CN106170496B - 针对纤连蛋白-eda的免疫球蛋白样分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗、预防由心肌梗塞或压力负荷过大导致或与其相关的病症和不良心脏重塑，如心力衰竭、动脉瘤形成、和远端心肌纤维化或防止其发展以及用于优选在缺血性损伤后改善血管发生的免疫球蛋白(Ig)‑样分子或其片段。本发明还提供了编码所述Ig‑样分子的核酸、包含其的载体、和包含其的宿主细胞。

Description

针对纤连蛋白-EDA的免疫球蛋白样分子
技术领域
本发明的涉及医学领域，且具体是心脏血和血管发生领域。本发明提供了特异性结合纤连蛋白-EDA的EDA-结构域的免疫球蛋白(Ig)样分子，如抗体，及其抗原结合片段。这些Ig-样分子特别适于治疗、预防不良心脏或血管重塑以及心肌梗塞相关并发症或防止其发展并且改善或刺激血管发生。本发明还涉及包含Ig-样分子，例如抗体或其抗原结合片段的药物组合物以及使用Ig-样分子，例如抗体或其抗原结合片段治疗、预防心肌梗塞相关并发症和不良心脏或血管重塑或防止其发展并且改善或刺激血管发生的方法。
背景技术
缺血性心脏病是西方社会最大的社会经济负担。在像中国和印度的发展中国家的快速现代化的时代中，这甚至成为更大的问题。缺血性心脏病的最严重和急性并发症是心脏病发作，也称为心肌梗塞。在美国、欧盟和日本，每年有240万患者患有心肌梗塞。每年在美国和欧盟仅治疗缺血性心脏病所花费的钱超过1500亿欧元。不幸的是，心肌梗塞相关的并发症或病症正在增加，因为越来越多的患者在初始威胁生命的梗塞中存活，但是之后逐渐有更差的心脏功能。心肌梗塞后的并发症，如心力衰竭、纤维化和心律失常导致高死亡率和发病率。这些并发症的最重要决定因素是不当的心脏修复反应，成为不良(心脏)重塑或不良血管重塑。
心力衰竭(HF)获得许多注意，因为其是心肌梗塞之后不良重塑的最严重和最常见结果。欧洲心脏协会(ESC)声明“HF在西方社会中是21世纪的瘟疫”。仅在美国、欧盟和日本，每年至少180万患者由于新诊断的梗塞相关的HF而住院。诊断后一年内的死亡率为20％，5年内50％死亡。存活者的生活质量受到严重影响，因为它们有逐渐减少的运动耐量和降低的进行正常日常活动的能力。由于1)减少的运动耐量和之后减少的生产能力，2)昂贵的医疗治疗，其不是预防或治愈性的，但是减少症状，和3)再次住院治疗的结果，仅在美国和欧盟，每年社会经济负担接近600亿欧元。
心肌梗塞的现有疗法目标在于恢复血液流过阻塞的冠状动脉。抗血栓药(即，防止血栓形成的药物)与支架一起是在心肌梗塞后恢复血液流动的最重要的药物和装置类别。尽管在血液流动恢复中有这些进展，梗塞相关的并发症仍然出现并且日益增加。主要原因在于不良重塑是与血液流动恢复完全不同的病理生理过程。
梗塞的心脏的愈合是涉及许多细胞类型的复杂过程。心肌梗塞是急性事件，其中部分心肌死亡，导致泵送功能丧失。在这一急性事件之后，在血液和心肌中马上诱导修过过程，特征为强化的炎症。然而，炎症类型决定了梗塞的心脏是否适当修复并重塑。驱动更合适的愈合和有害炎症的关键因素是由与心脏死亡和基质降解相关的分子活化先天免疫。在许多患者中，免疫系统以不利的方式活化，导致心肌梗塞后心脏的不当愈合。在这些情况中，心脏将进入称为不良重塑的过程。不良重塑有多个有害结果：心力衰竭、心脏扩张和纤维化、扰乱的收缩和舒张、以及扰乱的电活化是已知的并发症。梗塞相关的发病率，如心力衰竭的增加强调了对强化梗塞后心脏修复的新疗法的需要。有助于梗塞的心脏愈合，尤其在心肌梗塞后的早期中的另一因素是血管发生。微血管从头形成具有在心肌信息后的早期恢复缺血性心肌的潜力，导致防止转化成心力衰竭。
白细胞引起有害的炎性反应的主要决定因素是纤连蛋白-EDA的沉积。在心肌梗塞之后，纤连蛋白-EDA被新合成并且在梗塞的心肌中瞬时上调。纤连蛋白-EDA可活化面积系统和其他参与基质周转的细胞，从而诱导参与心脏修复的细胞(例如，白细胞、淋巴细胞和成纤维细胞)的迁移和分化。然后，纤连蛋白-EDA活化的细胞在愈合中的心脏中诱导有害的炎性反应。
细胞纤连蛋白是ECM中存在的多功能粘附糖蛋白并且由细胞响应随MI出现的组织损伤而产生。其含有交替剪接的编码III型重复外结构域A(EIIIA；EDA)的外显子，其作用是TLR2和TLR4以及整联蛋白α4β1、α4β7和α9β1的内源性配体。在体外，纤连蛋白-EDA诱导促炎性基因表达并活化单核细胞。纤连蛋白-EDA在鼠关节中的体内注射导致强化的炎症。纤连蛋白-EDA通常在健康人组织中不表达，但是在胚胎发生期间并在几个(病理性)病症如(心脏)缺血性组织、动脉粥样硬化病灶、纤维化组织、肿瘤、移植排斥和伤口中新发展的血管中高度上调。脑缺血后，EDA的过表达导致强化的炎症和损伤。因此，纤连蛋白-EDA能够活化白细胞并且导致细胞因子和趋化因子的上调。最近显示，与野生型小鼠相比，在心肌梗塞后，纤连蛋白-EDA敲除小鼠显示减少的纤维化、保留心脏功能和减少的心室膨胀(Arslan F.等，Circ.Res.，2011年3月；108：582-592)。
WO2012/057613描述了用针对纤连蛋白-EDA的EDA结构域的抗体处理小鼠在所述小鼠中防止左心室膨胀并且改善心肌梗塞后的存活率。
本领域仍然需要能够在对象中治疗、预防心肌梗塞相关病症或防止其发展并增加对象心肌梗塞后存活机会的抗体。本发明的目的是提供这类抗体。
发明内容
本发明提供了与氨基酸序列GIXXXF(SEQ ID NO：1)特异性结合的分离的免疫球蛋白(Ig)-样分子或其抗原结合片段，其中X可以是任意氨基酸。
在一个实施方式中，SEQ ID NO：1的3位处的氨基酸选自组氨酸、精氨酸、赖氨酸和丙氨酸，并且优选是组氨酸。
在一个实施方式中，SEQ ID NO：1的4位处的氨基酸选自谷氨酸和丙氨酸，并且优选是谷氨酸。
在一个实施方式中，SEQ ID NO：1的5位处的氨基酸选自亮氨酸和丙氨酸，并且优选是亮氨酸。
在一个实施方式中，Ig-样分子或其片段特异性结合氨基酸序列GIHELF(SEQ IDNO：2)。
本发明提供了与氨基酸序列LFPAP(SEQ ID NO：28)特异性结合的分离的免疫球蛋白(Ig)-样分子或其抗原结合片段。
Ig-样分子或其抗原结合片段可以是抗体，例如，单克隆抗体。Ig-样分子或其抗原结合片段可以是鼠源，例如，可来自小鼠。Ig-样分子或其抗原结合片段可以是嵌合的、人源化的或人的。
本发明还涉及Ig-样分子或其抗原结合片段，包含含有互补决定区(CDR)1、CDR2、和CDR3的重链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或有至多2个优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：3所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列或有至多2个优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：4所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ IDNO：5所示氨基酸序列或有至多3个优选至多2个更优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：5所示氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明涉及包含重链可变区的Ig-样分子或其抗原结合片段，重链可变区包含：
-具有氨基酸序列GYSIX1SGYSWH的CDR1，其中X1选自T和A；
-具有氨基酸序列YIHX2SGX3ANYNPSLKS的CDR2，其中X2选自Y和F，并且其中X3选自S和I；
-具有氨基酸序列EX4X5GX6FDY的CDR3，其中X4选自K和A，X5选自T和R，并且X6选自F和Y。
本发明还涉及Ig-样分子或其抗原结合片段，包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的轻链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列或有至多3个，优选至多2个，更优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：6所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：7所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ IDNO：8所示氨基酸序列或有至多3个，优选至多2个，更优选至多1个氨基酸被取代的SEQ IDNO：8所示氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供包含轻链可变区的Ig-样分子或其抗原结合片段，轻链可变区包含：
-具有氨基酸序列RSSQSX7VX8SNGNTYLX9的CDR1，其中X7选自L和I，X8选自H和R，并且X9选自H和T；
-具有氨基酸序列KVSNRFS的CDR2；
-具有氨基酸序列X10QX11X12HVPPT的CDR3，其中X10选自S和F，X11选自S和G，并且X12选自A和S。
本发明还涉及Ig-样分子或其抗原结合片段，包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的重链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：3所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：4所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或有至多3个，优选至多2个，更优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；和含有CDR1、CDR2、和CDR3的轻链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列或有至多3个，优选至多2个，更优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：6所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ IDNO：7所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或有至多3个，优选至多2个，更优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。
在一个实施方式中，这种Ig-样分子或抗原结合片段包含重链可变区，重链可变区包含
-具有氨基酸序列GYSIX1SGYSWH的CDR1，其中X1选自T和A；
-具有氨基酸序列YIHX2SGX3ANYNPSLKS的CDR2，其中X2选自Y和F，并且其中X3选自S和I；
-具有氨基酸序列EX4X5GX6FDY的CDR3，其中X4选自K和A，X5选自T和R，并且X6选自F和Y；
和轻链可变区，包含：
-具有氨基酸序列RSSQSX7VX8SNGNTYLX9的CDR1，其中X7选自L和I，X8选自H和R，并且X9选自H和T；
-具有氨基酸序列KVSNRFS的CDR2；
-具有氨基酸序列X10QX11X12HVPPT的CDR3，其中X10选自S和F，X11选自S和G，并且X12选自A和S。
在一个实施方式中，Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，重链可变区包含：
-具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的CDR3；
和轻链可变区，包含：
-具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的CDR3。
优选地，所述Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的重链可变区的人源化重链可变区以及具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的轻链可变区的人源化轻链可变区。
在另一个实施方式中，Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，重链可变区包含：
-具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的CDR3；
和轻链可变区，包含：
-具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的CDR3。
优选地，所述Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的重链可变区的人源化重链可变区以及具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的轻链可变区的人源化轻链可变区。
在另一个实施方式中，Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，重链可变区包含：
-具有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：17所示氨基酸序列的CDR3；
和轻链可变区，包含：
-具有SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：20所示氨基酸序列的CDR3。
优选地，所述Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变区的人源化重链可变区以及具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的轻链可变区的人源化轻链可变区。
本发明还提供Ig-样分子或其抗原结合片段，其包含含有互补决定区(CDR)1、CDR2、和CDR3的重链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：29所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：29所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：30所示氨基酸序列，并且CDR3具有氨基酸序列SHY。
