ES2361269T3

ES2361269T3 - Anticuerpos especificos de tgf beta 1.

Info

Publication number: ES2361269T3
Application number: ES06750860T
Authority: ES
Inventors: Julian Davies; Craig Duane Dickinson; Lihua Huang; Bryan Edward Jones; David Matthew Marquis; Scott William Rowlinson; Ying Tang; Peter Edward Vaillancourt; Jeffry Dean Watkins
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2005-04-22
Filing date: 2006-04-20
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2026-04-20
Also published as: JP5070200B2; BRPI0608376A2; WO2006116002A3; HRP20110334T1; CY1111518T1; SI1874818T1; EA200702278A1; KR20070114220A; CA2607448A1; NO20076003L; EA016038B1; IL186775A; ATE505489T1; EP1874818B1; AU2006240056B2; WO2006116002A2; DE602006021292D1; JP2008538564A; EP1874818A2; DK1874818T3

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo que neutraliza la proteína TGF-ß1 humana y tiene una K d de menos de 40pM para la TGF-ß1 humana, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en: i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 90 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 43; ii) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 92 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 42; iii) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 107 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 57; y iv) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 119 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 73.

Description

Campo de la invención

La invención se refiere en general a composiciones relacionadas con las proteínas TGF beta 1. En concreto, proporciona composiciones de unión purificadas y reactivos relacionados útiles, p.ej., en el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de trastornos de proliferación celular, autoinmunes/inflamatorios, cardiovasculares y fibróticos, y en la evaluación de los efectos de compuestos exógenos en la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de tales proteínas.

Antecedentes de la invención

El primer miembro de la superfamilia de los factores de crecimiento transformantes beta (TGF beta) polipeptídicos secretados, TGF beta 1, fue descubierto hace aproximadamente veinte años. Posteriormente, la familia ha crecido considerablemente y actualmente comprende más de treinta miembros en vertebrados y una docena más o menos de proteínas relacionadas estructural y funcionalmente de invertebrados, tales como gusanos y moscas (véase, p.ej.: Attisano y Lee–Hoeflich, 2001 Gen. Biol. 2, publicación 30101; Moustakas, et al., 2001 J. Cell Sci. 114:4359; Wrana, 2000 Cell 100:189). Los miembros de la familia de las TGF beta controlan muchas funciones celulares y su actividad es fundamental para regular numerosos procesos del desarrollo y homeostáticos. Los experimentos han revelado una ruta de señalización conservada de las TGF beta entre vertebrados, gusanos y moscas.

Un miembro de esta familia, TGF beta 1, está implicado en una variedad de procesos celulares, tales como, por ejemplo, la proliferación y la diferenciación celular, la migración, la diferenciación, la apoptosis, el desarrollo embrionario, la formación de la matriz extracelular, el desarrollo óseo, la cicatrización de heridas, la hematopoyesis y las respuestas inmunes e inflamatorias (véase, p.ej., Roberts, y Spom 1990, “Peptide Growth Factors and Their Receptors”, pp. 419–72, Springer–Verlag, Heidelberg, Alemania; Massagué, J. 1998 Annu. Rev. Biochem 67:753).

Además, los datos preclínicos y clínicos indican que TGF beta 1 contribuye de una manera fundamental en la deposición de las proteínas matriciales en la fibrosis intersticial, y está implicada en el inicio y la progresión de una serie de estados patológicos fibróticos asociados, incluyendo la fibrosis renal, que es común a todas las formas de enfermedad renal crónica (ERC). El grado de fibrosis renal coincide positivamente con la progresión hacia la insuficiencia renal crónica (IRC, también conocida como enfermedad renal en etapa terminal (ERET)) y puede conducir a la muerte, la diálisis crónica y el transplante renal.

TGF beta se relaciona con la IRC a través de diversos hechos complejos que afectan a la mayoría de las células del riñón (Bottinger, 2002, J. Am. Soc. Nephrol. 13:2600). Estos hechos producen en última instancia tanto fibrosis tubulointersticial como glomerulosclerosis, que conducen a la pérdida de la función del nefrón y, finalmente, a la insuficiencia renal crónica. De las tres isoformas de TGF beta, TGF beta 1 parece predominar en la mediación de la progresión de la enfermedad renal crónica, no sólo por ser la isoforma expresada con mayor predominancia, sino también porque tanto TGF beta 2 como TGF beta 3 parecen mediar sus efectos mediante la sobrerregulación de la expresión de TGF beta 1 (Yu, 2003, Kid. Int. 64, 844). Por consiguiente, para evitar los efectos perjudiciales de trastornos tales como la IRC, existe la necesidad de modular la expresión de TGF beta 1.

La publicación internacional n.º WO2005/010049 revela anticuerpos monoclonales específicos de TGF beta 1 y TGF beta 2 o TGF beta 3, y que neutralizan a TGF beta 1.

Por consiguiente, el descubrimiento de nuevas composiciones de unión a TGF beta 1 cubre la necesidad que existe en la técnica de proporcionar composiciones que sean útiles en el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de trastornos fibróticos, tales como la enfermedad renal crónica.

Resumen de la invención

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de composiciones de unión con mejores propiedades que se unen específica y/o selectivamente al TGF beta 1 maduro antes que al TGF beta 2 maduro y/o al TGF beta 3 maduro, y que neutralizan al TGF beta 1 maduro.

La presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo o un fragmento de unión antigénica del mismo según la reivindicación 1.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad fibrótica en un sujeto humano.

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La presente invención también proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad renal crónica en un sujeto humano.

La presente invención proporciona además un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo de la invención para su uso en una terapia de combinación para tratar una enfermedad fibrótica en un sujeto humano, en la que dicho anticuerpo o fragmento de unión antigénica del mismo se administra en combinación con un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ECA).

La presente invención también proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo de la invención para su uso en una terapia de combinación para tratar una enfermedad renal crónica en un sujeto humano, en la que dicho anticuerpo o fragmento de unión antigénica del mismo se administra en combinación con un inhibidor ECA.

La presente invención también proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

I. General

Se ha de entender que la presente invención no se limita a las composiciones, los procedimientos y las técnicas particulares descritos en la presente memoria, pues, como es obvio, tales composiciones, procedimientos y técnicas pueden variar. También se ha de entender que la terminología usada en la presente memoria sólo sirve para describir realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que sólo está limitado por las reivindicaciones anexas.

Como se usan en la presente memoria, incluyendo las reivindicaciones anexas, las formas de las palabras en singular “un”, “uno”, “una”, “el” y “la” incluyen, p.ej., sus correspondientes referentes en plural, a no ser que el contexto dicte claramente lo contrario. Así pues, por ejemplo, la referencia a “un organismo” incluye, p.ej., uno o más organismos diferentes, la referencia a “una célula” incluye, p.ej., una o más de tales células y la referencia a “un procedimiento” incluye, p.ej., la referencia a etapas y procedimientos equivalentes conocidos por el experto habitual en la técnica, etcétera.

A no ser que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado comúnmente entendido por cualquier experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque es posible usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria para poner en práctica o probar la invención, más adelante, se describen materiales y procedimientos adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias tratadas en la presente memoria se proporcionan únicamente para su revelación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente memoria ha de interpretarse como el reconocimiento de que la invención no merece anteceder a cualquier revelación en virtud de su invención anterior. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente memoria se incorporan por referencia en su totalidad para las enseñanzas para las que se citan (como lo dicta claramente el contexto), incluyendo todas las figuras, los dibujos, las imágenes, las gráficas, los hipervínculos y otras formas de código ejecutable de explorador.

