KR20160108322A - 피브로넥틴-eda에 대해 유도된 면역글로불린-유사 분자 - Google Patents

피브로넥틴-eda에 대해 유도된 면역글로불린-유사 분자 Download PDF

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KR20160108322A
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파티흐 아르스란
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유엠씨 우트레크트 홀딩 비.브이.
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Abstract

본 발명은, 유해 심장 리모델링 및 심근 경색 및 압력-과부하를 초래하거나 또는 그와 관련된 병증, 예를 들어 심부전, 동맥류 형성 및 원위 심근 섬유증의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방에서 사용하기 위한 것이며, 바람직하게는 허혈성 손상 후, 혈관 신생의 개선을 위해 사용하기 위한 면역글로불린 (Ig)-유사 분자 또는 그의 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 Ig-유사 분자를 인코딩하는 핵산 분자, 그와 같은 것을 포함하는 벡터 및 그와 같은 것을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.

Description

피브로넥틴-EDA에 대해 유도된 면역글로불린-유사 분자{Immunoglobulin-like molecules directed against fibronectin-EDA}
본 발명은 의학 분야, 특히 심장 및 혈관 신생 분야에 관한 것이다. 본 발명은 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 (Ig)-유사 분자, 예를 들면 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 이들 Ig-유사 분자는 특히, 유해 심장(adverse cardiac) 또는 혈관 리모델링(vascular remodelling) 및 심근 경색과 관련된 합병증의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방 및 혈관 신생의 개선 또는 자극에 적합하다. 본 발명은 또한 Ig-유사 분자, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 또는 그의 단편을 포함하는 약제학적 조성물 및 심근 경색과 관련된 합병증 및 유해 심장 또는 혈관 리모델링의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방 및 혈관 신생의 개선 또는 자극을 위해, Ig-유사 분자, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 또는 그의 단편을 이용하는 방법에 관한 것이다.
허혈성 심장 질환은 서구 사회에서 가장 큰 사회 경제적 부담이다. 이것은 중국과 인도와 같은 개발도상국의 급속한 근대화 시대에 더 큰 문제가 되고 있다. 허혈성 심장 질환의 가장 심각한 급성 합병증은 심근 경색 (myocardial infarction)으로 또한 알려진 심장 마비 (heart attack)이다. 미국, EU, 및 일본에서, 240만 명의 환자가 매년 심근 경색으로 고통받고 있다. 단지, 허혈성 심장 질환의 치료를 위해 미국과 유럽에서 소비되는 금액은 매년 € 1천 500억을 초과한다. 불행히도, 더 많은 환자가 생명을 위협하는 초기 경색증으로부터 생존하지만, 이후 심장 기능이 점진적으로 악화되기 때문에, 심근 경색 관련 합병증 또는 병증이 증가하고 있다. 심부전, 섬유화 및 부정맥과 같은 심근 경색 후 합병증은 높은 사망률과 이환율을 초래한다. 이러한 합병증의 가장 중요한 결정 인자는 유해 (심장) 리모델링 또는 유해 심실 리모델링으로 언급되는 유해 심장 복구 반응이다.
이것이 심근 경색 후 유해 리모델링의 가장 심각하고, 가장 빈번한 결과이기 때문에, 심부전 (HF)에 관심이 집중되고 있다. 유럽 심장 학회 (ESC)는 "HF는 서구 사회에서 21세기의 전염병이다"라고 말했다. 미국, EU 및 일본에서만, 적어도 180만 명의 환자가 경색 관련 HF로 매년 새로 진단되어, 입원하고 있다. 진단시로부터 1년 이내의 사망률은 20%이며, 50%는 5년 내에 사망한다. 이들은 운동 내구력의 점진적 감소 및, 정상적인 일상 활동 수행능력의 저하를 겪기 때문에, 생존자들의 삶의 질은 심각하게 영향을 받는다. 1) 운동 내구력의 저하 및 이후 생산성의 저하, 2) 예방 또는 치료는 아니지만 증상을 경감시키는 고비용의 의료 치료 및 3) 재입원의 결과로서, 사회 경제적 부담은 미국과 유럽 연합에서만, 매년 약 € 600 억이다.
심근 경색에 대한 최근의 치료법은 폐색된 관상 동맥을 통한 혈류의 복원을 겨냥하고 있다. 스텐트와 결합한 항혈전제 (즉, 혈병 형성 방지제)는 심근 경색 후, 혈류 복원을 최적화하기 위한 가장 중요한 약제 및 장치 종류이다. 혈류 최적화에 있어서, 이러한 발전에도 불구하고, 경색과 관련된 합병증은 여전히 발생하며, 증가하고 있다. 그 주된 이유는 유해 리모델링이 혈류 복원과는 완전히 다른 병리생리학적 과정이라는 사실에 있다.
경색된 심장의 치료는 다양한 유형의 세포가 포함되는 매우 복잡한 과정이다. 심근 경색은, 심장 근육의 일부가 괴사하여, 펌프 기능의 상실이 초래되는 급성 사건이다. 이러한 급성 사건 직후, 염증의 개선을 특징으로 하는 복구 과정이 혈액 및 심장 근육에서 유도된다. 그러나, 염증 유형에 따라, 경색된 심장의 적절한 복구 및 리모델링 여부가 판명된다. 부적절한 치유와 유해 염증을 유발하는 핵심 인자는, 심장 괴사와 매트릭스 분해와 관련된 분자에 의한 선천성 면역의 활성화이다. 많은 환자에서, 심근 경색 후, 면역 시스템이 유해한 방식으로 활성화되어, 심장의 부적절한 치유가 초래된다. 이런 경우에, 심장은 유해 리모델링이라고 불리는 과정으로 도입될 것이다. 유해 리모델링은, 합병증으로 불리는 다수의 유해한 결과: 심부전, 심장의 팽창 및 섬유화, 수축과 이완의 교란 및 전기적 활성화의 교란을 가진다. 심부전과 같은 경색증과 관련된 이환율 정도의 증가는 경색 후 심장 복구를 개선시키기 위한 신규의 치료법에 대한 필요성을 강조한다. 특히, 심근 경색 후 초기에, 경색된 심장의 치유에 기여하는 또 다른 요인은 혈관 신생이다. 미세 혈관의 신규 형성은 심근 정보 후 초기 단계에, 허혈성 심근 복구의 가능성을 가지며, 이는 심부전으로의 전환을 방지하는데 기여한다.
유해한 염증 반응을 일으키는 백혈구의 주요 결정 요인은 피브로넥틴-EDA의 침착(deposition)이다. 심근 경색 후, 피브로넥틴-EDA가 새로 합성되어 경색 심근에서 일시적으로 상향 조절된다. 피브로넥틴-EDA는 면역 체계와, 매트릭스 대사 회전 (matrix turnover)에 관련된 기타 세포를 활성화시켜, 심장 복구에 관여하는 세포 (예를 들어, 백혈구, 림프구 및 섬유아세포)의 이동 및 분화를 유도한다. 그후, 피브로넥틴-EDA에 의해 활성화된 세포는 심장의 치유시, 유해한 염증 반응을 유도한다.
세포성 피브로넥틴은 ECM에 존재하는 다기능 부착성 당단백질이며, MI 발병시, 조직 손상에 반응하여 세포에 의해 생성된다. 이것은, TLR2와 TLR4 양자 및 인테그린 α4β1, α4β7 및 α9β1의 내인성 리간드로서 작용하는 것으로서, III 형 반복 외부 도메인 A (EIIIA; EDA)를 인코딩하는 대안적 접속 엑손 (spliced exon)을 포함한다. 시험관 내에서, 피브로넥틴-EDA는 염증 전 유전자 발현을 유도하고, 단핵 세포를 활성화시킨다. 쥐과 관절에, 피브로넥틴-EDA의 생체 내 주입에 의해, 염증의 개선이 야기된다. 피브로넥틴-EDA는 일반적으로 건강한 인체 조직에서는 발현되지 않지만, 배 발생 과정 동안, 맥관 구조의 신규 발달시 및 다수 (병리학적) 병증, 예를 들어 (심장) 허혈성 조직, 동맥 경화 병변, 섬유성 조직, 종양, 이식 거부 및 상처에서, 매우 상향 조절된다. EDA의 과발현은 뇌 허혈증 후, 염증 및 손상의 개선을 초래한다. 따라서, 피브로넥틴-EDA는 백혈구를 활성화할 수 있고, 사이토카인 및 케모카인의 상향 조절을 야기한다. 최근, 야생형 마우스에 비해서, 피브로넥틴-EDA 녹아웃 마우스가 심근 경색 후, 섬유증의 감소, 심장 기능의 보존, 및 심실 팽창의 감소를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (Arslan F. et al. Circ. Res., Mar 2011; 108: 582-592).
WO2012/057613은, 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인에 대해 유도되는 항체에 의한 마우스의 처리에 의해, 상기 마우스에서 좌심실의 팽창이 방지되고, 심근 경색 후 생존율이 개선된다는 것을 개시하고 있다.
대상체에서, 심근 경색과 관련된 병증의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방을 가능하게 하고, 심근 경색 후, 대상체의 생존 가능성을 증가시키는 항체에 대한 필요성이 당업계에 존재한다. 이러한 항체의 제공이 본 발명의 목적이다.
본 발명은 아미노산 서열 GIXXXF (서열번호:1)에 특이적으로 결합하는 분리된 면역글로불린 (Ig)-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있다.
일 실시형태에서, 서열번호: 1의 3번 위치의 아미노산은 히스티딘, 아르기닌, 리신 및 알라닌으로부터 선택되고, 바람직하게는 히스티딘이다.
일 실시형태에서, 서열번호: 1의 4번 위치의 아미노산은 글루탐산 및 알라닌으로부터 선택되고, 바람직하게는 글루탐산이다.
일 실시형태에서, 서열번호: 1의 5번 위치의 아미노산은 류신 및 알라닌으로부터 선택되고, 바람직하게는 류신이다.
일 실시형태에서, Ig-유사 분자 또는 그의 단편은 아미노산 서열 GIHELF (서열번호:2)에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 아미노산 서열 LFPAP (서열번호:28)에 특이적으로 결합하는 분리된 면역글로불린 (Ig)-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편이 추가로 제공된다.
상기 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편은 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체일 수 있다. 상기 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편은 쥐과 기원일 수 있으며, 예를 들어, 마우스로부터 유래할 수 있다. 상기 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편은 키메라, 인간화 또는 인간일 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호:3에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:3에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 (CDR)1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:4에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 (CDR)2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:5에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:5에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 (CDR)2, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은
- 아미노산 서열 GYSIX1SGYSWH을 갖는 CDR1, 여기서 X1은 T 및 A에서 선택됨;
- 아미노산 서열 YIHX2SGX3ANYNPSLKS을 갖는 CDR2, 여기서 X2는 Y 및 F에서 선택되고, X3은 S 및 I에서 선택됨; 및
- 아미노산 서열 EX4X5GX6FDY을 갖는 CDR3, 여기서 X4는 K 및 A에서 선택되고, X5는 T 및 R에서 선택되고, X6은 F 및 Y에서 선택됨;
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 서열번호:6에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:6에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:7에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:7에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:8에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:8에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서, 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은
- 아미노산 서열 RSSQSX7VX8SNGNTYLX9을 갖는 CDR1, 여기서 X7은 L 및 I에서 선택되고, X8은 H 및 R에서 선택되고, X9는 H 및 T에서 선택됨;
- 아미노산 서열 KVSNRFS을 갖는 CDR2; 및
- 아미노산 서열 X10QX11X12HVPPT을 갖는 CDR3, 여기서 X10은 S 및 F에서 선택되고, X11은 S 및 G에서 선택되고, X12는 A 및 S에서 선택됨;
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호:3에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:3에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:4에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:5에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:5에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호:6에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:6에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:7에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:7에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:8에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:8에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 이러한 Ig-유사 분자 또는 항원-결합 단편은
- 아미노산 서열 GYSIX1SGYSWH을 갖는 CDR1, 여기서 X1은 T 및 A에서 선택됨;
- 아미노산 서열 YIHX2SGX3ANYNPSLKS을 갖는 CDR2, 여기서 X2는 Y 및 F에서 선택되고, X3은 S 및 I에서 선택됨;
- 아미노산 서열 EX4X5GX6FDY을 갖는 CDR3, 여기서 X4는 K 및 A에서 선택되고, X5는 T 및 R에서 선택되고, X6은 F 및 Y에서 선택됨;
을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
- 아미노산 서열 RSSQSX7VX8SNGNTYLX9을 갖는 CDR1, 여기서 X7은 L 및 I에서 선택되고, X8은 H 및 R에서 선택되고, X9는 H 및 T에서 선택됨;
- 아미노산 서열 KVSNRFS을 갖는 CDR2;
- 아미노산 서열 X10QX11X12HVPPT을 갖는 CDR3, 여기서 X10은 S 및 F에서 선택되고, X11은 S 및 G에서 선택되고, X12는 A 및 S에서 선택됨;
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
- 서열번호:9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
- 서열번호:12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:13에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직하게는, 상기 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호:40의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역의 인간화된 중쇄 가변 영역 및 서열번호:41의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역의 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
- 서열번호:3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2;및
- 서열번호:5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
- 서열번호:6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직하게는, 상기 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호:38의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역의 인간화된 중쇄 가변 영역 및 서열번호:39의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역의 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
- 서열번호:15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
- 서열번호:18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직하게는, 상기 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호:42의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역의 인간화된 중쇄 가변 영역 및 서열번호:43의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역의 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 서열번호:29에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:29에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 (CDR)1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:30에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:30에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 아미노산 서열 SHY을 갖는 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호:31에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:31에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서, 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:32에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:32에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:33에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:33에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호:29에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:29에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서, 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:30에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:30에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서, 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 아미노산 서열 SHY을 갖는 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호:31에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:31에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서, 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:32에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:32에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:33에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:33에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
- 서열번호:29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 아미노산 서열 SHY을 갖는 CDR3;
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
- 서열번호:31에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:32에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직하게는, 상기 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호:44의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역의 인간화된 중쇄 가변 영역 및 서열번호:45의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역의 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 및/또는 중쇄의 CDR은 인간-유래 프레임워크 영역에 통합된다.
상기 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편은 항체, 예를 들어 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 교시되는 상기 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 유전자 치료 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 명세서에서 교시되는 핵산 분자 또는 본 명세서에서 교시되는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포는 하이브리도마일 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편, (b) 상기 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자, (c) 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 (d) 이러한 핵산 분자 또는 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 특히, 유해 심장 리모델링 및 심근 경색 및/또는 압력 과부하와 관련되거나 또는 그로부터 초래되는 병증의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방 또는, 유해 조직 리모델링, 특히 피브로넥틴-EDA 매개 유해 조직 리모델링의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방을 위한 의약품으로서 사용하기 위한 것으로서, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편 또는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은, 유해 심장 리모델링 및 심근 경색 및/또는 과부하 압력을 초래하거나 또는 그와 관련된 병증의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방 방법으로서, (a) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편, 상기 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자, (c) 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 (d) 이러한 핵산 분자 또는 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 혈관 신생의 개선에서 사용하기 위한, 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및, 혈관 신생의 개선 방법으로서, 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 대상체는 인간일 수 있다.
본 발명은 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 (Ig)-유사 분자, 예를 들면 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 이들 Ig-유사 분자는 특히, 유해 심장(adverse cardiac) 또는 혈관 리모델링(vascular remodelling) 및 심근 경색과 관련된 합병증의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방 및 혈관 신생의 개선 또는 자극에 적합하다. 본 발명은 또한 Ig-유사 분자, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 또는 그의 단편을 포함하는 약제학적 조성물 및 심근 경색과 관련된 합병증 및 유해 심장 또는 혈관 리모델링의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방 및 혈관 신생의 개선 또는 자극을 위해, Ig-유사 분자, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 또는 그의 단편을 이용하는 방법에 관한 것이다.
