KR20110094267A

KR20110094267A - 변형성 관절증 치료제 또는 예방제

Info

Publication number: KR20110094267A
Application number: KR1020117004979A
Authority: KR
Inventors: 쿠즈키 니시오카; 카즈오 유도
Original assignee: 가부시키가이샤 아크시스
Priority date: 2008-08-01
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2011-08-23
Also published as: KR101196514B1; EP2322220A1; CA2732715A1; AU2009277824A1; US8377444B2; CN105169389A; CN102170905A; EP2322220A4; BRPI0917554A2; CA2732715C; WO2010013498A1; AU2009277824B2; JPWO2010013498A1; JP4560822B2; RU2011107405A; RU2492871C2; CN102170905B; US20110182915A1; EP2322220B1

Abstract

본 발명은 IgM형 항Fas항체를 이용함으로써, 변형성 관절증의 증상을 완화할 수 있다는 지견에 기반하는 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 IgM형 항Fas항체를 이용함으로써, 연골 기질 분해 효소 산생을 억제할 수 있다는 지견에 기반하는 것이다. 또한 본 발명은 IgM형 항Fas항체를 이용함으로써, 연골 기질 산생능을 개선할 수 있다는 지견에 기반하는 것이다.

Description

변형성 관절증 치료제 또는 예방제{A THERAPEUTIC AGENT AND A PREVENTIVE AGENT FOR OSTEOARTHRITIS AND OSTEOARTHRITIC INFLAMMATION}

본 발명은 IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하는 변형성 관절증, 및 변형성 관절증에서 야기되는 관절염(활막염)의 치료제 및 예방제 등에 관한 것이다.

변형성 관절증(osteoarthritis(OA))은, 가령(加齡)이나 기계적 스트레스가 원인이 되어, 관절 연골 표면의 붕괴와, 이에 수반하는 관절 변연(邊緣)의 새로운 연골의 증식 관절의 변형 적합성의 파탄을 초래하고, 추가로 관절 활막의 염증으로 진행하는 질환이다. 한편 대표적인 관절염인 관절 류마티즘(rheumatoid arthritis(RA))은, 면역 이상이나 감염증이 원인이 되어 활막에 염증성 세포가 습윤(濕潤)하고, 추가로 혈관 신생에 수반해서 활막 섬유아세포(blast cell)의 증식이 항진해서, 염증성 활막 육아 조직이 형성되고, 뼈나 연골의 파괴가 진행되고, 관절에 불가역적인 장해가 초래된다. 이 때문에 관절 류마티즘(RA)이 염증성 질환이라 불리는 자기 면역 질환임에 반해서, 변형성 관절증(OA)는 비염증성 질환이라 불리고 있다. 따라서 관절 류마티즘의 치료에 이용되는 치료약은, 변형성 관절증에서는 치료 효과가 없다고 일반적으로 생각되고 있다.

종래 관절 류마티즘(RA)의 치료를 목적으로 해서 다양한 의약 조성물이 개발되어 왔다. 그 중 하나로서 항Fas항체를 예로 들 수 있다(일본특허공개2004-59582호 공보(특허문헌1 참조)). 그러나 항Fas항체는 관절 루마티즘(RA)의 질환에서 채취한 활막 세포에 대해서는 아포토시스 유도 효과가 없는 것이 보고되고 있다. (NAKAJIMA et al., "APOPTOSIS AND FUNCTIONAL FAS ANTIGEN IN RHEUMATOID ARTHRITIS SYNOVICYTES", ARTHRITIS & RHEUMATISM, 38(4), 1995, p485-p491(비특허문헌 1 참조).

한편 변형성 관절증의 치료에는, 항염증, 진통 효과가 있는 비스테로이드계의 약제(NSAIDs)가 사용되어 왔다. 또한 이외에도 관절액을 주사 등으로 저감하거나, 부신피질 호르몬제나 콘드로이틴 황산 나트륨, 히알루론산(hyaluronic acid(HA))등의 관절 연골의 보호제를 주사하는 치료가 수행되어 왔다.

또한 이와 같은 관절변성 질환에 대한 치료약으로서, 시그널 전달계 저해제인 p21 활성화 키나아제(PAK) 저해제(일본특허공표2007-537134호 공보(특허문헌2 참조)나 안티센스폴리누클레오티드, 리보자임 및 저분자 간섭RNA 등을 포함하는 의약 조성물(일본특허공표2008-516593호 공보(특허문헌 3 참조))이 이용되고 있지만, 충분한 효과가 얻어지고 있지 않는 것이 현실이다.

이 외에 현재 수행되고 있는 치료약 개발에서는, 연골 재생의 촉진 인자(인터로이킨(IL)-1 등)을 타겟으로 한 치료약 개발이나 연골 수복·재생을 유도하는 인자를 약제로서 응용하는 시도가 행해지고 있지만, 만족스러운 결과가 얻어지고 있지 않는 것이 현실이다.

일본특허공개2004-59582호 공보, 일본특허공표2007-537134호 공보, 일본특허공표2008-516593호 공보, 일본특허공개평8-40897호 공보, 일본특허공개2006-151843호 공보, 일본 특허공개2007-51077호 공보.

NAKAJIMA et al., "APOPTOSIS AND FUNCTIONAL FAS ANTIGEN IN RHEUMATOID ARTHRITIS SYNOVICYTES", ARTHRITIS & RHEUMATISM, 38(4), 1995, p485-p491 ARTHRITIS RHEUM, 2001, VOL. 44, NO.8, P.1800-1807.

본 발명은 변형성 관절증, 및 변형성 관절증성 관절염(활막염)에 대한 치료제 및 예방제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 게다가 본 발명은 관절증에 관여하는 연골 기질 분해 효소 산생 억제제, 연골 기질 합성 개선제, 및 변형성 관절증으로 유도되는 마크로파지에 대한 아포토시스 유도제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 IgM형 항Fas항체를 이용함으로써, 변형성 관절증에 있어서 연골 변성을 억제할 수 있고, 연골 기질 분해 효소 산생을 억제할 수 있으며, 연골 기질 산생능을 개선할 수 있고, 변형성 관절증에 의해 유도되는 마크로파지의 아포토시스를 촉진할 수 있는 이점이 있다.

도1은 ICRS 그레이드마다의 관절 연골의 병능(病能)을 나타내는 도면으로, 1A는 그레이드0의 정상적인 상태의 연골을 나타내고, 1B는 그레이드1의 연골 표층에 완만한 홈이 생긴 상태의 연골을 나타내고, 1C는 그레이드1의 연골의 표층에 금이나 균열이 생긴 상태를 나타내고, 1D는 그레이드2의 연골 결손이 연골의 50% 이하의 깊이까지 확장된 상태를 나타내고, 1E는 그레이드3의 연골 결손이 연골의 50% 이상의 깊이까지 확장된 상태를 나타내고, 1F는 그레이드3의 연골 결손이 석회화층까지 확장된 상태를 나타내고, 1H는 그레이드3의 종창이 야기된 상태를 나타내고, 1I 및 1J는 그레이드4의 병변이 연골 하골까지 확장된 상태를 나타낸다.
도2는 IgM형 항Fas항체가 연골 세포의 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)의 산생능에 가하는 영향을 나타내는 도면을 대신하는 그래프들로, 2A는 IgM형 항Fas항체가 연골 세포의 MMP1산생능에 가하는 영향을 나타내는 도면을 대신하는 그래프이고, 2B는 IgM형 항Fas항체가 연골 세포의 MMP3 산생능에 가하는 영향을 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다.
도3은 IgM형 항Fas항체에 의한 연골 기질(프로테오글리칸) 산생능 저하에 대한 효과를 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다.
도4는 IgM형 항Fas항체의 아포토시스 억제 효과를 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다.
도5는 IgM형 항Fas항체 또는 IgG형 항Fas항체가 연골 세포의 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)의 산생능에 가하는 영향을 나타내는 도면을 대신하는 그래프들로, 5A는 IgM형 항Fas항체 또는 IgG형 항Fas항체가 연골 세포의 MMP1산생능에 가하는 영향을 나타내는 도면을 대신하는 그래프이고, 5B는 IgM형 항Fas항체 또는 IgG형 항Fas항체가 연골 세포의 MMP3산생능에 가하는 영향을 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다.
도6은 IgM형 항Fas항체 또는 IgG형 항Fas항체의 아포토시스 억제 효과를 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다.
도7은 변형성 관절증 모델 랫의 관절증 병리 조직 스코어를 나타내는 도면을 대신하는 그래프들로, 7A는 사프라닌O 염색의 결과를 나타내고, 7B는 연골 세포 결손의 결과를 나타낸다. 도7C는 연골 구조의 결과를 나타낸다.
도8은 처치 후 12주째의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내는 도면을 대신하는 사진들로, 8A~8F는 컨트롤의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내고, 8G~8J는 CH-11 저용량 투여군(CH-11: 1.0ng/ml 투여)의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내고, 8K~8N은 CH-11 고용량 투여군(CH-11: 10.0ng/ml투여)의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내고, 8O는 컨트롤의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내고, 8P는 CH-11 저용량 투여군(CH-11: 1.0ng/ml투여)의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타낸다.
도9는 처치 후 24주째의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내는 도면을 대신하는 사진들로, 9A~9H는 컨트롤의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내고, 9I~9L은 CH-11 저용량 투여군(CH-11: 1.0ng/ml투여)의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내고, 9M~9P는 CH-11 고용량 투여군(CH-11: 10.0ng/ml투여)의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타낸다. 도9B, 도9D, 도9F, 도9H, 도9I, 도9K, 도9M 및 도9O은 각각 도9A, 도9C, 도9E, 도9G, 도9J, 도9L, 도9N 및 도9P 중 사각으로 둘러싼 부분을 확대한 도면을 대신하는 사진이다.

본 발명은 IgM형 항Fas항체를 이용함으로써, 변형성 관절증에 있어서 연골 변성을 억제할 수 있다는 지견에 기반하는 것이다. 구체적으로는 본 발명은, IgM형 항Fas항체를 이용함으로써 연골 기질 분해 효소 산생을 억제할 수 있다는 지견에 기반하는 것이다. 또한 본 발명은 IgM형 항Fas항체를 이용함으로써, 연골 기질 산생능을 개선할 수 있다는 지견에 기반하는 것이다. 또한 본 발명은 변형성 관절증에 의해 유도되는 마크로파지의 아포토시스를 촉진할 수 있다는 지견에 기반하는 것이다. 변형성 관절증에 IgM형 항Fas항체를 이용할 수 있다는 것은 이번에 새롭게 수득된 지견이다.

본 발명의 제1 측면은 IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하는, 변형성 관절증의 초기 단계에서 진행기 단계로 분류되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 치료제 또는 예방제에 관한 것이다. 변형성 관절증의 초기 단계에서 진행기 단계의 각 단계는, 변형성 관절증의 ICRS 분류, KelIgren-Lawrence분류, Outerbridge분류, 또는 수정(修正) Mankin 스코어에 의해 분류된다. 상기 분류에 의해 변형성 관절증의 초기 단계에서 진행기 단계를 분류하면, 본 발명의 제(劑)가 타겟으로 하는 질환은, (1) 변형성 관절증의 ICRS분류에 의해 그레이드1~3으로 분류되는 질환, (2) 변형성 관절증의 KelIgren-Lawrence분류에 있어서 그레이드 1~3까지로 분류되는 질환, (3) 변형성 관절증의 Outerbridge분류에 있어서 그레이드 1~3까지로 분류되는 질환, 또는 (4) 변형성 관절증의 수정 Mankin 스코어에 있어서 스코어 1~7까지로 분류되는 질환이다.

변형성 관절증에 있어서, 상기 그레이드 또는 스코어로 분류되는 질환은, 증상으로서 연골 변성을 수반한다. 후술하는 바와 같이, 본 발명의 IgM형 항체는, 연골 변성을 억제할 수 있다. 따라서 IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하는 본 발명의 제(劑)는, 연골 변성을 수반하는 질환을 치료 또는 예방하기 위해서 효과적으로 이용할 수 있다. 즉 본 발명의 제(劑)는 변형성 관절증의 초기 단계부터 진행기 단계로 분류되는 질환을 치료 또는 예방하기 위해서 효과적으로 이용할 수 있다.

또한 후술하는 실시예에서 나타난 바와 같이, IgM형 항Fas항체는 연골 변성의 메디에이터인 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)-1 및 MMP-3의 산생을 억제할 수 있다. MMP는 연골 기질 분해 효소의 1종이다. 연골 기질 분해 효소는 관절 연골을 분해해 버리기 때문에, 변형성 관절증을 야기하거나, 변형성 관절증의 증상을 악화시키는 원인이 될 수 있다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 MMP의 산생을 억제할 수 있으므로, 연골 변성을 수반하는 질환의 치료제 또는 예방제로서 적합하게 이용할 수 있다. 또한 후술하는 실시예에서 나타난 바와 같이, IgM형 항Fas항체는 연골 기질 프로테오글리칸의 합성능을 개선시킬 수 있다. 변형성 관절증에서는, 관절 연골이 파괴되는 것도 원인이 된다. 연골 기질인 프로테오글리칸의 합성능을 개선시킴으로써, 파괴된 관절 연골은 재생된다. 따라서, 본 발명의 제(劑)는 연골 변성을 수반하는 변형성 관절증의 초기 단계에서 진행기 단계로 분류되는 질환을 치료 또는 예방하기 위해서 효과적으로 이용할 수 있다. 즉 본 발명은 IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함율하는 연골 파괴 억제제도 제공한다.

본 발명의 제1 측면의 바람직한 태양은, IgM형 항Fas항체가 Fas항원의 세포외 도메인(배열번호1의 26~173번째에 기재된 아미노산 배열)과 동일, 또는 1개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드에 대한 항체인, 상기에 기재된 제(劑)이다.

본 발명의 제1 측면의 바람직한 태양은, IgM형 항Fas항체가 CH11 또는 7C11인, 상기 어느 하나에 기재된 제(劑)이다. 후술하는 실시예에서 나타난 바와 같이, CH11 또는 C711은 MMP1 및 MMP3의 산생을 효과적으로 억제할 수 있다. 그리고 CH11은 연골 기질인 프로테오글리칸의 합성능을 개선할 수 있다. 따라서 IgM형 항Fas항체를 포함하는 본 발명의 제(劑)는 연골 변성을 수반하는 변형성 관절증의 초기 단계부터 진행기 단계로 분류되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 치료제 또는 예방제로서 적합하게 이용할 수 있다.