本发明还提供Ig-样分子或其抗原结合片段，包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的轻链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：31所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：31所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：32所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ ID NO：33所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：33所示氨基酸序列。
在一个实施方式中，Ig-样分子或其抗原结合片段包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的重链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：29所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：29所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：30所示氨基酸序列，并且CDR3具有氨基酸序列SHY；并且还包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的轻链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：31所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：31所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：32所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ ID NO：33所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：33所示氨基酸序列。在一个实施方式中，Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，重链可变区包含：
-具有SEQ ID NO：29所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：30所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有氨基酸序列SHY的CDR3；
和轻链可变区，包含：
-具有SEQ ID NO：31所示氨基酸序列的CDRl；
-具有SEQ ID NO：32所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：33所示氨基酸序列的CDR3。
优选地，所述Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列的重链可变区的人源化重链可变区以及具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列的轻链可变区的人源化轻链可变区。
在一个实施方式中，轻链和/或重链的CDR被整合到人衍生的框架区中。
Ig-样分子或其抗原结合片段可以是抗体，例如，嵌合抗体或人源化抗体。
本发明还提供编码本文所述的Ig-样分子或其抗原结合片段的核酸分子，和包含这种核酸分子的载体。这种载体可以是基因治疗载体。
另外，本发明提供包含本文所述的核酸分子或本文所述的载体的宿主细胞。宿主细胞可以是哺乳动物宿主细胞。宿主细胞可以是杂交瘤。
本发明还提供包含选自下组的药剂以及药学上可接受的运载体的药物组合物：(a)本文所述的Ig-样分子或其抗原结合片段，(b)编码Ig-样分子或其抗原结合片段的核酸分子，(c)包含这种核酸分子的载体和(d)包含这种核酸分子或这种载体的宿主细胞。
本发明还提供用作药物的本文所述的Ig-样分子或其抗原结合片段或药物组合物，尤其用于治疗、预防不良心脏重塑和由心肌梗塞和/或压力负荷过大导致或与之相关的病症或防止其发展，或用于治疗或预防不良组织重塑，尤其是纤连蛋白-EDA介导的不良组织重塑。
本发明还提供了治疗、预防由心肌梗塞和/或压力负荷过大导致或与之相关的病症和不良心脏重塑或防止其发展的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的选自下组的药剂：(a)本文所述的Ig-样分子或其抗原结合片段，编码Ig-样分子或其抗原结合片段的核酸分子，(c)包含这种核酸分子的载体和(d)包含这种核酸分子或这种载体的宿主细胞。对象可以是人。
本发明还提供用于改善血管生成的结合纤连蛋白-EDA的抗体或其抗原结合片段以及用于改善血管生成的方法，该方法包括向有此需要的对象给予治疗有效量的结合纤连蛋白-EDA的抗体或其抗原结合片段。对象可以是人。
发明详述
免疫球蛋白样分子、抗体及其抗原结合片段
在第一方面，本发明涉及特异性结合氨基酸序列GIXXXF(SEQ ID NO：1)或氨基酸序列LFPAP(SEQ ID NO：28)的分离的Ig-样分子或其抗原结合片段，其中X可以是任意氨基酸。
本文所用术语“分离的”是指基本或大致不含其在自然中通常伴随的组分的物质。
本文所用术语“免疫球蛋白”(缩写为“Ig”)为本领域熟知并且等同于术语“抗体”。本文所用术语“Ig-样分子”是指包含具有至少一个互补决定区(CDR)的抗原结合位点的任何多肽。该术语包括，但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体、和单链抗体(例如，VHH)。术语“Ig-样分子”还包括抗体片段，如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、dAb，和包含保留抗原结合功能CDR的其他抗体片段或其他构建体。通常，这类片段包含抗原结合结构域。Ig-样分子或其抗原结合片段可以是任意已知的抗体同种型及其构象，例如，IgA，如IgA1或IgA2，IgD，IgE，IgG，如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4，或IgM类，或者可以任意组合构成其混合物，如IgG1和IgG2a类的抗体的混合物。在优选的实施方式中，Ig-样分子、抗体或抗原结合片段是IgG4同种型，更优选具有减少的链内键解离的稳定化的IgG4，其产生较高水平的IgG4半分子。
免疫球蛋白或抗体是免疫系统相关蛋白质。各抗体由4条多肽组成-2条重链和2条轻链接合形成“Y”形分子。“Y”的顶端中的氨基酸序列在不同抗体之间显著不同。由110-130个氨基酸组成的这一可变区给予抗体其结合抗原的特异性。可变区包括轻链和重链末端。恒定区决定了用于破坏抗原的机制。抗体基于它们的重链恒定区结构和免疫功能分成5个主要类型，IgM、IgG、IgA、IgD、和IgE。重链的亚型也是已知的。例如，人中的IgG重链可以是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型中的任一种。
可变区细分成超变区(HV)和框架(FR)区。HV区在给定位置上相对于该位置中最常见的氨基酸有高比例的不同氨基酸。在轻链和重链内，存在3个HV区-HV 1、2和3。具有更稳定氨基酸序列的4个FR区将HV区分开。HV区直接接触抗原表面的部分。出于该原因，HV区有时也指互补决定区，或CDR。FR区形成β折叠结构，其用作支架以将HV区保持在接触抗原的位置上。
本文所用术语“抗原”是指特异性结合至相应抗体的目标分子。抗原通常存在多个可用作特定抗体的相互作用点的表面特征。任何这种表面特征可构成表位。因此，大多数抗原具有被多种不同抗体结合的潜力，其各自可结合至不同表位。
本文所述的Ig-样分子、抗体或抗原结合片段能够结合至纤连蛋白-EDA或仅纤连蛋白-EDA的EDA结构域或纤连蛋白-EDA的EDA结构域的部分如特定氨基酸区，尤其是氨基酸序列GIXXXF，其中X可以是任意氨基酸，如SEQ ID NO：1所示，或氨基酸序列LFPAP(SEQ IDNO：28)。
在本发明中，术语“抗原结合片段”理解为本文所述的Ig-样分子，例如抗体的部分或一部分，其至少包含特异性结合至SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：28所示氨基酸序列的结构域。可通过化学或酶处理完整或整个Ig-样分子，例如抗体来获得抗原结合片段。或者，可使用标准分子生物学技术和方案来获得抗原结合片段。Ig-样分子的抗原结合片段的非限制性示例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；双抗体；线性抗体和单链抗体分子。
在一个实施方式中，抗原结合片段包含Ig-样分子的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、或至少150个连续氨基酸残基，该Ig-样分子特异性结合至纤连蛋白-EDA的EDA结构域，如本文所述，优选特异性结合至纤连蛋白-EDA的EDA结构域的抗体的N-端部分，更优选结合至SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2和/或28所示的氨基酸序列。抗原结合片段优选保留Ig-样分子的抗原结合特异性。
在一个优选的实施方式中，抗原结合片段包含重链和轻链的全部三个CDR，即，CDR1、CDR2和CDR3。在一个更为优选的实施方式中，抗原结合片段包含重链和轻链的整个可变结构域。
优选地，Ig-样分子，例如抗体或其抗原结合片段特异性结合至纤连蛋白-EDA的EDA结构域。在一个优选的实施方式中，Ig-样分子，例如抗体或其抗原结合片段特异性结合至纤连蛋白-EDA的EDA结构域，其中所述部分具有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。本文所用的“结合至纤连蛋白-EDA的抗体或其抗原结合片段”是指特异性结合至纤连蛋白的EDA结构域的抗体或其抗原结合片段。这种抗体或片段并不结合缺少III型重复外结构域A(EIIIA；EDA)的纤连蛋白。
本领域技术人员知道术语“特异性结合”的含义。本文所用术语“特异性结合”表示本文所述的Ig-样分子或抗体或其片段显示出对抗原或特定表位的明显结合亲和性，并且优选不显示显著的交叉反应性。“明显”结合亲和性包括以至少106M-1，优选至少107M-1，更优选至少108M-1，更优选至少109M-1，或甚至更优选至少1010M-1的亲和性结合。“不显示显著的交叉反应性”的抗体是不会明显结合至其中不存在纤连蛋白-EDA表达的不希望实体或组织的抗体。可按照任何本领域公认的确定这种结合的方式来确定特异性结合。例如，可按照斯卡查德(Scatchard)分析和/或竞争性结合试验或本领域接受的其他试验确定特异性结合。
在本发明的一个实施方式中，本文所述的Ig-样分子是抗体，优选单克隆抗体。术语“单克隆抗体”为本领域熟知。其理解为指代作为单一克隆的抗体产生细胞的产物的抗体。通常通过将通常短寿的产生抗体的B细胞融合至快速生长细胞，如癌细胞(有时称为“永生”细胞)来制备单克隆抗体。所得的杂交细胞或杂交瘤快速复制，产生能够产生抗体的克隆。可通过多种常规技术来产生单克隆抗体。
本文所述的Ig-样分子，抗体或其抗原结合片段可以是任何免疫球蛋白同种型，如IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE。在一个优选的实施方式中，本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段是IgG，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选IgG4。
在一个实施方式中，本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段来自哺乳动物来源，如来自人、非人灵长类、绵羊、兔、猪、狗、马、牛、鸡和鼠以及其他哺乳动物。
本文所述的抗体或其抗原结合片段也可以是杂交抗体，例如，嵌合或人源化单克隆抗体。在本发明中，术语“杂交抗体”指其中该抗体的一个或多个区来自源于第一物种(例如小鼠)的抗体并且该抗体的一个或多个区来自源于第二不同物种(例如人)的抗体的抗体。在嵌合抗体中，通常抗体的非人(例如，小鼠)恒定区被人恒定区取代。
人源化抗体被理解为指代其中重链和轻链中的至少一个经人源化的抗体，即，重链和轻链中的至少一个包含可变区，其中构架区中的一个或多个，优选全部主要是人的。人源化抗体的超变区(CDR)可来自非人源，通常是啮齿类(例如小鼠)。人源化抗体可任选地包含Ig恒定区(Fc)，优选人Ig分子的Ig恒定区的至少一部分。
可通过本领域熟知的方法制备嵌合和人源化抗体，该方法包括CDR接枝方法(参见例如，美国专利号5,843,708、6,180,370、5,693,762、5,585,089、5,530,101)、链改组策略(参见例如，美国专利号5,565,332；Rader等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95：8910-8915)、分子建模策略(美国专利号5,639,641)等。例如，基于非人抗体的CDR长度和3D模型来选择最佳拟合的重链和轻链。随后，鉴定人和非人抗体之间不同并且可能影响抗原结合的构架区中的氨基酸。人源化抗体或其抗原结合片段的使用可最小化或消除人中免疫排斥或其他不良免疫应答的出现或风险。另外，通常，由于与非人抗体比较时减少的清除，当使用嵌合、人源化或人抗体时实现循环中更长的半衰期。
在一个特别优选的实施方式中，本发明的抗体是人源化抗体。本发明的人源化抗体优选包含人重链和轻链恒定区，并且更优选还包含人重链和轻链构架区。例如，本发明提供了鼠抗体27A12.70和33E3.10的人源化抗体。种系基因VK2-29和JK4用作人源化抗体27A12.70的轻链的受体序列并且种系基因VH4-31和JH4用作人源化抗体27A12.70的重链的受体序列。SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35分别提供了人源化抗体27A12.70的重链和轻链序列。种系基因VK1-12和JK4用作人源化抗体33E3.10的轻链的受体序列并且种系基因VH3-23和JH4用作人源化抗体33E3.10的重链的受体序列。SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37分别提供了人源化抗体33E3.10的重链和轻链序列。
