WO2012043634A1 - ヒトプロスタグランジンｅ２受容体ｅｐ４に対する抗体 - Google Patents

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清水朋子
漆畑祐司
杉本幸彦
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Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody against human prostaglandin E 2 receptor subtypes EP4.
  • Prostaglandin is a physiologically active substance called a prostanoid together with thromboxane, and is a lipid having a prostanoic acid skeleton.
  • Prostanoids such as prostaglandins are biosynthesized from arachidonic acid released from membrane phospholipids by phospholipase A2.
  • Prostaglandins are classified into groups A to J depending on the difference between the oxygen atom attached to the 5-membered ring and the double bond. Further, it is classified into 1 to 3 groups depending on the number of double bonds in the side chain of the prostanoic acid skeleton.
  • prostaglandin E has PGE 1 , PGE 2 , and PGE 3 groups that differ in the number of double bonds present in the side chain of the prostanoic acid skeleton.
  • PG is produced from PGH 2 from PGG 2 biosynthesized from arachidonic acid by cyclooxygenase I (COX-I) or cyclooxygenase II (COX-II), and then PGD 2 , PGE 2 , PGF 2 ⁇ and the like are generated.
  • PGA 2 , PGC 2 and the like are produced from PGE 2 .
  • the production reaction of each PG is caused by the action of specific enzymes, and these enzymes are considered to have tissue specificity and produce PG corresponding to the function of each tissue.
  • PGE is said to be responsible for various important biological activities and is involved in regulation of the immune system in addition to vasodilation, blood pressure lowering, uterine contraction through its specific receptors. It is believed that.
  • the receptor for PGE 2 is a 7-transmembrane G protein coupled receptor, like other PG receptors.
  • the PGE 2 receptor is abbreviated as EP, and the existence of four subtypes (EP1, EP2, EP3, EP4) has been revealed. In each subtype, EP1 is involved in an increase in intracellular Ca 2+ , EP2 and EP4 are associated with an increase in cAMP, and EP3 is associated with a decrease in cAMP (Non-patent Document 1).
  • the four subtypes have high homology in terms of protein structure.
  • Non-patent Document 2 When a low-molecular-weight compound antagonist highly selective for EP4 is administered to mice in which experimental autoimmune encephalomyelitis or contact hypersensitivity has been induced, the accumulation of both TH1 and TH17 cells in regional lymph nodes is reduced, and the disease It has been reported that the progression of is suppressed (Non-patent Document 2).
  • PGE 2 In dendritic cells, PGE 2 has been shown to enhance IL-23 production by increasing cAMP through EP4 activation.
  • PGE 2 In the TH17 cells, PGE 2 has been shown to be involved in the proliferation of TH17 cells in concert with IL-23. Also in TH17 cells, it has been shown that cAMP elevation through EP4 activation plays an important role in intracellular signal transduction (Non-patent Document 3).
  • PGE 2 receptors in particular EP4 selective antagonists, are diseases caused by immune abnormalities involving TH1 or TH17, such as multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease and contact dermatitis It is suggested that it is effective for the treatment (Non-patent Document 2).
  • PGE 2 acts on cancer tissues or surrounding tissues and is involved in cancer progression.
  • PGE 2 has been shown to be involved in infiltration of refractory inflammatory breast cancer cells or lung cancer cells into metastatic tissues (Non-Patent Documents 4 and 5).
  • PGE 2 is known to be involved in proliferation of non-small cell lung cancer cells, colon cancer cells, inflammatory breast cancer cells, B lymphocytes, prostate cancer cells and melanoma via EP4.
  • NK cells have an action of directly attacking cancer cells, but PGE 2 is known to inhibit the action.
  • Non-patent Document 6 As a mechanism of inhibition of NK cell activity of PGE 2 , intracellular cAMP increase through activation of EP4 has been shown (Non-patent Document 6). Furthermore, Treg cells, which are thought to suppress cancer immunity, are known to be activated through EP4, and the possibility of reducing the in vivo immune mechanism against cancer cells has been shown (Non-Patent Document). 7). From such reports it is clear that PGE 2 is important for cancer progression. Thus, clinical studies using non-selective inhibitors of COX related to the production of PGE 2 have been attempted, but sufficient therapeutic results have not been achieved due to side effects.
  • PGE 2 receptors particularly EP4 selective antagonists
  • various antibodies that selectively bind to the EP4 receptor are available. It is expected to be effective in the treatment of various cancers such as breast cancer, colon cancer, lung cancer, prostate cancer, skin cancer and B lymphoma.
  • non-specific COX inhibitors have been applied to reduce pain.
  • nonspecific inhibitors are known to cause side effects such as heartburn, dyspepsia, nausea, abdominal distension, diarrhea, stomach pain, peptic ulcer, and gastrointestinal bleeding.
  • COX-II selective inhibitors eg celecoxib, rofecoxib
  • COX-II selective inhibitors have been developed for the treatment of pain.
  • COX-II selective inhibitors have been suggested to cause serious cardiovascular disorders in certain patients, and drugs that alleviate pain with different mechanisms of action are desired.
  • PGE 2 is known to enhance hyperalgesia.
  • EP4 among PGE 2 receptors is involved in enhancing hyperalgesia.
  • EP4 expression is enhanced in an inflammatory pain model, and a relatively selective antagonist of EP4 (AH23848) is known to reduce pain sensitivity in the model.
  • Non-Patent Document 8 Moreover, the same result was obtained also in the analysis using the knockout mouse of EP4 (nonpatent literature 9).
  • a drug that selectively blocks the function of EP4 can be effective in treating diseases, cancer, and pain accompanied by immune abnormalities and has few side effects.
  • a plurality of antagonists based on low molecular weight compounds have been reported, but none have been successfully developed as pharmaceuticals.
  • Small molecule antagonists have room for improvement, such as binding selectivity for PGE 2 receptor subtypes (EP1-4) and reduced binding affinity for thromboxane or other prostanoid receptors. If there is not sufficient receptor selectivity, there is a concern that side effects similar to those of a COX inhibitor occur.
  • Antibodies that selectively bind to the EP4 receptor are expected to have higher receptor selectivity than low molecular weight compounds.
  • antibody drugs generally have a long half-life in blood compared to low molecular weight compounds, and are expected to retain long-term efficacy with a single administration, such as rheumatoid arthritis, colitis, cancer, etc. ) Is useful.
  • the main mechanism of action of an antibody drug against a membrane protein (receptor) is that the antibody recognizes cells expressing the protein, and then complement-dependent cytolytic action (CDC) and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. What was removed based on (ADCC) was common.
  • CDC and ADCC involve activation of inflammatory cells such as macrophages and are not necessarily appropriate for treatment of diseases and pain caused by immune abnormalities. Therefore, when a monoclonal antibody capable of selectively inhibiting EP4 is applied to treatment of a disease or pain caused by immune abnormality, a functional antibody not based on CDC or ADCC is desirable. That is, an antibody that selectively blocks EP4-dependent intracellular signal transmission is desirable.
  • Patent Document 1 Patent Document 1 describes a method for obtaining an antibody against EP4.
  • specific functions of EP4, EP2, and EP3 that specifically inhibit EP4 at low doses and do not bind to EP1, EP2, and EP3 are described.
  • the present invention has an object to provide a pharmaceutical composition, etc. comprising an antibody and said anti-human EP4 antibodies to EP4 subtype of useful human PGE 2 receptor diseases caused by immune disorders, tumors, as pain treatment.
  • the present inventors tried to produce a monoclonal antibody against the EP4 subtype of the human PGE 2 receptor. As a result, the present inventors specifically bound to the extracellular domain of the EP4 subtype and functions of EP4 (for example, intracellular cAMP concentration).
  • the present invention was completed by successfully obtaining an antibody that suppresses the ability to increase the That is, the present invention includes the following (1) to (21).
  • An antibody or a functional fragment thereof that binds to the extracellular domain of PGE 2 receptor subtype EP4 and inhibits the function of EP4.
  • CDR1 to 3 It specifically binds to the extracellular domain of EP4, and the complementarity determining regions 1 to 3 (CDR1 to 3) satisfy any of the following (A), (B) or (C) The antibody or the functional fragment thereof according to any one of (1) to (3) above, (A) a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, Heavy chain CDR2, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, A heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, A light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, Having a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • (C) a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45, Heavy chain CDR2, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46; A heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47; A light chain CDR1, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48, It has a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50.
  • (C) It has a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44.
  • the antibody or the functional fragment thereof according to any one of (1) to (9) above which is an antibody fragment, a single chain antibody, or a diabody.
  • a vector comprising the nucleic acid according to (11) above.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody or functional fragment thereof according to any one of (1) to (10) above.
  • the pharmaceutical composition according to (15) above, wherein the disease to be treated is an immune disease.
  • the pharmaceutical composition as described in (15) above, wherein the disease to be treated is a tumor.
  • the pharmaceutical composition according to (15) above, wherein the disease to be treated is pain.
  • An antibody-immobilized carrier obtained by immobilizing an anti-EP4 antibody or a functional fragment thereof according to any one of (1) to (10) on a carrier.
  • (21) A kit for measuring an EP4 expression level on a cell surface comprising the anti-EP4 antibody according to any one of (1) to (10) above.
  • the present invention provides for the first time an antibody that specifically suppresses its function in EP4.
  • the medicament of the present invention related to EP4 can treat or prevent immune diseases, tumors and pain related to EP4.
  • the antibody of the present invention having a higher binding selectivity for the EP4 subtype than a low molecular compound a therapeutic effect with fewer side effects can be provided.
  • the antibody-immobilized carrier of the present invention can selectively remove EP4-expressing cells from the blood of patients suffering from cancer, autoimmune diseases and the like.
  • the EP4 expression level measurement kit of the present invention can detect EP4-expressing cells from the blood of a patient suffering from cancer, autoimmune disease, etc., and evaluate the disease state.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry in which the binding of a mouse isotype control antibody and NBG016-mAb14 and NBG016-mAb21 to the parent strain Flp-In-CHO cells and the human EP4 stably expressing CHO cell line was analyzed.
  • FIG. 2 shows the results of flow cytometry in which the binding of the mouse isotype control antibody and NBG016-mAb9 to the parent strain Flp-In-CHO cells and the human EP4 stably expressing CHO cell line was analyzed.
  • Figure 3 is a result of analyzing the inhibitory effect of the mouse isotype control antibodies and NBG016-mAb14, NBG016-mAb21 for cAMP elevation of PGE 2 induced.
  • FIG. 4 is a result of analyzing the inhibitory effect of the mouse isotype control antibodies and NBG016-mAb9 on cAMP increase of PGE 2 induced.
  • FIG. 5 shows the results of flow cytometry in which the binding of NBG016-mAb14 to human EP1-4 and mouse EP1-4 gene-introduced 293FT cells was analyzed.
  • FIG. 6 shows the results of flow cytometry in which the binding of NBG016-mAb9 to human EP1-4 and mouse EP1-4 gene-transferred 293FT cells was analyzed.
  • FIG. 7 shows the results of flow cytometry in which the binding of mouse isotype control antibody and NBG016-mAb14 and NBG016-mAb21 to the lymphocyte fraction of human peripheral blood was analyzed.
  • FIG. 8 shows the results of flow cytometry in which the binding of a mouse isotype control antibody and NBG016-mAb9 to a lymphocyte fraction of human peripheral blood was analyzed.
  • FIG. 9 shows the result of immunostaining with human anti-EP4 antibody after treatment of human monocytic THP1 cell line with PMA.
  • FIG. 10 shows a flow site in which the binding of the culture supernatant of a non-antibody gene-introduced cell and the culture supernatant of a recombinant antibody NBG016-mAb9 gene-expressing cell to the parent strain Flp-In-CHO cell and human EP4 -stable CHO cell strain is analyzed. It is a result of a measurement.
  • FIG. 10 shows a flow site in which the binding of the culture supernatant of a non-antibody gene-introduced cell and the culture supernatant of a recombinant antibody NBG016-mAb9 gene-expressing cell to the parent strain Flp-
  • FIG. 11 shows the results of flow cytometry in which the binding of mouse isotype control antibody, recombinant antibody NBG016-mAb14, and recombinant antibody NBG016-mAb21 to the parent strain Flp-In-CHO cells and human EP4 ⁇ ⁇ stably expressing CHO cell lines was analyzed.
  • FIG. 12 (A) shows the results of flow cytometry in which the binding of the mouse isotype control antibody and the mouse IgG1-type antibody NBG016-mAb21 to the parent strain Flp-In-CHO cells and the human EP4 stably expressing CHO cell line was analyzed. Also FIG.
  • FIG. 12 (B) is a result of analyzing the inhibitory effect of the mouse isotype control antibody and mouse IgG1 type antibodies NBG016-mAb21 for cAMP elevation of PGE 2 induced.
  • FIG. 13 shows the culture supernatant of the antibody gene non-introduced cells and the culture supernatant of human chimeric antibody NBG016-mAb14 gene-expressing cells, human chimeric antibody NBG016-, for the parent strain Flp-In-CHO cells and human EP4 stably expressed CHO cell strain. It is the result of the flow cytometry which analyzed the coupling
  • the present invention is an antibody or a functional fragment thereof that binds to the extracellular domain of human PGE 2 receptor subtype EP4 and suppresses the function of EP4, and a medicament containing these antibodies or functional fragments thereof.
  • EP4 Protein As an EP4 protein that serves as an antigen of the present invention, a recombinant protein prepared from a cDNA or the like encoding an EP4 protein can be used. Alternatively, suitable cells that express EP4 on the cell surface may be used as the antigen. Nucleic acid sequences encoding human EP4 protein can be searched from public databases such as GenBank (for example, accession number: NM_000958). A DNA (such as cDNA) encoding EP4 can be prepared from an appropriate DNA library using a probe prepared based on this gene sequence or the like, or a primer pair for PCR amplification. Alternatively, total cDNA can be prepared by an artificial DNA synthesis method.
  • SEQ ID NO: 21 shows the amino acid sequence corresponding to human EP4.
  • Various variants such as amino acid substitutions are known for human EP4 other than the one shown in SEQ ID NO: 21.
  • “Human EP4” in the present invention includes the variants as long as it has a function as EP4.
  • the intracellular and extracellular domains of human EP4 are considered to correspond to the following parts in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21.
  • the left side is the amino acid number
  • the right side is each domain.
  • some front and back (1-5 amino acid residues, preferably 1-3 amino acid residues, more preferably 1-2 amino acid residues may occur.
  • N-terminal domain 44 to 54 intracellular first loop domain 80 to 96: extracellular first loop domain 116 to 135: intracellular second loop domain 161 to 184: extracellular second loop domain 212 to 267 : Intracellular third loop domain 296-312: extracellular third loop domain 333-488: C-terminal domain
  • Antibodies that suppress the function of EP4 of the present invention include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, etc., and functional fragments of the antibodies include antibodies such as Fab or F (ab ′) 2 Any fragment or single-chain antibody, which is a polypeptide (or polypeptide complex) that forms part of the antibody and suppresses the function of EP4, can be used. Included in the range.
  • EP4 examples include functions such as an increase in intracellular cAMP and activation of phosphoinoside 3-kinase (PI3K). These intracellular changes are known to control cancer cell proliferation, T lymphocyte cell proliferation, and cytokine production. That the antibody of the present invention specifically binds to the extracellular domain of human PGE 2 receptor subtype EP4 can be shown as follows. A nucleic acid sequence encoding human EP4 protein is inserted into an expression vector, and the vector is introduced into an appropriate host cell (eg, mammalian cells such as CHO cells, yeast cells, insect cells, etc.).
  • an appropriate host cell eg, mammalian cells such as CHO cells, yeast cells, insect cells, etc.
  • the antibody of the present invention is brought into contact with an EP4 expression host cell that does not have non-destructive amino acid insertions, deletions, substitutions, or the like, and the antibody of the present invention and allowed to react for a certain period of time. After washing excess antibody, the amount of antibody bound to the cells is measured by ELISA, RIA or flow cytometry. Binding of EP4 to the extracellular domain can be shown by more binding of the antibody of the present invention to EP4 expressing host cells compared to non-expressing host cells. Furthermore, an expression vector into which a nucleic acid sequence encoding a human or mouse-derived EP1, EP2, EP3 or EP4 protein is inserted is constructed, and receptor-expressing host cells are analyzed in the same manner as described above. The antibody of the present invention has more binding to human EP4-expressing host cells than other receptor cell-expressing cells, and preferably shows that binding to receptor-expressing cells other than human EP4 is not observed. it can.
  • the antibody of the present invention is an antibody that inhibits the function of EP4.
  • a nucleic acid sequence encoding human EP4 protein is inserted into an expression vector, and the vector is introduced into an appropriate host cell (for example, mammalian cells such as CHO cells, yeast cells, insect cells, etc.).
  • Human EP4-expressing host cells are contacted with antibodies at 0.01 to 30 ⁇ g / mL, and then PGE 2 is further contacted at a concentration of 10 ⁇ 12 to 10 ⁇ 6 M. Thereafter, the increase in intracellular cAMP is measured by an appropriate method.
  • the antibody of the present invention is added, the increase in cAMP induced by PGE 2 can be suppressed in a dose-dependent manner.
  • PGE 2 is further contacted at a concentration of 10 ⁇ 12 to 10 ⁇ 6 M.
  • cytokines and chemokines upon inflammation stimulation for example, lipopolysaccharide (LPS)
  • LPS lipopolysaccharide
  • PGE 2 is known to suppress cytokine production by LPS stimulation via EP4 or EP2.
  • Antibodies of the present invention it is possible to evaluate the functional inhibition of EP4 an index to recover cytokine production inhibition by PGE 2 via EP4.
  • inhibition of EP4 function of this antibody can be evaluated using the inhibitory effect of IL-23 production enhancing action by PGE 2 from human peripheral blood dendritic cells as an index.
  • cancer cell lines derived from human bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colorectal cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, skin cancer, lung cancer, oral cancer, prostate cancer, and multiple myeloma for example, MDA- When MB-231 cells, HCA-7 cells, HT-29 cells, etc.
  • PGE 2 multiple myeloma
  • the antibody of the present invention binds only to human EP4 and does not react to mouse EP4. Therefore, it is difficult to evaluate the drug effect on immune abnormalities and pain by animal tests.
  • cells expressing high levels of EP4 established from the above human cancer tissues are inoculated into immunodeficient mice at a cell number of 10 6 to 10 7 per mouse.
  • 0.1 to 0.5 mg / animal of the present invention is administered intraperitoneally or subcutaneously to mice.
  • the antibody administration group of the present invention can exhibit an antitumor effect by significantly reducing tumor formation and metastasis frequency.
  • Examples of the antibody of the present invention and functional fragments thereof include, for example, hybridomas of accession numbers FERM BP-11402 (NBG016-mAb14) and FERM BP-11403 (NBG016-mAb21) in international deposits.
  • the monoclonal antibody prepared by the method shown in the Examples described later can be mentioned.
  • an antibody having a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: An antibody having a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43, and a sequence
  • an antibody whose epitope overlaps (or is identical) with any of the monoclonal antibodies isolated in Examples is particularly preferred.
  • Such an antibody is referred to as an antibody that binds to substantially the same site in the present invention.
  • two antibodies bind to substantially the same site as the antigen protein can be determined, for example, by competition experiments. Specifically, when the binding between the anti-EP4 antibody of Example and EP4 is competitively inhibited by the second anti-EP4 antibody, the first antibody and the second antibody bind to substantially the same antigenic site. It is judged that Thus, antibodies that bind to substantially the same site as the EP4 binding site of the antibody isolated in the Examples and that have an action of inhibiting the function of EP4 are included in the present invention.
  • the anti-EP4 antibody of the present invention may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a functional fragment thereof.
