节炎的患者以有效量给药的治疗方法或预防方法。另外，因为本发明的含有IgM型抗Fas抗体作为有效成分的药剂抑制软骨基质分解酶产生，所以为了促进或改善软骨基质的产生及为了诱导骨关节炎中诱导的巨噬细胞凋亡，能够作为对患者给予有效量的治疗方法或预防方法进行利用。即，本发明还提供对对象给予有效量的IgM型抗Fas抗体的治疗或预防骨关节炎的方法；对对象给予有效量的IgM型抗Fas抗体的骨关节炎性关节炎治疗方法；对对象给予有效量的IgM型抗Fas抗体的软骨基质分解酶产生抑制方法；对对象给予有效量的IgM型抗Fas抗体的软骨基质产生方法；对骨关节炎中诱导的巨噬细胞的凋亡诱导方法。在该IgM型抗Fas抗体的用途中，可以组合之前说明的各方案进行使用。
本发明的药剂作为口服用或非口服用制剂进行使用，优选作为注射剂、点滴剂等非口服用制剂进行使用。非口服用制剂的给药方法只要使用公知方法即可，没有特别限定。例如可以举出静脉注射、动脉注射、皮下注射、肌肉注射、点滴等。另外，本发明的药剂可以直接注射到患部(例如关节)，另外也可以通过外科手术将患部开口进行给药。只要是本领域技术人员，就能够适当选择适合患者的给药方法。作为本发明的药剂的主成分的IgM型抗Fas抗体只要在本发明的药剂中包含有效量即可。本发明的药剂中包含的IgM型抗Fas抗体的比例在以总重量为100重量份时，只要为1×10-3～1×10重量份即可，优选为1×10-2～1×10-1重量份，更优选为5×10-2～5×10-1重量份。给药量根据给药的对象、年龄、症状等而改变。一般来说，1日的给药量以抗体的有效成分计可以举出每个个体为1ng～100μg，优选为10ng～10μg，更优选为100ng～1μg。或可以举出每1kg体重为10pg～2μg，优选为100pg～200ng，更优选为1ng～20ng。优选将1日的给药量分2～5次进行给药。另外，也可以将本发明的药剂制成缓释制剂，能够减少每1日的给药次数。为了制成上述缓释制剂，只要利用公知方法即可。通过分开给药或制成缓释制剂，容易将生物体内的药剂浓度保持一定，所以容易获得持续的药效，进而能够减轻副作用，所以能够减轻对患者的负担。
以下，具体地基于实施例说明本发明，但本发明并不限定于实施例。
实施例1
培养细胞的建立
取得知情同意后，由骨关节炎患者的手术组织采集骨软骨组织和末梢血，通过下述方法采集滑膜纤维芽细胞、软骨细胞、巨噬细胞。
滑膜纤维芽细胞
取得知情同意后，从骨关节炎患者的手术组织采集滑膜组织，切碎后，在含有1.0mg/ml胶原酶(collagenase)的液体低葡萄糖Dulbecco’smodifiedEagle’smedium(DMEM，Gibco社制)培养基内(37℃)下处理一夜，分离培养滑膜纤维芽细胞。通常，细胞在培养烧瓶(培养面积25cm2)中培养，实验中使用时在聚乙烯制培养皿(直径6cm)中培养。细胞培养如下进行：使用在DMEM培养基中添加培养基容量的10％的灭活胎牛血清(FetalBovineSerum(FBS)，Heat-inactivated，TRACE社制)、进而添加了2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES、100units/ml的青霉素和链霉素的培养基，在37℃、饱和湿度下，设定为5％CO2+95％air的CO2培养器(正常氧浓度环境)中进行培养。细胞的次代在用磷酸缓冲液(PBS，NISSUI社制)清洗后，使用0.25％胰蛋白酶-PBS液(Gibco社制)消化细胞，通过移液使细胞分散后，用培养基稀释至适当的浓度。
软骨细胞
取得知情同意后，从骨关节炎患者的手术组织采集软骨组织，切碎后，在含有1.5mg/ml胶原酶B(collagenaseB)的液体低葡萄糖Dulbecco’smodifiedEagle’smedium(DMEM，Gibco社制)培养基内(37℃)下处理一夜，分离培养软骨细胞。通常，细胞用培养烧瓶(培养面积25cm2)培养，实验中使用时在聚乙烯制培养皿(直径6cm)中培养。细胞培养使用在DMEM培养基中添加培养基容量的10％的灭活胎牛血清(FBS，TRACE社制)、进而添加了2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES、100units/ml的青霉素和链霉素的培养基，在37℃、饱和湿度下，用设定为5％CO2+95％air的CO2培养器(正常氧浓度环境)进行培养。细胞的次代在用磷酸缓冲液(PBS，NISSUI社制)清洗后，使用0.25％胰蛋白酶-PBS液(Gibco社制)消化细胞，通过移液使细胞分散后，用培养基稀释成适当的浓度。
巨噬细胞
取得知情同意后，从采集了上述手术检体的患者采血50ml，得到1％加肝素血。将淋巴细胞分离液上重叠了该血液的离心管以1500转/分离心30分钟，分别分离淋巴细胞和巨噬细胞。细胞培养使用在RPMI培养基中添加培养基容量的10％的灭活胎牛血清(FBS，TRACE社制)、进而添加了2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES、100units/ml的青霉素和链霉素的培养基，在37℃，饱和湿度下，用设定为5％CO2+95％air的CO2培养器(正常氧浓度环境)进行培养。
使用2层式Transwell小室的细胞培养
在用3μm微孔尺寸的多孔过滤器隔开的2层式Transwell小室(东洋纺)的上层部接种滑膜纤维芽细胞(1×106个/孔)或巨噬细胞(1×106个/孔)，在下层部接种软骨细胞(1×106个/孔)，进行培养。该培养体系的上层(炎症性细胞培养层)相当于滑膜炎，下层(软骨培养层)相当于软骨组织。在小室上层添加或未添加各种浓度(0.1，1.0，10.0ng/ml)的IgM型抗Fas抗体的条件下，在上层添加炎症性细胞因子(TNF-α：10ng/ml或IL-1β：10ng/ml)，培养48小时。经时回收培养上清和细胞，通过下述实验方法解析各种细胞活性。
实施例2
研究IgM型抗Fas抗体对软骨基质分解酶(MMP)产生的抑制作用