도 1은, 염수 처리 마우스에 비해서, 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인에 대해 유도된 다양한 항체 (즉, 17G8.72, 27A12.70, 29E7.35, 및 42H11.51)로 처리된 마우스에서, 30일 동안 관찰된 심근 경색 후의 생존율을 도시한다.
도 2는, 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인에 대해 유도된 다양한 항체 (즉, 17G8.72, 27A12.70, 29E7.35, 및 42H11.51)로 처리된 마우스에서, 심근 경색 후의 구혈률 (EF)을 도시한다.
도 3은, 염수 처리 마우스에 비해서, 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인에 대해 유도된 항체 33E3.10로 처리된 마우스에서, 30일 동안 관찰된 심근 경색 후의 생존율을 도시한다.
도 4는 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인에 대해 유도된 항체 33E3.10로 처리된 마우스에서, 심근 경색 후의 구혈률 (EF)을 도시한다.
도 5: 항-EDA 처리에 의한, MI 후의 심장 기능의 개선. A) 염수 처리 및 B) 항-EDA 처리 마우스 심장의 MRI 영상. C) MI 후, 말단-이완 용적 (EDV)의 증가. 염수 *p=0.011 및 #p=0.014 및 이소타입 대조군 처리 동물에 비해서, 항-EDA 처리는 EDV 증가의 약화를 나타낸다. D) 염수 *p=0.011 및 #p=0.014 이소타입 처리 동물에 비해서, MI 후, 말단-수축 용적 (ESV)이 증가한다; n=14/염수, n=9/항-EDA 처리 동물 및 n=5/이소타입 대조군 처리 동물.
도 6: 항-EDA 처리는 MI 7일 후, 혈중 백혈구 수준을 감소시킨다. A) 대조군 처리 동물에 비해서, 항-EDA 처리 그룹에서, Ly-6G+ 호중구가 현저히 감소하였다. B) 항-EDA 처리 후, CD3+ T-세포는 현저하게 감소하지 않았다. C) Ly-6C+/Ly-6G- 단핵구 및 D) Ly-6C-/Ly-6G- 단핵구는 항-EDA 처리 후, 현저하게 감소하지 않았다. E) 항-EDA 처리 후, CD49d는 Ly-6C-/Ly-6G-단핵구에서 현저히 증가하였다. N=8/대조군 그룹, N=5/항-EDA 그룹. 데이타는 평균 ± SEM으로 제시된다.
도 7: 경색 영역에서, 염증성 사이토카인이 감소하나, 이것은 백혈구 수치에 영향을 미치지 않는다. A) 항-EDA 처리 동물의 경색 영역에서, 염증 전 사이토카인 IL-1b (p=0.03), GM-CSF (p=0.04), TNF-a (p=ns), MIP-1b (p=ns), RANTES (p=0.01), IL-4 (p=0.02)는 감소한다. 항-EDA 처리 동물의 경색 영역에서, 항-염증성 사이토카인 IL-10은 감소하며 (p=ns), IL-17은 증가한다 (p=0.03). P 값은 다중 시험으로 보정된 것이 아니다. B) 경색 영역의 Ly-6G 호중구 염색의 예. C) 호중구 염색의 정량화. D) 경색 영역의 Mac-3 대식세포 염색의 예. E) 호중구 염색의 정량화. N=8/대조군 그룹, N=5/항-EDA 그룹. 데이타는 평균 ± SEM으로 제시된다.
도 8: 흉터 형성은 항-EDA 처리에 의해 영향을 받지 않는다. A) 경색 영역에서, 피크로시리우스 레드 염색의 편광 사진. B) 피크로시리우스 레드 염색의 정량화. C) 경색 영역에서, Col1의 mRNA 수준의 정량화. D) 경색 영역에서, Col3의 mRNA 수준의 정량화. N=8/대조군 그룹, N=5/항-EDA 그룹. 데이타는 평균 ± SEM으로 제시된다.
도 9: 항-EDA 처리는 경계 및 경색 지역에서, 소 혈관 (small vessel) 형성을 증가시킨다. A) 대조군 심장의 경계 지역의 CD31 혈관 염색. B) 항-EDA 처리 심장의 경계 지역의 CD31 혈관 염색. C) 경계 지역의 전체 혈관의 정량화. 항-EDA 처리 그룹의 경우, 전체 혈관 수가 증가한다 (p<0.0001). D) 혈관은 직경에 기반한 종류로 세분된다. 항-EDA 처리 그룹에서, 전체 혈관 수의 증가는 주로, 소 혈관 5-10 μm의 증가로 인한 것이다 (p<0.0001) E) 경색 지역의 전체 혈관의 정량화. 항-EDA 처리 그룹의 경우, 전체 혈관 수가 증가한다 (p=0.05). F) 혈관은 직경에 기반한 종류로 세분된다. 항-EDA 처리 그룹에서, 전체 혈관 수의 증가는 주로, 소 혈관 10-16 um의 증가로 인한 것이다 (p=0.01) G) 발아 분석의 양성 대조군의 예 H) 발아 분석에서, EDA 억제의 예. I) 상대 발아의 정량화. 음성 대조군은 1로 설정된다. N=8/대조군 그룹, N=5/항-EDA 그룹. 데이타는 평균 ± SEM으로 제시된다.
도 10: 항-EDA 처리시, 무세포 매트릭스의 제거가 지연된다. A) MI 7일 후, 대조군 동물의 무세포 매트릭스의 대표 이미지. B) MI 7일 후, 항-EDA 처리 동물의 무세포 매트릭스의 대표 이미지. C) 무세포 매트릭스의 정량화. 항-EDA 처리 그룹의 경우, 더 많은 무세포 매트릭스가 존재한다. (p<0.05) D) 대조군 및 항-EDA 처리 동물의 심장 조직에서, MMP2 활성을 나타내는 자이모그람. E) 전체 MMP2 활성의 정량화. 항-EDA 처리 동물에서, MMP2 활성이 감소한다. F) 다른 MMP2 형태의 정량화. 항-EDA 처리 동물의 경우, 다른 MMP2 형태 모두 감소한다. G) 대조군 및 항-EDA 처리 동물의 경색 영역에서, 페리오스틴 염색의 정량화. 항-EDA 처리 그룹에서, 페리오스틴 염색이 감소한다. H) 섬유아세포 부착 분석의 정량화. 코팅 되거나 또는 코팅되지 않은 III4-his 단편에 비해서, 섬유아세포는 코팅된 EDA-his 단편에 더 많이 부착된다. EDA-his 단편과의 이러한 부착은 항-EDA 항체에 의해 억제될 수 있으며, 이소타입 대조군의 경우에는 그러하지 않다. N=1. N=8/대조군 그룹, N=5/항-EDA 그룹. 데이타는 평균 ± SEM으로 제시된다.
도 11: 인간의 경색 심근의 EDA 면역 조직 화학 염색. A) 심근 세포의 응고 괴사 및 일부 호중구 과립구의 침윤을 가지는 심근 경색. B) 경색 영역에서, 약한 레드 염색을 나타내는 괴사 심근의 EDA 면역염색. C) 경색 주위의 심근 세포에서, 세포질 및 핵 염색 (레드)을 나타내는 경색 영역의 경계의 EDA 면역염색. D) 다수의 섬유아세포를 가지는 초기 육아 조직 (young granulation tissue). E) 섬유아세포의 강한 세포 염색을 나타내는 EDA 면역 염색. 인레이 고배율 (Inlay higher magnification)의 EDA 양성 섬유아세포. F) 일부 주변 심근 세포의 약한 세포질 염색 및 강한 핵 염색을 가지는, 육아 조직 주변 심근의 EDA 면역 염색. G) 일부 섬유아세포를 가지는 콜라겐 결합 조직을 가지는 흉터 조직. H) 및 I) 주변 심근 및 흉터의 EDA 면역 염색의 부재. 모든 막대는 100 μm이다. 시점 당 3 명의 환자의 대표 사진; H&E= 헤마톡실린 및 에오신 염색.
도 12. 마우스에서, 대동맥 수축 (transaortic constriction) (TAC)에 의해 유도되는 압력-과부하 6주 후, A) 구혈률 (EF) 및 B) 심장/체중 비. EDA-결핍 (KO; EDA-/-) 및 야생형 (WT) 마우스 사이의 차이는 p<0.05 수준에서 존재한다. (EDA-결핍 마우스는 문헌 [Arslan F. et al. Circ. Res., Mar 2011; 108: 582-592 및 WO2012/057613]에 개시되어 있으며, 마우스의 대동맥 수축 (TAC)은 압력 과부하-유도 심장 비대증 및 심부전에 있어서, 통상적으로 사용되는 실험 모델이다).
본 발명의 상세한 설명
면역글로불린-유사 분자, 항체 및 그의 항원-결합 단편
첫 번째 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 GIXXXF (서열번호:1) (여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있음), 아미노산 서열 LFPAP (서열번호:28)에 특이적으로 결합하는 분리된 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분리된"은, 자연에서 그와 일반적으로 동반되는 성분이 실질적으로 또는 필수적으로 부재하는 물질을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역글로불린" (약어 "Ig")은 당업계에 잘 알려져 있으며, 용어 "항체"와 동일하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Ig-유사 분자"는 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 가지는 항원-결합 자리를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 말한다. 상기 용어에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단일 특이적 항체, 다중 특이적 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 및 단일 사슬 항체 (예를 들어, VHH)이 포함된다. 용어 "Ig-유사 분자"에는 또한, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb와 같은 항체 단편 및 기타 항체 단편 또는, 항원 결합 기능을 보유하는 CDR을 포함하는 기타 작제물이 포함된다. 전형적으로, 이러한 단편은 항원-결합 도메인을 포함할 것이다. Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편은 임의의 공지 항체 이소타입 및 그의 형태, IgA, 예컨대 IgA1 또는 IgA2, IgD, IgE, IgG 예컨대 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, 또는 IgM 종류일 수 있거나, IgG1 및 IgG2a 종류의 항체 혼합물과 같은 임의의 조합의 그의 혼합물로 구성될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, Ig-유사 분자, 항체 또는 항원-결합 단편은, IgG4 이소타입, 더욱 바람직하게는, 비교적 높은 수준의 IgG4 반분자 (half-molecule)를 초래하는 사슬내 결합의 해리가 저하된 안정된 IgG4의 것일 수 있다.
면역글로불린 또는 항체는 면역체계-관련 단백질이다. 각 항체는, 결합하여, "Y"자형 분자를 형성하는 4개의 폴리펩티드-2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된다. "Y"의 끝의 아미노산 서열은 다른 항체 사이에서 대폭 변화된다. 110-130개의 아미노산으로 구성되는 가변 영역은 항체에 결합 항원에 대한 그의 특이성을 부여한다. 가변 영역에는 경쇄 및 중쇄의 말단이 포함된다. 불변 영역은 항원을 파괴하는데 사용되는 메커니즘을 결정한다. 항체는, 그의 중쇄 불변 영역 구조 및 면역 기능에 기초하여, 4개의 주요 종류, IgM, IgG, IgA, IgD, 및 IgE로 나뉜다. 또한, 중쇄의 하위 종류가 알려져 있다. 예를 들어, 인간의 IgG 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 하위 종류 중 임의의 것일 수 있다.
가변 영역은 초가변 (HV) 및 프레임워크 (FR) 영역으로 세분된다. HV 영역은, 소정의 위치에서, 그 위치에서 가장 흔한 아미노산과 관련하여, 고비율로 상이한 아미노산을 가진다. 경쇄 및 중쇄 내에, 3개의 HV 영역이 존재한다-HV 1, 2 및 3. 보다 안정된 아미노산 서열을 가지는 4개의 FR 영역이 HV 영역을 구분한다. HV 영역은 항원 표면 일부에 직접 접촉한다. 이러한 이유로, HV 영역은 또한 때로는 상보성 결정 영역 또는 CDR로 언급된다. FR 영역은, 항원과 접촉하는 위치에서, HV 영역을 보유하는 골격으로 기능하는 베타-시트 구조를 형성한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원"은, 각각의 항체에 특이적으로 결합하는 표적 분자를 말한다. 항원에는 일반적으로, 특이적 항체와 상호작용 포인트로 작용할 수 있는 다수의 표면 특성이 존재한다. 임의의 이러한 표면 특성은 에피토프를 구성할 수 있다. 따라서, 대부분의 항원은, 각각 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 다수의 별도의 항체에 의해 결합될 가능성을 가진다.
본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 항원-결합 단편은, 피브로넥틴-EDA 또는 단지 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인 또는 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인의 일부, 예를 들어 특이적 아미노산 영역, 특히 서열번호:1에서 설명된 바와 같은 아미노산 서열 GIXXXF (여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있음) 또는 아미노산 서열 LFPAP (서열번호:28)에 결합할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항원-결합 단편"은 서열번호:1, 서열번호:2 및/또는 서열번호:28에 설명된 바와 같은 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 도메인을 적어도 포함하는 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 예를 들어 항체의 일부 또는 부분으로서 이해된다. 항원-결합 단편은 온전하거나 또는 완전한 Ig-유사 분자, 예를 들어 항체의 화학적 또는 효소적 처리를 통해 얻어질 수 있다. 대안적으로, 항원-결합 단편은 표준 분자 생물학 기술 및 프로토콜을 이용하여 얻을 수 있다. Ig-유사 분자의 항원-결합 단편의 비제한 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체, 및 단일 사슬 항체 분자가 포함된다.
일 실시형태에서, 상기 항원-결합 단편은, 본 명세서에 교시되는 바와 같은 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인에 특이적으로 결합하는 Ig-유사 분자, 바람직하게는, 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인, 더욱 바람직하게는, 서열번호:1, 서열번호:2 및/또는 28에 설명된 바와 같은 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체의 N-말단 부분의 아미노산 서열의 적어도 5개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 10개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 15개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 20개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 25개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 40개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 50개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 60 인접 아미노산 잔기, 적어도 70개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 80개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 90개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 100개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 125개의 인접 아미노산 잔기, 또는 적어도 150개의 인접 아미노산 잔기를 포함한다. 항원-결합 단편은 바람직하게는 Ig-유사 분자의 항원-결합 특이성을 보유한다.
바람직한 실시형태에서, 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄 양자의 총 3개의 CDR, 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄 양자의 전체 가변 도메인을 포함한다.
바람직하게는, Ig-유사 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인에 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시형태에서, Ig-유사 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인의 일부에 특이적으로 결합하며, 여기서 상기 일부는 서열번호 1에 설명된 바와 같은 아미노산 서열을 가진다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "피브로넥틴-EDA에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편"은, 피브로넥틴의 EDA 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 말한다. 이러한 항체 또는 단편은, III 형 반복 외부 도메인 A (EIIIA; EDA)가 결핍된 피브로넥틴에 결합하지 않는다.
당업자는 용어 '특이적으로 결합하는'의 의미를 알 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하는"은, 본 명세서에 교시된 바와 같은 Ig-유사 분자 또는 항체 또는 그의 단편이 항원 또는 특정 에피토프에 대해 상당한 결합 친화력을 나타내며, 바람직하게는 현저한 교차-반응성을 나타내지 않는다는 것을 의미한다. "상당한" 결합 친화력은 적어도 106 M-1, 바람직하게는 적어도 107 M-1, 더욱 바람직하게는 적어도 108 M-1, 더더욱 바람직하게는 적어도 109 M-1, 또는 더더욱 더 바람직하게는 적어도 1010 M-1의 친화력에 의한 결합을 포함한다. "현저한 교차-반응성을 나타내지 않는" 항체는, 피브로넥틴-EDA 발현이 부재하는 원치않는 구성요소 또는 조직에 특이적으로 결합하지 않는 것이다. 특이적 결합은 이러한 결합을 측정하기 위한 당업계에 인지되어 있는 임의의 수단에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표준 분석 및/또는 경쟁 결합 분석 또는 당업계에서 인정되는 기타 분석에 따라 측정될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에 교시된 바와 같은 Ig-유사 분자는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 용어 "모노클로날 항체"는 당업계에 잘 알려져 있다. 이것은 단일 클론 항체 생성 세포의 생성물인 항체를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 모노클로날 항체는 일반적으로, 암 세포와 같은 빠르게 성장하는 세포 (때로는 "불멸의" 세포라 함)에 정상적인 단기간-생존 항체-생성 B 세포를 융합시킴으로써, 제조한다. 생성된 잡종 세포, 또는 하이브리도마는 빠르게 증식되어, 항체를 생성할 수 있는 클론을 생성시킨다. 모노클로날 항체는 다양한 종래 기술에 의해 생성될 수 있다.