  • Monoclonal antibodies are preferred in that homogeneous antibodies can be stably produced as pharmaceutical compositions.
  • “Monoclonal” is indicative of the properties of an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies and is not intended to limit the production of the antibody by any particular method.
  • the monoclonal antibody used in the present invention may be produced, for example, by the hybridoma method (Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)) or the recombinant method (US Pat. No. 4,816,567).
  • Monoclonal antibodies for use in the present invention may be isolated from a phage antibody library (Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581- 597 (1991)).
  • the monoclonal antibody in the present invention includes a part of the heavy chain and / or light chain derived from a specific species, or a specific antibody class or subclass, and the remaining part of the chain from another species, or another antibody. Included are “chimeric” antibodies (immunoglobulins), antibody variants, and functional fragments thereof that are derived from a class or subclass (US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci). USA 81: 6851-6855 (1984)).
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody
  • it can be prepared, for example, by injecting a mixture of an immunogen and an adjuvant into a mammalian host animal.
  • an antigen and / or adjuvant as an immunogen is injected multiple times subcutaneously or intraperitoneally into a host animal.
  • adjuvants include complete Freud and monophosphoryl lipid A synthesis-trehalose dicorynomycolate (MPL-TDM).
  • MPL-TDM monophosphoryl lipid A synthesis-trehalose dicorynomycolate
  • a desired antibody can be obtained by using an antibody against EP4 produced in blood as an index of EP4 binding specificity, EP4 function inhibitory action, and the like.
  • the antibody of the present invention is a monoclonal antibody
  • it can be prepared, for example, using a hybridoma method.
  • This method includes the following four steps: (i) immunizing a host animal or human EP4 protein from the host animal, (ii) monoclonal antibody secreting (or potentially secreting) lymphocytes (Iii) fuse lymphocytes to immortalized cells; (iv) select cells that secrete the desired monoclonal antibody.
  • a mouse, rat, guinea pig, hamster, or other suitable host animal is selected as the immunized animal and the immunogen is injected.
  • lymphocytes obtained from the host animal are fused with an immortalized cell line using a fusing agent such as polyethylene glycol in order to establish hybridoma cells.
  • a fusing agent such as polyethylene glycol
  • the fusion cell for example, a rat or mouse myeloma cell line is used.
  • the cells are grown in a suitable medium containing one or more substrates that inhibit the growth or survival of unfused lymphocytes and immortalized cell lines.
  • Conventional techniques use parental cells that lack the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT).
  • hypoxanthine, aminopterin and thymidine are added to a medium (HAT medium) that inhibits the growth of HGPRT-deficient cells and allows the growth of hybridomas.
  • HAT medium a medium that inhibits the growth of HGPRT-deficient cells and allows the growth of hybridomas.
  • HAT medium a medium that inhibits the growth of HGPRT-deficient cells and allows the growth of hybridomas.
  • a hybridoma that produces a desired antibody is selected, and the target monoclonal antibody can be obtained from the medium in which the hybridoma grows according to a conventional method.
  • the hybridoma thus prepared can be cultured in vitro, or in vivo cultured in ascites such as mouse, rat, guinea pig, hamster, etc., and the desired antibody can be prepared from the culture supernatant or ascites.
  • the nucleic acid of the present invention encodes the heavy chain variable region or the light chain variable region in the antibody of the present invention.
  • a nucleic acid encoding a heavy chain variable region or a light chain variable region, which is a nucleic acid of the present invention may be inserted into a vector and expressed in a cell.
  • the type of vector is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of host cell introduced thereafter.
  • recombinant antibodies can be prepared by introducing them into appropriate host cells (for example, mammalian cells such as CHO cells, yeast cells, insect cells, etc.).
  • an embodiment of the anti-EP4 antibody of the present invention includes a recombinant antibody.
  • a recombinant antibody for example, a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody etc. are mentioned.
  • the chimeric antibody is an antibody in which a variable region derived from different animal species and a constant region are linked, particularly an antibody in which the variable region of a mouse-derived antibody is linked to a human-derived constant region (Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.
  • the heavy chain variable region is preferably composed of, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 12, and the light chain variable region is, for example, SEQ ID NO: 4 or sequence What consists of an amino acid sequence shown by the number 14 is preferable.
  • the chimeric heavy chain or chimeric light chain of the present invention is inserted into the vector.
  • the type of vector is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of host cell introduced thereafter.
  • recombinant antibodies can be prepared by introducing them into appropriate host cells (for example, mammalian cells such as CHO cells, yeast cells, insect cells, etc.).
  • the chimeric antibody of the present invention includes a humanized antibody.
  • the humanized antibody is an antibody whose framework region is derived from human and CDR is a region derived from mouse.
  • the humanized antibody is prepared by first transplanting the CDR from the variable region of the mouse antibody to the human variable region, reconstituting the heavy chain and light chain variable regions, and then converting these humanized reshaped human variable regions to humans. It can be produced by linking to a constant region.
  • Methods for producing such humanized antibodies are well known in the art (eg, Nature, 321, 522-525 (1986); J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987); Queen C et al., Proc. Natl. Acad.
  • the mouse-derived CDR sequence used for the anti-EP4 antibody of the present invention is not limited.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 7 as heavy chain CDRs 1 to 3 are light chain CDRs 1 to 3.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 10 or the light chain CDRs 1 to 3 as shown in SEQ ID NOs: 18 to 20 are expressed in order to express a humanized antibody heavy chain or a humanized antibody light chain in a host cell.
  • the humanized antibody heavy chain or humanized antibody light chain may be inserted into a vector.
  • the type of the vector is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of host cell introduced thereafter.
  • In order to express these as antibodies they are introduced into appropriate host cells (for example, mammalian cells such as CHO cells, yeast cells, insect cells, etc.), and the antibodies are reconstituted in the host cells. It can also be prepared.
  • human antibodies of human antibody of the present invention (fully human antibodies), hypervariable region, an antigen-binding site of the variable region (Hyper Variable region), the structure of other parts and constant regions of the variable region, It has the same structure as a human antibody.
  • the hypervariable site may be derived from another animal.
  • a human antibody can be easily prepared by a person skilled in the art by a known technique.
  • the human antibody can be obtained by, for example, a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment containing the heavy and light chain genes of a human antibody (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1997) 16, 133-. Kuroiwa, Y. et al., Nuc.
  • the functional fragment of the antibody of the present invention means a partial region of the anti-EP4 antibody, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv (variable fragment of antibody).
  • Single chain antibody (heavy chain, light chain, heavy chain variable region, light chain variable region, etc.), scFv, diabody (scFv dimer), dsFv (disulfide stabilized variable region), and at least one CDR Peptides contained in the part.
  • Fab is an antibody fragment having antigen-binding activity in which about half of the heavy chain N-terminal side and the entire light chain are bound by a disulfide bond, among fragments obtained by treating antibody molecules with the proteolytic enzyme papain.
  • an appropriate expression vector into which DNA encoding Fab is inserted is constructed, and this is used as an appropriate host cell (for example, CHO cell). (Mammalian cells, yeast cells, insect cells, etc.) and then Fab can be expressed in the cells.
  • F (ab ′) 2 has an antigen binding activity that is slightly larger than that obtained by treating antibody molecules with proteolytic enzyme pepsin and Fab is bound via a disulfide bond in the hinge region. It is an antibody fragment.
  • F (ab ′) 2 can be produced by treating with the antibody molecule pepsin to obtain a fragment, and can also be prepared by linking a Fab described below with a thioether bond or a disulfide bond. Can also be made.
  • Fab ′ is an antibody fragment having an antigen-binding activity obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 .
  • Fab ′ can also be produced by genetic engineering techniques as in the case of Fab and the like.
  • scFv is a VH-linker-VL or VL-linker-VH polypeptide in which one heavy chain variable region (VH) and one light chain variable region (VL) are linked using an appropriate peptide linker.
  • the scFv can be prepared by obtaining a cDNA encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region of an antibody and using a genetic engineering technique.
  • Diabody is an antibody fragment in which scFv is dimerized and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity may be the same antigen binding activity, or one may be a different antigen binding activity.
  • Diabody obtains cDNA encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region of an antibody, constructs cDNA expressing scFv in which the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked by a peptide linker, It can be produced by a technique.
  • dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of the heavy chain variable region and the light chain variable region is substituted with a cysteine residue, which are linked via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted with the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody by the method shown by Reiter et al.
  • dsFv can be prepared by obtaining a cDNA encoding the heavy chain variable region and light chain variable region of an antibody, constructing a DNA encoding dsFv, and genetic engineering techniques.
  • a peptide comprising a CDR is configured to comprise at least one region of a heavy chain or light chain CDR (CDR1-3). Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • DNA encoding the heavy chain or light chain CDR of the antibody is constructed and inserted into an expression vector.
  • the type of vector is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of host cell introduced thereafter.
  • a peptide containing CDR can also be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the method for purifying the antibody of the present invention is not particularly limited, and a known method can be employed.
  • the culture supernatant of the hybridoma or the recombinant cell can be collected, and the antibody of the present invention can be purified by combining various known techniques such as chromatography, salting out, dialysis, membrane separation and the like.
  • the antibody isotype is IgG, it can be easily purified by affinity chromatography using protein A.
  • Medicament containing the antibody of the present invention can be used as a medicament comprising these as active ingredients.
  • a medicament of the present invention can be used for the treatment or prevention of immune diseases, tumors and pain related to EP4.
  • EP4 related immune diseases include, for example, psoriasis; multiple sclerosis; rheumatoid arthritis; systemic lupus erythematosus; inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease; type I diabetes and its complications (eg diabetic retinopathy, diabetic microvessels) , Diabetic nephropathy, macular degeneration, etc.); polymyositis; Sjogren's syndrome; asthma atopic and contact dermatitis; immunodeficiency disease; organ transplantation.
  • Nociceptive pain includes, for example, pain resulting from activation of somatic and visceral nociceptors, such as pathological deformities in the joints and chronic joint pain (eg, arthritis including rheumatoid arthritis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis) (Including spondylitis, osteoarthritis, gouty arthritis and juvenile arthritis) (including disease relief and joint structure maintenance); low back and neck pain; musculoskeletal pain; myositis; fractures; sprains, contusions; fibromyalgia Concomitant pain; pain associated with tumors and tumor treatment; pain associated with influenza or other viral infections (such as the common cold); rheumatic fever; visceral pain; functional bowel disease (eg irritable bowel syndrome, noncardiac) Pain associated with chest pain, non-ulcer dyspepsia, etc
  • Neuropathic pain includes, for example, physical trauma and amputation; phantom limb pain; pain due to chronic inflammatory symptoms; postherpetic neuralgia; diabetic neuropathy; nonspecific low back pain; back pain; sciatica; -Related neuropathy; HIV-related neuropathy; Carpal tunnel syndrome; Chronic alcoholism; Hypothyroidism; Trigeminal neuralgia; Trigeminal / autonomic headache; Uremia; Vitamin deficiency; Multiple sclerosis; Fibromyalgia Disease: Pain associated with toxins.
  • the medicament of the present invention is useful for treating or preventing tumors.
  • Tumor treatment includes not only full or partial inhibition of tumor growth, spread, metastasis or complete or partial removal of tumor cells, but also partial symptoms of the tumor (pain, loss of appetite, weight loss, etc.) Or including full resolution.
  • tumor treatment or prevention of tumor abnormal growth and polyp of benign tumor, abnormal growth and polyp of malignant tumor, and neoplasm are targeted.
  • Abnormal growth and polyps of benign tumors include, for example, squamous cell papilloma; basal cell tumor; transitional cell papilloma; adenoma; gastrinoma; cholangiocellular adenoma; hepatocellular adenoma; renal tubular adenoma; Nevi; fibroid; myxoma; lipoma; leiomyoma; rhabdomyomas; benign teratoma; hemangioma; osteoma; chondroma and meningioma.
  • malignant tumors such as hepatocellular carcinoma; cholangiocellular carcinoma; renal cell carcinoma; squamous cell carcinoma; basal cell carcinoma; transitional cell carcinoma; adenocarcinoma; malignant gastrinoma; Including liposarcoma; leiomyosarcoma; rhabdomyosarcoma; malignant teratoma; hemangiosarcoma; Kaposi's sarcoma; osteosarcoma; chondrosarcoma; lymphangiosarcoma; malignant meningioma; .
  • Neoplasms include epithelial cell-derived neoplasms (epithelial carcinomas), basal cell carcinomas, adenocarcinomas, and gastrointestinal cancers such as lip cancer, oral cancer, esophageal cancer, small intestine cancer and gastric cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, Includes bladder cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, cervical cancer, lung cancer, breast cancer, and skin cancer, such as squamous cell carcinoma and basal cell carcinoma, prostate cancer, renal cell carcinoma, and systemic epithelium, mesenchyme Or other known cancers that affect blood cells.
  • An antibody-drug complex comprising the antibody of the present invention and a compound having antitumor activity and / or cell killing activity can be provided.
  • a protein toxin as a compound having antitumor activity and / or cell killing activity is fused with an antibody gene on a gene and expressed as one protein, Generally referred to as immunotoxin.
  • the compound having antitumor activity include doxorubicin, mitomycin C and the like.
  • a method for producing the antibody-drug complex is not limited, and examples thereof include a method of coupling an antibody and a drug by a disulfide bond or a hydrazone bond.
  • composition Comprising the Antibody of the Present Invention
  • the present invention also includes a pharmaceutical or pharmaceutical composition.
  • an active ingredient of the medicament of the present invention in addition to the above-described antibody of the present invention or a functional fragment thereof, physiologically acceptable salts thereof may be used.
  • the salt examples include alkali metal and alkaline earth metal salts such as lithium, sodium, potassium, magnesium, and calcium; ammonia, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, dicyclohexylamine, tris ( A salt of an amine such as hydroxymethyl) aminomethane, N, N-bis (hydroxyethyl) piperazine, 2-amino-2-methyl-1-propanol, ethanolamine, N-methylglucamine, L-glucamine; or lysine; Salts with basic amino acids such as ⁇ -hydroxylysine and arginine can be formed.
  • alkali metal and alkaline earth metal salts such as lithium, sodium, potassium, magnesium, and calcium
  • ammonia methylamine, dimethylamine, trimethylamine, dicyclohexylamine, tris
  • a salt of an amine such as hydroxymethyl) aminomethane, N, N-bis (hydroxyethyl) piperazine, 2-amino-2-methyl-1-propanol,
  • salts of mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid; methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, paratoluenesulfonic acid, acetic acid, propionate, tartaric acid , Fumaric acid, maleic acid, malic acid, oxalic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid, mandelic acid, cinnamic acid, lactic acid, glycolic acid, glucuronic acid, ascorbic acid, nicotinic acid, salicylic acid and other organic acids Salts; or salts with acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid.
  • the medicament of the present invention may administer the antibody of the present invention which is an active ingredient or a functional fragment thereof, but generally one or more of the antibody or functional fragment thereof which is an active ingredient. It is desirable to administer in the form of a pharmaceutical composition containing the above pharmaceutical additives.
  • a pharmaceutical composition containing the above pharmaceutical additives As the active ingredient of the medicament of the present invention, two or more of the antibodies of the invention or functional fragments thereof can be used in combination, and the above-mentioned pharmaceutical composition may be combined with other known drugs. .
  • the type of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and the dosage form includes tablets, capsules, granules, powders, syrups, suspensions, suppositories, ointments, creams, gels, patches, inhalants, An injection agent etc. are mentioned.
  • preparations are prepared according to a conventional method.
  • a liquid preparation it may be dissolved or suspended in water or other appropriate solvent at the time of use. Tablets and granules may be coated by a known method.
  • injection it is prepared by dissolving the compound of the present invention in water, but it may be dissolved in physiological saline or glucose solution as necessary, and a buffer or preservative may be added. Good. It is provided in any dosage form for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration in the form of granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, syrups, emulsions, suspensions or liquids, for intravenous administration, for intramuscular administration
  • it can be prepared as a pharmaceutical composition for parenteral administration in the form of injections, drops, transdermal absorbents, transmucosal absorbents, nasal drops, inhalants, suppositories and the like for subcutaneous administration.
  • Injections, infusions and the like can be prepared as powdered dosage forms such as freeze-dried forms, and can be used by dissolving in an appropriate aqueous medium such as physiological saline at the time of use.
  • a sustained-release preparation coated with a polymer directly into the brain.
  • a person skilled in the art can appropriately select the type of pharmaceutical additive used for the production of the pharmaceutical composition, the ratio of the pharmaceutical additive to the active ingredient, or the method for producing the pharmaceutical composition depending on the form of the composition. It is.
  • the additive for preparation an inorganic or organic substance or a solid or liquid substance can be used, and it can generally be blended in an amount of 1 to 90% by weight based on the weight of the active ingredient.
  • examples of such substances are lactose, glucose, mannitol, dextrin, cyclodextrin, starch, sucrose, magnesium aluminate metasilicate, synthetic aluminum silicate, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, carboxymethylcellulose calcium.
  • Ion exchange resin methyl cellulose, gelatin, gum arabic, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, light anhydrous silicic acid, magnesium stearate, talc, tragacanth, bentonite, bee gum, titanium oxide, sorbitan fatty acid ester, Sodium lauryl sulfate, glycerin, fatty acid glycerin ester, purified lanolin, glycerogelatin, polyso Bate, macrogol, vegetable oils, waxes, liquid paraffin, white petrolatum, fluorocarbons, nonionic surfactants, propylene glycol, water and the like.
  • an active ingredient and excipient components such as lactose, starch, crystalline cellulose, calcium lactate, anhydrous silicic acid and the like are mixed to form a powder, or if necessary, sucrose, Add a binder such as hydroxypropylcellulose and polyvinylpyrrolidone, a disintegrant such as carboxymethylcellulose and carboxymethylcellulose calcium, and wet or dry granulate to form granules.
  • these powders and granules may be tableted as they are, or by adding a lubricant such as magnesium stearate and talc.
  • granules or tablets should be coated with an enteric solvent base such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, methacrylic acid-methyl methacrylate polymer, etc., and coated with an enteric solvent preparation, or with ethylcellulose, carnauba wax, hardened oil, etc. You can also.
  • an enteric solvent base such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, methacrylic acid-methyl methacrylate polymer, etc.
  • enteric solvent preparation or with ethylcellulose, carnauba wax, hardened oil, etc. You can also.
  • powder capsules or granules are filled into hard capsules, or active ingredients are coated as they are or dissolved in glycerin, polyethylene glycol, sesame oil, olive oil, etc., and then coated with a gelatin film to form soft capsules. be able to.
  • active ingredients such as hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactose, lactic acid, sodium, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, etc. It can be dissolved in distilled water for injection together with an isotonic agent, filtered aseptically and filled into ampoules, or further lyophilized by adding mannitol, dextrin, cyclodextrin, gelatin, etc. .
  • reticine, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil and the like can be added to the active ingredient and emulsified in water to give an emulsion for injection.
  • the active ingredient is moistened with a suppository base material such as cacao butter, fatty acid tri, di- and monoglycerides, polyethylene glycol, etc., dissolved, poured into a mold and cooled, or the active ingredient What is necessary is just to coat
  • a suppository base material such as cacao butter, fatty acid tri, di- and monoglycerides, polyethylene glycol, etc.
  • the dose and frequency of administration of the medicament of the present invention are not particularly limited, and conditions such as prevention and / or progression of the disease to be treated and / or purpose of treatment, type of disease, patient weight and age, severity of the disease, etc. Depending on the situation, it is possible to make an appropriate selection based on the judgment of the doctor.
  • the dose per day for an adult in oral administration is about 0.01 to 1000 mg (weight of active ingredient), and can be administered once or several times a day or every few days. it can.