II. Definiciones

Una “composición de unión” es una entidad molecular con afinidad de unión selectiva y/o específica por al menos alguna otra entidad molecular o pareja de unión. Comúnmente, la asociación se producirá en una interacción fisiológicamente relevante de manera natural, bien covalente o no covalentemente, y puede incluir miembros de un complejo de multiproteínas, incluyendo, sin limitación, compuestos vehículos, o parejas de dimerización o multimerización. Una composición de unión puede derivar de manera natural (p.ej., ser aislada y/o purificada) o ser producida sintéticamente, bien por completo o en parte. Comúnmente, una composición de unión tiene al menos una región, tal como, a modo de ejemplo no restrictivo, una superficie, una forma (tal como, p.ej., una cavidad, una hendidura, una grieta o una protuberancia), una disposición molecular o una configuración espacial que “se ajusta”, “se une” o es “complementaria” específica y/o selectivamente a una determinada organización espacial y/o polar de una zona o región de una pareja de unión. Así pues, por ejemplo, cuando una composición de unión se aproxima lo suficiente a una posible pareja de unión, la composición y la pareja de unión se unirán entre sí específica y/o selectivamente. Los ejemplos no restrictivos de una composición de unión emparejada con una pareja de unión incluyen: antígeno–anticuerpo y hapteno–sitio de unión. Los ejemplos no restrictivos de composiciones de unión de anticuerpo incluyen: anticuerpos, fragmentos divalentes, fragmentos trivalentes, fragmentos tetravalentes, minicuerpos, fragmentos Fab (incluyendo, tales como, p.ej., Fab diméricos o triméricos), fragmentos Fv, fragmentos scFv, fragmentos F(ab)2, etc. (véase, p.ej., Hudson y Souriau 2003 Nature Medicine 9:129–34 para ejemplos no restrictivos de las composiciones de unión de anticuerpo englobados por la invención). Una composición de unión de anticuerpo monoclonal es monoclonal en el sentido de que deriva de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea (i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son sustancialmente idénticos (p.ej., pueden proceder de un clon de un solo tipo de célula)). En cualquiera caso, esto no pretende limitarse a un determinado origen. Es posible producir fácilmente tal anticuerpo en células que, comúnmente, no producen anticuerpos, tales como células CHO, NSO o COS. Además, tal anticuerpo se puede producir en otros tipos de células, especialmente, en células de mamífero e incluso células vegetales, mediante el diseño genético de tales células para expresar y ensamblar las cadenas ligeras y pesadas de polipéptido que forman el anticuerpo producto. Además, tales cadenas pueden ser sintetizadas químicamente, pero como serían específicas de un factor determinante antigénico dado, seguirían constituyendo un anticuerpo “monoclonal” acorde al sentido con el que se usa el término en la presente memoria. Así pues, como se usa en la presente memoria, la expresión “anticuerpo monoclonal” pretende denotar más la especificidad y pureza de las moléculas de anticuerpo que el mero mecanismo usado para la producción de tales anticuerpos.

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Un “sitio de unión” es una región, zona o configuración específica de una entidad molecular que toma parte en la unión específica y/o selectiva con otra entidad molecular. Un ejemplo no restrictivo de sitio de unión es la secuencia de aminoácidos contiguos que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo. En una realización, un sitio de unión de la invención comprende una secuencia que tiene la fórmula mostrada en la Tabla 1. En otra realización no restrictiva, un sitio de unión comprende una combinación de las secuencias de la Tabla 1. Otro ejemplo no restrictivo es un sitio de unión formado a partir de la configuración tridimensional y la organización espacial de las secuencias de aminoácidos que comprenden los seis bucles de CDR de las cadenas variables pesadas y ligeras del borde del barril beta de ocho cadenas de un fragmento Fab (Chothia y Lesk, 1987 J. Mol. Biol. 196:901–17). Es posible incorporar/insertar una CDR revelada de la invención en un marco

o una estructura molecular, tal como, por ejemplo, como se hace en el injerto de CDR. En una realización, la estructura para portar una CDR de la invención será generalmente de una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo, o una parte sustancial de la misma, en la que la CDR se localiza en una ubicación correspondiente a la CDR de los dominios variables de anticuerpo VH y VL naturales codificados por genes de inmunoglobulina reorganizados. Las estructuras y las ubicaciones de los dominios inmunoglobulina variables se pueden determinar por referencia a (Kabat, et al., 1987 “Sequences of Proteins of Immunological Interest”. IV Ed. Departamento Estadounidense de Sanidad y Servicios Sociales, y sus actualizaciones, ahora disponible en Internet (http://immuno.bme.nwu.edu)). Las CDR son, en general, como las define Kabat, pero también es posible servirse de las definiciones de Chothia (J. Mol. Biol. 196:901–17) y/o MacCallum (J. Mol. Biol. 262:732–45). Los expertos en la técnica pueden determinar automáticamente qué residuos comprenden una determinada CDR dada la secuencia de aminoácidos de la región variable en la que está insertada. Además, en los residuos de un injerto de CDR del bucle adyacente definido por Chothia, es posible injertar la CDR1 de VH de Kabat.

En una realización, se pueden introducir las secuencias de CDR de la invención en un repertorio de dominios variables que carecen de regiones CDR usando una tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, Marks et al. (1992 BioTechnology 10:779–83) describen procedimientos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpo en los que se usan cebadores de consenso dirigidos hacia o adyacentes al extremo 5' de la zona del dominio variable en combinación con los cebadores de consenso con respecto a la tercera región marco de los genes de VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables de VH que carezcan de una CDR3. Marks et al. también describen cómo se puede combinar este repertorio con una CDR3 de un determinado anticuerpo (tal como el según lo descrito en la presente memoria). Usando técnicas análogas, se pueden mezclar las secuencias de CDR3 de la presente invención con repertorios de dominios VH o VL que carezcan de una CDR3, y combinar los dominios VH o VL completos mezclados con un dominio VL o VH afín para proporcionar miembros específicos de la composición de unión de la invención. Alternativamente, es posible combinar las secuencias de CDR3 con otras CDR de la invención usando una estrategia similar. Luego se puede exponer el repertorio en un sistema huésped adecuado tal como el sistema de despliegue en fagos de W092/01047, de manera que sea posible seleccionar miembros de unión específicos adecuados.

Complejo de composición de unión:TGF beta 1

La expresión “Complejo de composición de unión:TGF beta 1”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un complejo de una composición de unión y una proteína TGF beta 1 formado mediante la unión específica y/o selectiva de la composición de unión con una proteína TGF beta 1. En una realización preferida, la TGF beta 1 a la que se hace referencia a lo largo de la misma es una proteína TGF beta 1 “madura” de primate. En una realización más preferida, la TGF beta 1 a la que se hace referencia a lo largo de la misma es una proteína TGF beta 1 madura humana (véase, p.ej., n.º de acceso del NCBI: P01137, que describe la secuencia de aminoácidos del precursor del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF beta 1) humano y su parte madura). En cualquier caso, la TGF beta 1 a la que se hace referencia es TGF beta 1 en su forma madura biológicamente activa [(la TGF beta 1 es liberada de las células en forma de un complejo “latente” inactivo que comprende un homodímero de TGF beta 1 en un complejo no covalente con dos prosegmentos, a los que a menudo se encuentra unida una de varias proteínas de unión TGF beta 1 latentes (véase, p.ej., Annes, et al., 2003 J. Cell Science 116:217–24; Miyazono, et al., 1993 “Growth Factors” 8:11–22; Munger, et al. 1997 Kidney Int. 51:1376–82; Oklu y Hesketh 2000 Biochem. J. 352: 601– 10). Este complejo de TGF beta 1 latente representa una importante salvaguarda contra la activación “involuntaria” y puede estabilizar y dirigir la TGF beta 1 latente a la matriz extracelular, donde es secuestrada (Taipale, et al. 1998 Adv. Cancer Res. 75:87–134). La matriz extracelular actúa, por tanto, como depósito desde el que se puede activar fácilmente la TGF beta 1 sin la necesidad de nuevas síntesis celulares. La secreción de TGF beta 1 como un complejo latente necesita la existencia de un proceso de activación regulado, que lo más probable es que esté mediado por las actividades de las proteasas que degradan de forma preferente los prosegmentos de TGF beta 1 y liberan de ese modo la forma dimérica de TGF beta 1 activa madura altamente estable.)]

