CN103261412B

CN103261412B - 抗人ccr7抗体、杂交瘤、核酸、载体、细胞、医药组合物和抗体固定化担载体

Info

Publication number: CN103261412B
Application number: CN201180056955.3A
Authority: CN
Inventors: 西口直树; 平山明义; 古谷昌弘; 清水达丈; 高山喜好; 清水朋子; 铃木一矢
Original assignee: Nb Health Laboratory Co ltd; Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: NB Health Laboratory Co. Ltd.
Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2011-09-27
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2031-09-27
Also published as: IL225461B; NZ609154A; US20150017167A1; JPWO2012043533A1; US20130195869A1; EP2623592A4; EP2623592A1; US20150010998A1; KR20130119923A; AU2011309114B2; CN103261412A; JP5315495B2; JP2013059343A; AU2011309114A8; EP2623592B1; KR101886890B1; US8865170B2; IL225461A0; CN105884895A; WO2012043533A1

Abstract

本发明的课题在于提供作为组织的纤维化或癌的治疗药有用的新型的抗人CCR7抗体、以及含有该抗人CCR7抗体的医药组合物等。提供一种抗人CCR7抗体，其为与人CCR7的细胞外结构域特异性结合的抗人CCR7抗体，具有包含序列编号7、17、27、37、47、57、67或77所示的氨基酸序列的重链CDR3。还提供一种具有包含序列编号5～10、15～20、25～30、35～40、45～50、55～60、65～70或75～80所示的氨基酸序列的重链CDR1～3和轻链CDR1～3的抗人CCR7抗体。优选具有阻断通过刺激CCR7配体而产生的CCR7依赖性细胞内信号传导机制的活性。本发明的抗人CCR7抗体能够作为组织的纤维化或癌的治疗药的有效成分使用。

Description

抗人CCR7抗体、杂交瘤、核酸、载体、细胞、医药组合物和抗体固定化担载体

技术领域

本发明涉及抗人CCR7抗体、杂交瘤、核酸、载体、细胞、医药组合物以及抗体固定化担载体，更详细而言涉及与人CCR7的细胞外结构域特异性结合的抗人CCR7抗体、生产该抗体的杂交瘤、编码该抗体的重链可变区或轻链可变区的核酸、具有该核酸的载体、具有该载体的细胞、包含该抗体的医药组合物以及将该抗体固定化得到的抗体固定化担载体。

背景技术

趋化因子是调节各种细胞的游走或细胞功能的细胞因子。趋化因子及其受体的功能异常成为自身免疫性疾病、急性和慢性炎症、癌这样的各种疾病的原因。目前为止，进行了控制趋化因子及其受体的活性的药剂的开发，并得到临床应用，但是难以说充分地解决了问题。

为了表现特定的趋化因子调节细胞的游走或细胞功能的这样的活性，需要趋化因子选择性地与细胞膜受体结合。已经发现了约20种趋化因子受体，任何一种趋化因子受体均为与三聚体G蛋白质结合的7次膜贯通型蛋白质(GPCR)。当趋化因子与受体结合时，就使得三聚体G蛋白质的Gα单位游离。其结果，使细胞内的Ca浓度上升，或者使phosphatidylinositol3-kinase(PI3K)(磷脂酰肌醇3激酶)、smallRhoGTPases路径或其他路径活化而体现功能。任何一种趋化因子受体都由相对选择性的趋化因子进行活化，但蛋白质的一级结构或细胞内的活化结构非常类似。因此，选择性地阻断特定的趋化因子受体的功能并不容易。生理的以及病态的各趋化因子和趋化因子受体的功能表达是通过各个蛋白质在特定的细胞或组织中在特定的时期(炎症时)表达来控制的(非专利文献1)。

人CC模体受体7(CCMOTIF,RECEPTOR7；别名：EBI1、CMKBR7；以下，称为“CCR7”。)最初作为因埃-巴二氏(EPSTEIN-BARR)病毒感染而在淋巴球中选择性地表达的GPCR而被发现(非专利文献2)。其后得知，CCR7是CCL19(别名：ELC)以及CCL21(别名：SLC、EXODUS2)的选择性的趋化因子受体。CCR7在生理的条件下，在CD4阳性T细胞(Th1、Th2、Treg细胞)、成熟树状细胞、B细胞这样的细胞中相对选择性地表达。已知这样的细胞经由CCR7被导引至炎症部位等的病灶，炎症反应或免疫反应亢进。另外，CCR7异常活化是造成自身免疫性疾病、急性以及慢性炎症后的纤维症、癌转移这样的各种疾病的原因。

人CCR7的氨基酸序列和基因的碱基序列已知(例如，GenBank:EAW60669.1)。

炎症是组织对于损伤或感染的防御反应。对各种炎症刺激进行应答，炎症性分子(趋化因子或细胞因子)的表达亢进持续，促进嗜中性粒细胞以及单核细胞的浸润。进而当炎症反应亢进时，T以及B淋巴球流入而疾病状态转入慢性。另一方面，在炎症的消退阶段，发生由过剩的白血球的细胞凋亡或组织巨噬细胞引起的吞噬作用，可见由间质细胞(例如纤维芽细胞)进行的损伤组织的修复。

过剩的间质细胞的分化增殖与各种纤维症(肝纤维症、肾纤维症、肺纤维症、皮肤纤维症、心血管纤维症、消化管纤维症以及其他纤维性疾病)的恶化密切相关。慢性肺纤维症是引起遍及肺整体的瘢痕形成、预后不良的疾病。具有抗纤维化作用的毗非尼酮(Pirfenidone)、皮质类固醇(Corticosteroid)类(例如强的松)和/或抑制体内的免疫系统的其他药物由于抑制与纤维症相关的过程而被作为处方。然而，难说如今获得了充分的治疗效果。

另一方面，近年来，炎症反应后的修复过程中的纤维化的分子结构不断被解明。在这样的修复机构中，局部的休止纤维芽细胞向损伤区域移动，生成细胞外基质蛋白质，促进创伤的收缩和纤维形成(瘢痕)。另外表明，循环的纤维芽前体细胞、纤维芽细胞(它们存在于血液中)向创伤或纤维形成的部位移动，在此处它们分化并介导组织的修复或其他的纤维化反应。

血液中纤维芽前体细胞，CD14＋末梢血单核细胞前体细胞群在炎症部位浸润，局部分化为间质细胞样(胶原蛋白I型以及III型与纤维连接蛋白)(非专利文献3)。这些细胞分泌炎症性细胞因子，并且分泌细胞外基质蛋白质、其他细胞因子类，它们能够引起纤维形成。只要能够选择性地抑制血液中纤维芽前体细胞向炎症部位的过剩的浸润，就能够期待将纤维化阻止在最小限度，但尚未实现临床应用。

近年来，作为在纤维芽前体细胞中表达的趋化因子受体，上述CCR7备受注目(专利文献1)。公开了即使对将CCR7缺损后的基因转换动物施加使肺纤维症或肾纤维症发病那样的刺激，纤维症也不发病(非专利文献4)。因此，只要能够用低分子化合物、单克隆抗体、RNAi等抑制CCR7的功能，就能够期待抑制各种纤维化。但是，由于趋化因子受体的蛋白质的一级结构或细胞内的活化结构非常类似，所以希望有能够进一步选择性地抑制CCR7的物质。目前为止进行着抑制CCR7的功能的物质(单克隆抗体或者RNAi)的研究，但还没有达到临床应用的事例。

另外另一方面，在癌治疗中，原发癌的增殖抑制和伴随远端转移的复发预防很重要。在以往的外科疗法和化学疗法的基础上，利用分子靶向药物(例如激酶抑制剂)和抗体医药疗法，治疗效果有所提高。然而，伴随远端转移的复发，癌预后不良，希望开发新的治疗药物。作为远端转移的机理，存在由原发癌经由血管的情况和经由淋巴组织的情况。目前为止，虽然细胞外基质蛋白质分解酶抑制剂(MMP抑制剂)等作为转移预防药得到开发，但还没有达到临床应用的事例。

通过各种研究表明，CCR7在B细胞慢性淋巴性白血病、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌细胞、恶性乳房肿瘤等各种肿瘤细胞中表达。另外，解明了CCR7在胃癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、T细胞白血病细胞等各种癌的淋巴结转移中发挥作用(非专利文献1)。由于作为CCR7的配体的CCL19以及CCL21在淋巴结中高表达，所以选择性的CCR7功能抑制能够期待抑制癌细胞的淋巴性转移。

抗体医药对于膜蛋白质(受体)的主要的作用机制一般为在抗体识别表达该蛋白质的细胞后，基于补体依赖性细胞溶解作用(CDC)以及抗体依赖性细胞介导性细胞毒性(ADCC)进行除去。然而，CDC或ADCC伴随巨噬细胞等的炎症细胞的活化，并不能说作为纤维症治疗一定适合。因此，在将能够选择性地抑制CCR7的单克隆抗体应用于纤维症治疗的情况下，希望不依赖于CDC和ADCC的功能性抗体。即，希望选择性地阻断CCR7的CCL19或者CCL21依赖性细胞内信号传导的抗体。但是，一般而言，难以有效地获得对于GPCR的功能性抗体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2009-528977号公报

非专利文献

非专利文献1：ViolaA,LusterAD"Chemokinesandtheirreceptors:drugtargetsinimmunityandinflammation",AnnuRevPharmacolToxicol.2008;48:171-97

非专利文献2：Birkenbach,M.,Josefsen,K.,Yalamanchili,R.,Lenoir,G.,Kieff,E.,"Epstein-Barrvirus-inducedgenes:firstlymphocyte-specificGprotein-coupledpeptidereceptors",J.Virol.67:2209-2220,1993.

非专利文献3：PillingD,FanT,HuangD,KaulB,GomerRH."Identificationofmarkersthatdistinguishmonocyte-derivedfibrocytesfrommonocytes,macrophages,andfibroblasts",PLoSOne.2009Oct16;4(10):e7475

非专利文献4：WadaT,SakaiN,MatsushimaK,KanekoS."Fibrocytes:anewinsightintokidneyfibrosis"，KidneyInt.2007Aug;72(3):269-73.