  • daily dosages of 0.001 to 400 mg (active ingredient weight) are preferably administered continuously or intermittently to adults.
  • the medicament of the present invention can be prepared as a sustained-release preparation such as a delivery system encapsulated in implantable tablets and microcapsules, using a carrier that can prevent immediate removal from the body.
  • a carrier for example, biodegradable and biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydride, polyglycolic acid, collagen, polyorthoester, and polylactic acid can be used. Such materials can be readily prepared by those skilled in the art. Liposome suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers.
  • Useful liposomes are prepared as a lipid composition comprising, but not limited to, phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanol (PEG-PE), through a filter of appropriate pore size so as to be of a size suitable for use. Purified by evaporation.
  • the medicament of the present invention can be contained in the form of a kit as a pharmaceutical composition together with instructions for administration in a container or pack.
  • a kit When the pharmaceutical composition of the present invention is supplied as a kit, different components of the composition are packaged in separate containers and mixed immediately before use. The reason why the components are packaged separately is to enable long-term storage without losing the function of the active component.
  • the reagent contained in the kit is supplied into a container made of a material that maintains the activity of the component effectively for a long period of time, does not adsorb inside the container, and does not alter the component.
  • a sealed glass ampoule may include a buffer sealed in the presence of a neutral and non-reactive gas such as nitrogen gas.
  • the ampoule is composed of glass, polycarbonate, organic polymers such as polystyrene, ceramic, metal, or any other suitable material commonly used to hold reagents.
  • instructions for use may be attached to the kit.
  • Instructions for use of this kit are printed on paper and / or electrically and / or electromagnetically readable, such as floppy disk, CD-ROM, DVD-ROM, Zip disk, video tape, audio tape, etc. It may be stored on a medium and supplied to the user. Detailed instructions for use may be actually attached to the kit, or may be posted on a website designated by the manufacturer or distributor of the kit or notified by e-mail or the like.
  • the present invention includes a method for preventing or treating immune diseases, tumors, pain and the like related to EP4 by administering the pharmaceutical or pharmaceutical composition of the present invention to a patient or the like.
  • treatment means to prevent or alleviate the progression and worsening of the disease state in a mammal suffering from a disease or the like that develops due to an abnormal function of EP4 (eg, an abnormal increase in function).
  • an abnormal function of EP4 eg, an abnormal increase in function
  • the treatment aims to prevent or alleviate the progression and worsening of the disease.
  • prevention refers to pre-preventing the onset or illness of a mammal that is likely to suffer from a disease or the like that develops due to an EP4 dysfunction (for example, increased function abnormality). This is a treatment aimed at preliminarily preventing the onset of various symptoms of the disease.
  • the “mammal” to be treated means any animal classified as a mammal, and is not particularly limited.
  • pet animals such as dogs, cats, rabbits, cows, pigs, sheep , Livestock animals such as horses.
  • Particularly preferred “mammals” are humans.
  • the present invention includes an antibody-immobilized carrier.
  • the antibody-immobilized carrier of the present invention is obtained by immobilizing the anti-human EP4 antibody of the present invention on a carrier.
  • the antibody-immobilized carrier of the present invention is used for removing EP4 expressing cells from the body fluid by contacting blood containing EP4 expressing cells. Only one type or two or more types of anti-human EP4 antibodies may be immobilized on the carrier.
  • Specific examples of the antibody-immobilized carrier of the present invention include those in which the antibody of the present invention is immobilized on a water-insoluble carrier and filled in a container.
  • any material can be used as the water-insoluble carrier, but polyethylene, polypropylene, polystyrene, acrylic resin, nylon, polyester, and polycarbonate are listed as preferable in view of low moldability, sterilization, and cytotoxicity.
  • Synthetic polymers such as polyacrylamide and polyurethane, natural polymers such as agarose, cellulose, cellulose acetate, chitin, chitosan and alginate, inorganic materials such as hydroxyapatite, glass, alumina and titania, metal materials such as stainless steel and titanium Is mentioned.
  • the shape of the carrier examples include granular, cotton-like, woven fabric, non-woven fabric, sponge-like porous body, flat plate shape, etc., but in terms of large surface area per volume, granular, cotton-like, woven fabric, non-woven fabric, A sponge-like porous body is preferred.
  • the peripheral blood can be passed through a porous body filter in which a container is preliminarily filled with a water-insoluble carrier to which an antibody is immobilized, thereby efficiently removing EP4-expressing cells associated with the disease.
  • a kit for removing EP4-expressing cells can be prepared by combining the antibody-immobilized carrier of the present invention and other components. Examples of the other components include an anticoagulant and an extracorporeal circuit.
  • the anti-EP4 antibody of the present invention can be provided in the form of a diagnostic kit.
  • the diagnostic kit of the present invention contains an antibody, but can additionally contain a labeling substance, or a secondary antibody or a labeled product thereof.
  • the antibody labeling substance means a substance labeled with an enzyme, a radioisotope, a fluorescent compound, a chemiluminescent compound, or the like.
  • the diagnostic kit of the present invention includes other reagents for carrying out the detection of the present invention, such as an enzyme substrate (such as a chromogenic substrate) and an enzyme substrate when the label is an enzyme label.
  • a lysis solution may contain a lysis solution, an enzyme reaction stop solution, or a sample dilution solution.
  • various buffers, sterilized water, various cell culture containers, various reaction containers (eppendorf tubes, etc.), blocking agents (serum components such as Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat serum), detergents, surfactants, Various plates, preservatives such as sodium azide, and experimental operation manuals (instructions) may be included.
  • ELISA method EI method, RIA method, fluorescence immunoassay method (FIA), chemiluminescence immunoassay method (Luminescence immunoassay), flow cytometry method can be considered. Is preferable in terms of simplicity and high sensitivity.
  • the diagnostic kit of the present invention can be reacted with blood cells of a patient suffering from cancer, autoimmune disease, etc., and the proportion of EP4-expressing cells in the blood can be detected.
  • the proportion of EP4-expressing cells in a specific cell population for example, dendritic cells, TH17 cells, Treg cells
  • the state of the disease can be evaluated by evaluating the increase / decrease in the ratio of EP4-expressing cells.
  • Plasmid DNA of pcDNA-DEST40-hEP4 was amplified by transforming Escherichia coli (DH5 ⁇ strain) according to a conventional method, and prepared according to the instructions using PureLink HiPure Plasmid Filter Prep Kit (Invitrogen).
  • EP4 gene-introduced 293FT cells and non-gene-introduced 293FT cells were subjected to cell membrane permeabilization using Cytofix / Cytoperper Kit (manufactured by BD), mixed and incubated with anti-V5 tag antibody (manufactured by Invitrogen) (4 ° C., 1 hour). After washing three times with a washing buffer (PBS containing 0.1% fetal bovine serum (Phosphate Buffered Saline, manufactured by Invitrogen)), staining with a secondary antibody Alexa488-labeled anti-mouse IgG antibody (Invitrogen) (4 ° C.
  • a washing buffer PBS containing 0.1% fetal bovine serum (Phosphate Buffered Saline, manufactured by Invitrogen)
  • Alexa488-labeled anti-mouse IgG antibody Invitrogen
  • the well plate was seeded at a rate of 100 ⁇ L / well and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . From the next day of the fusion, the medium was replaced with a medium obtained by adding HAT Supplement (manufactured by Invitrogen) to the above medium, and the culture was continued for 13 days after the fusion. As a result, about 700 clones of hybridoma colonies were obtained.
  • NS0 cell line stably expressing human EP4 From pDONR-hEP4 described in (1), the pEF-DEST51 vector (manufactured by Invitrogen) was recombined with the Gateway system to obtain the pEF-DEST51-hEP4 plasmid. .
  • Human EP4 expressed from this plasmid is a fusion protein with V5 and 6 ⁇ HIS tags added to the C-terminus.
  • Lipoffectamine is added to 1 ⁇ 10 7 mouse myeloma NS0 cells (RIKEN cell bank) cultured in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum, 100 units / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin (manufactured by Invitrogen).
  • the cells were cultured in RPMI medium supplemented with 2.5 ⁇ g / mL antibiotic blasticidin (manufactured by Invitrogen) for 2 weeks while changing the medium every third day.
  • Blasticidin-resistant NS0 cells were cloned from the formed colonies by the penicillin cap method.
  • the obtained blasticidin-resistant NS0 cells were blocked with FcBlock (Becton Dickinson) at 4 ° C. for 15 minutes, and then the expression of EP4 fusion protein was confirmed by flow cytometry in the same manner as in (2). As a result, it was confirmed that the obtained blasticidin-resistant NS0 cells stably expressed human EP4.
  • hybridomas were named NBG016-mAb14 and NBG016-mAb21, respectively.
  • the obtained hybridoma cells NBG016-mAb14 and NBG016-mAb21 are dated June 29, 2010 (original deposit date), 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 6 Deposited to the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as deposit numbers FERM P-21978 and FERM P-21979, respectively.
  • the accession numbers are FERM BP-11402 and FERM BP-11403, respectively.
  • NBG016-mAb14 and NBG016-mAb21 are each cultured in serum-free CD-Hybridoma Medium (manufactured by Invitrogen) until about 90% of the cells are killed. Was produced. Cells were removed from 100 mL of this culture supernatant by centrifugation (1,500 rpm, 15 minutes), and then passed through a HiTrap Protein G HP column (GE Healthcare Japan) to purify and concentrate IgG. About the obtained purified IgG, the type of the subclass and the light chain was determined using the Iso Strip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Diagnostics), and both were (IgG2a, ⁇ ).
  • NBG016-mAb14 and NBG016-mAb21 refer to these purified antibodies, and when described as hybridomas or cells, they refer to hybridomas that produce these antibodies. Similar to (2), (3), (4), and (6), anti-EP4 antibody-producing hybridoma cells having different subclasses were obtained. From the culture supernatant of this hybridoma, purified IgG having the subclass and light chain type (IgG1, ⁇ ) was obtained in the same manner as in (7). This purified antibody was designated NBG016-mAb9.
  • Lipase-In-CHO cells (Invitrogen) cultured in Ham's F-12 medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum, 100 units / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin
  • the pEF-FRT-hEP4 plasmid and the pOG44 plasmid were simultaneously introduced using Perfectamine 2000. From the day after gene transfer, the medium was changed to Ham's F-12 medium supplemented with 500 ⁇ g / mL antibiotic hygromycin (manufactured by Invitrogen), and cultured for 2 weeks while changing the medium every third day.
  • Hygromycin resistant cells were cloned from the formed colonies by the penicillin cap method.
  • phycoerythrin (PE) -labeled anti-mouse IgG antibody (Beckman Coulter, Inc.) is used as the secondary antibody, and the resulting hygromycin-resistant cells are bound to the anti-V5 tag antibody.
  • the obtained hygromycin-resistant Flp-In-CHO cells showed PE positive, confirming that human EP4 was stably expressed.
  • This cell is hereinafter referred to as a human EP4 stably expressing CHO cell line.
  • binding test between anti-human EP4 antibody and human EP4-expressing cell was performed by flow cytometry according to the method described in (6).
  • Human EP4 stably expressing CHO cell line or parent strain Flp-In-CHO cell was used at 5 ⁇ 10 5 , and 1 ⁇ g of NBG016-mAb14, NBG016-mAb21 or mouse isotype control antibody (manufactured by BioRegend) was used as the primary antibody.
  • a PE-labeled anti-mouse IgG antibody was used as the next antibody. The result is shown in FIG.
  • NBG016-mAb14 and NBG016-mAb21 bound only to the human EP4 stably expressing CHO cell line, indicating that these antibodies bind specifically to human EP4.
  • NBG016-mAb9 was subjected to a binding test with a human EP4 stably expressing CHO cell line. The results are shown in FIG. From this result, it was shown that NBG016-mAb9 also specifically binds to human EP4.
  • NBG016-mAb14 and NBG016-mAb21 are functional antibodies having antagonistic activity against human EP4, and have strong receptors equivalent to or higher than those of existing substances having antagonistic activity against human EP4 (for example, low molecular weight compounds). It was shown to have a function inhibitory activity. Similarly, FIG.
  • NBG016-mAb9 is also a functional antibody having antagonistic activity against human EP4.
  • Human EP1-4 mouse EP1-4 expression vector preparation Human EP1 (GenBank accession number NM_000955), human EP2 (GenBank accession number NM_000956) human EP3a1 (GenBank accession number X83857), mouse EP1 (GenBank accession number NM_013641) , And the mouse EP2 (GenBank accession number NM_008964), mouse EP3 (GenBank accession number NM_011196), mouse EP4 (GenBank accession number NM_008965) ORF sequence excluding the stop codon at the 5 'end of the CATCATGGGACACACACACTCCTGTCTGTGTGTGTGTCTGCG DNA fragment was amplified by PCR using KOD FX (Toyobo Co., Ltd.) according to a conventional method.
  • KOD FX Toyobo Co., Ltd.
  • the amplified DNA was incorporated into a pENTR / D-TOPO vector (manufactured by Invitrogen), and pENTR-hEP1, pENTR-hEP2, pENTR-hEP3, pENTR-mEP1, pENTR-mEP2, pENTR-mEP3, and pENTR-mEP4, respectively.
  • the base sequence of the insert was determined according to a conventional method, and it was confirmed that there was no error in the sequence. Using these seven types of plasmids and the pDONR-hEP4 plasmid prepared in (1), each insert was recombined into a pcDNA-DEST47 vector (Invitrogen) by the Gateway system.
  • pcDNA-DEST47-hEP1, pcDNA-DEST47-hEP2, pcDNA-DEST47-hEP3, pcDNA-DEST47-hEP4, pcDNA-DEST47-mEP1, pcDNA-DEST47-mEP2, pcDNA-DEST47-mEP3, pcDNA-DEST47-mEP4 Got. From these plasmids, fusion proteins in which Cycle 3 Green Fluorescent Protein (GFP) is added to the C-terminus of each PGE 2 receptor are expressed.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the binding test of the anti-EP4 antibody of the present invention and EP transiently expressed 293FT cells was performed by flow cytometry by the method described in (6). 5 ⁇ 10 5 transiently expressed 293FT cells for each of the 8 PGE 2 receptor subtypes were used, and 1 ⁇ g of anti-EP4 antibody NBG016-mAb14, NBG016-mAb21 or mouse isotype control antibody (BioRegend) was used as the primary antibody. PE-labeled anti-mouse IgG antibody was used as the secondary antibody. As an example, the result of NBG016-mAb14 is shown in FIG. Since there were fluorescence-positive cells derived from GFP, it was confirmed that each PGE 2 receptor was expressed on 293FT cells.
  • NBG016-mAb21 had similar results, it was found that the anti-EP4 antibody of the present invention has a strong specificity for human-type EP4. PGE 2 receptor subtype binding specificity was shown to be higher than existing substances with antagonist activity against human EP4. Similarly, the results of examining the binding specificity of NBG016-mAb9 are shown in FIG. Of the cells expressing 8 types of PGE 2 receptor subtypes, only the cells expressing human EP4 showed positive PE fluorescence. From this result, it was found that NBG016-mAb9 also has a strong specificity for human type EP4.
  • Binding test of human lymphocytes and anti-EP4 antibody Frozen human peripheral blood mononuclear cells (Cellular Technology Ltd.) were obtained from CTL-Anti-Aggregate-Wash Supplement (manufactured by Cellular Technology Ltd.). And thawed and prepared.
  • the binding test between human lymphocytes and the anti-EP4 antibody of the present invention was performed by flow cytometry according to the method described in (6).
  • NBG016-mAb14, NBG016-mAb21 or 1.5 ⁇ g of mouse isotype control antibody is used as the primary antibody to 9 ⁇ 10 5 human peripheral blood mononuclear cells prepared, and Alexa488-labeled anti-mouse IgG antibody is used as the secondary antibody. used.
  • the cell population When analyzing with a flow cytometer, the cell population is divided into a lymphocyte fraction and a mononuclear cell / macrophage fraction based on a dot plot of forward scattered light and side scattered light. Alexa 488 fluorescence intensity was examined.
  • the analysis result by flow cytometry is shown in FIG.
  • the results obtained with the mouse isotype control antibody are shown in gray, and the results obtained with the anti-EP4 antibody are shown as a solid black line.
  • Most of the human lymphocyte fractions were positive for Alexa 488 only when reacted with anti-EP4 antibody, indicating that human lymphocytes were bound to anti-EP4 antibody. From this result, it was revealed that the anti-EP4 antibody of the present invention has the ability to bind to human endogenous EP4.
  • NBG016-mAb9 was similarly tested for binding to human lymphocytes.
  • Human peripheral blood mononuclear cells were isolated from fresh human peripheral blood using Lymphoprep (manufactured by AXIS SHIELD) according to the instruction manual, and then CD14 negative using anti-human CD14 microbeads (manufactured by Miltenyi Biotec) The cell fraction was collected and used as a human lymphocyte fraction.
  • the subsequent binding confirmation experiment was performed as described above using a fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by Beckman Coulter) as the secondary antibody.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • FIG. 8 most of the human lymphocytes bound to NBG016-mAb9, and it was found that NBG016-mAb9 can also bind to human endogenous EP4.
  • the human monocytic THP1 cell line is an RPMI medium containing 100 nM PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate, manufactured by Sigma-Aldrich). Becton Dickinson) was seeded at 1.5 ⁇ 10 5 cells per well and cultured for 3 days to differentiate into macrophages. After removing the medium, the cells were washed 3 times with PBS, and the cells were fixed with 200 ⁇ L of 1% paraformaldehyde solution (still at 4 ° C. for 30 minutes).
  • PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate
  • the right image was stained with anti-EP4 antibody, and FITC fluorescence (white) was observed around the cell nucleus in granular form. From this result, it was found that the antibody of the present invention binds to native EP4 on the cell membrane surface of macrophage-like cells obtained by differentiating the THP1 cell line with PMA.
  • PGE 2 Inhibition of cytokine inhibitory effect by PGE 2 by anti-EP4 antibody PGE 2 is known to suppress cytokine production by LPS stimulation in macrophages via EP4 or EP2.
  • the THP1 cell line was seeded at 2.5 ⁇ 10 5 cells per well in a 48-well cell culture plate in RPMI medium containing 100 nM PMA.
  • the medium was changed to RPMI medium containing NBG016-mAb14, NBG016-mAb21, and mouse isotype control antibody 3.0 ⁇ g / mL, and incubated for 30 minutes.
  • PGE 2 was added to 20 nM and incubated for another 30 minutes.
  • LPS was added to 100 ng / mL, and then cultured for 18 hours. The culture supernatant was collected, and the amount of TNF ⁇ in the culture supernatant was measured using TNF ⁇ Human DuoSet Kit (manufactured by R & D Systems) according to the instruction manual.
  • Alamar Blue (MorphoSys) diluted 10-fold with RPMI medium was added to the cells after collecting the culture supernatant. After incubation for 4 hours, fluorescence was measured with a plate reader ARVO 1420 HTS under conditions of an excitation wavelength of 535 nm and a detection wavelength of 595 nm. Based on the measurement results with Alamar Blue, the relative ratio of viable cells between each well was determined, and the amount of TNF ⁇ produced per viable cell ratio was calculated. The extent to which the antibody of the present invention recovers the suppression of cytokine production by PGE 2 was calculated based on the following criteria.
  • TNF [alpha] amount recovery rate of 100% of the wells was added only LPS stimulation, as the recovery rate of 0% TNF [alpha] amount of wells plus LPS stimulation and PGE 2, when the addition of LPS stimulation and PGE 2 and the antibody The recovery rate was calculated.