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La unión específica de la composición de unión significa que la composición de unión tiene un sitio de unión que reconoce una región de TGF beta 1, comúnmente, en su configuración activa nativa. Por ejemplo, los anticuerpos producidos hacia una TGF beta 1 y que reconocen un epítopo de TGF beta 1 son capaces de formar un complejo de composición de unión:TGF beta 1 mediante unión específica. Comúnmente, la formación de un complejo de composición de unión:proteína TGF beta 1 permite la medición de TGF beta 1 en una muestra biológica, p.ej., una mezcla con otras proteínas o sustancias biológicas. Es posible determinar un epítopo de una composición de unión de la invención usando técnicas descritas en la presente memoria o en la técnica (véase, p.ej., G. Tribbick, 2002 “Journal of Immunological Methods” 267:27–35; Woods y Hamuro 2001 “Journal of Cellular Biochemistry Supplement” 37:89–98) y/o como se determina mediante la unión competitiva según lo descrito en la presente memoria. En una realización preferida, un epítopo de una composición de unión de la invención comprende los residuos de aminoácido YYVGRK de la SEC ID N.º: 1; en otra realización, un epítopo de una composición de unión de la invención comprende los residuos de aminoácido YYVGRK de SEC ID N.º 1 y YSKV de SEC ID N.º 1; en otra realización más, un epítopo de una composición de unión de la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos (contiguos o no contiguos) de YYVGRK de SEC ID N.º 1 y/o al menos 1, 2, 3 ó 4 residuos (contiguos o no contiguos) de YSKV de SEC ID N.º 1 (tal realización se engloba de manera que incluye cualquiera o todas las combinaciones de la misma, tales como, p.ej., sin limitación: YYVGRK y KV de SEC ID N.º 1; o YVGRK e Y y KV de SEC ID N.º 1 (pudiéndose obtener la totalidad de tales combinaciones usando simplemente un algoritmo ejecutable por ordenador y fórmulas matemáticas para permutaciones y combinaciones ampliamente conocidas). En otra realización preferida más, se define funcionalmente un epítopo de la invención, por ejemplo, por la capacidad de una composición de unión de la invención para evitar la formación de un posterior complejo de unión mediante la competición de las composiciones de unión por el mismo antígeno, tal como, p.ej., TGF beta 1 (tal unión competitiva se describe en la presente memoria).

La expresión “unión específica”, como se usa en la presente memoria, se refiere a la situación en la que un miembro de una pareja de unión específica no mostrará una unión significativa con las moléculas que no sean su(s) pareja(s) de unión específica(s). La expresión también es aplicable cuando, p.ej., un dominio de unión antigénica es específico de un determinado epítopo que es portado por una serie de antígenos, en cuyo caso el miembro de unión específico que porta el dominio de unión antigénica será capaz de unirse a los diversos antígenos que portan el epítopo. Por consiguiente, una composición de unión específica de la proteína TGF beta 1 madura “no mostrará una unión significativa con las moléculas que no sean su(s) pareja(s) de unión específica(s)”, es decir, que no sean la TGF beta 1 madura.

Las expresiones “se une específicamente” o “específicamente inmunorreactiva con”, con respecto a una composición de unión, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la composición de unión en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros componentes biológicos. Por lo tanto, en determinadas condiciones de inmunoanálisis, la composición de unión específica se une con una proteína específica y no se une significativamente con otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica con una composición de unión en tales condiciones puede requerir una composición de unión que se seleccione por su especificidad por una determinada proteína. Por ejemplo, se puede producir una composición de unión, tal como un anticuerpo, contra una forma dimérica activa humana de TGF beta 1, cuyo monómero de secuencia de aminoácidos maduro está representado en la SEC ID N.º 1, y seleccionarlo posteriormente para obtener anticuerpos específicamente inmunorreactivo con la proteína TGF beta 1 y no con otras proteínas. Tal composición de unión podría diferenciar proteínas muy homólogas a la proteína TGF beta 1 humana, tales como, por ejemplo, otras isoformas de TGF beta humanas (p.ej., tales como la TGF beta 2 humana o la TGF beta 3 humana). En una realización preferida, la especificidad de una composición de unión de la invención por la TGF beta 1 madura es 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500, 8.0008.500, 9.000, 9.500 o 10.000 veces mayor o igual que su especificidad por la TGF beta 2 madura y/o la TGF beta 3 madura. En otra realización preferida, la especificidad de una composición de la invención puede tener un valor de especificidad particular por la TGF beta 2 humana de la lista anterior y un valor de especificidad diferente por TGF beta 3 humana, tal como, por ejemplo, una especificidad por la TGF beta 1 madura que sea igual

o 100 veces superior a su especificidad por la TGF beta 2 madura, e igual o 900 veces superior en su especificidad por la TGF beta 3 madura. Se engloba cualquiera de tales combinaciones.