本发明的特别优选的抗体是IgG4亚型的人源化抗体。本领域已知IgG4抗体在体内与其他IgG亚型抗体有不同表现。IgG4分子同时以已经形成重链间二硫键的形式和键之一或两者尚未形成的形式出现。重链间二硫键缺少的IgG4形式由一条重链和一条轻链组成，其也称为半分子。其被认为是IgG4铰链区的核心序列中IgG4的这种挠性的原因。该区由Cys-Pro-Ser-Cys组成，其中IgG1和IgG2中的相应序列是Cys-Pro-Pro-Cys。IgG4挠性的结果在于体内IgG4以多种形式存在，包括半分子、单特异性抗体和双特异性抗体，其由于2个IgG4分子以不同的抗原特异性结合而形成。对于抗体的治疗性用途，因为需要抗体的体内稳定性，半分子和双特异性抗体的形成是不利的。因此，已经设计稳定化的IgG4分子，其具有减少的体内半分子形成和交换。在一个优选的实施方式中，本发明的人源化IgG4抗体是稳定化的IgG4抗体。本文所用术语“稳定化的IgG4抗体”是指已经修饰以减少半分子形成和交换的IgG4抗体。合适的稳定化的IgG4抗体的示例是抗体，其中在人IgG4的重链恒定区中409位处的精氨酸(Kabat编号，Kabat等，《免疫上感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences ofProteins of Immunological interest)，第5版，公共健康服务部(Public HealthServices)，国立卫生研究院(National Institutes of Health)，马里兰州贝塞斯达，1991)被赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸取代，和/或其中IgG4的铰链区包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。具有抗体27A12.70的重链和轻链CDR的优选人源化IgG4的重链和轻链的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，并且具有抗体33E3.10的重链和轻链CDR的优选人源化IgG4的重链和轻链的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37。这些优选的稳定化IgG4重链和轻链中的一个或多个的恒定区和构架区的氨基酸序列在用于人源化本文公开的其他抗体的优选实施方式中。
因此，本文提供了特异性结合至SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链具有SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列并且所述轻链具有SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列。还提供了特异性结合至SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链具有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列并且所述轻链具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列。
还提供了特异性结合至SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：28所示氨基酸序列的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含重链和轻链，其中所述重链包含人源化可变区，其包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：36所示IgG4重链的构架区中的一个或多个，优选全部；并且其中所述轻链包含人源化可变区，其包含SEQ ID NO：35或SEQ IDNO：37所示IgG4轻链的构架区中的一个或多个，优选全部。还提供了特异性结合至SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：28所示氨基酸序列的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：36所示IgG4重链的恒定区(优选SEQ ID NO：34的氨基酸118-444或SEQ ID NO：36的氨基酸112-438)，并且所述轻链包含SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37所示IgG4轻链的恒定区(优选SEQID NO：35的氨基酸114-219或SEQ ID NO：37的氨基酸109-214)。此外，所述重链和/或轻链可包含可变区，其包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：36所示IgG4重链的构架区中的一个或多个，优选全部；和/或可变区，其包含SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37所示IgG4轻链的构架区中的一个或多个，优选全部。所述抗体还优选包含抗体27A12.70、29E7.35、17G8.72或33E3.10的重链和轻链CDR。CDR序列示于SEQ ID NO：3-8(27A12.70)、SEQ ID NO：9-14(29E7.35)、SEQ ID NO：15-20(17G8.72)和SEQ ID NO：29-33(33E3.10)。
因此，还提供了用于改善血管生成，优选用于改善缺血性组织、纤维化组织、压力负荷过大病症、伤口组织中和/或器官或组织移植后的血管生成的结合纤连蛋白-EDA的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段特异性结合至SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，其中所述抗体或其片段包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：36所示的IgG4重链的恒定区并且所述轻链包含SEQ IDNO：35或SEQ ID NO：37所示的IgG4轻链的恒定区。此外，所述重链和/或轻链优选可同时包含可变区，其包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：36所示IgG4重链的构架区中的一个或多个，优选全部；和/或可变区，其包含SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37所示IgG4轻链的构架区中的一个或多个，优选全部。所述抗体还优选包含抗体27A12.70、29E7.35、17G8.72或33E3.10的重链和轻链CDR。
在一个方面中，本文所述的Ig-样分子或其抗原结合片段特异性结合至氨基酸序列GIXXXF(SEQ ID NO：1)，其中X可以是任意氨基酸。
在一个实施方式中，SEQ ID NO：1的3位处的氨基酸可以是任意氨基酸。或者，SEQID NO：1的3位处的氨基酸可选自组氨酸、精氨酸、赖氨酸和丙氨酸。更优选地，SEQ ID NO：1的3位处的氨基酸是组氨酸。
类似地，SEQ ID NO：1的4位处的氨基酸可以是任意氨基酸。SEQ ID NO：1的4位处的氨基酸优选选自谷氨酸和丙氨酸。在一个优选的实施方式中，SEQ ID NO：1的4位处的氨基酸是谷氨酸。
SEQ ID NO：1的5位处的氨基酸可以是任意氨基酸。优选地，SEQ ID NO：1的5位处的氨基酸是选自亮氨酸和丙氨酸的小氨基酸。在一个优选的实施方式中，SEQ ID NO：1的5位处的氨基酸是亮氨酸。
在一个更优选的实施方式中，Ig-样分子或其抗原结合片段特异性结合至氨基酸序列GIHELF(SEQ ID NO：2)。发明人发现本文所述的Ig-样分子或其片段以高亲和性结合至SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。发明人还发现本文所述的Ig-样分子、抗体及其片段导致心肌梗塞后存活率增加和心脏功能改善。还发现还优选本文所述的Ig-样分子、抗体及其片段，因为它们不干扰心脏组织中的肌成纤维细胞并且不干扰胶原蛋白产生。这是优选的，因为在该组织中具有牢固的基于胶原蛋白的疤痕对于防止梗塞区域的破裂而言是重要的。如实施例5所示，用本发明的结合纤连蛋白-EDA抗体处理并不影响合适的疤痕形成。另外，发现抗纤连蛋白-EDA处理延缓无细胞基质的清除。这种临时无细胞基质的形成对于MI后的疤痕形成和无活力组织的血流动力学补偿而言是关键的。在伤口愈合期间，临时基质缓慢降解并且被基于胶原蛋白的牢固疤痕取代。
在非缺血条件下，没有EDA也在小鼠中心脏压力负荷过大之后保护免受不良重塑。心脏功能和心/体重(心力衰竭和后续堵塞程度的标志)在EDA缺陷型小鼠中显著改善。这些数据证明压力负荷过大病症(例如，高血压、瓣膜病和非缺血性心肌病)中的抗-EDA处理是有治疗价值的。
本发明还提供Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，包含含有互补决定区(CDR)1、CDR2、和CDR3的重链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：3所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：4所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或有至多3个，如至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQID NO：5所示氨基酸序列。
例如，发现SEQ ID NO：3的5位处的苏氨酸也可以是丙氨酸。另外，发现SEQ ID NO：4的4位处的酪氨酸也可以是苯丙氨酸，并且SEQ ID NO：4的7位处的异亮氨酸也可以是丝氨酸。最后，发现SEQ ID NO：5的2位处的赖氨酸也可以是丙氨酸，SEQ ID NO：5的3位处的苏氨酸也可以是精氨酸，并且SEQ ID NO：5的5位处的苯丙氨酸也可以是酪氨酸。
还提供了Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，包含：
重链可变区，包含：
-具有氨基酸序列GYSIX1SGYSWH的CDR1，其中X1选自T和A(SEQ ID NO：21)；
-具有氨基酸序列YIHX2SGX3ANYNPSLKS的CDR2，其中X2选自Y和F，并且其中X3选自S和I(SEQ ID NO：22)；
-具有氨基酸序列EX4X5GX6FDY的CDR3，其中X4选自K和A，X5选自T和R，并且X6选自F和Y(SEQ ID NO：23)。
本发明还提供Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的轻链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列或有至多3个，如至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：6所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：7所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ IDNO：8所示氨基酸序列或有至多3个，如至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。
最后，发现SEQ ID NO：6的6位处的亮氨酸也可以是异亮氨酸，SEQ ID NO：6的8位处的组氨酸也可以是精氨酸，并且SEQ ID NO：6的16位处的组氨酸也可以是苏氨酸。另外，发现SEQ ID NO：8的1位处的丝氨酸也可以是苯丙氨酸，SEQ ID NO：8的3位处的丝氨酸也可以是甘氨酸，并且SEQ ID NO：8的4位处的丙氨酸也可以是丝氨酸。
还提供了Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，包含：
轻链可变区，包含：
-具有氨基酸序列RSSQSX7VX8SNGNTYLX9的CDR1，其中X7选自L和I，X8选自H和R，并且X9选自H和T(SEQ ID NO：24)；
-有氨基酸序列KVSNRFS的CDR2(SEQ ID NO：25)；
-具有氨基酸序列X1oQX11X12HVPPT的CDR3，其中X10选自S和F，X11选自S和G，并且X12选自A和S(SEQ ID NO：26)。
在一个优选的实施方式中，Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的重链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或其中至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：3所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：4所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或有至多3个，如至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQID NO：5所示氨基酸序列；和含有CDR1、CDR2、和CDR3的轻链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列或有至多3个，如至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：6所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：7所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或有至多3个，如至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。发明人还发现本发明实施方式的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段特别适于治疗、预防心脏或血管重塑、心肌梗塞和压力负荷过大相关并发症或防止其发展。具体地，本发明实施方式的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段发现在心肌梗塞后增加存活率并改善心脏功能上是特别有效的。此外，本发明的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段是特别优选的，因为它们延迟了无细胞基质的清除并且不影响适当的疤痕形成，这对于防止心脏在心肌梗塞后扩张和破裂而言是重要的。另外，优选本发明的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，因为它们也改善了心肌梗塞后的梗塞和边界区域中的血管形成，由此改善伤口愈合并且防止不良重塑。
在另一个优选实施方式中，这种Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，重链可变区包含：