본 발명의 제2 측면은 IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하는, 변형성 관절증성 관절염 치료제 또는 예방제에 관한 것이다. 후술하는 실시예에서 나타난 바와 같이, IgM형 항Fas항체는 마크로파지에 의한 염증성 사이토카인의 산생을 억제할 수 있다. 또한 IgM형 항Fas항체는 면역 응답에 관여하는 MMP1 및 3의 산생을 억제한다. 따라서 제2 측면에 따른 제(劑)는 연골 세포 변형성 관절증성 관절염의 치료제 및 예방제로서 적합하게 이용할 수 있다.

본 발명의 제2 측면의 바람직한 태양은 IgM형 항Fas항체가 Fas항원의 세포외 도메인(배열 번호1의 26~173번째에 기재된 아미노산 배열)과 동일 또는 1개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드에 대한 항체인, 상기에 기재된 제(劑)이다.

본 발명의 제2 측면의 바람직한 태양은 IgM형 항Fas항체가 CH11 또는 7C11인 상기 어느 하나에 기재된 제(劑)이다. 후술하는 실시예에서 나타난 바와 같이, CH11 또는 7C11은 마크로파지에 의한 염증성 사이토카인의 산생을 억제한다. 또한 CH11 또는 7C11는 면역 응답에 관여하는 MMP1 및 MMP3의 산생을 억제한다. 따하서 이 제(劑)는 연골 세포 변형성 관절증성 관절염의 치료제 및 예방제로서 적합하게 이용할 수 있다.

본 발명의 제3 측면은, IgM형 항Fas항체를 유효성분으로서 함유하는 연골 기질 분해 효소 산생 억제제이다. 후술하는 실시예에서 나타난 바와 같이, IgM형 항Fas항체는 CH11 또는 7C11가 바람직하다. 실시예에 의해 실증된 바와 같이, 본 발명의 IgM형 항Fas항체는 효과적으로 연골 기질 분해 효소의 산생을 억제할 수 있다. 따라서 본 발명의 제(劑)는 연골 기질 분해 효소 산생 억제제로서 적합하게 이용할 수 있다.

본 발명의 제4 측면은, IgM형 항Fas항체를 유효성분으로서 함유하는 연골 기질 산생제이다. 후술하는 실시예에서 나타난 바와 같이, IgM형 항Fas항체는 CH11 또는 7C11가 바람직하다. 실시예에 의해 실증된 바와 같이, 본 발명의 IgM형 항Fas항체는 연골 기질(프로테오글리칸)의 재생능을 개선시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 제(劑)는 연골 기질 산생제로서 적합하게 이용할 수 있다.

본 발명의 제5 측면은 IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 포함하는 변형성 관절증으로 유도되는 마크로파지에 대한 아포토시스 유도제이다. 후술하는 실시예에서 나타난 바와 같이, IgM형 항Fas항체는 CH11 또는 7C11인 것이 바람직하다. 실시예에 의해 실증된 바와 같이, 본 발명의 IgM형 항Fas항체는 변형성 관절증으로 유도되는 마크로파지의 아포토시스를 유도할 수 있다. 따라서 본 발명의 제(劑)는 변형성 관절증으로 유도되는 마크로파지에 대한 아포트시스 유도제로서 적합하게 이용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 변형성 관절증, 및 변형성 관절증성 관절염(활막염)에 대한 치료제 및 예방제를 제공할 수 있다. 게다가 본 발명은 관절증 등에 관여하는 연골 기질 분해 효소 산생 억제제, 연골 기질 합성 개선제, 및 변형성 관절증으로 유도되는 마크로파지에 대한 아포토시스 유도제를 제공할 수 있다.

이하 본 발명에 대해서 설명한다. 본 발명의 제1 측면은 IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하는 변형성 관절증의 초기 단계~진행기 단계로 분류되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 치료제 또는 예방제에 관한 것이다. 변형성 관절증은, 지절간 관절, 제1 수근 중수 관절, 경추 또는 요추의 추간판, 제1 중족지절 관절, 고관절, 슬관절에 야기하는 질환이다. 본 발명의 제(劑)는 이와 같은 부위에 이용할 수 있다. 이들 중에서는, 본 발명의 제(劑)는 고관절, 슬관절, 또는 슬연골에 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제(劑)가 타겟으로 하는 질환은, 변형성 관절증에 있어서 연골 변성을 수반하는 발증 초기 단계~진행기 단계로 분류되는 질환이다. 변형성 관절증의 단계는, 그 병능에 기반해서, 하기 표1 내지 4에서 나타낸 바와 같이 분류된다. 이하 변형성 관절증의 단계에 대해서, 하기 표1 내지 표4에 나타낸 변형성 관절증의 진행도 분류 기준을 이용해서 설명한다.

표1은 변형성 관절증에 있어서, ICRS(International Cartilage Repair Society)에 의한 연골 결손의 grading(이하 "ICRS 분류"라고도 한다)을 나타낸다.

ICRS 분류에서는 변형성 관절증은 그레이드0~4로 분류된다. ICRS 분류에 있어서 그레이드0은 변형성 관절증을 발증하고 있지 않은 단계이다. 그레이드1은 변형성 관절증의 초기 단계이다. 그레이드2~3은 변형성 관절증의 진행기 단계이다. 그레이드4는 변형성 관절증의 미기(未期) 단계이다. 상기와 같이, 본 발명의 제(劑)의 타겟은, 변형성 관절증의 초기 단계~진행기 단계로 분류되는 질환이다. 즉 본 발명의 제(劑)의 타겟은 변형성 관절증의 ICRS분류에 있어서 그레이드1~3 중 어느 하나로 분류되는 질환이다.

변형성 관절증의 ICRS분류의 각 그레이드로 나타나는 연골의 상태를 도1에 나타냈다. 연골은, 표층, 중간층, 심층 및 석회화층으로 이루어지는 층상 구조를 취하고 있다(도1A). 그리고 연골은, 석회화층을 통해서 뼈(연골 하골)과 연결되어 있다. 도1의 1A는 그레이드0의 정상적인 상태의 연골을 나타내고, 1B는 그레이드1의 연골 표층에 완만한 홈이 생긴 상태의 연골을 나타내고, 1C는 그레이드1의 연골의 표층에 금이나 균열이 생긴 상태를 나타내고, 1D는 그레이드2의 연골 결손이 연골의 50% 이하의 깊이로 확장된 상태를 나타내고, 1E는 그레이드3의 연골 결손이 연골의 50% 이상의 깊이로 확장된 상태를 나타내고, 1F는 그레이드3의 연골 결손이 석회화층까지 확장된 상태를 나타내고, 1H는 그레이드3의 종창이 야기된 상태를 나타낸다. 도1의 1I 및 1J는 그레이드4의 병변이 연골 하골까지 확장된 상태를 나타낸다. 상기와 같이 본 발명의 제(劑)는 연골 변성을 치료 및 예방하는 것이다. 후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제(劑)는 ICRS에 의한 연골 결손의 분류에서는 그레이드1~그레이드3(변형성 관절증의 초기 단계~진행기 단계)에 상당하는 변형성 관절증의 병상을 억제한다. 따라서 본 발명의 제(劑)는 변형 관절증의 초기 단계~진행기 단계로 분류되는 질환을 치료 또는 예방하기 위해서 이용할 수 있다.

표2는 변형성 관절증의 KelIgren-Lawrence분류(이하, "KL분류"라고도 한다)를 나타낸다.

KL분류에서는, 변형성 관절증은 그레이드0~4로 분류된다. KL분류에 있어서, 그레이드0은 변형성 관절증을 발증하고 있지 않은 단계이다. 그레이드1은 변형성 관절증의 초기 단계이다. 그레이드2~3은 변형성 관절증의 진행기 단계이다. 그레이드4는 변형성 관절증의 미기(未期) 단계이다. 또한 KL분류에 있어서, 관절 열극의 협소화는 연골 세포의 소멸 등 연골의 변성에 의한 것이다. 상기와 같이 본 발명의 제(劑)의 타겟은 연골 변성을 수반하는 변형성 관절증의 초기 단계~진행기 단계로 분류되는 질환이다. 즉 본 발명의 제(劑)의 타겟은 변형성 관절증의 KL분류에 있어서 그레이드1~3 중 어느 하나로 분류되는 질환이다. 또한 표2에 있어서 KL분류의 그레이드0~4는 각각 ICRS분류의 그레이드0~4에 상당한다.

KL분류에서는, 변형성 관절증은 그레이드0~4로 분류된다.

표3은 변형성 관절증의 Outerbridge분류(이하 "OB분류"라고도 한다)를 나타낸다.

OB분류에서는 변형성 관절증은 그레이드0~4로 분류된다. OB분류에 있어서, 그레이드0은 변형성 관절증을 발증하고 있지 않은 단계이다. 그레이드1은 변형성 관절증의 초기 단계이다. 그레이드2~3은 변형성 관절증의 진행기 단계이다. 그레이드4는 변형성 관절증의 미기(未期) 단계이다. 상기와 같이 본 발명의 제(劑)의 타겟은 변형성 관절증의 초기 단계~진행기 단계로 분류되는 질환이다. 즉 본 발명의 제(劑)의 타겟은 변형성 관절증의 OB분류에 있어서 그레이드1~3 중 어느 하나로 분류되는 질환이다. 또한 표3에 있어서 OB분류의 그레이드0~4는 각각 ICRS분류의 그레이드0~4에 상당한다.

표4는 변형성 관절증의 수정 Mankin스코어에 의한 분류를 나타낸다.

수정 Mankin스코어에 있어서, 사프라닌O-패스트그린 염색에서는 관절 연골 조직을 염색한 때의 염색 정도에 따라서 변형성 관절증이 분류된다. 연골 세포 결손에서는, 염색된 연골 세포량에 따라서 변형성 관절증이 분류된다. 그리고 구조에서는 관절 연골에 발생하는 균열의 정도에 따라서 변형성 관절증이 분류된다. 표4에 있어서 스코어1~3은 변형성 관절증의 초기 단계이며, ICRS 분류의 그레이드1에 상당한다. 스코어4~5는 변형성 관절증의 진행기 단계이며, ICRS분류의 그레이드2에 상당한다. 스코어6~8도 변형성 관절증의 진행기 단계이며, ICRS분류의 그레이드3에 상당한다. 상기와 같이 본 발명의 제(劑)의 타겟은 변형성 관절증의 초기 단계~진행기 단계로 분류되는 질환이다. 즉 본 발명의 제(劑)의 타겟은 변형성 관절증의 수정 Mankin스코어에 있어서 그레이드1~7 중 어느 하나로 분류되는 질환이다.

후술하는 실시예에서 나타난 바와 같이, IgM형 항Fas항체는 수정 Mankin 스코어2~7의 변형성 관절증의 증상(연골 변성)을 억제할 수 있다. 또한 후술하는 실시예에서 나타난 바와 같이, IgM형 항Fas항체는 연골 기질의 결손을 억제할 수 있다. 또한 IgM형 항Fas항체는 연골 기질 산생능을 개선할 수 있다. 상기와 같이 Mankin스코어2~7은 그 병태로서 연골 변성을 수반하는 변형성 관절증의 초기~진행기 단계이다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 변형성 관절증의 초기 단계~진행기 단계로 분류되는 질환의 치료제 또는 예방제로서 효과적으로 이용할 수 있다.

후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같이 IgM형 항Fas항체는 수정 Mankin스코어2~7의 변형성 관절증의 증상(연골 변성)을 억제할 수 있다. 또한 후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같이, IgM형 항Fas항체는 연골 기질의 결손을 억제할 수 있다. 또한 IgM형 항Fas항체는 연골 기질 산생능을 개선할 수 있다.상기와 같이 Mankin스코어2~7은 그 병태로서 연골 변성을 수반하는 변형성 관절증의 초기~진행기 단계이다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 변형성 관절증의 초기 단계~진행기 단계로 분류되는 질환의 치료제 또는 예방제로서 효과적으로 이용할 수 있다.

본 발명의 제2 측면은, IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하는 변형성 관절증성 관절염의 치료제 또는 예방제에 관한 것이다. 변형성 관절증성 관절염은, 변형성 관절증에서 야기되는 2차 염증 반응이다. 변형성 관절증에서는, 관절 연골 표면의 붕괴나, 이에 수반하는 관절 연변(緣邊)의 새로운 연골의 증식 관절의 변형 등에 의해, 주변의 세포가 자극을 받고, 2차 염증 반응이 야기될 수 있다. 본 발명의 제(劑)는 이와 같은 변형성 관절증성 관절염의 치료제 또는 예방제로서 적합하게 이용할 수 있다.

게다가 본 발명의 제(劑)는 IgM형 항Fas항체를 유효성분으로서 함유하는 연골 기질 분해 효소 산생 억제제, 연골 기질 산생제, 및 변형성 관절증으로 유도되는 마크로파지에 대한 아포토시스 유도제로서 이용할 수 있다. 그렇게 해서 IgM형 항Fas항체는 CH11, AGR098 또는 7C11인 것이 바람직하다. 후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같이, 이와 같은 IgM형 항Fas항체는 연골 기질 분해 효소 산생 억제제, 연골 기질 산생제, 및 변형성 관절증으로 유도되는 마크로파지에 대한 아포토시스 유도제로서 효과적으로 이용할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 항체란 생물체내에 유도되는 단백질이다. 이와 같은 생물의 예는, 포유류 및 조류이다. 본 발명의 항체의 예는, 인간, 마우스 및 랫 등 포유 동물 유래의 항Fas항체이다. 본 발명의 항체는, 인간 이외에도 개나 고양이 등의 동물 의약으로서 이용할 수도 있다. 투여 후의 부작용을 피하기 위해서, 투여하는 생물 유래의 항체로 하는 것이 바람직하다. 인간에게 투여하는 항체의 타입의 예는 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 (완전)인간 항체이다.