Una composición de unión de la invención neutraliza preferiblemente a TGF beta 1 y tiene una constante de disociación (Kd) para TGF beta 1 preferiblemente de menos de aproximadamente: 40pM, 35pM, 30pM, 25pM, 20pM, 15pM, 14pM, 13pM, 12pM, 11pM o 10pM; más preferiblemente, menos de aproximadamente: 10pM, 9,9pM, 9,8pM, 9,7pM, 9,6pM, 9,5pM, 9,4pM, 9,3pM, 9,2pM, 9,1pM 9,0pM, 8,9pM, 8,8pM, 8,7pM, 8,6pM, 8,5pM, 8,4pM, 8,3pM, 8,2pM, 8,1pM 8,0pM, 7,9pM, 7,8pM, 7,7pM, 7,6pM, 7,5pM, 7,4pM, 7,3pM, 7,2pM, 7,1pM 7,0pM, 6,9pM, 6,8pM, 6,7pM, 6,6pM, 6,5pM, 6,4pM, 6,3pM, 6,2pM, 6,1pM, 6,0pM, 5,9pM, 5,8pM, 5,7pM, 5,6pM, 5,5pM, 5,4pM, 5,3pM, 5,2pM, 5,1pM o 5,0pM; incluso más preferiblemente, de menos de aproximadamente 5,0pM, 4,9pM, 4,8pM, 4,7pM, 4,6pM, 4,5pM, 4,4pM, 4,3pM, 4,2pM, 4,1pM 4,0pM, 3,9pM, 3,8pM, 3,7pM, 3,6pM, 3,5pM, 3,4pM, 3,3pM, 3,2pM, 3,1pM 3,0pM 2,9pM, 2,8pM, 2,7pM, 2,6pM, 2,5pM, 2:4pM, 2,3pM, 2,2pM, 2,1pM 2,0pM, 1,9pM, 1,8pom, 1,7pM, 1,6pM, 1,5pM, 1,4pM, 1,3pM, 1,2pM, 1,1pM, 1,0pM; e incluso mucho más preferiblemente, de 9,9pM, 9,8pM, 9,7pM, 9,6pM, 9,5pM, 9,4pM, 9,3pM, 9,2pM, 9,1pM 9,0pM, 8,9pM, 8,8pM, 8,7pM, 8,6pM, 8,5pM, 8,4pM, 8,3pM, 8,2pM, 8,1pM 8,0pM, 7,9pM, 7,8pM, 7,7pM, 7,6pM, 7,5pM, 7,4pM, 7,3pM, 7,2pM, 7,1pM 7,0pM, 6,9pM, 6,8pM, 6,7pM, 6,6pM, 6,5pM, 6,4pM, 6,3pM, 6,2pM, 6,1pM, 6,0pM, 5,9pM, 5,8pM, 5,7pM, 5,6pM, 5,5pM, 5,4pM, 5,3pM, 5,2pM, 5,1pM, 5,0pM, 5,0nM, 4,9pM, 4,8pM, 4,7pM, 4,6pM, 4,5pM, 4,4pM, 4,3pM, 4,2pM, 4,1 pM 4,0pM, 3,9pM, 3,8pM, 3,7pM, 3,6pM, 3,5pM, 3,4pM, 3,3pM, 3,2pM, 3,1pM 3,0pM 2,9pM, 2,8pM, 2,7pM, 2,6pM, 2,5pM, 2,4pM, 2,3pM, 2,2pM, 2,1pM 2,0pM, 1,9pM, 1,8pM, 1,7pM, 1,6pM, 1,5pM, 1,4pM, 1,3pM, 1,2pM, 1,1pM, 1,0pM, 0,9pM, 0,8pM, 0,7pM, 0,6pM, 0,5pM, 0,4pM, 0,3pM, 0,2pM, 0,1pM o 0,01pM. Es posible determinar la constante de disociación (Kd) de una composición de unión usando cualquier procedimiento de la técnica, por ejemplo, mediante el BIACore™, adaptando del procedimiento de Karlsson et al., 1991 J. Immunol. Methods 145, 299–340. Para otras descripciones, véase Jonsson, et al. 1993 Ann. Biol. Clin. 51:19–26; Jonsson, et al. 1991 Biotechniques 11:620–7; Johnsson, et al. 1995 J. Mol. Recognit. 8:125–31; y Johnnson, et al. 1991 Anal. Biochem. 198:268–77.

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El término “kon”, como se usa en la presente memoria, pretende referirse a la constante de velocidad de asociación u on, o velocidad de reacción específica, de una reacción directa o formadora de complejos, medida en unidades: M– 1sec–1. El término “koff”, como se usa en la presente memoria, pretende referirse a la constante de velocidad de disociación u off, o velocidad de reacción específica, para la disociación de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno, medido en unidades: 1/segundo. El término “Kd”, como se usa en la presente memoria, pretende referirse a la constante de disociación de una determinada interacción de anticuerpo–antígeno. Se calcula mediante la fórmula: koff/kon = Kd. La afinidad de una composición de unión a menudo coincide con una Koff inferior, más que con una kon superior; sin embargo, sin quedar vinculados a la teoría, se engloban ambas realizaciones, la de mejor koff y la de mejor kon. En una realización más preferida, las composiciones de unión de la presente invención son anticuerpos de alta potencia, o fragmentos de los mismos, que presentan generalmente valores bajos de koff. En una realización todavía más preferible, la velocidad kon de una realización de Fab de la invención es al menos 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,1; 2,2; 2,3 ó 2,4 veces mejor que la velocidad kon mejorada de un Fab comparable, tal como, p.ej., el Acm2471 descrito en la publicación internacional n.º W02005/010049. En otra realización, una composición de la invención tiene una velocidad koff mejorada que es al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 130, 150, 195, 200, 225, 250, 260, 270, 280, 290 o 300 veces mejor que una composición de unión comparable (p.ej., tal como un Fab o Acm).

Preferiblemente, una composición de unión de anticuerpo se une específica y/o selectivamente a TGF beta 1 en comparación con TGF beta 2 y/o TGF beta 3; más preferiblemente, una composición de unión de anticuerpo se une específica y/o selectivamente a TGF beta 1 humana en comparación con la TGF beta 2 humana y/o TGF beta 3 humana. Preferiblemente, tal anticuerpo tiene una reactividad cruzada menor del aproximadamente 20% con TGF beta 2 y/o TGF beta 3 (medida mediante la proporción entre las constantes de disociación), más preferiblemente, una reactividad cruzada menor del aproximadamente 15%, e incluso más preferiblemente, una reactividad cruzada menor del aproximadamente 10%; y todavía más preferiblemente, una reactividad cruzada menor del aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1%.

Además, una composición de unión de anticuerpo reconoce preferiblemente la forma activa y no la forma latente de TGF beta 1; más preferiblemente, la forma activa, pero no la forma latente de la TGF beta 1 humana.

Neutralización

El término “neutralizar” o “antagonizar” con respecto a una composición de unión se refiere a la situación en la que la unión específica y/o selectiva de una composición de unión con otra entidad molecular da como resultado la abrogación o inhibición de la función efectora biológica de la entidad molecular unida por la composición de unión. Con respecto a TGF beta 1, el término “neutralizar” o “antagonizar” pretende referirse a una composición de unión cuya unión o interacción con TGF beta 1 da como resultado la inhibición de una actividad biológica inducida por TGF beta 1. Es posible medir la inhibición de la actividad biológica de TGF beta 1 midiendo uno o más indicadores in vitro

o in vivo de la actividad biológica de TGF beta 1, incluyendo, por ejemplo, sin limitación, la inhibición de la unión a receptores, la inhibición de la fibrosis, la inhibición de la quimiotaxis o la inhibición de la transducción de señales en un ensayo de unión de TGF beta 1 (véase, p.ej., EP 0 945 464 para consultar ejemplos no restrictivos de los análisis de neutralización englobados). En una realización no restrictiva, se evalúa la capacidad de una composición de unión para neutralizar o antagonizar la actividad de TGF beta 1 mediante el uso del análisis descrito en un ejemplo de la presente memoria.

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La actividad neutralizante de una composición de unión, tal como, por ejemplo, una realización de anticuerpo se puede analizar mediante un procedimiento aceptado por la técnica. En un ejemplo no restrictivo, se lleva a cabo la prueba mediante la adopción/modificación del análisis de las TGF de Randall et al (1993) J. Immunol Methods 164, 61–67. Este análisis se basa en la capacidad de TGF beta 1 y TGF beta 2 para inhibir la proliferación inducida por la interleucina 5 (IL–5) de la línea celular de eritroleucemia TF1 y en la capacidad de invertir la inhibición de las TGF beta con composiciones de unión específicas de las TGF beta. El análisis se presenta como un ensayo rápido, reproducible y sensible a menos de 500 fg/ml de TGF beta 1 y 5–10 pg/ml de TGF beta 2. El análisis también se presenta como de 100–1.000 veces menos sensible a otras moléculas inhibidoras, tales como interferón beta, interferón gamma y TNF alfa. El análisis también se presenta como un ensayo capaz de hacerse específico de TGF beta 1 o TGF beta 2 mediante la inclusión de anticuerpos neutralizantes específicos de TGF beta 1 o TGF beta 2, y de reconocer todas las especies moleculares recombinantes fácilmente disponibles de estas moléculas, así como las proteínas naturales producidas por plaquetas humanas y bovinas, y de detectar los TFG beta en muestras de suero.