본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE와 같은 임의의 면역글로불린 이소타입일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 IgG4이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 포유동물 유래, 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 양, 토끼, 돼지, 개, 말, 소, 닭, 및 쥐과 및 기타 포유류이다.
본 명세서에서 교시되는 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한 잡종 항체, 예를 들어, 키메라 또는 인간화 모노클로날 항체일 수 있다. 본 발명에서, 용어 "잡종 항체"는, 상기 항체의 하나 이상의 영역이 제1 종 (예를 들어, 마우스)으로부터 유래된 항체로부터 유래하며, 상기 항체의 하나 이상의 영역이 상이한 제2 종 (예를 들어, 인간)으로부터 유래된 항체로부터 유래하는 항체를 말한다. 키메라 항체에서, 일반적으로, 상기 항체의 비인간 (예를 들어, 마우스) 불변 영역은 인간 불변 영역에 의해 치환된다.
인간화 항체란, 중쇄 및 경쇄 중 적어도 하나가 인간화된 것, 즉 중쇄 및 경쇄 중 적어도 하나가, 프레임워크 영역의 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 그 전체가 주로 인간인 가변 영역을 포함하는 항체를 의미하는 것으로 이해된다. 인간화 항체의 초가변 (CDR) 영역은 비인간 공급원, 전형적으로 설치류 (예를 들어, 마우스)로부터 유래될 수 있다. 인간화 항체는 경우에 따라 IG 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 바람직하게는 인간 Ig 분자의 것을 포함할 수 있다.
키메라 및 인간화 항체는 CDR 이식 방식 (예를 들어, 미국 특허 제 5,843,708호; 제 6,180,370호; 제 5,693,762호; 제 5,585,089호; 제 5,530,101호), 연쇄 셔플 전략 (예를 들어, 미국 특허 제 5,565,332호; Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95:8910-8915), 분자 모델링 전략 (미국 특허 제 5,639,641호) 등을 포함하여 당해 분야에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 최적의 인간 중쇄 및 경쇄는 비-인간 항체의 3차원 모델과 CDR의 길이에 기반하여 선택한다. 이후에, 인간 및 비-인간 항체 간에 상이하며, 항원 결합에 영향을 미칠 수 있는 프레임워크 영역의 아미노산을 확인한다. 키메라 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 사용에 의해, 인간에서, 면역 거부 위험 또는 기타 이상 면역 반응의 발생이 최소화되거나 또는 제거될 수 있다. 또한, 일반적으로, 키메라, 인간화 또는 인간 항체의 사용시, 비-인간 항체에 비해서 제거율 (clearance)의 저하로 인해, 긴 순환 반감기가 획득된다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 인간화 항체이다. 본 발명에 따른 인간화 항체는 바람직하게는 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하며, 더욱 바람직하게는 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 쥐과 항체의 인간화 항체 (27A12.70 및 33E3.10)를 제공한다.
생식 세포 유전자 VK2-29 및 JK4가 인간화 항체 27A12.70의 경쇄의 수용체 서열로서 사용되며, 생식 세포 유전자 VH4-31 및 JH4가 인간화 항체 27A12.70의 중쇄의 수용체 서열로 사용된다. 서열번호:34 및 서열번호:35는 인간화 항체 27A12.70의 중쇄 및 경쇄 각각의 서열을 제공한다. 생식 세포 유전자 VK1-12 및 JK4가 인간화 항체 33E3.10의 경쇄의 수용체 서열로 사용되며, 생식 세포 유전자 VH3-23 및 JH4가 인간화 항체 33E3.10의 중쇄의 수용체 서열로 사용된다. 서열번호:36 및 서열번호:37은 인간화 항체 33E3.10의 중쇄 및 경쇄 각각의 서열을 제공한다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 항체는 IgG4 하위 유형의 인간화 항체이다. IgG4 항체가 생체 내에서 다른 IgG 하위 유형 항체와는 다르게 거동한다는 것이 당업계에 알려져 있다. IgG4 분자는, 중쇄 간 이황화 결합이 형성되는 형태 및 상기 결합 중 하나 또는 양자가 형성되지 않는 형태 둘 모두로 생성된다. 중쇄간 이황화 결합이 결핍된 IgG4 형태는, 또한 반분자로서 언급되는, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로 구성된다. IgG4의 이러한 유연성의 원인은 IgG4 힌지 영역의 핵심 서열에 존재한다고 여겨진다. 이러한 영역은 Cys-Pro-Ser-Cys로 구성되고, 반면 IgG1 및 IgG2의 해당 서열은 Cys-Pro-Pro-Cys이다. IgG4 유연성의 결과, 생체 내에서, IgG4는, 상이한 항원 특이성을 가지는 2개의 IgG4가 결합된 결과로서 형성되는 반 분자, 단일 특이적 항체 및 이중 특이적 항체를 포함하여, 다수의 형태로 존재한다. 항체의 치료 용도에 있어서, 상기 항체의 생체 내 안정성이 바람직하기 때문에, 반분자 및 이중 특이적 항체의 형성은 바람직하지 않다. 따라서, 반분자의 형성이 감소되고, 생체 내에서 교체되는 안정된 IgG4 분자가 설계되었다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 인간화 IgG4 항체는 안정된 IgG4 항체이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안정된 IgG4 항체"는 반분자의 형성이 감소되고, 교체되도록 변형된 IgG4 항체를 말한다. 적절한 안정된 IgG4의 예는, 인간 IgG4의 중쇄 불변 영역의 위치 409의 아르기닌 (Kabat numbering, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991)이 리신, 트레오닌, 메티오닌 또는 류신으로 치환되고, 및/또는 IgG4의 힌지 영역이 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함하는 항체이다. 항체 27A12.70의 중쇄 및 경쇄 CDR을 가지는 바람직한 안정된 인간화 IgG4의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호:34 및 서열번호:35에 제시되며, 항체 33E3.10의 중쇄 및 경쇄 CDR을 가지는 바람직한 인간화 IgG4의 아미노산 서열은 각각 서열번호:36 및 서열번호:37에 제시된다. 바람직한 실시형태에서, 하나 또는 그 이상의 이러한 바람직한 안정된 IgG4 중쇄 및 경쇄의 불변 영역과 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 본 발명에서 개시되는 다른 항체의 인간화에 사용된다.
따라서, 서열번호:1 또는 서열번호:2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편이 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 서열번호:34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, 상기 경쇄가 서열번호:35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다. 서열번호:28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편이 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 서열번호:36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, 상기 경쇄가 서열번호:37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 추가로 제공된다.
서열번호:1, 서열번호:2 또는 서열번호:28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편이 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 서열번호:34 또는 서열번호:36에 제시된 바와 같은 IgG4 중쇄의 프레임워크 영역 중 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 그 전체를 포함하는 인간화 가변 영역을 포함하며, 상기 경쇄가 서열번호:35 또는 서열번호:37에 제시된 바와 같은 IgG4 경쇄의 프레임워크 영역 중 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 그 전체를 포함하는 인간화 가변 영역을 포함하는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 추가로 제공된다. 서열번호:1, 서열번호:2 또는 서열번호:28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 단편이 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 서열번호:34 또는 서열번호:36에 제시된 바와 같은 IgG4 중쇄의 불변 영역 (바람직하게는 서열번호:34의 아미노산 118-444 또는 서열번호:36의 아미노산 112-438)을 포함하며, 상기 경쇄가 서열번호:35 또는 서열번호:37에 제시된 바와 같은 IgG4 경쇄의 불변 영역 (바람직하게는 서열번호:35의 아미노산 114-219 또는 서열번호:37의 아미노산 109-214)을 포함하는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 추가로 제공된다. 또한, 상기 중쇄 및/또는 경쇄는 서열번호:34 또는 서열번호:36에 제시된 바와 같은 IgG4 중쇄의 프레임워크 영역 중 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 그 전체를 포함하는 가변 영역, 및/또는 서열번호:35 또는 서열번호:37에 제시된 바와 같은 IgG4 경쇄의 프레임워크 영역 중 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 그 전체를 포함하는 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 항체는 바람직하게는 항체 27A12.70, 29E7.35, 17G8.72 또는 33E3.10의 중쇄 및 경쇄 CDR을 추가로 포함한다. CDR 서열은 서열번호:3-8 (27A12.70), 서열번호:9-14 (29E7.35), 서열번호:15-20 (17G8.72) 및 서열번호:29-33 (33E3.10)에 제시된다.
또한, 혈관 신생 개선을 위해 사용하기 위한, 바람직하게는 허혈성 조직, 섬유성 조직, 압력-과부하 병증, 상처 조직에서 및/또는 기관 또는 조직 이식시, 혈관 신생 개선을 위해 사용을 위한, 피브로넥틴-EDA와 결합하는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 단편이 서열번호:1, 서열번호:2 또는 서열번호:28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 특이적으로 결합하며, 상기 항체 또는 그의 단편이 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 서열번호:34 또는 서열번호:36에 제시된 바와 같은 IgG4 중쇄의 불변 영역을 포함하며, 상기 경쇄가 서열번호:35 또는 서열번호:37에 제시된 바와 같은 IgG4 경쇄의 불변 영역을 포함하는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다. 또한, 상기 중쇄 및/또는 경쇄, 바람직하게는 둘 모두는, 서열번호:34 또는 서열번호:36에 제시된 바와 같은 IgG4 중쇄의 프레임워크 영역 중 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 그 전체를 포함하는 가변 영역, 및/또는 서열번호:35 또는 서열번호:37에 제시된 바와 같은 IgG4 경쇄의 프레임워크 영역 중 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 그 전체를 포함하는 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 항체는 바람직하게는 항체 27A12.70, 29E7.35, 17G8.72 또는 33E3.10의 중쇄 및 경쇄 CDR을 추가로 포함한다.
일 측면에서, 본 명세서에서 교시되는 Ig-유사 분자 또는 항원-결합 단편은 아미노산 서열 GIXXXF (서열번호:1)에 특이적으로 결합하며, 여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있다.
일 실시형태에서, 서열번호:1의 위치 3의 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있다. 대안적으로, 서열번호:1의 위치 3의 아미노산은 히스티딘, 아르기닌, 리신, 알라닌으로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 서열번호:1의 위치 3의 아미노산은 히스티딘이다.
유사하게, 서열번호:1의 위치 4의 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있다. 서열번호:1의 위치 4의 아미노산은 바람직하게는 글루탐산 및 알라닌으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 서열번호:1의 위치 4의 아미노산은 글루탐산이다.
서열번호:1의 위치 5의 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 서열번호:1의 위치 5의 아미노산은 류신 및 알라닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 작은 아미노산이다. 바람직한 실시형태에서, 서열번호:1의 위치 5의 아미노산은 류신이다.
더욱 바람직한 실시형태에서, Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 GIHELF (서열번호:2)에 특이적으로 결합한다. 본 발명자는, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자 또는 그의 단편이 서열번호:2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 높은 친화력으로 결합한다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 또한, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 단편이 심근 경색 후, 생존율의 증가 및 심장 기능의 개선을 초래한다는 것을 발견하였다. 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 단편이, 이들이 심장 조직에서 근섬유아세포의 양에 영향을 미치지 않으며, 콜라겐 생성을 방해하지 않음으로 인해, 더욱 바람직하다는 것을 추가로 발견되었다. 경색 영역의 파열을 방지하기 위해, 이러한 조직의 단단한 콜라겐 기반 흉터를 가지는 것이 중요하기 때문에, 이러한 것이 유리하다. 실시예 5에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 피브로넥틴-EDA 결합 항체에 의한 처리는 적절한 흉터 생성에 영향을 미치지 않는다. 또한, 항-피브로넥틴 EDA 처리가 무세포 매트릭스의 제거를 지연시킨다는 것이 발견되었다. 이러한 임시 무세포 매트릭스의 형성은 MI 후 비생존 조직의 혈역학적 보충 및 흉터 형성을 위해 매우 중요하다. 상처 치유 과정 동안, 임시 매트릭스는 서서히 분해되고, 단단한 콜라겐-기반 흉터로 대체된다.
비 허혈성 병증에서, EDA의 부재가 또한 마우스에서 심장의 압력 과부하 후, 유해 리모델링에 대해 보호한다. 심장 기능 및 심장/체중 (심부전 및 이후 울혈 정도에 대한 마커) 둘 모두 EDA 결핍 생쥐에서 현저히 개선되었다. 이러한 자료에 의해, 압력 과부하 병증 (예를 들어, 고혈압, 판막 질환 및 비허혈성 심근 병증)에서, 항-EDA 처리가 치료학적 가치를 가진다는 것이 입증된다.
본 발명은 또한, 서열번호:3에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:3에 제시된 것과 같은 아미노산 서열 (여기서, 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨)을 가지는 상보성 결정 영역 (CDR)1, 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:4에 제시된 것과 같은 아미노산 서열 (여기서, 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨)을 가지는 CDR2, 및 서열번호:5에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:5에 제시된 것과 같은 아미노산 서열 (여기서, 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨)을 가지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
예를 들어, 서열번호:3의 위치 5의 트레오닌이 또한 알라닌일 수 있다는 것이 발견되었다. 또한, 서열번호:4의 위치 4의 티로신이 또한 페닐알라닌일 수 있으며, 서열번호:4의 위치 7의 이소류신이 또한 세린일 수 있다는 것이 발견되었다. 마지막으로, 서열번호:5의 위치 2의 리신이 또한 알라닌일 수 있으며, 서열번호:5의 위치 3의 트레오닌이 또한 아르기닌일 수 있고, 서열번호:5의 위치 5의 페닐알라닌이 또한 티로신일 수 있다는 것이 발견되었다.
- 아미노산 서열 GYSIX1SGYSWH을 갖는 CDR1, 여기서 X1은 T 및 A에서 선택됨 (서열번호:21);
- 아미노산 서열 YIHX2SGX3ANYNPSLKS을 갖는 CDR2, 여기서 X2는 Y 및 F에서 선택되고, X3은 S 및 I에서 선택됨 (서열번호:22); 및
- 아미노산 서열 EX4X5GX6FDY을 갖는 CDR3, 여기서 X4는 K 및 A에서 선택되고, X5는 T 및 R에서 선택되고, X6은 F 및 Y에서 선택됨 (서열번호:23);
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 또한 제공된다.
본 발명은 또한, 서열번호:6에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:6에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:7에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:7에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:8에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:8에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
예를 들어, 서열번호:6의 위치 6의 류신이 또한 이소류신일 수 있으며, 서열번호:6의 위치 8의 히스티딘이 또한 아르기닌일 수 있고, 서열번호:6의 위치 16의 히스티딘이 또한 트레오닌일 수 있다는 것이 발견되었다. 또한, 서열번호:8의 위치 1의 세린이 또한 페닐알라닌일 수 있으며, 서열번호:8의 위치 3의 세린이 또한 글리신일 수 있고, 서열번호:8의 위치 4의 알라닌이 또한 세린일 수 있다는 것이 발견되었다.
- 아미노산 서열 RSSQSX7VX8SNGNTYLX9을 갖는 CDR1, 여기서 X7은 L 및 I에서 선택되고, X8은 H 및 R에서 선택되고, X9는 H 및 T에서 선택됨 (서열번호: 24);
- 아미노산 서열 KVSNRFS을 갖는 CDR2 (서열번호: 25); 및
- 아미노산 서열 X10QX11X12HVPPT을 갖는 CDR3, 여기서 X10은 S 및 F에서 선택되고, X11은 S 및 G에서 선택되고, X12는 A 및 S에서 선택됨 (서열번호: 26);
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 또한 제공된다.