이와 같은 항체는, 공지의 방법으로 제조할 수 있다(예를 들면, 다케나와 타다오미편(編), 단백질 실험 핸드북, 2003, p86~p105, ㈜ 요도사(社) 발행). 항체가 결합하는 항원인 단백질이나 펩티드를, 항체를 산생하는 면역 동물에 주사한다. 면역 동물은 마우스, 래트, 행스터, 토끼 및 염소 등 면역 동물로서 이용되는 공지의 동물을 이용할 수 있다. 면역 동물에 대한 항원의 주입은, 1회 또는 2회 이상으로 정기적(예를 들면 2~4주간마다)으로 수행한다. 항원의 주입 후 일정 기간 마다(예를 들면 1~2주간), 채혈을 수행하고, 목적하는 항체가 산생되고 있음을 확인한다(항체가(價)를 조사한다). 항체가를 조사하는 방법은 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면 웨스턴 블로팅, ELISA 등을 들 수 있다. 이와 같은 방법을 이용함으로써, 면역 동물 유래의 항체(마우스라면 마우스 항체)를 수득할 수 있다.

키메라 항체란, 마우스 항체의 가변 영역을 인간 항체의 정상 영역에 연결한 것으로, 공지의 방법(예를 들면 일본특허공개 평7-194384호 공보 등)에 의해 제조할 수 있다. 인간화 항체란, 마우스 항체의 상보쇄 결정 영역(complementarity determining region: CDR)을 인간 항체의 가변 영역에 이식한 항체이며, 공지의 방법(일본특허2828340호 공보, 일본특허공개평11-4694호 공보 등)으로 제조할 수 있다. 인간 항체는 면역 동물이 본래 가지고 있는 면역 글로불린을 파괴한 녹아웃(knockout) 동물에, 인간 면역 글로불린 유전자를 도입하고, 산생시킨 항체이며, 공지의 방법(일본특허공개평10-146194호 공보, 일본특허공개평10-155492호 공보 등)으로 제조할 수 있다. 완전 인간항체란, 인간의 세포에서 산생되는 항체이며, 공지의 방법(일본특허공개2007-141호 공보, 일본특허공개2005-034154호 공보 등). 당업자라면, 이와 같은 항체의 공지의 제조 방법을 적절히 채용해서, 본 발명의 항체를 제조할 수 있다.

Fas항원은, 세포막 관통형 당단백질이며, APO-1, CD95, ALPS1A, APT1, Fas1, FasL 리셉터, TNF 리셉터 수퍼패밀리 멤버6(TNF receptor superfamily member6), TNFR6 등이라고도 불린다. 세포 표면상에 발현하고 있는 Fas항원은, Fas리간드(FasL)나 항Fas항체 등으로 자극됨으로써, 그 세포에 아포토시스를 유도하는 리셉터로서 기능하는 것이 알려져 있다(Fas 개재성 아포토시스). Fas항원은, 생체내의 각 조직을 구성하는 세포에 널리 분포되어 있다. 또한 Fas항원은, 마크로파지, 내추럴 킬러(NK(세포, B세포, T세포, 과립구, 단구 등의 염증관련 세포에도 발현한다. FasL은, T세포, NK세포, 이펙터 세포 등에 발현하는 것이 보고되고 있다. Fas항원에 Fas리간드나 항Fas항체가 결합하면, Fas항원은 3량체(trimer)를 형성한다. 게다가 Fas 항원의 세포내 도메인도 3량체화함으로써, 세포내에 아포토시스 시그날을 전달해 가는 것이 알려져 있다. 또한 생체내에 있어서 Fas리간드는 3량체를 형성하고 있는 것이 보고되고 있으며, 3량체화한 Fas리간드가 Fas항원에 결합함으로써, Fas항원의 세포내 도메인의 3량체화가 일어나고, 아포토시스 시그날이 전달된다고 생각되고 있다.

항Fas항체로서는 Fas개재성 아포토시스를 유도하는 항체(아고니스트 항체)나, Fas개재성 아포토시스를 저해하는 항체(안타고니스트 항체) 등이 있다. 본 발명에 있어서 바람직한 항Fas항체는 Fas개재성 아포토시스를 유도하는 항체(아고니스트 항체)이다. 이와 같은 항FAS 항체로서, 예를 들면 배열 번호1에 기재된 아미노산 배열과 동일, 또는 1~10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드에 대한 항체를 들 수 있다. 배열 번호1은 인간의 Fas항원을 나타내는 아미노산 배열이다. 배열 번호1에 기재된 아미노산 배열 중, 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 잔기의 수는 1~10개를 들 수 있지만, 바람직하게는 1~5개이며, 더 바람직하게는 1~2개이며, 더욱 더 바람직하게는 1개이다. 본 발명의 항Fas항체를 포함하는 제(劑)는, 인간 이외에도 개나 고양이 등의 동물을 대상으로 하는 것도 가능하다. 이와 같은 동물 의약으로서, 본 발명의 항Fas항체를 포함하는 제(劑)를 이용하는 경우에는, 항Fas 항체는 인간 유래의 Fas항원을 나타내는 배열 번호 1에 기재된 아미노산 배열과 동일 또는 1~10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드에 대한 항체보다도, 투여하는 동물 유래의 Fas항원을 구성하는 아미노산 배열과 동일 또는 1~10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 배열로 이루어지는 펜티드에 대한 항체로 하는 것이 바람직하다. 이와 같은 동물 유래의 Fas항원을 구성하는 아미노산 배열은 예를 들면 GenBank 등 공지의 사이트를 사용해서 입수하면 된다.

본 발명의 바람직한 태양은 항Fas항체는, Fas항원의 세포외 도메인을 인식하는 항체이다. 구체적으로는 배열번호1의 26~173번째에 기재된 아미노산 배열과 동일, 또는 1~5개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드에 대한 항체이다. 배열 번호1의 26~173번째에 기재된 아미노산 배열 중, 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 잔기의 수는, 1~5개를 들 수 있지만, 바람직하게는 1~2개이며, 더 바람직하게는 1개이다. 이와 같은 치환 등이 되는 아미노산 잔기의 예로서는, UniProt(the universal protein resource(http://www.pir.uniprot.org/)) 어센션 No.P25445에 기재된 것을 들 수 있다. 배열 번호1의 26~173번째에 기재된 아미노산 배열은, Fas항원의 세포외 도메인을 나타내는 배열이다. 본 발명에 있어서 바람직한 항Fas항체는, Fas 개재성 아포토시스를 유도하는 항체이다. 즉 본 발명의 항Fas항체는 Fas항원에 결합하고, Fas항원의 3량체화를 일이키고, 아포토시스 시그널을 세포내에 전달할 수 있는 항체인 것이 바람직하다. 본 발명의 항Fas항체를 Fas항원의 세포외 도메인에 대한 항체로 함으로써, 항Fas항체를 포함하는 제(劑)를 투여한 경우, 적합하게 Fas항원과 결합하고, 그 3령체화를 일으키고, 세포냐 시그널 전달을 촉진할 수 있다. 따라서 효과적으로 치료 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 항Fas항체는, 폴리클로날 항체나 모노클로날 항체여도 된다. 그러나 폴리클로날 항체는 항체가가 안정되기 어렵다. 따라서 항체가가 안정된 모노클로날 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 항체(면역 글로불린(Ig) 분자)의 아이소타입으로서는 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD를 들 수 있지만, 본 발명의 항체는 IgG형 항체, IgA형 항체 또는 IgM형 항체인 것이 바람직하며, IgA형 항체 또는 IgM형 항체인 것이 더 바람직하며, IgM형 항체가 더욱 더 바람직하다. 이와 같은 항체는 후술하는 방법으로 제조할 수 있지만, 후술하는 제조 방법에 한정되는 것은 아니며, 공지의 제조 방법으로 제조할 수 있다.

항체(면역 글로불린(Ig) 분자)는 각 아이소타입(IgG, IgM, IgA, IgE, IgD)에 공통된 기본 구조를 가지고, 분자량 5~7만의 H쇄(Heavy chain)와 분자량2~2.5만의 L쇄(Light chain)으로 구성되어 있다. 그리고 H쇄는 아이소타입마다 특징적인 구조를 가지고 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE에 대응해서, 각각 γ, μ, α, δ 및 ε쇄라 불린다. L쇄도 L형과 K형 2종이 알려져 있고, 각각 λ, κ쇄라 불린다. 기본 구조의 펩티드쇄 구조는 각각 상동인 2개의 H쇄 및 L쇄가 디술피드 결합(S-S결합) 및 비공유 결합에 의해 결합하고 있다. 2종의 L쇄는 어느 H쇄와도 쌍을 이룰 수 있다. 예들 들면 IgM형의 경우, μ, λ, κ쇄의 조합은 μ2λ2 및 μ2κ2가 된다. 쇄내의 디술피드 결합은, H쇄에 4개(μ, ε쇄는 5개), L쇄에는 2개 있으며, 아미노산 100~110 잔기마다 1개의 루프를 형성하고, 이 단위를 도메인이라 부른다.

H쇄 및 L쇄에는, N말단측에 위치하는 도메인에, 가변 영역(V)라 불리는 도메인(VH 및 VL로 표시된다)이 존재한다. 그리고 이에 의해 C말단측의 아미노산 배열은 각 아이소타입으로 거의 일정한 아미노산 배열을 갖는 정상 영역(C)이라 불리는 도메인(CH1, CH2, CH3, CL 이라 표시된다)을 갖는다. 항체의 항원 결합부위(에피톱)은 VH 및 VL에 의해 구성되고, 이 부위의 배열에 의해 항원의 특이성이 바뀌게 된다. 그리고, 이와 같은 항체는 아이소타입에 의해 다른 중합 구조를 취한다. 예를 들면 IgM형 항체는 Hα 2개와 L쇄 2개로 이루어지는 항체이지만, 추가로 J쇄라 불리는 폴리펩티드가 결합하고, 5량체 또는 6량체의 형태로 존재하고 있다. IgA형 항체는 Hα 2개와 L쇄 2개로 이루어지는 항체이지만, 단량체, 2량체, 또는 3량체로 존재한다. 그리고 IgA형 항체의 2량체 또는 3량체는, J쇄나 분비편((secretory piece)에 의해 결합하고 있다. IgG형 항체는 단량체로 존재하고 있다. 또한 상기한 바와 같이, Fas개재성 아포토시스에서는, 3량체의 Fas리간드가 Fas항원에 결합함으로써, Fas항원의 세포내 도메인의 3량체화가 촉진되고, 아포토시스 시그날이 전달한다. 상기와 같이 IgM형 항체는 중합 구조(5량체 또는 6량체)를 취하기 때문에, IgM형 항체는 3개 이상의 Fas항원을 움켜쥐듯이 결합한다. 이에 의해 Fas항원의 3량체화가 효율적으로 일어나고, 아포토시스 시그널이 전달된다. 따라서 이와 같은 관점에서 본 발명에서의 항Fas항체로서 IgM형 항체를 이용하는 것이 바람직하다.

[폴리클로날 항체]

폴리클로날의 제조 방법의 예를 이하에 들지만, 당업자에게 있어 공지의 방법을 이용해서 적절히 변경할 수 있다. 폴리클로날 항체는, 상기한 면역 동물에 항원(면역원)을 주입함으로써 작제(作製)할 수 있다.

이와 같은 항원으로서 상기한 배열 번호1에 기재된 아미노산 배열과 동일 또는 1~10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드를 들 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 항Fas항체는 Fas개재 아포토시스를 유도하는 항체이기 때문에, 항원은 배열 번호1의 26~173번째에 기재된 아미노산 배열과 동일 또는 1~5개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드인 것이 바람직하며, 상기 아미노산 배열에 치환, 결실, 부가 또는 삽입되는 아미노산 잔기의 수는 1~2개가 더 바람직하며, 더 바람직하게는 1개이다. 또한 본 발명의 항Fas항체는, Fas항원과 결합하고, Fas개재성 아포토시스를 유도하는 항체이기 때문에, 항체를 제조할 때에 이용하는 펩티드(항원)는, 배열 번호1의 26~173번째에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드보다도 짧은 펩티드를 이용해도 된다. 펩티드의 길이는 당업자라면 적절히 조정하는 것이 가능하다.

폴리클로날 항체를 제조할 때에, 항원은 아듀번트(adjuvant)와 혼합해서 면역 동물에 주입한다. 여기에서 아듀번트란, 항원에 대한 면역 응답을 강화할 목적으로 이용되는 물질을 가르키고, 예를 들면 알루미늄 아듀번트, 완전(불완전) 프로인트(Freund's) 아듀번트, 백일해균 아듀번트 등이다. 면역 동물에 대한 항원의 주입은, 2~4주간마다 수행한다. 2회 이상 주입을 한 후, 주입일 후 1~2주간 후에 채혈을 행하고, 항체가 검정(檢定)(antibody　titer　check)을 행한다. 면역 동물에 대한 주입량, 주입 회수(면역 회수)는 면역 돌물의 종류나 그 개체마다 다르다. 당업자라면, 항체가 검정의 결과에 따라서 적절히 조정할 수 있다. 면역 종료 후, 전혈을 착취하고, 원심 분리 등 공지의 방법을 이용해서 혈정을 분리한다. 혈청은 혈청 중에 포함되는 내재성 항체 등을 제거하기 위해 정제를 행한다. 정제 방법은 예르 들면 친화성 크로마토그래피 등 공지의 방법을 이용할 수 있다. 이와 같이 해서 폴리클로날 항체를 작제할 수 있다.

[항원 발현 세포]

항원으로서 이용하는 항원 발현 세포는, 배양 세포 등의 세포막상에 항원이 되는 단백질이 발현한 세포가 바람직하다. 이와 같은 항원 발현 세포는, 공지의 방법으로 작제할 수 있다. 구체적으로는 항원이 되는 단백질을 코딩하는 DNA를 배양 세포에 도입하고 발현시키면 된다. 항원을 발현시키는 배양 세포(이하 "숙주"라고도 부른다)는, 특별히 한정되지 않고 공지의 세포를 이용하면 된다. 예를 들면 항원 제공 세포로서 알려진 B세포나 수상 세포 등을 들 수 있다. 이와 같은 세포에 항원이 되는 단백질을 발현시키는 방법으로서는, 항원이 되는 단백질을 코딩하는 DNA를 넣는 항원 발현 벡터를 작제하고, 항원을 발현시키는 세포에 도입한다. 발현 벡터에 넣은 DNA가 세포막 도메인 배열을 포함하지 않는 경우에는, 발현 벡터를 도입하는 숙주가 갖는 세포막 도메인의 배열을 포함시켜 놓는 것이 바람직하다. 이와 같은 배열을 포함함으로써, 효율적으로 세포막상에 단백질(항원)을 발현시킬 수 있다.

