JP2007204398A - 脂肪分解促進作用組成物、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性阻害作用組成物、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用組成物、ＭＭＰ−１活性阻害作用組成物、コラーゲン産生促進組成物、皮膚線維芽細胞増殖作用組成物、エストロゲン様作用組成物、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用組成物、抗老化作用組成物、育毛作用組成物、美白作用組成物および抗炎症作用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】脂肪分解促進作用などを有する組成物を提供する。
【解決手段】エルカンプーレから抽出したエルカンプーレ抽出物は、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、ＳＯＤ様作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用およびヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有している。エルカンプーレ抽出物は、チロシナーゼ活性阻害作用、Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エストロゲン様作用、コラーゲン産生促進作用および皮膚線維芽細胞増殖作用を有している。エルカンプーレ抽出物は、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用、アンドロゲン受容体拮抗作用を有している。脂肪分解促進による肥満防止、抗酸化、抗炎症、美白、白髪防止、抗老化および育毛に有用である。
【選択図】なし

Description

本発明は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有する脂肪分解促進作用組成物、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性阻害作用組成物、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用組成物、ＭＭＰ−１活性阻害作用組成物、コラーゲン産生促進作用組成物、皮膚線維芽細胞増殖作用組成物、エストロゲン様作用組成物、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用組成物、抗老化作用組成物、育毛作用組成物、美白作用組成物および抗炎症作用組成物に関する。

南米ペルーのアンデス地方の高地に生育している多年性の双子葉植物であるエルカンプーレは、抗糖尿病作用をはじめ、腎・肝臓機能の再生、抗肝炎、マラリア熱の沈静化、浄血、胆汁分泌刺激等の効能があると伝えられている。

そして近年、このエルカンプーレには、血圧上昇抑制作用や、悪玉コレステロール抑制作用、善玉コレステロール上昇作用、抗糖尿病効果、抗肥満効果などといった生活習慣病予防および改善作用を有することが知られている(例えば、特許文献１参照。)。
特開２００４−１７２号公報（第４頁）

しかしながら、上述したように、エルカンプーレの脂肪分解促進作用、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、コラーゲン産生促進作用、皮膚線維芽細胞増殖作用、エストロゲン様作用、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用、抗老化作用、育毛作用、美白作用および抗炎症作用などについては未だ明確に解明されていないという問題を有している。

本発明は、このような点に鑑みなされたもので、エルカンプーレの脂肪分解促進作用、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、コラーゲン産生促進作用、皮膚線維芽細胞増殖作用、エストロゲン様作用、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用、抗老化作用、育毛作用、美白作用および抗炎症作用を有する脂肪分解促進作用組成物、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性阻害作用組成物、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用組成物、ＭＭＰ−１活性阻害作用組成物、コラーゲン産生促進作用組成物、皮膚線維芽細胞増殖作用組成物、エストロゲン様作用組成物、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用組成物、抗老化作用組成物、育毛作用組成物、美白作用組成物および抗炎症作用組成物を提供することを目的とする。

請求項１記載の脂肪分解促進作用組成物は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、脂肪分解促進作用を有するものである。

請求項２記載のｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性阻害作用組成物は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、サイクリックアデノシンモノフォスフェイト(ｃＡＭＰ)−ホスホジエステラーゼ(ＰＤＥ)活性阻害作用を有するものである。

請求項３記載のヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用組成物は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有するものである。

請求項４記載のＭＭＰ−１活性阻害作用組成物は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、マトリクスメタロプロテアーゼ−１(ＭＭＰ−１)活性阻害作用を有するものである。

請求項５記載のコラーゲン産生促進作用組成物は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、コラーゲン産生促進作用を有するものである。

請求項６記載の皮膚線維芽細胞増殖作用組成物は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、皮膚線維芽細胞増殖作用を有するものである。

請求項７記載のエストロゲン様作用組成物は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、エストロゲン様作用を有すものである。

請求項８記載のテストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用組成物は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用を有するものである。

請求項９記載の抗老化作用組成物は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、抗老化作用を有するものである。

請求項１０記載の育毛作用組成物は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、育毛作用を有するものである。

請求項１１記載の美白作用組成物は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、美白作用を有するものである。

請求項１２記載の抗炎症作用組成物は、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、抗炎症作用を有するものである。

請求項１記載の脂肪分解促進作用組成物によれば、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有するので、脂肪分解促進作用を期待できる。

請求項２記載のｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性阻害作用組成物によれば、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有するので、サイクリックアデノシンモノフォスフェイト(ｃＡＭＰ)−ホスホジエステラーゼ(ＰＤＥ)活性阻害作用を期待できる。

請求項３記載のヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用組成物によれば、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有するので、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を期待できる。

請求項４記載のＭＭＰ−１活性阻害作用組成物によれば、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有するので、マトリクスメタロプロテアーゼ−１(ＭＭＰ−１)活性阻害作用を期待できる。

請求項５記載のコラーゲン産生促進作用組成物によれば、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有するので、コラーゲン産生促進作用を期待できる。

請求項６記載の皮膚線維芽細胞増殖作用組成物によれば、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有するので、皮膚線維芽細胞増殖作用を期待できる。

請求項７記載のエストロゲン様作用組成物によれば、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有するので、エストロゲン様作用を有すものである。

請求項８記載のテストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用組成物によれば、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有するので、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用を期待できる。

請求項９記載の抗老化作用組成物によれば、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、抗老化作用を有するので、抗老化作用を期待できる。

請求項１０記載の育毛作用組成物によれば、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、育毛作用を有するので、育毛作用を期待できる。

請求項１１記載の美白作用組成物によれば、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、美白作用を有するので、美白作用を期待できる。

請求項１２記載の抗炎症作用組成物によれば、エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、抗炎症作用を有するので、抗炎症作用を期待できる。

以下、本発明の一実施の形態の脂肪分解促進作用組成物について説明する。

まず、この脂肪分解促進作用組成物は、脂肪分解促進作用としてサイクリックアデノシンモノフォスフェイト(cyclic adenosine monophosphate:ｃＡＭＰ、環状アデノシン３´,５´−リン酸)−ホスホジエステラーゼ(phosphodiesterase:ＰＤＥ)活性阻害作用を有している。また、この脂肪分解促進作用組成物は、抗酸化作用である活性酵素消去作用を有する抗酸化物質、すなわちスーパーオキサイドディスムターゼ(Super Oxide Dismutase:ＳＯＤ)の様な作用を有している。

さらに、この脂肪分解促進作用組成物は、抗炎症作用としてヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)活性阻害作用およびヘキソサミニダーゼ(ＨＥＸ)遊離抑制作用を有しているとともに、美白作用および白髪防止作用としてチロシナーゼ(tyrosinase)活性阻害作用およびＢ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用を有している。また、この脂肪分解促進作用組成物は、抗老化作用としてマトリクスメタロプロテアーゼ−１(Matorix Metalloproteinase-1(コラゲナーゼ群):ＭＭＰ−１)活性阻害作用や、エストロゲン(estorogen)様作用、コラーゲン産生促進作用、皮膚線維芽細胞増殖作用を有している。さらに、この脂肪分解促進作用組成物は、育毛作用としてテストステロン(testosterone)５α−リダクターゼ活性阻害作用や、５α−ＤＨＴとアンドロゲン受容体との結合を阻害する作用であるアンドロゲン受容体(Androgen receptor)拮抗作用を有している。したがって、この脂肪分解促進作用組成物は、抗酸化作用組成物であるとともに、抗炎症作用組成物、美白作用組成物、白髪防止作用組成物、抗老化組成物および育毛作用組成物でもある。