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的在于提供作为纤维症或癌的治疗药有用的新型的抗人CCR7抗体、和含有该抗人CCR7抗体的医药组合物等。

解决问题的方法

用于解决上述问题的本发明的一种方式为一种抗人CCR7抗体，其为与人CCR7的细胞外结构域特异性结合的抗人CCR7抗体，具有包含序列编号7、序列编号17、序列编号27、序列编号37、序列编号47、序列编号57、序列编号67或序列编号77所示的氨基酸序列的重链互补决定区3(重链CDR3)。

用于解决同样的问题的本发明的另一种方式为一种抗人CCR7抗体，其为与人CCR7的细胞外结构域特异性结合的抗人CCR7抗体，其互补决定区1～3(CDR1～3)的氨基酸序列满足下述(A1)～(A8)中的任意一项：

(A1)具有包含序列编号5所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号6所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号7所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A2)具有包含序列编号15所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号16所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号17所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A3)具有包含序列编号25所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号26所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号27所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A4)具有包含序列编号35所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号36所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号37所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A5)具有包含序列编号45所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号46所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号47所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A6)具有包含序列编号55所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号56所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号57所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A7)具有包含序列编号65所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号66所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号67所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A8)具有包含序列编号75所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号76所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号77所示的氨基酸序列的重链CDR3。

用于解决同样的问题的本发明的另一种方式为一种抗人CCR7抗体，其为与人CCR7的细胞外结构域特异性结合的抗人CCR7抗体，其互补决定区1～3(CDR1～3)的氨基酸序列满足下述(B1)～(B8)中的任意一项：

(B1)具有包含序列编号5所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号6所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号7所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号8所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号9所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号10所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B2)具有包含序列编号15所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号16所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号17所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号18所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号19所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号20所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B3)具有包含序列编号25所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号26所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号27所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号28所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号29所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号30所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B4)具有包含序列编号35所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号36所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号37所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号38所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号39所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号40所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B5)具有包含序列编号45所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号46所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号47所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号48所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号49所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号50所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B6)具有包含序列编号55所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号56所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号57所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号58所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号59所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号60所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B7)具有包含序列编号65所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号66所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号67所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号68所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号69所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号70所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B8)具有包含序列编号75所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号76所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号77所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号78所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号79所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号80所示的氨基酸序列的轻链CDR3。

用于解决同样的问题的本发明的另一种方式为一种抗人CCR7抗体，其为与人CCR7的细胞外结构域特异性结合的抗人CCR7抗体，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列满足下述(C1)～(C8)中的任意一种：

(C1)具有包含序列编号2所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含序列编号4所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(C2)具有包含序列编号12所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含序列编号14所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(C3)具有包含序列编号22所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含序列编号24所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(C4)具有包含序列编号32所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含序列编号34所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(C5)具有包含序列编号42所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含序列编号44所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(C6)具有包含序列编号52所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含序列编号54所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(C7)具有包含序列编号62所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含序列编号64所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(C8)具有包含序列编号72所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含序列编号74所示的氨基酸序列的轻链可变区。

优选具有阻断通过刺激CCR7配体而产生的CCR7依赖性细胞内信号传导机制的活性。

优选为人源化抗体或嵌合抗体。

优选为抗体片段、单链抗体或双抗体。

本发明的另一种方式为一种抗人CCR7抗体，其为与人CCR7的细胞外结构域特异性结合的抗人CCR7抗体，由R7-01(FERMBP-11369)、R7-02(FERMBP-11404)、R7-05(FERMBP-11371)、R7-09(FERMBP-11372)、R7-11(FERMBP-11373)、R7-18(FERMBP-11374)、R7-25(FERMBP-11375)或R7-47(FERMBP-11376)产生。

本发明的另一种方式为一种抗人CCR7抗体，其与上述抗人CCR7抗体结合同一的表位。

本发明的又一种方式为一种杂交瘤，其为R7-01(FERMBP-11369)、R7-02(FERMBP-11404)、R7-05(FERMBP-11371)、R7-09(FERMBP-11372)、R7-11(FERMBP-11373)、R7-18(FERMBP-11374)、R7-25(FERMBP-11375)或R7-47(FERMBP-11376)。

本发明的又一种方式为一种核酸，其编码本发明的抗人CCR7抗体的重链可变区或轻链可变区。

优选具有序列编号1、序列编号3、序列编号11、序列编号13、序列编号21、序列编号23、序列编号31、序列编号33、序列编号41、序列编号43、序列编号51、序列编号53、序列编号61、序列编号63、序列编号71或序列编号73所示的碱基序列。

本发明的又一种方式为包含上述核酸的载体。

本发明的又一种方式为导入有上述载体的细胞。

本发明的又一种方式为一种医药组合物，包括：上述本发明的抗人CCR7抗体，以及药学上可接受的担载体。

优选为阻断通过CCR7配体的CCR7依赖性细胞内信号传导机制的医药组合物。

优选用于治疗组织的纤维化。

优选上述组织的纤维化为选自肝纤维症、肾纤维症、肺纤维症、皮肤纤维症、心血管纤维症、消化管纤维症以及其他纤维性疾病中的纤维症。

优选上述肝纤维症为选自肝硬化、缺血再灌注、肝移植后损伤、坏死性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、原发性胆汁性肝硬化以及原发性硬化性胆管炎。

优选上述肝硬化是选自由酒精诱发、由药物诱发以及化学诱发中的至少一种造成的肝硬化。

优选上述肾纤维症选自增生性肾小球肾炎、硬化性肾小球肾炎、肾源性纤维化性皮肤病、糖尿病性肾病、肾小管间质性纤维症以及局灶节段性肾小球硬化症。

优选上述肺纤维症选自肺间质性纤维症、药物诱发结节病、肺纤维症、特发性肺纤维症、哮喘、慢性阻塞性肺病、弥漫性肺泡损伤疾病、肺高血压症以及新生儿支气管肺发育不良。

优选上述皮肤纤维症选自硬皮病、瘢瘤性疤痕、银屑病、增生性疤痕以及假性硬皮病。

优选上述心血管纤维症选自动脉粥样硬化、冠状动脉再狭窄、充血性心肌病、心脏衰竭、心脏移植以及心肌纤维症。

优选上述消化管纤维症选自胶原性结肠炎、绒毛萎缩、隐窝增生、息肉形成、克罗恩病的纤维症、胃溃疡愈合以及腹腔粘连术后瘢痕。

优选上述纤维症具有从与骨关联的纤维化性疾病产生的状态，为类风湿性血管翳形成。

优选用于治疗癌的转移。

优选上述癌选自咽癌、软骨肉瘤、大肠癌、胰腺癌、白血病、乳腺癌。

本发明的又一种方式是通过将上述的本发明的抗人CCR7抗体固定于担载体而形成的抗体固定化担载体。

优选用于与含有CCR7表达细胞的血液接触，从而从上述体液中除去CCR7表达细胞。

发明的效果

根据本发明的抗人CCR7抗体，能够提供对于难以治疗的纤维症或淋巴性癌转移等的新型医药品。

关于本发明的杂交瘤也同样，能够制造作为对于难以治疗的纤维症或淋巴性癌转移等的新型医药品的有效成分的抗人CCR7抗体。

根据本发明的核酸，能够利用重组技术生产本发明的抗体。另外，也能够应用于基因治疗。

关于本发明的载体也同样，能够利用重组技术生产本发明的抗体。另外，也能够应用于基因治疗。

关于本发明的细胞也同样，能够利用重组技术生产本发明的抗体。

根据本发明的医药组合物，能够提供对于难以治疗的纤维症或淋巴性癌转移等的新型医药品。

根据本发明的抗体固定化担载体，能够从患有纤维症或癌等的患者的血液中，选择性地除去CCR7表达细胞。

附图说明

图1是表示R7-01的可变区的氨基酸序列和CDR1～3的位置的说明图，(a)表示重链可变区，(b)表示轻链可变区。

图2是表示R7-02的可变区的氨基酸序列和CDR1～3的位置的说明图，(a)表示重链可变区，(b)表示轻链可变区。

图3是表示R7-05的可变区的氨基酸序列和CDR1～3的位置的说明图，(a)表示重链可变区，(b)表示轻链可变区。

图4是表示R7-09的可变区的氨基酸序列和CDR1～3的位置的说明图，(a)表示重链可变区，(b)表示轻链可变区。

图5是表示R7-11的可变区的氨基酸序列和CDR1～3的位置的说明图，(a)表示重链可变区，(b)表示轻链可变区。

图6是表示R7-18的可变区的氨基酸序列和CDR1～3的位置的说明图，(a)表示重链可变区，(b)表示轻链可变区。

图7是表示R7-25的可变区的氨基酸序列和CDR1～3的位置的说明图，(a)表示重链可变区，(b)表示轻链可变区。

图8是表示R7-47的可变区的氨基酸序列和CDR1～3的位置的说明图，(a)表示重链可变区，(b)表示轻链可变区。

图9是表示导入了人CCR7基因的细胞与小鼠对照IgG的相互作用的解析结果的柱状图。

图10是表示导入了人CCR7基因的细胞与抗人CCR7抗体R7-47的相互作用的解析结果的柱状图。

图11是表示细胞内Ca^2＋浓度和各添加物的浓度的关系的曲线图。

图12(a)是表示由同种型对照抗体和FITC标记抗小鼠IgG抗体染色的结果的柱状图；(b)是表示由R7-47和FITC标记抗小鼠IgG抗体染色的结果的柱状图。

图13是表示对诱发了肺纤维症的小鼠给药抗人CCR7抗体R7-11、R7-18或R7-47的实验的结果的曲线图。

图14(a)是表示CHO-K1细胞与来自杂交瘤R7-02的重组型抗人CCR7抗体的相互作用的解析结果的二维点阵图和柱状图；(b)是表示导入了人CCR7基因的细胞与来自杂交瘤R7-02的重组型抗人CCR7抗体的相互作用的解析结果的二维点阵图和柱状图。

图15(a)是表示CHO-K1细胞与来自杂交瘤R7-11的重组型抗人CCR7抗体的相互作用的解析结果的二维点阵图和柱状图；(b)是表示导入了人CCR7基因的细胞与来自杂交瘤R7-11的重组型抗人CCR7抗体的相互作用的解析结果的二维点阵图和柱状图。

图16(a)是表示CHO-K1细胞与来自杂交瘤R7-18的重组型抗人CCR7抗体的相互作用的解析结果的二维点阵图和柱状图；(b)是表示导入了人CCR7基因的细胞与来自杂交瘤R7-18的重组型抗人CCR7抗体的相互作用的解析结果的二维点阵图和柱状图。