  • the 3 ′ primers for amplification of the heavy chain variable region are 5′-AGGGGCCAGGTGATAGACCGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 33) and 5′-GGCTGTTTTTGGCTGCAGAGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 34).
  • the 3 ′ primers for light chain variable region amplification are 5′-ACTGGATGGTGGGAAGATGGATAC-3 ′ (SEQ ID NO: 35) and 5′-TGGATACAGTTGGTGCAGCCATCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 36).
  • the obtained amplified fragment was electrophoresed on an agarose gel, the band was cut out, and the gel was dissolved to purify the DNA.
  • the purified DNA was incorporated into T-Vector pMD20 (manufactured by Takara Bio Inc.), and the nucleotide sequence was analyzed to determine the amino acid sequence.
  • the sequencing reaction was carried out using ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits Version 3.1 (Applied Biosystems), and Applied Biosystems 3130xl Genetic Sequence System (Applied Biosystems 3130xl Genetic Array).
  • SEQ ID NO: 1 as a nucleic acid sequence encoding the heavy chain variable region of NBG016-mAb14
  • SEQ ID NO: 3 as a nucleic acid sequence encoding the light chain variable region.
  • SEQ ID NO: 2 was obtained as the amino acid sequence of the heavy chain variable region
  • SEQ ID NO: 4 was obtained as the amino acid sequence of the light chain variable region.
  • nucleic acid sequence encoding the heavy chain variable region of NBG016-mAb21 was SEQ ID NO: 11, and the nucleic acid sequence encoding the light chain variable region was SEQ ID NO: 13.
  • SEQ ID NO: 12 was obtained as the amino acid sequence of the heavy chain variable region
  • SEQ ID NO: 14 was obtained as the amino acid sequence of the light chain variable region.
  • the heavy chain CDRs 1 to 3 of NBG016-mAb14 were SEQ ID NOs: 5 to 7, respectively.
  • the light chain CDRs 1 to 3 were SEQ ID NOs: 8 to 10, respectively.
  • the heavy chain CDRs 1 to 3 of NBG016-mAb21 were SEQ ID NOs: 15 to 17, respectively.
  • the light chain CDRs 1 to 3 were SEQ ID NOs: 18 to 20, respectively. Both clones were in perfect agreement for heavy chain CDRs.
  • the heavy chain variable region was amplified using the primers of SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34, and the light chain variable region was amplified using the primers of SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36. It was determined.
  • the nucleic acid sequence encoding the heavy chain variable region of NBG016-mAb9 was SEQ ID NO: 41, and the nucleic acid sequence encoding the light chain variable region was SEQ ID NO: 42. Further, SEQ ID NO: 43 was obtained as the amino acid sequence of the heavy chain variable region, and SEQ ID NO: 44 was obtained as the amino acid sequence of the light chain variable region.
  • the heavy chain CDRs 1 to 3 of NBG016-mAb9 were SEQ ID NOs: 45 to 47, respectively.
  • the light chain CDRs 1 to 3 were SEQ ID NOs: 48 to 50, respectively.
  • the 5 ′ primer for heavy chain gene amplification is 5′-CACTGACCCTACCGCGTATGGAATGGAGATGATCTTTCCTCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 37), and the 3 ′ primer is 5′-ATAAGAAATCGGCCCCTCATTTTACCAGGAGAGTGGGAGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 38).
  • the 5 ′ primers for light chain variable region amplification are 5′-TTGCAGCCAGGAACCGCGTATGGACATGAGGACCCCTGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 39) and 5′-ATAGAATGCGGCCGCCTTAACACTCATTCCTGTTTGAAGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 40).
  • the amplified heavy chain and light chain amplified fragments were cleaved with restriction enzymes MluI and NotI, the heavy chain was pEHX1.1 (Toyobo), and the light chain was pELX2.1 (Toyobo) MluI and NotI sites.
  • the amino acid sequence was determined by analyzing the nucleotide sequence. As a result of analyzing the nucleotide sequence, it was found that the nucleic acid sequence encoding NBG016-mAb14 heavy chain was SEQ ID NO: 22, and the nucleic acid sequence encoding light chain was SEQ ID NO: 24. Further, SEQ ID NO: 23 was obtained as the heavy chain amino acid sequence, and SEQ ID NO: 25 was obtained as the light chain amino acid sequence.
  • the nucleic acid sequence encoding the heavy chain of NBG016-mAb21 was SEQ ID NO: 26, and the nucleic acid sequence encoding the light chain was SEQ ID NO: 28. Further, SEQ ID NO: 27 was obtained as the heavy chain amino acid sequence, and SEQ ID NO: 29 was obtained as the light chain amino acid sequence.
  • the amino acid sequences of the heavy chain and light chain variable regions were identical to the amino acid sequences analyzed by the 5′-RACE method.
  • NBG016-mAb9 cDNA was synthesized according to the above-described method, and the full length of the heavy chain and light chain genes of NBG016-mAb9 was PCR amplified using it as a template.
  • the 5 ′ primer for heavy chain gene amplification is 5′-CACTAGAGCCCCCATACCGCGTATGGCTGTCCTGGTGCTGTTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 51), and the 3 ′ primer is 5′-ATAAGAAATCGGCCCCTCTATTTACCCCGGAGATGGGAGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 52).
  • the 5 ′ primers for light chain gene amplification are 5′-TCCTCAGGTTGCCTCACGCGTATGAGAGTGTCCTGTTAG-3 ′ (SEQ ID NO: 53) and 5′-ATAAGAATGCGCCGCTTAACACTCATTCCTGTTTGAAGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 40).
  • the amplified heavy chain and light chain amplified fragments were cleaved with restriction enzymes MluI and NotI, the heavy chain was pEHX1.1 (Toyobo), and the light chain was pELX2.1 (Toyobo) MluI and NotI sites.
  • the amino acid sequence was determined by analyzing the nucleotide sequence.
  • the nucleic acid sequence encoding the heavy chain of NBG016-mAb9 was SEQ ID NO: 54
  • the nucleic acid sequence encoding the light chain was SEQ ID NO: 55.
  • SEQ ID NO: 56 was obtained as the heavy chain amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 57 was obtained as the light chain amino acid sequence.
  • This plasmid was transduced into 293FT cells using Lipofectamine 2000 for transient antibody expression.
  • a cell culture supernatant 72 hours after the transduction was collected, and a binding test with a human EP4 stably expressing CHO cell line was performed by flow cytometry by the method described in (6).
  • As a control a culture supernatant of 293FT cells into which no antibody gene was introduced was used.
  • the recombinant antibodies NBG016-mAb14 and NBG016-mAb21 secreted into the culture supernatant retained binding to human EP4. From this, it was confirmed that the antibody gene sequence obtained in (17) encodes an anti-EP4 antibody.
  • a recombinant antibody of NBG016-mAb9 was also produced in the same manner as described above.
  • PELX2.1 into which the light chain gene was inserted was cleaved with restriction enzymes SalI and SpeI and electrophoresed on an agarose gel to purify the fragment containing the light chain gene.
  • the purified light chain gene fragment was incorporated into the SalI-SpeI site of pEHX1.1 into which the heavy chain gene was inserted, and a plasmid carrying both the light chain and heavy chain genes was prepared. This plasmid was transduced into 293FT cells for transient antibody expression.
  • a culture supernatant of 293FT cells into which no antibody gene was introduced was used as a control.
  • the results are shown in FIG. A histogram in which the parent strain Flp-In-CHO cells are grayed out and the human EP4 stably expressing CHO cell line is indicated by a solid black line. Since the recombinant antibody NBG016-mAb9 secreted into the culture supernatant retained binding to human EP4, the antibody gene sequence of NBG016-mAb9 obtained in (17) encodes an anti-EP4 antibody. It was confirmed that
  • CHO-K1 cells were seeded on a 24-well plate and cultured in Ham's F12 medium containing 10 ⁇ g / mL puromycin for 3 days. Three days later, the medium was replaced with Ham's F12 medium (without fetal bovine serum added) containing 10 ⁇ g / mL puromycin, and the culture supernatant after 72 hours of culture was recovered. Mouse IgG in the culture supernatant was detected by ELISA. A dilution series of the culture supernatant was prepared using PBS, dispensed into Maxisorp 96-well plate (manufactured by Nunc), and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
  • Recombinant antibody NBG016-mAb14 and recombinant antibody NBG016-mAb21 were obtained from the cell line culture supernatant established in the binding test (19) of recombinant anti-EP4 antibody and human EP4 stably expressing CHO cell line in the same manner as (7). Purified. The binding test of the obtained purified recombinant anti-EP4 antibody and human EP4 stably expressing CHO cell line was performed by flow cytometry by the method described in (6). Purified recombinant anti-EP4 antibody or mouse isotype control antibody was used at 1 ⁇ g per 5 ⁇ 10 5 cells. A PE-labeled anti-mouse IgG antibody was used as the secondary antibody. FIG. 11 shows the result.
  • a histogram in which the parent strain Flp-In-CHO cells are grayed out and the human EP4 stably expressing CHO cell line is indicated by a solid black line. Both recombinant antibody NBG016-mAb14 and recombinant antibody NBG016-mAb21 bind only to the human EP4 stable expression CHO cell line, confirming that the purified recombinant anti-EP4 antibody retains the binding to human EP4. It was.
  • mice IgG1-type antibody NBG016-mAb21 expression vector NBG016-mAb21 purified in (7) had an IgG2a subclass. Therefore, the subclass of NBG016-mAb21 was modified to IgG1, and a mouse IgG1-type antibody NBG016-mAb21 was produced.
  • the mouse IgG1-type antibody NBG016-mAb21 gene was prepared by Overwrapping PCR as follows.
  • NBG016-mAb21 heavy chain gene Using NBG016-mAb21 heavy chain gene as a template, 5′-CACTGACCCTACCGCGTATGGAATGAGATGGATCTTTCCTCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 37) and 5′-GACAGATGGGGGTGTGTCGTTTTAGCGCTAGAGACAGTGGAGAN sequence was used. .
  • 5′-GGGAACTCTGGTCACTGTCTCTAGCGCTAAAAACGAACCCCCCCATCGTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 59) and 5′-ATAGAATAGCCGGCCCCTCATTTACCAGGAGGTGGG (AGGATGTGGG) using the cDNA synthesized from the total RNA of the hybridoma producing mouse IgG1 as a template PCR amplification was performed from CH1 of IgG1 to the constant region gene.
  • the heavy chain variable region gene obtained by amplification and the CH1-constant region gene fragment were mixed and PCR-amplified using the primers of SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38.
  • the amplified DNA fragment was cleaved with restriction enzymes MluI and NotI and inserted into the MluI-NotI site of the expression vector pEHX1.1.
  • the obtained expression vector was cleaved with restriction enzymes EcoRI and BglII, and a light chain gene fragment of NBG016-mAb21 (EcoRI-BglII fragment) was inserted to obtain a mouse IgG1-type antibody NBG016-mAb21 expression vector.
  • the cells were suspended in 8 ml of EX-CELL CD CHO medium containing 8 mM glutamine, and 4 ml was dispensed into 2 wells of a 6-well plate. 3 ⁇ l of 10 mg / ml puromycin was added to one well and 4 ⁇ l was added to the other well, and cultured for 18 days while changing the medium every 3 or 4 days.
  • Cells in the expanded wells were collected and conditioned medium (700 ml of EX-CELL CD CHO medium per 1 liter, 300 ml of floating CHO-KI cell culture supernatant, 10 mg / ml puromycin 1 ml or 0.75 ml so as to be 5 cells / ml. In a mixed medium), and 200 ⁇ l was dispensed into 96-well plates. One week later, 100 ⁇ l of Conditioned medium was added and further cultured for one week. After subculture for several times, 500 ⁇ l of drug resistant cells (4 ⁇ 10 4 cells / ml) were placed in a 24-well plate and cultured for 5 days.
  • conditioned medium 700 ml of EX-CELL CD CHO medium per 1 liter, 300 ml of floating CHO-KI cell culture supernatant, 10 mg / ml puromycin 1 ml or 0.75 ml so as to be 5 cells / ml.
  • 200 ⁇ l was dispensed
  • mouse IgG1-type antibody NBG016-mAb21 stably expressing CHO cell line Five days later, antibody producing cells were screened by quantifying the amount of antibody in the supernatant using Mouse IgG EIA Kit (manufactured by Takara Bio Inc.). The cells were designated as mouse IgG1-type antibody NBG016-mAb21 stably expressing CHO cell line.
  • mice IgG1-type antibody NBG016-mAb21 (23) Purification of mouse IgG1-type antibody NBG016-mAb21
  • Mouse IgG1-type antibody NBG016-mAb21 stably expressing CHO cell line was cultured in EX-CELL CD CHO medium containing 8 mM glutamine and 7.5 ⁇ g / ml puromycin for 10 days. Antibody was produced. Purified IgG was obtained from 200 mL of this culture supernatant in the same manner as (7). Hereinafter, the obtained purified IgG was referred to as mouse IgG1-type antibody NBG016-mAb21.
  • NBG016-mAb14 and 21 Production of human chimeric antibody NBG016-mAb14 and 21 A human chimeric antibody in which the CH1 region of NBG016-mAb14 and 21 was replaced with a human antibody gene was produced using Mammalian Power Express System (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). NBG016-mAb14 and 21 heavy chain variable region genes were PCR amplified using 5′-CACTGACCCTAAGCTTATGGAATGAGATGGGATCTTTCTCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 60) and 5′-GGCTGTTGTGCTAGCTGCAGAGACAGTGGACAGAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 61).
  • the obtained heavy chain gene fragment was cleaved with restriction enzymes HindIII and NheI and inserted into the HindIII-NheI site of the expression vector pEH ⁇ X1.1.
  • the light chain variable region genes of NBG016-mAb14 and 21 were amplified using 5′-ATTGCAGCCAGGAGAATTCATGACATGGAGACCCCTGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 62) and 5′-GGTGCAGCCATCCGTACCTTTTATTTCCAACTTTGTCCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 63).
  • the obtained light chain gene fragment was cleaved with restriction enzymes BsiWI and EcoRI, and inserted into the BsiWI-EcoRI site of the expression vector pEL ⁇ X2.1.
  • PEL ⁇ 2.1 into which the light chain gene was inserted was cleaved with restriction enzymes BglII, NotI and ScaI, and electrophoresed on an agarose gel to purify a fragment containing the light chain gene.
  • the purified light chain gene fragment was incorporated into the BglII-NotI site of pEH ⁇ X1.1 into which the heavy chain gene was inserted to prepare a plasmid carrying both the light chain and heavy chain genes. This plasmid was transduced into 293FT cells using Lipofectamine 2000 for transient antibody expression.
  • As a control 293FT cell culture supernatant into which no antibody gene had been introduced was used, and as a secondary antibody, a PE-labeled anti-human IgG antibody (manufactured by Abcam) was used.
  • the results are shown in FIG. A histogram in which the parent strain Flp-In-CHO cells are grayed out and the human EP4 stably expressing CHO cell line is indicated by a solid black line.
  • the antibody provided by the present invention specifically suppresses the function of human PGE 2 receptor subtype EP4, it provides a method for preventing or treating a disease related to EP4, and a preventive or therapeutic agent for the disease. Expected to play an important role in development.