-具有氨基酸序列GYSIX1SGYSWH的CDR1，其中X1选自T和A(SEQ ID NO：21)：
-具有氨基酸序列YIHX2SGX3ANYNPSLKS的CDR2，其中X2选自Y和F，并且其中X3选自S和I(SEQ ID NO：22)；和
-具有氨基酸序列EX4X5GX6FDY的CDR3，其中X4选自K和A，X5选自T和R，并且X6选自F和Y(SEQ ID NO：23)；
和轻链可变区，包含：
-具有氨基酸序列RSSQSX7VX8SNGNTYLX9的CDR1，其中X7选自L和I，X8选自H和R，并且X9选自H和T(SEQ ID NO：24)；
-具有氨基酸序列KVSNRFS的CDR2(SEQ ID NO：25)；和
-具有氨基酸序列X10QX11X12HVPPT的CDR3，其中X10选自S和F，X11选自S和G，并且X12选自A和S(SEQ ID NO：26)。
在一个实施方式中，这种Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，重链可变区包含：
-具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的CDR3；
和轻链可变区，包含：
-具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的CDR3。
在另一个实施方式中，这种Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，重链可变区包含：
-具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的CDR3；
和轻链可变区，包含：
-具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的CDR3。
在另一个实施方式中，Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，重链可变区包含：
-具有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：17所示氨基酸序列的CDR3；
和轻链可变区，包含：
-具有SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：20所示氨基酸序列的CDR3。
在另一个方面，本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段特异性结合至氨基酸序列LFPAP(SEQ ID NO：28)。发明人发现本文所述的Ig-样分子或其片段以高亲和性结合至SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。发明人还发现本文所述的Ig-样分子导致心肌梗塞后存活率增加。
本发明还提供Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，其包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的重链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：29所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：29所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：30所示氨基酸序列，并且CDR3具有氨基酸序列SHY。
另外，本发明提供Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的轻链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：31所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：31所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：32所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQID NO：33所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：33所示氨基酸序列。
在一个实施方式中，Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的重链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：29所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：29所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：30所示氨基酸序列，并且CDR3具有氨基酸序列SHY；并且还包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的轻链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：31所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：31所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ IDNO：32所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ ID NO：33所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：33所示氨基酸序列。
在一个合适的实施方式中，另外，本发明提供Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的轻链可变区，CDR1具有SEQ ID NO：31所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：31所示氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：32所示氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ ID NO：33所示氨基酸序列或有至多2个，优选至多1个氨基酸被取代的SEQ ID NO：33所示氨基酸序列。
在一个实施方式中，Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，重链可变区包含：
-具有SEQ ID NO：29所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：30所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有氨基酸序列SHY的CDR3；
和/或轻链可变区，包含：
-具有SEQ ID NO：31所示氨基酸序列的CDR1；
-具有SEQ ID NO：32所示氨基酸序列的CDR2；和
-具有SEQ ID NO：33所示氨基酸序列的CDR3。
发明人发现本发明所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段在心肌梗塞后增加存活率并改善心脏功能上都特别有效的。此外，发现本发明所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段延迟了无细胞基质的清除并且不影响适当的疤痕形成，这对于防止心脏在心肌梗塞后扩张和破裂而言是重要的。
本发明的核酸分子、载体和宿主细胞
本发明还涉及编码本发明所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段的(分离的)核酸分子。在本发明中，术语“核酸分子”或“多核苷酸分子”理解为指代任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应整合到聚合物中的任意底物。能够编码本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段的核酸分子的制备、合成和产生的方法和标准方案通过常规分子生物学启示为本领域所熟知。
在本文所述的Ig-样分子是包含轻链和重链的抗体的情况中，可将2个核酸分子引入宿主细胞，即，编码轻链的氨基酸序列的一个核酸分子和编码重链的氨基酸序列的第二核酸分子。本发明还提供了一组核酸分子，所述组包含编码抗体的轻链的第一核酸分子以及编码抗体的重链的第二核酸分子，所述轻链包含可变区和恒定区，所述重链包含可变区和恒定区。
在一个实施方式中，本发明涉及包含本文所述的核酸分子的载体，其能够编码本文所述的Ig-样分子、抗体及其抗原结合片段。术语“载体”为本领域所熟知并且理解为指代能够人工携带并运输其已经连接的外来遗传物质(即，核酸分子)至其被复制和/或表达的另一细胞的核酸分子。
在本发明的一个实施方式中，某些载体能够在其转导的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和细菌载体和附加体哺乳动物载体)。可在导入宿主细胞后将其他载体(例如，非附加体哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，载体可包含能够引导其可操作连接的基因表达的启动子。载体可以是“表达载体”。其他类型的载体包括粘粒和人工染色体。包含能够编码本文所述的Ig-样分子或其片段的核酸分子的合适载体的制备方法和标准方案也是本领域技术人员所熟知的。
在一个实施方式中，载体优选是基因治疗载体。
本发明还涉及包含并任选地表达本发明的核酸分子或载体的宿主细胞。优选地，该宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。哺乳动物宿主是本领域已知的，并且市售可得。哺乳动物宿主细胞的非限制性示例是中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、和人细胞。
在一个优选的实施方式中，哺乳动物宿主细胞是杂交瘤。用于产生本文所述的抗体或Ig-样分子或其片段的培养基中产生并维持永生化的B细胞的方法和方案是本领域所熟知的。
药物组合物
本发明还提供了包含选自下组的药剂和药学上可接受的稀释剂或运载体的药物组合物：(a)本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，(b)包含编码本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核酸，(c)包含编码本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段的核酸分子的载体，和(d)表达本文所述的(b)的核酸或(c)的载体的宿主细胞。
在本发明中，术语“药学上可接受的”是指合理医疗判断范围内的药剂、材料、或组成的组合或组合物和/或其剂型，其适用于接触人体和动物组织、与合理的效益/风险比相适应的、不会产生过度毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症。此外，术语“药学上可接受的稀释剂或运载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载剂，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与将对象化学物从一个器官或身体的部分携带或运输至另一个器官或身体的部分。医学中广泛使用的材料的其他示例是支架，包括但不限于基于聚合物或可吸收(即，生物可降解)支架。在本领域中，这些支架称为药物洗脱支架。在本发明中，支架被药物组合物覆盖或包含药物组合物以将药物组合物释放至感兴趣的位点(在心肌梗塞的情况中是冠状动脉，在缺血性脑损伤/中风的情况中是颈动脉或远分支)。能用作药学上可接受的运载体的材料的其他非限制性示例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羟甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末化的黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻籽油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热源水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)药物制剂中采用的其他非毒性相容物质。
该药物组合物可通过任何合适途径和方式给予。本领域熟练技术人员应当理解，给药的途径和/或方式根据所需结果而有所不同。
本发明的药物组合物可按照常规过程配制用于通过任何途径给予，如胃肠道外、局部、口服、舌下、透皮，或通过吸入或通过药物洗脱支架。组合物可以是片剂、胶囊、粉末、药物洗脱支架、颗粒、锭剂、乳液或液体制备物，如无菌胃肠道外溶液或悬液的形式，或喷雾、气溶胶或其他用于吸入的常规方法的形式。
本发明的药物组合物包括适于口服、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道和/或胃肠道外给药的那些。
在一个实施方式中，胃肠道外给予药物组合物。
本文所用术语“胃肠道外给药”和“胃肠道外给药”代表除肠道和局部给药外的给药形式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、冠状动脉内、鞘内、囊内、眼内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下(subcapsular)、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注给药。
在一个实施方式中，通过静脉内注射或输注给予药物组合物。
药学上可接受的运载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。药学活性物质的这类介质和试剂的用法是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂都与活性化合物不相容，否则应考虑在本发明的药物组合物中使用这些介质或试剂。优选地，运载体适用于胃肠道外给药，例如，静脉内注射或输注。
在制备和储存条件下，药物组合物通常必须无菌和稳定。可将组合物制成适合高药物浓度的溶液、微乳剂、脂质体或其它有序结构。用于本发明药物组合物的水性和非水性运载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它们的合适混合物，植物油如橄榄油，以及可注射有机酯，如油酸乙酯。可通过使用涂覆材料如卵磷脂、如果是分散体则保持所需粒度、以及使用表面活性剂，来维持合适的流动性。