También se engloban otros ensayos presentados en la presente memoria o conocidos en la técnica. Por ejemplo, el modelo anti–Thy1.1 para ratas es un modelo ampliamente establecido de glomerulonefritis mesangioproliferativa (véase, p.ej., Morita, et al., 1998 Am. J. Kidney Dis 31:559–73; Bagchus, et al., 1986 Lab. Invest. 55:680–7 y Yamamoto y Wilson 1987 Kidney Int. 32:514–25) en el que la inyección de un anticuerpo dirigido contra el antígeno Thy ubicado sobre la superficie de células mesangiales induce la mesangiolisis seguida de una fase de sobreproliferación compensatoria de células mesangiales que produce niveles elevados de proteína urinaria (proteinuria). El modelo de nefritis anti–Thy1.1 se asemeja a la nefritis de IgA humana o a la púrpura de Henoch– Schonlein en muchos aspectos (O’Donoghue, et al., 1991 J Clin Invest 88:1522–30) y se ha usado para analizar enfoques potencialmente terapéuticos de la enfermedad renal mediante la determinación de la capacidad de las composiciones de prueba para efectuar disminuciones relacionadas con la dosis de la proteinuria (véase, p.ej., Burg, et al., 1997 Lab Invest 76:505–16; Johnson, et al., 1995 Kidney Int 47:62–9). En una realización preferida, una composición de unión de la invención disminuye la proteinuria en tal modelo en más del o igual al 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% o 80%. Además se engloban realizaciones que tienen un intervalo de proteinuria disminuida (en tal modelo) de entre dos valores cualquiera de los indicados, intervalo que puede o no incluir cualquiera o ambos valores numéricos inicial y final (p.ej., un intervalo >12% y ≤42%).

Además, es posible adoptar bien el ensayo del modelo de ratones diabéticos db/db de Sharma (véase, p.ej., 2000 PNAS 97:8015–20), que demuestra que la inhibición crónica de las acciones biológicas de TGF beta en el riñón previene eficazmente la insuficiencia renal debida a la diabetes u.c., o es posible adoptar el modelo de ratones diabéticos STZ de Sharma (1996, “Diabetes” 45, 522–30) para analizar la capacidad de una composición de unión para mejorar o prevenir la nefropatía diabética. Además, Ueberham et al., 2003 “Hepatology” 37(5):1067–78, describen un sistema de expresión de genes regulado por la tetraciclina en un modelo de ratones doble transgénico de fibrosis hepática, en el que se regula la expresión de TGF beta 1 mediante la adición o la eliminación de clorhidrato de doxiciclina a o del agua potable, permitiendo así activar o desactivar la expresión de TGF beta 1 a voluntad. El aumento de la expresión de TGF beta 1 en el hígado de tales animales conduce a estados patológicos fibróticos que son reversibles mediante la desactivación de la expresión de TGF beta 1, incluso tras haberse reducido la masa de hígado un 59%. El uso de este modelo permite la evaluación de los efectos de las composiciones de unión de la invención sobre la inhibición de las funciones biológicas de TGF beta 1 mediante la comparación de una composición de unión de la invención con los efectos de la desactivación con clorhidrato de doxiciclina de la expresión de TGF beta 1. En una realización particular en la que se usa un ensayo de proliferación de células HT–2 (según lo descrito en la presente memoria), los solicitantes engloban preferiblemente las realizaciones de las composiciones de unión con una CI50 ≥ al menos: 50, 60, 70, 80, 90, 100, 105, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425 ó 450 veces mejor que el valor CI50 obtenido usando una composición de unión similar tal como, por ejemplo, Acm2471 (descrita en la publicación internacional n.º WO2005/010049) en condiciones de análisis iguales o similares. También se engloban realizaciones que tienen un intervalo de mejora de la CI50 (según lo definido anteriormente) de dos de tales valores que puede incluir o no cualquiera o ambos puntos inicial y final (p.ej., una mejora de la CI50 en el intervalo de >80 y ≤100 veces mejor que, p.ej., el Acm2471).

Anticuerpos

Las composiciones de unión de anticuerpo de la invención incluyen, p.ej., sin limitación, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), fragmentos producidos por un banco de expresión de Fab, anticuerpos anti–idiotípico (anti–Id) (incluyendo, p.ej., anticuerpos anti–Id contra los anticuerpos de la invención) y un fragmento de unión con epítopos de cualquiera de los anteriores.

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El término “anticuerpo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a composiciones de inmunoglobulina y a partes inmunológicamente activas de composiciones de inmunoglobulina, p.ej., a una molécula de la composición de unión que contiene un sitio de unión que se une específica y/o selectivamente a un antígeno. Una composición de inmunoglobulina de la invención puede ser de cualquier tipo (p.ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgA), clase (p.ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Preferiblemente, un anticuerpo es un fragmento de unión antigénica de un anticuerpo humano de la invención, tal como, p.ej., sin limitación, Fab, Fab' y F(ab’)2, Fc, fragmentos Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, Fv unidos mediante disulfuros (sdFv) y fragmentos que comprenden bien un dominio VL o VH. Los fragmentos de unión antigénica de anticuerpos, que incluyen anticuerpos monocatenarios, pueden comprender la(s) región(es) variable(s) solas o en combinación con la totalidad o una parte de los siguientes: una región bisagra, un dominio CH1, CH2 o CH3, o combinaciones de los mismos. También se incluyen en la invención, sin limitación, p.ej., un fragmento de unión antigénica que también puede comprender cualquier combinación de la(s) región(es) variable(s) con una región bisagra, p.ej., tal como un dominio CH1, CH2 o CH3, o combinaciones de los mismos. Un anticuerpo de la invención puede ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son humanos, de primate, murinos (p.ej., de ratón y rata), de asno, de conejo, de cabra, de cobaya, de camello, de caballo o de pollo.

Como se usa en la presente memoria, la expresión “anticuerpos humanos” incluye, p.ej., sin limitación, anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, incluyendo, p. ej. sin limitación, un anticuerpo aislado de un banco de inmunoglobulinas humanas (tal como, p.ej., un banco de línea germinal humana)

o de un animal transgénico para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresa inmunoglobulinas endógenas, según lo descrito en la presente memoria o como se muestra, p.ej., en la patente estadounidense n.º

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Una composición de unión puede ser monoespecífica, biespecífica, triespecífica o tener una multiespecificidad superior. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos de epítopos diferentes de una proteína diana, polipéptido (o fragmento del mismo), o pueden ser específicos tanto de una proteína TGF beta 1 como de un epítopo heterólogo, tal como una isoforma de TGF beta heteróloga o un material de soporte sólido (véase, p.ej., WO2093/17715; WO92/08802; WO91/00360; WO92/05793; Tutt, et al. (1991) J. Immunol. 147:60–69; patentes estadounidenses n.º 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; o 5.601.819; o Kostelny, et al. (1992) J. Immunol. 148:1547–1553.