使用酶联免疫吸附法(ELISA)分析IgM型抗Fas抗体(CH-11(小鼠抗体)(MBL社制))对通过软骨异化诱导因子TNF-α增强的软骨基质分解酶产生的影响。研究所使用的IgM型抗Fas抗体(CH-11)是由将小鼠骨髓瘤细胞NS-1和Balb/c小鼠的脾脏融合得到的杂交瘤产生的抗体。杂交瘤由来自人2倍体纤维芽细胞株(Humandiploidfibroblastcellline)FS-7的抗原制作。
分别以1×106个/孔将通过上述方法分离培养的软骨细胞接种到Transwell小室的下层，将滑膜纤维芽细胞接种到上层。在上层中添加TNF-α：10ng/ml。进而按下述表1的组合在上层中添加各种浓度(0.1，1.0，5.0，10.0ng/ml)的IgM型抗Fas抗体或透明质酸制剂(HA)，培养48小时后，回收培养液。另外，作为比较对照，使用透明质酸制剂(HA)(0.1，1.0mg/ml)。研究条件的组合示于下表5。表5中，TNF-α(+)的TNF-α浓度为10ng/ml。HA的浓度单位为mg/ml，IgM型抗Fas抗体CH-11的浓度单位为ng/ml。表1的No.1为阴性对照(Negativecontrol)，No.2为阳性对照(Positivecontrol)。
[表5]
表5
No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
TNF-α - + + + + + + + + + + +
HA - - 0.1 1.0 - - - - 1.0 1.0 1.0 1.0
CH-11 - - - - 0.1 1.0 5.0 10.0 0.1 1.0 5.0 10.0
培养上清中的软骨基质分解酶基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-3浓度使用作为本技术领域目前已知的标准技术的ELISA试剂盒(MMP-1，MMP-3：R&D社制)确定。该ELISA通过以下的标准方法进行。ELISA以样本数6(n＝6)进行。将稀释的培养上清样品按致敏平板每1孔添加100μl，在室温下静置1小时(1次反应)。1次反应后，使用清洗瓶，将各孔用PBS充分清洗4次以上。将用0.1％Tween20-PBS稀释了3000倍的辣根·过氧化物酶(HorseradishPeroxidase：HRP)标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体，在各孔中每孔分注100μl，在室温下静置1小时(2次反应)。2次反应后，同样地用PBS清洗后，每1孔添加100μl0.8mMTMB(四甲基联苯胺：Tetramethylbenzidine)溶液，在30℃下显色5～20分钟(显色反应)。每1孔加入100μl1.5NH3PO4，使显色反应停止，使用微量滴定板读取器(microtiterplatereader)，测定450nm处的吸光度。根据制造商提供的说明书，使用对照冷冻干燥试剂校正测定浓度，进行显著性差异检查。结果示于图2。图中，*表示显著性差异检查的拒绝率(P值)不足0.05(P＜0.05)，**表示显著性差异检查的拒绝率(P值)不足0.01(P＜0.01)(下同)。
图2A是代表IgM型抗Fas抗体对软骨细胞的MMP1产生能力的影响的图表。图2A的纵轴用每1ml培养基的浓度表示由软骨细胞产生的MMP1。结果可知对被TNF-α刺激增强的软骨基质分解酶(MMP1)产生的抑制能力，IgM型抗Fas抗体(No.5～8)比HA单独(No.3及4)高。因此，表示IgM型抗Fas抗体能够有效果地抑制MMP1产生。
图2B是代表IgM型抗Fas抗体对软骨细胞的MMP3产生能力的影响的图表。图2B的纵轴用每1ml培养基的浓度表示由软骨细胞产生的MMP3。结果，可知对被TNF-α刺激增强的软骨基质分解酶(MMP3)产生的抑制能力，IgM型抗Fas抗体(No.5～8)比HA单独(No.3及4)高。因此，表示IgM型抗Fas抗体能够有效果地抑制MMP3产生。
图2中显示IgM型抗Fas抗体有效果地抑制作为软骨基质分解酶的MMP的产生。如上所述，MMP分解关节软骨。所以，MMP能成为引起骨关节炎或使骨关节炎的症状恶化的原因。如本实施例所示，IgM型抗Fas抗体抑制MMP的产生。由此，IgM型抗Fas抗体能够抑制骨关节炎发病，另外能够抑制骨关节炎的症状恶化。因此，IgM型抗Fas抗体能优选用作骨关节炎的预防剂。进而，因为MMP1及MMP3也参与免疫应答，所以IgM型抗Fas抗体通过抑制MMP1及MMP3的产生，也可以用作骨关节炎发病后发生的骨关节炎性关节炎的预防剂或治疗剂。
实施例3
IgM型抗Fas抗体对软骨基质产生能力下降的改善作用的研究
使用ELISA解析IgM型抗Fas抗体对因软骨异化诱导因子TNF-α或IL-1β而下降的软骨基质(蛋白聚糖)产生能力是否有抑制效果。
与上述IgM型抗Fas抗体对软骨基质分解酶酸性的抑制作用的研究中使用的方法同样地分别以1×106个/孔在Transwell小室的下层接种软骨细胞，在上层接种巨噬细胞。在上层中添加TNF-α：10ng/ml或IL-1β：10ng/ml。进而在上层中添加或未添加各种浓度(1.0，10.0ng/ml)的IgM型抗Fas抗体的条件下培养48小时后，回收培养液。培养上清中的软骨基质(蛋白聚糖)产生量(浓度)使用作为本技术领域目前已知的标准性技术的ELISA试剂盒(蛋白聚糖：Biosource社制)确定。将其结果示于图3。
图3是代表IgM型抗Fas抗体对软骨基质(蛋白聚糖)产生能力下降的效果的图表。图3的纵轴表示蛋白聚糖产生量。纵轴的值越高高，越产生蛋白聚糖。即，表示IgM型抗Fas抗体改善被TNF-α抑制的蛋白聚糖合成能力。结果可知IgM型抗Fas抗体能够改善被TNF-α及IL-1β抑制的软骨基质(蛋白聚糖)合成能力。
图3中显示IgM型抗Fas抗体改善软骨基质(蛋白聚糖)的合成。骨关节炎中，作为病态观察到关节软骨的破坏。因此，因为IgM型抗Fas抗体能够改善骨关节炎中被破坏的关节软骨再生所需的软骨基质(蛋白聚糖)的合成，所以能优选用作骨关节炎的治疗剂。
实施例4
IgM型抗Fas抗体对凋亡的抑制效果