바람직한 실시형태에서, 이러한 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호:3에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:3에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:4에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:5에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:5에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호:6에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:6에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:7에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:7에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:8에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:8에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명자는, 본 실시형태의 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 심장 및 혈관 리모델링, 심근 경색- 및 압력-과부하-관련 합병증의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방에 특히 적합하다는 것을 발견하였다. 특히, 본 실시형태의 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 심근 경색 후, 생존율의 증가 및 심장 기능의 개선에 특히 효과적이라는 것이 발견되었다. 또한, 본 발명의 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 심근 경색 후, 심장의 팽창 및 파열의 예방에 중요한 것으로서, 이들이 무세포 매트릭스의 제거를 지연시키고, 적절한 흉터 형성에 영향을 미치지 않으므로, 특히 바람직하다. 또한, 본 발명의 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 이들이 또한 심근 경색 후, 경색 및 경계 지역에서, 혈관 신생을 개선시키고, 따라서, 상처 치유의 개선 및 유해 리모델링의 예방에 기여하므로, 바람직하다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 이러한 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
- 아미노산 서열 GYSIX1SGYSWH을 갖는 CDR1, 여기서 X1은 T 및 A에서 선택됨 (서열번호:21);
- 아미노산 서열 YIHX2SGX3ANYNPSLKS을 갖는 CDR2, 여기서 X2는 Y 및 F에서 선택되고, X3은 S 및 I에서 선택됨 (서열번호:22); 및
- 아미노산 서열 EX4X5GX6FDY을 갖는 CDR3, 여기서 X4는 K 및 A에서 선택되고, X5는 T 및 R에서 선택되고, X6은 F 및 Y에서 선택됨 (서열번호:23);
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
- 아미노산 서열 RSSQSX7VX8SNGNTYLX9을 갖는 CDR1, 여기서 X7은 L 및 I에서 선택되고, X8은 H 및 R에서 선택되고, X9는 H 및 T에서 선택됨 (서열번호: 24);
- 아미노산 서열 KVSNRFS을 갖는 CDR2 (서열번호: 25); 및
- 아미노산 서열 X10QX11X12HVPPT을 갖는 CDR3, 여기서 X10은 S 및 F에서 선택되고, X11은 S 및 G에서 선택되고, X12는 A 및 S에서 선택됨 (서열번호: 26);
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 이러한 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
- 서열번호:3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
- 서열번호:6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 이러한 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
- 서열번호:9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
- 서열번호:12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:13에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
- 서열번호:15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
- 서열번호:18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 LFPAP (서열번호:28)에 특이적으로 결합한다. 본 발명자는, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자 또는 그의 단편이 서열번호:28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 높은 친화력으로 결합한다는 것을 발견하였다. 본 발명자는, 본 명세서에서 교시되는 Ig-유사 분자가 심근 경색 후, 생존율의 증가를 초래한다는 것을 발견하였다.
본 발명은 또한 서열번호:29에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:29에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:30에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:30에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 아미노산 서열 SHY을 갖는 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호:31에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:31에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:32에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:32에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:33에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:33에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
일 실시형태에서, Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호:29에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:29에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:30에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:30에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 아미노산 서열 SHY을 갖는 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호:31에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:31에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:32에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:32에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:33에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:33에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
적절한 실시형태에서, 또한, 본 발명은 서열번호:31에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:31에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:32에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:32에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:33에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:33에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서, 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
일 실시형태에서, Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
- 서열번호:29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 아미노산 서열 SHY을 갖는 CDR3;
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
- 서열번호:31에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
- 서열번호:32에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
- 서열번호:33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명자는, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 항원-결합 단편이 모두, 심근 경색 후, 생존율의 증가 및 심장 기능의 개선에 특히 효과적이라는 것을 발견하였다. 또한, 본 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 무세포 매트릭스의 제거를 지연시키고, 적절한 흉터 형성에 영향을 미치지 않으며, 이것은 심근 경색 후, 심장의 팽창 및 파열의 예방에 중요하다는 것이 발견되었다.
본 발명의 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 (분리된) 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명에서, 용어 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드 분자"는 임의의 길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미하는 것으로 이해되며, DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변이된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그 유사체, 또는, DNA 또는 RNA 중합효소 또는 합성 반응에 의해, 중합체로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩할 수 있는 핵산 분자의 제조, 합성 및 생성을 위한 방법 및 표준 프로토콜은 종래의 분자 생물학 기술을 통해, 당업계에 잘 알려져 있다.
본 명세서에서 교시되는 Ig-유사 분자가 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체인 경우, 2개의 핵산 분자, 즉, 하나의 핵산 분자는 경쇄의 아미노산 서열을 인코딩하고, 두 번째 핵산 분자는 중쇄의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자가 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본 발명에서, 핵산 분자의 일 세트로서, 상기 세트가, 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 항체의 경쇄를 인코딩하는 첫 번째 핵산 분자 및, 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 항체의 중쇄를 인코딩하는 두 번째 핵산 분자를 포한하는 핵산 분자의 일 세트가 제공될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 및 그의 항원-결합 단편을 인코딩할 수 있는, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 용어 "벡터"는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 복제되고/거나 발현될 수 있는 또 다른 세포에 연결된 외래 유전 물질 (즉, 핵산 분자)을 인위적으로 운송 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 특정 벡터는, 이들이 도입되는 숙주 세포에서, 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 에피솜 포유동물 벡터 및, 박테리아 복제 기원을 가지는 박테리아 벡터). 숙주 세포로의 도입시, 다른 벡터 (예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)가 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있으며, 이에 따라, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 벡터는, 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 포함할 수 있다. 벡터는 "발현 벡터"일 수 있다. 다른 유형의 벡터는 코스미드 및 인공 염색체를 포함한다. 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자 또는 그의 단편을 인코딩할 수 있는 핵산 분자를 포함하는 적절한 벡터의 제조를 위한 방법 및 표준 프로토콜이 또한 당업자에 잘 알려져 있다.
일 실시형태에서, 벡터 (들)는 바람직하게는 (a) 유전자 치료 벡터 (들)이다. 본 발명은 또한 본 발명의 벡터 (들) 또는 핵산 (들)을 포함하고, 임의로 발현시키는 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 포유동물 숙주 세포는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 상업적으로 구할 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비제한 예로는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 쥣과 동물 골수종 세포 및 PER.C6® 인간 세포가 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 포유동물 숙주 세포는 하이브리도마이다. 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 항체 또는 Ig-유사 분자 또는 그의 단편의 생성을 위해, 배양 배지에서, 불멸의 B 세포 (immortalized B cell)를 생성 및 유지하기 위한 방법 및 프로토콜은 당업계에 잘 공지되어 있다.
약제학적 조성물
본 발명은 또한 (a) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, (b) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 핵산, (c) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 (d) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 (b)의 핵산 또는 (c)의 벡터를 발현하는 숙주 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제; 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 것으로서, 인간 및 동물의 조직과 접촉시, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 사용하기에 적합한, 건전한 의학적 판단의 범위 내의 이러한 조성물 또는, 제제, 재료 또는 조성물의 조합물 및/또는 이들의 투여 형태를 말한다. 또한, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체"는 신체의 일 기관 또는 일부분으로부터 신체의 다른 기관 또는 일부분으로 대상 화학 물질을 운송 또는 수송하는데 포함되는 약제학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고형 필터, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 의학계에서 광범위하게 사용되는 재료의 다른 예는, 이로 제한되는 것은 아니나, 중합체-기반 또는 흡수성 (즉, 생분해성) 스텐트를 비롯한 스텐트이다. 당업계에서, 이러한 스텐트는 약제-용출 스텐트라고 한다. 본 발명에서, 스텐트는, 약제학적 조성물을 목적 위치 (예를 들어, 허혈성 뇌 손상/뇌졸중의 경우, 경동맥 또는 그의 말초 혈관, 심근 경색의 경우, 경동맥)에 방출되도록 하기 위해, 약제학적 조성물을 포함하거나 또는 그에 의해 도포된다. 약제학적으로 허용 가능한 담체로서 기능할 수 있는 물질의 다른 비제한 예에는: (1) 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 셀룰로오스, 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 그의 유도체; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩 유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 한천; (14) 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄과 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열 물질 무함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) 인산 완충액; 및 (21) 약제학적 제형물에 사용되는 기타 비-독성 상용 물질이 포함된다.
상기 약제학적 조성물은 임의의 적합한 경로 및 방식에 의해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 비경구, 국소, 경구, 설하, 경피 등의 임의의 경로에 의한 투여 또는 약제-용출 스텐트를 통한 투여를 위해, 통상의 절차에 따라 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 멸균 비경구 용액 또는 현탁액과 같은 알약, 캡슐, 분말, 약제 용출 스텐트, 과립제, 로젠지, 크림 또는 액체 제제의 형태 또는 스프레이, 에어로졸 또는 다른 종래의 흡입 방법의 형태일 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에는 경구, 비강, 국소 (구강 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여에 적합한 것들이 포함된다.
일 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 비경구 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"은 일반적으로 주사에 의한, 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 제한없이, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 관상동맥 내, 경막 내, 피막 내, 안와 내, 심장 내, 피내, 복강 내, 기관지경, 피하, 표피 하, 관절 내, 낭하, 지주막 하, 척수 내, 경막 외 및 흉골 내 주사 및 주입이 포함된다.
일 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 정맥 내 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
약제학적으로 허용 가능한 담체에는 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말이 포함된다. 약제학적 활성 물질에 있어서 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져있다. 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 상용되지 않는 한, 본 발명의 약제학적 조성물에서의 그의 용도가 고려된다. 바람직하게는, 상기 담체는 비경구 투여, 예를 들어 정맥 주사 또는 주입에 적합하다.
약제학적 조성물은 일반적으로 제조 및 보관 조건 하에서 멸균 및 안정해야 한다. 상기 조성물은 고농도의 약물에 적합한 용액, 마이크로 에멀젼, 리포좀, 또는 기타 정연한 구조로서 제형화될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예에는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스테르가 포함된다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우, 필요한 입자 크기의 유지 및 계면 활성제의 사용에 의해, 적절한 유동성이 유지될 수 있다.
상기 주사용 조성물의 흡수의 연장은, 조성물에 흡수 지연제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함함으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사액은, 예를 들어, 필요에 따라, 상기 열거된 바와 같은 성분 중 하나 또는 그의 조합물을 이용하여, 필요한 양의 적절한 용매 중에 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 혼입시키고, 멸균 정밀 여과시킴으로써, 제조될 수 있다. 일반적으로 분산액은, 예를 들어, 상기에서 열거된 것 외에, 필요한 다른 성분 및 기본 분산 매질을 포함하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은, 그의 사전 멸균 여과 용액으로부터 활성 성분 및 바람직한 임의의 추가 성분 분말을 생성시키는 진공 건조 및 냉동 건조 (동결 건조,lyophilisation)이다.
투여 섭생은 바람직한 최적의 치료 반응이 제공되도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 수회로 분할된 투여량이 시간에 따라 투여될 수 있거나, 투여량은, 치료 상황의 위급성에 따라, 지정된 바와 같이 비례하여 감량 또는 증량될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해, 비경구 조성물을 투여량 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 투여량 단위 형태는, 단일 투여량으로서, 처리 대상체에 적합한 물리적으로 별도인 단위를 말하며; 각 단위에는, 필요한 약제학적 담체와 관련하여, 원하는 치료 효과가 생성되도록 계산된 소정량의 활성 화합물이 포함된다.
본 발명의 투여량 단위 형태에 대한 설계서는, (a) 활성 화합물의 고유 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, (b) 개체의 민감성 처리에 있어서, 이러한 활성 화합물을 배합하는 기술 분야에 내재된 한계, 및 (c) 관련 질환 객체에서, 피브로넥틴-EDA의 발현 수준 및 기간에 따라 지시되고 직접적으로 의존한다. 예를 들어, 피브로넥틴-EDA 발현은 급성 심근 경색 후, 2 내지 3주에 최고에 도달하며, 5 내지 6주에 기준 수준으로 감소된다. 항-피브로넥틴-EDA 화합물 (예를 들어, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편)의 반감기에 따라, 상기 화합물은, 피브로넥틴-EDA의 전체 발현 기간을 포괄하기에 바람직한 경우, 1회, 2회, 3회 또는 그 이상의 횟수로 투여될 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물 중의 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 실제 투여량 수준은, 환자에 대해 독성이 없는 것으로서, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 있어서, 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 Ig-유사 분자 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양 ("유효량")이 얻어지도록, 변경될 수 있다. 선택된 투여 수준은, 사용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 횟수, 배출률, 처리 기간, 사용되는 특정 조성물과 병용되는 다른 약제, 화합물 및/또는 물질, 치료 환자의 연령, 성별, 체중, 병증, 일반적 건강 상태 및 이전 병력 및 의학계에 잘 알려진 유사 요인을 비롯한 다양한 약동학적 요인에 의존할 것이다
본 발명의 방법 및 용도
본 발명은 또한, 허혈성 손상 후, 피브로넥틴-EDA-매개 상처 치유시, 고유 혈관 반응을 개선시키기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 혈관 신생 자극시, 사용하기 위한 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 또한 제공된다. 실시예 5에서 입증되는 바와 같이, 본 발명자는, 심근 경색 후, 항-피브로넥틴-EDA 항체에 의한 처리가 심장, 특히 심장의 경색 부위 및 심장의 비손상 부위와 경색 부위의 경계 지역 양자에서, 혈관 형성을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 또한, 시험관 내 발아 분석(spouting assay)은, 피브로넥틴-EDA가 내피 세포의 발아를 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 종합하면, 이러한 발견은, 피브로넥틴-EDA가 경색 심장에서 혈관 신생을 억제한다는 것을 시사한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 피브로넥틴-EDA가, 이들 세포의 α1 인테그린에 결합함으로써, 내피 세포의 발아를 억제하며, 항-피브로넥틴-EDA 항체에 의해 야기되는 혈관 형성의 증가가 이러한 억제의 방지로 인한 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명자는, 항-피브로넥틴-EDA 항체가 조직 손상 후 혈관 신생에 대한 피브로넥틴-EDA의 억제 효과를 방지하는데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 항종양제로서, 항-피브로넥틴-EDA 항체의 사용이 현재 고려되고 있으므로, 이것은 특히 놀랍다. 본 발명자의 발견과는 대조적으로, 피브로넥틴-EDA가 종양 혈관 주위에서 고도로 상향 조절된다는 것이 발견되었고, 피브로넥틴-EDA가 종양의 혈관 신생과 관련되는 것으로 생각된다.
심근 경색 후의 심장 이외에, 일반적으로, 혈관 반응의 개선이 허혈성 손상 후 유리한 효과를 가지는 다른 허혈성 조직에서, 피브로넥틴-EDA가 상향 조절될 수 있다.