Se puede describir una composición de unión o especificarla en términos de uno o varios epítopos, o una o varias partes de una proteína TGF beta 1 (o fragmento de la misma) que ésta reconozca o se una selectiva y/o específicamente. Se pueden especificar uno o varios epítopos, o una o varias partes de polipéptido según lo descrito en la presente memoria, p.ej., por las posiciones N–terminales y C–terminales, por el tamaño de los residuos de aminoácido contiguos o según se enumeren en la tabla y/o la figura anexas, o se describan en la presente memoria. Además, también se puede excluir específicamente de la presente invención un anticuerpo que se una específicamente a un epítopo, polipéptido, proteína o fragmento de polipéptido o de proteína. Por ejemplo, los solicitantes anulan el derecho de estipular cualquier anticuerpo que se una específicamente a un epítopo, polipéptido, proteína o fragmento de polipéptido o de proteína. Por consiguiente, la invención puede englobar un primer (u otro) anticuerpo que se una específicamente a un polipéptido o una proteína, o fragmento de los mismos) y, al mismo tiempo, puede excluir un segundo (u otro) anticuerpo que también se pueda unir selectivamente a la misma proteína o al mismo polipéptido, o un fragmento de los mismos, p.ej., mediante la unión a un epítopo diferente. En una realización preferida, los solicitantes estipulan una composición de unión que se une específica y/o selectivamente a la isoforma TGF beta 1 frente a TGF beta 2 y/o TGF beta 3, y que neutraliza a TGF beta 1 que comprende al menos un sitio de unión que comprende al menos: cuatro aminoácidos contiguos de QQWNGNPPA [SEC ID N.º 126]; al menos seis aminoácidos contiguos de QQWDSNPPA [SEC ID N.º 127]; al menos cinco aminoácidos contiguos de YIYPYNGDTGYNQKFKS [SEC ID N.º 128] (en la que uno de dichos al menos cinco aminoácidos contiguos es D); o al menos cinco aminoácidos contiguos de GYTFTDYTMH [SEC ID N.º 129].

Los anticuerpos de la invención también se pueden describir o especificar en términos de su reactividad cruzada. Se incluyen los anticuerpos que no se unen a ningún otro análogo, ortólogo, parálogo u homólogo de una proteína diana, polipéptido (o fragmento de los mismos).

También se puede caracterizar o especificar una composición de unión en términos de su afinidad de unión por una proteína o un polipéptido (un fragmento de los mismos) o un epítopo. En otra realización, una afinidad de unión preferida de una composición de unión, p.ej., un anticuerpo o un fragmento de unión de un anticuerpo, incluye, p.ej., una afinidad de unión (usando un ensayo descrito en la presente memoria) que demuestra una constante de disociación o Kd de menos de (o en el intervalo entre dos números definidos a continuación, intervalo que puede o no incluir cualquiera o ambos puntos inicial y final): 10–11M, 5 x 10–12 M, 4,9 x 10–12 M, 4,8 x 10–12M, 4,7 x 10–12M, 4,6 x 10–12M, 4,5 x 10–12M, 4,4 x 10–12M, 4,3 x 10–12M, 4,2 x 10–12M, 4,1 x 10–12M, 4,0 x 10–12M, 3,9 x 10–12M, 3,8 x 10–12M, 3,7 x 10–12M, 3,6 x 10–12M, 3,5 x 10–12M, 3,4 x 10–12M, 3,3 x 10–12M 3,2x 10–12M, 3,1 x 10–12M, 3,0 x 10–12M, 2,9 x 10– 12M , 2,8 x 10–12 M, 2,7 x 10–12M, 2,6 x 10–12M, 2,5 x 10–12M, 2,4 x 10–12M, 2,3 x 10–12M, 2,2 x 10–12M, 2,1 x 10–12M, 2,0 x 10–12M, 1,9 x 10–12M, 1,8 x 10–12M, 1,7 x 10–12M, 1,6 x 10–12M, 1,5 x 10–12M, 1,4 x 10–12M, 1,3 x 10–12M, 1,2 x 10–12M, 1,1 x 10–12M, 1,0 x 10–12M, 0,9 x 10–12M, 0,8 x 10–12M, 0,7 x 10–12M, 0,6 x 10–12M, 0,5 x 10–12M, 0,4 x 10–12M, 0,3 x 10–12M, 0,2 x 10–12M, 0,1 x 10–12M, 10–12M, 5 x 10–13M, 10–13M, 5 x 10–14M, 10–14M, 5 x 10–15M o 10–15M.

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Los anticuerpos de la invención pueden actuar como antagonistas de TGF beta 1 (o uno de sus fragmentos). Por ejemplo, un anticuerpo o una composición de unión de la invención puede interrumpir, p. ej., una interacción, bien parcial o completamente, de TGF beta 1 con un receptor/ligando afín. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se unen con un epítopo antigénico de TGF beta 1 o una de sus partes.

Asimismo, la invención engloba anticuerpos que se unen a un ligando y evitan la unión a un receptor (p.ej., mediante hidrancia estérica). De igual manera, se engloban anticuerpos de unión a ligandos que inhiben la activación de receptores sin inhibir la unión de los receptores.

Los anticuerpos de la invención se pueden usar, p.ej., sin limitación, para purificar, detectar o dirigir una proteína TGF beta 1 (o un fragmento de la misma) para, p.ej., procedimientos de diagnóstico y terapéuticos in vitro y/o in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmunoensayos para medir cualitativa y/o cuantitativamente niveles de TGF beta 1 (o fragmentos de la misma) de la invención en una muestra biológica (véase, p.ej., Harlow y Lane, “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999).

Las composiciones de unión se pueden usar bien solas o en combinación con otras composiciones. Además, es posible fusionar recombinantemente una composición de unión, tal como un anticuerpo, con un polipéptido heterólogo en el terminal N o C, o conjugarla químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con un polipéptido u otras composiciones. Por ejemplo, es posible fusionar recombinantemente o conjugar los anticuerpos de la invención a moléculas útiles como marcadores en análisis de detección y moléculas efectoras, tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionucleidos o toxinas (véase, p.ej., WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; patente estadounidense n.º 5.314.995; y EP 396.387).

Una composición de unión incluye, p. ej., derivados que son modificados, p. ej., mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula con, p. ej., un anticuerpo, de modo que la unión covalente no evite que el anticuerpo genere una respuesta anti–idiotípica. Por ejemplo, un derivado de anticuerpo incluye, sin limitación, anticuerpos modificados, p. ej., mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, amidación, derivación mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, unión con un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas, incluyendo, p.ej., pero sin limitarse a, la escisión química específica, la acetilación, la formulación, la síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Las composiciones de unión se pueden generar mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, es posible preparar anticuerpos monoclonales usando cualquier tecnología conocida en la técnica, tal como, p.ej., Harlow y Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Harlow y Lane, “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); Breitling y Dübel 1999 “Recombinant Antibodies” (John Wiley & Sons, Nueva York); H. Zola, “Monoclonal Antibodies” (Garland Press); y James W. Goding, “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice” (Academic Press).

La expresión “anticuerpo monoclonal”, como se usa en la presente memoria, no se limita a anticuerpos producidos por una determinada técnica (p.ej., tecnología de hibridomas). Los procedimientos para producir y rastrear anticuerpos específicos usando una tecnología de hibridomas son habituales y conocidos en la técnica. La expresión “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo derivado de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no al procedimiento mediante el cual se produce.

Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos se pueden generar mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, es posible producir fragmentos Fab y F(ab’)2 de la invención mediante la escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab’)2). Los fragmentos F(ab’)2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena ligera. Por ejemplo, también se puede generar una composición de unión usando diversos procedimientos de despliegue en fagos conocidos en la técnica en los que se despliegan dominios de anticuerpos funcionales sobre la superficie de partículas de fago que portan una secuencia de polinucleótidos que los codifican.