이와 같은 세포막 도메인 배열은, 당업자라면 적절히 취득하고, 발현 벡터에 넣는 DNA배열에 포함시킬 수 있다. 이와 같은 발현 백터로서는, 프로모터, 인헨서, 스플리싱 시그널, 폴리 A부가 시그널, 선택 마커, SV40복제 오리진 등을 함유하고 있는 것을 이용할 수 있다. 숙주가 동물 세포인 경우, 프로모터로서는 예를 들면 SRα프로모터, SV40프로모터, HIV·LTR프로모터, CMV프로모터, HSV-TK프로머터 등을 들 수 있다. 선택 마커로서는, 예를 들면 디히드로 엽산 환원 효소 유전자(메토트렉세이트(MTX)내성), 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자(G418 내성), 히드로마이신 내성 유전자, 블라스티사이딘내성 쥬전자 등을 들 수 있다. 이와 같은 발현 벡터는, 공지의 것을 사용하면 되고, 당업자라면, 숙주에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 항원 발현 벡터를 도입하는 방법으로서는, 인산 칼숨법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법 등 공지의 방법의 방법을 이용할 수 있다. 세포에 항원을 발현하고 있는 것을 확인하는 방법은, 면역 염색법 등 공지의 방법을 적절히 이용하면 된다. 이와 같이 항원을 발현시킨 세포는, 공지의 방법으로 회수하고, 면역 동물에 주입하는 항원으로서 이용할 수 있다.

"조(粗) 정제 단백질"

항원으로서 이용하는 (조)정제 단백질은, 배양 세포 등이 발현하는 단백질을 정제한 것이다. 이와 같은 단백질은, 세포의 시그널 전달 경로에 작용하거나, 전사 인자에 작용하는 약제나 인자로 배양 세포 등을 자극함으로써 발현시키면 된다. 발현한 단백질은 공지의 방법으로 정제하고, 정제 단백질로서 이용할 수 있다. 예를 들면, 분비 단백질이라면, 배양 상청을 회수하고, 예를 들면 염석이나 칼럼크로마토그래피, 막처리 등으로 정제할 수 있다. 칼럼크로마토그래피로서는, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 아피니티크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 등을 들 수 있고, 당업자라면, 단백질의 성질에 따라서 적절히 사용할 수 있다. 세포외에 분비되지 않는 단백질이라면, 배양 세포를 회수하고, 초음파 처리 등으로 세포를 파쇄하고, 단백질을 회수할 수 있다. 그리고 상기한 방법으로 단백질을 정제하면 된다. 이와 같은 정제 단백질을 취득하는 방법은 공지이며, 당업자라면 단백질의 특성에 맞춰서 적절히 이용할 수 있다.

"재조합 단백질"

항원으로서 이용하는 재조합 단백질은, 공지의 방법으로 작제할 수 있다. 구체적으로는 항원으로서 이용하는 재조합 단백질을 코딩하는 DNA를 공지의 방법으로 벡터에 삽입하고, 재조합 단백질을 발현시키는 숙주에 도입한다. 벡터는 공지의 것을 이용하면 되고, 당업자라면 도입하는 숙주에 따라서 선택할 수 있다. 이와 같은 숙주로서는, 세균, 곤충 세포, 식물세포, 동물 세포 등 공지의 숙주를 이용할 수 있다. 그리고 숙주에 벡터에 도입하는 방법은 일렉트로포레이션법, 인산 칼슘법, 리포펙션법 등, 숙주에 따라서 적절히 공지의 방법을 이용할 수 있다.

재조합 단백질은, GST(glutathione S transferase), HA(hemagglutinin), 또는(올리고)히스티딘 등의 태그와의 융합 단백질로서 해도 된다. 이와 같은 태그는 목적으로 하는 항원을 코딩하는 DNA의 N말단측 또는 C말단측에 결합시키면 된다. 이와 같은 태그를 결합시킨 융합 단백질로 함으로써, 발현한 단백질을 간단하게 정제하는 것이 가능해진다. 숙주로 발현시킨 단백질은, 예를 들면 분비 단백질이라면 배양상청을 회수함으로써, 분비 단백질이 아니면, 초음파 처리 등으로 숙주 세포를 파쇄하거나 해서 회수할 수 있다. 단백질의 정제 방법은 상기한 바와 같이, 예를 들면 HPLC나 어피니티 칼럼 등을 이용할 수 있다. 또한 인히드로에서의 단백 발현계나 곤충, 동물, 식물 등의 생체를 이용해서 재조합 단백질을 수득할 수도 있다. 이와 같은 방법은, 공지이며, 당업자라면 적절히 변경을 가할 수 있다.

"합성 펩티드"

펩티드를 합성하는 방법으로서, 고상법이나 액상법 등을 들 수 있다. 펩티드 합성에서는 목적으로 하는 아미노산 배열을 N말단 또는 C말단에서 축차 결합시켜 가는 스텝와이즈 연장법, 또는 아미노산 배열을 적당한 프래그먼트로 나누고, 그들 프래그먼트를 축합시켜서 목적하는 펩티드를 합성하는 프래그먼트 축합법을 들 수 있다.

또한 펩티드 합성법으로서 불용성 수지에 아미노산을 결합하고, 아미노산 배열 정보에 기반해서, 그 수지상에서 아미노산을 1개씩 결합시켜가고 쇄(鎖)를 신장시켜 가는 고상법이나, 수지 등의 담체를 이용하지 않는 액상법을 들 수 있다. 게다가 그러한 방법을 조합해서 효율적으로 합성하는 것도 가능하다. 이와 같은 방법은 공지이며, 당업자라면 목적의 아미노산 배열흘 합성하기 때문에, 적절히 이용할 수 있다. 또한 합성한 펩티드는 정제를 수행해도 된다. 합성 펩티드의 정제는, 침전법, HPLC, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등 공지의 방법을 이용할 수 있다. 항원으로서 합성 펩티드를 이용하는 경우는, 그 상태로는 항원성이 부족하므로, BSA(Bovine Serum Albumin)이나 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin) 등의 캐리어에 가교제(예를 들면, MBS(m-maleimidobenxoic acid)에스테르, DMS(dimethyl suberimidate)등)을 이용해서 공유 결합시켜서 이용하는 편이 좋다.

"모노클로날 항체"

모노클로날 항체는, 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 구체적으로는 면역 동물(예를 들면 마우스 등)에 상기한 항원을 2~4주간 간격으로 1~6개월간 주입(면역)하고, 폴리클로날 항체의 제조 방법과 마찬가지로, 항체가 검정을 수행한다.

검정에 의해 원하는 항체가가 수득되면, 면역 동물로부터 비장을 단리한다. 단리한 비장은 무혈청 배지(예를 들면 이스코브 배양(GIBCO사제)로 현탁하고, 비장 세포 현탁액으로 한다. 현탁 세포와 미에로마 세포(골수종 세포)를 혼합하고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 가하여, 세포를 융합시킨다. 그 후, 하이포크산틴(hypoxanthine)-아미노프텔린(aminopterine)-티미딘(thymidine)(HAT) 선택 배지로 배양함으로써, 하이브리도마(비장 세포와 미에로마 세포가 융합한 세포)만을 증식시킨다. 게다가 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브르도마를 선택하기 위해서, 목적으로 하는 항체의 유무의 검정과 동시에, 검정 양성 하이브리도마의 클로닝을 수행한다. 이 조작을 수회 반복함으로써, 목적으로 하는 항체를 산생하는 클론화 하이브리도마를 수득할 수 있다. 그 후 클론화 하이브리도마를 면역 동물의 복강 내에 주사하고, 2~4주간 후에 복수를 회수하고, 정제함으로써 모노클로날 항체를 수득할 수 있다. 복수를 정제하는 방법은 공지의 방법을 이용하면 되고, 예를 들면 어피니티 크로마토그래피나 겔 여과 크로마토 그래피 등을 들 수 있다.

"리컴비넌트 항체의 제조 방법"

또한 본 발명의 항체는, 리컴비넌트 항체로 해도 된다. 리컴비넌트 항체란, 항체 산생 공정에서 하이브리도마를 이용하지 않는 재조합형 모노클로날 항체이다. 예로서 최소의 항원 결합 부위 만을 가진 것, 다가형 항원 결합 부위를 구비한 것, IgG와 IgA를 조합시켜서 분비형으로 한 것, 이종 동물간에서의 키메라나 휴머니제이션(humanization)를 실시한 것 등을 들 수 있다. 이와 같은 리컴비넌트 항체는, 각 아이소타입의 면역 글로불린 유전자를 숙주로 발현시킴으로써 수득할 수 있다. 이와 같은 숙주를 이용하는 산생계로서는, 대장균을 이용하는 방법, 배양 세포를 이용하는 방법, 식물에 산생시키는 방법, 트랜스제닉 마우스로 산생시키는 방법 등을 들 수 있다.

이와 같은 리컴비넌트 항체의 제조는 공지의 방법을 이용하면 된다. 구체적인 예로서는 파지 디스플레이법(예를 들면, Ricombinant antibody expression system(Amersham Biosciences) 등)을 들 수 있다. 파지 디스플레이법은, 대장균 바이러스의 일종인 M13 등의 섬유 형상 퍼지의 코트 단백질에 퍼지의 감염능을 잃지 않도록 외래 유전자를 융합 단백질로서 발현시키는 시스템이다. 퍼지란, 세균에 감염되는 바이러스이며, 그 DNA에 외래성 유전자를 넣으면, 감염시에 숙주 내에 칩입하고, 증식하는 능력을 갖는다.

"파지 디스플레이법"

파지 디스플레이법에 의한 모노클로날 항체의 작제 방법의 1예를 이하에 들지만, 본 발명은 이하의 작제 방법에 한정되는 것은 아니며, 당업자가 각 공정을 다른 공지의 방법을 이용해서 적절히 변경할 수 있다. 또한 당업자라면, 각각의 공정에 있어서 온도, 반응 시간, 사용 용액 농도, 사용 용액량 등의 파라미터를 적절히 설정해서, 또 변경을 가해서 실시할 수 있다. 파지 디스플레이법에서는 우선 파지 항체 라이브러리의 작제를 수행하고, 그 후 항체 산행 파지의 스크리닝을 수행함으로써 모노클로날 항체를 작제한다.

파지 항체 라이브러리의 작제

(1) B세포로부터 mRNA를 추출하고, RT-PCR을 수행해서 cDNA라이브러리를 작제한다.

B세포는, 마우스나 인간 등으로부터 채취한 세포를 이용하면 된다. B세포의 RNA의 추출은, 예를 들면 AGPC법(Acid-Guanidinium-Phenol-Chloroform법) 등을 이용할 수 있다. AGPC법에서는 우선 B세포에 구아닌티오시아네이트 용액을 가하여, 호모지나이즈한다. 그 후 세포의 호모지네이트 용액에 초산 나트륨, 페놀, 클로로포름을 가하여 혼화하고, 원심한다. 원심 후 용액의 수층(水層)을 회수한다.

회수한 수층에 이소프로판올을 가하고, 혼화 후 원심하고, RNA를 침전시킨다. 침전물(RNA)은 재차 구아니딘티오시아네이트 용액에 용해 후, 초산 나트륨, 페놀, 클로로포름을 가하여 진탕한다. 진탕 후 원심해서 재차 수층을 회수한다. 회수한 수층에 재차 이소프로판올을 가하여 원심하고, RNA를 침전시킨다. 침전시킨 RNA에 70% 에탄올을 가하고, 현탁하고 재차 원심해서 RNA를 침전시킴으로서, 토탈 RNA(total RNA)를 수득할 수 있다. 이어서 토탈 RNA로부터 mRNA의 추출은, mRNA의 C말단측에 존재하는 폴리A배열에 결한하는 프라이머(올리고dT 프라이머)를 이용해서 PCR로 mRNA를 증폭시키고, 올리고dT컬럼(예를 들면 QIAGEN사제) 등으로 추출·정제할 수 있다. 또한 올리고dT가 코팅된 자성 비드(예를 들면, 나카라이 테스크사제)를 이용한 어피니티 크로마토그래피 등으로 추출·정제해도 된다. 정제한 mRNA는 역전사 효소를 포함하는 반응 용액 중에서 PCR에 의해 cDNA 라이브러리를 작제할 수 있다.

(2) L쇄(Light chain)와 H쇄(Heavy chain)의 가변 영역에 특이적인 프라이머를 이용해서 각각 PCR로 증폭한다.

항체(면역 글로불린(Ig)분자)의 H쇄 및 L쇄의 가변 영역인 VH 및 VL의 배열은, 예를 들면 GenBank 등에서 입수할 수 있다. 예를 들면 IgA형 인간 항체를 얻기 위해서는 인간의 IgA의 VL및 VH 배열을 입수하고, 그들 배열을 늘리기 위한 프라이머 설계를 행하고, 템플레이트로서 상기 cDNA를 이용해서 PCR로 양 배열을 증폭시키면 된다. 당업자라면, 어떠한 항체를 수득할지에 따라서, 프라이머 설계는 적절히 수행할 수 있고, 또한 PCR 등의 조건도 적절히 결정할 수 있다. 증폭시킨 VL과 VH는 공지의 방법으로 정제하면 된다.