组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸盐和明胶可延长可注射组合物的吸收。
可通过将所需量的本文所述的Ig-样分子、或抗体、或其抗原结合片段和一种或多种如上述的成分组合根据需要掺入合适溶剂然后过滤除菌，从而制备无菌注射液。通常，将活性活化物掺入含有碱性分散介质和例如上述其它所需成分的无菌载剂中制备分散剂。当制备无菌注射液制备所需的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。
可调整剂量方案以提供最佳所需治疗响应。例如，可给予单一推注剂量，可随时间给予分成数次的剂量或可如治疗情况的紧急性所示成比例降低或增加剂量。尤其有利的是配制成单位剂型的胃肠道外组合物以便于给药和剂量均一性。本文所用的单位剂量形式指作为单一剂量用于待治疗对象的物理离散单位，每个单位包含预定量的活性化合物与所需药物运载体，该预定量经计算能够产生所需治疗效果。本发明中剂量单位形式的规格取决于或直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和待实现的具体治疗效果，(b)复合这种活性化合物用于个体中治疗灵敏度的领域中的固有限制，以及(c)纤连蛋白-EDA在相关疾病实体中的表达水平和持续时间。例如，纤连蛋白-EDA表达在心肌梗塞后2-3周达到峰值并且在5-6周降低至基线水平。根据抗-纤连蛋白-EDA化合物(例如，本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段)的半衰期，如果需要，将给予化合物1次、2次、3次或更高频率以覆盖纤连蛋白-EDA的整个表达期间。
可改变本发明的药物组合物中本文所述的Ig-样分子或抗体或其抗原结合片段的实际剂量水平以获得对于实现特定患者、组成和给药方案所需治疗响应而不对该患者有毒性而言有效的量(“有效量”)的Ig-样分子或抗体或其抗原结合片段。所选剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，排泄率，治疗持续时间，与所用特定组合物联用的其他物质，所治疗患者的年龄、性别、体重、病症、整体健康状况、先前病史以及医学领域熟知的类似因素。
本发明的方法和应用
本发明还涉及用于改善缺血性损伤后纤连蛋白-EDA介导的伤口愈合中固有血管生成响应的方法。这种方法包括向有此需要的对象给予治疗有效量的结合纤连蛋白-EDA的抗体或其抗原结合片段。还提供了用于刺激血管发生的结合纤连蛋白-EDA的抗体或其抗原结合片段。如实施例5所示，发明人发现用抗-纤连蛋白-EDA抗体治疗在心肌梗塞之后在心脏，尤其是心脏的梗塞区和心脏的梗塞和不受影响区的边界区域中增加了血管形成。此外，体外萌发(sprouting)试验显示，纤连蛋白-EDA能够抑制内皮细胞萌发。这些发现共同表明纤连蛋白-EDA抑制梗塞的心脏中的血管发生。不希望受理论限制，纤连蛋白-EDA被认为通过结合至这些细胞上的α1整联蛋白抑制内皮细胞萌发并且由抗-纤连蛋白-EDA抗体导致的血管形成的增加是由于这种抑制的防止。因此，发明人发现可使用抗-纤连蛋白-EDA抗体来防止组织损伤后纤连蛋白-EDA对血管发生的抑制作用。这是特别令人惊讶的，因为抗-纤连蛋白-EDA抗体目前被考虑用作抗肿瘤剂。纤连蛋白-EDA发现在肿瘤血管周围高度上调并且与发明人的发现相反，纤连蛋白-EDA被认为与肿瘤中的血管发生相关。
除了心脏以外，在心肌梗塞之后，纤连蛋白-EDA可在其他缺血组织中上调，其中血管生成响应的改善通常在缺血性损伤后有有益影响。
因此，提供了一种改善有此需要的对象中血管发生的方法，包括向所述对象给予治疗有效量的结合纤连蛋白-EDA的抗体或其抗原结合片段。还提供了用于改善血管发生的结合纤连蛋白-EDA的抗体或其抗原结合片段。血管发生优选在缺血性损伤后纤连蛋白-EDA介导的伤口愈合中改善。
本文所用术语“改善血管发生”表明与其中纤连蛋白-EDA表达但是其中没有本发明的结合纤连蛋白-EDA的抗体的组织中的血管发生水平相比(优选在损伤后)，在给予本发明的结合纤连蛋白-EDA的抗体后，组织中的血管发生水平增加。因此，与其中没有所述抗体但是优选地纤连蛋白-EDA表达的情况相比，本发明的这种抗体诱导血管发生。优选地，血管发生在损伤后的组织，如缺血组织、伤口、纤维化组织中和/或器官或组织移植后改善。
优选地，血管发生在患有缺血性疾病，尤其是心脏缺血、外周缺血和/或外周血管疾病的患者中，纤维化疾病中，压力负荷过大病症中，伤口中和/或器官或组织移植后，最优选患有缺血性疾病的对象中改善。血管发生优选在缺血组织，如心脏缺血组织或外周缺血组织中，在纤维化组织中，在压力负荷过大病症中，在伤口组织中和/或器官或组织移植后改善。最优选地，血管发生在缺血组织中改善。本文所用术语“缺血性疾病”是指一种或多种器官或组织受缺血影响的疾病。缺血性疾病的示例是心脏缺血、外周缺血和外周动脉疾病。心脏缺血或其原因的示例包括，但不限于心肌梗塞、二尖瓣疾病、慢性心房纤颤和心肌症，其中易于发生血栓。本文所用的“外周缺血”是指向一个或多个肢体供血减少的病症，其可关联外周动脉疾病。外周缺血的原因的示例包括栓塞、血栓形成、切除、静脉闭塞、动脉粥样硬化、动脉瘤和创伤。“压力负荷过大病症”是本领域熟知的术语并且涉及，压力负荷过大病症的优选但非限制性示例是高血压、瓣膜病和非缺血性心肌病。
在一个优选的实施方式中，本发明的Ig-样分子或其抗原结合片段用于刺激本文所述的血管发生。因此，提供了用于刺激血管发生的特异性结合至SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的分离的免疫球蛋白(Ig)-样分子或其抗原结合片段。
优选地，Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段选自下组：
-包含重链可变区和轻链可变区的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的CDR3；所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的CDR3；
-包含重链可变区和轻链可变区的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的CDR3；所述轻链可变区包含具有SEQ IDNO：12所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQ IDNO：14所示氨基酸序列的CDR3；
-包含重链可变区和轻链可变区的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQ ID NO：17所示氨基酸序列的CDR3；所述轻链可变区包含具有SEQ IDNO：18所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQ IDNO：20所示氨基酸序列的CDR3；
-包含重链可变区和/或轻链可变区的权利要求10所述的Ig-样分子或其抗原结合片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO：29所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO：30所示氨基酸序列的CDR2；和具有氨基酸序列SHY的CDR3；所述轻链可变区包含具有SEQ IDNO：31所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO：32所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQ IDNO：33所示氨基酸序列的CDR3；
用于改善血管发生，优选用于在患有缺血性疾病、纤维化疾病、压力负荷过大病症、伤口和/或器官或组织移植后的患者中改善血管发生。更优选地，这种Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段用于改善缺血组织，如心脏缺血组织或外周缺血组织中，纤维化组织中，压力负荷过大病症中，伤口组织中和/或器官或组织移植后，最优选缺血组织中的血管发生。优选地，这种抗体是人源化抗体，优选本文所述的人源化稳定的IgG4抗体。
还提供了在有此需要的对象中改善血管发生的方法，包括向所述对象给予治疗有效量的选自下组的药剂：(a)本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，(b)包含编码本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核酸，(c)一种或多种包含本文所述核酸分子的载体和(d)表达本文所述的核酸分子的宿主细胞。
还提供了选自下组的药剂用于在有此需要的对象中改善血管发生：(a)本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，(b)包含编码本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核酸，(c)一种或多种包含本文所述核酸分子的载体和(d)表达本文所述的核酸分子的宿主细胞。
本发明还提供如本文所述用于刺激血管生成的结合纤连蛋白-EDA的抗体或其抗原结合片段以及用于刺激血管生成的方法，该方法包括向有此需要的对象给予治疗有效量的结合纤连蛋白-EDA的抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及治疗、预防不良心脏和血管重塑以及心肌梗塞和压力负荷过大相关并发症或防止其发展的方法。本文所述的这种方法包括向有此需要的对象给予治疗有效量的选自下组的药剂：(a)本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，(b)包含编码本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核酸，(c)一种或多种包含本文所述核酸分子的载体和(d)表达本文所述的核酸分子的宿主细胞。
本文所用术语“有效量”是指足以实现需要的治疗和/或预防效果的量，例如导致治疗、预防不良心脏重塑和/或与心肌梗塞和/或压力负荷过大相关、关联或由其所致的疾病或病症，如心力衰竭或者一种或多种与心力衰竭相关的症状或者防止其发展的量。
本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段可给予具有一种或多种心肌梗塞和/或心力衰竭的迹象或症状，如胸痛、呼吸困难、水肿和心脏肥大的对象。例如，本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段的“治疗有效量”是指最少延缓与心肌梗塞、压力负荷过大和/或不良心脏重塑，如心力衰竭相关、关联或由其所致的疾病或病症的生理影响的水平。本领域技术人员将能够确定这种疾病或病症已经得到治疗、预防之时，或已经防止其发展之时。
在一个实施方式中，有效量的本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段，如单克隆抗体的量可以是约0.1μg/kg至约10g/kg，如约1μg/kg至约1g/kg，约10μg/kg至约100mg/kg，或约0.1mg/kg至约50mg/kg。
本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段可在心肌梗塞之后以单一剂量给予一次，或可给予数次。例如，在心肌梗塞之后立即(即，心肌梗塞48小时内)静脉内给予本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段一次，之后在第一次给予本发明的结合成员后的数日一次或多个静脉内给予。可以约2小时至约14天，如约4小时至约10天、约6小时至约8天、约8小时至约6天、约12小时至约4天、或约24小时至约2天的间隔给予本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段以实现最优的治疗或预防效果。
在一个实施方式中，在按照本文所述的方法治疗对象后观察到治疗益处。例如，可通过观察以下来例示治疗益处：1)防止对象中心肌梗塞和压力负荷过大相关病症和不良心脏重塑的发展，和/或2)降低或较低的对象中与心肌梗塞、压力负荷过大和不良心脏重塑相关或由其所致的并发症，和/或3)对象中发展或患有与心肌梗塞、压力负荷过大和不良心脏重塑相关或由其所致的并发症的较低风险，和/或4)停止对象中心肌梗塞和压力负荷过大病症和不良心脏重塑的发展，和/或5)对象中心肌梗塞、压力负荷过大和不良心脏重塑后的存活率增加。
在本发明中，与心肌梗塞、压力负荷过大和不良心脏重塑相关或由其所致的疾病病症包括诸如以下的疾病病症：心力衰竭；远端心肌纤维化；动脉瘤或心室破裂；二尖瓣反流，尤其是如果梗塞很大程度且很可能导致严重的心室扩张；和心律失常，如由于心室扩大的室性心动过速和心室纤颤，反应性和/或替代(疤痕)纤维化。
在本发明的一个实施方式中，本文所述的Ig-样分子、抗体或其片段及其使用方法特别适于治疗、预防心肌梗塞和压力负荷过大病症(例如，心力衰竭；远端心肌纤维化；动脉瘤或心室破裂；二尖瓣反流，尤其是如果梗塞很大程度且很可能导致严重的心室扩张；和心律失常，如由于心室扩大的室性心动过速和心室纤颤，反应性和替代(疤痕)纤维化)或防止其发展。
Ig-样分子、抗体或其片段也可适于治疗、预防不良组织重塑，如纤维化和由高血液和/主动脉瓣狭窄或所致的降低的心脏功能；心脏移植之后导致的同种异体移植排斥；肺纤维化导致的肺功能障碍和肺高血压，类风湿性关节炎和/或骨关节炎导致的关节功能障碍，癫痫，瘫痪和/或局部麻痹，和由缺血性中风所致的大脑梗塞或防止其发展。
在本发明的一个实施方式中，可通过观察以下来例示其他治疗益处：1)在患有高血压和/或主动脉狭窄的对象中减少的心力衰竭，或减少的纤维化或减少的心律失常风险，和/或2)心脏移植后在有同种异体移植排斥的对象中改善的心脏功能，或减少的纤维化，或减少的心律失常风险，和/或3)在患有缺血性中风的对象中减少的梗塞尺寸，或严重性较低的瘫痪和/或局部麻痹，或改善的神经学病症，和/或4)在接触某些药物(胺碘酮、博莱霉素、氨甲蝶呤、呋喃妥因、白消安)、或辐射、或结节病或其他结缔组织疾病的对象中降低的发展肺纤维化的风险，和/或5)在患有骨关节炎或类风湿性关节炎的对象中减少的疼痛或改善的关节功能，和/或6)在患有癌症的对象中减少的转移，或改善的局部功能，或改善的存活率。