また、この脂肪減少作用組成物は、少なくともエルカンプーレ(Gentianella alborosea(Gilg)Fabris)およびエルカンプーレ抽出物の少なくともいずれか一方を主成分として含有している。ここで、このエルカンプーレは、双子葉類、リンドウ科、リンドウ属の多年草の植物であり、南米ペルーのアンデス地方の標高３５００ｍ〜４０００ｍのプナと呼ばれる寒冷な高原地帯に生息している。

さらに、このエルカンプーレは、このエルカンプーレの乾燥全草(根・茎・葉)に５倍量の含水アルコールである例えば３０％以上９０％以下、好ましくは５０％以上８０％以下、例えば７０％アルコールを加えてから浸漬抽出したエルカンプーレ溶液にデキストリンを加えた後に噴霧乾燥したエルカンプーレエキス末としてのエルカンプーレエキスパウダであるエルカンプーレ抽出物として脂肪分解促進作用組成物に含有されている。ここで、このエルカンプーレ抽出物は、上記アルコールの代わりに、例えば５０℃以上１００℃以下、好ましくは８０℃以上の水を加えても抽出できる。さらに、このエルカンプーレ抽出物には、キサントン誘導体が豊富に含有されている。

そして、この脂肪分解促進作用組成物としては、この脂肪分解促進作用組成物を含有する機能性食品、化粧料、皮膚外用あるいは医薬として用いることもできる。したがって、この脂肪分解促進作用組成物としては、皮膚外用剤や、機能性食品、医薬品、化粧品として適宜用いることもできる。このため、この脂肪分解促進作用組成物は、少なくともエルカンプーレから抽出したエルカンプーレエキスパウダであるエルカンプーレ抽出物を含有し、脂肪分解促進作用を有するものであることを特徴とし、肥満の予防および改善のために用いられるものである旨の表示を付した飲食品や医薬品、化粧品などとして用いられる。

そして、この脂肪分解促進作用組成物を提供する形態としては、散剤、顆粒、粉末、錠剤、糖衣錠、カプセル、液剤、シロップ状のいずれであっても良く、これらは適宜助剤、賦香料とともに賦形されてもよい。用いられる賦形剤、希釈剤としては、ゼラチン、糖類、澱粉類、脂肪酸およびその塩、油脂、タルク、生理食塩水、その他のマスキング剤などが挙げられる。これらのものをそのまま服用してもよいが、各種料理品、菓子、キャンディなどの食品に混ぜて服用するのも好都合である。

ここで、この脂肪分解促進作用組成物を飲食品とする場合には、ヒトの健康に危害を加えるおそれがなく、通常の社会生活において、経口または消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品、などの区分に制限されず、例えば経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、美容食品、医薬部外品あるいは医薬品などを幅広く含む。

また、脂肪分解促進作用組成物を用いた飲食品としては、清涼飲料・炭酸飲料・栄養飲料・果実飲料・乳酸飲料などの飲料(濃縮原液および調整用粉末を含む)や、アイスクリーム・アイスシャーベット・かき氷などの冷菓、そば・うどん・はるさめ・ぎょうざの皮・しゅうまいの皮・中華麺・即席麺などの麺類、飴・チューインガム・キャンディ・ガム・チョコレート・錠菓・スナック菓子・ビスケット・ゼリー・ジャム・クリーム・焼き菓子などの菓子類、かまぼこ・ハム・ソーセージなどの水産畜産加工食品、加工乳・発酵乳などの乳製品、サラダ油・てんぷら油・マーガリン・マヨネーズ・ショートニング・ホイップクリーム・ドレッシングなどの油脂および油脂加工食品、ソース・たれなどの調味料、スープ・シチュー・サラダ・惣菜・漬物、その他種々の形態の健康・栄養補助食品、錠剤、ハードカプセルあるいはソフトカプセルなどのカプセル剤、ドリンク剤、顆粒体などの形状に形態に加工することにより簡便に飲食でき、広範囲に利用できる。

さらに、この脂肪分解促進作用組成物を化粧品とする場合には、例えば軟膏、パップ、クリーム、乳液、ローション、パック剤、ゼリー、リップ、入浴剤、浴用剤、ヘアシャンプ、ヘアリンス、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアローション、ポマード、アストリンゼント、液体石鹸、固形石鹸、ボディシャンプ、などが挙げられ、皮膚に対して使用するものが好ましく、皮膚や頭皮などに吸収させることにより、脂肪分解促進作用組成物が有する種々の作用が発揮される。また、この脂肪分解促進作用組成物を医薬品とする場合には、外皮用剤、内服液剤、内服固形剤、注射剤、座剤などとして使用できる。

なお、本発明の脂肪分解促進作用組成物は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。

次に、エルカンプーレ抽出物によるＳＯＤ様作用試験(ＮＢＴ法)について説明する。

＜試験方法＞
まず、０．０５ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウム緩衝液(ｐＨ１０．２)を２．４ｍＬと、３ｍｍｏｌ／Ｌキサンチンを０．１ｍＬと、３ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン４酢酸(tetrasodium Ethylene Diamine Tetra Acetate:ＥＤＴＡ)０．１ｍＬと、５０μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)０．１ｍＬと、０．７５ｍｍｏｌ／Ｌニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)０．１ｍＬとのそれぞれを試験管に加えた。

そして、この試験管内の溶液に、被験試料溶液であるエルカンプーレ溶液０．１ｍＬを添加してから、２５℃で２０分間放置した。この後、この試験管内にキサンチンオキシダーゼ溶液０．１ｍＬを加えてからすぐに攪拌し、２５℃で２０分間反応させた。さらに、この試験管内に、６ｍｍｏｌ塩化銅０．１ｍＬを加えて、この試験管内での反応を停止させてから、５６０ｎｍでの吸光度を測定した。このとき、この方法と同様の方法で、被験試料溶液を添加しない空試験を同時にしてコントロール溶液を作成し、このコントロール溶液の吸光度を測定して補正した。

このとき、被験試料溶液としては、エルカンプーレ抽出物の最終濃度が１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍｇのそれぞれのエルカンプーレ溶液を用いた。

さらに、ＳＯＤ様作用の計算方法として次の式を用いた。

・スーパーオキサイドの消去率(％)＝{１−(Ｓｔ−Ｓｂ)／(Ｃｔ−Ｃｂ)}×１００
Ｓｔ ： 被験試料溶液の波長５６０ｎｍでの吸光度
Ｓｂ ： 被験試料溶液に酵素溶液を入れない場合(ブランク)の波長５６０ｎｍでの吸光度
Ｃｔ ： コントロール溶液の波長５６０ｎｍでの吸光度
Ｃｂ ： コントロール溶液ブランクの波長５６０ｎｍでの吸光度

このとき、被験試料の濃度を段階的に減少させてスーパーオキサイドの消去率を測定し、このスーパーオキサイドの消去率が５０％になる被験試料濃度ＩＣ_５０(μｇ／ｍＬ)を内挿法にて求めた。