具体实施方式

首先，对于本发明的抗体所特异性地识别的人CCR7，以其结构为中心进行说明。如上所述，CCR7为G蛋白偶联受体(GPCR)的一种，贯穿细胞膜7次，其N末端存在于细胞外，C末端向着细胞内存在。编码人CCR7的基因(cDNA)已经被分离，人CCR7的氨基酸序列也已经已知。该序列信息，例如能够从GenBank等的数据库中获取(例如，GenBank:EAW60669.1)。作为其一例，序列编号81中表示了人CCR7基因的碱基序列和与该碱基序列对应的氨基酸序列，在序列编号82中仅表示氨基酸序列。

人CCR7的各结构域可以认为相当于序列编号82所示的氨基酸序列中的以下的部分。左侧为氨基酸编号，右侧为各结构域。其中，关于各结构域间的边界，多少会产生偏差。

1～24：膜易位信号肽序列(表达后被切断、除去)

25～59：N末端结构域

87～95：细胞内第1环结构域

117～130：细胞外第1环结构域

153～170：细胞内第2环结构域

192～219：细胞外第2环结构域

248～263：细胞内第3环结构域

290～313：细胞外第3环结构域

332～378：C末端结构域

人CCR7除序列编号82所示的以外还已知氨基酸置换体等的各种变体。本发明的“人CCR7”中，只要具有细胞外结构域且具有作为CCR7的功能，就包含上述变体。

本发明的抗人CCR7抗体(以下，有时简称为“本发明的抗体”。)为与人CCR7的细胞外结构域特异性地结合的抗体。在1种方式(第一方式)中，本发明的抗体具有包含序列编号7、序列编号17、序列编号27、序列编号37、序列编号47、序列编号57、序列编号67或序列编号77所示的氨基酸序列的重链互补决定区3(重链CDR3)。

另外，在其他方式(第二方式)中，就本发明的抗体而言，关于其互补决定区1～3(CDR1～3)的氨基酸序列，满足下述(A1)～(A8)中的任意一种。

(A1)具有包含序列编号5所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号6所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号7所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A2)具有包含序列编号15所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号16所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号17所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A3)具有包含序列编号25所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号26所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号27所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A4)具有包含序列编号35所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号36所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号37所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A5)具有包含序列编号45所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号46所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号47所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A6)具有包含序列编号55所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号56所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号57所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A7)具有包含序列编号65所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号66所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号67所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A8)具有包含序列编号75所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号76所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号77所示的氨基酸序列的重链CDR3。

另外，在其他方式(第三方式)中，就本发明的抗体而言，关于其互补决定区1～3(CDR1～3)的氨基酸序列，满足下述(B1)～(B8)中的任意一种。

(B1)具有包含序列编号5所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号6所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号7所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号8所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号9所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号10所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B2)具有包含序列编号15所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号16所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号17所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号18所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号19所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号20所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B3)具有包含序列编号25所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号26所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号27所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号28所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号29所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号30所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B4)具有包含序列编号35所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号36所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号37所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号38所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号39所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号40所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B5)具有包含序列编号45所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号46所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号47所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号48所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号49所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号50所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B6)具有包含序列编号55所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号56所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号57所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号58所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号59所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号60所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B7)具有包含序列编号65所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号66所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号67所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号68所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号69所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号70所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B8)具有包含序列编号75所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号76所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号77所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号78所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号79所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号80所示的氨基酸序列的轻链CDR3。

另外，在其他方式(第四方式)中，本发明的抗体，其重链可变区(以下，有时简单记为“VH”。)和轻链可变区(以下，有时简单记为“VL”。)的氨基酸序列满足以下(C1)～(C8)中的任意一种。

序列编号5(重链CDR1)、序列编号6(重链CDR2)、序列编号7(重链CDR3)分别相当于序列编号2(VH)的氨基酸编号27～35、50～66、97～112的部分(图1(a))。

序列编号8(轻链CDR1)、序列编号9(轻链CDR2)、序列编号10(轻链CDR3)分别相当于序列编号4(VL)的氨基酸编号24～39、55～68、94～102的部分(图1(b))。

序列编号15(重链CDR1)、序列编号16(重链CDR2)、序列编号17(重链CDR3)分别相当于序列编号12(VH)的氨基酸编号43～51、66～82、113～124的部分(图2(a))。

序列编号18(轻链CDR1)、序列编号19(轻链CDR2)、序列编号20(轻链CDR3)分别相当于序列编号14(VL)的氨基酸编号24～37、53～59、87～99的部分(图2(b))。

序列编号25(重链CDR1)、序列编号26(重链CDR2)、序列编号27(重链CDR3)分别相当于序列编号22(VH)的氨基酸编号30～38、53～68、100～111的部分(图3(a))。

序列编号28(轻链CDR1)、序列编号29(轻链CDR2)、序列编号30(轻链CDR3)分别相当于序列编号24(VL)的氨基酸编号23～36、52～58、91～99的部分(图3(b))。

序列编号35(重链CDR1)、序列编号36(重链CDR2)、序列编号37(重链CDR3)分别相当于序列编号32(VH)的氨基酸编号28～36、51～67、98～109的部分(图4(a))。

序列编号38(轻链CDR1)、序列编号39(轻链CDR2)、序列编号40(轻链CDR3)分别相当于序列编号34(VL)的氨基酸编号23～36、52～58、91～99的部分(图4(b))。

序列编号45(重链CDR1)、序列编号46(重链CDR2)、序列编号47(重链CDR3)分别相当于序列编号42(VH)的氨基酸编号29～37、52～68、98～110的部分(图5(a))。

序列编号48(轻链CDR1)、序列编号49(轻链CDR2)、序列编号50(轻链CDR3)分别相当于序列编号44(VL)的氨基酸编号24～39、55～61、94～102的部分(图5(b))。

序列编号55(重链CDR1)、序列编号56(重链CDR2)、序列编号57(重链CDR3)分别相当于序列编号52(VH)的氨基酸编号30～37、53～69、99～111的部分(图6(a))。

序列编号58(轻链CDR1)、序列编号59(轻链CDR2)、序列编号60(轻链CDR3)分别相当于序列编号54(VL)的氨基酸编号24～39、55～61、94～102的部分(图6(b))。

序列编号65(重链CDR1)、序列编号66(重链CDR2)、序列编号67(重链CDR3)分别相当于序列编号62(VH)的氨基酸编号30～41、54～69、100～111的部分(图7(a))。

序列编号68(轻链CDR1)、序列编号69(轻链CDR2)、序列编号70(轻链CDR3)分别相当于序列编号64(VL)的氨基酸编号24～39、56～62、95～102的部分(图7(b))。

序列编号75(重链CDR1)、序列编号76(重链CDR2)、序列编号77(重链CDR3)分别相当于序列编号72(VH)的氨基酸编号27～35、50～66、96～109的部分(图8(a))。

序列编号78(轻链CDR1)、序列编号79(轻链CDR2)、序列编号80(轻链CDR3)分别相当于序列编号74(VL)的氨基酸编号24～39、55～61、94～102的部分(图8(b))。

本发明中“抗体”这一用语能够与“免疫球蛋白”互换。

本发明的抗体中包含其功能性片段。其中，“抗体的功能性片段”是指抗体(即免疫球蛋白)的部分片段，且至少保持1种对于抗原的作用的片段。作为上述部分片段的例子，可以列举F(ab’)₂、Fab、Fv、二硫键Fv、单链抗体(scFv、VH-VL)、VH和它们的聚合体、以及它们与重链CH3区域的融合体。另外，可以列举CDR1、CDR2、CDR3等各CDR和这些CDR的连接体、以及这些CDR或CDR连接体与重链CH3区域的融合体。即，本发明的抗体中，只要与人CCR7的细胞外结构域特异性地结合，就包含上述那样的抗体的部分片段。有时也将抗体的部分片段称为“抗体片段”。

另外本发明的抗体也可以为多特异性抗体。作为例子，可以列举作为双特异性抗体的一种的双抗体(Diabody)(国际公开第93/11161号小册子等)。

在本发明的抗体为功能性片段的情况下，例如，具有以下的效果。即，在将本发明的抗人CCR7抗体应用于后述那样的医药品时，若使用IgG型等的全长的抗体，则除了抑制靶标受体的信号，还会对靶标组织引起障碍，这有时会导致副作用。在这样的情况下，当采用仅使用可变区的“抗体的功能性片段”时，就容易避免上述那样的副作用。

对于本发明的抗体的类型(同种型)没有特别限定。例如可以为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等的任意类型。另外，对于本发明的抗体的亚型也没有特别限定，例如，只要为IgG，可以为IgG1、IgG2、IgG3等的任意亚型。

在优选实施方式中，具有阻断通过CCR7配体刺激的CCR7依赖性细胞内信号传导机制的活性。

本发明的抗体的又一种方式(第五方式)为由R7-01(FERMBP-11369)、R7-02(FERMBP-11404)、R7-05(FERMBP-11371)、R7-09(FERMBP-11372)、R7-11(FERMBP-11373)、R7-18(FERMBP-11374)、R7-25(FERMBP-11375)或R7-47(FERMBP-11376)产生的抗人CCR7抗体。这8种杂交瘤产生的抗体为与人CCR7的细胞外结构域特异性地结合的抗体。

如后述的实施例中详细说明的那样，由这些杂交瘤产生的8种抗体分别具有包括上述的特定的氨基酸序列的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)以及各CDR。表1中汇总了VH、VL、各CDR的氨基酸序列的序列编号和对应的克隆的关系。

表1

产生本发明的抗体的上述8种杂交瘤，保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(IPOD，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。保藏的详细内容如下。

表示：R7-01

保藏编号：FERMBP-11369

保藏日：平成22年(2010年)7月28日

(从2010年7月28日所保藏的FERM-21988移管)

表示：R7-02

保藏编号：FERMBP-11404

保藏日：平成22年(2010年)7月28日

(从2010年7月28日所保藏的FERM-21989移管)

表示：R7-05

保藏编号：FERMBP-11371

保藏日：平成22年(2010年)7月28日

(从2010年7月28日所保藏的FERM-21990移管)

表示：R7-09

保藏编号：FERMBP-11372

保藏日：平成22年(2010年)7月28日

(从2010年7月28日所保藏的FERM-21991移管)

表示：R7-11

保藏编号：FERMBP-11373

保藏日：平成22年(2010年)7月28日

(从2010年7月28日所保藏的FERM-21992移管)

表示：R7-18

保藏编号：FERMBP-11374

保藏日：平成22年(2010年)7月28日

(从2010年7月28日所保藏的FERM-21993移管)

表示：R7-25

保藏编号：FERMBP-11375

保藏日：平成22年(2010年)7月28日

(从2010年7月28日所保藏的FERM-21994移管)

表示：R7-47

保藏编号：FERMBP-11376

保藏日：平成22年(2010年)7月28日

(从2010年7月28日所保藏的FERM-21995移管)