使用ApoStandELISAApotosisDetectionKit(BiomolInternational社)研究IgM型抗Fas抗体对被软骨异化诱导因子TNF-α诱导的软骨细胞的凋亡是否有抑制效果。该试剂盒用甲酰胺使发生凋亡的细胞的DNA特异性变性，通过抗single-strandedDNA抗体检出变性的DNA，能够定量地检出凋亡。
与上述IgM型抗Fas抗体对软骨基质分解酶酸性的抑制作用的研究中使用的方法同样地分别以1×106个/孔在Transwell小室的下层接种软骨细胞，在上层中接种巨噬细胞。在上层中添加TNF-α：10ng/ml。进而在上层中添加或未添加IgM型抗Fas抗体(10.0ng/ml)的条件下培养48小时。除去培养基·诱导物质，加入试剂盒中附带的细胞固定液，固定细胞。然后，将溶液除去并干燥后，加入甲酰胺，在56℃下加热，使发生凋亡的细胞的DNA热变性。冷却后，除去甲酰胺，加入封闭溶液(Blockingsolution)，进行封闭。除去封闭溶液，加入抗single-strandedDNA(ssDNA)抗体，在室温下培养4小时。用PBS清洗3次后，加入Peroxidasesubstrate，用微量滴定器测定405nm处的吸光度。将其结果示于图4。
图4是代表IgM型抗Fas抗体的凋亡抑制效果的图表。图4的纵轴表示细胞的核的凋亡的比例(％)。即，值越低，表示凋亡被抑制。结果可知IgM型抗Fas抗体能够抑制由TNF-α引起的软骨细胞的凋亡。需要说明的是，已知骨关节炎是TNF-α被诱导的状态。因此，根据本实施例，表示IgM型抗Fas抗体能够抑制骨关节炎中引起的软骨细胞的凋亡。
图4中表示IgM型抗Fas抗体抑制巨噬细胞导致的软骨细胞死亡。因此，认为IgM型抗Fas抗体抑制软骨变性，能够优选用作骨关节炎的治疗剂或预防剂。另外，认为上述用途是因为IgM型抗Fas抗体诱导了巨噬细胞的凋亡。已知巨噬细胞诱导炎症性细胞因子。因此，IgM型抗Fas抗体通过诱导巨噬细胞的凋亡，抑制来自巨噬细胞的炎症性细胞因子的释放，抑制炎症反应。因此，IgM型抗Fas抗体能用作对可由骨关节炎引发的2次炎症反应(骨关节炎性关节炎)的预防剂及治疗剂。
实施例5
对于有凋亡诱导能力的激动剂抗Fas抗体作为OA治疗药的可能性，在invitro实验系中评价抗体的亚型(IgG型和IgM型)的差异产生的该可能性的差异。IgG型抗体使用UB2(MBL社制)及ZB4(MBL社制)。IgM型抗体使用CH-11(MBL社制)及7C11(BeckmanCoulter社制)。各自的对照使用IgG同种型(SouthernBiotech社制)及IgM同种型(SouthernBiotech社制)。
培养细胞的建立
取得知情同意后，由骨关节炎患者5名(n＝5)的手术组织采集骨软骨组织和末梢血，通过与实施例1同样的方法采集滑膜纤维芽细胞、软骨细胞及巨噬细胞。
使用了2层式Transwell小室的细胞培养
在被3mm微孔尺寸的多孔过滤器隔开的2层式反式孔小室(东洋纺社制)的上层部接种滑膜纤维芽细胞(1×105个/孔)或巨噬细胞(1×105个/孔)，在下层部接种软骨细胞(1×105个/孔)，进行培养。该培养体系的上层(炎症性细胞培养层)相当于滑膜炎，下层(软骨培养层)相当于软骨组织。
在小室上层内添加或未添加各种的上述Fas抗体或同种型的条件下，在上层中添加炎症性细胞因子(TNF-α：10ng/ml)，培养48小时。经时回收培养上清和细胞，通过下述实验方法解吸各种的细胞活性。
不同亚型抗Fas抗体对软骨基质分解酶(MMP)产生的抑制作用
使用酶结合免疫分析法(ELISA)解析不同亚型抗Fas抗体对被软骨异化诱导因子TNF-α增强的软骨基质分解酶产生的影响。
分别以1×105细胞/孔将通过上述方法分离培养的软骨细胞接种到Transwell小室的下层，将滑膜纤维芽细胞接种到上层。在上层中添加TNF-α：10ng/ml。进而在上层中添加或未添加各种浓度(0.01nM)的各种Fas抗体的条件下培养48小时后，回收培养液。
培养上清中的软骨基质分解酶基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-3浓度使用作为本技术领域目前已知的标准性技术的ELISA试剂盒(MMP-1，MMP-3(R&D社制))确定。需要说明的是，ELISA与上述方法同样地进行。将其结果示于图5。
图5A是代表IgM型抗Fas抗体或IgG型抗Fas抗体对软骨细胞的MMP1产生能力的影响的图表。图5A的纵轴用每1ml培养基的浓度表示由软骨细胞产生的MMP1。图5A中，No.1表示阴性对照(Negativecontrol)，No.2表示阳性对照(Positivecontrol)。结果可知对被TNF-α刺激增强的软骨基质分解酶(MMP1)产生的抑制能力，IgM型抗Fas抗体(No.7～8)比IgG型抗Fas抗体(No.5～6)高。因此，IgM型抗Fas抗体可以说能够有效果地抑制MMP1产生。
图5B是代表IgM型抗Fas抗体或IgG型抗Fas抗体对软骨细胞的MMP3产生能力的影响的图表。图5B的纵轴用每1ml培养基的浓度表示由软骨细胞产生的MMP3。图5B中，No.1表示阴性对照(Negativecontrol)，No.2表示阳性对照(Positivecontrol)。结果可知对被TNF-α刺激增强的软骨基质分解酶(MMP3)产生的抑制能力，IgM型抗Fas抗体(No.7～8)比IgG型抗Fas抗体(No.5～6)高。因此，可以说IgM型抗Fas抗体能够有效果地抑制MMP3产生。
图5中显示IgM型抗Fas抗体有效果地抑制作为软骨基质分解酶的MMP的产生。如上所述，MMP分解关节软骨。所以，MMP能够成为引起骨关节炎或使骨关节炎的症状恶化的原因。如本实施例所示，IgM型抗Fas抗体抑制MMP的产生。由此IgM型抗Fas抗体能够抑制骨关节炎发病，另外能够抑制骨关节炎的症状恶化。因此，IgM型抗Fas抗体能够优选作为骨关节炎的预防剂使用。进而，因为MMP1及MMP3也参与免疫应答，所以IgM型抗Fas抗体也可以通过抑制MMP1及MMP3的产生用作骨关节炎的发病后引发的骨关节炎性关节炎的预防剂或治疗剂。
实施例6
不同亚型的抗Fas抗体对凋亡的抑制效果