＜結果＞

この結果、表１に示すように、濃度が１００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で７５．３％のＳＯＤ消去率が確認でき、濃度が５０μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で４０．８％のＳＯＤ消去率が確認でき、濃度が２５μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で１９．１％のＳＯＤ消去率が確認できたので、このエルカンプーレ溶液中に含まれているエルカンプーレ抽出物にＳＯＤ様作用を有することが確認できた。

ここで、生体細胞内のエネルギ代謝過程によって活性酵素が生じる。そして、この活性酵素としては、スーパーオキサイド(酸素分子の一電子還元で生じるスーパーオキシドアニオン：・Ｏ_２ ⁻)、過酸化水素(Ｈ_２Ｏ_２)、ヒドロキシラジカル(・ＯＨ)および一重項酸素などがある。さらに、生体内において酸素を基に最初に生成されるラジカルは、スーパーオキサイドであり、ヒドロキシラジカルなどの他のラジカルがスーパーオキサイドを経て生成される。そして、このスーパーオキサイドは、細胞中で産生されるスーパーオキシドジスムターゼ(ＳＯＤ)の作用によって過酸化水素に変換される。

なお、ラジカルとは、不対電子を１つ又はそれ以上有する分子又は原子を意味し、スーパーオキサイド、ヒドロキシラジカル、ＤＰＰＨなどが含まれる。

さらに、このＳＯＤ量は、老化と共に減少し、ＳＯＤ量の減少によってスーパーオキサイドの細胞内濃度が高くなり、活性酸素の無毒化酵素であるカタラーゼなどの活性を低下させて、スーパーオキサイドが生体に対して障害をもたらすようになる。この結果、例えば関節リュウマチあるいはベーチェット病などの組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、糖尿病、動脈硬化、肩こり、冷え性、肌のしみ・シワなど障害をもたらすようになる。この結果、ＳＯＤ様作用によって、例えば関節リュウマチあるいはベーチェット病などの組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、糖尿病、動脈硬化、肩こり、冷え性、肌のしみ・シワなどを予防あるいは改善できる。

次に、エルカンプーレ抽出物によるヒアルロニダーゼ活性阻害作用試験について説明する。

＜試験方法＞
まず、被験試料であるエルカンプーレ抽出物を溶解させた０．１ｍｏｌ酢酸緩衝液(ｐＨ３．５)０．２ｍＬに、ヒアルロニダーゼ溶液(Type IV-S(牛精巣(bovine testis)からの抽出物;Sigma社製 400 NF units/mL))０．１ｍＬを加えてから、３７℃で２０分間反応させた。さらに、この反応液に、活性化剤として、２．５ｍｍｏｌ塩化カルシウム０．２ｍＬを加えてから、３７℃で２０分間反応させた。この後、この反応液に、０．４ｍｇ／ｍＬヒアルロン酸カリウム溶液(鶏冠(robster comb)からの抽出物)０．５ｍＬを加えてから、３７℃で４０分間反応させた。

さらに、この反応液に、０．４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム０．２ｍＬを加えて反応を停止させて冷却した後、各反応溶液にホウ酸溶液０．２ｍＬを加えてから、３分間煮沸した。この後、この煮沸後の反応溶液を氷冷した後、ｐ−ＤＡＢＡ(ｐ−ジメチルアミノべンズアルデヒド)試薬６ｍＬを加えてから、３７℃で２０分間反応させた。この後、この反応液を、波長５８５ｎｍでの吸光度を測定した。このとき、上記方法と同様の方法で、被験試料を添加せずに蒸留水を添加した空試験を同時にしてコントロール溶液を作成し、このコントロール溶液の吸光度を測定して補正した。

また、被験試料溶液としては、エルカンプーレ抽出物の最終濃度が４００μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬそれぞれのエルカンプーレ溶液を用いた。

さらに、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用の計算方法として次の式を用いた。

・ヒアルロニダーゼ活性阻害率(％)＝{１−(Ｓｔ−Ｓｂ)／(Ｃｔ−Ｃｂ)}×１００
Ｓｔ ： 被験試料溶液の波長５８５ｎｍでの吸光度
Ｓｂ ： 被験試料溶液ブランクの波長５８５ｎｍでの吸光度
Ｃｔ ： コントロール溶液の波長５８５ｎｍでの吸光度
Ｃｂ ： コントロール溶液ブランクの波長５８５ｎｍでの吸光度

＜結果＞

この結果、表２に示すように、濃度が４００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で３２．７％のヒアルロニダーゼ活性阻害率を確認でき、濃度が１００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で１１．９％のヒアルロニダーゼ活性阻害率を確認できたので、このエルカンプーレ溶液中に含まれているエルカンプーレ抽出物がヒアルロニダーゼ阻害作用を有することを確認できた。

このことから、このエルカンプーレ抽出物は、接触性皮膚炎、乾癬、尋常性天疱瘡などによる肌荒れ症状や、乾燥あるいは洗浄剤などによって惹起される健常人の肌荒れおよび荒れ性に対して改善および予防効果を有することが分かった。

さらに、肥満細胞中での活性化によって肥満細胞から脱顆粒に関与するヒアルロニダーゼの活性阻害作用を有することから、細胞間組織として存在し血管透過性とも関与しているヒアルロン酸の加水分解酵素であるヒアルロニダーゼの活性を阻害することにより、ヒアルロン酸を安定化できるとともに、肥満細胞からの種々ケミカルメディエータの放出を予防でき、保湿強化および抗炎症が期待できる。

次に、エルカンプーレ抽出物によるヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用試験について説明する。

＜試験方法＞
ここで、細胞内のヒスタミンが遊離されると同時にヘキソサミニダーゼが遊離されることから、ヘキソサミニダーゼ遊離を指標にヒスタミン遊離抑制作用を評価する。すなわち、このヒスタミンは、マストセルに抗原が一度感作し、ＩｇＥ抗体をセル膜に標識する。この状態で再度抗原が侵入した場合に、抗原抗体反応により即座に脱顆粒反応が生じてヒスタミン遊離が起こる。このときヒスタミンとパラレルにヘキソサミニダーゼの遊離が起こるため、ヒスタミン遊離の指標となる。このヒスタミンは毛細血管拡張、平滑筋収縮、胃酸分泌など多くの薬理作用を持つ。

そして、ラット好塩基球白血病細胞(ＲＢＬ−２Ｈ３細胞)を、１５％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)を添加したＳ−ＭＥＭ(Minimum Essential medium)を培地として培養(インキュベーション)した後、トリプシン処理にてラット好塩基球白血病細胞を回収した。そして、この回収したラット好塩基球白血病細胞を、４．０×１０^５cells／ｍＬの濃度に培地で希釈してから、マウスモノクロナール抗ジニトロフェニル基ＩｇＥ(ＤＮＰ−specific ＩｇＥ)が最終濃度０．５μｇ／ｍＬとなるように添加した後、９６穴プレートに１穴当たり１００μＬずつ播種してから、一晩培養した。