本发明的抗体特异性地结合的人CCR7的细胞外结构域可以为N末端结构域、细胞外第1环结构域、细胞外第2环结构域、细胞外第3环结构域中的任意结构域。另外本发明的抗体可以仅与这些细胞外结构域中的任意一种，也可以与2种以上结合。

本发明的抗体中还包括与上述的第一至第五方式所涉及的抗人CCR7抗体结合同一的表位的抗人CCR7抗体。换而言之，还包括具有与上述的第一至第五方式所涉及的抗人CCR7抗体的CDR“功能性同等”的CDR的抗人CCR7抗体。例如，利用了使用人CCR7的部分肽等的表位作图法解析后述的实施例中具体所示的8种抗人CCR7抗体的表位。并且，使用包含所鉴定的表位的合成肽作为抗原，能够得到与上述8种抗人CCR7抗体结合同一的表位的抗人CCR7抗体。另外，能够确定所得到的抗人CCR7抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，决定重链CDR1～3和轻链CDR1～3的氨基酸序列。

此外，作为该抗人CCR7抗体中的“功能性同等”的CDR的氨基酸序列的例子，可以列举在原始的氨基酸序列(序列编号5～10、15～20、25～30、35～40、45～50、55～60、65～70、75～80)中缺失、取代或添加有1或数个、优选1～5个、更优选1～3个、更加优选1个氨基酸且具有作为CDR的同等功能的氨基酸序列。作为另一个例子，可以列举与上述原始的氨基酸序列的同源性为80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上且具有作为CDR的同等功能的氨基酸序列。

作为对于2个抗体调查表位是否相同的方法，可以列举利用竞争性试验的方法。例如，作为第一抗体的上述8种抗人CCR7抗体与受体的结合在受到来自作为试验对象的第二抗体的竞争性抑制时，该第二抗体可以说是与上述第一抗体结合相同的表位的抗体。

本发明的核酸是编码本发明的抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的核酸。即，编码第一方式涉及的具有包含序列编号7、序列编号17、序列编号27、序列编号37、序列编号47、序列编号57、序列编号67或序列编号77所示的氨基酸序列的重链CDR3的抗人CCR7抗体的VH或VL的核酸包括在本发明的核酸中。另外，编码第二方式涉及的满足上述(A1)～(A8)中的任意一种的VH或VL的核酸包括在本发明的核酸中。另外，编码第三方式涉及的满足上述(B1)～(B8)中的任意一种的VH或VL的核酸包括在本发明的核酸中。另外，编码第四方式涉及的满足上述(C1)～(C8)中的任意一种的VH或VL的核酸包括在本发明的核酸中。作为这些核酸的具体例，可以列举具有序列编号1、序列编号3、序列编号11、序列编号13、序列编号21、序列编号23、序列编号31、序列编号33、序列编号41、序列编号43、序列编号51、序列编号53、序列编号61、序列编号63、序列编号71或序列编号73所示的碱基序列的核酸。

本发明的核酸也能够使用PCR等从上述8种杂交瘤中取得。

本发明的载体是包含本发明的核酸的载体。作为载体的种类没有特别限定，根据之后导入的宿主细胞的种类等适当选择即可。另外，本发明的载体中包含基因治疗用载体。此时，可以将载体本身直接给药至生物体内。

本发明的细胞是导入有本发明的载体的细胞。作为细胞的种类，只要是所导入的载体发挥功能的细胞就没有特别限定。作为例子，可以列举动物细胞(COS细胞、CHO细胞等)、酵母、细菌(大肠杆菌等)、植物细胞、昆虫细胞等。

本发明的抗体，例如能够如下来制造。

(利用杂交瘤的生产)

能够培养上述8种中的任意杂交瘤，从该培养物中生产本发明的抗体。作为培养的方法，能够直接适用作为杂交瘤的培养方法被通常所采用的方法。例如，能够使用DMEM或RPMI1640这样的动物细胞用的培养基培养杂交瘤，从其培养上清中获得本发明的抗体。在动物的腹腔内培养杂交瘤时，能够采取腹水，从该腹水中得到本发明的抗体。

(利用基因重组技术的生产)

本发明的抗体也能够使用基因重组的方法生产。特别在生产嵌合型抗体、人源化抗体、抗体的功能性片段等的情况下，一般利用基因重组的方法生产。

首先，关于生产第四方式所涉及的具有满足上述(C1)～(C8)中的任意一种的重链可变区和轻链可变区的抗体的方法，以嵌合型抗体的生产为例进行说明。其中“嵌合型抗体”是指重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)来自人以外的动物，且重链恒定区(CH)或轻链恒定区(CL)等的其他区域来自人的抗体。

首先，制备编码序列编号2、序列编号12、序列编号22、序列编号32、序列编号42、序列编号52、序列编号62或序列编号72所示的氨基酸序列(VH)的DNA。同样制备编码序列编号4、序列编号14、序列编号24、序列编号34、序列编号44、序列编号54、序列编号64或序列编号74所示的氨基酸序列(VL)的DNA。作为这些DNA，例示了序列编号1、序列编号3、序列编号11、序列编号13、序列编号21、序列编号23、序列编号31、序列编号33、序列编号41、序列编号43、序列编号51、序列编号53、序列编号61、序列编号63、序列编号71或序列编号73所示的DNA，但也可以为其他碱基序列。DNA的制备能够使用PCR等公知的方法进行。也能够利用化学合成制备该DNA。

将编码所得到的VH或VL的DNA分别插入具有编码人抗体的CH或CL的序列的载体，构建嵌合型抗体表达载体。其中，具有编码人抗体的CH或CL的序列的载体能够从市场获得。通过将构建的表达载体导入宿主细胞，得到表达嵌合型抗体的重组细胞。然后，培养该重组细胞，从该培养物获得所期望的嵌合型抗体。

作为上述宿主细胞，只要是表达载体能够发挥功能的细胞就没有特别限定。能够适当采用上述那样的动物细胞(COS细胞、CHO细胞等)、酵母、细菌(大肠杆菌等)、植物细胞、昆虫细胞等。

接着，对于生产第三方式涉及的具有满足上述(B1)～(B8)中的任意一种的特定的CDR的抗体的方法，以人源化抗体的生产为例进行说明。其中，人源化抗体是指CDR来自人以外的动物且其他区域(框架区或恒定区等)来自人的抗体。

首先，作为编码重链CDR1～3以及轻链CDR1～3的DNA，制备编码序列编号5～10、序列编号15～20、序列编号25～30、序列编号35～40、序列编号45～50、序列编号55～60、序列编号65～70或序列编号75～80所示的氨基酸序列的各DNA。作为该DNA，可以例示序列编号1、序列编号3、序列编号11、序列编号13、序列编号21、序列编号23、序列编号31、序列编号33、序列编号41、序列编号43、序列编号51、序列编号53、序列编号61、序列编号63、序列编号71或序列编号73所示的碱基序列中相当于各CDR的部分的序列，但也可以为其他碱基序列。DNA的制备能够使用PCR等公知的方法进行。也能够利用化学合成制备该DNA。

接着，使用这些DNA，制作编码在任意的人抗体的VH的框架区(FR)中移植有重链CDR1～3的可变区的DNA。同样制作编码在任意的人抗体的VL的FR中移植有轻链CDR1～3的可变区的DNA。将所制作的各DNA插入具有编码人抗体的CH或CL的序列的载体，构建人源化抗体表达载体。通过将构建的表达载体导入宿主细胞，得到表达人源化抗体的重组细胞。然后，培养该重组细胞，从该培养物中取得所期望的人源化抗体。

对于第二方式涉及的具有满足上述(A1)～(A8)中的任意一种的特定的CDR的抗体，也能够由同样的程序生产。

对于第一方式涉及的具有包含序列编号7、序列编号17、序列编号27、序列编号37、序列编号47、序列编号57、序列编号67或序列编号77所示的氨基酸序列的重链CDR3的抗人CCR7抗体，也能够由同样的程序生产。

作为本发明的抗体的纯化方法没有特别限定，能够采用公知的方法。例如，能够回收上述杂交瘤或上述重组细胞的培养上清，组合各种色谱、盐析、透析、膜分离等公知的方法，纯化本发明的抗体。在抗体的同种型为IgG的情况下，也能够利用使用了蛋白A的亲和色谱简便地进行纯化。

其中，本发明的杂交瘤，如后述实施例中所详述的那样，为使用公知的杂交瘤制作技术筛选并取得的细胞。其中，在对动物(例如小鼠)免疫抗原时，也能够使用所纯化的人CCR7作为抗原，但也可以使用基因免疫的方法。特别有时通过使用使作为大肠杆菌分子伴侣的GroEL的基因与CCR7基因连接得到的融合基因作为免疫原，能够容易进行抗体制作。该基因免疫方法的详细内容记载于国际公开第2006/041157号小册子中。

本发明的抗体可用作医药组合物(治疗剂)的有效成分。本发明的医药组合物的特征在于包含本发明的抗人CCR7抗体和药学上可接受的担载体。优选阻断通过CCR7配体的CCR7依赖性细胞内信号传导机制。

在优选实施方式中，本发明的医药组合物用于治疗组织的纤维化。作为组织的纤维化的例子，可以列举选自肝纤维症、肾纤维症、肺纤维症、皮肤纤维症、心血管纤维症、消化管纤维症以及其他纤维性疾病中的纤维症。

作为上述肝纤维症的例子，可以列举选自肝硬化、缺血再灌注、肝移植后损伤、坏死性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、原发性胆汁性肝硬化以及原发性硬化性胆管炎中的肝纤维症。关于肝硬化，可以列举选自酒精诱发、药物诱发以及化学诱发中的至少1种造成的肝硬化。作为上述肾纤维症的例子，可以列举选自增生性肾小球肾炎、硬化性肾小球肾炎、肾源性纤维化性皮肤病、糖尿病性肾病、肾小管间质性纤维症以及局灶节段性肾小球硬化症中的肾纤维症。作为上述肺纤维症的例子，可以列举选自肺间质性纤维症、药物诱发结节病、肺纤维症、特发性肺纤维症、哮喘、慢性阻塞性肺病、弥漫性肺泡损伤疾病、肺高血压症以及新生儿支气管肺发育不良中的肺纤维症。