따라서, 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료학적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 혈관 신생을 개선하는 방법이 제공된다. 또한, 혈관 신생 개선을 위해 사용하기 위한 것으로서, 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다. 바람직하게는, 허혈성 손상 후, 피브로넥틴-EDA-매개 상처 치유시, 혈관 신생이 개선된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "혈관 신생 개선"은, 바람직하게는, 피브로넥틴-EDA가 발현되나, 본 발명에 따른 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체는 존재하지 않는 손상 후 조직의 혈관 신생 수준에 비해서, 본 발명에 따른 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체의 투여 후, 바람직하게는 손상 후, 조직의 혈관 신생 수준이 증가한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 이러한 항체는 존재하지 않으나, 바람직하게는, 피브로넥틴-EDA가 발현되는 상황에 비해서, 본 발명에 따른 이러한 항체는 혈관 신생을 유도한다. 바람직하게는, 손상 후 조직, 예를 들어 허혈성 조직, 상처, 섬유성 조직에서 및/또는 기관 또는 조직 이식시, 혈관 신생이 개선된다. 바람직하게는, 허혈성 질환, 특히 심장 허혈증, 말초 허혈증 및/또는 말초 동맥 질환을 앓고 있는 대상체, 섬유성 질환, 압력-과부화 병증, 상처에서 및/또는 기관 또는 조직 이식시, 가장 바람직하게는 허혈성 질환을 앓고 있는 대상체에서, 혈관 신생이 개선된다. 바람직하게는, 허혈성 조직, 예를 들어 심장 허혈성 조직 또는 말초 허혈성 조직, 섬유성 조직, 압력-과부화 병증, 상처 조직에서 및/또는 기관 또는 조직 이식시, 혈관 신생이 개선된다. 가장 바람직하게는, 허혈성 조직에서, 혈관 신생이 개선된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "허혈성 질환"은, 하나 또는 그 이상의 기관 또는 조직이 허혈증에 의해 영향을 받는 질환을 의미한다. 허혈성 질환의 예로는 심장 허혈증, 말초 허혈증 및 말초 동맥 질환이 있다. 심장 허혈 또는 그 원인의 예에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 심근 경색, 승모판막 질환, 만성 심방세동 및, 혈전이 발생할 수 있는 심근 병증이 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "말초 허혈증"은, 말초 동맥 질환과 연관될 수 있는 것으로서, 사지 중 하나 또는 그 이상으로의 혈액 공급이 감소하는 병증을 말한다. 말초 허혈증의 원인의 예에는 색전증, 혈전증, 절개 (dissection), 정맥 폐색, 동맥 경화, 동맥류 및 외상이 포함된다. "압력 과부하 병증"은 당업계에 잘 알려진 용어로서, 압력 과부하 병증의 바람직한 비 제한 예에는 고혈압, 판막 질환 및 비 허혈성 심근증이 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편은 혈관 신생을 자극하기 위해 사용된다. 혈관 신생 자극을 위해 사용하기 위한, 서열번호:1, 서열번호:2 또는 서열번호:28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 분리된 면역글로불린 (Ig)-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다.
바람직하게는,
- 서열번호:3에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR1; 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR2; 및 서열번호:5에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호:6에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR1; 서열번호:7에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR2; 및 서열번호:8에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
- 서열번호:9에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR1; 서열번호:10에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR2; 및 서열번호:11에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호:12에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR1; 서열번호:13에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR2; 및 서열번호:14에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
- 서열번호:15에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR1; 서열번호:16에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR2; 및 서열번호:17에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호:18에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR1; 서열번호:19에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR2; 및 서열번호:20에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
- 서열번호:29에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR1; 서열번호:30에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR2; 및 아미노산 서열 SHY을 가지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호:31에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR1; 서열번호:32에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR2; 및 서열번호:33에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 청구항 제10항에 따른 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편;
으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 혈관 신생을 개선하기 위해, 바람직하게는, 허혈성 질환을 앓고 있는 대상체, 섬유성 질환, 과부하 압력 병증, 상처에서 및/또는 기관 또는 조직 이식시, 혈관 신생을 개선하기 위해 이용된다. 더욱 바람직하게는, 이러한 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 허혈성 조직, 예를 들어 심장 허혈성 조직 또는 말초 허혈성 조직, 섬유성 조직, 압력-과부하 병증, 상처 조직에서 및/또는 기관 또는 조직 이식시, 가장 바람직하게는 허혈성 조직에서, 혈관 신생을 개선하기 위해 이용된다. 바람직하게는, 이러한 항체는 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 인간화 항체, 바람직하게는 멸균 인간화 IgG4 항체이다.
(a) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, (b) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 (a) 핵산 분자 (들)를 포함하는 핵산, (c) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 핵산 분자 (들)를 포함하는 하나 또는 그 이상의 벡터 (들) 및 (d) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 핵산 분자 (들)를 발현하는 숙주 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제의 치료학적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 혈관 신생을 개선하는 방법이 추가로 제공된다.
또한, 이를 필요로 하는 대상체의 혈관 신생을 개선시키는데 이용하기 위한, (a) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, (b) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 (a) 핵산 분자 (들)를 포함하는 핵산, (c) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 핵산 분자 (들)를 포함하는 하나 또는 그 이상의 벡터 (들) 및 (d) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 핵산 분자 (들)를 발현하는 숙주 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제가 제공된다.
본 발명은, 본 명세서에서 개시되는 바와 같이, 혈관 신생의 자극을 위해 사용하기 위한 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관 신생 자극 방법이 제공된다.
본 발명은 또한, 유해 심장 및 혈관 리모델링 및 심근 경색- 및 압력-과부하-관련 합병증의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 이러한 방법은 (a) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, (b) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 (a) 핵산 분자 (들)를 포함하는 핵산, (c) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 핵산 분자 (들)를 포함하는 하나 또는 그 이상의 벡터 (들) 및 (d) 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 핵산 분자 (들)를 발현하는 숙주 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량"은 목적하는 치료 및/또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 양, 예를 들어, 심부전 또는 하나 또는 그 이상의 심부전 관련 증상과 같은, 심근 경색 및/또는 압력-과부하와 연관되거나, 관련되거나 또는 그로부터 초래되는 질환 또는 병증 및/또는 유해 심장 리모델링의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방을 야기하는 양을 말한다.
본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 항원-결합 단편은 가슴 통증, 호흡 곤란, 부종 및 심비대와 같은, 심근 경색 및/또는 심부전의 하나 또는 그 이상의 신호 또는 증상을 가지는 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 항원-결합 단편의 "치료학적 유효량"은, 심부전와 같은, 심근 경색, 압력-과부하 및/또는 유해 심장 리모델링과 연관되거나, 관련되거나 또는 그로부터 초래되는 질환 또는 병증의 생리학적 영향이 최소한으로 개선되는 수준을 의미한다. 당업자는, 이러한 질환 또는 병증이 치료, 예방되거나 또는 그 진행이 예방된 시기를 측정할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 예를 들어 모노클로날 항체의 유효량은 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 10 g/kg, 예를 들어 약 1 ㎍/kg 내지 약 1 g/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 범위 내일 수 있다.
본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 심근 경색 후, 단일 투여량으로 1회 투여될 수 있거나 또는 수회에 걸쳐 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 심근 경색 직후 (즉, 심근 경색 후, 48시간 내), 정맥내로 투여된 후, 본 발명의 결합 구성원의 첫 번째 투여일에, 하나 또는 그 이상의 정맥내 투여로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 최적의 치료 또는 예방 효과를 달성하기 위해, 약 2 시간 내지 약 14일, 예를 들어 약 4시간 내지 약 10일, 약 6시간 내지 약 8일, 약 8시간 내지 약 6일, 약 12시간 내지 약 4일, 또는 약 24시간 내지 약 2일의 간격으로 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 치료 이점은 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 방법에 따른 대상체의 치료 후에 관찰한다. 예를 들어, 치료 이점은 하기 사항을 관찰함으로써 예시될 수 있다: 1) 대상체에서, 유해 심장 리모델링 및 심근 경색- 및 압력-과부하-관련 병증의 진행의 예방 및/또는 2) 대상체에서, 유해 심장 리모델링 및 심근 경색, 압력-과부하와 관련되거나 또는 그로부터 초래되는 합병증 수준의 감소 또는 저하 및/또는 3) 대상체에서, 유해 심장 리모델링 및 심근 경색, 압력-과부하와 관련되거나 또는 그로부터 초래되는 합병증이 발병하거나 또는 그러한 합병증을 앓을 수 있는 위험의 저하 및/또는 4) 대상체에서, 유해 심장 리모델링 및 심근 경색-, 압력-과부하 관련 병증의 진행의 중단 및/또는 5) 대상체에서, 유해 심장 리모델링 및 심근 경색, 압력-과부하 이후, 생존율의 증가.
본 발명에서, 심근 경색, 압력-과부하 및 부정적 심장 리모델링과 관련되거나 또는 그로부터 초래되는 질환 병증에는, 심부전; 원위 심근 섬유증; 동맥류 또는 심실 파열; 특히 경색이 크고, 중증의 심실 팽창을 초래할 가능성이 있는 경우, 승모판 폐쇄 부전; 및 심실 확대, 반응성 및/또는 대체성 (흉터) 섬유증으로 인한 심실세동 및 심실 빈맥과 같은 부정맥과 같은 병증 또는 질환이 포함된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 단편 및 그를 이용한 방법은 심근 경색- 및 압력-과부하-관련 병증 (예를 들어, 심부전; 원위 심근 섬유증; 동맥류 또는 심실 파열; 특히 경색이 크고 심각한 심실 팽창을 일으킬 가능성이 있는 경우, 승모판 폐쇄 부전; 및 심실 확대, 반응성 및/또는 대치 (흉터) 섬유증으로 인한 심실세동 및 심실 빈맥과 같은 부정맥)의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방에 특히 적합하다.
Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 단편은 또한, 부정적 조직 리모델링, 예를 들어, 고혈압 및/또는 대동맥 판막 협착증으로부터 초래되는 심장 기능의 저하 및 섬유증; 심장 이식 후 초래되는 동종 이식 거부 반응; 폐 섬유증으로부터 초래되는 폐고혈압 및 폐기능 장애; 관절염 및/또는 골관절염으로부터 초래되는 관절 기능 장애; 허혈성 뇌졸중으로부터 초래되는 발작, 마비 및/또는 부전마비, 및 뇌경색의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방에 적합할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 다른 치료 이점은 하기 사항을 관찰함으로써, 예시될 수 있다: 1) 고혈압 및/또는 대동맥 협착을 앓고 있는 대상체에서, 심부전의 감소 또는 섬유증의 감소 또는 부정맥 위험의 감소, 및/또는 2) 심장 이식 후 이식 거부 반응을 겪고 있는 대상체에서, 심장 기능의 개선, 섬유증의 감소 또는 부정맥 위험의 감소, 및/또는 3) 허혈성 뇌졸중을 앓고 있는 대상체에서, 경색 크기의 감소 또는 중증도가 낮은 마비 및/또는 부전마비 또는 신경 병증의 개선, 및/또는 4) 특정 약물 (아미오다론, 블레오마이신, 메토트렉세이트, 니트로푸란토인, 부설판), 또는 방사선, 또는 사르코이드증 또는 기타 결합 조직 질환에 노출된 대상체에서, 폐 섬유증의 발병 위험의 감소, 및/또는 5) 퇴행성- 또는 류마티스 관절염을 앓고 있는 대상체에서, 통증의 감소 또는 관절 기능의 개선, 및/또는 6) 암을 앓고 있는 대상체에서, 전이의 감소 또는 국소 기능의 개선 또는 생존율 개선.
본 발명에서, 용어 "심부전"은 비정상적 충전 압력 및/또는 심실의 심박출량의 감소를 특징으로 하는 임의의 병증을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 상황에서, 심장은 적절한 속도로 또는 적절한 용적 및/또는 적절한 힘으로 혈액을 펌프할 수 없거나 (즉, 수축기 심부전) 또는, 심실 강도의 증가 및/또는 심실 이완의 방해를 나타낸다 (즉, 이완기 심부전). 심부전의 경우, 기관의 혈액 관류가 저해되어, 이에 따라, 기관의 기능이 손상된다 (예를 들어, 신장 또는 간 기능 부전). 또한, 혈액이 폐로 복귀될 수 있어, 폐울혈의 원인이 된다. 심부전의 전형적인 증상에는 숨참 (호흡 장애), 피로, 약화, 엎드린 자세시, 호흡 곤란 및 다리, 발목 또는 복부의 팽창 (부종)이 포함된다.
본 발명에서, 용어 "치료","예방" 또는 "진행의 예방"은, 부정적 심장 리모델링의 개시를 포함할 뿐만 아니라, 유해 심장 리모델링이 개시되나, 추가 진행이 중단되는 상황을 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 여기에는, 심지어, 이러한 심근 경색- 및/또는 압력 과부하 관련 합병증의 발병이 이미 개시된 경우에도, 심근 경색- 및/또는 압력 과부하 관련 합병증의 본격적 발병이 예방되는 상황을 포함한다. 예를 들어, 이미 개시된 심장 팽창이, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용한 치료적 개입에 의해 중단될 수 있다. 이러한 방법은 본 발명에 의해 포함된다. 부정적 리모델링은 가역적 반응이므로, 본 명세서에서, 또한 "심근 경색 및/또는 압력-과부하-관련 합병증"으로 언급되는 유해 리모델링-관련 합병증이 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "대상체"는 임의의 척추 동물을 의미하는 것으로 이해되나, 일반적으로, 포유동물, 예를 들어 인간 환자, 가축 (예: 개 또는 고양이 등), 농장 동물 (예: 말, 소, 또는 양 등), 또는 실험실 동물 (예: 랫트, 마우스, 비인간 영장류 또는 기니피크 등)에 속하는 것일 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 대상체는 인간이다.
일 실시형태에서, 상기 대상체는 말, 개 및 인간으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 또는 항체 또는 그의 단편, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 약제학적 조성물 및 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 본 발명의 방법은 개 및 말, 특히 경주 개 및 말에서, 유해 심장 리모델링 및 심근 경색, 압력-과부하와 관련된 합병증을 예방 또는 치료하고/거나, 유해 심장 리모델링 및 심근 경색, 압력-과부하 후, 생존율을 증가시키거나 또는 사망률을 감소시키기 위해, 사용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 대상체는 인간, 특히, 유해 심장 리모델링의 발생 위험이 있는 인간 대상체 및/또는 유해 심장 리모델링 및 심근 경색, 압력-과부하를 앓고 있는 인간 대상체 및/또는 유해 심장 리모델링 및 심근 경색, 압력-과부하와 관련된 합병증을 앓고 있는 인간 대상체이다. 또 다른 실시형태에서, 인간 대상체는, 폐 (예를 들어, 폐 섬유증으로부터 초래되는 호흡 곤란, 폐고혈압 및 폐기능 장애), 관절 (예를 들어, 류마티스 및/또는 골관절염으로부터 초래되는 관절 기능 장애), 뇌 (예를 들어, 허혈성 뇌졸중으로부터 초래되는 발작, 마비 및/또는 부전마비, 뇌경색)에서, 피브로넥틴-EDA-매개 부정적 조직 리모델링을 겪거나 또는 발생될 위험이 있다. 본 발명자들은, 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이, 추측하건대, 대상체에서, 유해 심장 리모델링의 예방, 치료 및/또는 그 진행의 예방에 의해, 심근 경색 및 압력 과부하 후, 생존율을 증가시키고, 심장 기능을 개선시킨다는 것을 발견하였다.
본 발명에서 이용되는 종래 기술의 실시 방법은 당업자에게 분명할 것이다. 분자 생물학, 생화학, 계산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA, 생물정보학, 유전체학, 서열분석 및 관련 분야는 당업자에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 하기 참조 문헌에 논의되어 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 주기적 업데이트; 및 [Enzymology, Academic Press, San Diego]의 일련의 방법.
본 명세서 및 특허청구범위에서, 동사 "~을 포함하다" 및 그 활용형은, 비제한적 의미에서, 상기 단어 이후의 항목을 포함하며, 구체적으로 언급되지 않은 항목을 배제하지 않는 의미로 사용된다. 또한, 동사 "~로 구성된다"는 "~으로 필수적으로 구성된다"로 대체될 수 있으며, 이것은 본 발명의 조성물이 구체적으로 지정된 것 이외의 추가의 성분(들)을 포함할 수 있으며, 상기 추가의 성분(들)이 본 발명의 고유 특성을 변경시키지 않는다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "및/또는"은, 언급된 경우 중 하나 또는 그 이상이 단독으로 또는, 언급된 경우 중 적어도 하나와 조합하여, 최대로는, 언급된 경우 전부와 조합하여 발생할 수 있는 상황을 말한다.
용어 "적어도"는, 특정 값이 상기 특정 값과 동일하거나 또는 그 이상인 상황을 말한다. 예를 들어, "적어도 2"는 "2와 같거나 또는 그 이상", 즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.... 등으로 이해된다.
부정 관사 "하나 (a 또는 an)"는 따라서 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다. 본 명세서에서, "서열들"로 언급되는 경우, 일반적으로, 특정 서열의 하위 단위 (예를 들어, 아미노산)를 가지는 실제 물리적 분자를 의미한다는 것이 추가로 이해된다.