使用ApoStandELISAApoptosisDetectionKit(BiomolInternational社)研究不同亚型的抗Fas抗体对被软骨异化诱导因子TNF-α诱导的软骨细胞的凋亡是否有抑制效果。
与上述方法同样地使用2层式Transwell小室进行细胞培养。分别以1×105细胞/孔在Transwell小室的下层接种软骨细胞，在上层中接种巨噬细胞。在上层中添加TNF-α：10ng/ml。进而在上层中添加或未添加各种抗Fas抗体(0.01nM)的条件下培养48小时。除去培养基·诱导物质，加入试剂盒内的细胞固定液，将细胞固定。然后，将溶液除去·干燥后，加入甲酰胺，在56℃下加热，使发生了凋亡的细胞的DNA热变性。冷却后，除去甲酰胺，加入封闭溶液(Blockingsolution)，进行封闭。除去封闭溶液，加入抗single-strandedDNA(ssDNA)抗体在室温下培养4小时。用PBS清洗3次后，加入Peroxidasesubstrate，用微量滴定器测定405nm处的吸光度。将其结果示于图6。
图6是代表IgM型抗Fas抗体或IgG型抗Fas抗体的凋亡抑制效果的图表。图6的纵轴表示细胞的核的凋亡的比例(％)。即，值越低，越表示凋亡被抑制。图6中，No.1表示阴性对照(Negativecontrol)，No.2表示阳性对照(Positivecontrol)。结果可知IgM型抗Fas抗体与IgG型抗Fas抗体相比，能够抑制由TNF-α引起的软骨细胞的凋亡。需要说明的是，已知骨关节炎中是NF-α被诱导的状态。因此，显示IgM型抗Fas抗体能够抑制骨关节炎中引起的软骨细胞的凋亡。
图6中显示IgM型抗Fas抗体有效果地抑制由巨噬细胞导致的软骨细胞死亡。因此，认为IgM型抗Fas抗体有效果地抑制软骨变性，能够优选用作骨关节炎的治疗剂或预防剂。另外，认为上述作用是因为IgM型抗Fas抗体诱导了巨噬细胞的凋亡。已知巨噬细胞诱导炎症性细胞因子。因此，IgM型抗Fas抗体通过诱导巨噬细胞的凋亡，抑制来自巨噬细胞的炎症性细胞因子的释放，抑制炎症反应。因此，IgM型抗Fas抗体能用作对可由骨关节炎引发的2次炎症反应(骨关节炎性关节炎)的预防剂及治疗剂。
实施例7
IgM型抗Fas抗体对骨关节炎模型大鼠的效果
使用诱导了骨关节炎的大鼠进行IgM型抗Fas抗体CH-11的药效评价试验。
骨关节炎模型大鼠的制作
将大鼠(Wisterrat，体重200g～250g)检疫·驯化饲养约1周后，进行盐酸氯胺酮(PFIZER(株)社制，Ketalar100)及甲苯噻嗪盐酸盐的并用麻醉(肌肉内给药)，麻醉效果差时在上述混合麻醉溶液或戊巴比妥·Na静脉内给药下除去左右膝关节部位的毛，用作为碘类消毒液的聚烯吡酮碘消毒。消毒后，将膝关节内侧的表皮切开，切断内侧侧副韧带后，确认·切开关节包，将内侧半月板露出·全摘出。将关节包的周围组织及表皮缝合。缝合时用包含抗生物质(注射用氨苄青霉素钠)的生理盐水(500mg(效价)/20ml)清洗术部。
制作的骨关节炎模型大鼠如下述表6所示分小组，使用27规格的注射针将受试物质或对象液每周1次经24周进行关节内注射。
[表6]
表6
实验组 处置 每4周解剖数 总数
A 对照组 关节症手术+盐水(介质) - 5
B 非特异性抗体对照组 关节症手术+IgM抗体给药 5 30
C 受试物质低用量 关节症手术+CH-11低用量 5 30
D 受试物质高用量 关节症手术+CH-11高用量 5 30
E 手术对照组 假手术+盐水(介质) - 2
病理学检查
每4周5只在戊巴比妥·Na(静脉内给药)的深麻醉下通过放血实施安乐死后进行剖检。对于第8、12及24周的计划剖检例，采集左右膝关节组织、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、脑、精巢及精囊，用4％对甲醛溶液固定。对于关节组织，将用Plank·Rychlo脱钙液脱钙、进行中和后用石蜡包埋、切片得到的标本进行苏木素-伊红染色及番红O染色。对于其他器官，将进行石蜡包埋、切片的标本进行苏木素-伊红染色，用光学显微镜实施病理组织学检查。
IgM型抗Fas抗体给药对关节症病理组织评分的影响
将制作的骨关节炎模型大鼠分成3组，使用micro-needle注射器，每周1次在对照组(表3中A及B)的左膝关节注入盐水或对照抗体溶液(10.0ng/ml)50.0μl，在CH-11给药组(表3中C及D)的左膝关节注入CH-11(低用量给药组：1.0ng/ml，高用量给药组：10.0ng/ml)50.0μl。各组以例数4(n＝4)进行。关节炎及关节症的病势(关节症病理组织评分)在处置后第4周、第8周、第12周、第16周及第24周进行观察，通过Student’sT法统计学比较2组间的差。两组均不处置右膝关节，比较观察关节炎的发病和进行的程度。将其结果示于图7。需要说明的是，关节症病理组织评分使用上述表4所示的修正Mankin评分。
图7A表示番红O染色的结果。图7B表示软骨细胞缺损的结果。图7C表示软骨结构的结果。图7A～图7C的纵轴表示各评分，横轴表示经时变化。图7A～图7C的结果确认了对照组的大鼠膝关节的软骨变性度(修正Mankin评分)与评分的各项目(表4：A～C)均观察到经时增强，确认了关节症的诱导和增恶(骨关节炎从初期阶段移行到发展期阶段)。相反，CH-11给药组的评分有从给药开始后第8周开始显示比对照组的平均评分低的值的倾向，在第12周以后CH-11低用量给药组、CH-11高用量给药组均观察到统计学显著性差异。因此，IgM型抗Fas抗体CH-11在初期～发展期阶段的骨关节炎模型大鼠中，显示抑制软骨变性。因此，显示IgM型抗Fas抗体能够有效果地用于伴随软骨变性的分类为骨关节炎的初期阶段～发展期阶段的疾病的治疗。
实施例8
IgM型抗Fas抗体给药对病理组织的影响
通过上述病理组织学检查研究对骨关节炎模型大鼠给予IgM型抗Fas抗体时对各组织的影响。骨关节炎模型大鼠使用处置后第12周及第24周的大鼠。用光学显微镜观察·拍摄各大鼠的膝关节组织的病理标本的结果示于图8及图9。在图8及图9中，“×40”及“×200”表示光学显微镜的倍率。