そして、この培養が終了した後、培地を抜いてから、シラガニアン(Siraganian)緩衝液１００μＬにて２回洗浄した。次いで、この緩衝液３０μＬと、この緩衝液にて調整した被験試料１０μＬとを加えてから、３７℃にて１０分間静置させた。この後、この緩衝液に、１００ｎｇ／ｍＬジニトロフェニル化ウシ血清アルブミン(ＤＮＰ−ＢＳＡ)溶液１０μを加えてから、３７℃で１５分間静置させて、ヘキソサミニダーゼ(ＨＥＸ)を遊離させた。さらに、９６穴プレートを氷上に静置させて、ヘキソサミニダーゼの遊離を停止させた。

次いで、各穴の細胞上清１０μＬおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ ｐ−ＮＡＧ(ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド: p-nitrophenyl N-acetyl β-D-glucosaminide)溶液１０μＬを、新たな９６穴プレートに添加し、３７℃で１時間反応させた。そして、この反応が終了した後、各穴に０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム(Ｎａ_２ＣＯ_３)／炭酸水素ナトリウム(ＮａＨＣＯ_３)２５０μＬを加えてから、マイクロプレートリーダにて波長４１５ｎｍでの吸光度を測定した。このとき、上記方法と同様の方法で、被験試料を添加せずにシランガニアン緩衝液を添加した空試験を同時にしてコントロール溶液を作成し、このコントロール溶液の吸光度を測定して補正した。

また、被験試料溶液としては、エルカンプーレ抽出物の最終濃度が４００μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬとなるように調製したそれぞれのエルカンプーレ溶液を用いた。

さらに、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用の計算方法として次の式を用いた。

・ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率(％)＝{１−(Ｂ−Ｃ)／Ａ}×１００
Ａ ： 被験試料無添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度
Ｂ ： 被験試料添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度
Ｃ ： 被験試料添加，ｐ−ＮＡＧ無添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度

このとき、被験試料の濃度を段階的に減少させてヘキソサミニダーゼ遊離抑制率を測定し、このヘキソサミニダーゼの遊離を５０％阻害する被験試料濃度ＩＣ_５０(μｇ／ｍＬ)を内挿法にて求めた。

＜結果＞

この結果、表３に示すように、濃度が４００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で７０．７％のヘキソサミニダーゼ遊離抑制率を確認でき、濃度が１００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で２０．６％のヘキソサミニダーゼ遊離抑制率を確認できた。したがって、このエルカンプーレ溶液中に含まれているエルカンプーレ抽出物がヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有することを確認できた。このことから、このエルカンプーレ抽出物がヒスタミン遊離抑制作用を有するので、肌荒れ改善作用を有することが分かった。

ここで、このヒスタミン遊離抑制作用によって、花粉症、アレルギ性鼻炎、気管支喘息、アトピ性皮膚炎などのアレルギ反応や、それに伴う炎症反応の発生を防止できる。すなわち、Ｔ細胞が放出するサイトカインが好酸球やマクロファージを活性化し集積させて炎症反応を引き起しアレルギ性接触性皮膚炎に代表されるＩＶ型アレルギ(遅延型アレルギ)を予防および改善できる。

さらに、細胞や好塩基球からヒスタミンなどのケミカルメディエータが放出され、これらケミカルメディエータが鼻炎や喘息などの症状を伴う炎症反応を引き起させるアレルギ性鼻炎や気管支喘息に代表されるＩ型アレルギ(即時型アレルギ)を予防および改善できる。したがって、抗アレルギ剤として用いることができる。

次に、エルカンプーレ抽出物によるチロシナーゼ活性阻害作用試験について説明する。

＜試験方法＞
まず、４８穴プレートに、マックルパイン(Mcllvaine)緩衝液(ｐＨ６．８)０．２ｍＬと、０．３ｍｇ／ｍＬチロシン溶液０．０６ｍＬと、被験試料の２５ｖ／ｖ％ＤＭＳＯ溶液０．１８ｍＬを加え、３７℃で１０分間静置させた。この後、この静置液に２５００units／ｍＬチロシナーゼ溶液０．０２ｍＬを加えてから、引き続き３７℃で１５分間反応させた。そして、この反応が終了した後、波長４７５ｎｍでの吸光度を測定した。このとき、上記方法と同様の方法で、被験試料を添加しない空試験を同時にしてコントロール溶液を作成し、このコントロール溶液の吸光度を測定して補正した。

また、被験試料溶液としては、エルカンプーレ抽出物の濃度が４００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬそれぞれのエルカンプーレ溶液を用いた。

さらに、チロシナーゼ活性阻害作用の計算方法としては次の式を用いた。

・チロシナーゼ活性阻害率(％)＝{１−(Ｓｔ−Ｓｂ)／(Ｃｔ−Ｃｂ)}×１００
Ｓｔ ： 被験試料溶液の波長４７５ｎｍでの吸光度
Ｓｂ ： 被験試料溶液ブランクの波長４７５ｎｍでの吸光度
Ｃｔ ： コントロール溶液の波長４７５ｎｍでの吸光度
Ｃｂ ： コントロール溶液ブランクの波長４７５ｎｍでの吸光度

このとき、被験試料の濃度を段階的に減少させてチロシナーゼ活性阻害率を測定し、この阻害率が５０％になる被験試料の濃度ＩＣ_５０(μｇ／ｍＬ)を内挿法により算出した。なお、このＩＣ_５０の値が小さいほどチロシナーゼ阻害作用が強い。

＜結果＞

この結果、表４に示すように、濃度が４００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で３６．０％のチロシナーゼ活性阻害率を確認でき、濃度が２００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で４３．７％のチロシナーゼ活性阻害率を確認できた。また、濃度が１００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で２７．３％のチロシナーゼ活性阻害率を確認でき、濃度が５０μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で１６．０％のチロシナーゼ活性阻害率を確認できた。したがって、このエルカンプーレ溶液中に含まれているエルカンプーレ抽出物がチロシナーゼ活性阻害作用を有することを確認できた。

ここで、このチロシナーゼ活性阻害作用によって、しみや、そばかすなどの発生を防止あるいは改善できるので、これらしみやそばかすなどによる皮膚の老化を防止あるいは改善できる。

次に、エルカンプーレ抽出物によるＢ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用試験について説明する。

＜試験方法＞
まず、Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ(ＤＭＥＭ)を培地として用いて培養した後、この培養したＢ１６メラノーマ細胞をトリプシン処理にて回収した。そして、この回収したＢ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳおよび１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭにて８．０×１０^５cells／ｍＬの濃度に希釈した後、１０％ＦＢＳおよび１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで調製した同培地を２ｍＬ加えた直径(φ)６０ｍｍシャーレに０．５ｍＬずつ播種してから、８時間培養した。

この培養の後、１０％ＦＢＳおよび１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで最終濃度の２倍に調製した被験試料を２．５ｍＬ添加してから、４日間培養した。さらに、この培養の後、この培養したＢ１６メラノーマ細胞をトリプシン処理にて回収して細胞数を数えた。この後、遠心分離(２５００×ｇ，６分，室温)して培地を取り除いてから、１０％ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)含有１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム(ＮａＯＨ)溶液２ｍＬを添加して図示しない超音波破砕器にてＢ１６メラノーマ細胞を破壊した。この後、この破壊したＢ１６メラノーマ細胞をろ過し、このろ過にて得られたろ液の波長４７５ｎｍでの吸光度を測定した。このとき、上記方法と同様の方法で、被験試料を添加しない空試験を同時にしてコントロール溶液を作成し、このコントロール溶液の吸光度を測定して補正した。