서열
서열번호: 1: 에피토프의 아미노산 서열 GIXXXF
서열번호: 2: 에피토프의 아미노산 서열 GIHELF
서열번호: 3: 중쇄 가변 영역의 CDR1 (항체 27A12.70)
GYSITSGYSWH
서열번호: 4: 중쇄 가변 영역의 CDR2 (항체 27A12.70)
YIHYSGIANYNPSLKS
서열번호: 5: 중쇄 가변 영역의 CDR3 (항체 27A12.70)
EKTGFFDY
서열번호: 6: 경쇄 가변 영역의 CDR1 (항체 27A12.70)
RSSQSLVHSNGNTYLH
서열번호: 7: 경쇄 가변 영역의 CDR2 (항체 27A12.70)
KVSNRFS
서열번호: 8: 경쇄 가변 영역의 CDR3 (항체 27A12.70)
SQSAHVPPT
서열번호: 9: 중쇄 가변 영역의 CDR1 (항체 29E7.35)
GYSITSGYSWH
서열번호: 10: 중쇄 가변 영역의 CDR2 (항체 29E7.35)
YIHYSGSANYNPSLKS
서열번호: 11: 중쇄 가변 영역의 CDR3 (항체 29E7.35)
EKTGFFDY
서열번호: 12: 경쇄 가변 영역의 CDR1 (항체 29E7.35)
RSSQSLVHSNGNTYLH
서열번호: 13: 경쇄 가변 영역의 CDR2 (항체 29E7.35)
KVSNRFS
서열번호: 14: 경쇄 가변 영역의 CDR3 (항체 29E7.35)
SQSAHVPPT
서열번호: 15: 중쇄 가변 영역의 CDR1 (항체 17G8.7VL)
GYSIASGYSWH
서열번호: 16: 중쇄 가변 영역의 CDR2 (항체 17G8.7VL)
YIHFSGSANYNPSLKS
서열번호: 17: 중쇄 가변 영역의 CDR3 (항체 17G8.7VL)
EARGYFDY
서열번호: 18: 경쇄 가변 영역의 CDR1 (항체 17G8.7VL)
RSSQSIVRSNGNTYLT
서열번호: 19: 경쇄 가변 영역의 CDR2 (항체 17G8.7VL)
KVSNRFS
서열번호: 20: 경쇄 가변 영역의 CDR3 (항체 17G8.7VL)
FQGSHVPPT
서열번호: 21: 중쇄 가변 영역의 CDR1 (공통)
GYSIX1SGYSWH
X1=T 또는 A
서열번호: 22: 중쇄 가변 영역의 CDR2 (공통)
YIHX2SGX3ANYNPSLKS
X2= Y 또는 F; 그리고 X3= S 또는 I
서열번호: 23: 중쇄 가변 영역의 CDR3 (공통)
EX4X5GX6FDY
X4= K 또는 A; 그리고 X5= T 또는 R; 그리고 X6= F 또는 Y
서열번호: 24: 경쇄 가변 영역의 CDR1 (공통)
RSSQSX7VX8SNGNTYLX9
X7= L 또는 I; 그리고 X8= H 또는 R; 그리고 X9= H 또는 T
서열번호: 25: 경쇄 가변 영역의 CDR2 (공통)
KVSNRFS
서열번호: 26: 경쇄 가변 영역의 CDR3 (공통)
X10QX11X12HVPPT
X10= S 또는 F; 그리고 X11= S 또는 G; 그리고 X12= A 또는 S
서열번호: 27 (면역화 펩티드)
TYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGGC
서열번호: 28: 항체 33E3.10에 있어서, 피브로넥틴-EDA의 EDA 도메인의 에피토프의 아미노산 서열
LFPAP
서열번호: 29: 중쇄 가변 영역의 CDR1 (항체 33E3.10)
GFTFSNSAMT
서열번호: 30: 중쇄 가변 영역의 CDR2 (항체 33E3.10)
SISGGGTTYYPDSVKG
중쇄 가변 영역의 CDR3 (항체 33E3.10)
SHY
서열번호: 31: 경쇄 가변 영역의 CDR1 (항체 33E3.10)
KASQNVVTNVA
서열번호: 32 경쇄 가변 영역의 CDR2 (항체 33E3.10)
SASYRYS
서열번호: 33: 경쇄 가변 영역의 CDR3 (항체 33E3.10)
QQYNSYPYT
서열번호: 34: 항체 27A12.70의 인간화 중쇄
Figure pct00001
서열번호: 35: 항체 27A12.70의 인간화 경쇄
Figure pct00002
서열번호: 36: 항체 33E3.10의 인간화 중쇄
Figure pct00003
서열번호: 37: 항체 33E3.10의 인간화 경쇄
Figure pct00004
서열번호: 38: 중쇄 가변 영역 (항체 27A12.70)
Figure pct00005
서열번호: 39: 경쇄 가변 영역 (항체 27A12.70)
Figure pct00006
서열번호: 40: 중쇄 가변 영역 (항체 29E7.35)
Figure pct00007
서열번호: 41: 경쇄 가변 영역 (항체 29E7.35)
Figure pct00008
서열번호: 42: 중쇄 가변 영역 (항체 17G8.7VL)
Figure pct00009
서열번호: 43: 경쇄 가변 영역 (항체 17G8.7VL)
Figure pct00010
서열번호: 44: 중쇄 가변 영역 (항체 33E3.10)
Figure pct00011
서열번호: 45: 경쇄 가변 영역 (항체 33E3.10)
Figure pct00012
실시예
실시예 1
방법
펩티드 합성 및 스크리닝 분석
표준 Fmoc-화학을 사용하여, 표적 펩티드의 아미노산 서열 (즉, TYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGGC (서열번호: 27))에 기반하여, 선형 및 CLIPS 펩티드를 합성한 후, 스캐빈저가 포함된 트리플루오르산을 이용하여, 탈보호화 하였다. 선형 및 CLIPS 펩티드는 다양한 길이의 짧은 단편으로서, 에피토프를 포함할 수 있다. 구조적 에피토프를 재구성하기 위해, 스카폴드상에 화학적으로 결합된 펩티드 (CLIPS)기술을 사용하여, 구속성 CLIPS 펩티드(constrained CLIPS peptide)를 화학물질 골격 상에 합성하였다. 예를 들어, 알파, 알파'-디브롬옥실렌으로 처리함으로써 고리화된, 디시스테인을 포함하는 단일 고리 펩티드를 합성하였다. 다양한 간격으로 시스테인 잔기를 도입함으로써 고리의 크기를 변화시켰다. 새로 도입된 시스테인 이외에 다른 시스테인이 존재하는 경우, 이들을 알라닌으로 대체하였다. 크레디트 카드 포맷 폴리프로필렌 PEPSCAN 카드 (455개의 펩티드 형식/카드) 상에서, 중탄산 암모늄 (20 mM, pH 7.9)/아세토니트릴 (1:1 (v/v)) 중의 1,3-비스 (브로모메틸) 벤젠과 같은 CLIPS 주형의 0.5 mM 용액과 반응시킴으로써, 상기 펩티드의 다중 시스테인 측쇄를 CLIPS 주형에 결합시켰다. 상기 카드를 30 내지 60분 동안 상기 용액 중에서 가볍게 진탕하여, 용액 중에 완전히 도포시켰다. 마지막으로, 상기 카드를 과량의 H2O로 광범위하게 세척한 후, 30분 동안, 70℃에서, PBS (pH 7.2)중에 1% SDS/0.1 % 베타-머캅토에탄올을 포함하는 분해 완충액(disrupt-buffer)에서, 초음파 처리한 다음, 45분 동안 H2O에서 초음파 처리하였다.
PEPSCAN-기반 ELISA에서, 각 펩티드에 대한 항체의 결합을 시험하였다. 공유 적으로 결합된 펩티드를 함유하는 455-웰 크레디트 카드 포맷 폴리프로필렌 카드를 차단 용액 (즉, PBS/0.1% 트윈 중의 4% 말 혈청, 5% 오브알부민 (w/v)) 중에 희석된 0.05 마이크로그램 항체/mL로 구성된 일차 항체 용액으로 인큐베이션하였다. 세척 후, 상기 펩티드를 25℃에서, 1시간 동안, 항체 퍼록시다아제 컨쥬게이트의 1/1000 희석액으로 인큐베이션하였다. 세척 후, 퍼록시다아제 기질인 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 설포네이트 (ABTS) 및 2 마이크로리터의 3% H2O2를 첨가하였다. 1시간 후, 발색 정도를 측정하였다. (문헌 [Slootstra et al. Mol Divers. 1996 Feb;1(2):87-96]에 처음 개시된 바와 같이) 전하 결합 소자 (CCD)-카메라 및 영상 처리 시스템으로, 발색 정도를 정량화하였다.
데이타 계산
원 데이타: 광학 밀도 (임의 OD 단위)
원 데이터는 CCD 카메라에 의해 얻은 광학 값이다. 상기 값은 대부분 0 내지 3000의 범위이었으며, 이는 표준 96 웰 플레이트 ELISA 판독기의 대략 1 내지 3의 로그 스케일이다. 우선, CCD 카메라에 의해, 퍼옥시다아제 착색 전에, 카드의 사진을 찍은 다음, 퍼옥시다아제 착색 후, 다시 사진을 찍었다. 이들 두 장의 사진을 서로 빼서, 원 데이타를 제공하였다. 원 데이타를 Peplabtm 데이타베이스로 카피하였다. 카드를 수동으로 검사하여 거짓양성 (false-positive) (예를 들어, 공기 거품의 존재)을 보정하였다.
결과
항체 27A12.70, 29E7.35, 17G8.72, 42H11.51 및 33E3.10의 에피토프는 CLIPSTM 기술 (Timmerman et al. J Mol Recognit. 2007 Sep-Oct;20(5):283-99.)을 이용하여, 서열이 면역화에 이용된 펩티드(서열번호:27)를 기반으로 한 서열의 7 내지 14-머 선형 및 CLIPS 펩티드를 중첩하면서 매핑하였다. 항체 27A12.70, 29E7.35, 17G8.72, 및 42H11.51의 에피토프는 아미노산 GIHELF로 구성되는 것으로 밝혀졌다. 항체 33E3.10의 에피토프는 아미노산 LFPAP로 구성되는 것이 밝혀졌다.
또한, Tyr36 내지 Pro48 범위의 13-머 펩티드를 사용하여, 항체 27A12.70, 29E7.35, 17G8.72, 및 42H11.51의 에피토프 내의 주요 아미노산을 측정하기 위해, 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발을 수행하였다. 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발에 의해, Gly42, Ile43 및 Phe47이 에피토프 GIHELF 내의 주요 아미노산이라는 것이 밝혀졌다.
실시예 2
동물 및 실험 설계
Male Balb/C 야생형 마우스 (10-12주령, 25-30 g)에 임의량의 표준 사료와 물을 공급하였다. 좌심방 바로 아래의 좌측 관상 동맥 결찰에 의해, 심근 경색을 유도하였다. 모든 동물 실험은 동물 보호에 대한 국가의 지침에 따라, 위트레흐트 대학의 동물 실험위원회의 사전 승인 하에 수행하였다.
생체 내 심근 경색
복강 내로, Fentanyl (Jansen-Cilag) 0.05 mg/kg, Dormicum (Roche) 5 mg/kg 및 메데토미딘 0.5 mg/kg의 혼합물을 주입하여, 마우스 (Balb/C)를 마취시켰다. 수술 과정 동안, 직장 온도계 및 자동 가열 담요에 의해, 지속적으로 모니터링하여, 동체 온도 (Core body temperature)를 약 37℃로 유지시켰다. 마우스에 삽관한 후, 100% 산소로 환기시켰다 (Harvard Apparatus Inc.). 8-0 바이크릴 봉합사를 사용하여, 좌측 관상 동맥 (LCA)을 영구적으로 결찰하였다. 심근 및 심실 부정맥의 표백에 의해, 허혈증을 확인하였다. 가짜 수술을 받은 동물에서, 결찰없이, 봉합선을 LCA 아래에 배치했다. 흉벽을 닫은 후, 동물들에게 Antisedan (Pfizer) 2.5 mg/kg, Anexate (Roche) 0.5 mg/kg 및 Temgesic (Schering-Plough) 0.1 mg/kg을 피하로 제공하였다.
심근 경색 28일 후, 마우스의 심장 기능 및 기하학적 구조를 평가하였다. 250 마이크로리터 (μL)의 염수 (대조군) 또는 항체 용액을 꼬리 정맥을 통해, 정맥내로 마우스에 제공하였다. 경색 2일 후, 동물들에 무작위로, 염수, 27A12.70 (10 mg/kg), 29E7.35 (10 mg/kg), 17G8.72 (10 mg/kg), 42H11.51 (10 mg/kg) 또는 33E3.10 (10 mg/kg) 모노클로날 항체를 제공하였다. 경색 후 4일 및 5일째에, 상기 볼루스 주입을 반복하였다. 10 mg/kg의 투여량으로, 두 번째 및 세 번째 항체 주입을 제공하였다.
결과
생존율
항체 27A12.70, 29E7.35, 17G8.72, 42H11.51
기준선 (t=0)에서, 다른 그룹의 마우스 사이에 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 시험 항체에 따라 차별적 생존 특성이 나타났다. 대조군 상황 (염수)에 비해서, 시험 항체는 심근 경색 후, 마우스의 생존율을 증가시켰다. 항체 27A12.70 및 29E7.35 처리 마우스는 심근 경색 후, 30일의 추적 기간 동안, 최고의 심근 경색 후 생존율을 나타내었다 (도 1). 구체적으로, 심근 경색 30일 후, 항체 27A12.70 및 29E7.35 처리 마우스의 생존율이, 단지 50%의 마우스가 생존한 대조군 그룹 (염수)의 마우스의 생존율 보다 현저히 개선되었다는 것이 관찰되었다. 또한, 대조군 그룹 (염수)의 마우스에 비해서, 항체 17G8.72 및 42H11.51 처리 마우스의 생존이 개선되었다.
항체 33E3.10
기준선 (t=0)에서, 2개 그룹의 마우스 사이에 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 시험 항체에 따라 차별적 생존 특성이 나타났다. 대조군 상황 (염수)에 비해서, 시험 항체는 심근 경색 후 마우스의 생존율을 증가시켰다. 항체 33E3.10 처리 마우스는 심근 경색 후, 30일의 추적 기간 동안, 심근 경색 후 생존율의 증가를 나타내었다 (도 3). 구체적으로, 항체 33E3.10 처리 마우스의 생존율이, 심근 경색 30일 후, 단지 50%의 마우스가 생존한 대조군 그룹 (염수)의 마우스의 생존율 보다 현저히 개선되었다는 것이 관찰되었다.
실시예 3
생체 내 심근 경색
Male Balb/C 야생형 마우스 (10-12주령, 25-30 g)를 실시예 2의 본 명세서에서 교시되는 바와 같은 심근 경색 유도 절차에 적용하였다. 또한, 이들을 동일한 항체로 처리하였다.
심장 초음파 검사
심근 경색 28일 후, 이소플루란 마취 하에, 고해상도 심장 초음파 검사 (Vevo 2100, FUJIFILM VisualSonics, Inc., Toronto, Canada)에 의해, 마우스의 심장 직경과 기능에 대한 일련의 평가를 실시하였다. 1.0mm 슬라이스 간격으로, 장축과 단축 이미지를 획득하고, 이완 용적 (EDV, 최대 볼륨) 및 말단-수축 용적 (ESV, 최소 볼륨)을 계산하는데 이용하였다. 구혈률 (EF)을 100*(EDV-ESV)/EDV로 계산하였다.
결과
항체 27A12.70, 29E7.35, 17G8.72, 42H11.51
결과는, 염수 처리된 마우스에 비해서, 항체 27A12.70, 29E7.35, 17G8.72 및 42H11.51 처리 마우스가 심근 경색 후, 심장 기능의 개선을 나타내었으며, 이는 구혈률 (EF)의 증가에 의해 시사된 바와 같으며, 항체 27A12.70 및 29E7.35 처리시, 나타난 고비율의 EF 측정치에 의해 제시된 바와 같이, 최대 개선도를 가진다는 것을 보여준다 (도 2).