图8是代表处置后第12周的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本的图的照片。图8A～图8F表示对照的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图8G～图8J表示CH-11低用量给药组(CH-11：1.0ng/ml给药)的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图8K～图8N表示CH-11高用量给药组(CH-11：10.0ng/ml给药)的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图8O表示对照的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图8P表示CH-11低用量给药组(CH-11：1.0ng/ml给药)的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图8B、图8D、图8F、图8G、图8I、图8K及图8M分别表示代替图8A、图8C、图8E、图8H、图8J、图8L及图8N中被四角包围的部分的放大图的照片。
由图8的结果，在对照组(图8A～图8F及图8O)中，与CH-11给药组(图8G～图8N及图8P)相比，确认了软骨变性(软骨细胞聚集或软骨细胞消失)。需要说明的是，软骨细胞聚集可以由被番红O染色部位增加判断。软骨细胞消失如图8O及图8P所示，可以由番红O(SO)的染色性下降判断。该结果显示，因为通过给予CH-11能够抑制软骨变性，所以CH-11能够治疗或预防伴随软骨变性的骨关节炎。
图9是代表处置后第24周的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本的图的照片。图9A～图9H表示对照的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图9I～图9L表示CH-11低用量给药组(CH-11：1.0ng/ml给药)的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图9M～图9P表示CH-11高用量给药组(CH-11：10.0ng/ml给药)的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图9B、图9D、图9F、图9H、图9I、图9K、图9M及图9O分别为在图9A、图9C、图9E、图9G、图9J、图9L、图9N及图9P中被四角包围的部分的放大图的照片。
由图9的结果，对照组(图9A～图9H)与CH-11给药组(图9I～图9P)相比，确认了软骨变性(软骨细胞消失或软骨基质结构变性)。由此显示因为通过给予CH-11能够抑制软骨变性，所以CH-11能够治疗或预防伴随软骨变性的分类为骨关节炎的初期阶段到发展期阶段的疾病。
进而，本骨关节炎模型大鼠的CH-11关节内给药组与对照大鼠组相比，观察到二次性滑膜炎(炎症)以及软骨变性被有显著性差异地抑制。进而，CH-11的关节内给药组在试验后期基本没有观察到对照大鼠中观察到的骨增殖性变化(骨刺)。需要说明的是，对于膝关节以外的脏器(心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、脑、精巢及精囊)，特别是在对照组和CH-11给药组之间观察到组织学差异。因此，作为IgM型抗Fas抗体的CH-11显然能够特异性地抑制动物中分类为骨关节炎的初期阶段～发展期阶段的疾病。
产业上的可利用性
本发明的治疗剂或预防剂能够用于医药产业。

Claims (8)

1.IgM型抗Fas抗体在制备软骨基质分解酶产生抑制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体是CH11或7C11。
3.IgM型抗Fas抗体在制备软骨基质产生剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体是CH11或7C11。
5.IgM型抗Fas抗体在制备骨关节炎中的软骨变性的抑制剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体是CH11或7C11。
7.IgM型抗Fas抗体在制备基质金属蛋白酶1及基质金属蛋白酶3的产生抑制剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体是CH11或7C11。
CN200980138584.6A 2008-08-01 2009-07-31 骨关节炎治疗剂及预防剂 Active CN102170905B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510417168.7A CN105169389A (zh) 2008-08-01 2009-07-31 骨关节炎治疗剂及预防剂

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008199232 2008-08-01
JP2008-199232 2008-08-01
PCT/JP2009/003668 WO2010013498A1 (ja) 2008-08-01 2009-07-31 変形性関節症治療剤又は予防剤

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510417168.7A Division CN105169389A (zh) 2008-08-01 2009-07-31 骨关节炎治疗剂及预防剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102170905A CN102170905A (zh) 2011-08-31
CN102170905B true CN102170905B (zh) 2016-08-03

Family

ID=41610208