また、被験試料溶液としては、エルカンプーレ抽出物の最終濃度が４００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬそれぞれのエルカンプーレ溶液を用いた。

さらに、メラニン産生抑制作用および細胞生存率の計算方法として次の式を用いた。

・メラニン産生抑制率(％)＝(Ａ−Ｂ)／Ａ×(Ｃ／Ｄ)×１００
・細胞生存率(％)＝(Ｃ／Ｄ)×１００
Ａ ： 被験試料無添加での波長４７５ｎｍにおける吸光度
Ｂ ： 被験試料添加での波長４７５ｎｍにおける吸光度
Ｃ ： 被験試料添加での細胞数
Ｄ ： 被験試料無添加での細胞数

＜結果＞

この結果、表５に示すように、濃度が４００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液でＢ１６メラノーマ細胞の毒性を確認できた。また、濃度が１００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液では、２４．３％のメラニン産生抑制率、および７５．７％のＢ１６メラノーマ細胞生存率を確認できた。さらに、濃度が２５μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液では、１６．３％のメラニン産生抑制率、および１１０．９％のＢ１６メラノーマ細胞生存率を確認できた。したがって、このエルカンプーレ溶液中に含まれているエルカンプーレ抽出物がメラニン産生抑制作用を有することを確認できた。

次に、エルカンプーレ抽出物によるＭＭＰ−１活性阻害作用試験について説明する。

＜試験方法＞
まず、このＭＭＰ−１活性阻害作用試験は、いわゆるWunsch and Heidrich 法の一部を改変したものである。

すなわち、このＭＭＰ−１活性阻害作用試験では、蓋付き試験管にて、２０ｍｍｏｌ／ｍＬ塩化カルシウム(ＣａＣｌ_２)含有０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．１)に溶解した被試験料５０μＬと、ＭＭＰ−１溶液５０μＬと、Pz-peptide溶液４００μＬとを混合し、３７℃で３０分間反応させた後、２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液１ｍＬを加え反応を停止させた。ここで、ＭＭＰ−１溶液として、COLLAGENASE Type IV from Clostridium histolyticum (Sigma社製)を用いた。また、Pz-peptide溶液として、Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH (BACHEM Feinchemikalien AG社製)を用いた。

この後、反応液中に、酢酸エチル５ｍＬを加えてから激しく振とうさせた後に、遠心分離(１６００×ｇ，１０分)してから、酢酸エチル層の波長３２０ｎｍでの吸光度を測定した。このとき、上記方法と同様の方法で、被験試料を添加しない空試験を同時にしてコントロール溶液を作成し、このコントロール溶液の吸光度を測定して補正した。

また、被験試料溶液としては、エルカンプーレ抽出物の濃度が４００μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬそれぞれのエルカンプーレ溶液を用いた。

さらに、ＭＭＰ−１活性阻害作用の計算方法として次の式を用いた。

・ＭＭＰ−１活性阻害率(％)＝{１−(Ｃ−Ｄ)／(Ａ−Ｂ)}×１００
Ａ ： 被験試料無添加および酵素添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度
Ｂ ： 被験試料無添加および酵素無添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度
Ｃ ： 被験試料添加および酵素添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度
Ｄ ： 被験試料添加および酵素無添加での３２０ｎｍにおける吸光度

＜結果＞

この結果、表６に示すように、濃度が４００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で７１．５％のＭＭＰ−１活性阻害率を確認でき、濃度が１００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で２０．２％のＭＭＰ−１活性阻害率を確認できた。したがって、このエルカンプーレ溶液中に含まれているエルカンプーレ抽出物がＭＭＰ−１活性阻害作用を有することを確認できた。

ここで、このＭＭＰ−１活性阻害作用によって、このＭＭＰ−１が関与する疾患、例えば動脈硬化症、関節炎(例えば、慢性関節リウマチあるいは変形性関節症など)、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤、腫瘍性転移、組織の腫瘍形成(例えば、角膜腫瘍、胃潰瘍あるいは表皮潰瘍など)、骨疾患(例えば、骨粗鬆症、人工関節置換術後の弛みなどの骨吸収性疾患)、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染、糖尿病合併症などの治療剤あるいは予防剤などとして有用である。

次に、エルカンプーレ抽出物によるエストロゲン様作用試験について説明する。

＜試験方法＞
まず、エストロゲン依存性細胞の増殖に対する影響を調べるThomasらの方法(In Vitro Cell.Dev.Biol.28A,595〜602,1992)に準拠して、エストロゲン様作用を試験した。

そして、ヒト乳癌由来細胞(ＭＣＦ―７)を、１０％ＦＢＳと１％Ｎ−エチルアセトアミド(ＮＥＡＡ)と１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウムとのそれぞれを含有するＭＥＭを培地として培養させた後、この培養したヒト乳癌由来細胞をトリプシン処理にて回収した。次いで、この回収したヒト乳癌由来細胞を、活性炭処理した１０％ＦＢＳと、１％ＮＥＡＡと、１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウムとのそれぞれを含有するフェノールレッド不含ＭＥＭ(Ｔ−ＭＥＭ)を用いて３．０×１０^４cells/ｍＬの濃度に希釈してから、４８穴プレートに１穴当たり４５０μＬずつ播種し、これら播種したヒト乳癌由来細胞を安定させるために培養した。

そして、この培養の６時間後(０日目)に、Ｔ−ＭＥＭで最終濃度の１０倍に調製した被験試料を各穴に１００μＬ添加して培養を継続させた。さらに、この培養の３日後に培地を抜き、Ｔ−ＭＥＭで最終濃度に調製した被験試料を各穴に１ｍＬずつ添加して培養を継続させた。そして、エストロゲン様作用としては、ＭＴＴアッセイ(assay)法を用いて測定した。

さらに、この培養の終了後に、培養したヒト乳癌由来細胞から培地を抜き、１％ＮＥＡＡおよび１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭに最終濃度０．４ｍｇ／ｍＬで溶解させたＭＴＴを各穴に２００μＬずつ添加した。そして、ヒト乳癌由来細胞を２時間培養した後に、このヒト乳癌由来細胞内に生成されたブルーホルマザンを２−プロパノール２００μＬで抽出した。この後、この抽出したブルーホルマザンの波長５７０ｎｍでの吸光度を測定した。同時に、付着細胞の影響を補正するため、濁度として波長６５０ｎｍでの吸光度を測定し、これら波長５７０ｎｍでの吸光度と波長６５０ｎｍでの吸光度との差をブルーホルマザンの生成量とした。このとき、ポジティブコントロールとして、１０^−９ｍｏｌ／Ｌエストラジオールを用いた。

また、被験試料溶液としては、エルカンプーレ抽出物の最終濃度が５０μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬおよび３．１２５μｇ／ｍＬそれぞれのエルカンプーレ溶液を用いた。

さらに、エストロゲン様作用の計算方法として次の式を用いた。

・エストロゲン様作用率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ ： 被験試料添加時の吸光度
Ｂ ： 被験試料無添加時の吸光度