(3) 라이브러리의 구축

정제한 VL과 VH는 각각을 링커로 연결하고, 1개쇄로 하고, 파지 미드벡터에 삽입해서, 1개쇄 Fv(가변 영역 단편) 유전자 라이브러리를 구축한다. 링커란 각 단편을 접속하는 배열이다. 이와 같은 링커로서는, 링커로서 공지의 배열을 이용하면 된다. 파지 미드 벡터란, M13파지 혹은 f1파지의 1개쇄 DNA의 생성에 필요한 복제 기점(IG 영역)을 넣은 플라스미드 벡터이다. 파지 미드벡터는 플라스미드로서의 특성과 1개쇄 DNA파지로서의 특성을 구비하고 있으며, 통상의 2개쇄 DNA 플라스미드로서 조작하는 것이 가능할 뿐만 아니라, 플라스미드의 한쪽의 DNA쇄를 포함하는 선 형상 파지 입자를 산생시킬 수 있다. 파지 미드벡터로서는 공지의 것을 이용하면 된다(예를 들면 pCANTAB5E(Amersham Biosciences사제). 또한 다른 방법으로서, 항체 H쇄 Fd부분(VH 및 CH1영역) 및 L쇄 부분에 특이적인 프라이머를 이용해서 PCR에 의해 항체 유전자 단편을 증폭하고, 이들 유전자 단편을 파지 미드벡터에 삽입함으로써 항체Fab에 대응하는 유전자 라이브러리를 구축해도 된다.

항체 산생 파지의 스크리닝

(4) 항체 제시 파지 라이브러리의 농축

파지 미드벡터를 이용해서 구축한 항체 유전자 라이브러리를 대장균에 도입하고, 헬퍼 파지(M14K07, VCSM13 등)를 감염시킴으로써, 항체 제시 파지 라이브러리를 작제한다. 이 항체 제시 파지 라이브러리의 농축 방법으로서는 패닝법을 들 수 있다. 이 방법에 의해 정제한 항원(상기 방법 등에 의해 정제한 항원)을 이용해서 고상법에 의해 파지 라이브러리로부터 목적하는 항체를 제시하는 파지 집단을 농축할 수 있다. 패닝법에서는 고상화 항원과 파지 라이브러리의 반응, 세정(고상화 항원과 결합하지 않은 파지 라이브러리의 제거), 항원 결합 파지의 용출, 대장균으로의 감염에 의한 증폭이라는 스텝을 수회(예를 들면 4~5회) 반복한다. 이에 의해 항원 특이적 파지(항체 산생 파지)를 농축할 수 있다.

(5) 항원 특이적 파지 클론의 선택 및 모노클로날 항체의 취득

항원 특이적 파지 클론의 선택법으로서는, 예를 들면 ELISA법 등을 이용할 수 있다. 정제 항원을 코팅한 ELISA 플레이트에, 항체 산생 파지를 반응시키고, 정제 항원과의 반응성(결합성)을 조사한다. 이 공정을 반복하고, 클론을 선별해 감으로써, 모노클로날 항체를 산생하는 파지를 수득할 수 있다. 그리고 이와 같은 파지를 대장군으로 증식시키고, 항체를 회수함으로써 모노클로날 항체를 취득할 수 있다. 이와 같은 항체는, 예를 들면 어피니티 클로마토그래피 등의 공지의 정제 방법을 이용해서 정제하는 것이 가능하다.

본 발명의 바람직한 태양으로서, 변형성 관절증 또는 변형성 관절증선 관절염의 치료제 또는 예방제, 연골 기질 분해 효소 산생 억제제, 연골 기질 산생제, 및 변형성 관절증으로 유도되는 마크로퍼지에 대한 아포토시스 유도제를 제조하기 위해서 본 발명의 항체를 사용하는 것을 들 수 있다. 즉 본 발명은 변형성 관절증 치료 방법; 변형성 관절증성 관절염 치료방법; 연골 기질 분해 효소 산생 억제제를 제조하기 위한 IgM형 항Fas항체의 사용; 연골 기질 산생제를 제조하기 위한 IgM형 항Fas항체의 사용; 변형성 관절증에 의해 유도되는 마크로퍼지에 대한 아포토시스 유도제를 제조하기 위한 IgM형 항Fas항체의 사용도 제공한다. 그리고, 이 IgM형 항Fas항체의 사용에 있어서 먼저 설명한 각각의 패턴을 조합해서 이용할 수 있다.

본 발명의 제(劑)는 당업자에게 공지의 방법으로 제조하면 된다. 본 발명의 제(劑)는 경구용 제제 및 비경구용 제제로서 제조할 수 있지만, 바람직하게는 비경구용 제제이다. 이와 같은 비경구용 제제는, 액제(수성 액제, 비부성 액제, 현택성 액제, 유탁성 액제 등)로 해도 되고, 고형제(분말 충전제제, 동결 건조 제제 등)로 해도 된다. 또한 본 발명의 제(劑)는 서방(徐放) 제제로 해도 된다.

액제를 제조하는 방법은, 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면 항체를 약학적으로 허용된 용제에 용해하고, 멸균된 액제용 용기에 충전함으로써 제조할 수 있다. 약학적으로 허용된 용제로서는, 예를 들면 주사용수, 증류수, 생리식염수 전해질 용액제 등을 들 수 있고, 멸균된 용제를 이용하는 것이 바람직하다. 멸균된 액제용 용기로서는, 앰플, 바이알, 백 등을 들 수 있다. 이들 용기는 유리제나 플라스틱제 등 공지의 용기를 이용할 수 있다. 구체적으로는 플라스틱제 용기로서는 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌·초산 비닐·코폴리머 등의 재질을 이용한 것을 들 수 있다. 이들 용기나 용제의 멸균법은, 가열법(화염법, 건조법, 고온 증기법, 유통(流通) 증기법, 자비(煮沸)법 등), 여과법, 조사법(방사선법, 자외선법, 고주파법 등), 가스법, 약액법 등을 들 수 있다. 이와 같은 멸균법은, 용기의 재질, 용제의 성질에 따라서, 당업자라면 적절히 선택해서 이용할 수 있다.

고형제를 제조하는 방법은, 동결 건조법, 스프레이 드라이(분무 건조)법, 무균 재결정법 등, 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 동결 건조제는 이하의 공정을 거침으로써 제조할 수 있다. (1) 결정화시킨 항체를 실온 4℃, 상압하에 2~3시간 놓고, 냉각한다(냉각 공정). (2) 실온 -50℃, 상압하에 12~15시간 놓고, 동결시킨다(동결 공정). (3) 실온 -20℃, 상압하에 4~6시간 놓고 재결정화시킨다. (재결정화 공정). (4) 실온 -50℃, 상압하에 14~16시간 놓고, 재동결시킨다(재동결 공정). (5) 실온 -13℃, 압력 10~20kPa하(고진공하)에 24~26시간 놓는다(제1 건조 공정). (6) 실온 24℃, 상압하에 놓는다. 이와 같이 동결 건조법에서는 저온에서 동결시키고, 고진공하에서 수분(얼음)을 승화시켜서 제거시켜간다. 본 발명의 동결 건조제는, 상기의 방법으로 제조할 수 있지만, 이 제조 방법에 한정되지 않고, 당업자라면 적절히 변경할 수 있다. 또한 적절히 각 공정의 온도, 압력, 시간 등의 파라미터에 변경을 가할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 IgM형 항Fas항체를 포함하는 제(劑)와 의료용구를 조합한 키트 제품으로서 제공하는 것도 가능하다. 예를 들면 본 발명의 IgM형 항Fas항체를 포함하는 제(劑)를 주사통 등의 의료용구에 미리 충전한 것, 1개의 소프트백에 이벽(離壁)을 통해서 한쪽에 고형제를, 다른 쪽에 용제를 충전하고, 사용시에 이벽을 개통해서 혼합할 수 있도록 한 것 등을 들 수 있다. 이와 같이 함으로써, 사용시에 의료 종사자가 조제하는 부담을 경감할 수 있을 뿐 만 아니라, 세포 오염이나 이물 혼입 등을 방지할 수 있으며, 적합하게 사용할 수 있다. 이와 같은 주사통이나 소프트백은 공지이기 때문에, 의료 종사자라면 적절히 사용할 수 있다.

본 발명의 IgM형 항Fas항체를 포함하는 제(劑)는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 비강내 투여 등의 공지의 투여 방법을 이용해서 투여할 수 있다. 바람직하게는 주사에 의한 투여이며, 점적(點滴)에 의해 주입하는 것도 가능하다. 또한 본 발명의 제(劑)는 환부(예를 들면 관절)에 직접 주사해도 되고, 또한 외과 수술에 의해 환부를 개구하고 투여하는 것도 가능하다. 본 발명의 제(劑)는 경구용 제제 및 비경구용 제제로서 조정할 수 있지만, 바람직하게는 비경구용 제제이다. 이와 같은 비경구용 제제는, 액제(수성 액제, 비수성 액제, 현택성 액제, 유탁성 액제 등)로 해도 되고, 고형제(분말 충전제제, 동결 건조제제 등)로 해도 된다. 고형제는 투여할 때에 약학적으로 허용된 용제이며 원하는 농도로 용시 용해 또는 현탁화해서 이용한다. 이와 같은 비경구용 제제는, 주사나 점적 등의 투여 방법으로 이용할 수 있다.

본 발명의 IgM형 항Fas항체를 포함하는 제를 제제화하는 경우, 약학적으로 허용되는 담체 또는 매체 등과 적절히 조합해서 제제화하는 것도 가능하다. 게다가 약제를 포함시켜도 된다. 또한 본 발명의 IgM형 항Fas항체를 포함하는 제는 알부민, 리포단백질, 글로불린 등의 본 발명의 항체의 작용을 저해하지 않는 단백질을 포함시켜도 된다. 이와 같이 단백질을 포함시킴으로써, 액제 중에 포함되는 항체의 안정성을 향상시킬 수 있다. 이와 같은 단백질은 액제로서 본 발명의 제를 제제화하는 경우는, 액제 중에 포함시켜도 된다. 고형제로서, 제제화하는 경우는, 본 발명의 항Fas항체를 고형화하는 경우에 상기 단백질을 포함시켜도 되고, 고형제를 용해하는 용제에 상기 단백질을 포함시켜도 된다. 이와 같은 단백질의 함량은 투여시의 액량을 100중량부로 한 경우에, 0.01 중량부~5중량부를 들 수 있고, 당업자라면 투여하는 항체의 양이나 기타 포함되는 물질에 따라서 적절히 조정할 수 있다.

"약학적으로 허용되는 담체 또는 매체"

약학적으로 허용되는 담체 또는 매체는, 예를 들면 부형(賦形)제, 안정화제, 용해 보조제, 유화제, 현탁화제, 완충제, 등장화제, 항산화제, 또는 보존제 등 약학적으로 허용되는 물질을 들 수 있다. 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 고분자 재료나 사이클로덱스트린 등의 포합(抱合)화 방물을 사용할 수도 있다. 이하 구체예를 들지만, 본 발명은 그것들에 한정되는 것은 아니며, 공지의 것을 사용할 수 있다.

부형제로서는 전분이나 유당 등 각 자체가 약리 작용을 갖지 않는 것이 바람직하다. 안정화제로서는 알부민, 젤라틴, 졸비톨, 만니톨, 유당, 자당, 트레할로오스, 말토스, 글루코스 등을 들 수 있다. 이들 중에서는 자당 또는 트레할로오스가 바람직하다. 용해 보조제로서는 에탄올, 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있다. 유화제로서는, 레시틴, 스테아린상 알루미늄, 또는 세스키오레인산 졸비탄 등을 들 수 있다. 현탁화제로서는, 마크로골, 폴리비닐피로리돈(PVP), 또는 카멜로오스(CMC) 등을 들 수 있다. 등장화제로서는, 염화 나트륨, 글루코스 등을 들 수 있다. 완충제로서는, 구연산염, 초산염, 붕산, 또는 인산염 등을 들 수 있다. 항산화제로서는, 아스코르빈산, 아황산 수소 나트륨, 피로아황산 나트륨 등을 들 수 있다. 보존제로서는, 페놀, 티메로살, 염화 펜잘코늄 등을 들 수 있다.

본 발명의 항체와 조합하는 약제로서, 관절질환 치료제, 항염증제, 진통제, 골재생제, 골흡수 억제제, 항생물질, 또는 성장제 등, 관절질환에 이용되는 공지의 약제를 들 수 있다. 또한 본 발명의 항Fas항체를 포함하는 제를 주사 등에 의해 투여할 때, 주사에 의한 동통이 일어날 수 있으므로, 무통화제를 포함시켜도 된다. 이와 같은 약제는 1종 또는 2종 이상 조합해도 된다.

관절 질환 치료제로서, 예를 들면 관절 연골 세포외 매트릭스 분해 저해제(WO2004/017996호 팜플렛), 부신피질 호르몬제나 콘드로이틴 황산 나트륨, 히알론산(hyaluronic　acid(HA))등의 관절 연골의 보호제, 또는 시그널 전달계 저해제인 p21 활성화 키나아제(PAK) 저해제(일본특허공표2007-537134호 공보) 등을 들 수 있다.

항염증제로서, 스테로이드성 항염증제나 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs) 등을 들 수 있다. 스테로이드성 항염증제는, 예를 들면 텍사메타존, 콜티존, 하이드로콜티존, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 베타메타존, 트리암시놀론, 트리암시놀론아세토니드, 플루오 시놀론아세토니드, 플루오 시노니드, 베크로메타존, 에텐자미드 등을 들 수 있다. 비스테로이드성 항염증제로서, 예를 들면, 아스피린, 이부프로펜, 나프로키센, 디클로페낙, 인도메타신, 나부토멘, 페닐부타존, 로페콕시브, 세레콕시브, 옥시캄, 피라졸론, 아자프로파존 등을 들 수 있다.

진통제로서, 소화 진통약이기도 한 NSAIDs에 덧붙여서, 오피오이드계 진통약 등을 들 수 있다. 오피오이드계 진통제로서는 예를 들면 엔돌핀, 다이놀핀, 엔케파린, 코데인, 디하이드로코데인, 덱스트로프로폭시펜 등을 들 수 있다.

골흡수 억제제로서, 에스트로겐제, 칼시토닌 및 비스포스포네이트 중 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 들 수 있다.