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Abstract

　本発明は、ヒトＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４に結合し、ＥＰ４の機能を阻害する抗体又はその機能的断片の提供を目的とする。さらに、該抗体又はその機能的断片を含む医薬の提供を目的とする。ヒトＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４をマウスに免疫し、ＥＰ４による細胞内ｃＡＭＰ上昇を抑制するモノクローナル抗体をスクリーニングした。また、取得したモノクローナル抗体のＣＤＲの配列決定を行った。

Description

ヒトプロスタグランジンＥ２受容体ＥＰ４に対する抗体
　本発明は、ヒトプロスタグランジンＥ２受容体サブタイプＥＰ４に対するモノクローナル抗体に関する。
　プロスタグランジン（ＰＧ）は、トロンボキサンと共にプロスタノイドと称される生理活性物質で、プロスタン酸骨格を持つ脂質である。プロスタグランジンなどのプロスタノイドは、ホスホリパーゼＡ２により膜リン脂質から遊離されるアラキドン酸から生合成される。プロスタグランジンは、その５員環に付く酸素原子と二重結合の相違により、Ａ～Ｊの各群に区別される。また、プロスタン酸骨格側鎖の二重結合の数によって、１～３群に区別される。例えば、プロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）には、プロスタン酸骨格側鎖に存在する二重結合の数が相違する、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＰＧＥ３の各群が存在する。
　ＰＧは、アラキドン酸からシクロオキシゲナーゼＩ（ＣＯＸ-Ｉ）あるいはシクロオキシゲナーゼＩＩ（ＣＯＸ-ＩＩ）により生合成されるＰＧＧ２からＰＧＨ２が生じ、その後、酸素原子間の結合の切断の相違により、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２αなどが生じる。さらに、ＰＧＥ２からは、ＰＧＡ２、ＰＧＣ２などが生産されていく。各ＰＧの生成反応は、特異的な酵素の作用によって生じており、これらの酵素には組織特異性が存在し、各組織の機能に応じたＰＧを産生しているものと考えられている。
　ＰＧの中でもＰＧＥは、様々な重要な生物活性を担っているとされており、その特異的受容体を介して血管拡張、血圧降下、子宮収縮の他、免疫系の調節などに関与していると考えられている。ＰＧＥ２の受容体は、他のＰＧ受容体と同様に、７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体である。ＰＧＥ２受容体は、ＥＰと略称され、４種類のサブタイプ（ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４）の存在が明らかにされている。各サブタイプは生体内において、ＥＰ１が細胞内Ｃａ２＋の上昇、ＥＰ２及びＥＰ４がｃＡＭＰの上昇、ＥＰ３がｃＡＭＰの減少に関与している（非特許文献１）。４種類のサブタイプは、タンパク質構造上高い相同性を有している。
　ＥＰ４に選択性の高い低分子化合物アンタゴニストを、実験的自己免疫性脳脊髄炎あるいは接触過敏症を誘導したマウスに投与すると、所属リンパ節内のＴＨ１及びＴＨ１７細胞の両方の蓄積が減少し、疾患の進行が抑制されることが報告された（非特許文献２）。樹状細胞においては、ＰＧＥ２はＥＰ４の活性化を介したｃＡＭＰの上昇によりＩＬ－２３の産生を亢進させることが示されている。また、ＴＨ１７細胞においては、ＰＧＥ２はＩＬ－２３と協調してＴＨ１７細胞の増殖にかかわることが示されている。ＴＨ１７細胞においても、ＥＰ４の活性化を介したｃＡＭＰ上昇が細胞内情報伝達に重要な役割を果たしていることが示されている（非特許文献３）。このような報告から、ＰＧＥ２受容体、特にＥＰ４選択的アンタゴニストが、ＴＨ１あるいはＴＨ１７が関与する免疫異常に起因する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患及び接触性皮膚炎などの治療に効果的であることが示唆されている（非特許文献２）。
　多くの癌細胞が正常細胞と比較してＣＯＸ－ＩＩを過剰発現していることが報告されている。さらにＰＧＥ２が癌組織あるいは周辺組織に対して作用し、癌の進行に関与することが示されている。例えば、ＰＧＥ２は難治性の炎症性乳癌細胞あるいは肺癌細胞の転移組織への浸潤に関わることが示されている（非特許文献４、５）。またＰＧＥ２はＥＰ４を介して非小細胞肺癌細胞、大腸癌細胞、炎症性乳癌細胞、Ｂリンパ球、前立腺癌細胞、黒色腫の増殖に関与することが知られている。
　ＮＫ細胞は、直接癌細胞を攻撃する作用を有するが、ＰＧＥ２はその作用を阻害することが知られている。ＰＧＥ２のＮＫ細胞活性阻害の機構としては、ＥＰ４の活性化を介した細胞内のｃＡＭＰ上昇が示されている（非特許文献６）。さらに、癌免疫を抑制すると考えられているＴｒｅｇ細胞がＥＰ４を介して活性化することが知られており、癌細胞に対する生体内の免疫機構を低下させる可能性が示されている（非特許文献７）。このような報告から、ＰＧＥ２が癌の進展に重要であることが明らかである。そこでＰＧＥ２の産生にかかわるＣＯＸの、非選択的阻害剤による臨床研究が試みられているが、副作用により充分な治療成績をあげることができていない。ＰＧＥ２受容体、特にＥＰ４選択的アンタゴニストが直接的に癌細胞の増殖を抑制し、かつ自己の癌免疫機構を賦活化させることができることから、ＥＰ４受容体に選択的に結合する抗体は、様々な癌、例えば、乳癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、皮膚癌、Ｂリンパ腫の治療に効果的であることが期待される。
　従来より、非特異的なＣＯＸ阻害剤は疼痛の軽減に応用されている。しかしながら非特異的阻害剤については胸やけ、消化不良、吐き気、腹部膨満、下痢、胃痛、消化性潰瘍、消化管出血といった副作用を発生することが知られている。近年、ＣＯＸ―ＩＩ選択的阻害剤（例えばセレコキシブ、ロフェコキシブ）が疼痛治療を目的として開発された。しかしＣＯＸ―ＩＩ選択的阻害剤は特定の患者において重篤な心血管系障害を発症させる可能性が示唆されており、異なる作用機序で疼痛を軽減する薬剤が望まれている。ＣＯＸにより産生されるＰＧのうち、ＰＧＥ２は痛覚の過敏性を増強させることが知られている。特に、ＰＧＥ２受容体の中でＥＰ４が痛覚の過敏性の増強に関わることが複数の動物試験で証明されている。例えばラット脊髄後根神経節（ＤＲＧ）では、炎症性疼痛モデルにおいてＥＰ４の発現が増強し、ＥＰ４の比較的選択的アンタゴニスト（ＡＨ２３８４８）が同モデルでの疼痛の感受性を軽減することが知られている（非特許文献８）。また、ＥＰ４のノックアウトマウスを用いた解析でも同様の結果が得られている（非特許文献９）。このような報告から、ＥＰ４の機能を選択的に遮断する医薬品は免疫異常を伴う疾患、癌、疼痛治療に有効で、かつ副作用が少ないものとなりうることが示唆される。
　ＥＰ４の機能を選択的に遮断する方法としては、低分子化合物によるアンタゴニストが複数報告されているが、医薬品として開発に成功しているものはない。低分子化合物のアンタゴニストは、ＰＧＥ２受容体サブタイプ（ＥＰ１～４）に対する結合選択性やトロンボキサンあるいはその他のプロスタノイド受容体への結合親和性の軽減といった改良の余地がある。充分な受容体選択性がなければＣＯＸ阻害剤同様の副作用が発生する懸念がある。
　ＥＰ４受容体に選択的に結合する抗体は、低分子化合物と比較して受容体選択性が高いことが期待される。さらに抗体医薬は、低分子化合物と比べて一般的に血中半減期が長いため、一回の投与で長期に薬効を保持することが期待され、慢性疾患（例えば関節リウマチ、大腸炎、癌など）においては有用である。
　膜タンパク質（受容体）に対する抗体医薬の主要な作用機序は、当該タンパク質を発現する細胞を抗体が認識した後、補体依存性細胞溶解作用（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）に基づき除去するものが一般的であった。しかしながら、ＣＤＣやＡＤＣＣはマクロファージ等の炎症細胞の活性化を伴い、免疫異常に起因する疾患や疼痛治療には必ずしも適切とはいえない。したがって、ＥＰ４を選択的に阻害しうるモノクローナル抗体を免疫異常に起因する疾患や疼痛治療に応用する場合には、ＣＤＣやＡＤＣＣによらない機能性抗体が望ましい。すなわち、ＥＰ４依存的細胞内情報伝達を選択的に遮断する抗体が望ましい。
　これまで特許第３１１８４６０号（特許文献１）においてＥＰ４に対する抗体の取得法に関する記載があるが、低用量でＥＰ４特異的にその機能を抑制しかつ、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３には結合しない具体的な抗体の報告はいまだにない。また、特許第３１１８４６０号に記載されている一般的なモノクローナル抗体の取得法では、７回膜貫通型受容体に対する機能性抗体を取得することは一般的に困難であることが知られている。
特許第３１１８４６０号
Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２，１１６１３－１１６１７　２００７ Ｙａｏら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１５，６３３－６４０　２００９ Ｓａｋａｔａら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ .,１１２（１）:１?５. ２０１０ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＦＭ　Ｃａｎｃｅｒ. ２０１０ Ｊｕｎ １;１１６（１１ Ｓｕｐｐｌ）:２８０６－１４. Ｍａｒｔｉｎｅｔ Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. ２０１０ Ｓｅｐ １５;８０（６）:８３８－４５. Ｓｈａｒｍａ ＳＤ,　 Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ. ２０１０ Ｍａｒ;９（３）:５６９－８０. Ｓｈａｒｍａ Ｓら　Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ２００５ Ｊｕｎ １５;６５（１２）:５２１１－２０ Ｌｉｎ Ｃ.-Ｒ.ら Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　２００６ ３１９:３ （１０９６－１１０３） Ｐｏｐｐ Ｌ.らＥｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｉｎ．２００９　１３:７ （６９１－７０３）
　本発明は、免疫異常に起因する疾患、腫瘍、疼痛の治療薬として有用なヒトＰＧＥ２受容体のＥＰ４サブタイプに対する抗体と当該抗ヒトＥＰ４抗体を含む医薬組成物等の提供を目的とする。
　本発明者らは、ヒトＰＧＥ２受容体のＥＰ４サブタイプに対するモノクローナル抗体の作製を試みたところ、ＥＰ４サブタイプの細胞外ドメインに特異的に結合し、かつＥＰ４の機能（例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させる機能）を抑制する抗体の取得に成功し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（２１）である。
（１）ＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４の機能を阻害する抗体又はその機能的断片。
（２）前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする上記（１）に記載の抗体又はその機能的断片。
（３）上記抗体が国際寄託受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４０２、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４０３のハイブリドーマから産生されることを特徴とする上記（２）に記載の抗体又はその機能的断片。
（４）上記ＥＰ４の機能が、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることである、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（５）ＥＰ４の細胞外ドメインに特異的に結合し、その相補性決定領域１～３（ＣＤＲ１～３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（Ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
（Ｃ）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
（６）ＥＰ４の細胞外ドメインに特異的に結合し、その重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列について、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
（ｃ）配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
（７）ＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４の機能を阻害する抗体又はその機能的断片であって、上記（３）乃至（６）のいずれかに記載の抗体と同一のエピトープに結合する、抗体又はその機能的断片。
（８）ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする上記（１）乃至（７）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（９）ヒト抗体であることを特徴とする上記（１）乃至（７）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（１０）抗体断片、一本鎖抗体、又はダイアボディであることを特徴とする上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（１１）配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号４１、配列番号４２であらわされる上記（５）又は（６）に記載の抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸。
（１２）上記（１１）に記載の核酸を含むベクター。
（１３）上記（１２）に記載のベクターが導入された細胞。
（１４）上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を含む医薬組成物。
（１５）ＥＰ４の機能異常によって発症及び／又は進展する疾患の予防または治療に用いられる（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）治療対象疾患が、免疫疾患であることを特徴とする上記（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）治療対象疾患が、腫瘍であることを特徴とする上記（１５）に記載の医薬組成物。
（１８）治療対象疾患が、疼痛であることを特徴とする上記（１５）に記載の医薬組成物。
（１９）上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の抗ＥＰ４抗体又はその機能的断片が担体に固定化されてなる抗体固定化担体。
（２０）ＥＰ４発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＥＰ４発現細胞を除去するために用いられることを特徴とする上記（１９）に記載の抗体固定化担体。
（２１）上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の抗ＥＰ４抗体を含む細胞表面上のＥＰ４発現量を測定するキット。
　本発明により、ＥＰ４特異的にその機能を抑制する抗体が初めて提供される。
　本発明により、ＥＰ４に関連する本発明の医薬はＥＰ４に関連する免疫疾患、腫瘍および疼痛の治療又は予防が可能となる。特に、低分子化合物に比べ、ＥＰ４サブタイプに対して結合選択性の高い本発明の抗体を使用することで、副作用などの少ない治療効果を提供することができる。
　本発明の抗体固定化担体により、癌、自己免疫疾患などを罹患している患者の血液から、ＥＰ４発現細胞を選択的に除去することが出来る。
　本発明のＥＰ４発現量を測定キットにより、癌、自己免疫疾患などを罹患している患者の血液からＥＰ４発現細胞を検出し、疾病の状態を評価することができる。
図１は、親株 Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞並びにヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株に対する、マウスアイソタイプコントロール抗体並びにＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４，　ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。 図２は、親株 Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞並びにヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株に対する、マウスアイソタイプコントロール抗体並びにＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。 図３は、ＰＧＥ２誘発のｃＡＭＰ上昇に対するマウスアイソタイプコントロール抗体並びにＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４，　ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１による抑制効果を解析した結果である。 図４は、ＰＧＥ２誘発のｃＡＭＰ上昇に対するマウスアイソタイプコントロール抗体並びにＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９による抑制効果を解析した結果である。 図５は、ヒトＥＰ１～４、マウスＥＰ１～４遺伝子導入２９３ＦＴ細胞に対するＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。 図６は、ヒトＥＰ１～４、マウスＥＰ１～４遺伝子導入２９３ＦＴ細胞に対するＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。 図７は、ヒト末梢血液のリンパ球分画に対するマウスアイソタイプコントロール抗体並びにＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４，ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である． 図８は、ヒト末梢血液のリンパ球分画に対するマウスアイソタイプコントロール抗体並びにＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。 図９は、ヒト単球系ＴＨＰ１細胞株をＰＭＡで処理後、抗ＥＰ４抗体で免疫染色した結果である。 図１０は、親株 Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞並びにヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株に対する、抗体遺伝子未導入細胞の培養上清並びにリコンビナント抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９遺伝子発現細胞の培養上清の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。 図１１は、親株 Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞並びにヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株に対する、マウスアイソタイプコントロール抗体並びにリコンビナント抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、リコンビナント抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。 図１２（Ａ）は、親株 Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞並びにヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株に対する、マウスアイソタイプコントロール抗体並びにマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。また図１２（Ｂ）は、ＰＧＥ２誘発のｃＡＭＰ上昇に対するマウスアイソタイプコントロール抗体並びにマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１による抑制効果を解析した結果である。 図１３は、親株 Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞並びにヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株に対する、抗体遺伝子未導入細胞の培養上清並びにヒトキメラ型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４遺伝子発現細胞の培養上清、ヒトキメラ型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１遺伝子発現細胞の培養上清の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。
　本発明は、ヒトＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４の機能を抑制する抗体又はその機能的断片、及び、これらの抗体又はその機能的断片を含む医薬である。
ＥＰ４タンパク質の定義
　本発明の抗原となるＥＰ４タンパク質としては、ＥＰ４タンパク質をコードするｃＤＮＡなどから調製された組換えタンパク質などを使用することができる。あるいは、ＥＰ４を細胞表面に発現する適当な細胞などを抗原として使用してもよい。ヒトＥＰ４タンパク質をコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開されたデータベースなどから検索できる（例えば、アクセッション番号：ＮＭ＿０００９５８）。この遺伝子配列などに基づいて作製したプローブ又はＰＣＲ増幅用のプライマーペアなどを使用して、適当なＤＮＡライブラリーからＥＰ４をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡなど）を調製することができる。あるいは人工ＤＮＡ合成法で、全ｃＤＮＡを調整することができる。その一例として、配列番号２１にヒトＥＰ４に対応するアミノ酸配列を示す。ヒトＥＰ４には、配列番号２１に示すもの以外にアミノ酸置換体等の各種のバリアントが知られている。本発明における「ヒトＥＰ４」には、ＥＰ４としての機能を有する限り、前記バリアントが含まれる。
　ヒトＥＰ４の細胞内および細胞外ドメインは、配列番号２１に示すアミノ酸配列における以下の部分に相当すると考えられている。左側がアミノ酸番号、右側が各ドメインである。なお各ドメイン間の境界については、多少の前後（１～５アミノ酸残基、好ましくは、１～３アミノ酸残基、より好ましくは１～２アミノ酸残基）が生じ得る。
　１～　１９：Ｎ末端ドメイン
　４４～５４：細胞内第１ループドメイン
　８０～９６：細胞外第１ループドメイン
　１１６～１３５：細胞内第２ループドメイン
　１６１～１８４：細胞外第２ループドメイン
　２１２～２６７：細胞内第３ループドメイン
　２９６～３１２：細胞外第３ループドメイン
　３３３～４８８：Ｃ末端ドメイン
抗体又は機能性抗体の定義
　本発明のＥＰ４の機能を抑制する抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが含まれ、該抗体の機能的断片には、Ｆａｂ又はＦ(ａｂ’)２などの抗体断片、又は、単一鎖抗体などが含まれ、抗体の一部をなすポリペプチド（あるいは、ポリペプチド複合体）、であってＥＰ４の機能を抑制するものであれば、如何なるものも本発明の範囲に含まれる。
ＥＰ４に対する特異的機能性抗体の定義と評価方法
　ＥＰ４の機能としては、例えば、細胞内におけるｃＡＭＰの上昇、　Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３－ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）の活性化などの機能を挙げることができる。これらの細胞内の変化が癌細胞の増殖、Ｔリンパ球の細胞増殖、サイトカイン産生を制御することが知られている。本発明の抗体がヒトＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の細胞外ドメインに特異的に結合することは次のように示すことができる。ヒトＥＰ４タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入し、ベクターを適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入する。非破壊状態のアミノ酸の挿入、欠失、置換等を有しないＥＰ４発現宿主細胞又はＥＰ４非発現宿主細胞と、本発明の抗体とを接触させ一定時間反応させる。過剰な抗体を洗浄後、細胞をＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法あるいはフローサイトメトリー法で細胞に結合している抗体量を測定する。非発現宿主細胞と比較してＥＰ４発現宿主細胞に本発明の抗体がより多く結合することでＥＰ４の細胞外ドメインへの結合を示すことができる。さらに、ヒト又はマウス由来ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３もしくはＥＰ４タンパク質をコードする核酸配列を挿入した発現ベクターを構築し、上述と同様に受容体発現宿主細胞を解析する。本発明の抗体はヒトＥＰ４発現宿主細胞への結合がその他の受容体細胞発現細胞と比較して多い、好ましくは、ヒトＥＰ４以外の受容体発現細胞への結合が認められないことを示すことができる。
　本発明の抗体が、ＥＰ４の機能を阻害する抗体であることは次のように示すことができる。ヒトＥＰ４タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入する。ヒトＥＰ４発現宿主細胞と抗体を０．０１～３０μｇ／ｍＬで接触させたのちＰＧＥ２を１０-１２～１０-６Ｍの濃度でさらに接触させる。その後、細胞内のｃＡＭＰの上昇を適切な方法で測定する。本発明の抗体を添加した場合は、用量依存的にＰＧＥ２により誘発されたｃＡＭＰの上昇を抑制することができる。
　また、ヒトＥＰ４を天然に発現している細胞株（例えばヒトマクロファージ細胞）に抗体を０．０１～１０μｇ/ｍＬで接触させたのちＰＧＥ２を１０-１２～１０-６Ｍの濃度でさらに接触させる。その後炎症刺激（例えばリポポリサッカライド（ＬＰＳ））時のサイトカインやケモカイン産生を調べる。ＰＧＥ２は、ＬＰＳ刺激によるサイトカイン産生をＥＰ４あるいはＥＰ２を介して抑制することが知られている。本発明の抗体は、ＥＰ４を介したＰＧＥ２によるサイトカイン産生抑制を回復することを指標にＥＰ４の機能阻害を評価することができる。同様に、ヒト末梢血樹状細胞からのＰＧＥ２によるＩＬ－２３産生増強作用の阻害効果を指標に本抗体のＥＰ４機能阻害を評価することができる。
　さらに、ヒト膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、肺癌、口腔癌、前立腺癌、また多発性骨髄腫に由来する癌細胞株（例えば、ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞、ＨＣＡ－７細胞あるいはＨＴ－２９細胞など）をＰＧＥ２と接触させることで細胞の増殖性が高まる。これらの細胞に本発明の抗体をあらかじめ接触させたのち、ＰＧＥ２による細胞の増殖性の増加が低減することを指標に機能阻害を評価することができる。
　本発明の抗体は、ヒトＥＰ４のみに結合し、マウスＥＰ４には反応しない。したがって動物試験による免疫異常や疼痛に関する薬効の評価は困難である。一方、抗腫瘍効果については、上記のヒト癌組織から樹立されたＥＰ４を高発現している細胞を、免疫不全マウスに一匹あたり１０6～１０7個の細胞数で接種する。接種直後より本発明の抗体０．１～０．５ｍｇ／匹をマウスに腹腔内あるいは皮下投与する。アイソタイプコントロール抗体投与群と比較して本発明の抗体投与群が有意に腫瘍形成、転移頻度を軽減することで抗腫瘍効果を示すことができる。
本発明の抗体の詳細な定義
　本発明の抗体及びその機能的断片の例として、例えば、国際寄託における受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４０２（ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４）、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４０３（ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１）のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の他、後述の実施例に示される方法で調製されるモノクローナル抗体が挙げられる。
　さらに、本発明の抗体及びその機能的断片として、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、及びこれらの抗体の機能的断片、並びに、これらの抗体を構成する重鎖及び／又は軽鎖の各アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は軽鎖からなる抗体、及びこれらの抗体の機能的断片であって、ＥＰ４の機能を抑制するものを挙げることができる。
本発明の抗体と同一のエプトープの定義
　さらに本発明の抗体及びその機能的断片としては、実施例において単離されたいずれかのモノクローナル抗体とエピトープが重複する（または同一の）抗体が特に好ましい。このような抗体を、本発明においては実質的に同じ部位に結合する抗体と呼ぶ。２つの抗体が抗原蛋白質と実質的に同じ部位に結合するかどうかは、例えば競合実験により決定することができる。具体的には、実施例の抗ＥＰ４抗体とＥＰ４との結合が、第二の抗ＥＰ４抗体によって競合阻害を受けるとき、第一の抗体と第二の抗体は実質的に同じ抗原部位に結合していると判断される。このように、実施例で単離した抗体のＥＰ４結合部位と実質的に同じ部位に結合する抗体であって、ＥＰ４の機能を阻害する作用を有する抗体は本発明に含まれる。
本発明の抗体の取得方法
　本発明の抗ＥＰ４抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそれら機能的断片であってもよい。医薬組成物として均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。「モノクローナル」というのは、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、例えばハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５））、又は、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体は、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Ｃｌａｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１））。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、又は別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、抗体変異体、並びにその機能的断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：６８５１－６８５５（１９８４））。
　本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原としての抗原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成－トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ－ＴＤＭ）が含まれる。免疫原処理の後、血中に産生されたＥＰ４に対する抗体を、ＥＰ４結合特異性及び、ＥＰ４の機能抑制作用などを指標にして、所望の抗体を取得することができる。