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510417168.7A Pending CN105169389A (zh) 2008-08-01 2009-07-31 骨关节炎治疗剂及预防剂
CN200980138584.6A Active CN102170905B (zh) 2008-08-01 2009-07-31 骨关节炎治疗剂及预防剂

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510417168.7A Pending CN105169389A (zh) 2008-08-01 2009-07-31 骨关节炎治疗剂及预防剂

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8377444B2 (zh)
EP (1) EP2322220B1 (zh)
JP (1) JP4560822B2 (zh)
KR (1) KR101196514B1 (zh)
CN (2) CN105169389A (zh)
AU (1) AU2009277824B2 (zh)
BR (1) BRPI0917554A2 (zh)
CA (1) CA2732715C (zh)
RU (1) RU2492871C2 (zh)
WO (1) WO2010013498A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012246222A (ja) * 2010-01-29 2012-12-13 Axis Inc 変形性関節症治療剤または予防剤を製造するための使用
KR20120115383A (ko) * 2010-01-29 2012-10-17 가부시키가이샤 아크시스 변형성 관절증 치료 또는 예방용 의약 조성물 및 이의 제조 방법
CN102821786B (zh) * 2010-01-29 2016-01-13 阿克西斯股份有限公司 含有骨关节炎治疗剂的注射液
AU2011309028B2 (en) * 2010-09-29 2016-03-17 Nb Health Laboratory Co. Ltd. Antibody against human prostaglandin E2 receptor EP4
JP2012219022A (ja) * 2011-04-05 2012-11-12 Mss:Kk 抗体を有効成分として含む血友病の治療剤
SI3247728T1 (sl) 2015-01-20 2020-09-30 Igm Biosciences, Inc. Super-družina receptorjev, ki vežejo molekule TNF (dejavnik tumorske nekroze), in njihova uporaba
RU2582974C1 (ru) * 2015-06-01 2016-04-27 Федеральное бюджетное учреждение "Государственный институт лекарственных средств и надлежащих правил" (ФБУ "ГИЛС и НП") Комбинированная активная композиция для лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0691129A2 (en) * 1994-07-06 1996-01-10 Eli Lilly And Company Thiazolidone and pyrrolidinone compounds for inhibiting bone loss
CN1203922A (zh) * 1997-03-21 1999-01-06 三共株式会社 人源化抗人fas抗体
CN1207395A (zh) * 1997-04-01 1999-02-10 三共株式会社 抗-fas抗体
WO2003020768A1 (en) * 2001-08-28 2003-03-13 Sankyo Company, Limited A method for the treatment or prevention of bone erosion
TW200400830A (en) * 2002-06-07 2004-01-16 Sankyo Co A pharmaceutical composition used in the treatment of bone erosion
JP2004059582A (ja) * 2002-06-07 2004-02-26 Sankyo Co Ltd 骨破壊の治療または予防剤組成物の併用効果
CN1191861C (zh) * 1999-05-24 2005-03-09 三共株式会社 含有抗Fas抗体的药物组合物

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3023237C2 (de) * 1980-06-21 1983-03-10 Smit Ovens Nijmegen B.V., Nijmegen Vorrichtung zum Induktionslöten von aus dünnwandigen Rohren bestehenden Rahmenkonstruktionen, insbesondere Zweiradrahmen
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
CA2158822C (en) * 1994-09-27 2008-12-23 Kusuki Nishioka Therapeutic agent for rheumatic disease
US6927044B2 (en) * 1998-09-25 2005-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-1 receptor based cytokine traps