항체 33E3.10
결과는, 염수 처리된 마우스에 비해서, 항체 33E3.10 처리 마우스가 심근 경색 후, 심장 기능의 개선을 나타내었으며, 이는 구혈률 (EF)의 증가에 의해 시사된 바와 같으며, 항체 33E3.10 처리시, 나타난 고비율의 EF 측정치에 의해 제시된 바와 같이, 최대 개선도를 가진다는 것을 보여준다 (도 4).
실시예 4
방법
실시예 1에 기재된 바와 같이, 피브로넥틴-EDA 에피토프의 알라닌 스캔에 대한 펩티드 합성, 스크리닝 분석 및 데이터 산출을 수행하였다. 각 펩티드에서 하나의 아미노산이 알라닌으로 대체된, TYSSPEDGIHELFP에 기반한 펩티드를 합성하였다. 항체 27A12.70, 29E7.35, 17G8.72 및 42H11.51에 의한 결합에 대해, 상기 펩티드를 시험하였다.
결과
결과는 하기 표에 제시된다.
항체 결합 (임의의 광학 밀도 단위)
펩티드 대체된 아미노산 17G8.72 27A12.70 29E7.35 42H11.51
TYSSPEDGIHELFP 없음 2087 2681 2754 2845
AYSSPEDGIHELFP T 2146 2709 2779 2859
TASSPEDGIHELFP Y 2668 2786 2841 2865
TYASPEDGIHELFP S 2501 2719 2735 2867
TYSAPEDGIHELFP S 2098 2680 2631 2853
TYSSAEDGIHELFP P 2091 2712 2656 2866
TYSSPADGIHELFP E 2481 2693 2627 2835
TYSSPEAGIHELFP D 2646 2751 2724 2834
TYSSPEDAIHELFP G 89 122 81 433
TYSSPEDGAHELFP I 66 91 74 120
TYSSPEDGIAELFP H 2563 2405 1798 2869
TYSSPEDGIHALFP E 2101 2204 302 2842
TYSSPEDGIHEAFP L 1552 1783 194 2819
TYSSPEDGIHELAP F 106 249 124 2642
TYSSPEDGIHELFA P 2164 2601 2596 2869
에피토프 GIHELF GIHELF GIHELF GIHEL
주요 아미노산 G, I, F G, I, F G, I, E, L, F G, I
실시예 5
방법
동물 및 실험 설계
수컷 Balb/C 야생형 (WT) (10-12 wks, 25-30 g)에게 임의량의 표준 사료와 물을 공급하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 좌심방 바로 아래의 좌측 관상 동맥 결찰에 의해, 심근 경색을 유도하였다. 동물을, 염수 대조군 또는, 에피토프 GIXXXF에 대해 유도된 항-EDA IgG1 항체 (20 mg/kg; 250 μL)로 무작위화하였다. 또한, 이소타입 대조군의 또 다른 그룹 (20 mg/kg; 250 μL)을 상이한 시점에 포함시켰다. MI 3일 후, 치료 또는 위약을 정맥내로 개시하였다. 처리 블라인드 연구에 의해, 심장 기능 및 기하학적 구조를 평가하였다. 모든 동물 실험은 동물 보호에 대한 국가의 지침에 따라, 위트레흐트 대학의 동물 실험위원회의 사전 승인 하에 수행하였다.
항-EDA IgG1 모노클로날 항체
IgG1 및 IgG2b 이소타입을 Protein A Sepharose의 차등적 pH 용출에 의해 조건부 하이브리도마 배지로부터 개별적으로 정제하였으며, 정제된 IgG1을 본 연구에서 개시되는 실험에 사용하였다.
경색 크기 및 심장 자기 공명 영상
MI 3일 후, 화합물 주입 전에, 마우스의 하위 세트에서, 후기 가돌리늄 증강 자기 공명 영상 (late Gadolinium enhancement magnetic resonance imaging) (LGE-MRI)을 이용하여, 경색 크기를 평가하였다. 고해상도 MRI에 의해, 좌심실의 기하학적 구조뿐만 아니라, 국소 및 전체적 심장 기능을 평가하였다 (9.4T, Bruker, Rheinstetten, Germany).
유동 세포 계측법
MI 7일 후, EDTA 튜브에 혈액을 수집하였다. 50 μL의 혈액을 100 μL의 항체에 첨가한 후, 실온의 어두운 곳에서, 30분 동안 인큐베이션하였다. 10분 동안, Optilyse 완충액 (Beckman Coulter)을 사용한 적혈구 용해 후, 샘플을 Gallios (Beckman Coulter)에서 측정하였다.
정량적 PCR
제조자의 지침에 따라, iScriptTM cDNA 합성 키트 (Bio-Rad)를 사용하여, 마우스 심장으로부터 분리된 전체 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. iQTM5 실시간 PCR 검출 시스템 (Bio-Rad)에서, SYBR 그린 (Bio-Rad) 방법을 이용하여, 정량적 PCR을 수행하였다. 하기 프라이머 세트가 본 연구에 사용되었다: 콜라겐 I 프로-알파 I 사슬 (정방향), (역방향); 콜라겐 III 프로-알파 I 사슬 (정방향), (역방향); TIMP-1 (정방향), (역방향);TIMP-2 (정방향), (역방향), MMP-2 (정방향), (역방향); P0 (정방향), (역방향), RPL27 (정방향), (역방향), EDA-FN (정방향), (역방향), 총 FN (정방향), (역방향). 각 샘플을 2회 반복 구동하였다.
문헌 [Willems, Leyns, & Vandesompele, Anal Biochem. 2008 Aug 1;379(1):127-9]에 개시된 프로토콜을 이용하여, 유전자 발현 수준을 P0 및 RPL27로 정상화하였다. qPCR 효율의 평가에 있어서, 5개의 상이한 cDNA 희석에 의한 표준 곡선이 포함되었다.
자이모그라피
경색 심근 및 콜라겐 패드의 MMP 활성을 젤라틴 자이모그라피에 의해 조사하였다. 구동 겔 (2.68 ml 30% (비스)아크릴아미드 (Bio-Rad), 4.82 ml 2 mg/ml 돼지 피부 젤라틴 용액 (Sigma-Aldrich), 2.5 ml 트리스-HCl 1.5 M pH 8,8 (Roche), 100 μL 10% SDS (Sigma-Aldrich) 50 μL APS 및 17.8 μL의 TEMED (GE Life Sciences, Pittsburgh, US)) 및 스태킹 겔 (0.67 ml 30% (비스)아크릴아미드, 3.04 ml 증류수 (aqua dest), 1.25 ml 트리스-HCl 0.5 M pH 6.8, 50 μL 10% SDS, 25 μL APS, 및 8.8 μL의 TEMED))을 부었다. 심근 샘플을 로슈 용해 완충액에서 균질화시켰다. 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Scientific)를 사용하여 측정하였다. 5 μg의 심근 추출물을 1:4 비율로 램리 완충액과 혼합한 후, 겔 상에 부하하였다. 겔을 적층 단계를 통해 30 mA에서 구동시킨 후, 구동 단계의 경우, 60 mA에서, 구동시켰다. 구동 후, SDS 제거를 위해, 겔을 2.5% 트리톤 X-100에서 2x15분 동안 세척하였다. 그 후, 겔을 Brij-용액 (50 mM Tris-HCl pH 7.4; 10 mM CaCl2 (Merck, Whitehouse Station, USA); 0.05% Brij35 (Sigma-Aldrich))에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 겔을 쿠마시 블루 (0.1% Coomassie Brilliant blue R-250 (Bio-Rad), 25% 메탄올 및 15% 아세트산 (둘 모두 Sigma-Aldrich))으로 염색한 다음, 파란색 바탕에, 선명한 밴드가 나타날 때까지, 탈염색시켰다 (25% 메탄올 및 15% 아세트산). Chemidoc XRS+에서 사진을 찍었다. ImageLab (Bio-Rad)을 이용하여, 영상을 분석하였다.
세포 배양
인간의 유방 내피 세포 (HMEC)를 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신 (pen/strep), 50 mM 하이드로코르티손, 50 mM 표피 성장 인자 및 L-글루타민이 보충된 MCDB131 배지 (10372-019,Gibco)에서 배양하였다. 세포를 매 3일 마다 계대배양하였다. 부착 연구를 위해, NIH3T3 섬유아세포 세포주를 사용하였다. 세포를 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지 (41965, Gibco)에서 배양하였다. 세포를 매 3일 마다 계대배양하였다.
발아 분석
Cytex 비드를 HMEC로 코팅한 후, 마트리겔 (Corning)에 배치하였다. 기본 MCDB131 배지 (Bare MCDB131 medium)를 음성 대조군으로, 완전 MCDB131 (full MCDB131)을 양성 대조군으로 이용하였다. EDA 단편 및 III4 단편을 1 μM의 농도로 첨가하였다. 48시간에, 사진을 찍은 후, 포토샵 및 ImageJ를 이용하여, 정량화하였다.
세포 부착 분석법
96 웰 플레이트를 1 μm의 EDA-his 또는 III4-his를 이용하여, 37℃에서 1시간 동안 코팅한 후, PBS 1%BSA로 차단하였다. 웰당 NIH3T3 0.5x10^5개의 세포를 기본 DMEM에 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비접착 세포의 세척 후, 접착 세포를 고정시킨 후, 0.5 % 크리스탈 바이올렛 1 % 포름알데히드, 20 % 메탄올을 사용하여, 염색하였다. 플레이트를 마이크로플레이트 판독기를 이용하여, 540 nm에서 판독하였다.
단백질 정제
1 μL의 DNA 작제물을 이용하여, BL21 pLysS E.coli를 형질전환시킨 후, 밤새 효모 트립톤의 암피실린/클로람페니콜 플레이트 상에 플레이팅하였다. 다음날, 모든 콜로니를 긁어낸 후, OD가 0.6-0.8에 도달될 때까지, Amp/Chlor의 LB 배지에서 성장시켰다. 단백질 생성을 개시시키기 위해, IPTG를 첨가하였다. 24시간 후, 박테리아를 펠레팅한 후, 용해 완충액과 초음파 처리 단계를 이용하여, 용해시켰다. 파편을 펠레팅한 후, 상청액은 다음 과정을 위해 사용하였다. his 정제를 위해, Ni-NTA 비드를 사용하였다. 요약하면, 4℃에서, Ni-NTA 비드를 상청액으로 인큐베이션하였다. 비드를 ACTA 시스템의 칼럼에 부었다. 2회 세척 후, 300 mM 이미다졸을 이용하여, 결합된 EDA-his 또는 III4-his를 용출시켰다. EDA-his 또는 III4-his를 포함하는 분획을 수집한 후, 겔 여과 칼럼에 주입하였다. 단백질을 그 크기에 따라 분리한 후, HEPES 완충액에서 용출시켰다. EDA-his 또는 III4-his를 포함하는 분획을 풀링 (pooling)한 후, Vivaspin 5 kD 농축 칼럼을 이용하여, 농축시켰다. BCA 키트를 이용하여, 단편 농도를 평가하였다. 내독소를 조사하기 위해, LAL 분석을 수행하였다. <0.1 EU/uM 이하의 농도의 단편을 사용하였다.
병력
처리시, 심장을 절제하여, 4 %의 포름알데히드에 고정시킨 후, 파라핀에 포매하였다. 파라핀 절편을 Ly-6G (호중구; 랫트 항-마우스 Ly-6G, Abcam, Cambridge, United Kingdom), MAC-3 (대식세포; 랫트 항-마우스 MAC-3, BD Pharmingen, Breda, the Netherlands) 및 CD31 (혈관, Santa Cruz, Heidelberg, Germany)에 대해 염색하였다.
염색 전에, 절편을 탈파라핀화하고, 1.5% H2O2를 함유하는 메탄올에서 30분 동안 인큐베이션하여, 내인성 과산화효소를 차단하였다. 시트르산염 완충액을 20분 동안 끓이거나 (MAC-3 및 CD31), 37℃에서 15분 동안 0.08% 펩신 용액에서 인큐베이션하여 (Ly-6G), 항원 검색을 수행하였다.
MAC-3 염색의 경우, 절편을 정상 염소 혈청을 이용하여, 사전 인큐베이션한 후, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다 (MAC-3, 1:30; CD163, 1:500). CD31 염색의 경우, 절편을 일차 항체 (1:1500)를 이용하여, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 그후, 절편을 비오틴 표지 이차 염소 항체를 이용하여, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 스트렙타비딘-겨자무 과산화효소를 이용하여, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 절편을 AEC로 발달 (developing) 시켰다.
Ly-6G에 있어서, 절편을 일차 항체 (1:100)로 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그후, 절편을 파워비젼 폴리-HRP 항-토끼 IgG로 30분 동안 인큐베이션하였다 (ImmunoVision Technologies, Daily City, USA). 제조자의 지시에 따라, 벡터 NovaREDTM 기질을 이용하여, 염색을 즉시 시각화하였다 (Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA).
모든 절편을 마이어의 헤마톡실린 염색으로 대조 염색하였다.
콜라겐 밀도의 정량화를 4 % 포르말린 고정 파라핀 포매 심장 절편의 피크로시리우스 레드 염색을 사용하여 수행하였다. 콜라겐 밀도 분석을 디지털 영상 현미경 및 명암도(Grey value)로의 변환 후, 원편광을 이용하여, 실시하였다. 30 이하의 명암도는 영상의 배경 신호로 간주하였다.
급성 MI 후, 인간 EDA 염색
심근 경색으로 사망한 환자의 부검 과정에서, 심근 조직을 획득하고, 병리학 아카이브에서 검색하였다. 본 연구는 네덜란드에서 사용되는 적절한 인체 조직 사용 기준을 충족하였다. EDA를 시각화하기 위해, 절편을 시트르산염 완충액 (pH 6.0)에서 끓인 후, 본 발명의 모노클로날 마우스-항 EDA 항체 (1/800 희석)로 인큐베이션하였다. 폴리 AP-항-마우스 IgG (Immunologic, Duiven, the Netherlands)를 이차 항체로 사용하였으며, 액상 퍼머넌트 레드 (Liquid permanent red) (Dako, Glostrup, Denmark)를 사용하여, 신호를 시각화하였다.
통계
데이타는 평균±SEM으로 제시된다. 그룹 간 다중 비교를 위해, post-hoc 2-측 Dunnett t-검정 조정의 일원분산분석 (One-way ANOVA) (염수를 대조군으로 설정함)을 이용하였다. 항-EDA 및 염수 처리 동물 사이의 생존율 차이를 비교하기 위해, Mann-Whitney U 검정을 이용하였다. 모든 통계 분석은 SPSS 15.1.1.을 사용하여 수행하였으며, p<0.05는 유의미한 것으로 고려하였다.
결과
항-EDA 치료는 심근 경색 후 생존율을 향상시키고 유해 리모델링을 억제한다.
심장 기능 및 직경의 기준선 MRI 평가에 의해, 처리 그룹 간에 차이가 없다는 것이 밝혀졌다. 화합물 주입 전, 경색 크기는 42±3%이었다 (도 5A). 28일의 연구 기간 동안, 3/9의 항-EDA 처리 마우스가 폐사한 것으로 나타났으며, 추적 기간 동안, 9/14의 염수 처리 동물이 폐사하였다 (p=0.06). 병리학적 분석에 의해, 단지 2마리의 파열만이 밝혀졌으며 (둘 모두 염수 그룹), 나머지 사체의 경우, 과도한 폐 울혈이 뚜렸하였다. 심장 기능과 기하학적 구조의 일련의 MRI 평가에 의해, 염수와 이소타입 대조군 양자에 비해서, 항-EDA 처리 동물에서, 좌심실 기능 및 직경이 상당히 보존된 것으로 나타났다 (도 5; 표 2). 표 2는 급성 MI 후, 심장 기능 및 기하학적 구조이다.