作为上述皮肤纤维症的例子，可以列举选自硬皮病、瘢瘤性疤痕、银屑病、增生性疤痕以及假性硬皮病中的皮肤纤维症。作为上述心血管纤维症的例子，可以列举选自动脉粥样硬化、冠状动脉再狭窄、充血性心肌病、心脏衰竭、心脏移植以及心肌纤维症中的心血管纤维症。作为上述消化管纤维症的例子，可以列举选自胶原性结肠炎、绒毛萎缩、隐窝增生、息肉形成、克罗恩病的纤维症、胃溃疡愈合以及腹腔粘连术后瘢痕中的消化管纤维症。

另外上述纤维症具有从与骨关联的纤维化性疾病产生的状态，可以为类风湿性血管翳形成。

另外，本发明的医药组合物在用于治疗癌的转移中也能够使用。作为上述癌的例子，可以列举选自咽癌、软骨肉瘤、大肠癌、胰腺癌、白血病、乳腺癌中的癌。

本发明的医药组合物能够口服或者非口服地、全身或者局部地给药。作为给药的形式，可以列举注射剂型、经鼻给药剂型、经肺给药剂型、经皮给药型等。注射剂型时，例如能够通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等，全身或局部给药。另外，也能够根据患者的年龄、症状，适当选择给药方法。作为本发明的抗体的给药量，例如，能够在一次每1kg体重从0.0001mg至1000mg的范围选择。或者，例如，能够在每位患者抗体0.001～100000mg/body的范围选择给药量。然而，本发明的抗体的给药量不限于这些范围。

包含本发明的抗体的医药组合物能够按照常规方法制剂化(例如、Remington'sPharmaceuticalScience,最新版,MarkPublishingCompany,Easton,U.S.A)。本发明的医药组合物包含药学上可接受的担载体、添加物。作为上述担载体或者上述添加物的例子，能够列举表面活性剂(PEG、Tween等)、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、着色料、着香料、保存料、稳定剂、缓冲剂(磷酸、柠檬酸、其他有机酸等)、螯合剂(EDTA等)、悬浮剂、等渗剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等，但不限于这些，也能够适当使用其他常用的担载体等。具体而言，能够列举轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露糖醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。另外，也可以包含其他其他低分子量的多肽、血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质、甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸以及赖氨酸等氨基酸。

在形成为注射用的水溶液时，可以列举例如生理食盐水、含有葡萄糖或其他辅助药的等渗液、例如，也可以列举D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可以与适当的助溶剂、例如酒精(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子性表面活性剂(聚山梨醇酯80、HCO-50)等组合使用。另外，也能够根据需要将本发明的抗体封入微胶囊(羟甲基纤维素、明胶、聚［甲基丙烯酸甲酯］等的微胶囊)中，或者制成胶体药物传递系统(脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒以及纳米胶囊等)(参照"Remingto'sPharmaceuticalScience16thedition",OsloEd.(1980)等)。

此外，已知有使药剂缓释的技术，也能够应用于本发明的医药组合物(Langeretal.,J.Biomed.Master.Res.15:167-277(1981);Langer,Chem.Tech.12:98-105(1982)；美国专利第3，773，919号；欧州专利申请公开第58，481号；Sidmanetal.,Biopolymers22:547-556(1983)；欧州专利申请公开第133，988号)。

此外，使其他药剂(抗纤维化作用剂、低分子抗癌剂、细胞因子等)与抗体直接融合来提高治疗效果的技术，能够应用于本发明的医药组合物。

另外，也可以考虑将编码本发明的抗体的基因组入基因治疗用载体，制成基因治疗药。作为该基因治疗药(重组载体)的给药方法除利用裸(naked)质粒的直接给药以外，还可以列举在脂质体等中包装进行给药的方法、组入逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘苗病毒载体、痘病毒载体、腺伴随病毒载体、HVJ载体等各种病毒载体进行给药的方法(参照Adolph《病毒基因组法》，CRCPress，Florid(1996))、包覆胶体金颗粒等珠子担载体(国际公开第93/17706号小册子等)进行给药的方法等。即，只要是上述基因治疗药能够在生物体内表达本发明的抗体并发挥其作用，就可以通过任何方法给药。优选通过适当的非口服路径(经由静脉内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪组织内、乳腺组织内、吸入或肌肉内的路径进行注射、注入，或气体诱导性颗粒轰击法(利用电子枪等)、滴鼻药等经由粘膜路径的方法等)将充分的量进行给药。此外，上述基因治疗药也可以通过离体利用脂质体转染、粒子轰击法(美国专利第4，945，050号)、或病毒感染向细胞给药，将该细胞再导入动物进行给药。

此外，在本发明中，也包括与患有因CCR7信号的异常亢进而发病的疾病或疾患的哺乳动物的该疾病相关的治疗方法和治疗药。

其中“治疗”以如下含义使用：以在可能患有疾病或者已经患有疾病的哺乳动物中，阻止或缓解该疾病的疾病状态的发展以及恶化，由此以阻止或缓解该疾病的各种症状等的发展以及恶化为目的的治疗措施。

另外，“疾病”的意思是指因CCR7信号的异常亢进而发病的所有疾病，没有特别限定，例如是包括肝纤维症、肾纤维症、肺纤维症、皮肤纤维症、心血管纤维症、消化管纤维症以及其他纤维性疾病的概念。另外，也为包括以咽癌、软骨肉瘤、大肠癌、胰腺癌、白血病、乳腺癌为原发的癌转移的概念。作为治疗的对象“哺乳动物”的意思是分类为哺乳类的任意的动物，没有特别限定，例如，除人以外，为狗、猫、兔子等宠物动物、牛、猪、羊、马等家畜动物等。特别优选的“哺乳动物”为人。

本发明的抗体固定化担载体是将本发明的抗人CCR7抗体固定于担载体而形成的。在优选实施方式中，使本发明的抗体固定化担载体与包含CCR7表达细胞的血液接触，用于从上述体液中除去CCR7表达细胞。固定于担载体的抗人CCR7抗体可以仅为1种也可以为2种以上。

作为本发明的抗体固定化担载体的具体的形态，例如，可以列举将本发明的抗体固定于水不溶性担载体并填充于容器的形态。其中，作为水不溶性担载体可以使用任意材质，但若在成型性、灭菌性和细胞毒性低的方面列举优选的材质，则可以列举聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、丙烯酸类树脂、尼龙、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚氨酯等合成高分子、琼脂糖、纤维素、醋酸纤维素、几丁质、壳聚糖、海藻酸钠等天然高分子、羟基磷灰石、玻璃、氧化铝、氧化钛等无机材料、不锈钢、钛等金属材料。

作为担载体的形状，可以列举粒状、棉状、纺织布、无纺布、海绵状多孔质体、平板状等，但在每体积的表面积大的方面优选粒状、棉状、纺织布、无纺布、海绵状多孔质体。例如，使末梢血通过预先在容器中填充有固定了抗体的水不溶性担载体的多孔质体过滤器，能够高效地除去与疾病相关的CCR7表达细胞。

组合本发明的抗体固定化担载体和其他构成要素，能够制作CCR7表达细胞除去用试剂盒。作为该其他构成要素，可以列举抗凝固剂、体外循环回路等。

本发明包含下述(1)～(5)的抗人CCR7抗体。

(1)抗人CCR7抗体，其为与人CCR7的细胞外结构域特异性结合的抗人CCR7抗体，其特征在于，具有包含序列编号7、序列编号17、序列编号27、序列编号37、序列编号47、序列编号57、序列编号67或序列编号77所示的氨基酸序列的重链互补决定区3(重链CDR3)。

(2)上述(1)中记载的抗人CCR7抗体，其特征在于，其互补决定区1～3(CDR1～3)的氨基酸序列，满足下述(A1)～(A8)中的任意一种。

(A1)具有包含序列编号5所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号6所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号7所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A2)具有包含序列编号15所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号16所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号17所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A3)具有包含序列编号25所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号26所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号27所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A4)具有包含序列编号35所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号36所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号37所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A5)具有包含序列编号45所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号46所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号47所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A6)具有包含序列编号55所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号56所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号57所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A7)具有包含序列编号65所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号66所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号67所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(A8)具有包含序列编号75所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号76所示的氨基酸序列的重链CDR2、以及

包含序列编号77所示的氨基酸序列的重链CDR3。

(3)上述(1)或(2)中记载的抗人CCR7抗体，其特征在于，其互补决定区1～3(CDR1～3)的氨基酸序列满足下述(B1)～(B8)中的任意一种。

(B1)具有包含序列编号5所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号6所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号7所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号8所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号9所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号10所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B2)具有包含序列编号15所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号16所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号17所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号18所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号19所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号20所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B3)具有包含序列编号25所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号26所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号27所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号28所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号29所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号30所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B4)具有包含序列编号35所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号36所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号37所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号38所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号39所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号40所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B5)具有包含序列编号45所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号46所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号47所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号48所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号49所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号50所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B6)具有包含序列编号55所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号56所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号57所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号58所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号59所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号60所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B7)具有包含序列编号65所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号66所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号67所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号68所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号69所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号70所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B8)具有包含序列编号75所示的氨基酸序列的重链CDR1、

包含序列编号76所示的氨基酸序列的重链CDR2、

包含序列编号77所示的氨基酸序列的重链CDR3、

包含序列编号78所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

包含序列编号79所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

包含序列编号80所示的氨基酸序列的轻链CDR3。

(4)上述(1)～(3)中任一项中记载的抗人CCR7抗体，其特征在于，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列满足下述(C1)～(C8)中的任意一种。

(5)上述(1)～(4)中任一项中记载的抗人CCR7抗体，其特征在于，由R7-01(FERMBP-11369)、R7-02(FERMBP-11404)、R7-05(FERMBP-11371)、R7-09(FERMBP-11372)、R7-11(FERMBP-11373)、R7-18(FERMBP-11374)、R7-25(FERMBP-11375)或R7-47(FERMBP-11376)产生。

本发明包含给药有效量的上述抗人CCR7抗体的组织的纤维化或癌的转移的治疗方法。组织的纤维化和癌的具体例如上所述。

本发明包含用于治疗组织的纤维化或癌的转移的治疗剂制造的上述抗人CCR7抗体的使用。本发明还包含组织的纤维化或癌的转移的治疗用的上述抗人CCR7抗体。组织的纤维化和癌的具体例如上所述。

实施例

以下，使用实施例进一步具体地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

(1)人CCR7(hCCR7)基因的制备

利用DNA合成装置制作在Genebank注册完毕的人CCR7基因序列(NM＿001838、序列编号81)的5’末端添加有GCTAGC序列、在3’末端添加有GTCGACTAGGAATTC序列(序列编号83)的人工合成基因。然后，将该基因导入pUC57克隆载体，制备人CCR7基因克隆。以下，将所得到的载体在NheI和SalI位点切断而制备的基因片段称为“DNA片段A”，将在NheI和EcoRI位点切断而制备的基因片段称为“DNA片段B”。