在本发明中，术语“心力衰竭”理解为指特征为减少的心脏输出和/或心室中异常灌浆压力和任何病症。在这些情况中，心脏不能以足够速率或足够体积和/或足够力泵送血液(即，收缩性心力衰竭)或者显示出增加的心室硬度和/或扰乱的心室驰豫(即，舒张性心力衰竭)。在心力衰竭中，器官的血液灌注受到阻碍，从而使器官功能恶化(例如，肾衰竭或肝衰竭)。另外，血液可退回肺中，导致肺被流体堵塞。心力衰竭的典型症状包括呼吸浅短(呼吸困难)、疲劳、虚弱、躺平时呼吸困难、和腿部肿胀、踝部肿胀或腹部肿胀(水肿)。
在本发明中，术语“治疗”、“预防”或“防止……发展”理解为不仅包括不良心脏重塑的发作，也包括不良心脏重塑已经开始但停止进一步继续的情况。因此，其包括心肌梗塞和/或压力负荷过大相关并发症的充分发展被防止的情况，及时这种心肌梗塞和/或压力负荷过大相关并发症已经开始发展。例如，已经开始的心脏扩张可被使用本文所述的Ig-样分子、或抗体或其抗原结合片段的治疗性介入所停止。本发明包括这种方法。由于不良重塑是可逆的，也可使用本发明的方法治疗在本文中也称为“心肌梗塞和/或压力负荷过大相关并发症”的不良重塑相关并发症。
在本发明中，术语“对象”理解为指任何脊椎动物，但一般涉及哺乳动物，例如人患者，家养动物(如狗或猫)，农场动物(如马、牛或绵羊)或实验室动物(如大鼠、小鼠、非人灵长类或豚鼠)。在某些实施例中，该对象是人。
在一个实施方式中，对象选自马、狗和人。在本发明的另一个实施方式中，可使用本文所述的Ig-样分子、或抗体或其片段，本文所述的药物组合物，和本文所述的本发明的方法以在狗和马，尤其是赛狗和赛马中预防或治疗与心肌梗塞、压力负荷过大和不良心脏重塑相关的并发症和/或在心肌梗塞、压力负荷过大和不良心脏重塑后增加存活率或降低死亡率。
在一个优选的实施方式中，对象是人，尤其是处于发生不良心脏重塑风险中的人对象和/或患有心肌梗塞、压力负荷过大和不良心脏重塑的人对象和/或患有与心肌梗塞、压力负荷过大和不良心脏重塑相关的并发症的人对象。在另一个实施方式中，人对象处于在肺部(例如，由肺纤维化导致的肺功能障碍、肺高血压和呼吸困难)、在关节中(例如，由类风湿性关节炎和/或骨关节炎导致的关节功能障碍)、在大脑中(例如，由缺血性中风导致的大脑梗塞、和癫痫、瘫痪和/或局部麻痹)患有或发生纤连蛋白-EDA-介导的不良组织重塑的风险中。发明人发现本文所述的Ig-样分子、抗体或其抗原结合片段在心肌梗塞和压力负荷过大后增加了存活率并改善了心脏功能，大概是通过对象中预防、治疗不良心脏重塑和/或防止其发展。
用于本发明的常规技术的实施方法对本领域技术人员是显而易见的。分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域中的常规技术的实践对于本领域技术人员而言是熟知的，并描述在(例如)以下参考文献中：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(《分子克隆：实验室手册》)，冷泉港出版社，冷泉港，纽约，1989；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，(《新编分子生物学实验指南》)，John Wiley&Sons公司，纽约，1987及定期更新；和《酶学方法》系列，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥。
在本文件及其权利要求中，动词“包含”及其变化形式是以非限制性使用，意味着该词语后面的条目被包含，但没有特别提及的条目并未被排除。另外，动词“组成”可被“基本由……组成”所取代，表示本发明的组合物可包含除了具体鉴定的那些以外的其他组分，所述其他组分并不改变本发明的独特特征。
本文所用术语“和/或”指其中一个或多个表示示例可能单独或与至少一种表示示例直至与所有表示示例一起出现的情况。
术语“至少”是指其中特定值与所述特定值或更高相同的情况。例如，“至少2”理解为与“2或更高”相同，即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15……等。
因此不定冠词“一个”或“一种”通常表示“至少一个”。还理解，当指代本文的“序列”时，通常指具有特定亚基(例如，氨基酸)序列的实际物理分子。
附图说明
图1显示了在用针对纤连蛋白-EDA的EDA结构域的各种抗体(即，17G8.72、27A12.70、29E7.35和42H11.51)处理的小鼠相对于用盐水处理的小鼠在30天的时间内观察到的心肌梗塞后的存活百分比。
图2显示了用针对纤连蛋白-EDA的EDA结构域的各种抗体(即，17G8.72、27A12.70、29E7.35和42H11.51)处理的小鼠的心肌梗塞后的射血分数(EF)。
图3显示了在用针对纤连蛋白-EDA的EDA结构域的抗体33E3.10处理的小鼠相对于用盐水处理的小鼠在30天的时间内观察到的心肌梗塞后的存活百分比。
图4显示了用针对纤连蛋白-EDA的EDA结构域的抗体33E3.10处理的小鼠的心肌梗塞后的射血分数(EF)。
图5：抗-EDA处理改善了MI后的心脏功能。A)盐水处理和B)抗-EDA处理的小鼠心脏的MRI图像。C)MI后的舒张末期体积(EDV)增加。抗-EDA处理显示与盐水(*p＝0.011和#p＝0.014)和同种型对照处理的动物相比减弱的EDV增加。D)与盐水*p＝0.011和#p＝0.014同种型处理的动物相比，MI后的收缩末期体积(ESV)增加；盐水n＝14，抗-EDA处理的动物n＝9并且同种型对照处理的动物n＝5。
图6：抗-EDA处理在MI 7天后降低血液白细胞水平。A)与对照处理的动物相比，Ly-6G+嗜中性粒细胞在抗-EDA处理的组中明显减少。B)CD3+T-细胞在抗-EDA处理后减少不明显。C)Ly-6C+/Ly-6G-单核细胞和D)Ly-6C-/Ly-6G-单核细胞在抗-EDA处理后减少不明显。E)CD49d表达在抗-EDA处理后在Ly-6C-/Ly-6G-单核细胞上明显增加。对照组N＝8，抗-EDA组N＝5。数据表示为平均值±SEM。
图7：炎性细胞因子在梗塞区中减少；然而，这并不影响白细胞数量。A)促炎细胞因子L-1b(p＝0.03)、GM-CSF(p＝0.04)、TNF-a(p＝ns)、MIP-1b(p＝ns)、RANTES(p＝0.01)、IL-4(p＝0.02)在抗-EDA处理的动物的梗塞区中减少。在抗-EDA处理的动物的梗塞区中，抗炎细胞因子IL-10减少(p＝ns)并且IL-17增加(p＝0.03)。P值并不对多重测试进行校正。B)梗塞区中Ly-6G嗜中性粒细胞染色的示例。C)对嗜中性粒细胞染色的定量。D)梗塞区中Mac-3巨噬细胞染色的示例。E)对嗜中性粒细胞染色的定量。对照组N＝8，抗-EDA组N＝5。数据表示为平均值±SEM。
图8：疤痕形成并不受抗-EDA处理的影响。A)梗塞区中天狼星红染色的偏振光图的示例。B)对天狼星红染色的定量。C)对梗塞区中Col1的mRNA水平的定量。D)对梗塞区中Col3的mRNA水平的定量。对照组N＝8，抗-EDA组N＝5。数据表示为平均值±SEM。
图9：抗-EDA处理在边界和梗塞区域中增加了小血管形成。A)对照心脏的边界区域中的CD31血管染色。B)在抗-EDA处理的心脏中的边界区域中的CD31血管染色。C)对边界区域中总血管的定量。在抗-EDA处理的组中总血管数量增加(p＜0.0001)。D)血管细分成基于直径的类别。抗-EDA处理的组中总血管数量的增加主要是由于小血管5-10μm的增加(p＜0.0001)。E)对梗塞区域中总血管的定量。在抗-EDA处理的组中总血管数量增加(p＝0.05)。F)血管细分成基于直径的类别。抗-EDA处理的组中总血管数量的增加主要是由于小血管10-16μm的增加(p＝0.01)。G)萌发试验阳性对照的示例。H)萌发试验中EDA抑制的示例。I)对相对萌发的定量。阴性对照设为1。对照组N＝8，抗-EDA组N＝5。数据表示为平均值±SEM。
图10：在抗-EDA处理后有延迟的无细胞基质清除。A)MI 7天后对照动物中无细胞基质的代表性图像。B)MI 7天后抗-EDA处理动物中无细胞基质的代表性图像。C)对无细胞基质的定量。在抗-EDA处理组中有更多的无细胞基质(p＜0.05)。D)显示来自对照和抗-EDA处理动物的心脏组织中MMP2活性的酶谱。E)对总MMP2活性的定量。在抗-EDA处理的动物中，MMP2活性降低。F)对不同MMP2形式的定量。在抗-EDA处理的动物中，所有不同MMP2形式减少。G)对在对照和抗-EDA处理的动物的梗塞区中骨膜蛋白染色的定量。在抗-EDA处理的组中，骨膜蛋白染色减少。H)成纤维细胞粘附试验的定量。与III4-his片段涂层或无涂层相比，成纤维细胞更多地粘附至EDA-his片段涂层。可通过抗-EDA抗体而不是通过同种型对照来抑制这种对EDA-his片段的粘附。N＝1。对照组N＝8，抗-EDA组N＝5。数据表示为平均值±SEM。
图11：梗塞的人心肌中的EDA免疫组化染色。A)带有心肌细胞的凝固性坏死和一些嗜中性粒细胞浸渗的心肌梗塞。B)坏死心肌膜的EDA免疫染色显示梗塞区中弱的红染色。C)梗塞区边界处的EDA免疫染色显示梗塞周围的心肌细胞的胞质和核染色(红色)。D)带多个成纤维细胞的年轻肉芽组织。E)显示成纤维细胞的强细胞染色的EDA免疫染色。插入EDA阳性成纤维细胞的更高倍数放大。F)肉芽组织周围的心肌膜的EDA免疫染色，周围的心肌细胞的部分的弱胞质和强核染色。G)疤痕组织与胶原结缔组织和一些成纤维细胞。H)和I)疤痕和周围的心肌膜的无EDA免疫染色。所有比例尺都是100μm。每个时间点3名患者的代表图；H&E＝苏木精和伊红染色。
图12.小鼠中由主动脉缩窄(TAC)诱导的压力负荷过大后6周的A)射血分数(EF)和B)心/体重比。EDA-缺陷型(KO；EDA-/-)和野生型(WT)小鼠之间的差异处于p＜0.05的水平(EDA-缺陷型小鼠描述于Arslan F.等，Circ.Res.，2011年3月；108：582-592和WO2012/057613，小鼠中主动脉缩窄(TAC)是压力负荷过大诱导的心脏肥大和心力衰竭的一种常用实验模型)。
序列
SEQ ID NO：1：表位GIXXXF的氨基酸序列
SEQ ID NO：2：表位GIHELF的氨基酸序列
SEQ ID NO：3：重链可变区的CDR1(抗体27A12.70)
GYSITSGYSWH
SEQ ID NO：4：重链可变区的CDR2(抗体27A12.70)
YIHYSGIANYNPSLKS
SEQ ID NO：5：重链可变区的CDR3(抗体27A12.70)
EKTGFFDY
SEQ ID NO：6：轻链可变区的CDR1(抗体27A12.70)
RSSQSLVHSNGNTYLH
SEQ ID NO：7：轻链可变区的CDR2(抗体27A12.70)
KVSNRFS
SEQ ID NO：8：轻链可变区的CDR3(抗体27A12.70)
SQSAHVPPT
SEQ ID NO：9：重链可变区的CDR1(抗体29E7.35)
GYSITSGYSWH
SEQ ID NO：10：重链可变区的CDR2(抗体29E7.35)
YIHYSGSANYNPSLKS
SEQ ID NO：11：重链可变区的CDR3(抗体29E7.35)
EKTGFFDY
SEQ ID NO：12：轻链可变区的CDR1(抗体29E7.35)
RSSQSLVHSNGNTYLH
SEQ ID NO：13：轻链可变区的CDR2(抗体29E7.35)
KVSNRFS
SEQ ID NO：14：轻链可变区的CDR3(抗体29E7.35)
SQSAHVPPT
SEQ ID NO：15：重链可变区的CDR1(抗体17G8.7VL)
GYSIASGYSWH
SEQ ID NO：16：重链可变区的CDR2(抗体17G8.7VL)
YIHFSGSANYNPSLKS
SEQ ID NO：17：重链可变区的CDR3(抗体17G8.7VL)
EARGYFDY
SEQ ID NO：18：轻链可变区的CDR1(抗体17G8.7VL)
RSSQSIVRSNGNTYLT
SEQ ID NO：19：轻链可变区的CDR2(抗体17G8.7VL)
KVSNRFS
SEQ ID NO：20：轻链可变区的CDR3(抗体17G8.7VL)
FQGSHVPPT
SEQ ID NO：21：重链可变区的CDR1(共有)
GYSIX1SGYSWH
X1＝T或A
SEQ ID NO：22：重链可变区的CDR2(共有)
YIHX2SGX3ANYNPSLKS
X2＝Y或F；并且X3＝S或I
SEQ ID NO：23：重链可变区的CDR3(共有)
EX4X5GX6FDY
X4＝K或A；并且X5＝T或R；并且X6＝F或Y
SEQ ID NO：24：轻链可变区的CDR1(共有)
RSSQSX7VX8SNGNTYLX9
X7＝L或I；并且X8＝H或R；并且X9＝H或T
SEQ ID NO：25：轻链可变区的CDR2(共有)
KVSNRFS
SEQ ID NO：26：轻链可变区的CDR3(共有)
X10QX11X12HVPPT
X10＝S或F；并且X11＝S或G；并且X12＝A或S
SEQ ID NO：27(免疫肽)
TYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGGC
SEQ ID NO：28：纤连蛋白-EDA的EDA结构域上针对抗体33E3.10的表位的氨基酸序列
LFPAP
SEQ ID NO：29：重链可变区的CDR1(抗体33E3.10)
GFTFSNSAMT
SEQ ID NO：30：重链可变区的CDR2(抗体33E3.10)
SISGGGTTYYPDSVKG
重链可变区的CDR3(抗体33E3.10)
SHY
SEQ ID NO：31：轻链可变区的CDR1(抗体33E3.10)
KASQNVVTNVA
SEQ ID NO：32：轻链可变区的CDR2(抗体33E3.10)
SASYRYS
SEQ ID NO：33：轻链可变区的CDR3(抗体33E3.10)
QQYNSYPYT
SEQ ID NO：34：抗体27A12.70的人源化重链
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYSWHWIRQHPGKKLEWMGYIHYSGIANYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATEKTGFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：35：抗体27A12.70的人源化轻链
DVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSAHVPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：36：抗体33E3.10的人源化重链
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSAMTWVRQAPGKRLEWVASISGGGTTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSHYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：37：抗体33E3.10的人源化轻链