항생물질로서, 페니실린계 항생 물질, 세펨계 항생 물질, 아미노글로코시드계 항생 물질, 마크로라이드계 항생 물질, 테트라사이클린계 항생 물질, 펩티드계 항생 물질 등의 항생 물질을 들 수 있다. 페니실린계 항생 물질로서는, 펜질페닐린, 페녹시메틸페닐린, 메틸실린, 플루클록사실린, 아목시실린, 암피실린, 피페라실린, 아즐로실린, 티카실린 등을 들 수 있다. 세펨계 항생 물질로서는, 세파졸린, 세프록심, 세파크롤, 세픽심, 세프테람 등을 들 수 있다. 아미노글리코시드계 항생 물질로서는, 겐타마이신, 네틸마이신, 록시트로마이신, 록타마이신, 글린다마이신, 아지트로마이신 등을 들 수 있다. 테트라사이클린계 항생 물질로서, 테크라사이클린, 미노사이클린, 도키시(土岐氏) 재(再)클린 등을 들 수 있다. 이 외에 β-락탐계 항생 물질로서, 라타목세프, 프로목세프, 아즈트레오남(Azthreonam), 이미페넴, 파니페넴을 들 수 있다. 또한 이 외에 반코마이신, 리판피신, 클로람페니콜 등을 들 수 있다.

성장제로서, 골형성 인자(BMP), 골증식 인자(BGF), 혈소판 유래 증식 인자(PDGF), 염기성 섬유아 증식 인자(bFGF), 인슐린, 인슐린유사 증식 인자(IGF), 호르몬, 사이토카인, 또는 트랜스포밍 증식 인자(TGF) 등을 들 수 있다. 이들 성장제는 1종 또는 2종 이상 포함시킬 수 있으며, 또한 추가로 다른 약효를 갖는 공지의 약제와 조합해도 된다.

무통화제는, 주사에 의한 동통이, 액제의 pH 및 침투압이 체액과 현저히 다른 경우인지, 약제에 그것의 작용에 의해 일어나는지에 따라서 다른 약제를 사용한다. 동통이 pH, 침투압에 의해 일어날 수 있는 경우는, 완충제나 등장화제 등을 포함하는 액제로 하는 것이 바람직하다. 한편 약제 그것의 작용에 의해 동통이 일어날 수 있는 경우는, 국소 마취제 등을 이용하고 있으면 된다. 국소 마취제로서는, 예를 들면 벤질알콜, 클로로부탄올, 염산 프로카인, 염산 리드카인, 염산 디부카인, 염산 메피바카인 등을 들 수 있으며, 공지의 약제를 이용하면 된다.

상기와 같이 제조된 본 발명의 IgM형 항Fas항체를 유효성분으로서 포함하는 제는, 변형성 관절증 또는 변형성 관절증성 관절염 환자에게 유효량 투여하는 치료 방법 또는 예방 방법으로서 이용할 수 있다. 또한 본 발명의 IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 포함하는 제는, 연골 기질 분해 효소 산생을 억제하기 때문에, 연골 기질의 산생을 촉진 또는 개선시키기 때문에, 및 변형성 관절증에서 유도되는 마크로파지에 아포토시스 유도를 유도시키기 때문에, 환자에게 유효량을 투여하는 치료 방법 또는 예방 방법으로서 이용할 수 있다. 즉 본 발명은 대상에게 유효량의 IgM형 항Fas항체를 투여하는 변형성 관절증을 치료 또는 예방 방법; 대상에게 유효량의 IgM형 항Fas항체를 투여하는 변형성 관절증성 관절염 치료 방법; 대상에게 유효량의 IgM형 항Fas항체를 투여하는 연골 기질 분해 효소 산생 억제 방법; 대상에게 유효량의 IgM형 항Fas항체를 투여하는 연골 기질 산생 방법; 변형성 관절증에 의해 유도되는 마크로파지에 대한 아포토시스 유도 방법도 제공한다. 그리고 이 IgM형 항Fas항체의 사용에 있어서, 먼저 설명한 각각의 패턴을 조합해서 이용할 수 있다.

본 발명의 제는, 경구요, 또는 비경구용 제제로서 이용되지만, 주사제, 점적제 등의 비경구용 제제로서 이용되는 것이 바람직하다. 비경구용 제제의 투여 방법은 공지의 방법을 이용하면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 정맥 주사, 동맥주사, 피하 주사, 근육 주사, 점적 등을 들 수 있다. 또한 본 발명의 제는, 환부(예를 들면 관절)에 직접 주사해도 되고, 또 외과 수술에 의해 환부를 개구해서 투여하는 것도 가능하다.

당업자라면, 적절히 환자에게 실시한 투여 방법을 선택할 수 있다. 본 발명의 제의 주성분인 IgM형 항Fas항체는, 본 발명의 제에 유효량 포함되고 있으면 된다. 본 발명의 제에 포함되는 IgM형 항Fas항체의 비율은, 전중량을 100중량부로 한 경우에, 1×10^-3~1×10 중량부이면 되고, 1×10^-2~1×10^-1 중량부가 바람직하고, 5×10^-2~5×10^-1가 더 바람직하다. 투여량은 투여할 대상, 연령, 증상 등에 따라 변화한다. 일반적으로는, 1일의 투여량은 항체의 유효서분으로 개체 당 1ng~100μg를 들 수 있고, 바람직하게는 10ng~10μg이며, 더 바람직하게는, 100ng~1μg이다. 또는, 체중 1kg 당 10pg~2μg를 들 수 있고, 바람직하게는 100pg~200ng 이며, 더 바람직하게는 1ng~20ng이다. 바람직하게는 1일분의 투여량을 2~5회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 제를 서방 제제로 해서, 1회 당 투여 회수를 줄이는 것도 가능하다. 이와 같은 서방 제제로 하기 위해서는 공지의 방법을 이용하면 된다. 나누어 투여하거나, 서방 제제로 하거나 함으로써, 생체 내의 약제 농도를 일정하게 유지하기 쉬우므로, 지속된 약효를 얻기 쉬워지고, 추가로 부작용이 경감될 수 있으므로, 환자에 대한 부담을 줄일 수 있다.

이하, 본 발명에 대해서 구체적으로 실시예에 기반해서 설명하지만, 본 발명은 실시예에 한정되는 것은 아니다.

배양 세포의 수립

인폼 컨센트를 얻은 후, 변형성 관절증 환자의 수술 조직에서 뼈 연골조직과 말초혈을 채취하고, 하기의 방법에 의해 활막 섬유아 세포, 연골 세포, 마크로파지를 채취했다.

활막 섬유아세포

인폼 컨센트를 얻은 후, 변형성 관절증 환자의 수술 조직에서 활막 조직을 채취하고, 세절(細切)한 후 1.0mg/ml 콜라게나아제(collagenase)를 함유하는 액체 저글루코오스 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibco사 제품) 배지내(37℃)에서 하룻밤 처리하고, 배양 활막 섬유 아세포를 분리했다. 통상, 세포는 배양 플라스코(배양 면적 25cm²)에서 배양하고, 실험에 사용할 때에는 폴리에틸렌제 배양 접시(직경 6cm)에서 배양했다. 세포 배양은 DMEM배지에 비동화(非動化) 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum(FBS), Heat-inactivated, TRACE사 제품)을 배지 용량의 10% 첨가하고, 추가로 2mM L-글루타민, 25mM HEPES, 100units/ml의 페니실린과 스트레프트 마이신을 첨가한 것을 사용하고, 37℃, 포습하(飽濕下), 5% CO₂+95% air로 설정한 CO₂인큐베이터(정상 산소 농도 환경)에서 수행했다. 세포의 계대(繼代)는 인산 완충액(PBS, 닛스이사 제품)으로 세정 후, 0.25% 트립신-PBS액(Gibco사 제품)을 이용해서 세포를 박리시키고, 피펫팅으로 세포를 분산시킨 후 배지에서 적당한 농도로 희석했다.

연골 세포

인폼 컨센트를 얻은 후, 변형성 관절증 환자의 수술 조직에서 연골 조직을 채취하고, 세절한 후 1.5mg/ml 콜라게나아제B(collagenase B)를 함유하는 액체 저글루코오스 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibco사 제품) 배지내(37℃)에서 하룻밤 처리하고, 배양 연골 세포를 분리했다. 통상, 세포는 배양 플라스코(배양 면적 25cm²)에서 배양하고, 실험에 사용할 때에는 폴리에틸렌제 배양 접시(직경 6cm)에서 배양했다. 세포 배양은 DMEM배지에 비동화(非動化) 소 태아 혈청(FBS, TRACE사 제품)을 배지 용량의 10% 첨가하고, 추가로 2mM L-글루타민, 25mM HEPES, 100units/ml의 페니실린과 스트레프트 마이신을 첨가한 것을 사용하고, 37℃, 포습하(飽濕下), 5% CO₂+95% air로 설정한 CO₂ 인큐베이터(정상 산소 농도 환경)에서 수행했다. 세포의 계대(繼代)는 인산 완충액(PBS, 닛스이사 제품)으로 세정 후, 0.25% 트립신-PBS액(Gibco사 제품)을 이용해서 세포를 박리시키고, 피펫팅으로 세포를 분산시킨 후 배지에서 적당한 농도로 희석했다.

마크로파지

인폼 컨센트를 얻은 후, 상기 수술 검체를 채취한 환자로부터 50ml의 채혈을 행하고, 1% 헤파린 가혈(加血)을 수득했다. 이 혈액을 림파구 분리액에 중층한 원심관을 1500회전/분으로 30분 원심해서, 림파구와 마크로파지를 각각 분리했다. 세포 배양은 RPMI 배지에 비동화 소 태아 혈청(FBS, TRACE사 제품)을 배지 용량의 10% 첨가하고, 추가로 2mM L-글루타민, 25mM HEPES, 100units/ml의 페니실린과 스트레프트 마이신을 첨가한 것을 사용하고, 37℃, 포습하(飽濕下), 5% CO₂+95% air로 설정한 CO₂ 인큐베이터(정상 산소 농도 환경)에서 수행했다.

2층식 트랜스웰 챔버를 이용한 세포 배양

3μm 포아 사이즈의 다공 필터로 구획된 2층식 트랜스웰 쳄버(토요보(TOYOBO))의 상층부에 활막 섬유아세포(1×106개/웰) 또는 마크로파지(1×106개/웰)을 하층부에 연골 세포(1×106개/웰)을 파종하고 배양했다. 이 배양계의 상층(염증성 세포 배양층)은 활막염에 상당하고, 하층(연골 배양층)은 연골 조직에 상당한다. 각 종 농도(0.1, 1.0, 10.0ng/ml)의 IgM형 항Fas 항체를 챔버 상층에 첨가 또는 비첨가의 조건하에서, 상층에 염증성 사이토카인(TNF-α 10ng/ml 또는 IL-1β10ng/ml)을 첨가해서, 48시간 배양했다. 경시적으로 배양 상청과 세포를 회수해서, 하기의 실험 방법에 의해 각종 세포 활성을 해석했다.

IgM형 항Fas 항체에 의한 연골 기질 분해 효소(MMP) 산생의 억제 작용의 검토

연골 이화(異化) 유도 인자 TNF-α에 의해 증강하는 연골 기질 분해 효소 산생에 대한, IgM형 항Fas 항체(CH-11(마우스 항체)(MBL사 제품))의 영향을 효소 결합 면역검정법(immunoassay)(ELISA)을 이용해서 해석했다. 검토에 이용한 IgM형 항Fas 항체(CH-11)는 마우스 미에로마 세포 NS-1과 Balb/c 마우스의 비장을 융합해서 수득된 하이브리도마로부터 산생되는 항체이다. 하이브리도마는 인간 2배체 섬유아세포주(株)(Human diploid fibroblast cell line)FS-7유래의 항원에서 작제된 것이다.

상기의 방법으로 분리 배양한 연골 세포를 트랜스웰 챔버의 하층에, 활막 섬유아세포를 상층에 각각 1×106개/웰로 파종했다. 상층에는 TNF-α10ng/ml를 첨가했다. 추가로 각종 농도(0.1, 1.0, 5.0, 10.0ng/ml)의 IgM형 항Fas 항체, 또는 히알론산 제제(HA)를 상층에 하기 표1의 조합이 되도록 첨가하고, 48시간 배양한 후, 배양액을 회수했다. 또한 비교 대조해서 히알론산 제제(HA)(0.1, 1.0mg/ml)를 이용했다. 검토 조건의 조합을 하기의 표5에 나타냈다. 표5 중, TNF-α(+)의 TNF-α농도는 10ng/ml이다. 표1의 No. 1은 네거티브 컨트롤(Negative control)을 No.2는 포지티브 컨트롤(Positive control)이다.

배양 상청 중의 연골 기질 분해 효소 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)-1, MMP-3 농도는, 당 기술 분야에서 현재 기지(旣知)의 표준적인 기술인 ELISA키트(MMP-1, MMP-3: R&D사 제품)를 이용해서 결정했다. 이 ELISA는 이하의 표준적 방법에 의해 수행했다. ELISA는 예수(例收) 6(n=6)에서 수행했다. 희석한 배양 상청 샘플을 감작(感作) 플레이트 1웰당 100μl 첨가하고, 실온에 1시간 정치했다(1차 반응). 1차 반응 후, 세정병을 이용해서 각 웰을 PBS로 4회 이상, 충분히 세정했다. 0.1% Tween20-PBS로 3000배 희석한 호스래디쉬 페록시다아제(Horseradish Peroxidase: HRP) 표지 염소 항 토끼 IgG(H+L)항체를 각 웰에 100μl씩 분주(分注)하고, 실온에 1시간 정치했다(2차 반응). 2차 반응 후, 마찬가지로, PBS로 세정한 후 0.8Mm TMB(테트라메틸벤지딘: Tetramethylbenzidine) 용액을 1웰당 100μl 첨가하고, 30℃에서 5~20분간 발색시켰다(발색 반응). 1.5N H3PO4를 1웰당 100μl씩 가해서 발색 반응을 정지시키고, 마이크로타이터 플레이트 리더(microtiter plate reader)를 이용해서 450nm에서의 흡광도를 측정했다. 제조원에 따라서 제공된 설명서를 따라서, 컨트롤 동결 건조 시약을 이용해서 측정 농도를 교정하고, 유의차 검정을 수행했다. 그 결과를 도2에 나타냈다. 도면 중 *는 유의차 검정의 폐각률(P값)이 0.05미만(P<0.05)을 나타내고, **는 유의차 검정의 폐각률(P값)이 0.01미만(P<0.01)인 것을 나타낸다(이하 동일).