(2)GroEL亚单位基因的分离

从大肠杆菌HMS174(DE3)株(Novagen公司)提取、纯化基因组DNA。接着，以纯化后的基因组DNA作为模板，以具有序列编号84以及85所示的碱基序列的寡核苷酸作为引物对进行PCR，扩增具有序列编号86所示的碱基序列的含有GroEL亚单位基因的DNA片段(以下，称为“DNA片段C”。)。在DNA片段C中，在5’末端导入来自引物的SalI位点，在3’末端导入来自引物的编码2个终止密码子(TAATAG)的序列以及NotI位点。

(3)表达人CCR7和GroEL亚单位的融合蛋白的基因免疫用载体的构建

用制限酶NheI和SalI消化哺乳动物表达载体pCIMammalianExpressionVector(Promega公司)，用来自细菌的碱性磷酸酶(BAP)对末端进行脱磷酸化处理后，插入在上述(1)中制备的DNA片段A。再将该表达载体用SalI和NotI消化，用BAP对末端进行脱磷酸化处理后，插入在上述(2)中制备的DNA片段C，构建载体pCI-hCCR7·GroEL。即，载体pCI-hCCR7·GroEL具有编码人CCR7的基因和编码GroEL亚单位的基因的融合基因。

(4)制作导入了人CCR7基因的稳定表达细胞

将在上述(1)中制备的DNA片段B导入pCIneo(Promega公司)的NheI-EcoRI位点，构建pCIneo-hCCR7。

混合POFECTAMINE(Lipofectamin)溶液37.5μL、OPTI-MEMI培养基625μL、和含有20μgpCIneo-hCCR7的OPTI-MEMI培养基625μL。使用该混合液，将pCIneo-hCCR7导入2×10⁵个CHO-K1细胞(大日本制药株式会社)。作为对照，仅将pCIneo导入CHO-K1细胞。用Ham’sF12K＋10%FBS培养基(ICN公司)培养30小时导入有基因的各CHO-K1细胞。然后剥离、悬浮各细胞，在100mm培养皿中接种5×10⁵个，用以0.8mg/mL的浓度含有抗生素G418(Promega公司)的Ham’sF12K＋10%FBS培养基进行2周药剂处理。药剂处理后，利用极限稀释法，克隆G418耐性细胞。另外，为了增大Ca信号应答，在克隆后的细胞中基因导入pCEP-Gα16(MolecularDevices公司)，在抗生素潮霉素0.2mg/mL的浓度下，同样地进行药剂处理，然后，进一步进行潮霉素耐性细胞的克隆。通过以上的操作，制作导入了人CCR7基因的稳定表达细胞。接着，为了确认该细胞上的CCR7功能活性，进行了以下的评价。对于细胞，以2×10⁴个/100μL的初始细胞浓度，使用96孔微量滴定板培养一昼夜，培养结束后，利用10^-6～10^-12M的浓度范围内的CCL21(R&Dsystems公司)刺激各细胞，结果细胞内的Ca^2＋浓度瞬间上升。Ca^2＋浓度使用Ca^2＋信号解析装置(FLIPR；MolecularDevices公司)以及细胞内Ca²⁺染色试剂盒(Ca3kit；MolecularDevices公司)测定。由此可知活性型人CCR7在CHO-K1细胞膜上正常稳定地表达。

(5)基因免疫

在生理食盐水中溶解载体pCI-hCCR7·GroEL使其达到250μg/mL的浓度，制备免疫用组合物。将该免疫用组合物在8周龄的小鼠BALB/c(雌)的两大腿肌肉中各进行0.12mL的注射，进行免疫(第0日)。由此，在两腿各给药30μgpCI-hCCR7·GroEL，即，每一只一次给药60μg。然后，在第7日、第21日、以及第28日也同样重复免疫。然后，在第0、7、14、21、28、35、42日进行采血，制备血清。作为对照，使用单独表达hCCR7的载体pCI-hCCR7对小鼠进行免疫。

(6)利用流式细胞仪评价对于活性型人CCR7的血清中抗体结合性

将确认了pCIneo-hCCR7被导入并稳定表达的CHO-K1细胞(以下，称为“hCCR7基因导入细胞”。)以及导入了pCIneo的CHO-K1细胞(对照细胞)用PBS清洗。将免疫后第56日的血清稀释500倍，与各细胞一起培育。再用PBS清洗各细胞，作为2次抗体添加藻红蛋白标记抗小鼠IgG抗体(BeckmanCoulter公司)后，使用流式细胞仪FACScalibur(BectonDickinson公司)，解析各细胞与血清中的抗人CCR7抗体的相互作用。

其结果，在使用了导入了人CCR7基因的细胞时，在基因免疫前的血清中几乎没有检测出藻红蛋白，但在基因免疫后的血清中检测出。这表示免疫后的血清中的抗人CCR7抗体与导入了人CCR7基因的细胞结合。另一方面，在使用对照细胞时，在基因免疫后的血清中也没有检测出藻红蛋白。这表示免疫后的血清中的抗人CCR7抗体未与对照细胞结合。

从以上可知，通过由载体pCI-hCCR7·GroEL的基因免疫，小鼠血清中诱导出了特异性识别活性型人CCR7的细胞外结构域的抗体的产生。

(7)抗人CCR7单克隆抗体的制作

对于用与上述(5)同样的程序进行了基因免疫的小鼠6只进行追加免疫。追加免疫的3日后摘出脾脏，制备脾细胞。利用PEG法，将1×10⁸个脾细胞、和1×10⁷个来自BALB/C小鼠的HAT选择性的骨髓瘤SP2/0细胞融合(细胞融合)。将融合的细胞(杂交瘤)的集团悬浮于RPMI培养基中，接种于14枚96孔微孔板的各孔中。在该阶段，得到了约990种杂交瘤。

从细胞融合的第二日开始2周，以每3日一次的频率，将上述微孔板内的培养基置换为添加了HATMediaSupplement(50×)(Sigma公司、型号：H0262)的RPMI培养基。

利用与上述(6)同样的流式细胞仪进行抗体结合评价，研究导入了人CCR7基因的细胞和各孔的杂交瘤培养上清中的抗体的结合性。其结果，在8个孔中确认到了与抗体的结合性。

对于确认了与抗体的结合性的8种杂交瘤，进行利用极限稀释法的克隆。即，对于8种杂交瘤在96孔微孔板中以细胞1个以下/孔的方式接种并培养。2周后，进行同样的流式细胞仪检测，确认了所克隆的培养上清中的抗体(抗人CCR7单克隆抗体)的结合性。其结果，产生抗人CCR7单克隆抗体的8种杂交瘤得到克隆。

对于各杂交瘤在RPMI培养基100mL内进行2周烧瓶培养。将各培养上清供给蛋白质G柱(AmershamBiosciences公司)进行纯化、浓缩，各得到约20mg的纯化的8种抗人CCR7单克隆抗体。

将各杂交瘤保藏于IPOD。各杂交瘤的表示和保藏编号如上所述。

对于各个抗人CCR7单克隆抗体(以下，简单称为“抗人CCR7抗体”。)进行以下所示的试验。在以下的记载中，也将杂交瘤的表示作为抗体名称使用。

(8)利用流式细胞仪评价对于导入了人CCR7基因的细胞的结合性

制备10μg/mL浓度的抗人CCR7单克隆抗体以及小鼠对照IgG(Thermo、阴性对照)的PBS溶液(以下，称为“抗体溶液”。)。另一方面，用PBS清洗导入了人CCR7基因的细胞之后，抗体溶液与细胞一起温育。此外，用PBS清洗细胞，作为2次抗体添加了藻红蛋白标记抗小鼠IgG抗体(BeckmanCoulter公司)，然后使用流式细胞仪FACScalibur(BectonDickinson公司)，解析细胞与抗人CCR7抗体以及小鼠对照IgG的相互作用。结果示于图9、10以及表2。图9是表示导入了人CCR7基因的细胞和小鼠对照IgG的相互作用的解析结果的柱状图。图10是表示导入了人CCR7基因的细胞与抗人CCR7抗体R7-47的相互作用的解析结果的柱状图。表2表示由导入了人CCR7基因的细胞与各抗人CCR7抗体的相互作用的解析结果算出的特异的结合细胞的比例。在图9、10中，纵轴表示细胞数，横轴表示来自藻红蛋白(PE)的荧光强度。另外，在2个区域(area)(M1、M2)中，属于M2(右区域)的细胞表示与抗体结合的细胞。在表2中，特异性结合的细胞的比例由M2/(M1＋M2)表示。

其结果，使用导入了人CCR7基因的细胞的情况，在M2的区域检测出大量细胞(图10、表2)。这表示各抗人CCR7抗体与导入了人CCR7基因的细胞结合。另一方面，使用了小鼠对照IgG的情况(图9)，在M2的区域几乎没有检测出细胞。这表示小鼠对照IgG未与导入了人CCR7基因的细胞结合。从以上表明，所得到的抗人CCR7抗体均为特异性识别活性型人CCR7的细胞外结构域的抗体。

表2

(9)评价细胞内Ca^2＋信号传导抑制活性

将导入了人CCR7基因的细胞以2×10⁴个/100μL的初始细胞浓度，使用96孔微量滴定板培养一昼夜。培养结束后，在各孔中添加10^-6～10^-11M浓度范围内的抗人CCR7抗体。另外，作为对照，也制备将小鼠对照IgG(Thermo公司、阴性对照)同样地以10^-6～10^-11M浓度范围内添加得到的样品。1小时后，测定利用1×10^-7M的CCL21(R&Dsystems公司)刺激各细胞时的细胞内Ca²⁺浓度的瞬时上升的依赖于抗体浓度的减少度。Ca^2＋浓度的测定使用Ca²⁺信号解析装置(FLIPR；MolecularDevices公司)以及细胞内Ca染色试剂盒(Ca3kit；MolecularDevices公司)进行。添加了抗人CCR7抗体R7-47的结果示于图11。图11是表示细胞内Ca²⁺浓度和各添加物的浓度的关系的曲线图。如图11所示，观察到了细胞内Ca²⁺浓度依赖于R7-47的浓度地下降。这表明R7-47竞争性抑制CCL21与人CCR7的结合的结果，使得向细胞内的信号传导受到抑制。算出50%抑制浓度(IC50)，利用R7-47为7.4nM。表3表示R7-47以外的抗人CCR7抗体的IC50。