En una realización particular, se usa un procedimiento de despliegue en fagos para desplegar dominios de unión antigénica expresados de un repertorio o un banco de anticuerpos combinatorio (p.ej., humano o murino). Es posible seleccionar o identificar el fago que expresa un dominio de unión antigénica que se une a un antígeno de interés con un antígeno, p.ej., usando un antígeno marcado o un antígeno unido a o capturado en una superficie sólida o una perla. Tras la selección del fago, se aíslan las regiones codificantes de anticuerpos de un fago y se usan para

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generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión antigénica deseado, y se expresan en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levadura y bacterias, p.ej., según lo descrito en la presente memoria o en la bibliografía.

También se pueden emplear técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab’)2 usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como, p.ej., WO 92/122324; Mullinax, et al., BioTechniques 1992 12(6):864–9; y Sawai, et al., 1995 AJRI 34:26–34; y Better, et al., 1988 Science 240:1041–3. Los ejemplos de producción de anticuerpos y Fv monocatenarios incluyen, p.ej., las patentes estadounidenses n.º 4.946.778 y 5.258.498; Huston, et al., 1991 Methods in Enzymology 203:46–88; Shu, et al., 1993 PNAS EE.UU. 90:7995–9; y Skerra, et al., 1988 Science 240: 1038–40. Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y los ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos humanizados o humanos producidos mediante tecnologías conocidas en la técnica.

Los anticuerpos humanizados de la presente memoria son composiciones de unión que se unen con un antígeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) según lo descrito en la presente memoria insertadas en la región marco que tiene menor tendencia a crear una reacción de inmunogenicidad perjudicial tras su introducción in vivo en un sistema huésped humano (p.ej., tras una administración parenteral). A menudo, las regiones donantes CDR son apropiadamente introducidas en regiones marco humanas para mejorar la unión antigénica y/o reducir la inmunogenicidad. Es posible identificar regiones marco útiles usando procedimientos conocidos en la técnica, p.ej., mediante (1) el modelado de las interacciones de una CDR con los residuos del marco para identificar los residuos del marco importantes para la unión antigénica; (2) mediante la comparación de secuencias para identificar residuos marco no habituales en determinadas posiciones (véase, p.ej., la patente estadounidense n.º 5.585.089; Riechmann, et al., Nature 332:323 (1988); o (3) empíricamente.

En la siguiente Tabla 1 (a y b) se muestran regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera variable de determinadas realizaciones de la composición de unión de anticuerpo monoclonal de la invención. Las regiones CDR se indican usando el código de una sola letra de aminoácido estándar y la numeración de CDR estándar (i.e., haciendo corresponder el valor numérico creciente de una CDR con su proximidad creciente al dominio constante de una estructura de cadena pesada o ligera de IgG típica; p.ej., la CDR3 de VH está más próxima al dominio CH1 que la CDR1 de VH).

Las realizaciones de CDR específicas se representan genéricamente usando fórmulas de aminoácidos para describir un género de CDR (de nuevo, usando el código de aminoácido de una sola letra estándar con los residuos de aminoácido sustituibles indicados por la letra “X” y la colocación de su residuo en una determinada CDR indicada por un subíndice numérico cuyo valor aumenta del residuo menor (el más amino) al residuo mayor (el más carboxilo) de la CDR (p.ej., X1 de VHCDR2 es el residuo más amino de la CDR, mientras que el residuo sustituible más carboxilo es X6). Usando estas fórmulas genéricas, cualquier experto habitual en la técnica es capaz de determinar todas las realizaciones de las CDR posibles en cada posición designada en una realización de dominio pesado o ligero variable (VL o VH) englobada en la invención. Cualquier ejemplificación particular de una posible secuencia de aminoácidos se determina simplemente generando todas las sustituciones posibles en cada residuo X en particular de una fórmula de CDR concreta usando el código de aminoácido. En la presente memoria, se engloba la totalidad de tales realizaciones)).

La información de las siguientes tablas se proporciona con fines únicamente informativos y no forma parte de la invención.

Tabla 1a: Fórmula de la cadena pesada de las CDR de las composiciones de unión

CDR de cadena pesada

CDR1: CDR2 CDR3

GYX1FX2DYNX3X4* [SEC ID N.º 2]: X1X2YPYDGX3TGX4NX5K6KS ** [SEC ID N.º 3] GYRX1X2X3Y*** [SEC ID N.º 4]

 * Para VHCDR1: X1 es bien T o D; X2 es bien T, E o F; X3 es bien M, I, L o V; y X4 es bien H, V o A.

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(continuación)

 **Para VHCDR2: X1 es bien Y, Q o S; X2 es bien I o V; X3 es bien D o E; X4 es bien Y, T, H o L; X5 es bien Q, K, P o S; y X6 es bien F o Y.

 ***Para VHCDR3: X1 es bien W o A; X2 es bien F o L; y X3 es bien A, E o Y.

Tabla 1b Fórmula de la cadena ligera de las CDR de las composiciones de unión

CDR de cadena ligera

CDR1: CDR2 CDR3

X1AX2X3X4VX5 YMH * [SEC ID N.º 5]: ATSNX1AX2 ** [SEC ID N.º 6] X1QWDX2X3X4PA *** [SEC ID N.º 7]

* Para VHCDR1: X1 es bien R, Y, E o Q; X2 es bien S o T; X3 es bien S, V o A; y X4 es bien S o L; X5 es bien S, P, L o Y. **Para VHCDR2: X1 es bien L, N o P; y X2 es bien S, K, Y, L, M, F, E Q, R o H. ***Para VHCDR3: X1 es bien Q o S; X2 es bien L, D o P; X3 es bien N o R; y X4 es bien P, F, Y o R.

5 Además, se engloban composiciones de unión de anticuerpo que usan las CDR englobadas en la presente memoria que están insertadas (en el sentido apropiado) o son portadas con las regiones marco de los anticuerpos humanos para permitir que la composición de unión resultante se una específica y/o selectivamente a TGF beta 1 madura frente a la TGF beta 2 madura y/o la TGF beta 3 madura, y neutralice la TGF beta 1 madura. Se pueden usar técnicas conocidas en la técnica para insertar o colocar determinadas CDR en los marcos apropiados.

10 En una realización preferida, el marco FR1 de HCVR comprende QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS [SEC ID N.º 8]; el marco FR2 de HCVR comprende WVRQAPGQGLEWMG [SEC ID N.º 9]; el marco FR3 de HCVR comprende RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR [SEC ID N.º 10]; y el marco FR4 de HCVR comprende WGQGTLVTVSS [SEC ID N.º 11]. En otra realización preferida, el marco FR1 de LCVR comprende DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC [SEC ID N.º 12]; el marco FR2 de LCVR comprende una secuencia seleccionado

15 entre: [SEC ID N.º 13,14 y 18], el marco FR3 de LCVR comprende GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC [SEC ID N.º 37]; y el marco FR4 de LCVR comprende FGQGTKLEIK [SEC ID N.º 38]. También se revelan regiones marco que pueden contener alteraciones, eliminaciones, adiciones, sustituciones o cualquier otra combinación. Además, también se revelan marcos en los que se sustituyen, eliminan o añaden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos en cualquier combinación.