＜結果＞

この結果、表７に示すように、濃度が５０μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で２６４．１％±６．３％のエストロゲン様作用率を確認でき、濃度が１２．５μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で２１２．３％±５．７％のエストロゲン様作用率を確認できた。さらに、濃度が３．１２５μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液では、１４１．４％±４．８％のエストロゲン様作用率を確認できた。したがって、このエルカンプーレ溶液中に含まれているエルカンプーレ抽出物には、非常に強いエストロゲン様作用を有することを確認できた。

次に、エルカンプーレ抽出物によるコラーゲン産生促進作用試験について説明する。

＜試験方法＞
まず、ヒト正常線維芽細胞(Detroit 551)を、１０％ＦＢＳと１％ＮＥＡＡと１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウムとのそれぞれを含有するＭＥＭを培地として培養させた後、この培養したヒト正常線維芽細胞をトリプシン処理にて回収した。次いで、この回収したヒト正常線維芽細胞を、１０％ＦＢＳと１％ＮＥＡＡと１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウムとのそれぞれを含有するＭＥＭにて２×１０^５cells/ｍＬの濃度に希釈させた後に、９６穴マイクロプレートに１穴当たり１００μＬずつ播種して一晩培養させた。

そして、この培養の終了後に、培養したヒト正常線維芽細胞から培地を抜き、０．５％ＦＢＳを含有するＭＥＭに溶解させた被験試料を各穴に１５０μＬずつ添加して、３日間培養させた。さらに、この培養の終了後に、各穴の培地中のコラーゲン量をＥＬＩＳＡ(酵素免疫測定法：Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay)法にて測定した。

また、被験試料溶液としては、エルカンプーレ抽出物の最終濃度が１００μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬそれぞれのエルカンプーレ溶液を用いた。

さらに、コラーゲン産生促進作用の計算方法として次の式を用いた。

・コラーゲン産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ ： 被験試料添加時のコラーゲン量
Ｂ ： 被験試料無添加時のコラーゲン量

＜結果＞

この結果、表８に示すように、濃度が１００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で１５４．３±１２．７％のコラーゲン産生促進率を確認でき、濃度が２５μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で１２２．８±８．６％のコラーゲン産生促進率を確認できた。したがって、このエルカンプーレ溶液中に含まれているエルカンプーレ抽出物には、やや強いコラーゲン産生促進作用を有することを確認できた。

ここで、このコラーゲン産生促進作用によって、体内でのコラーゲンの合成が促進されることから、皮膚の保湿性や弾力性の低下を予防あるいは改善でき、皮膚の張りや、艶やの損失、肌荒れ、しわなどの老化症状を予防あるいは改善できる。

すなわち、皮膚の表皮および真皮は、表皮細胞、線維芽細胞およびこれら細胞の外にあって皮膚構造を支持するコラーゲン、ヒアルロン酸などの細胞外マトリクスにて構成されている。そして、若い皮膚では、皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことによって、水分保持、柔軟性、弾力性などが確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。

このことから、コラーゲン産生促進作用によって、皮膚や肌の水分保持、柔軟性、弾力性などが確保され、肌を外見的に張りや艶があるみずみずしい状態に維持あるいは近づけることが可能となるので、皮膚の老化に伴う変化、すなわちしわの形成、くすみ、きめの消失、弾力性の低下などを予防あるいは改善できる。

次に、エルカンプーレ抽出物による皮膚線維芽細胞増殖作用試験について説明する。

＜試験方法＞
まず、ヒト皮膚線維芽細胞(ＮＢＩＲＧＢ)を、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳを含有するα−ＭＥＭ(GIBCO BLR社製)を培地として培養させた後、この培養したヒト皮膚線維芽細胞をトリプシン処理にて回収した。次いで、この回収したヒト皮膚線維芽細胞を、５％ＦＢＳを含有するα−ＭＥＭにて７．０×１０^４cells/ｍＬの濃度に希釈させた後に、９６穴マイクロプレートに１穴当たり１００μＬずつ播種して一晩培養させた。

そして、この培養の終了後に、５ｖ／ｖ％ＦＢＳを含有するα−ＭＥＭで溶解させた被験試料を各穴に１００μＬずつ添加して、３日間培養させた。このとき、皮膚線維芽細胞増殖作用は、ＭＴＴ法(J.Immunol.Method, 93, 157, 1986)に準拠して測定した。すなわち、この培養の終了後に、各穴から１００μＬずつ培地を抜き、最終濃度５ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ(−)に溶解させたＭＴＴ試薬(3-(4,5-dimethy-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide,５ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ(−)溶液)を各穴に２０μＬずつ添加した。この後、この皮膚線維芽細胞を４．５時間培養させた後に、１０質量％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を溶解させた０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸(ＨＣｌ)溶液を各穴に１００μＬずつ添加し、一晩培養させた。

さらに、この培養の終了後に、マイクロプレートリーダを用いて波長５７０ｎｍでの吸光度を測定した。同時に、濁度として波長６５０ｎｍでの吸光度を測定し、これら波長５７０ｎｍでの吸光度と波長６５０ｎｍでの吸光度との差をブルーホルマザンの生成量とした。このとき、上記方法と同様の方法で、被験試料を添加しない空試験を同時にしてコントロール溶液を作成し、このコントロール溶液の吸光度を測定して補正した。

また、被験試料溶液としては、エルカンプーレ抽出物の最終濃度が４００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬそれぞれのエルカンプーレ溶液を用いた。

さらに、皮膚線維芽細胞増殖作用の計算方法として次の式を用いた。

・皮膚線維芽細胞増殖率(％)＝(Ｓｔ−Ｓｂ)／(Ｃｔ−Ｃｂ)×１００
Ｓｔ ： 被験試料を添加した細胞での吸光度
Ｓｂ ： 被験試料を添加した空試験の吸光度
Ｃｔ ： 被験試料を添加しない細胞での吸光度
Ｃｂ ： 被験試料を添加しない空試験の吸光度

＜結果＞

この結果、表９に示すように、濃度が４００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で１２０．３％±０．９％の皮膚線維芽細胞増殖率を確認でき、濃度が２００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で１１２．５％±１．３％の皮膚線維芽細胞増殖率を確認できた。さらに、濃度が１００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で１０９．４％±０．８％の皮膚線維芽細胞増殖率を確認できた。したがって、このエルカンプーレ溶液中に含まれているエルカンプーレ抽出物には、皮膚線維芽細胞増殖作用を有することを確認できた。

次に、エルカンプーレ抽出物によるテストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用試験について説明する。

＜試験方法＞
まず、蓋付きＶ底試験管に、プロピレングリコールで調製した４．２ｍｇ／ｍＬテストステロン(東京化成株式会社製)２０μＬと、１ｍｇ／ｍＬ ＮＡＤＰＨを含有した５ｍｍｏｌ／ｍＬトリス塩酸(Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ)緩衝液(ｐＨ７．１３)８２５μＬとを入れて混合した。この後、この混合液に、５０ｖ／ｖ％エタノールまたは精製水で調製した被験資料８０μＬと、Ｓ−９(ラット肝臓ホモジネート:オリエンタル酵母株式会社製)７５μＬとそれぞれを加えてから再度混合した後に、３７℃で３０分間反応させる。次いで、この反応後に、混合液に塩化メチレン(ＣＨ_２Ｃｌ_２)１ｍＬを加えて反応を停止させた。