从以上表明所得到的抗人CCR7抗体均能够阻断通过人CCR7配体的CCR7依赖性细胞内信号传导机制。

表3

抗体名称	50%抑制浓度(IC50)
		R7-01	340nM
R7-02	46nM
		R7-05	94nM
R7-09	32nM
		R7-11	16nM
R7-18	11nM
		R7-25	22nM
R7-47	7.4nM

(10)同种型解析

使用小鼠单克隆抗体同种型鉴定试剂盒(GEHEALTHCARE公司)，确定抗人CCR7抗体的同种型。检测是通过使用了辣根过氧化物酶标记小鼠IgG抗体的三明治ELISA得到的。结果示于表4。

表4

抗体名称	免疫球蛋白抗体同种型
		R7-01	IgG1κ
R7-02	IgG2aλ
		R7-05	IgG2bλ
R7-09	IgG2aλ
		R7-11	IgG1κ
R7-18	IgG1κ
		R7-25	IgG1κ
R7-47	IgG1κ

(11)抗体可变区的cDNA克隆以及互补决定区(CDR)的确定

利用上述8种杂交瘤，克隆编码各抗体的L链以及H链的可变区的DNA，确定其碱基序列。克隆如下进行。首先使用RNeasyMiniKit(QIAGEN公司)从杂交瘤中分离RNA。然后，使用“SMARTer-RACEcDNAAmplificationKit”(TakaraBio株式会社)，按照制造商说明书进行利用5’-RACE法的cDNA合成，并得到PCR产物。作为PCR的3’侧引物，γ链时，使用序列编号87的序列，κ链时使用序列编号88～90的序列，λ链时使用序列编号91的序列。

利用DNALigationkitver.2(TakaraBio株式会社)将所得到的DNA片段插入pT7BlueTVector(Novagen公司)。用该载体转化XL10Gold(Stratagene公司)，接种于含有X-gal、氨苄青霉素、IPTG的平板后，挑取白色菌落。利用各5种含有正常尺寸的插入序列的克隆制备质粒后，使用ABIPRISM3130型自动测序仪确定DNA序列。所确定的序列除了一部分被认为是由PCR误差造成的变异以外，3个克隆都显示相同序列，因此，将该序列作为目的DNA序列。将所得到的碱基序列和对应的氨基酸序列表示为序列编号1(R7-01的VH)、序列编号3(R7-01的VL)、序列编号11(R7-02的VH)、序列编号13(R7-02的VL)、序列编号21(R7-05的VH)、序列编号23(R7-05的VL)、序列编号31(R7-09的VH)、序列编号33(R7-09的VL)、序列编号41(R7-11的VH)和43(R7-11的VL)、序列编号51(R7-18的VH)、序列编号53(R7-18的VL)、序列编号61(R7-25的VH)、序列编号63(R7-25的VL)、序列编号71(R7-47的VH)、序列编号73(R7-47的VL)。

仅将与各碱基序列对应的氨基酸序列表示为序列编号2(R7-01的VH)、序列编号4(R7-01的VL)、序列编号12(R7-02的VH)、序列编号14(R7-02的VL)、序列编号22(R7-05的VH)、序列编号24(R7-05的VL)、序列编号32(R7-09的VH)、序列编号34(R7-09的VL)、序列编号42(R7-11的VH)和44(R7-11的VL)、序列编号52(R7-18的VH)、序列编号54(R7-18的VL)、序列编号62(R7-25的VH)、序列编号64(R7-25的VL)、序列编号72(R7-47的VH)、序列编号74(R7-47的VL)。

对于各VH和VL，鉴定CDR1～3(序列编号5～10、15～20、25～30、35～40、45～50、55～60、65～70、75～80)。参照图1～9和表1。

(12)确认使用了人初代培养细胞的抗人CCR7抗体的结合

从健康人的末梢血中按照常规方法使用Lymphoprep(Axis-Shield公司)分离单核球细胞(PBMC)。将所分离的PBMC悬浮于含有1mg/mL的人γ球蛋白(JacksonImmunoResearchLaboratories公司)的PhosphateBufferedSaline(磷酸盐缓冲液，PBS)溶液中，通过在室温温育30分钟进行封闭。将封闭后的PBMC(3×10⁵个细胞)与各抗人CCR7抗体(0.5μg)或同种型对照抗体(0.5μg)一起在4℃温育1小时。然后，将PBMC用清洗缓冲液(含有0.1%胎牛血清的PBS溶液)清洗3次。接着，作为2次抗体，添加异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗小鼠IgG抗体(BeckmanCoulter公司)，在4℃温育1小时。将该PBMC再次用清洗缓冲液清洗3次之后，使用流式细胞仪(BeckmanCoulter公司制)分析。

使用了R7-47时的流式细胞仪的结果示于图12。图12(a)表示用同种型对照抗体和FITC标记抗小鼠IgG抗体染色的结果，图12(b)表示用R7-47和FITC标记抗小鼠IgG抗体染色的结果。图12(a)，(b)的两个箭头所示的部分分别显示同种型对照抗体和R7-47特异性结合的细胞集团。另外图中的数字表示将分析得到的PBMC的细胞数设为100%时的该细胞集团的比例。

在PBMC中各抗人CCR7抗体特异性结合的细胞的比例示于表5。

表5

抗体名称	特异性结合的细胞的比例
		R7-01	10.8%
R7-02	44.6%
		R7-05	37.3%
R7-09	32.9%
		R7-11	25.5%
R7-18	40.5%
		R7-25	47.0%
R7-47	49.3%

这些结果表明该抗人CCR7抗体识别人天然型CCR7，能够与人天然型CCR7结合。

(13)确认使用了人初代培养细胞的抗人CCR7抗体的功能性

将PBMC(1.6×10⁵细胞)接种于24孔细胞培养插管(Becton·Dickinson公司)的插管中。再添加各抗人CCR7抗体或同种型对照IgG抗体10μg/mL，在室温使其反应5分钟。在细胞培养插管的各孔中添加人重组体CCL21(150ng/mL)。将插管设置在平板上后，在37℃使其反应1.5小时。反应后，除去插管，测定在各孔中游走的细胞数。在表6和表7中表示由该抗体实现的对于依赖于CCL21的细胞游走的功能抑制的结果。

表6

(平均值±标准偏差)

表7

(平均值±标准偏差)

首先，未添加CCL21和添加CCL21的比较表明PBMC的一部分细胞进行CCL21依赖性地细胞游走。而且，即使添加同种型对照(IgG1或者IgG2)抗体，对于CCL21依赖性的细胞游走也没有影响。另一方面，在添加该抗体时，8种抗体全部显著抑制CCL21依赖性的细胞游走。这些结果表明该抗人CCR7抗体的任何一种都抑制人天然型CCR7的功能。

(14)确认抗人CCR7抗体的肺纤维症模型的组织纤维化形成的抑制作用

表达人PBMC中的CCR7的CD14阳性细胞对于肺纤维的纤维化形成是重要的细胞(AbeR,DonnellySC,PengT,BucalaR,MetzCN,"Peripheralbloodfibrocytes:differentiationpathwayandmigrationtowoundsites."JImmunol.2001Jun15;166(12):7556-62；CurnowSJ,FaircloughM,SchmutzC,KissaneS,DennistonAK,NashK,BuckleyCD,LordJM,SalmonM,"Distincttypesoffibrocytecandifferentiatefrommononuclearcellsinthepresenceandabsenceofserum."PLoSOne.2010Mar18;5(3):e9730)。抗人CCR7抗体在肺纤维症中的有效性，能够通过对免疫不全小鼠(例如SCID小鼠)将诱发肺纤维症的刺激物质(例如博莱霉素，Bleomycin)进行给药后，通过调查将表达来自人的CCR7的CD14阳性细胞植入时的该细胞向肺组织的转移来表示。

按照常规方法从健康人的末梢血中分离PBMC。使分离的PBMC再与人CD14标记磁珠(MiltenyiBiotec公司)接触，分离CD14阳性细胞，用于向小鼠的细胞植入。对T细胞和B细胞缺失的SCID小鼠，将在生理食盐水中溶解的博莱霉素(日本化药株式会社、商品名：BLEO)经气道给药使其达到5mg/kg，按照常规方法诱发肺纤维症。将博莱霉素给药日作为第0日，在博莱霉素给药4日前和从给药后第1、4、8、11日，将溶解于生理食盐水的抗人CCR7抗体R7-11、R7-18或R7-47分别以20mg/kg的用量进行腹腔给药。作为对照，将同种型对照IgG以同样的时间安排进行给药。在博莱霉素给药后第4日，用上述的方法分离包含表达CCR7的细胞的人CD14阳性细胞，用PKH26PCL红色荧光细胞接头(linker)试剂盒(Sigma公司)进行荧光标记。从尾静脉对每一只小鼠植入1×10⁶个荧光标记细胞。从博莱霉素给药开始第15日后将小鼠解剖检查，按照常规方法将肺组织用中性福尔马林固定，制作病理切片。用荧光显微镜观察病理组织，在右肺全部视野中对来自被荧光标记的人细胞的细胞数计数。其结果，与给药了同种型对照IgG的小鼠相比，在给药了抗人CCR7抗体的小鼠中，任何一个在肺中荧光标记细胞数均减少。

另外，从通过解剖检查所得到的左肺中，利用TRIzol试剂(Invitrogen公司)提取组织的全部RNA，利用NanoDrop1000(ThermoFisherScientific公司)对提取的RNA量进行定量。对于从各小鼠肺得到的RNA样品2μg，使用HighCapacitycDNAReversetranscriptionkit(AppliedBiosystems公司)进行逆转录反应，利用实时PCR法对所得到的cDNA样品进行肺组织中的人CCR7的mRNA量的测定。利用实时PCR的解析通过TaqManGeneExpressionAssays系统(AppliedBiosystems公司)进行。作为内部标准使用TaqManRibosomalRNAControlReagents(AppliedBiosystems公司)，在人CCR7的检测中使用了Hs01013469_m1的引物对(AppliedBiosystems公司)。所得到的数据通过ΔΔCt法进行解析，通过以给药了同种型对照的组为基准的相对表达量的形式进行评价。其结果，与给药了同种型对照IgG的小鼠相比，在给药了抗人CCR7抗体R7-11、R7-18或R7-47的小鼠中的任何一个中，人CCR7的mRNA量均减少(图13)。该结果反映了该抗人CCR7抗体在肺纤维症中，抑制对于纤维化重要的细胞向肺组织的浸润。这些结果表明该抗CCR7抗体对于肺纤维化治疗有用。