　また、本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、例えば、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。
　この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（ｉ）宿主動物又は、宿主動物由来にヒトＥＰ４タンパク質を免疫する、（ｉｉ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（ｉｉｉ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（ｉｖ）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。
　免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、例えば、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマが生育する培地から、常法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
　このようにして調製したハイブリドーマをインビトロ培養し、あるいは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの腹水中でインビボ培養し、目的の抗体を培養上清、あるいは、腹水から調製することができる。
　本発明の核酸は、本発明の抗体における重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするものである。本発明の核酸である重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸をベクターに挿入し、これを細胞内で発現させてもよい。
　ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、組換型の抗体を調製することもできる。
本発明のキメラ抗体の定義と生産方法
　本発明の抗ＥＰ４抗体の実施形態には、遺伝子組換え抗体が含まれる。遺伝子組換え抗体としては、特に限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト抗体等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、異なる動物種由来の可変領域と定常領域を連結した抗体、特に、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結した抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６８５１－６８５５，（１９８４）等を参照）、キメラを作製する場合、そのように連結した抗体が得られるよう、当業者に周知の遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。ここで、マウス由来抗体の可変領域として、重鎖可変領域は、例えば、配列番号２又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、軽鎖可変領域は、例えば、配列番号４又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。本発明のキメラ重鎖又はキメラ軽鎖をベクターに挿入する。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、組換型の抗体を調製することもできる。
本発明のヒト型抗体の定義と生産方法
　本発明のキメラ抗体には、ヒト（型）化抗体が含まれる。ヒト型化抗体は、フレームワーク領域はヒト由来で、ＣＤＲはマウス由来の領域からなる抗体のことである。ヒト型化抗体は、まず、マウス抗体の可変領域からそのＣＤＲをヒト可変領域に移植し、重鎖及び軽鎖可変領域を再構成した後、これらヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結することで作製することができる。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２－５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１－９１７（１９８７）；Ｑｕｅｅｎ　Ｃ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９－１００３３（１９８９）等を参照）。ここで、本発明の抗ＥＰ４抗体に使用されるマウス由来ＣＤＲ配列としては、限定はされないが、例えば、重鎖ＣＤＲ１～３として配列番号５～７に示されるアミノ酸配列が、軽鎖ＣＤＲ１～３として配列番号８～１０に示されるアミノ酸配列あるいは軽鎖ＣＤＲ１～３として配列番号１８～２０に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
　ヒト型化抗体重鎖又はヒト型化抗体軽鎖を宿主細胞内において発現させるために、ヒト型化抗体重鎖又はヒト型化抗体軽鎖をベクターに挿入してもよい。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択することができる。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、宿主細胞内で抗体を再構築させて、組換型の抗体を調製することもできる。
本発明のヒト抗体の定義と生産方法
　ヒト抗体（完全ヒト抗体）とは、可変領域の抗原結合部位である超過変領域（Ｈｙｐｅｒ　Ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ）、可変領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ただし、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト抗体は、公知の技術により当業者であれば容易に作製することができる。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９９７）１６，１３３－１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７－３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９－７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ　Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２－７２７等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　＆　Ｖｉｓｕａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１－８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ　ｉｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９－２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７－４３１等を参照）により取得することができる。　
本発明の抗体の機能的断片
　本発明の抗体の機能的断片としては、抗ＥＰ４抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）、一本鎖抗体（重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域等）、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＦｖ二量体）、ｄｓＦｖ（ジスルフィド安定化可変領域）、並びに、ＣＤＲを少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。Ｆａｂは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、重鎖のＮ末端側約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｆａｂの作製は、抗体分子をパパインで処理して断片を取得する他、例えば、ＦａｂをコードするＤＮＡを挿入した適当な発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入後、細胞内でＦａｂを発現させることで実施することができる。
　また、Ｆ（ａｂ’）２は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、抗体分子ペプシンで処理して断片を取得する他、後述するＦａｂをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて作製することも可能で、さらに、Ｆａｂと同様に遺伝子工学的手法によっても作製することができる。
　Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’も、Ｆａｂ等と同様に遺伝子工学的な手法により作製することができる。
　ｓｃＦｖは、１本の重鎖可変領域（ＶＨ）と１本の軽鎖可変領域（ＶＬ）とを適当なペプチドリンカーを用いて連結した、ＶＨ－リンカー－ＶＬないしはＶＬ－リンカー－ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｃＦｖは、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを取得し、遺伝子工学的手法により作製することができる。
　ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一抗原結合活性であっても、又は、一方を異なる抗原結合活性であってもよい。ｄｉａｂｏｄｙは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを取得し、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をペプチドリンカーで結合したｓｃＦｖを発現するｃＤＮＡを構築して、遺伝子工学的手法により作製することができる。
　ｄｓＦｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、Ｒｅｉｔｅｒらにより示された方法などにより、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。ｄｓＦｖは、抗体の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築して遺伝子工学的手法により作製することができる。
　ＣＤＲを含むペプチドは、重鎖又は軽鎖のＣＤＲ（ＣＤＲ１～３）の少なくとも１領域以上を含むように構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。ＣＤＲを含むペプチドは、抗体の重鎖又は軽鎖のＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、発現ベクターに挿入する。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体の精製
　本発明の抗体の精製方法としては特に限定はなく、公知の手法を採用することができる。例えば、前記ハイブリドーマ又は前記組換え細胞の培養上清を回収し、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて、本発明の抗体を精製することができる。抗体のアイソタイプがＩｇＧである場合には、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。
本発明の抗体を含む医薬
　本発明の抗体又はその機能的断片は、これらを有効成分とした医薬として使用することができる。このような本発明の医薬は、ＥＰ４に関連する免疫疾患、腫瘍および疼痛の治療又は予防のために使用することができる。
　ＥＰ４に関連する免疫疾患とは例えば乾癬；多発性硬化症；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス；クローン病等の炎症性腸疾患；Ｉ型糖尿病とその合併症（例えば糖尿病性網膜症、糖尿病性細小血管症、糖尿病性腎障害、黄斑変性等）；多発性筋炎；シェーグレン症候群；喘息アトピー性皮膚炎及び接触性皮膚炎；免疫不全疾患；臓器移植等を指す。
　本発明の医薬は、疼痛すなわち侵害受容性疼痛及び神経障害性疼痛の治療又は予防のために使用することができる。侵害受容性疼痛とは例えば、体性及び内臓性の侵害受容器の活性化に起因する疼痛、例えば関節における病的変形及び慢性関節痛（例えば関節リウマチを含む関節炎、変形性関節症、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎、痛風性関節炎及び若年性関節炎等）（疾患の緩和と関節構造維持を含む）；腰痛および頸部痛；筋骨格痛；筋炎；骨折；捻挫、挫傷；線維筋痛症に付随する疼痛；腫瘍及び腫瘍治療に関連する疼痛；インフルエンザ又は他のウイルス感染症（感冒等）に付随する疼痛；リウマチ熱；内臓痛；機能性の腸疾患（例えば過敏性腸症候群、非心臓性胸痛、非潰瘍性消化不良等）に付随する疼痛；心筋虚血に付随する疼痛；歯痛；術後および歯科処置後の疼痛；産後痛；一次性頭痛（例えば片頭痛、緊張型頭痛、群発頭痛とその他の一次性頭痛）；二次性頭痛（例えば頭頸部外傷による頭痛、頭頸部血管障害による頭痛、非血管性頭蓋内疾患による頭痛、薬物乱用等物質又はその離脱による頭痛、感染症による頭痛、ホメオスターシスの障害による頭痛、頭蓋骨，頸，眼，耳，鼻，副鼻腔，歯，口あるいはその他の顔面・頭蓋の構成組織の障害に起因する頭痛あるいは顔面痛薬物誘発性頭痛及び片頭痛に付随する疼痛等）等を指す。
　神経障害性疼痛とは例えば物理的外傷や切断；幻肢痛；慢性炎症症状に起因する疼痛；帯状疱疹後神経痛；糖尿病性神経障害；非特異的腰痛；背部痛；坐骨神経痛；腫瘍とその治療に関連する神経障害；ＨＩＶ関連神経障害；手根管症候群；慢性アルコール中毒；甲状腺機能低下症；三叉神経痛；三叉神経・自律神経性頭痛；尿毒症；ビタミン欠乏症；多発性硬化症；線維筋痛症；毒素等に付随する疼痛等を指す。
　本発明の医薬は、腫瘍の治療又は予防に有用である。腫瘍の治療とは、腫瘍の成長、散開、転移の全面又は部分的阻止又は腫瘍細胞の全面又は部分的駆除のみならず、腫瘍に付随する症状（疼痛、食欲不振、体重減少等）の部分的または全面的解消を含む。
　腫瘍の治療又は予防としては、良性の腫瘍の異常増殖およびポリープ、悪性の腫瘍の異常増殖およびポリープ、新生物を対象とする。
　良性の腫瘍の異常増殖及びポリープとは例えば扁平上皮細胞乳頭腫；基底細胞腫瘍；移行細胞乳頭腫；腺腫；ガストリノーマ；胆管細胞腺腫；肝細胞腺腫；腎管状腺腫；膨大細胞腫；グロムス腫瘍；メラノサイト母斑；線維腫；粘液腫；脂肪腫；平滑筋腫；横紋筋腫；良性奇形腫；血管腫；骨腫；軟骨腫および髄膜腫等を指す。
　悪性の腫瘍の異常増殖及びポリープ、例えば肝細胞癌；胆管細胞癌；腎細胞癌；扁平上皮癌；基底細胞癌；移行細胞癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；悪性黒色腫；線維肉腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；悪性奇形腫；血管肉腫；カポジ肉腫；骨肉腫；軟骨肉腫；リンパ管肉腫；悪性髄膜腫；非ホジキンリンパ腫；ホジキンリンパ腫；白血病及び脳腫瘍等を含む。
　新生物は、上皮細胞由来新生物（上皮癌腫）、基底細胞癌腫、腺癌腫、並びに、口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌及び胃癌のような胃腸癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頚癌、肺癌、乳癌、並びに、扁平上皮細胞癌及び基底細胞癌のような皮膚癌、前立腺癌、腎細胞癌腫を含み、また、全身の上皮、間葉又は血液細胞を冒す他の既知の癌を含む。
　本発明の抗体と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体－薬剤複合体を提供することができる。また、遺伝子組換え技術を用い、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物としてのタンパク質トキシンを、遺伝子上で抗体遺伝子と融合させて、１つのタンパク質として発現させて得られたものは、一般に、イムノトキシンと称される。抗腫瘍活性を有する化合物としては、例えば、ドキソルビシン、マイトマイシンＣなどが挙げられる。抗体－薬剤複合体の作製方法としては、限定はされないが、例えば、ジスルフィド結合やヒドラゾン結合によって抗体と薬剤とをカップリングする方法などが挙げられる。
本発明の抗体を含む医薬組成物
　本発明には、医薬又は医薬組成物も含まれる。本発明の医薬の有効成分としては、上述の本発明の抗体又はその機能的断片のほか、生理学的に許容されるその塩を用いてもよい。塩としては、例えば、酸性基が存在する場合には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ－ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、エタノールアミン、Ｎ－メチルグルカミン、Ｌ－グルカミン等のアミンの塩；又はリジン、δ－ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩を形成することができる。塩基性基が存在する場合には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；又はアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩などを挙げることができる。
　本発明の医薬は、有効成分である本発明の抗体又はその機能的断片自体を投与してもよいが、一般的には、有効成分である抗体又はその機能的断片の他、１又は２以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。本発明の医薬の有効成分としては、発明の抗体又はその機能的断片の２種以上を組み合わせて用いることができ、上記医薬組成物には、公知の他の薬剤を併せて配合してもよい。
　医薬組成物の種類は特に限定されず、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。経口投与用又は非経口投与用の任意の製剤形態で提供される。例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又は液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、若しくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。また、高分子などで被覆した徐放製剤を脳内に直接投与することも可能である。
　医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、又は医薬組成物の製造方法は、組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機又は有機物質あるいは固体又は液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して１重量％から９０重量％の間で配合することができる。具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
　経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま、あるいはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸－メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
　注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０ 、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
　直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜等で被覆すればよい。
　本発明の医薬の投与量及び投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止及び／又は治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は０．０１～１０００ｍｇ（有効成分重量）程度であり、一日１回又は数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量０．００１～４００ｍｇ（有効成分重量）を連続投与又は間欠投与することが望ましい。
　本発明の医薬は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。担体として、例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。
　本発明の医薬は、医薬組成物としてキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明の医薬組成物がキットとして供給される場合、該組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。
　キット中に含まれる試薬は、構成成分の活性を長期間有効に持続し、容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質することのない材質で製造された容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料によって構成される。
　また、キットには使用説明書が添付されてもよい。本キットの使用説明は、紙などに印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体に保存されて使用者に供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
　さらに、本発明には、本発明の医薬又は医薬組成物を患者等に投与し、ＥＰ４に関連する免疫疾患、腫瘍および疼痛等を予防又は治療する方法が含まれる。
　ここで「治療」とは、ＥＰ４の機能異常（例えば、機能の異常亢進など）に起因して発症する疾患等に罹患した哺乳動物において、その病態の進行及び悪化を阻止又は緩和することを意味し、これによって該疾患の進行及び悪化を阻止又は緩和することを目的とする処置のことである。
　また、「予防」とは、ＥＰ４の機能異常（例えば、機能の異常亢進など）に起因して発症する疾患等に罹患するおそれがある哺乳動物について、該疾患の発症又は罹患を予め阻止することを意味し、これによって該疾患の諸症状等の発症を予め阻止することを目的とする処置のことである。
　治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
本発明の抗体固定化担体
　本発明には、抗体固定化担体が含まれる。本発明の抗体固定化担体は、本発明の抗ヒトＥＰ４抗体が担体に固定化されてなるものである。好ましい実施形態では、本発明の抗体固定化担体は、ＥＰ４発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＥＰ４発現細胞を除去するために用いられる。担体に固定化される抗ヒトＥＰ４抗体は、１種類のみでもよいし、２種以上でもよい。
本発明の抗体固定化担体の具体的形態としては、例えば、本発明の抗体が水不溶性担体に固定され、容器に充填されたものが挙げられる。ここで、水不溶性担体としてはいかなる材質も使用可能であるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを列記すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属材料が挙げられる。
　担体の形状としては、粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体、平板状、などが挙げられるが、体積当たりの表面積が大きいという点で粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ましい。例えば、抗体が固定された水不溶性担体を予め容器に充填した多孔質体フィルターに末梢血液を通過させ、疾患に関わるＥＰ４発現細胞を効率よく除去することができる。
　本発明の抗体固定化担体と他の構成要素とを組み合わせて、ＥＰ４発現細胞除去用キットを作製することができる。当該他の構成要素としては、抗凝固剤、体外循環回路が挙げられる。
本発明の抗ＥＰ４抗体を含む診断用キット
　本発明の抗ＥＰ４抗体は、診断用キットの形態で提供することができる。本発明の診断用キットは抗体を含むが、その他に、標識物質、又は２次抗体もしくはその標識物含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明の診断用キットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、ブロッキング剤（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），Ｓｋｉｍ　ｍｉｌｋ，Ｇｏａｔ血清等の血清成分）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよい。測定法としては、例えばＥＬＩＳＡ法、ＥＩ法、ＲＩＡ法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、フローサイトメトリー法が考えられるが、なかでも特に、フローサイトメトリー法が、簡便かつ高感度という点で好ましい。また、その他の細胞表面抗原を認識する抗体キットと組み合わせて使用することができる。
本発明の診断用キットを、癌、自己免疫疾患などを罹患している患者の血液細胞と反応させ、ＥＰ４発現細胞の血液中での割合を検出することができる。その他の細胞表面抗原抗体と組み合わせることにより特定の細胞集団（例えば樹状細胞、ＴＨ１７細胞、Ｔｒｅｇ細胞）でのＥＰ４発現細胞の割合を検出することができる。ＥＰ４発現細胞の割合の増減を評価することで、疾病の状態を評価することができる。
　以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
（１）ヒトＥＰ４　発現ベクター ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４０-ｈＥＰ４ の作製
　ＧｅｎＢａｎｋに登録済みのヒトＥＰ４遺伝子(登録番号ＮＭ＿０００９５８)の、ＯＲＦ配列から終止コドンを除いた配列の ５’末端に５’－ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣ－３’配列（配列番号３０）を、３’末端に５’－ＧＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＣＣＣＣ－３’配列（配列番号３１）を付加したＤＮＡを合成し、 ｐＤＯＮＲ２２１ベクター（インビトロジェン社製）にＧａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を使用して組み込み、ｐＤＯＮＲ－ｈＥＰ４とした。インサートの塩基配列は常法に従って決定し、配列に誤りがないことを確認した。次にＧａｔｅｗａｙシステムにより、ヒトＥＰ４遺伝子を含む配列をｐｃＤＮＡ－ＤＥＳＴ４０ ベクター（インビトロジェン社製）に組み替え、ｐｃＤＮＡ－ＤＥＳＴ４０－ｈＥＰ４ を得た。このプラスミドから発現するヒトＥＰ４は、Ｃ末端にＶ５と６×ＨＩＳタグが付加された融合タンパク質である。ｐｃＤＮＡ－ＤＥＳＴ４０－ｈＥＰ４のプラスミドＤＮＡは、常法に従って大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換して増幅し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて使用説明書に従い調製した。
（２）ヒトＥＰ４発現２９３ＦＴ細胞の調製
　１００ｍｍのコラーゲンＩコート細胞培養用ディッシュに播種した２９３ＦＴ 細胞（インビトロジェン社製）に、上述のｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４０-ｈＥＰ４ プラスミドＤＮＡ１０μｇを、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）２５μＬを用いて、使用説明書に従い遺伝子導入した。遺伝子導入２４時間後に細胞をＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、インビトロジェン社製） で洗浄し、酵素不含細胞解離バッファー（インビトロジェン社製）によって細胞培養用ディッシュから剥がし取り、遠心操作により回収した。ＥＰ４遺伝子導入２９３ＦＴ細胞および遺伝子未導入２９３ＦＴ細胞は、Ｃｙｔｏｆｉｘ/Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｋｉｔ（ＢＤ社製）を用いて細胞膜透過処理を施し、抗Ｖ５タグ抗体(インビトロジェン社製)と混合してインキュベートした(４℃、１時間)。洗浄バッファー（０．１％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ，インビトロジェン社製）)で３回洗浄した後、２次抗体のＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体(インビトロジェン社製)によって染色(４℃、１時間)し、再度洗浄バッファーで３回洗浄した後、フローサイトメーターＱｕａｎｔａ ＳＣ ＭＰＬ(ベックマン・コールター社製)で解析した。その結果、遺伝子導入２９３ＦＴ細胞のみがＡｌｅｘａ４８８蛍光陽性を示したことから、ヒトＥＰ４を発現していることが確認できた。
　そこで、このヒトＥＰ４発現２９３ＦＴ細胞を感作抗原として使用した。
（３）免疫
　抗原免疫は １２９/Ｏｌａ 系統の７週齢のメスマウスに対して行った。（２）で記載したヒトＥＰ４ 発現２９３ＦＴ細胞を生理食塩水に懸濁した後、１０～１４日の間隔を空けて５回腹腔内投与を行った。
（４）ハイブリドーマの作製
　５回目の免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞とマウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＥＣＡＣＣ）とをポリエチレングリコール４０００（メルク社製）を用いて、常法に従って細胞融合させた。融合細胞は、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、ＮＣＴＣ-１０９培地（以上インビトロジェン社製）を含むＧＩＴ培地（和光純薬社製）に懸濁し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルの割合で播種、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。融合の翌日からは、上述の培地にＨＡＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を加えた培地に交換して、融合後１３日間培養を継続した。その結果、約７００クローンのハイブリドーマのコロニーを得た。
（５）ヒトＥＰ４安定発現ＮＳ０細胞株の構築
　（１）で述べたｐＤＯＮＲ－ｈＥＰ４からｐＥＦ－ＤＥＳＴ５１ベクター（インビトロジェン社製）へＧａｔｅｗａｙシステムによる配列の組み換えを行い、ｐＥＦ－ＤＥＳＴ５１-ｈＥＰ４ プラスミドを得た。このプラスミドから発現するヒトＥＰ４は、Ｃ末端にＶ５と６×ＨＩＳタグが付加された融合タンパク質である。
　１０％のウシ胎児血清と、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（インビトロジェン社製）を含む ＲＰＭＩ培地で培養した、マウスミエローマＮＳ０細胞（理化学研究所細胞バンク）１×１０７細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＬＴＸ　（インビトロジェン社製）３５μＬとＰｌｕｓＲｅａｇｅｎｔ(インビトロジェン社製) １４μＬを使って、使用説明書に従ってｐＥＦ－ＤＥＳＴ５１－ｈＥＰ４プラスミド １４μｇを遺伝子導入した。遺伝子導入の翌日からは、２．５μｇ／ｍＬ の抗生物質ブラストシジン(インビトロジェン社製)を加えたＲＰＭＩ培地で、３日目ごとに培地を交換しながら２週間培養した。形成されたコロニーからペニシリンキャップ法により、ブラストシジン耐性 ＮＳ０細胞をクローニングした。