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQNVVTNVAWYQQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNSYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：38：重链可变区(抗体27A12.70)
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSGIANYNPSLKSRISITRDTSKNHFFLQLNSVTTEDTATYYCATEKTGFFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：39：轻链可变区(抗体27A12.70)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSAHVPPTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：40：重链可变区(抗体29E7.35)
AVQLQESGPDLVKPSHSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSGSANYNPSLKSRFSITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCATEKTGFFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：41：轻链可变区(抗体29E7.35)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSAHVPPTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：42：重链可变区(抗体17G8.7VL)
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSIASGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHFSGSANYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCASEARGYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：43：轻链可变区(抗体17G8.7VL)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVRSNGNTYLTWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCFQGSHVPPTFGSGTKLEIKR
SEQ ID NO：44：重链可变区(抗体33E3.10)
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNSAMTWVRQTPEKRLEWVASISGGGTTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAIYYCARSHYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：45：轻链可变区(抗体33E3.10)
DIVMTQSQKFMSTSIGDRVSVTCKASQNVVTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIKR
实施例
实施例1
方法
肽合成和筛选试验
使用标准Fmoc-化学基于目标肽(TYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGGC(SEQ ID NO：27))的氨基酸序列合成线性和CLIPS肽并且使用三氟酸和清除剂(trifluoric acid withscavengers)去保护。线性和CLIPS肽是各种长度的短片段，其可能含有表位。使用支架上化学连接肽(CLIPS)技术在化学支架上合成限制的CLIPS肽以重构构象表位。例如，合成含有双半胱氨酸的单环肽，其通过用α，α’-二溴二甲苯处理来环化。通过以变化的间隔引入半胱氨酸来改变环的尺寸。除了新引入的半胱氨酸以外如果还存在其他半胱氨酸，则用丙氨酸取代它们。通过在信用卡(credit-card)形式的聚丙烯PEPSCAN卡(455个肽模板/卡)上与碳酸氢铵(20mM，pH 7.9)/乙腈(1∶1(v/v))中0.5mM的CLIPS模板如1，3-双(溴甲基)苯溶液反应将肽中多个半胱氨酸的侧链偶联至CLIPS模板。所述卡在溶液中温和摇晃30-60分钟，同时在溶液中被完全覆盖。最后，用过量的H2O充分洗涤卡并且在含1％SDS/0.1％β-巯基乙醇的PBS(pH 7.2)中在70℃下超声处理30分钟，之后在H2O中另外超声处理45分钟。
在PEPSCAN-基ELISA中测试抗体与各肽的结合。含共价连接的肽的455-孔信用卡形式的聚丙烯卡与由封闭溶液(即PBS/0.1％吐温中4％马血清，5％卵清蛋白(w/v))中稀释的0.05微克抗体/mL组成的一抗溶液孵育。洗涤后，肽与抗体过氧化物酶偶联物的1/1000稀释物在25℃下孵育1小时。洗涤后，加入过氧化物酶底物2,2’-连氮-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸酯(ABTS)和2微升的3％H2O2。1小时后，测量显色。用电荷偶联装置(CCD)-相机和图像处理系统来对显色进行定量(如Slootstra等.Mol Divers.1996年2月；1(2)：87-96中首先描述)。
数据计算
原始数据：光密度(任意OD单位)
原始数据是由CCD-相机获得的光值。该值大部分范围是0-3000，类似于标准96-孔板ELISA-读数器的1-3的log标尺。首先，CCD相机在过氧化物酶着色之前对卡成像，然后在过氧化物酶着色之后再次成像。这2张图片互相的差提供了原始数据。将原始数据复制到Peplabtm数据库中。卡经手动检查以校正假阳性(例如，存在气泡)。
结果
使用CLIPSTM技术(Timmerman等，J Mol Recognit.2007年9月-10月；20(5)：283-99)用重叠的7-14聚体线性和CLIPS肽来对27A12.70、29E7.35、17G8.72、42H11.51和33E3.10的表位进行作图，其序列基于用于免疫的肽。发现抗体27A12.70、29E7.35、17G8.72、和42H11.51的表位由氨基酸GIHELF组成。发现抗体33E3.10的表位由氨基酸LFPAP组成。
另外，进行丙氨酸扫描诱变用范围从Tyr36至Pro48的13-聚体肽来确定抗体27A12.70、29E7.35、17G8.72、和42H11.51的表位内的关键氨基酸。丙氨酸扫描诱变显示Gly42、Ile43和Phe47是表位GIHELF内的关键氨基酸。
实施例2
动物和实验设计
雄性Balb/C野生型小鼠(10-12周，25-30g)接受自由喂食和饮水。在邻近左心耳以下通过左冠状动脉结扎诱导心肌梗塞。所有动物实验都按照由乌得勒支大学动物实验协会的事先批准和国家动物护理指南进行。
体内心肌梗塞
通过腹膜内注射用芬太尼(Jansen-Cilag)0.05mg/kg、多美康(罗氏公司(Roche))5mg/kg和美托咪啶0.5mg/kg的混合物来麻醉小鼠(Balb/C)。通过用直肠温度计和自动加热毯将核心体温在手术期间维持在37℃左右。用100％氧对小鼠进行插管和通气(哈佛仪器公司(Harvard Apparatus Inc.))。用0-8薇乔缝线来永久性连接左冠状动脉(LCA)。通过对心肌膜和心室快速心律失常进行漂白来确认缺血。在空白操作的动物中，缝线放在LCA之下而没有连接。胸腔壁封闭并且动物皮下接受咹啶醒(辉瑞公司(Pfizer))2.5mg/kg、安易醒(罗氏公司)0.5mg/kg和疼即息(先灵葆雅公司(Schering-Plough))0.1mg/kg。
小鼠在心肌梗塞后28天进行心脏功能和几何评价。小鼠通过尾静脉静脉内给予250微升(μl)盐水(对照)或抗体溶液。动物在梗塞后2天随机接受盐水、27A12.70(10mg/kg)、29E7.35(10mg/kg)、17G8.72(10mg/kg)、42H11.51(10mg/kg)或33E3.10(10mg/kg)单克隆抗体。在梗塞后第4天和第5天重复推注。以10mg/kg的剂量给予第二次和第三次抗体注射。
结果
存活百分比
抗体27A12.70、29E7.35、17G8.72、42H11.51
不同组小鼠在基线处(t＝0)没有观察到差异。然而，不同存活概况根据测试的抗体合并。测试的抗体在心肌梗塞后相对于对照情况(盐水)增加了小鼠存活率。在心肌梗塞后的30天跟踪期间，用抗体27A12.70和29E7.35处理的小鼠显示出在心肌梗塞后最高的存活百分比(图1)。具体地，用抗体27A12.70和29E7.35处理的小鼠的存活百分比相对于对照组(盐水)中小鼠的存活百分比显著改善，对照组中仅50％的小鼠在心肌梗塞30天后存活。另外，用抗体17G8.72和42H11.51处理的小鼠的存活率相对于对照组(盐水)中的小鼠改善。
抗体33E3.10
2组小鼠在基线处(t＝0)没有观察到差异。然而，不同存活概况根据测试的抗体合并。测试的抗体在心肌梗塞后相对于对照情况(盐水)增加了小鼠存活率。在心肌梗塞后的30天跟踪期间，用抗体33E3.10处理的小鼠显示出在心肌梗塞后增加的存活率(图3)。具体地，用抗体33E3.10处理的小鼠的存活百分比相对于对照组(盐水)中小鼠的存活百分比显著改善，对照组中仅50％的小鼠在心肌梗塞30天后存活。
实施例3
体内心肌梗塞
雄性Balb/C野生型小鼠(10-12周，25-30g)经过如实施例2所述用于诱导心肌梗塞的过程。也用相同的抗体处理它们。
超声心动描记术
在心肌梗塞后28天，在异氟烷麻醉下，小鼠通过高分辨率超声心动描记术(Vevo2100，加拿大多伦多的富士胶片公司(FUJIFILM VisualSonics，Inc.))对心脏尺寸和功能进行连续评价。获得在切片之间有1.0mm间隔的长轴和短轴图像并用于计算舒张末期体积(EDV，最大体积)和收缩末期体积(ESV，最小体积)。射血分数(EF)计算为100*(EDV-ESV)/EDV。
结果
抗体27A12.70、29E7.35、17G8.72、42H11.51
结果显示，相对于用盐水处理的小鼠，用抗体27A12.70、29E7.35、17G8.72和42H11.51处理的小鼠显示出在心肌梗塞后改善的心脏功能，如增加的射血分数(EF)所示，最大的改善如用抗体27A12.70和29E7.35处理后显示的EF测量的更高百分比所示(图2)。
抗体33E3.10
结果显示，相对于用盐水处理的小鼠，用抗体33E3.10处理的小鼠显示出在心肌梗塞后改善的心脏功能，如增加的射血分数(EF)所示，最大的改善如用抗体33E3.10处理后显示的EF测量的更高百分比所示(图4)。
实施例4
方法
如实施例1所述进行纤连蛋白-EDA表位的肽合成、扫描实验和丙氨酸扫描数据计算。合成基于TYSSPEDGIHELFP的肽，其中各肽中，一个氨基酸被丙氨酸取代。测试肽被抗体27A12.70、29E7.35、17G8.72和42H11.51的结合。
结果
结果示于下表。
实施例5
方法
动物和实验设计
雄性Balb/C野生型(WT)小鼠(10-12周，25-30g)接受自由喂食和饮水。如实施例2所述，在邻近左心耳以下通过左冠状动脉结扎诱导心肌梗塞。动物随机分为针对表位GIXXXF的抗-EDA IgG1抗体(20mg/kg；250μL)或盐水对照。还包括在不同的时间点用同种型对照(20mg/kg；250μL)的另一组。在MI后3天静脉内开始处理或安慰剂。对治疗未知的研究者评价心脏功能和几何形状。所有动物实验都按照由乌得勒支大学动物实验协会的事先批准和国家动物护理指南进行。
抗-EDAIgG1单克隆抗体
通过差异pH洗脱从蛋白A琼脂糖上从条件杂交瘤培养基分开纯化IgG1和IgG2b同种型，并且纯化的IgG1用于本研究中所述的实验。
梗塞尺寸和心脏磁共振成像
MI后3天，对使用后期钆增强磁共振成像(LGE-MRI)输注化合物之前在小鼠亚组中评价梗塞尺寸。通过高分辨率MRI(9.4T，德国莱茵施泰滕的布鲁克公司(Bruker))来评价局部和全部心脏功能以及左心室几何形状。
流式细胞术
MI后7天在EDTA管中收集血液。将50μL血液加入100μL抗体混合物中并且在室温下黑暗中孵育30分钟。在用Optilyse缓冲剂(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))裂解血红细胞10分钟后，在Gallios(贝克曼库尔特公司)上测量样品。
定量PCR
来自小鼠心脏的分离的总RNA按照生产商的指南用iScriptTM cDNA合成试剂盒(伯乐公司(Bio-Rad))逆转录成cDNA。在iQTM5实时PCR检测系统(伯乐公司)上使用SYBR绿(伯乐公司)进行定量PCR。在该研究中使用以下组引物：胶原蛋白I前-αI链(正向)，(反向)；胶原蛋白III前-αI链(正向)，(反向)；TIMP-1(正向)，(反向)；TIMP-2(正向)，(反向)；MMP-2(正向)，(反向)；P0(正向)，(反向)；RPL27(正向)，(反向)；EDA-FN(正向)，(反向)；总FN(正向)，(反向)。各样品一式两份运行。
使用(Willems，Leyns和Vandesompele，Anal Biochem.2008年8月1日；379(1)：127-9)中所述的方案将基因表达水平标准化至P0和RPL27。为了评价qPCR效率，包括5种不同cDNA稀释物的标准曲线。
酶谱
通过明胶酶谱来检验梗塞的心肌和胶原蛋白垫中的MMP活性。倒入运行凝胶(2.68ml 30％(双)丙烯酰胺(伯乐公司)，4.82ml 2mg/ml猪皮明胶溶液(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、2.5ml Tris-HCl 1.5M pH 8，8(罗氏公司)，100μl 10％SDS(西格玛-奥德里奇公司)50μl APS和17.8μl的TEMED(美国匹兹堡的GE生命科学公司(GE LifeSciences))和积层凝胶(0.67ml 30％(双)丙烯酰胺，3.04ml蒸馏水，1.25ml Tris-HCl0.5M pH 6.8，50μl 10％SDS，25μl APS，和8.8μl的TEMED)。心肌样品在罗氏裂解缓冲剂中匀化。使用BCA蛋白试验试剂盒(热科学公司(Thermo Scientific))来测量蛋白质浓度。5μg的心肌提取物以1∶4的比率与Laemlli缓冲剂混合并加载到凝胶上。凝胶以30mA运行通过积层相并以60mA通过运行相。在运行后，凝胶在2.5％曲通X-100中2次洗涤15分钟以去除SDS。然后，凝胶在Brij-溶液(50mM Tris-HCl pH 7.4；10mM CaCl2(美国白宫站的默克公司(Merck))；0.05％Brij35(西格玛-奥德里奇公司))中过夜孵育。孵育后，用考马斯蓝(0.1％考马斯亮蓝R-250(伯乐公司)，25％甲醇和15％乙酸(均来自西格玛-奥德里奇公司)对凝胶进行染色并随后脱色(在25％甲醇和15％乙酸中)直至出现针对蓝色背景不同的清晰条带。在Chemidoc XRS+上拍摄图像。使用ImageLab(伯乐公司)分析图像。