DE10034607A1 (de) * 2000-07-20 2002-02-07 Gundram Jung Multispezifisches Reagenz zur selektiven Stimulierung von Zelloberflächenrezeptoren
US6600057B2 (en) * 2000-12-29 2003-07-29 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Matrix metalloproteinase inhibitors
CA2495354A1 (en) 2002-08-20 2004-03-04 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. An agent for inhibiting articular cartilage extracellular matrix degradation
JP2004277311A (ja) * 2003-03-14 2004-10-07 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd 新規ｍｍｐ−３阻害剤
US20050014230A1 (en) 2003-07-16 2005-01-20 Ccl Holding Co., Ltd. Preparation of fully human antibodies
EP1498133A1 (en) 2003-07-18 2005-01-19 Aventis Pharma Deutschland GmbH Use of a pak inhibitor for the treatment of a joint disease
GB0327493D0 (en) * 2003-11-26 2003-12-31 Univ Belfast Treatment medicament
US20050148496A1 (en) * 2003-11-26 2005-07-07 Entelos, Inc. Treatment of rheumatoid arthritis with hypoxia inducible factor-1alpha antagonists
US7510710B2 (en) * 2004-01-08 2009-03-31 The Regents Of The University Of Colorado Compositions of UCP inhibitors, Fas antibody, a fatty acid metabolism inhibitor and/or a glucose metabolism inhibitor
WO2005107801A2 (en) * 2004-04-29 2005-11-17 The Regents Of The University Of Colorado Systems and methods for treating human inflammatory and proliferative diseases, with a combination of fatty acid metabolism inhibitors and glycolytic inhibitors and/or ucp and/or fas antibodies
US7485468B2 (en) 2004-10-15 2009-02-03 Galapagos Bv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of joint degenerative and inflammatory diseases
JP2006151843A (ja) 2004-11-26 2006-06-15 Shimada Kagaku Kogyo Kk カテプシンｋ阻害剤およびその機能が付与された食品
JP2007000141A (ja) 2005-05-25 2007-01-11 Tokyo Univ Of Science 完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法、及び融合ミエローマ細胞
JP4875865B2 (ja) 2005-08-17 2012-02-15 株式会社日本バリアフリー 変形性関節症の予防及び治療用ＮＴｘ値低減剤
RU2298410C1 (ru) * 2005-09-12 2007-05-10 ЗАО "РеМеТэкс" Биотрансплантат и способ лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний
JP2007204398A (ja) * 2006-01-31 2007-08-16 Ｔｏｗａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 株式会社 脂肪分解促進作用組成物、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性阻害作用組成物、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用組成物、ＭＭＰ−１活性阻害作用組成物、コラーゲン産生促進組成物、皮膚線維芽細胞増殖作用組成物、エストロゲン様作用組成物、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用組成物、抗老化作用組成物、育毛作用組成物、美白作用組成物および抗炎症作用組成物

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0691129A2 (en) * 1994-07-06 1996-01-10 Eli Lilly And Company Thiazolidone and pyrrolidinone compounds for inhibiting bone loss