도2의 2A는 IgM형 항Fas항체가 연골 세포의 MMP1 산생능에 가하는 영향을 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다. 2A의 세로축은, 연골 세포로부터 산생된 MMP1을, 배양 배지 1ml당 농도로 나타내고 있다. 결과, TNF-α 자극에 의해 증강되는 연골 기질 분해 효소(MMP1) 산생에 대한 억제능은, HA단독(No. 3 또는 4)에 비해서 IgM형 항Fas 항체(No. 5~8)가 높음을 알 수 있다. 따라서 IgM형 항Fas항체는, MMP1산생을 효과적으로 억제할 수 있음이 나타났다.

도2의 2B는 IgM형 항Fas항체가 연골 세포의 MMP3 산생능에 가하는 영향을 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다. 2B의 세로축은, 연골 세포로부터 산생된 MMP3을, 배양 배지 1ml당 농도로 나타내고 있다. 결과, TNF-α 자극에 의해 증강되는 연골 기질 분해 효소(MMP3) 산생에 대한 억제능은, HA단독(No. 3 또는 4)에 비해서 IgM형 항Fas 항체(No.5~8)가 높음을 알 수 있다. 따라서 IgM형 항Fas항체는, MMP3산생을 효과적으로 억제할 수 있음이 나타났다.

도2에 있어서, IgM형 항Fas항체는, 연골 기질 분해 효소인 MMP의 산생을 효과적으로 억제하는 것이 나타났다. 상기한 바와 같이, MMP는 관절 연골을 분해한다. 그 때문에 MMP는 변형성 관절증을 야기하거나, 변형성 관절증의 증상을 악화하는 원인이 될 수 있다. 본 실시예에서 나타낸 바와 같이, IgM형 항Fas항체는 MMP의 산생을 억제한다. 이에 의해 IgM형 항Fas항체는, 변형성 관절증의 야기를 억제할 수 있고, 또한 변형성 관절증의 증상 악화를 억제할 수 있다. 따라서 IgM형 항Fas항체는, 변형성 관절증의 예방제로서 적합하게 이용할 수 있다. 또한 MMP1 및 MMP3는 면역 응답에도 관여하고 있으므로, IgM형 항Fas항체는 MMP1 및 MMP3의 산생을 억제함으로써, 변형성 관절증의 발증 후에 야기되는 변형성 관절증성 관절염의 예방제 또는 치료제로서도 이용할 수 있다.

IgM형 항Fas항체에 의한 연골 기질 산생능 저하에 대한 개선 작용의 검토

연골 이화 유도인자 TNF-α 또는 IL-1β에 의해 저하되는 연골 기질(프로테오글리칸)산생능에 대한 IgM형 항Fas항체의 억제 효과의 유무를 ELISA를 이용해서 해석했다. 상기 IgM형 항Fas항체에 의한 연골 기질 분해 효소 산성의 억제 작용의 검토에서 이용한 방법과 마찬가지로, 트랜스웰 챔버의 하층에는 연골 세포를, 상층에는 마크로파지를 각각 1×106개/웰로 파종했다. 상층에는 TNF-α: 10ng/ml 또는 IL-1β: 10ng/ml를 첨가했다. 게다가 각종 농도(1.0,10.0ng/ml)의 IgM형 항Fas항체를 상층에 첨가 또는 비첨가 조건하에서 48시간 배양한 후, 배양액을 회수했다. 배양 상청 중의 연골 기질(프로테오글리칸) 산생량(농도)은, 당 기술 분야에서 현재 기지의 표준적인 기술인 ELISA키트(프로테오글리칸: Biosource사 제품)를 이용해서 결정했다. 그 결과를 도3에 나타냈다.

도3은 IgM형 항Fas항체에 의한 연골 기질(프로테오글리칸) 산생능 저하에 대한 효과를 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다. 도3의 세로축은, 프로테오글리칸 산생량을 나타낸다. 세로축의 값이 높을수록 프로테오글리칸이 산생되고 있다. 즉 IgM형 항Fas항체에 따라 TNF-α에 의해 억제되는 프로테오글리칸 합성능이 개선된 것을 나타낸다. 결과, IgM형 항Fas항체는, TNF-α 및 IL-1β의해 억제되는 연골 기질(프로테오글리칸) 합성능을 개선할 수 있음을 알 수 있다.

도3에 있어서, IgM형 항Fas항체는, 연골 기질(프로테오글리칸)의 합성을 개선하는 것이 도시되었다. 변형성 관절증에서는 병능으로서 관절 연골의 파괴가 관찰되었다. 따라서 IgM형 항Fas항체는, 변형성 관절증으로 파괴되고 있는 관절 연골의 재생에 필요한 연골 기질(프로테오글리칸)의 합성을 개선할 수 있으므로, 변형성 관절증의 치료제로서 적합하게 이용할 수 있다.

IgM형 항Fas항체의 아포토시스 억제 효과

연골 이화 유도인자 TNF-α에 의해 유도되는 연골 세포의 아포토시스에 대한 IgM형 항Fas항체의 억제 효과의 유무를 ApoStand ELISA Apotosis Detection Kit(Biomol International사)를 이용해서 검토했다. 이것은 아포토시스를 일으킨 세포의 DNA를 포름아미드로 특이적으로 변성시키고, 변성된 DNA를 항 single-stranded DNA항체로 검출함으로써, 아포토시스를 정량적으로 검출할 수 있는 키트이다.

상기 IgM형 항Fas항체에 의한 연골 기질 분해 효소 산성의 억제 작용의 검토에서 이용한 방법과 마찬가지로, 트랜스웰 챔버의 하층에는 연골 세포를, 상층에는 마크로파지를 각각 1×106개/웰로 파종했다. 상층에는 TNF-α: 10ng/ml을 첨가했다. 추가로 IgM형 항Fas항체(10.0ng/ml)를 상층에 첨가 또는 비첨가하에서 48시간 배양했다. 배지·유도 물질을 제거하고, 키트에 부속된 세포 고정액을 가해서 세포를 고정했다. 그 후 용액을 제거·건조 후, 포름아미드를 가하고, 56℃로 가열하고, 아포토시스를 일으킨 세포의 DNA를 열변성시켰다. 냉각 후, 포름아미드를 제거해서 블록킹 용액(Blocking solution)을 가하고, 블록킹을 수행했다. 블록킹 용액을 제거하고, 항 single-stranded DNA(ssDNA)항체를 가하여, 실온에서 4시간 배양했다. PBS로 3회 세정 후 Peroxidase substrate를 가하여 405nm의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더로 측정했다. 그 결과를 도4에 나타냈다.

도4는 IgM형 항Fas항체의 아포토시스 엑제 효과를 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다. 도4의 세로축은 세포의 핵의 아포토시스 비율(%)을 나타낸다. 즉 값이 낮을수록, 아포토시스가 억제된 것을 나타낸다. 그 결과 IgM형 항Fas항체는 TNF-α에 의해 야기되는 연골 세포의 아포토시스를 억제할 수 있음을 알 수 있었다. 또한 변형성 관절증에서는 TNF-α가 유도된 상태인 것이 알려져 있다. 따라서 본 실시예에 의해 IgM형 항Fas항체는 변형성 관절증으로 야기되는 연골 세포의 아포토시스를 억제할 수 있음이 나타났다.

도4에 있어서 IgM형 항Fas항체가 마크로파지에 의한 연골 세포사를 억제함이 나타났다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 연골 변성을 억제한다고 생각되고, 변형성 관절증의 치료제 또는 예방제로서 적합하게 이용할 수 있다. 또한 이들 작용은 IgM형 항Fas항체가 마크로파지의 아포토시스를 유도했기 때문이라 생각된다. 마크로파지는 염증성 사이토카인을 유도하는 것이 알려져 있다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 마크로파지의 아포토시스를 유도함으로써, 마크로파지로부터의 염증성 사이토카인의 방출을 억제하고, 염증 반응을 억제한다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 변형성 관절증에 의해 야기될 수 있다 2차 염증 반응(변형성 관절증성 관절염)에 대한 예방제 및 치료제로서 이용할 수 있다.

아포토시스 유도능이 있는 아고니스트 항Fas항체의 OA치료약으로서의 포텐셜에 대해서, 항체의 아이소타입(IgG형과 IgM형)의 차이에 의한 해당 포텐셜의 차이를 in vitro실험계에 있어서 평가했다. IgG형 항체는 UB2(MBL사 제품) 및 ZB4(MBL사 제품)를 이용했다. IgM형 항체는 CH-11(MBL사 제춤) 및 7C11((Beckman Coulter사 제품)을 이용했다. 각각의 컨트롤은 IgG isotype control(SouthernBiotech사 제품) 및 IgM isotype control(SouthernBiotech사 제품)을 이용했다.

배양 세포의 수립

인폼 컨센트를 얻은 후, 변형성 관절증 환자 5명(n=5)의 수술조직에서 뼈 연골 조직과 말초혈을 채취하고, 실시예1과 동일한 방법에 의해 활막 섬유아세포, 연골 세포, 및 마크로파지를 채취했다.

2층식 트랜스웰 챔버를 이용한 세포 배양

3mm 포아 사이즈의 다골 필터로 구획된 2층식 트랜스웰 쳄버(토요보(TOYOBO)사 제품)의 상층부에 활막 섬유아세포(1×105개/웰) 또는 마크로파지(1×106개/웰)을 하층부에 연골 세포(1×105개/웰)을 파종하고 배양했다. 이 배양계의 상층(염증성 세포 배양층)은 활막염에 상당하고, 하층(연골 배양층)은 연골 조직에 상당한다.

각 종 상기 Fas항체 또는 isotype control을 챔버 상층에 첨가 또는 비첨가의 조건하에서, 상층에 염증성 사이토카인(TNF-α: 10ng/ml)을 첨가해서, 48시간 배양했다. 경시적으로 배양 상청과 세포를 회수해서, 하기의 실험 방법에 의해 각종 세포 활성을 해석했다.

아이소타입별 항Fas항체에 의한 연골 기질 분해 효소(MMP)산생의 억제 작용

연골 이화 유도인자 TNF-α에 의해 증강하는 연골 기질 분해 효소 산생에 대한, 아이소타입별 항Fas항체의 영향을, 효소 결합 면역검정법(immunoassay)(ELISA)을 이용해서 해석했다. 상기의 방법에서 분리 배양한 연골 세포를 트랜스웰 챔버의 하층에, 연골섬유아세포를 상층에 각각 1×105세포/웰로 파종했다. 상층에는 TNF-α: 10ng/ml를 첨가했다. 추가로 각 종 농도(0.01nM)의 각종 Fas항체를 상체에 첨가하 또는 비첨가하에 48시간 배양한 후 배양액을 회수했다.

배양 상청 중의 연골 기질 분해 효소 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)-1, MMP-3, 농도는, 당해 기술 분야에서 현재 기지의 표준적인 기술인 ELISA키트(MMP-1, MMP-3(R&d사 제품)을 이용해서 결정했다. 또한 ELISA는 상기한 방법과 동일하게 수행했다. 그 결과를 도5에 나타냈다.

도 5의 5A는 IgM형 항Fas항체 또는 IgG형 항Fas항체가 연골 세포의 MMP1산생능에 가하는 영향을 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다. 5A의 세로축은 연골 세포에서 산생된 MMP1을, 배양 배지 1ml당 농도로 나타내고 있다. 5A 중, No. 1은 네거티브 컨트롤(Negative control)을 No.2는 포지티브 컨트롤(Positive control)을 나타낸다. 그 결과, TNF-α 자극에 의해 증강되는 연골 기질 분해 효소(MMP1) 산생에 대한 억제능은, IgG형 항Fas항체(No. 5~6)에 비해서 IgM형 항Fas항체(No. 7~8)이 높음을 알 수 있었다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 MMP1산생을 효과적으로 억제할 수 있다고 말할 수 있다.

도5의 5B는 IgM형 항Fas항체 또는 IgG형 항Fas항체가 연골 세포의 MMP3산생능에 가하는 영향을 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다. 5B의 세로축은 연골 세포에서 산생된 MMP3을, 배양 배지 1ml당 농도로 나타내고 있다. 5B 중, No. 1은 네거티브 컨트롤(Negative control)을 No.2는 포지티브 컨트롤(Positive control)을 나타낸다. 그 결과, TNF-α자극에 의해 증강되는 연골 기질 분해 효소(MMP3) 산생에 대한 억제능은, IgG형 항Fas항체(No. 5~6)에 비해서 IgM형 항Fas항체(No.7~8)이 높음을 알 수 있었다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 MMP3산생을 효과적으로 억제할 수 있다고 말할 수 있다.

도5에 있어서 IgM형 항Fas항체는 연골 기질 분해 효소인 MMP의 산생을 효과적으로 억제할 수 있음이 나타났다. 상기한 바와 같이, MMP는 관절 연골을 분해한다. 그 때문에 MMP는 변형성 관절증을 야기하거나, 변형성 관절증의 증상을 악화시키는 원인이 될 수 있다. 본 실시예에서 나타낸 바와 같이, IgM형 항Fas항체는 MMP의 산생을 억제한다. 이에 의해 IgM형 항Fas항체는 변형성 관절증의 야기를 억제할 수 있고, 또한 변형성 관절증의 증상의 악화를 억제할 수 있다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 변형성 관절증의 예방제로서 적합하게 이용할 수 있다. 또한 MMP1 및 MMP3는 면역 응답에 관여하고 있으므로, IgM형 항Fas항체는 MMP1 및 MMP3의 산생을 억제함으로써, 변형성ㄹ 관절증의 발증 후에 야기되는 변형성 관절증성 관절염의 예방제 또는 치료제로서도 이용할 수 있다.

아이소타입별 항Fas항체의 대(對) 아포토시스 엑제 효과

연골 이화 유도인자 TNF-α에 의해 유도되는 연골 세포의 아포토시스에 대한 아이소타입별 항Fas항체의 억제 효과의 유무를, ApoStand ELISA Apoptosis Detection Kit(Biomol International사)를 이용해서 검토했다.