そして、この反応を停止させた混合液を、遠心分離(１６００×ｇ，１０分)してから、塩化メチレン層をガスクロマトグラフィ分析した。このとき、このガスクロマトグラフィ分析は、使用機器としてShimadzu ＧＣ−７Ａ(島津製作所製)を用い、カラムとしてＤＢ−１７０１(φ：０．５３ｍｍ×３０ｍ，膜厚：１．０μｍ)(J&W Scientific社製)を用い、カラムの温度を２４０℃とし、注入温度を３００℃とし、検出器としてＦＩＤ(島津製作所製)を用い、キャリアガスとして窒素ガスを用いた。このとき、上記方法と同様の方法で、被験試料を添加しない空試験を同時にしてコントロール溶液を作成した。

ここで、３α−アンドロスタンジオールと、ジヒドロテストステロン(ＤＨＴ)と、テストステロンとのそれぞれの標準品の塩化メチレン溶液を同様にガスクロマトグラフィ分析し、これら３α−アンドロスタンジオール、ジヒドロテストステロンおよびテストステロンの精秤量とピーク面積とから、このピーク面積当たりの化合物量をあらかじめ算出しておき、Ｓ−９による反応後の３α−アンドロスタンジオール、ジヒドロテストステロンおよびテストステロンそれぞれのピーク面積当たりの濃度を求めた。このとき、このピーク面積当たりの濃度は、濃度(％)＝(被験試料のピーク面積)×(標準品濃度)／(標準品のピーク面積)の式で求めた。この後、被験試料の変化率を求めた。

このとき、この被験試料の変化率として次の式を用いた。

・変化率(％)＝(Ａ＋Ｂ)／(Ａ＋Ｂ＋Ｃ)の式で求めた。

Ａ ： ３α−アンドロスタンジオールの濃度
Ｂ ： ジヒドロテストステロン(ＤＨＴ)の濃度
Ｃ ： テストステロンの濃度

さらに、この変化率に基づいて、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用を測定した。このとき、被験試料溶液としては、エルカンプーレ抽出物の最終濃度が３０００μｇ／ｍＬおよび１０００μｇ／ｍＬそれぞれのエルカンプーレ溶液を用いた。

そして、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用の計算方法として次の式を用いた。

・テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害率(％)＝(１−Ｅ／Ｄ)×１００
Ｄ ： 空試験での変換率
Ｅ ： 被験試料添加での変換率

＜結果＞

この結果、表１０に示すように、濃度が３０００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で９２．３％のテストステロン５α−リダクターゼ活性阻害率を確認でき、濃度が１０００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で１６．７％のテストステロン５α−リダクターゼ活性阻害率を確認できた。したがって、このエルカンプーレ溶液中に含まれているエルカンプーレ抽出物には、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用を有することを確認できた。さらに、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用の強さが、エルカンプーレ抽出物の濃度に依存して変化していることから、このエルカンプーレ溶液中のエルカンプーレ抽出物量の濃度を調製することにより、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用の強さを調節できることが分かった。

ここで、このテストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用によって、標的臓器の細胞内でのテストステロン５α−リダクターゼの５α−ジヒドロテストステロン(５α−ＤＨＴ)への還元が防止されるので、この５α−ジヒドロテストステロンによるアンドロゲンとしての作用の発現を防止できる。言い換えると、テストステロンを活性型５α−ＤＨＴに還元するテストステロン５α−レダクターゼの作用を阻害することにより活性な５α−ＤＨＴが生じるのを抑制できるとともに、このテストステロンから生じた５α−ＤＨＴが受容体と結合するのを阻害することによりアンドロゲン活性を発現させないようにできる。

したがって、このアンドロゲンの作用による男性ホルモン依存型の疾患である男性型禿頭、多毛症、脂漏症、座瘡、前立腺肥大症、前立腺腫瘍あるいは男児性早熟などの様々な症状を予防あるいは改善できる。

次に、エルカンプーレ抽出物によるアンドロゲン受容体拮抗作用試験について説明する。

＜試験方法＞
まず、マウス自然発生乳癌(シオノギ癌；ＳＣ１１５)よりクローニングされたアンドロゲン依存症マウス乳癌細胞(ＳＣ−３細胞)を、２％ＤＣＣ(Dextran coated charcoal)−ＦＢＳと、１０^−８ｍｏｌ／Ｌテストステロンを含有したＭＥＭ(ＭＥＭ／２)とを培地として用いて培養させた後、この培養したＳＣ−３細胞をトリプシン処理にて回収した。次いで、この回収したＳＣ−３細胞を、２％ＤＣＣ−ＦＢＳを含有したＭＥＭ(ＭＥＭ／２にて１．０×１０^５cells/ｍＬの濃度に希釈させた後に、９６穴マイクロプレートに１穴当たり１００μＬずつ播種して一晩培養させた。

そして、この培養の終了後に培地を抜き、被験資料を溶解した１０^−９ｍｏｌ／Ｌ ＤＨＴを含む０．５％ＢＳＡを含有したＨａｍ Ｆ１２＋ＭＥＭ(ＨＭＢ)１００μＬに培地を交換して、４８時間培養させた。

さらに、この培養の終了後に、最終濃度が０．４ｍｇ／ｍＬで２％ＤＣＣ−ＦＢＳを含有したＭＥＭ／２に溶解させたＭＴＴを各穴に１００μＬずつ添加してから、２時間培養させた。この培養の終了後に、ＳＣ−３細胞内に生成したブルーホルマザンを、２−プロパノール２００μＬで抽出させた。この後、この抽出したブルーホルマザンを含有するイソプロパノールについて、ブルーホルマザンの吸収極大点である波長５７０ｎｍでの吸光度を測定した。同時に、付着細胞の影響を補正するために、濁度として波長６５０ｎｍでの吸光度を測定し、これら波長５７０ｎｍでの吸光度と波長６５０ｎｍでの吸光度との差をブルーホルマザンの生成量とした。

このとき、被験試料を添加しない空試験として、ＨＭＢのみで培養したＳＣ−３細胞を、陽性対照として１０^−９ｍｏｌ／Ｌ ＤＨＴのみを含有したＨＭＢで培養したＳＣ−３細胞として用い、同様の方法で試験して補正した。また、被験試料溶液としては、エルカンプーレ抽出物の最終濃度が５０μｇ／ｍＬおよび１２．５μｇ／ｍＬそれぞれのエルカンプーレ溶液を用いた。

さらに、アンドロゲン受容体拮抗作用の計算方法として次の式を用いた。なお、この式での吸光度は、補正済みの吸光度である。

・アンドロゲン受容体拮抗率(％)＝{１−(Ｃ−Ｄ)／(Ａ−Ｂ)}×１００
Ａ ： ＤＨＴ添加および被験試料無添加での５７０ｎｍおよび６５０ｎｍにおける吸光度
Ｂ ： ＤＨＴ無添加および被験試料無添加での５７０ｎｍおよび６５０ｎｍにおける吸光度
Ｃ ： ＤＨＴ添加および被験試料添加での５７０ｎｍおよび６５０ｎｍにおける吸光度
Ｄ ： ＤＨＴ無添加および被験試料添加での５７０ｎｍおよび６５０ｎｍにおける吸光度