细胞培养
在补充10％FBS，青霉素/链霉素，50mM氢化可的松，50mM表皮生长因子和L-谷氨酰胺的MCDB131培养基(10372-019，吉布可公司(Gibco))中培养人乳腺内皮细胞(HMEC)。每3天传代培养细胞。使用NIH3T3成纤维细胞系用于粘附研究。细胞在补充10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM培养基(41965，吉布可公司)中培养。每3天传代培养细胞。
萌发试验
用HMEC包被Cytex珠并置于基质胶(康宁公司(Corning))中。裸MCDB131培养基用作阴性对照，完全MCDB131用作阳性对照。以1μM的浓度加入EDA片段和III4片段。图片在48小时时拍摄并且使用photoshop和ImageJ进行定量。
细胞粘附试验
在37℃下用1μM EDA-his或III4-his片段包被96孔平板1小时，然后用PBS 1％BSA封闭。NIH3T3 0.5x105个细胞加入裸DMEM中并且在37℃下孵育1小时。在洗去未连接的细胞后，连接的细胞固定并且用0.5％结晶紫、1％甲醛、20％甲醇染色。用酶标仪在540nm下读取平板。
蛋白质纯化
用1μl的DNA构建体转化BL21pLysS大肠杆菌并且涂布在酵母胰蛋白胨氨苄青霉素/氯霉素平板上过夜。第二天，刮下所有的菌落并且在含氨苄青霉素/氯霉素的LB培养基中生长直至达到0.6-0.8的OD。加入IPTG以起始蛋白质生产。24小时后，细菌沉淀并裂解，使用裂解缓冲剂和超声步骤。细胞碎片沉淀并且上清用于后续处理。该纯化使用Ni-NTA珠。简言之，在4℃下用上清孵育Ni-NTA珠(ON)。珠倒入ACTA系统上的柱中。在数次洗涤后，用300mM咪唑洗脱结合的EDA-his或III4-his。收集含EDA-his或III4-his的部分并且注射到凝胶过滤柱上。基于尺寸分离蛋白质并且在HEPES缓冲剂中洗脱。汇集含EDA-his或III4-his的部分并且使用Vivaspin 5kD浓缩柱浓缩。使用BCA试剂盒评价片段浓度。进行LAL试验来检测内毒素。以低于＜0.1EU/uM的浓度使用片段。
组织学
终止后，心脏切除并在4％甲醛中固定，并包埋在石蜡中。石蜡切片对Ly-6G(针对嗜中性粒细胞；大鼠抗小鼠Ly-6G，英国剑桥的阿柏堪穆公司(Abcam))、MAC-3(针对巨噬细胞；大鼠抗小鼠MAC-3，荷兰布雷达的BD法敏进公司(BD Pharmingen))和CD31(针对血管，德国海德堡的圣克鲁兹公司(Santa Cruz))染色。
染色前，切片去石蜡并且通过在含1.5％H2O2的甲醇中30分钟来封闭内源性过氧化物酶。通过在柠檬酸盐缓冲剂中煮沸20分钟(MAC-3和CD31)或通过在37℃下在0.08％胃蛋白酶溶液中孵育15分钟(Ly-6G)来回收抗原。
对于MAC-3染色，切片与正常山羊血清预孵育并且在4℃下过夜孵育(MAC-3，1∶30；CD163，1∶500)。对于CD31染色，切片在室温下与一抗过夜孵育(1∶1500)过夜。切片然后在室温下与生物素标记的山羊二抗孵育1小时，并且与链霉素-辣根过氧化物酶在室温下孵育1小时。用AEC对所有切片进行显色。
对于Ly-6G，切片在室温下与一抗孵育(1∶100)1小时。然后用Powervision聚-HRP抗-兔IgG(美国得累城(Daily City)的免疫视觉技术公司(ImmunoVision Technologies))孵育切片30分钟。立即按照生产商(美国伯林盖姆的维克多实验室公司(VectorLaboratories，Inc.))的说明用Vector NovaREDTM底物试剂盒使染色可视化。
所有切片用Mayer苏木精染色复染。
采用对4％甲醛固定和石蜡包埋的心脏切片的天狼猩红染色来进行对胶原蛋白密度的定量。在转化成灰度值后用圆形偏振光和数字图像显微术进行胶原蛋白密度分析。低于30的灰度值被认为是图像的背景信号。
急性MI后的人EDA染色
在死于心肌梗塞的患者尸检期间获得心肌组织，并且从病理档案中取回。该研究符合荷兰采用的妥善使用人类组织的准则标准。为了使EDA可视化，在柠檬酸盐缓冲剂(pH6.0)中沸腾之后，切片与我们的单克隆EDA抗体(1/800稀释)孵育。聚AP-抗-小鼠IgG(荷兰德伊芬的免疫公司(Immunologic))用作二抗并且用液体永固红(丹麦格洛斯楚普的大科公司(Dako))使信号可视化。
统计
数据表示为平均值±标准误。使用事后2-侧邓奈特t-检验调整(盐水设为对照)的单因素ANOVA来进行组间多重比较。使用曼-惠特尼U检验来比较抗-EDA和盐水处理的动物之间的存活差异。使用SPSS 15.1.1.来进行所有的统计学分析并且p＜0.05被认为是显著的。
结果
抗-EDA处理改善了存活率并且防止心肌梗塞后的不良重塑
对心脏功能和尺寸的基线MRI评价显示处理组间没有差异。在化合物输注之前梗塞尺寸为42±3％(图5A)。在28天的研究期间，发现3/9的抗-EDA处理的小鼠死亡，而9/14的盐水处理的动物在跟踪期间死亡(p＝0.06)。病理分析显示仅2个破裂(都在盐水组中)，而在其余实体中可注意到过度肺充血。对心脏功能和几何形状的连续MRI评价显示与盐水和同种型对照相比，抗-EDA处理的动物中显著保留的左心室功能以及尺寸(图5；表1)。
表1.急性MI后的心脏功能和几何形状
数据表示为平均值±标准误。*p-值与基线比较并且低于0.05水平；-值与盐水处理比较。BPM＝每分钟搏动次数，EDV＝舒张末期体积，ESV＝收缩末期体积，EF＝射血分数，WT＝壁厚度，SWT＝收缩期壁增厚，NS＝不显著。
循环白细胞数量在抗-EDA处理的小鼠中降低/抗-EDA处理在MI后在外周血中减少白细胞数量
MI后7天使用流式细胞术来评价血液中的白细胞亚组数量。抗-EDA处理的小鼠显示嗜中性粒细胞的显著减少以及在抗-EDA处理后T-细胞数量减少的趋势(图6a和b)。炎性Ly6Cpos单核细胞亚组和抗炎性Ly6Cneg单核细胞亚组都在抗-EDA处理后显著减少(图6c和d)。
抗-EDA处理在梗塞的心脏中减少了细胞因子突释而不是白细胞数量
在梗塞区域，炎性细胞因子L-1β、TNFα、GM-CSF、IL-4、RANTES、IL-10和MIP-1α在抗-EDA处理的动物中减少(图7a)。在心脏的远端区域中没有观察到细胞因子水平的差异(数据未显示)。在MI后7天，嗜中性粒细胞、T-细胞和巨噬细胞数量不受抗-EDA处理的影响(图7b至e)。
抗-EDA处理并不影响合适的疤痕形成
合适的疤痕形成对于防止MI后扩张型重塑、疤痕变薄和/或梗塞的壁的破裂而言是最重要的。在该研究中，MI后28天时对照和抗-EDA之间的胶原蛋白含量没有差异(图8a和b)。与这种观察一致，我们没有观察到肌成纤维细胞(该细胞是MI后的主要胶原蛋白产生细胞)的总量(数据未显示)或者Col1和Col3的mRNA水平(图8c和d)中的任何差异。
抗-EDA处理增加了心脏中的血管形成
抗-EDA处理后，在梗塞和边界区域中都没有形成更多的血管(图9)。当我们将血管细分成不同的尺寸类型时，我们可清楚地在边界区域中5-10μm的最小血管(图9d)和梗塞区域中10-16μm血管(图9f)中看到这种差异。在类别对应于心肌膜中的毛细血管。体外3D萌发试验显示EDA而不是对照片段III4抑制内皮细胞的萌发(图9g至i)。
抗-EDA处理延缓了无细胞基质的清除
临时无细胞基质的形成对于MI后的疤痕形成和无活力组织的血流动力学补偿而言是关键的。在伤口愈合期间，临时基质缓慢降解并且被牢固的基于胶原蛋白的疤痕取代。我们在抗-EDA处理的小鼠中观察到延迟的无细胞基质清除(图10a至c)。为了找到临时基质延迟清除的解释，我们研究了处理组中的固有MMP2和-9活性。我们发现通过酶谱定量，抗-EDA处理减少了MMP2和-9活性(图10d至f)。组间没有观察到MMP2和-9的mRNA水平变化(数据未显示)。成纤维细胞是心脏中的主要MMP产生细胞。骨膜蛋白染色能够估计心脏中成熟成纤维细胞的量。在抗-EDA处理后，骨膜蛋白表达减少(图10g)。此外，体外细胞粘附试验显示，呈现为细胞可粘附至EDA并且抗-EDA抗体可防止这种细胞粘附(图10h)。
EDA在梗塞的人心脏中瞬时表达
迄今为止，在患有急性MI的患者中没有EDA表达的证据。我们使用死后人心脏试验来研究MI后人中EDA表达的时间线。在梗塞后的前2-3周在梗塞的区域和梗塞边界区域中观察到EDA(图11)。在年轻肉芽组织和边界区域心肌细胞中残留的成纤维细胞中观察到EDA表达。这些发现与我们之前的鼠数据一致，其中我们显示EDA-FN确实在缺血心肌中暂时表达。

Claims (22)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其包含
重链可变区，包含
-氨基酸序列为GYSITSGYSWH的CDR1；
-氨基酸序列为YIHYSGX1ANYNPSLKS的CDR2，其中X1选自S和I；和
-氨基酸序列为EKTGFFDY的CDR3；
和轻链可变区，包含：
-氨基酸序列为RSSQSLVHSNGNTYLH的CDR1；
-氨基酸序列为KVSNRFS的CDR2；和
-氨基酸序列为SQSAHVPPT的CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包含
重链可变区，包含：
-氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的CDR1；
-氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的CDR2；和
-氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的CDR3；
和轻链可变区，包含：
-氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的CDR1；
-氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的CDR2；和
-氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的CDR3。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包含
重链可变区，包含：
-氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR1；
-氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR2；和
-氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR3；
和轻链可变区，包含：
-氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR1；
-氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDR2；和
-氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的CDR3。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链和重链的CDR整合到人源的框架区中。
5.如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其特征在于，其为嵌合抗体。
6.如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其特征在于，其为人源化抗体。
7.如权利要求6所述的抗体，包含重链和轻链，其中所述重链的氨基酸序列如SEQ IDNO:34所示并且所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示。
8.如权利要求6所述的抗体，包含重链和轻链，其中所述重链包含IgG4重链的恒定区并且所述轻链包含IgG4轻链的恒定区，其中所述IgG4重链的序列如SEQ ID NO:34所示，所述IgG4轻链的序列如SEQ ID NO:35所示。
9.如权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述重链和/或轻链可变区含有IgG4重链和/或IgG4轻链的一个或多个框架区，其中，所述IgG4重链的序列如SEQ ID NO:34所示，所述IgG4轻链的序列如SEQ ID NO:35所示。
10.一种编码权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
11.一种包含权利要求10所述核酸分子的载体。
12.如权利要求11所述的载体，其是基因治疗载体。
13.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求10所述的核酸分子或如权利要求11或12所述的载体。
14.如权利要求13所述的宿主细胞，其是哺乳动物宿主细胞。
15.如权利要求13或14所述的宿主细胞，其是杂交瘤。
16.一种药物组合物，其包含选自下组的试剂和药学上可接受的运载体：
(a)如权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，(b)如权利要求10所述的核酸分子，(c)如权利要求11-12中任一项所述的载体，和(d)如权利要求14-15中任一项所述的宿主细胞。
17.如权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或如权利要求16所述的药物组合物在制备药物中的用途。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗不良心脏重塑或防止其发展，或者用于治疗由心肌梗塞导致的病症或与心肌梗塞相关的病症。
19.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述药物用于改善血管发生。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，在组织损伤之后改善血管发生。
21.如权利要求19所述的用途，其特征在于，在患有缺血性疾病的对象中改善血管发生。
22.权利要求17-21中任一项所述用途，其特征在于，所述药物用于人。
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