상기의 방법과 동일하게, 2층식 트랜스웰 챔버를 이용해서 세포 배양을 수행했다. 트랜스웰 챔버의 하층에는 연골 세포를, 상층에는 마크로파지를 각각 1×105세포/웰로 파종했다. 상층에는 TNF-α: 10ng/ml을 첨가했다. 추가로 각 종 항Fas항체(0.01nM)를 상층에 첨가 또는 비첨가하에서 48시간 배양했다. 배지·유도 물질을 제거하고, 키트내의 세포 고정액을 가해서 세포를 고정했다. 그 후 용액을 제거·건조 후, 포름아미드를 가하고, 56℃로 가열하고, 아포토시스를 일으킨 세포의 DNA를 열변성시켰다. 냉각 후, 포름아미드를 제거해서 블록킹 용액(Blocking solution)을 가하고, 블록킹을 수행했다. 블록킹 용액을 제거하고, 항 single-stranded DNA(ssDNA)항체를 가하여, 실온에서 4시간 배양했다. PBS로 3회 세정 후 Peroxidase substrate를 가하여 405nm의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더로 측정했다. 그 결과를 도6에 나타냈다.

도6은 IgM형 항Fas항체 또는 IgG형 항Fas항체의 아포토시스 엑제 효과를 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다. 도6의 세로축은 세포의 핵의 아포토시스 비율(%)을 나타낸다. 즉 값이 낮을수록, 아포토시스가 억제된 것을 나타낸다. 도6 중 No. 1은 네거티브 컨트롤(Negative control),No.2는 포지티브 컨트롤(Positive control)을 나타낸다. 그 결과 IgM형 항Fas항체는 IgG형 항Fas항체와 비교해서 TNF-α에 의해 야기되는 연골 세포의 아포토시스를 억제할 수 있음을 알 수 있었다. 또한 변형성 관절증에서는 TNF-α가 유도된 상태인 것이 알려져 있다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 변형성 관절증으로 야기되는 연골 세포의 아포토시스를 억제할 수 있음이 나타났다.

도6에 있어서, IgM형 항Fas항체가, 마크로파지에 의한 연골세포사를 효과적으로 억제함이 나타났다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 연골 변성을 효과적으로 억제한다고 생각되고, 변형성 관절증의 치료제 또는 예방제로서 적합하게 이용할 수 있다. 또한 이들 작용은 IgM형 항Fas항체가 마크로파지의 아포토시스를 유도했기 때문이라 생각된다. 마크로파지는 염증성 사이토카인을 유도하는 것이 알려져 있다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 마크로파지의 아포토시스를 유도함으로써, 마크로파지로부터의 염증성 사이토카인의 방출을 억제하고, 염증 반응을 억제한다. 따라서 IgM형 항Fas항체는 변형성 관절증에 의해 야기될 수 있다 2차 염증 반응(변형성 관절증성 관절염)에 대한 예방제 및 치료제로서 이용할 수 있다.

변형성 관절증 모델 랫(RAT)에 대한 IgM형 항Fas항체의 효과

변형성 관절증을 유도한 랫를 이용해서, IgM형 항Fas항체CH-11의 약효 평가 시험을 수행했다.

변형성 관절증 모델 랫의 작제

랫((Wister　rat, 체중 200g~250g)을 약 1주간 검역·순화사육(馴化飼育)한 후, 염산 케타민(화이자㈜사 제품, Ketalar 100) 및 자일라진염산염 병용 마취(근육내 투여), 마취효과가 약한 경우는 상기 혼합 마취 용액 또는 펜토바르비탈·Na를 정맥내 투여하에서 좌우의 슬관절 부위를 제모하고, 요오드계 소독액인 이소딘으로 소독했다. 소독 후, 슬관절 내측의 표피를 절개, 내측 부인대를 절단한 후, 관절포(關節包)를 확인·절개하고, 내측 반월판을 노출·전체 적출한다. 관절포의 주위 조직 및 표피를 봉합했다. 봉합시에는 항생 물질(주사용 암피실린나트륨)을 포함하는 생리 식염수(500mg(역가)/20ml)로 술부(術部)를 세정했다.

작제한 변형성 관절증 모델 랫은 하기 표6에 나타낸 바와 같이 서브 그룹으로 나누어서, 피험 물질 또는 대상액을 27 게이지의 주사 바늘을 이용해서, 주 1회 24주에 걸쳐 관절내에 주사했다.

병리학적 검사

4주마다 5마리씩, 펜토바르비탈·Na를(정맥내 투여)의 심(深) 마취하에서 방혈에 의해 안락사시키 후에 부검했다. 8, 12 및 24주째 계획 부검예에 대해서는, 좌우 슬관절 조직, 심장, 폐, 간장, 비장, 신장, 뇌, 정소 및 정낭을 채취하고, 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정했다. 관절 조직에 대해서는 Plank·Rychlo 탈회액(脫灰液)으로 탈회, 중화 후, 파라핀 포매(包埋), 얇게 썬 표본에 대해서, 헤마톡실린-에오딘 염색 및 사프라닌O염색을 수행했다. 기타 기관에 대해서는 파라핀 포매, 얇게 썬 표본에 대해서 헤마톡실린-에오신 염색을 수행하고, 광학 현미경에 의한 병리 조직학적 검사를 실시했다.

IgM형 항Fas항체 투여에 의한 관절증 병리 조직 스코어에 대한 영향

작제한 변형성 관절증 모델 랫을 3군으로 나누고, 컨트롤군(표3 중 A 및 B)의 왼쪽 슬관절에는 생식 또는 컨트롤 항체 용액(10.0ng/ml) 50.0μl을 CH-11 투여군(표3 중 C 및 D)의 오른쪽 슬관절에는 CH-11(저용량 투여군: 1.0ng/ml, 고용량 투여군: 10.0ng/ml) 50.0μl를 micro-needle 주사 실린지를 이용해서 주 1회 주입했다. 각 군은 예수 4(n=4)로 수행했다. 관절염 및 관절증의 병세(관절증 병리 조직 스코어)는 처치 후 4주째, 8주째, 12주째, 16주째 및 24주째에 관찰하고, 2군간의 차이를 Student's T법으로 통계학적으로 비교했다. 양군모두 오른쪽 슬관절은 무처치로 해서, 관절염의 발증과 진행의 정도를 비교 관찰했다. 그 결과를 도7에 나타냈다. 또한 관절증 병리조직 스코어는, 상기 표4에 나타낸 수정 Mankin스코어를 이용했다.

도7의 7A는 사프라닌0염색의 결과를 나타내고, 7B는 연골 세포 결손의 결과를 나타내고, 7C는 연골 구조의 결과를 나타내고, 7A~도7C의 세로축은 각 스코어를 나타내고, 가로축은 경시 변화를 나타내고, 7A~도7C의 결과, 컨트롤군의 랫 슬관절의 연골 변성도(수정 Mankin스코어)는, 스코어의 각 항목(표4: A~C)모두에 경시적인 증강이 관찰되고, 관절증의 유도와 증악(增惡)(변형성 관절증의 초기 단계에서 진행기 단계로의 이행)이 확인되었다. 이에 반해서 CH-11투여군의 스코어는 투여 개시 후 8주째부터 컨트롤군의 평균 스코어에 비해서 낮은 값을 나타내는 경향이 있고, 12주째 이후에는 CH-11 저용량 투여군, CH-11 고용량 투여군모두에 통계학적 유의차가 보였다. 따라서 IgM형 항Fas항체 CH-11은, 초기~진행기 단계의 변형성 관절증 모델 랫에 있어서, 연골 변성을 억제하는 것이 나타났다. 따라서 IgM형 항Fas항체는, 연골 변성을 수반하는 변형성 관절증의 초기단계~진행기 단계로 분류되는 질환의 치료에 효과적으로 이용할 수 있음이 나타났다.

IgM형 항Fas항체 투여에 의한 병리조직에 대한 영향

변형성 관절증 모델 랫에 IgM형 항Fas항체를 투여한 때의 각 조직에 대한 영향을, 상기의 병리 조직학적 검사에 의해 조사했다. 변형성 관절증 모델 랫은, 처치 후 12주째 및 24주째의 랫을 이용했다. 각각의 랫의 슬관절 조직의 병리 표본을 광학 현미경으로 관찰, 촬영한 결과를 도8 및 도9에 나타냈다. 도8 및 도9 중 "×40" 및 "×200"은 광학득 현미경의 배율을 나타낸다.

도8은, 처치 후 12주째의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내는 도면을 대신하는 사진이다. 도8의 8A~8F는 컨트롤의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내고, 8G~8J는 CH-11 저용량 투여군(CH-11: 1.0ng/ml 투여)의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내고, 8K~8N은 CH-11 고용량 투여군(CH-11: 10.0ng/ml투여)의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내고, 8O은 컨트롤의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내고, 8P는 CH-11 저용량 투여군(CH-11: 1.0ng/ml 투여)의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타낸다. 도 8의 8B, 8D, 8F, 8G, 8I, 8K 및 8M은 각각 8A, 8C, 8E, 8H, 8J, 8L 및 8N 중 사각으로 둘러싼 부분을 확대한 도면을 대신하는 사진이다.

도8의 결과에서, 컨트롤군(8A~8F 및 8O)에서는, CH-11 투여군(8G~8N 및 8P)과 비교해서, 연골 변성(연골 세포의 클러스터링이나 연골 세포의 소실)이 확인되었다. 또한 연골 세포의 클러스터링은, 사프라닌0에 의한 염색 부분의 증가에서 판단할 수 있다. 그리고 연골 세포의 소실은 도8의 8O 및 8P에서 도시한 바와 같이, 사프라닌0(S0)의 염색성 저하에서 판단할 수 있다. 이 결과로부터 CH-11을 투여함으로써, 연골 변성을 억제할 수 있으므로, CH-11은 연골 변성을 수반하는 변형성 관절증을 치료 또는 예방할 수 있음이 나타났다.

도9는 처치 후 24주째의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내는 도면을 나타내는 사진들로, 9A~9H는 컨트롤의 변형성 관절증 모델랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타낸다. 도9의 9I~9L은 CH-11 저용량 투여군(CH-11: 1.0ng/ml 투여)의 변형성 관절증 모델랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타내고, 9M~9P는 CH-11 고용량 투여군((CH-11: 10.0ng/ml 투여)의 변형성 관절증 모델 랫의 슬관절 조직 병리 표본을 나타낸다. 도 9의 9B, 9D, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M 및 9O는,각각 9A, 9C, 9E, 9G, 9J, 9L, 9N 및 9P 중 사각으로 둘러싼 부분을 확대한 도면을 대신하는 사진이다.

도9의 결과에서, 컨트롤군(9A~,9H)은, CH-11 투여군(9I~9P)과 비교해서, 연골 변성(연골 세포의 소실이나 연골 기질 구조 변성)이 확인되었다. 이것으로부터 CH-11을 투여함으로써 연골 변성을 억제할 수 있으므로, CH-11은 연골 변성을 수반하는 변형성 관절증의 초기 단계~진행기 단계로 분류되는 질환을 치료 또는 예방할 수 있음이 나타났다.

게다가 본 변형성 관절증 모델 랫에서는 CH-11의 관절내 투여군은 컨트롤 랫군과 비교해서, 유의하게 2차성 활막염(염증) 및 연골 변성의 억제가 관찰되었다. 또한 CH-11의 관절내 투여군은 시험 후기에 컨트롤 랫에서 관찰되는 골증식성 변화(골극)가 거의 관찰되지 않았다. 또한 슬관절 이외의 장기(심장, 폐, 간장, 비장, 신장, 뇌, 정소 및 정낭)에 대해서는, 컨트롤군과 CH-11 투여군과의 사이에 조직학적인 차이는 특별히 보여지지 않았다. 따라서 IgM형 항Fas항체인 CH-11은 동물에 있어서도 변형성 관절증의 초기 단계~진행기 단계로 분류되는 질환을 특이적으로 억제할 수 있음이 명백해졌다.

본 발명의 치료제 또는 예방제는, 의약산업에서 사용될 수 있다.

Claims

IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하고,
변형성 관절증의 ICRS분류에 있어서 그레이드 1~3 중 어느 하나로 분류되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 치료제 또는 예방제.
제1항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 Fas항원의 세포외 도메인에 대한 IgM형 항Fas항체인 치료제 또는 예방제.
제1항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 CH11 또는 7C11인 치료제 또는 예방제.
IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하고,
변형성 관절증의 켈그렌-로렌스(KelIgren-Lawrence) 분류에 있어서 그레이드1~3중 어느 하나로 분류되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 치료제 또는 예방제.
제4항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 Fas항원의 세포외 도메인에 대한 IgM형 항Fas항체인 치료제 또는 예방제.
제4항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 CH11 또는 7C11인 치료제 또는 예방제.
IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하고,
변형성 관절증의 아우터브릿지(Outerbridge) 분류에 있어서 그레이드 1~3 중 어느 하나로 분류되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 치료제 또는 예방제.
제7항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 Fas항원의 세포외 도메인에 대한 IgM형 항Fas항체인 치료제 또는 예방제.
제7항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 CH11 또는 7C11인 치료제 또는 예방제.
IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하는 연골 파괴 억제제.
제10항에 있어서,
변형성 관절증의 ICRS분류에 있어서 그레이드1~3 중 어느 하나로 분류되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 연골 파괴 억제제.
제10항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 Fas항원의 세포외 도메인에 대한 IgM형 항Fas항체인 치료제 또는 예방제.
제10항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 CH11 또는 7C11인 치료제 또는 예방제.
IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하는 변형성 관절증성 관절염 치료제 또는 예방제.
제14항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 Fas항원의 세포외 도메인에 대한 IgM형 항Fas 항체인 변형성 관절증성 관절염 치료제 또는 예방제.
제14항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 CH11 또는 7C11인 변형성 관절증성 관절염 치료제 또는 예방제.
IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하는 연골 기질 분해 효소 산생 억제제.
제17항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 CH11 또는 7C11인 연골 기질 분해 효소 산생 억제제.
IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하는 연골 기질 산생제.
제19항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 CH11 또는 7C11인 연골 기질 산생제.
IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하는 변형성 관절증에 있어서의 연골 변성의 억제제.
제21항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 CH11 또는 7C11인 제(劑).
IgM형 항Fas항체를 유효 성분으로서 함유하는 매트릭스 메탈로프로테아제1 및 매트릭스 메탈로프로테아제3의 산생 억제제.
제23항에 있어서,
상기 IgM형 항Fas항체는 CH11 또는 7C11인 제(劑).