CN1203922A (zh) * 1997-03-21 1999-01-06 三共株式会社 人源化抗人fas抗体
CN1207395A (zh) * 1997-04-01 1999-02-10 三共株式会社 抗-fas抗体
CN1191861C (zh) * 1999-05-24 2005-03-09 三共株式会社 含有抗Fas抗体的药物组合物
WO2003020768A1 (en) * 2001-08-28 2003-03-13 Sankyo Company, Limited A method for the treatment or prevention of bone erosion
TW200400830A (en) * 2002-06-07 2004-01-16 Sankyo Co A pharmaceutical composition used in the treatment of bone erosion
JP2004059582A (ja) * 2002-06-07 2004-02-26 Sankyo Co Ltd 骨破壊の治療または予防剤組成物の併用効果

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Anti-tumour necrosis factor (TNF)-α therapy (etanercept) down- regulates serum matrix metalloproteinase (MMP)-3 and MMP-1 in rheumatoid arthritis》;Catrina, A.I.et al;《Rheumatology》;20020531;第41卷(第1期);第484-489页 *
《Doninant-Negative Fas Mutation Is Reversed by Down-expression of c-FLIP》;Marie Beneteau，et al;《Cancer Rearch》;20070101;第67卷(第1期);第108-115页 *
《Fraxetin inhibits the induction of anti-Fas IgM, tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta- mediated apoptosis by Fas pathway inhibition in human osteoblastic cell line MG-63》;Po-Lin Kuo et al.;《International Immunopharmacology》;20120701;第6卷(第7期);第1167-1175页 *
《Henkeisei Kansetsusho Kenkyu no Genjo OA to Hakotsu Saibo-OA Chiryoyaku no Aratana Target》;Akira Fukuda et al;《Shukan Igaku no Ayumi》;20041231;第211卷(第1期);第285-288页 *
《骨关节炎的实验研究现况与进展》;李茂强等;《农恳医学》;20040229;第26卷(第1期);第29-32页 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2322220A1 (en) 2011-05-18
CN105169389A (zh) 2015-12-23
EP2322220A4 (en) 2012-08-29
US20110182915A1 (en) 2011-07-28
EP2322220B1 (en) 2014-01-01
AU2009277824B2 (en) 2013-06-06
AU2009277824A1 (en) 2010-02-04
US8377444B2 (en) 2013-02-19
KR101196514B1 (ko) 2012-11-01
KR20110094267A (ko) 2011-08-23
CA2732715A1 (en) 2010-02-04
WO2010013498A1 (ja) 2010-02-04
RU2011107405A (ru) 2012-09-10
RU2492871C2 (ru) 2013-09-20
JPWO2010013498A1 (ja) 2012-01-05
BRPI0917554A2 (pt) 2017-06-20
CA2732715C (en) 2015-04-07
CN102170905A (zh) 2011-08-31
JP4560822B2 (ja) 2010-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102170905B (zh) 骨关节炎治疗剂及预防剂
RU2663120C2 (ru) Шаттл для гематоэнцефалического барьера
CN103261412B (zh) 抗人ccr7抗体、杂交瘤、核酸、载体、细胞、医药组合物和抗体固定化担载体
CN108601834A (zh) 抗间质-上皮细胞转化因子抗体及其用途
CN102307595A (zh) 治疗雌激素受体相关疾病的抗体及方法
CN102811738A (zh) 制备骨关节炎治疗剂及预防剂的用途
CN102821786B (zh) 含有骨关节炎治疗剂的注射液
CN102811737A (zh) 骨关节炎治疗及预防药物组合物和上述组合物的制造方法
WO2010058550A1 (ja) 抗ヒトｇｇｔ抗体による肝疾患治療剤又は予防剤
JP2012219022A (ja) 抗体を有効成分として含む血友病の治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1157205

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1157205

Country of ref document: HK