＜結果＞

この結果、表１１に示すように、濃度が５０μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で５２．６％のアンドロゲン受容体拮抗率を確認でき、濃度が１２．５μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で２６．３％のアンドロゲン受容体拮抗率を確認できた。したがって、このエルカンプーレ溶液中に含まれているエルカンプーレ抽出物は、アンドロゲン受容体拮抗作用を有することを確認できた。

ここで、このアンドロゲン受容体拮抗作用によって、テストステロンの活性発現を阻害できることから、このテストステロンが標的臓器の細胞内に入ってテストステロン５α−レダクターゼにより５α−ジヒドロテストステロン(５α−ＤＨＴ)に還元されて受容体と結合し、アンドロゲンとしての作用を発現することを防止できる。すなわち、テストステロンを活性型５α−ジヒドロテストステロン(活性型５α−ＤＨＴ)に還元するテストステロン５α−レダクターゼの作用を阻害できる。

したがって、テストステロン５α−レダクターゼの活性過多や分泌過多に起因しアンドロゲンの作用による男性ホルモン依存型の疾患である各種疾患、例えば男性型禿頭、多毛症、脂漏症、座瘡、前立腺肥大症、前立腺腫瘍、男児性早熟などの予防および治療に有用である。また、これらの用途以外にも、テストステロン５α−レダクターゼの作用を阻害することに意義あるすべての用途に用いることが可能である。

次に、エルカンプーレ抽出物によるサイクリックＡＭＰ(ｃＡＭＰ)−ホスホジエステラーゼ活性阻害作用試験について説明する。

＜試験方法＞
まず、５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム(ＭｇＣｌ_２)を含有した５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸(Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ)緩衝液(ｐＨ７．５)０．２ｍＬに、２．５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン溶液０．１ｍＬと、０．１ｍｇ／ｍＬｃＡＭＰホスホジエステラーゼ溶液０．１ｍＬと、被験試料溶液０．０５μＬとのそれぞれを加えてから、３７℃で５分間予備反応させた。この後、この予備反応液に、０．５ｍｇ／ｍＬ ｃＡＭＰ溶液０．０５ｍＬと加えてから、３７℃で３０分間反応させた。

この後、この反応液を３分間沸騰水浴上で煮沸して、この反応液中の反応を停止させてから、遠心分離(２２６０×ｇ，１０分，４℃)して、反応液の上清を被験試料反応液とし、この被験試料反応液を高速液体クロマトグラフィ(High Performance Liquid Chromatography:ＨＰＬＣ)分析した。このとき、このＨＰＬＣ分析は、カラムとしてWakosil Ｃ１８−ＯＤＳ ５μｍ(和光純薬株式会社製)を用い、移動相(Mobile phase)として２５ｍｍｏｌリン酸二水素カリウム( ＫＨ_２ＰＯ_４)を含有した１ｍｍｏｌ／Ｌテトラブチルアンモニウムパークレート(ＴＢＡＰ)を用い、流量(Flow rate)を１．０ｍＬ／ｍｉｎとし、検出量(Detector)を２６０ｎｍとし、検出強度(atten)を３２以上６４以下とした。

さらに、上記方法と同様の方法で、被験試料を添加しない空試験を同時にしてコントロール溶液を作成した。ここで、被験試料溶液としては、エルカンプーレ抽出物の最終濃度が２００μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬそれぞれのエルカンプーレ溶液を用いた。

そして、ｃＡＭＰのピーク面積から、ホスホジエステラーゼ活性阻害作用を算出した。

ここで、このホスホジエステラーゼ活性阻害作用の計算方法としては次の式を用いた。

・ホスホジエステラーゼ活性阻害率(％)＝(１−Ａ／Ｂ)×１００
Ａ ： 被験試料添加でのｃＡＭＰのピーク面積
Ｂ ： コントロールでのｃＡＭＰのピーク面積

このとき、被験試料およびテオフィリンの濃度を段階的に減少させてホスホジエステラーゼ活性阻害率を測定し、この阻害率が５０％になる被験試料およびテオフィリンの濃度ＩＣ_５０(μｇ／ｍＬ)を内挿法により算出した。なお、このＩＣ_５０の値が小さきほどホスホジエステラーゼ活性阻害作用が強い。

＜結果＞

この結果、表１２に示すように、濃度が２００μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で８２．５％のｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害率を確認でき、濃度が５０μｇ／ｍＬのエルカンプーレ溶液で５９．９％のｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害率を確認できた。さらに、濃度が２００μｇ／ｍＬのテオフィリン(陽性対照)では、５３．４％のｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害率を確認でき、濃度が５０μｇ／ｍＬのテオフィリン(陽性対照)では、３９．２％のｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害率を確認できた。したがって、このエルカンプーレ溶液中に含まれているエルカンプーレ抽出物は、陽性対照として用いたテオフィリンより強いｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有することを確認できた。

ここで、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用によって、脂肪の代謝促進に関与しているｃＡＭＰを分解する酵素できるｃＡＭＰホスホジエステラーゼの作用を抑制できることから、細胞内のｃＡＭＰの濃度を上昇させて脂質代謝を活発にできるので、肥満を解消あるいは予防できる。

＜まとめ＞
以上の結果、上記実施例１ないし実施例１２に示すように、エルカンプーレ抽出物には、エストロゲン様作用、コラーゲン産生促進作用、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用などの強い作用があるとともに、ＭＭＰ−１活性阻害作用、皮膚線維芽細胞増殖作用、テストステロン５αリダクターゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、ＳＯＤ様作用、チロシナーゼ活性阻害作用およびＢ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用が認められたことから、抗老化や抗炎症、肥満防止、育毛、美白などに有用だと考えられる。

Claims (12)

1. エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、脂肪分解促進作用を有する
   ことを特徴とした脂肪分解促進作用組成物。
2. エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、サイクリックアデノシンモノフォスフェイト(ｃＡＭＰ)−ホスホジエステラーゼ(ＰＤＥ)活性阻害作用を有する
   ことを特徴としたｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性阻害作用組成物。
3. エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有する
   ことを特徴としたヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用組成物。
4. エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、マトリクスメタロプロテアーゼ−１(ＭＭＰ−１)活性阻害作用を有する
   ことを特徴としたＭＭＰ−１活性阻害作用組成物。
5. エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、コラーゲン産生促進作用を有する
   ことを特徴としたコラーゲン産生促進作用組成物。
6. エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、皮膚線維芽細胞増殖作用を有する
   ことを特徴とした皮膚線維芽細胞増殖作用組成物。
7. エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、エストロゲン様作用を有する
   ことを特徴としたエストロゲン様作用組成物。
8. エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用を有する
   ことを特徴としたテストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用組成物。
9. エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、抗老化作用を有する
   ことを特徴とした抗老化作用組成物。
10. エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、育毛作用を有する
    ことを特徴とした育毛作用組成物。
11. エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、美白作用を有する
    ことを特徴とした美白作用組成物。
12. エルカンプーレおよびエルカンプーレの抽出物の少なくともいずれかを含有し、抗炎症作用を有する
    ことを特徴とした抗炎症作用組成物。