염수 항-EDA
기준선 MI 후
7일째		 MI 후
28일째		 기준선 MI 후
7일째		 †p MI 후
28일째		 †p
EDV, μL 58.7
±3.8		 101.9
±6.9* 		151.2
±13.4** 		58.2
±1.0		 82.8
±6.7*†		 0.052 106.5
±10.2**†		 0.021
ESV, μL 25.1
±2.2		 86.3
±4.3* 		128.3
±12.9** 		26.4
±.7		 63.8
±7.2*†		 0.011 81.6
±10.4**†		 0.014
EF, % 57.1
±3.2		 14.7
±2.8* 		15.7
±2.0** 		54.7
±1.3		 23.6
±3.0* 		NS 24.4
±2.5**†		 0.067
WT
격벽
(원위,
mm)		 0.90
±0.02		 0.70
±0.03* 		0.91
±0.04		 0.99
±0.01		 0.97
±0.02*†		 0.01 0.94
±0.03		 NS
WT
자유 벽
(경색, mm)		 0.93
±0.02		 0.57
±0.04* 		0.56
±0.03** 		0.91
±0.01		 0.65
±0.06* 		NS 0.60
±0.04** 		NS
SWT
격벽
(원위, %)		 49.2
±2.0		 49.7
±5.0		 42.4
±3.7		 50.9
±2.9		 32.0
±2.4*†		 0.006 27.8
±8.6** 		NS
SWT
자유 벽
(경색, %)		 54.8
±2.3		 -23.7
±4.7* 		-26.5
±3.5** 		51.1
±5.0		 -8.2
±4.6*†		 0.047 -7.8
±3.1**†		 0.002
데이타는 평균±SEM으로 제시된다. *p-값은 기준선 및 0.05 수준 이하와 비교된다; †p-값은 염수 처리와 비교된다. BPM=분당 맥박수, EDV=말단-이완 용적, ESV=말단-수축 용적, EF=구혈률, WT=벽 두께, SWT=수축 벽 두께, NS=유의미하지 않음.
백혈구 수를 계산해보면, 항-EDA 처리 마우스의 경우 , 감소하고/ MI 후, 항-EDA 처리는 말초 혈액에서 백혈구 수를 감소시킨다.
MI 7일 후, 유세포 분석을 이용하여, 혈중 백혈구의 하위 세트 수를 평가하였다. 항-EDA 처리 후, 항-EDA 처리 마우스에서, 호중구의 상당한 감소 및 T 세포 수의 감소 경향이 나타났다 (도 6a 및 도 6b). 항-EDA 처리 후, 염증성 Ly6Cpos 단핵구 하위 세트 및 항-염증성 Ly6Cneg 단핵구 하위 세트는 둘 모두 현저히 감소하지 않았다 (도 6c 및 도 6d).
항-EDA 처리는 경색 심장에서, 사이토카인의 방출을 감소시키나, 백혈구 수는 그러하지 않다.
항-EDA 처리 동물의 경우, 경색 영역에서, 염증성 사이토카인 IL-1β, TNFα, GM-CSF, IL-4, RANTES, IL-10 및 MIP-1α가 감소하였다 (도 7a). 심장의 원위 영역에서 사이토카인 수준의 차이가 관찰되지 않았다 (데이타 미제시). MI 7일 후, 항-EDA 처리에 의해, 호중구, T 세포 및 대식세포 수는 영향을 받지 않았다 (도 7b 내지 도 7e ).
항-EDA 처리는 적절한 흉터 형성에 영향을 미치지 않는다.
MI 후, 적절한 흉터 형성은 광범위한 리모델링, 흉터의 흐려짐(thinning) 및/또는 경색 벽의 파열을 억제하는데 있어서 가장 중요하다. 본 연구에서, MI 28일 후, 항-EDA 처리 동물과 대조군 사이에, 콜라겐 함량의 차이가 존재하지 않았다 (도 8a, 도 8b). 이러한 관찰 결과에 일관된 것으로서, 본 발명자는, MI 후, 주요 콜라겐 생성 세포 (데이타 미제시), 섬유아세포의 총량 또는 Col1 및 Col3의 mRNA 수준 (도 8c 및 도 8d)에서, 어떠한 차이도 관찰하지 못했다.
항-EDA 처리는 심장의 혈관 형성을 증가시킨다.
항-EDA 처리시, 경색 지역과 경계 지역 둘 모두에서, 더욱 많은 혈관이 형성되었다 (도 9). 본 발명자가 혈관을 크기가 다른 종류로 세분했을 때, 본 발명자들은, 이러한 차이가, 경계 지역의 경우, 50-10 μm의 가장 작은 혈관 (도 9d)에 존재하고, 경색 영역의 경우, 10-16 μm의 혈관 (도 9f)에 존재한다는 것을 명백히 알 수 있었다. 이들 종류는 심근의 모세 혈관에 해당한다. 시험관 내 3차원 발아 분석에 의해, EDA가 내피 세포의 발아를 억제하며, 대조군 단편 III4의 경우에는 그러하지 않다는 것이 제시된다 (도 9g 내지 도 9i).
항-EDA 처리는 무세포 매트릭스의 제거를 지연시킨다.
임시 무세포 매트릭스 형성은 MI 후 비생존 조직의 혈역학적 보충 및 흉터 형성을 위해 매우 중요하다. 상처 치유 과정 동안, 임시 매트릭스는 서서히 분해되고, 단단한 콜라겐-기반 흉터에 의해 대체된다. 본 발명자들은, 항-EDA 처리 마우스에서 무세포 매트릭스의 제거가 지연되는 것을 관찰하였다 (도 10a 내지 도 10c). 임시 매트릭스 제거의 지연에 대한 설명을 찾기 위해, 본 발명자들은 처리 그룹에서, 고유의 MMP2 및-9 활성을 연구하였다. 본 발명자들은 항-EDA 처리가 MMP2 및-9 활성을 감소시킨다는 것을 발견하고, 자이오그래피에 의해 정량화하였다 (도 10d 내지 도 10f). 그룹 사이에, MMP2 및-9의 mRNA 수준에 있어서, 변화가 관찰되지 않았다 (데이타 미제시). 섬유아세포는 심장의 주요 MMP 생성 세포이다. 페리오스틴 염색에 의해, 심장에서, 성숙한 섬유아세포의 양을 추정할 수 있다. 항-EDA 처리시, 페리오스틴 발현이 감소한다 (도 10g). 또한, 시험관 내 세포 부착 분석에서, 섬유아세포가 EDA에 부착할 수 있으며, 상기 항-EDA 항체가 세포 부착을 억제할 수 있다는 것이 제시된다 (도 10h).
인간의 경색 심장에서 EDA가 일시적으로 발현된다.
현재까지, 급성 MI를 앓고 있는 환자에서, EDA가 발현된다는 증거는 없다. 우리는 인간에서 MI 후 EDA 발현의 타임라인을 연구하기 위해, 사후 인간의 심장 표본을 사용하였다. 경색 영역 및 경색 경계 영역에서, 경색 후 처음 2-3주 내에 EDA가 관찰되었다 (도 11). 초기 육아 조직 및 경계 지역 심근 세포에 존재하는 섬유아세포에서, EDA 발현이 관찰되었다. 이러한 연구 결과는, 본 발명자들이, EDA-FN이 허혈성 심근에서 실제로 일시적으로 발현된다는 것을 보여준 본 발명자들의 이전의 쥣과 동물 데이타와 일치하는 것이다.

Claims (45)

  1. 바람직하게는 조직 손상 후, 혈관 신생을 개선하는데 사용하기 위한 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 허혈성 질환을 앓고 있는 대상체, 바람직하게는 상기 대상체의 허혈성 조직에서, 혈관 신생이 개선되는 것인 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상체의 혈관 신생을 자극하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 대상체가 허혈성 질환을 앓고 있으며, 바람직하게는 상기 대상체의 허혈성 조직에서, 혈관 신생이 개선되는 것인 방법.
  5. 서열번호:1 또는 서열번호:28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 분리된 면역글로불린 (Ig)-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 서열번호: 1의 3번 위치의 아미노산이 히스티딘, 아르기닌, 리신 및 알라닌으로부터 선택되고, 바람직하게는 서열번호: 1의 3번 위치의 아미노산이 히스티딘이고, 및/또는 서열번호: 1의 4번 위치의 아미노산이 글루탐산 및 알라닌으로부터 선택되고, 바람직하게는 서열번호: 1의 4번 위치의 아미노산이 글루탐산이고, 및/또는 서열번호: 1의 5번 위치의 아미노산이 류신 및 알라닌으로부터 선택되고, 바람직하게는 서열번호: 1의 5번 위치의 아미노산이 류신인 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, Ig-유사 분자 또는 단편이 서열번호:2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체인 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날인 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 쥐과 기원이거나, 마우스로부터 유래되는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라인 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이거나 또는 인간화된 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 서열번호:3에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:3에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 (CDR)1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:4에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:5에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:5에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 제13항에 있어서,
    - 아미노산 서열 GYSIX1SGYSWH을 갖는 CDR1, 여기서 X1은 T 및 A에서 선택됨;
    - 아미노산 서열 YIHX2SGX3ANYNPSLKS을 갖는 CDR2, 여기서 X2는 Y 및 F에서 선택되고, X3은 S 및 I에서 선택됨; 및
    - 아미노산 서열 EX4X5GX6FDY을 갖는 CDR3, 여기서 X4는 K 및 A에서 선택되고, X5는 T 및 R에서 선택되고, X6은 F 및 Y에서 선택됨;
    을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 서열번호:6에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:6에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:7에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:7에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:8에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:8에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 제15항에 있어서,
    - 아미노산 서열 RSSQSX7VX8SNGNTYLX9을 갖는 CDR1, 여기서 X7은 L 및 I에서 선택되고, X8은 H 및 R에서 선택되고, X9는 H 및 T에서 선택됨;
    - 아미노산 서열 KVSNRFS을 갖는 CDR2;
    - 아미노산 서열 X10QX11X12HVPPT을 갖는 CDR3, 여기서 X10은 S 및 F에서 선택되고, X11은 S 및 G에서 선택되고, X12는 A 및 S에서 선택됨;
    을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  17. 서열번호:3에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:3에 제시된 것과 같은 아미노산 서열 갖는 CDR1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:4에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:5에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:5에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호:6에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:6에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:7에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:7에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:8에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:8에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서, 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  18. 제17항에 있어서,
    - 아미노산 서열 GYSIX1SGYSWH을 갖는 CDR1, 여기서 X1은 T 및 A에서 선택됨;
    - 아미노산 서열 YIHX2SGX3ANYNPSLKS을 갖는 CDR2, 여기서 X2는 Y 및 F에서 선택되고, X3은 S 및 I에서 선택됨; 및
    - 아미노산 서열 EX4X5GX6FDY을 갖는 CDR3, 여기서 X4는 K 및 A에서 선택되고, X5는 T 및 R에서 선택되고, X6은 F 및 Y에서 선택됨;
    을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    - 아미노산 서열 RSSQSX7VX8SNGNTYLX9을 갖는 CDR1, 여기서 X7은 L 및 I에서 선택되고, X8은 H 및 R에서 선택되고, X9는 H 및 T에서 선택됨;
    - 아미노산 서열 KVSNRFS을 갖는 CDR2; 및
    - 아미노산 서열 X10QX11X12HVPPT을 갖는 CDR3, 여기서 X10은 S 및 F에서 선택되고, X11은 S 및 G에서 선택되고, X12는 A 및 S에서 선택됨;
    을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  19. - 서열번호:9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
    - 서열번호:10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
    - 서열번호:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    - 서열번호:12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
    - 서열번호:13에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
    - 서열번호:14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  20. - 서열번호:3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
    - 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
    - 서열번호:5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    - 서열번호:6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
    - 서열번호:7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
    - 서열번호:8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  21. - 서열번호:15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
    - 서열번호:16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
    - 서열번호:17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    - 서열번호:18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
    - 서열번호:19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
    - 서열번호:20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  22. 서열번호:29에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:29에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 (CDR)1, 여기서, 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:30에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:30에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서, 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 아미노산 서열 SHY을 갖는 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  23. 서열번호:31에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:31에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:32에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:32에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:33에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:33에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  24. 서열번호:29에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:29에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:30에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:30에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 아미노산 서열 SHY을 을 갖는 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호:31에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:31에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 서열번호:32에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:32에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨; 및 서열번호:33에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호:33에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 여기서 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 치환됨;을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  25. 제24항에 있어서,
    - 서열번호:29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
    - 서열번호:30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
    - 아미노산 서열 SHY을 갖는 CDR3;
    을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    - 서열번호:31에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
    - 서열번호:32에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
    - 서열번호:33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig-유사 분자, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  26. 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 및/또는 상기 중쇄의 CDR이 인간-유래 프레임워크 영역으로 통합되는 것인 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  27. 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항체인 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  28. 제27항에 있어서, 키메라 항체인 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  29. 제27항에 있어서, 인간화 항체인 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  30. 제12항 또는 제29항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 것으로서, 상기 중쇄가 서열번호:34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, 상기 경쇄가 서열번호:35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지거나 또는 상기 중쇄가 서열번호:36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, 상기 경쇄가 서열번호:37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 것인 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  31. 제12항 또는 제29항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 것으로서, 상기 중쇄가 서열번호:34에 제시된 바와 같은 IgG4 중쇄의 불변 영역을 포함하며, 상기 경쇄가 서열번호:35에 제시된 바와 같은 IgG4 경쇄의 불변 영역을 포함하거나 또는 상기 중쇄가 서열번호:36에 제시된 바와 같은 IgG4 중쇄의 불변 영역을 포함하며, 상기 경쇄가 서열번호:37에 제시된 바와 같은 IgG4 경쇄의 불변 영역을 포함하는 것인 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  32. 제31항에 있어서, 상기 중쇄 및/또는 경쇄가 서열번호:34에 제시된 바와 같은 IgG4 중쇄 및/또는 서열번호:35에 제시된 바와 같은 IgG4 경쇄의 프레임워크 영역 중 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 그 전체를 포함하는 가변 영역을 추가로 포함하거나, 또는 상기 중쇄 및/또는 경쇄가 서열번호:36에 제시된 바와 같은 IgG4 중쇄 및/또는 서열번호:37에 제시된 바와 같은 IgG4 경쇄의 프레임워크 영역 중 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 그 전체를 포함하는 가변 영역을 추가로 포함하는 것인 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편.
  33. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편인, 사용하기 위한 피브로넥틴-EDA와 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 방법.
  34. 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자.
  35. 제34항의 핵산 분자를 포함하는 벡터
  36. 제35항에 있어서, 유전자 치료 벡터인 벡터.
  37. 제34항의 핵산 분자 또는 제35항 또는 제36항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  38. 제37항에 있어서, 포유동물 숙주 세포인 숙주 세포.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 하이브리도마인 숙주 세포.
  40. (a) 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편, (b) 제34항에 따른 핵산 분자, (c) 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 벡터 및 (d) 제38항 또는 제39항에 따른 숙주 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  41. 의약품으로서 사용하기 위한 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제40항에 따른 약제학적 조성물.
  42. 유해 심장 리모델링 및 심근 경색 및/또는 압력-과부하를 초래하거나 또는 그와 관련된 병증의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방에 사용하기 위한 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제40항에 따른 약제학적 조성물.
  43. 유해 조직 리모델링의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제40항에 따른 약제학적 조성물.
  44. 심근 경색 및 압력-과부화를 초래하거나 또는 그와 관련된 병증 및 유해 심장 리모델링의 치료, 예방 또는 그 진행의 예방 방법으로서, (a) 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 Ig-유사 분자 또는 그의 항원-결합 단편, (b) 제34항에 따른 핵산 분자, (c) 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 벡터 및 (d) 제38항 또는 제39항에 따른 숙주 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 상기 대상체가 인간인 제2항 내지 제4항, 제33항 또는 제44항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 항-피브로넥틴-EDA 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 방법.
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