　得られたブラストシジン耐性 ＮＳ０細胞を、ＦｃＢｌｏｃｋ（ベクトン・ディッキンソン社製）で４℃１５分間ブロッキングした後、（２）と同様の方法でフローサイトメトリーによりＥＰ４融合タンパク質の発現を確認した。その結果、得られたブラストシジン耐性 ＮＳ０細胞がヒトＥＰ４を安定発現していることが確認できた。
（６）抗ＥＰ４抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
　（５）で作製したヒトＥＰ４安定発現ＮＳ０細胞株 ２×１０５細胞を、（２）と同様の方法で染色しフローサイトメーターによる解析を行った。細胞膜透過処理は施さず、１次抗体として、（４）で得られたハイブリドーマの培養上清５０μＬを使用した。その結果、２１ウェルの上清でＡｌｅｘａ４８８蛍光陽性の反応が見られた。陽性だったウェルの細胞は限界希釈法によりクローニングし、２週間後の培養上清についても同様の方法で、フローサイトメトリーによるヒトＥＰ４安定発現ＮＳ０細胞株との結合試験を行った。同様のクローニングと結合試験を再度繰り返し、最終的に２クローンの抗ＥＰ４抗体産生ハイブリドーマを得た。これらのハイブリドーマを、それぞれＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１と名付けた。
　得られたハイブリドーマ細胞 ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１は、２０１０年６月２９日（原寄託日）付で、茨城県つくば市東１丁目１番地１ つくばセンター中央第６ （郵便番号３０５－８５６６）、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１９７８及びＦＥＲＭ　Ｐ－２１９７９として、寄託された。その後、ブダペスト条約に基づき、原寄託より国際寄託に移管された（「原寄託についての受託証」及び「生存に関する証明書」の通知日；２０１１年９月５日）。受託番号はそれぞれＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４０２及びＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４０３である。
(７）抗ＥＰ４抗体の精製
　ハイブリドーマ細胞 ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１それぞれを、無血清のＣＤ－Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ (インビトロジェン社製)中で、細胞の約９割が死滅するまで培養を継続し、抗体を産生させた。この培養上清１００ｍＬから遠心操作（１，５００ｒｐｍ、１５分間）により細胞をとり除いた後、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム(ＧＥヘルスケア・ジャパン社製)に通すことでＩｇＧを精製・濃縮した。得られた精製ＩｇＧについて、Ｉｓｏ Ｓｔｒｉｐ マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いてサブクラスと軽鎖の種類を決定したところ、共に（ＩｇＧ２ａ、κ）であった。以降、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１とはこれらの精製抗体のことを指し、ハイブリドーマもしくは細胞と記載した場合はこれらの抗体を産生するハイブリドーマのことを指す。
（２）、（３）、（４）、（６）と同様に、サブクラスの異なる抗ＥＰ４抗体産生ハイブリドーマ細胞を取得した。このハイブリドーマの培養上清から、（７）と同様にしてサブクラスと軽鎖の種類が（ＩｇＧ１、κ）である精製ＩｇＧを得た。この精製抗体をＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９とした。
（８）ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株の作製
　ｐＤＯＮＲ-ｈＥＰ４ から、Ｇａｔｅｗａｙ システムで ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５－ＤＥＳＴ ベクター(インビトロジェン社製)に ヒトＥＰ４ 遺伝子を乗せ換え、 ｐＥＦ-ＦＲＴ-ｈＥＰ４ を得た。このプラスミドから発現するヒトＥＰ４は、Ｃ末端にＶ５と６×ＨＩＳタグを付加した融合タンパク質である。
　１０％のウシ胎児血清と、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ-１２培地(インビトロジェン社製)で培養した、Ｆｌｐ-Ｉｎ-ＣＨＯ 細胞(インビトロジェン社製)に、リポフェクトアミン２０００を用いてｐＥＦ-ＦＲＴ-ｈＥＰ４ プラスミドとｐＯＧ４４プラスミド(インビトロジェン社製)を同時に遺伝子導入した。遺伝子導入の翌日から、５００μｇ／ｍＬ の抗生物質ハイグロマイシン(インビトロジェン社製)を加えたＨａｍ’ｓ Ｆ-１２培地に培地を交換し、３日目ごとに培地を交換しながら２週間培養した。形成されたコロニーから、ペニシリンキャップ法によりハイグロマイシン耐性細胞をクローニングした。
　（２）に記載した方法で、２次抗体としてはフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマン・コールター社）を使用し、得られたハイグロマイシン耐性細胞と抗Ｖ５タグ抗体との結合をフローサイトメーターで解析した。その結果、得られたハイグロマイシン耐性 Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞がＰＥ陽性を示したことから、ヒトＥＰ４を安定発現していることが確認できた。この細胞を以下、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株と記載する。
（９) 抗ヒトＥＰ４抗体とヒトＥＰ４発現細胞の結合試験
　抗ヒトＥＰ４抗体と、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株の結合試験を（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株もしくは親株Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞を５×１０５使用し、１次抗体としては１μｇのＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体（ＢｉｏＲｅｇｅｎｄ社製）を、２次抗体としてはＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
　図１にその結果を示す。親株Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトＥＰ４安定発現株細胞を黒の実線で示している。ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１が共に、ヒトＥＰ４安定発現ＣＨＯ細胞株にのみ結合していることから、これらの抗体がヒトＥＰ４に特異的に結合することが示された。
　同様にしてＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９についても、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株との結合試験を行った。結果を図２に示す。この結果よりＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９もヒトＥＰ４に特異的に結合することが示された。
（１０）ＰＧＥ ２ によるｃＡＭＰ産生に対する抗体の阻害試験
　ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株もしくは親株Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞を、アセチルサリチル酸１ｍＭを含む培地で１８時間培養した後、細胞解離バッファーで細胞培養ディッシュから回収して、ＣｕｌｔｕｒＰｌａｔｅ-９６(パーキンエルマー社製)に１ウェルあたり２，５００個分注した。各ウェルにＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体を０．０５～３０μｇ／ｍＬになるように加え、室温で１５分間静置した。次にＰＧＥ２(Ｃａｙｍａｎ社製)を５×１０－１１Ｍになるように加え、さらに室温で３０分間静置した。細胞内で産生されたｃＡＭＰ量は、ＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ｃＡＭＰ Ｋｉｔ（パーキンエルマー社製）を用いて、使用説明書に従った反応を行い、プレートリーダーＡＲＶＯ　１４２０　ＨＴＳ(パーキンエルマー社製)で測定した。
　その結果を図３に示す。マウスアイソタイプコントロール抗体を加えても、ＰＧＥ２により誘導されたｃＡＭＰ産生量に関して有意な阻害効果が見られなかったのに対し、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１を加えた場合には、抗体濃度依存的にｃＡＭＰ産生阻害効果が見られた。データ解析ソフトウェア　ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ８．１（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ社製）を用いてロジスティック関数による解析を行ったところ、ＩＣ５０値はＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４では０．１５μｇ／ｍＬ（約１．０ｎＭ）、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１では０．２４μｇ／ｍＬ（約１．６ｎＭ）であった。この結果からＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１はヒトＥＰ４に対するアンタゴニスト活性を有する機能性抗体であり、ヒトＥＰ４に対するアンタゴニスト活性を有する既存の物質（例えば低分子化合物）に比して同等以上の強い受容体機能阻害活性を有していることが示された。
　　同様にしてＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９について、ＰＧＥ２を１．５×１０－１０Ｍ添加して行った試験の結果を図４に示す。上述の解析を行ったところ、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９のＩＣ５０値は４．６μｇ／ｍＬ（約２８．８ｎＭ）であった。この結果から、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９もヒトＥＰ４に対するアンタゴニスト活性を有する機能性抗体であることが示された。
（１１）ヒトＥＰ１～４、マウスＥＰ１～４の発現ベクター作製
　ヒトＥＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００９５５）、ヒトＥＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００９５６）ヒトＥＰ３ａ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ８３８５７）、マウスＥＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１３６４１）、マウスＥＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８９６４）、マウスＥＰ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１１１９６）、マウスＥＰ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８９６５）の終止コドンを除くＯＲＦ配列の５’末端に、ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣ配列（配列番号３２）を付加したＤＮＡ断片を、ＫＯＤ　ＦＸ(東洋紡績社製)を用いて常法に従ってＰＣＲ増幅した。増幅したＤＮＡは、ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯベクター(インビトロジェン社製)に組み込み、それぞれｐＥＮＴＲ－ｈＥＰ１、ｐＥＮＴＲ－ｈＥＰ２、ｐＥＮＴＲ－ｈＥＰ３、ｐＥＮＴＲ－ｍＥＰ１、ｐＥＮＴＲ－ｍＥＰ２、ｐＥＮＴＲ－ｍＥＰ３、ｐＥＮＴＲ－ｍＥＰ４とした。インサートの塩基配列は常法に従って決定し、配列に誤りがないことを確認した。これら７種類のプラスミドと、（１）で作製したｐＤＯＮＲ－ｈＥＰ４プラスミドを用いて、ＧａｔｅｗａｙシステムによりそれぞれのインサートをｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７ベクター(インビトロジェン社製)に組み替えた。その結果、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｈＥＰ１、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｈＥＰ２、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｈＥＰ３、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｈＥＰ４、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｍＥＰ１、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｍＥＰ２、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｍＥＰ３、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｍＥＰ４を得た。これらのプラスミドからは、それぞれのＰＧＥ２受容体のＣ末端にＣｙｃｌｅ　３　Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を付加した融合タンパク質が発現される。
（１２）抗ＥＰ４抗体の結合特異性試験
　（１１）で作製したｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｈＥＰ１、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｈＥＰ２、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｈＥＰ３、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｈＥＰ４、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｍＥＰ１、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｍＥＰ２、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｍＥＰ３、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７－ｍＥＰ４、各１０μｇを、リポフェクトアミン２０００を使用して２９３ＦＴ細胞に遺伝子導入した。その翌日に細胞をＨＢＳＳで洗浄し、酵素不含細胞解離バッファーによって細胞培養用ディッシュから剥がし取り、遠心操作により回収した。これらの細胞をＥＰ一過性発現２９３ＦＴ細胞と記載する。
　本発明の抗ＥＰ４抗体と、ＥＰ一過性発現２９３ＦＴ細胞の結合試験を（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。８種類のＰＧＥ２受容体サブタイプそれぞれの一過性発現２９３ＦＴ細胞は５×１０５個使用し、１次抗体としては１μｇの抗ＥＰ４抗体 ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体（ＢｉｏＲｅｇｅｎｄ社製）を、２次抗体としてはＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
　例としてＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４の結果を図５に示す。ＧＦＰ由来の蛍光陽性細胞が存在することから、それぞれのＰＧＥ２受容体が２９３ＦＴ細胞上に発現していることが確認できた。しかし８種類の細胞の中でＰＥ蛍光陽性を示したのは、ヒトＥＰ４の発現細胞のみであった。ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１も同様の結果であったことから、本発明の抗ＥＰ４抗体はヒト型のＥＰ４に強い特異性を有することが分かった。ＰＧＥ２受容体サブタイプ結合特異性が、ヒトＥＰ４に対するアンタゴニスト活性を有する既存の物質よりも高いことが示された。
　同様にＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９の結合特異性を調べた結果を図６に示す。８種類のＰＧＥ２受容体サブタイプをそれぞれ発現する細胞のうち、ＰＥ蛍光陽性を示したのはヒトＥＰ４の発現細胞のみであった。この結果から、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９もヒト型のＥＰ４に強い特異性を有することが分かった。
（１３）ヒトリンパ球と抗ＥＰ４抗体の結合性試験
　凍結ヒト末梢血単核細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄ．社製）は、使用説明書に従ってＣＴＬ－Ａｎｔｉ－Ａｇｇｒｅｇａｔｅ－Ｗａｓｈ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄ．社製）を使用して解凍、調製した。
　ヒトリンパ球と本発明の抗ＥＰ４抗体の結合性試験は、（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。調製したヒト末梢血単核細胞９×１０５個に、１次抗体としてＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体を１．５μｇ使用し、２次抗体にはＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。フローサイトメーターによる解析の際には、前方散乱光と側方散乱光のドットプロットに基づき、細胞集団をリンパ球画分と単核球・マクロファージ画分とに区分して、リンパ球画分のＡｌｅｘａ４８８蛍光強度を調べた。
　フローサイトメトリーによる解析結果を図７に示す。マウスアイソタイプコントロール抗体による結果を灰色で塗りつぶしたヒストグラムで、抗ＥＰ４抗体による結果を黒の実線で示している。抗ＥＰ４抗体と反応させた場合にのみ、ヒトリンパ球画分の大部分がＡｌｅｘａ４８８陽性を示したことから、ヒトリンパ球と抗ＥＰ４抗体が結合していることが分かる。この結果より、本発明の抗ＥＰ４抗体はヒトの内在性ＥＰ４に結合する能力を有していることが明らかとなった。
　ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９についても同様に、ヒトリンパ球との結合確認実験を行った。ヒト新鮮末梢血から Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ　ＳＨＩＥＬＤ社製）を使用して、使用説明書に従いヒト末梢血単核細胞を単離した後、抗ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を使用してＣＤ１４陰性の細胞画分を分取し、ヒトリンパ球画分とした。以降の結合確認実験は２次抗体としてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＧ抗体(ベックマン・コールター社製)を用いて、上述の通り行った。図８に示した通り、ヒトリンパ球の大部分がＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９と結合しており、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９もまたヒトの内在性ＥＰ４に結合できることがわかった。
（１４）ＰＭＡ刺激ＴＨＰ１の抗ＥＰ４抗体による免疫染色
　ヒト単球系ＴＨＰ１細胞株は、ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３?ａｃｅｔａｔｅ、シグマ・アルドリッチ社製）１００ｎＭを含むＲＰＭＩ培地で、４ウェルカルチャースライド（ベクトン・ディッキンソン社製）に１ウェルあたり１．５×１０５細胞になるように播種し、３日間培養してマクロファージ様に分化させた。培地を除いてからＰＢＳで３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド溶液２００μＬにより細胞を固定（４℃で３０分間静置）した。再度ＰＢＳで３回洗浄した後、ヒトガンマグロブリン(和光純薬社製)１ｍｇ／ｍＬを含む１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ，和光純薬社製）を３００μＬ加えてブロッキングした(室温、２０分間静置)。次に０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＭＰバイオ社製）を含むＰＢＳ(以下、免染洗浄バッファーと記載する)で３回洗浄してから、１ｍｇ／ｍＬに調製したＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体を２００μＬ加えて、４℃で１時間インキュベートした。免染洗浄バッファーで３回洗浄後、２次抗体のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体によって染色(４℃、１時間)した。免染洗浄バッファーで３回洗浄したスライドは、最後にＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ (ＰＩ)を含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 社製）で封入した。作製したスライドは蛍光顕微鏡を用いて観察した。
　免疫染色したＴＨＰ１細胞の蛍光顕微鏡観察像を図９に示す。左の像は、マウスアイソタイプコントロール抗体での染色像で、中央にＰＩで染められた細胞核(灰色)のみが観察できる。右の像は抗ＥＰ４抗体での染色像で、細胞核の周辺にＦＩＴＣの蛍光(白色)が粒状に観察された。この結果から、ＴＨＰ１細胞株をＰＭＡによって分化させたマクロファージ様細胞の細胞膜表面上の天然型ＥＰ４に本発明の抗体が結合することが分かった。
（１５）ＰＧＥ ２ によるサイトカイン抑制効果の抗ＥＰ４抗体による阻害
　ＰＧＥ２は、マクロファージにおいてＬＰＳ刺激によるサイトカイン産生をＥＰ４あるいはＥＰ２を介して抑制することが知られている。本発明の抗体が、ＥＰ４を介したＰＧＥ２によるサイトカイン産生抑制を回復させるかを、ＥＰ４受容体を発現しているＰＭＡ分化ＴＨＰ1を用いて調べた。ＴＨＰ１細胞株は、ＰＭＡ　１００ｎＭを含むＲＰＭI培地で４８ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり２．５×１０５細胞播種した。３日間培養後、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１、マウスアイソタイプコントロール抗体３．０μｇ／ｍＬを含むＲＰＭＩ培地に培地交換し、３０分間インキュベートした。次に、ＰＧＥ２を２０ｎＭになるように加えてさらに３０分間インキュベートした。さらにＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬになるように加えてから１８時間培養した。培養上清を回収し、ＴＮＦα　Ｈｕｍａｎ　ＤｕｏＳｅｔ　Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を使用して使用説明書に従い、培養上清中のＴＮＦαの量を測定した。
　一方、培養上清を回収した後の細胞には、ＲＰＭＩ培地で１０倍希釈したアラマーブルー（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ社製）を０．５ｍＬ加えた。４時間インキュベートした後に、励起波長５３５ｎｍ、検出波長５９５ｎｍの条件でプレートリーダーＡＲＶＯ　１４２０　ＨＴＳで蛍光測定した。このアラマーブルーでの測定結果を基に、各ウェル間の相対的な生存細胞数比を求め、生存細胞数比当たりのＴＮＦα生産量を算出した。本発明の抗体が、どの程度ＰＧＥ２によるサイトカイン産生抑制を回復するかは、以下の基準に基づいて算出した。すなわち、ＬＰＳ刺激のみを加えたウェルのＴＮＦα量を回復率１００％、ＬＰＳ刺激とＰＧＥ２を加えたウェルのＴＮＦα量を回復率０％として、ＬＰＳ刺激とＰＧＥ２と当該抗体を加えた場合の回復率を算出した。
　試験結果を表１に示した。マウスアイソタイプコントロール抗体を加えても、ＰＧＥ２によるＴＮＦα産生抑制に有意な変化は見られなかった。しかしＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１を加えた場合には、ＰＧＥ２によるＴＮＦα産生抑制を約５０％程度回復することが分かった。独立した２回の試験で同様の結果を得た。以上よりＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１はヒト内在性ＥＰ４に対してアンタゴニスト活性を有する機能性抗体であることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（１６）抗ＥＰ４抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析
　抗ＥＰ４抗体を産生するハイブリドーマ（ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１）約１×１０７個よりＲｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （キアゲン社製）を用いて、添付の使用説明書に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡの抽出を行った。５’/３’ ＲＡＣＥキット、２ｎｄ ジェネレーション（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）にて５’－ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法によるＰＣＲを行い、重鎖または軽鎖の可変領域の増幅を行った。３’プライマーはマウス定常領域γ１とκに相当するプライマーを使用した。重鎖可変領域増幅のための３’ プライマーは５’－ＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧ－３’（配列番号３３）と５’－ＧＧＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣ－３’（配列番号３４）である。軽鎖可変領域増幅のための３’プライマーは５’－ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣ－３’（配列番号３５）と５’－ＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧ－３’（配列番号３６）である。次に、得られた増幅断片をアガロースゲルによって電気泳動し、バンドを切り出し、ゲルを溶かし出すことによってＤＮＡの精製を行った。精製したＤＮＡをＴ－Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）に組み込み、塩基配列を解析してアミノ酸配列を決定した。シーケンス反応はＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　３．１（アプライドバイオシステムズ社）を使用し、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）により塩基配列を決定した。　塩基配列を解析した結果、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４の重鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号１、軽鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号３であった。また重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号２、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４が得られた。
　さらに、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１の重鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号１１、軽鎖可変領域をコードする核酸配列としてとして配列番号１３であった。また重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号１２、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号１４が得られた。
　以上の結果から、Ｋａｂａｔら((１９９１) Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ, Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｕ. Ｓ. Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ,Ｕ. Ｓ. Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ)により定義されるＣＤＲ領域のアミノ酸配列が明らかとなった。
　ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４の重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ、配列番号５～７であった。また軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号８～１０であった。また、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１の重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ、配列番号１５～１７であった。また軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号１８～２０であった。重鎖ＣＤＲについて両クローンは完全一致していた。
　ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９に関しても上述の方法に従って、重鎖可変領域は配列番号３３と配列番号３４のプライマーを、軽鎖可変領域は配列番号３５と配列番号３６のプライマーを用いて増幅し、可変領域の配列を決定した。ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９の重鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号４１、軽鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号４２であった。また重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４３、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４４が得られた。
　ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９の重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ、配列番号４５～４７であった。また軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号４８～５０であった。
（１７）抗ＥＰ４抗体遺伝子のクローニング
　Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ Ｆｏｒ ＲＴ?ＰＣＲ （ＡＭＶ） （ロシュ・ダイアグノスティックス社製)に付属のＯｌｉｇｏ－ｄＴ Ｐｒｉｍｅｒを用いて、使用説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、本発明の抗ＥＰ４抗体の重鎖および軽鎖遺伝子全長をＰＣＲ増幅した。重鎖及び軽鎖の５’末端側は５’－ＲＡＣＥで判明した塩基配列を参考に、３’末端側は定常領域特異的配列を参考に設計した。重鎖遺伝子増幅のための５’プライマーは５’－ＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＡＣＧＣＧＴＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣ－３’（配列番号３７）、３’プライマーは５’－ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’ （配列番号３８）である。軽鎖可変領域増幅のための５’プライマーは５’－ＴＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴ－３’（配列番号３９）と５’－ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴ－３’（配列番号４０）である。得られた重鎖および軽鎖増幅断片は制限酵素ＭｌｕＩとＮｏｔＩで切断し、重鎖はｐＥＨＸ１．１(東洋紡績社製)、軽鎖はｐＥＬＸ２．１(東洋紡績社製)のＭｌｕＩとＮｏｔＩサイトに組み込み、塩基配列を解析してアミノ酸配列を決定した。
　塩基配列を解析した結果、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４の重鎖をコードする核酸配列として配列番号２２、軽鎖をコードする核酸配列として配列番号２４となった。また重鎖のアミノ酸配列として配列番号２３、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号２５が得られた。
　ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１の重鎖をコードする核酸配列として配列番号２６、軽鎖をコードする核酸配列として配列番号２８となった。また重鎖のアミノ酸配列として配列番号２７、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号２９が得られた。
　重鎖ならびに軽鎖可変領域のアミノ酸配列は上記５’－ＲＡＣＥ法で解析したアミノ酸配列と同一であった。
　ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９に関しても、上述の方法に従ってｃＤＮＡを合成し、それを鋳型としてＮＢＧ０１６―ｍＡｂ９の重鎖および軽鎖遺伝子全長をＰＣＲ増幅した。重鎖遺伝子増幅のための５’プライマーは５’－ＣＡＣＴＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＴＡＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＴＴＣＣ－３’（配列番号５１）、３’プライマーは５’－ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’ （配列番号５２）である。軽鎖遺伝子増幅のための５’プライマーは５’－ＴＣＣＴＣＡＧＧＴＴＧＣＣＴＣＡＣＧＣＧＴＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧ－３’（配列番号５３）と５’－ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴ－３’（配列番号４０）である。得られた重鎖および軽鎖増幅断片は制限酵素ＭｌｕＩとＮｏｔＩで切断し、重鎖はｐＥＨＸ１．１(東洋紡績社製)、軽鎖はｐＥＬＸ２．１(東洋紡績社製)のＭｌｕＩとＮｏｔＩサイトに組み込み、塩基配列を解析してアミノ酸配列を決定した。
　ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ９の重鎖をコードする核酸配列として配列番号５４、軽鎖をコードする核酸配列として配列番号５５となった。また重鎖のアミノ酸配列として配列番号５６、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号５７が得られた。
（１８）得られた抗体遺伝子配列が抗ＥＰ４抗体をコードしていることの確認
　ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１のリコンビナント抗体は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＰｏｗｅｒＥｘｐｒｅｓｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（東洋紡績社製）を用いて生産した。軽鎖遺伝子が挿入されたｐＥＬＸ２．１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切断し、アガロースゲルによって電気泳動して軽鎖遺伝子を含む断片を精製した。精製した軽鎖遺伝子断片を、重鎖遺伝子を挿入されたｐＥＨＸ１．１のＥｃｏＲＩ－ＢｇｌＩＩサイトに組み込み、軽鎖および重鎖両方の遺伝子を保持するプラスミドを作製した。このプラスミドをリポフェクトアミン２０００を用いて２９３ＦＴ細胞に形質導入し、一過性での抗体発現を行った。
　形質導入から７２時間後の細胞培養上清を採取し、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株との結合試験を（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。コントロールとしては抗体遺伝子未導入の２９３ＦＴ細胞の培養上清を使用した。その結果、培養上清中に分泌されたリコンビナント抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１は、ヒトＥＰ４に対する結合性を保持していた。このことから、（１７）で得られた抗体遺伝子配列は、抗ＥＰ４抗体をコードしていることが確認できた。
　ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ９のリコンビナント抗体も、上述の方法と同様に生産した。軽鎖遺伝子が挿入されたｐＥＬＸ２．１は制限酵素ＳａｌＩとＳｐｅＩで切断し、アガロースゲルによって電気泳動して軽鎖遺伝子を含む断片を精製した。精製した軽鎖遺伝子断片を、重鎖遺伝子が挿入されたｐＥＨＸ１．１のＳａｌＩ－ＳｐｅＩサイトに組み込み、軽鎖および重鎖両方の遺伝子を保持するプラスミドを作製した。このプラスミドを２９３ＦＴ細胞に形質導入し、一過性での抗体発現を行った。
　形質導入から７２時間後の細胞培養上清を採取し、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株との結合試験を（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。コントロールとしては抗体遺伝子未導入の２９３ＦＴ細胞の培養上清を使用した。結果を図１０に示す。親株Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株を黒の実線で示している。培養上清中に分泌されたリコンビナント抗体ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ９がヒトＥＰ４に対する結合性を保持していたことから、（１７）で得られたＮＢＧ０１６―ｍＡｂ９の抗体遺伝子配列は、抗ＥＰ４抗体をコードしていることが確認できた。
（１９）リコンビナント抗ＥＰ４抗体安定発現ＣＨＯ細胞の作製
　（１８）で作製した、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１の軽鎖および重鎖の遺伝子を保持するベクターを制限酵素ＳｓｐＩで切断し、エタノール沈殿法で精製した。リポフェクトアミン２０００を用いてＣＨＯ－Ｋ１細胞（理化学研究所細胞バンク）に形質導入し、１０%ウシ胎児血清を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地で２４時間培養した。２４時間後、１０% ウシ胎児血清および１０μｇ/ｍＬピューロマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地に交換し、３日毎に培地交換をしながら１２日間培養した。１２日後にペニシリンキャップ法でコロニーを分離した。
　分離したＣＨＯ―Ｋ１細胞を２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、１０μｇ/ｍＬ ピューロマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地で３日間培養した。３日後に１０μｇ/ｍＬピューロマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ウシ胎児血清無添加）に交換し、７２時間培養後の培養上清を回収した。
　培養上清中のマウスＩｇＧはＥＬＩＳＡ法により検出した。ＰＢＳを用いて培養上清の希釈系列を作製し、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （Ｎｕｎｃ社製)に分注して４℃で一晩静置した。翌日、３％ ＢＳＡ(Ｓｉｇｍａ社製)を含むＰＢＳを加えて室温で1時間静置してブロッキングした。０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで４，０００倍に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ミリポア社製）を加え、室温で１時間静置した。０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、発色試薬（Ｓｕｒｅｂｌｕｅ ＴＭＢ ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ加えて室温で５分静置した後、１００μＬの１Ｎ硫酸を加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、軽鎖および重鎖の遺伝子を保持するベクターを導入して株化したＣＨＯ－Ｋ１細胞の上清で、ＩｇＧの発現を確認した。
(２０)リコンビナント抗ＥＰ４抗体とヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株の結合試験
　（１９）で樹立した細胞株培養上清から（７）と同様にして、リコンビナント抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、リコンビナント抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１を精製した。得られた精製リコンビナント抗ＥＰ４抗体と、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株の結合試験を（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。精製リコンビナント抗ＥＰ４抗体もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体は細胞５×１０５個あたり１μｇを使用した。２次抗体にはＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
　図１１にその結果を示す。親株Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株を黒の実線で示している。リコンビナント抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４、リコンビナント抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１が共に、ヒトＥＰ４安定発現ＣＨＯ細胞株にのみ結合していることから、精製リコンビナント抗ＥＰ４抗体が、ヒトＥＰ４に対する結合性を保持していることが確認された。
（２１）マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１発現ベクターの作製
　（７）で精製したＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１はサブクラスがＩｇＧ２ａであった。そこで、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１のサブクラスをＩｇＧ１に改変し、マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１を作製した。マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１遺伝子はＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ　ＰＣＲ法で以下の通り作製した。ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ２１の重鎖遺伝子を鋳型として、５’－ＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＡＣＧＣＧＴＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣ－３’（配列番号３７）と５’－ＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＡＧＣＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣ－３’（配列番号５８）を用い、ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ２１の可変領域遺伝子をＰＣＲ増幅した。一方で、マウスＩｇＧ１を産生するハイブリドーマのＴｏｔａｌ　ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型にして、５’－ＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＡＧＣＧＣＴＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣ－３’（配列番号５９）と５’－ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号３８）を用い、マウスＩｇＧ１のＣＨ１から定常領域遺伝子までをＰＣＲ増幅した。増幅して得られた重鎖可変領域遺伝子とＣＨ１―定常領域遺伝子断片を混合し、配列番号３７と配列番号３８のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。増幅して得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＭｌｕＩとＮｏｔＩで切断し、発現ベクターｐＥＨＸ１．１のＭｌｕＩ－ＮｏｔＩサイトに挿入した。得られた発現ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切断し、ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１の軽鎖遺伝子断片（ＥｃｏＲＩ－ＢｇｌＩＩ断片）を挿入してマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１発現ベクターとした。
（２２）マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１安定発現株作製方法
　８ｍＭグルタミンを含むＥＸ－ＣＥＬＬ　ＣＤ　ＣＨＯ培地（ＳＡＦＣＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で培養した浮遊ＣＨＯ－ＫＩ細胞（東洋紡績社）（２.５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を２４穴プレートの２ウェルに１ｍｌずつ分注した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ　１３６μｌ、リポフェクトアミン２０００　１５μｌ、および制限酵素ＳｓｐＩで切断したマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１発現ベクター４μｇを混合し、室温で２０分放置した後、ＣＨＯ－Ｋ１を入れたウェルに６８μｌずつ添加し、ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートした。２４時間後の細胞を８ｍＭグルタミンを含むＥＸ－ＣＥＬＬ　ＣＤ　ＣＨＯ培地８ｍｌに細胞を懸濁し、６穴プレートの２ウェルに４ｍｌずつ分注した。一方のウェルに１０ｍｇ／ｍｌのピューロマイシンを３μｌ、もう一方のウェルに４μｌ添加し、３日または４日毎に培地を交換しながら１８日間培養した。増殖したウェルの細胞を回収して、５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ　（１ｌ当たりＥＸ－ＣＥＬＬ　ＣＤ　ＣＨＯ培地７００ｍｌ、浮遊ＣＨＯ－ＫＩ細胞培養上清３００ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ　ピューロマイシン１ｍｌまたは０．７５ｍｌを混合した培地）に懸濁して、９６穴プレートに２００μｌずつ分注した。１週間後にＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍを１００μｌ添加し、さらに1週間培養した。数回継代培養した後、薬剤耐性細胞（４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を２４穴プレートに５００μｌ入れ、５日間培養した。５日後にＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ　ＥＩＡ　Ｋｉｔ　（タカラバイオ社製）を用いて上清中の抗体量を定量して抗体生産細胞をスクリーニングした。この細胞をマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１安定発現ＣＨＯ細胞株とした。
（２３）マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１の精製
　マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１安定発現ＣＨＯ細胞株を、８ｍＭ　グルタミン、７．５μｇ／ｍｌ　ピューロマイシンを含むＥＸ－ＣＥＬＬ　ＣＤ　ＣＨＯ培地で１０日間培養して抗体を産生させた。この培養上清２００ｍＬから（７）と同様にして精製ＩｇＧを得た。以降、得られた精製ＩｇＧをマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１とした。
（２４）マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１とヒトＥＰ４の結合試験　
　マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１と、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株の結合試験を（９）と同様に実施した。結果を図１２（Ａ）に示す。親株Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株を黒の実線で示している。マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１がヒトＥＰ４安定発現ＣＨＯ細胞株にのみ結合していることから、作製したマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１が、ヒトＥＰ４に対する結合性を保持していることが確認された。
（２５）ＰＧＥ ２ によるｃＡＭＰ産生に対するマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１の阻害試験
　マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１が、ＰＧＥ２による ｃＡＭＰ産生を阻害するかを（１０）と同様に調べた。細胞と抗体を室温で１５分間反応させた後、ＰＧＥ２を１．５×１０－１０Ｍになるように加え、さらに室温で３０分間静置した。ｃＡＭＰ量は、ＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ｃＡＭＰ Ｋｉｔ（パーキンエルマー社製）を用いて、使用説明書に従った反応を行って測定した。
　その結果を図１２（Ｂ）に示す。マウスアイソタイプコントロール抗体を加えても、ＰＧＥ２により誘導されたｃＡＭＰ産生量に関して有意な阻害効果が見られなかったのに対し、マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１を加えた場合には、その抗体濃度に依存的なｃＡＭＰ産生阻害効果が見られた。ＩＣ５０値は１．１μｇ／ｍＬ（約６．９ｎＭ）であった。この結果からＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１をマウスＩｇＧ１型抗体に改変してもＥＰ４に対するアンタゴニスト活性を保持していることが示された。
（２６）ヒトキメラ型抗体ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ１４および２１の作製
　ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ１４および２１のＣＨ１領域以降をヒト抗体遺伝子に置換したヒトキメラ型抗体は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＰｏｗｅｒＥｘｐｒｅｓｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（東洋紡績社製）を用いて生産した。ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ１４および２１の重鎖可変領域遺伝子を、５’－ＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣ－３’（配列番号６０）と５’－ＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴ－３’（配列番号６１）を用いてＰＣＲ増幅した。得られた重鎖遺伝子断片は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＮｈｅＩで切断し、発現ベクターｐＥＨγＸ１．１のＨｉｎｄＩＩＩ－ＮｈｅＩサイトに挿入した。一方で、ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ１４および２１の軽鎖可変領域遺伝子を５’－ＡＴＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴ－３’（配列番号６２）と５’－ＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣＣＣＣ－３’（配列番号６３）を用いてＰＣＲ増幅した。得られた軽鎖遺伝子断片は制限酵素ＢｓｉＷＩとＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターｐＥＬκＸ２．１のＢｓｉＷＩ－ＥｃｏＲＩサイトに挿入した。
　軽鎖遺伝子が挿入されたｐＥＬκ２．１を制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＳｃａＩで切断し、アガロースゲルによって電気泳動して軽鎖遺伝子を含む断片を精製した。精製した軽鎖遺伝子断片を、重鎖遺伝子が挿入されたｐＥＨγＸ１．１のＢｇｌＩＩ―ＮｏｔＩサイトに組み込み、軽鎖および重鎖両方の遺伝子を保持するプラスミドを作製した。このプラスミドをリポフェクトアミン２０００を用いて２９３ＦＴ細胞に形質導入し、一過性での抗体発現を行った。
　形質導入から７２時間後の細胞培養上清を採取し、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株との結合試験を（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。コントロールとしては抗体遺伝子未導入の２９３ＦＴ細胞の培養上清を、２次抗体としてはＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（アブカム社製）を使用した。図１３に結果を示す。親株Ｆｌｐ－Ｉｎ－ＣＨＯ細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株を黒の実線で示している。この結果より、培養上清中に分泌されたヒトキメラ型抗体ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ１４および２１は、ヒトＥＰ４に対する結合性を保持していることが確認された。
　これらの結果から、本発明により提供される抗体をコードする核酸配列を用いて、その機能を保持するリコンビナント抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト抗体等）の生産が可能であることが示された。
　本発明により提供される抗体は、ヒトＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の機能を特異的に抑制することから、ＥＰ４に関連する疾患の予防又は治療方法の提供や、該疾患の予防又は治療剤の開発において重要な役割を果たすことが期待される。

Claims (21)

  1. ＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４の機能を阻害する抗体又はその機能的断片。
  2. 　前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載の抗体又はその機能的断片。
  3. 　前記抗体が国際寄託受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４０２（ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ１４）、　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４０３（ＮＢＧ０１６－ｍＡｂ２１）のハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項２に記載の抗体又はその機能的断片。
  4. 　前記ＥＰ４の機能が、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることである、請求項１乃至３のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
  5. ＥＰ４の細胞外ドメインに特異的に結合し、その相補性決定領域１～３（ＣＤＲ１～３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のいずれかを満たすことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
    （Ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
    配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
    配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
    配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
    配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
    配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
    （Ｂ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
    配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
    配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
    配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
    配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
    配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
    （Ｃ）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
    配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
    配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
    配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
    配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
    配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
  6. ＥＰ４の細胞外ドメインに特異的に結合し、その重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列について、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかを満たすことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
    （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
    （ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
    （ｃ）配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
  7. ＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４の機能を阻害する抗体又はその機能的断片であって、請求項３乃至６のいずれかに記載の抗体と同一のエピトープに結合する、抗体又はその機能的断片。
  8. 　ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
  9. 　ヒト抗体であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
  10. 　抗体断片、一本鎖抗体、又はダイアボディであることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
  11. 　配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号４１、配列番号４２であらわされる請求項５又は６に記載の抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸。
  12. 　請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
  13. 　請求項１２に記載のベクターが導入された細胞。
  14. 　請求項１乃至１０のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を含む医薬組成物。
  15. 　ＥＰ４の機能異常によって発症及び/又は進展する疾患の予防あるいは治療に用いられる、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　治療対象疾患が、免疫疾患であることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 　治療対象疾患が、腫瘍であることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
  18. 　治療対象疾患が、疼痛であることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
  19. 　請求項１乃至１０のいずれかに記載の抗ＥＰ４抗体又はその機能的断片が担体に固定化されてなる抗体固定化担体。
  20. 　ＥＰ４発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＥＰ４発現細胞を除去するために用いられることを特徴とする請求項１９に記載の抗体固定化担体。
  21. 　請求項１乃至１０のいずれかに記載の抗ＥＰ４抗体を含む細胞表面上のＥＰ４発現量を測定するキット。
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