(15)利用基因重组技术制造抗人CCR7抗体

对含有序列编号11所示的DNA的小鼠抗体重链全长的基因进行克隆，并导入至分泌表达用载体pSecTag2(Invitrogen公司)。将该载体命名为pSecTag2-R702HC。同样地对含有序列编号41所示的DNA的小鼠抗体重链全长的基因进行克隆，并导入至分泌表达用载体pSecTag2。将该载体命名为pSecTag2-R711HC。同样地对含有序列编号51所示的DNA的小鼠抗体重链全长的基因进行克隆，并导入分泌至表达用载体pSecTag2。将该载体命名为pSecTag2-R718HC。

对含有序列编号13所示的DNA的小鼠抗体轻链全长的基因进行克隆，并导入至分泌表达用载体pSecTag2。将该载体命名为pSecTag2-R702LC。同样地对含有序列编号43所示的DNA的小鼠抗体轻链全长的基因进行克隆，并导入至分泌表达用载体pSecTag2。将该载体命名为pSecTag2-R711LC。同样地对含有序列编号53所示的DNA的小鼠抗体轻链全长的基因进行克隆，并导入至分泌表达用载体pSecTag2。将该载体命名为pSecTag2-R718LC。

使用LIPOFECTAMINE2000(Invitrogen公司)将pSecTag2-R702HC以及pSecTag2-R702LC导入到HEK293细胞中。将该细胞培养2天。将培养上清供给至Protein-G柱，制备来自杂交瘤R7-02的重组型抗人CCR7抗体。同样地使用LIPOFECTAMINE2000，将pSecTag2-R711HC以及pSecTag2-R711LC导入至HEK293细胞。将该细胞培养2天。将培养上清供给至Protein-G柱，制备来自杂交瘤R7-11的重组型抗人CCR7抗体。同样地使用LIPOFECTAMINE2000，将pSecTag2-R718HC以及pSecTag2-R718LC导入至HEK293细胞。培养该细胞2天。将培养上清供给至Protein-G柱，制备来自杂交瘤R7-18的重组型抗人CCR7抗体。

与上述(6)同样操作，对于导入了人CCR7基因的细胞以及CHO-K1细胞(阴性对照)，使用流式细胞仪确认10μg/mL的各重组型抗人CCR7抗体是否结合。作为荧光2次抗体使用藻红蛋白标记抗小鼠IgG抗体(BeckmanCoulter公司)，作为流式细胞仪使用FACScalibur(BectonDickinson公司)，对各细胞和各重组型抗人CCR7抗体的相互作用进行解析。结果示于图14～16。图14表示使用了来自杂交瘤R7-02的重组型抗人CCR7抗体的结果。图15表示使用了来自杂交瘤R7-11的重组型抗人CCR7抗体的结果。图16表示使用了来自杂交瘤R7-18的重组型抗人CCR7抗体的结果。在图14～16中，(a)为使用了CHO-K1细胞时的二维点阵图(左)和柱状图(右)，(b)为使用导入了人CCR7基因的细胞时的二维点阵图(左)和柱状图(右)。在各二维点阵图中，纵轴表示来自藻红蛋白(PE)的荧光强度，横轴表示来自异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光强度。即，表明任何一种重组型抗人CCR7抗体均与导入了人CCR7基因的细胞结合，但不与CHO-K1细胞结合。这些结果表明，使用基因重组的方法，能够以小鼠型抗体、嵌合型抗体、人源化抗体、抗体的功能性片段等的形式生产本发明的抗体。

Claims

1.一种抗人CCR7抗体，其具有阻断活性，所述阻断活性为不通过依赖补体的细胞溶解作用或者依赖抗体的细胞毒性作用，而通过刺激CCR7配体来阻断依赖CCR7的细胞内信息传导机制，且，所述抗人CCR7为与人CCR7的细胞外结构域特异性结合的抗人CCR7抗体，其互补决定区1～3(CDR1～3)的氨基酸序列满足下述(B5)、(B6)、(B8)中的任意一项：

(B5)具有

序列编号45所示的氨基酸序列的重链CDR1、

序列编号46所示的氨基酸序列的重链CDR2、

序列编号47所示的氨基酸序列的重链CDR3，

具有

序列编号48所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

序列编号49所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

序列编号50所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B6)具有

序列编号55所示的氨基酸序列的重链CDR1、

序列编号56所示的氨基酸序列的重链CDR2、

序列编号57所示的氨基酸序列的重链CDR3，

具有

序列编号58所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

序列编号59所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

序列编号60所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(B8)具有

序列编号75所示的氨基酸序列的重链CDR1、

序列编号76所示的氨基酸序列的重链CDR2、

序列编号77所示的氨基酸序列的重链CDR3，

具有

序列编号78所示的氨基酸序列的轻链CDR1、

序列编号79所示的氨基酸序列的轻链CDR2、以及

序列编号80所示的氨基酸序列的轻链CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗人CCR7抗体，其满足下述(C5)、(C6)、(C8)中的任意一项：

(C5)具有序列编号42所示的氨基酸序列的重链可变区以及序列编号44所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(C6)具有序列编号52所示的氨基酸序列的重链可变区以及序列编号54所示的氨基酸序列的轻链可变区；

(C8)具有序列编号72所示的氨基酸序列的重链可变区以及序列编号74所示的氨基酸序列的轻链可变区。

3.根据权利要求1或2所述的抗人CCR7抗体，其为人源化抗体或嵌合抗体。

4.根据权利要求1或2所述的抗人CCR7抗体，其为抗体片段、单链抗体或双抗体。

5.根据权利要求3中所述的抗人CCR7抗体，其为抗体片段、单链抗体或双抗体。

6.一种抗人CCR7抗体，其为与人CCR7的细胞外结构域特异性结合的抗人CCR7抗体，由以R7-11(FERMBP-11373)、R7-18(FERMBP-11374)或R7-47(FERMBP-11376)为特征的杂交瘤产生，且，具有阻断活性，所述阻断活性为不通过依赖补体的细胞溶解作用或者依赖抗体的细胞毒性作用，而通过刺激CCR7配体来阻断依赖CCR7的细胞内信息传导机制。

7.一种杂交瘤，其为R7-11(FERMBP-11373)、R7-18(FERMBP-11374)或R7-47(FERMBP-11376)。

8.一种核酸，其编码权利要求1、2、5或6所述的抗人CCR7抗体的重链可变区或轻链可变区。

9.一种核酸，其编码权利要求3中所述的抗人CCR7抗体的重链可变区或轻链可变区。

10.一种核酸，其编码权利要求4中所述的抗人CCR7抗体的重链可变区或轻链可变区。

11.根据权利要求8所述的核酸，其由序列编号41、序列编号43、序列编号51、序列编号53、序列编号71或序列编号73所示的碱基序列构成。

12.一种包含权利要求8所述的核酸的载体。

13.一种载体，其包含权利要求9～11中任一项所述的核酸。

14.一种导入有权利要求12所述的载体的细胞。

15.一种导入有权利要求13所述的载体的细胞。

16.一种医药组合物，包括：

权利要求1、2、5或6所述的抗人CCR7抗体，以及，

药学上可接受的载体。

17.一种医药组合物，包括：

权利要求3所述的抗人CCR7抗体，以及，

药学上可接受的载体。

18.一种医药组合物，包括：

权利要求4所述的抗人CCR7抗体，以及，

药学上可接受的载体。

19.根据权利要求16所述的医药组合物，用于治疗组织的纤维化。

20.根据权利要求17或18所述的医药组合物，用于治疗组织的纤维化。

21.根据权利要求19所述的医药组合物，其中，所述组织的纤维化为选自肝纤维症、肾纤维症、肺纤维症、皮肤纤维症、心血管纤维症、消化管纤维症以及其他纤维性疾患中的纤维症。

22.根据权利要求20所述的医药组合物，其中，所述组织的纤维化为选自肝纤维症、肾纤维症、肺纤维症、皮肤纤维症、心血管纤维症、消化管纤维症以及其他纤维性疾患中的纤维症。

23.根据权利要求21或者22所述的医药组合物，其中，所述肝纤维症选自肝硬化、缺血再灌注、肝移植后损伤、坏死性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、原发性胆汁性肝硬化以及原发性硬化性胆管炎。

24.根据权利要求23所述的医药组合物，其中，所述肝硬化是选自由酒精诱发、由药物诱发以及化学诱发中的至少一种造成的肝硬化。

25.根据权利要求21或者22所述的医药组合物，其中，所述肾纤维症选自增生性肾小球肾炎、硬化性肾小球肾炎、肾源性纤维化性皮肤病、糖尿病性肾病、肾小管间质性纤维症以及局灶节段性肾小球硬化症。

26.根据权利要求21或者22所述的医药组合物，其中，所述肺纤维症选自肺间质性纤维症、药物诱发结节病、肺纤维症、特发性肺纤维症、哮喘、慢性阻塞性肺病、弥漫性肺泡损伤疾病、肺高血压症以及新生儿支气管肺发育不良。

27.根据权利要求21或者22所述的医药组合物，其中，所述皮肤纤维症选自硬皮病、瘢瘤性疤痕、银屑病、增生性疤痕以及假性硬皮病。

28.根据权利要求21或者22所述的医药组合物，其中，所述心血管纤维症选自动脉粥样硬化、冠状动脉再狭窄、充血性心肌病、心脏衰竭、心脏移植以及心肌纤维症。

29.根据权利要求21或者22所述的医药组合物，其中，所述消化管纤维症选自胶原性结肠炎、绒毛萎缩、隐窝增生、息肉形成、克罗恩病的纤维症、胃溃疡愈合以及腹腔粘连术后瘢痕。

30.根据权利要求21或者22所述的医药组合物，其中，所述纤维症具有从与骨关联的纤维化性疾病产生的状态，为类风湿性血管翳形成。

31.一种抗体固定化担载体，其是通过将权利要求1、2、5或6所述的抗人CCR7抗体固定于担载体而形成的。

32.一种抗体固定化担载体，其是通过将权利要求3所述的抗人CCR7抗体固定于担载体而形成的。

33.一种抗体固定化担载体，其是通过将权利要求4所述的抗人CCR7抗体固定于担载体而形成的。

34.根据权利要求31所述的抗体固定化担载体，其用于与含有CCR7表达细胞的血液接触从而从所述体液中除去CCR7表达细胞。

35.根据权利要求32或33所述的抗体固定化担载体，其用于与含有CCR7表达细胞的血液接触从而从所述体液中除去CCR7表达细胞。