20 En una realización, una región constante de cadena pesada preferida usada para insertar las CDR de las composiciones de unión de anticuerpo de la invención incluye, por ejemplo, una región constante de IgG. En una realización más preferida, la región constante de IgG es una región constante de IgG1 o una región constante de IgG4 como se muestra a continuación:

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Una secuencia de región constante de cadena ligera preferida de la invención es la región constante de cadena kappa mostrada a continuación:

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En otra realización preferida, las composiciones de unión de anticuerpo contienen la región constante de cadena pesada de IgG1 o la región constante de cadena pesada de IgG4 y la región constante de cadena ligera kappa.

La siguiente realización se proporciona únicamente con fines informativos y no forma parte de la invención. Usando la información que se proporciona en la presente memoria, cualquier experto en la técnica podría crear una realización de Acm, por ejemplo, tal como el n.º 46P–L1–6, que tendría una cadena ligera que comprende:

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en la que: el marco FR1 de LCVR = DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC;

La CDR1 de VL = EASSSVSYMH de fórmula X1AX2X3X4VX5 YMH, en la que X1 es bien R, Y, E o Q; X2 es bien S o T; X3 es bien S, V o A; X4 es bien S o L; y X5 es bien S, P, L o Y;

el marco FR2 de LCVR = WYQQKPGKAPKPLIY;

la CDR2 de VL = ATSNLAS de fórmula ATSNX1AX2, en la que X1 es bien L, N o P; y X2 es bien S, K, Y, L, M, F, E, Q, R o H;

el marco FR3 de LCVR = GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC;

la CDR3 de VL = QQWDLNPPA de fórmula X1QWDX2X3X4PA, en la que X1 es bien Q o S; X2 es bien L, D o P; X3 es bien N o R; y X4 es bien P, F, Y o R; el marco FR4 de LCVR= FGQGTKLEIK; y la región constante de cadena ligera =

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y una cadena pesada que comprende:

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en la que: el marco FR1 de LCVR = QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS;

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la CDR1 de VH = GYTFTDYNMH de fórmula GYX1FX2DYNX3X4; X1 es bien T o D; X2 es bien T, E o F; X3 es bien M, I, L o V; y X4 es bien H, V o A;

el marco FR2 de LCVR = WVRQAPGQGLEWMG; la CDR2 de VH = YIYPYDGDTGYNQKFKS de fórmula X1X2YPYDGX3TGX4NX5KX6KS; X1 es bien Y, Q o S; X2 es bien I o V; X3 es bien D o E; X4 es bien Y, T, H o L; X5 es bien Q, K, P o S; y X6 es bien F o Y;

el marco FR3 de LCVR = RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR;

la CDR3 de VH = GYRWFAY de fórmula GYRX1X2X3Y; en la que X1 es bien W o A; X2 es bien F o L; y X3 es bien A, E o Y; el marco FR4 de HCVR = wGQGTLVTVSS; y la región constante de cadena pesada =

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Polinucleótidos que codifican anticuerpos

Las moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de polinucleótidos que codifican una composición de unión (o un fragmento de la misma) o la secuencia polipeptídica de la invención se pueden obtener, así como determinar la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos, mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica como, por ejemplo, si se conoce la secuencia polipeptídica (p.ej., de un anticuerpo o un fragmento del mismo), es posible determinar un polinucleótido que codifique el polipéptido simplemente usando la degeneración del código genético en cualquier algoritmo ejecutable por ordenador, y usarse la información de la secuencia resultante para ensamblar, por ejemplo, oligonucleótidos sintetizados químicamente (p.ej., según lo descrito en Kutmeier, et al., (1994) BioTechniques 17:242), lo que, en resumen, implica sintetizar oligonucleótidos solapantes que contienen partes de la secuencia que codifica la secuencia polipeptídica, aparear y ligar esos oligonucleótidos, y luego amplificar los oligonucleótidos ligados usando una reacción en cadena de la polimerasa.

Alternativamente, se puede generar un polinucleótido que codifique una secuencia polipeptídica de la invención a partir de ácido nucleico de cualquier origen adecuado. Si no se puede obtener un clon que contenga una molécula de ácido nucleico que codifique un determinado anticuerpo, pero, sin embargo, se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, entonces es posible sintetizar químicamente un ácido nucleico que codifique la inmunoglobulina u obtenerlo de una fuente adecuada. Por ejemplo, la fuente puede ser un banco de ADNc de anticuerpos o un banco de ADNc generado a partir de ARN de poli(A+), aislado de cualquier tejido o célula que exprese el anticuerpo de interés, tal como, p.ej., células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo de la invención mediante amplificación PCR usando cebadores sintéticos hibridables a los extremos 3’ y 5’ de una secuencia de polinucleótido de interés o mediante clonación usando una sonda de oligonucleótido específica de una determinada secuencia génica para identificar, p.ej., un clon de ADNc de un banco de ADNc que codifique el anticuerpo, es posible generar una molécula de ácido nucleico para el anticuerpo.

Es posible clonar los ácidos nucleicos amplificados en vectores de clonación replicables usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Una vez determinadas la secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos del anticuerpo, se puede manipular la secuencia de nucleótidos usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, p.ej., técnicas de ADN recombinante, mutagénesis de sitio dirigida, PCR, etc., para generar (véase, p.ej., Sambrook, et al., y Ausubel, et al., eds., cur. ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).

En una realización específica, se puede examinar la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada y/o cadena ligera para identificar las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) mediante procedimientos conocidos, p. ej., mediante la comparación de secuencias de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de cadena pesada y ligera para determinar las regiones de hipervariabilidad secuencial. Con las técnicas de ADN recombinante habituales, se pueden insertar una o más CDR descritas en la presente memoria en las regiones marco adecuadas, p.ej., en regiones marco humanas para reducir la inmunogenicidad. Las regiones marco pueden ser naturales o regiones marco de consenso (como se enseña en la presente memoria) y son preferiblemente regiones marco humanas (para consultar un listado de regiones marco humanas, véase, p.ej., Chothia, et al. 1998 J. Mol. Biol. 278: 457–79). En términos generales, para identificar los residuos de los marcos humanos con tendencia a influir en la integridad del sitio de unión antigénica y, por tanto, en la unión con antígenos, se pueden alinear tanto la secuencia donante como la secuencia aceptora humana seleccionada con varios moldes de secuencias derivados de repertorios de anticuerpos. Hay identificados “residuos invariables” (Kabat et al., 1991) y “residuos clave” (Chothia et al., 1989) y se han determinado asignaciones de clases canónicas de los bucles de unión antigénica donantes L1–L3, H1 y H2, respectivamente, mediante el rastreo de moldes de secuencia contra secuencia (Martin y Thornton, 1996 Mol. Biol. 263:800–15 en http://www.bioinf.org.uk/). Además, los residuos de la interfase VH/VL (Chothia et al., 1985) y los residuos conocidos por estar estructuralmente conservados en los sitios centrales (Chothia et al., 1998) se comparan con los correspondientes residuos donantes y aceptores. Los residuos marco donantes y aceptores no coincidentes de estos sitios se analizan en base a la información obtenida de otros anticuerpos de estructura conocida del Banco de Datos de Proteínas (Berman, et al., 2000 Nucl. Acids Res. 28(1):235–42). La selección de los marcos humanos para usarlos como moldes para la humanización de las regiones V foráneas puede definir las decisiones posteriores relativas a qué residuos se van a humanizar. La elección de moldes homólogos de anticuerpos con estructura cristalina conocida de las secuencias de la línea germinal, no germinal o consenso derivadas de las bases de datos disponibles son opciones (para más información, Routledge et al. (Routledge, et al., 1993 en “Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man” (Clark, M., ed) pp. 14–44, Academic Titles, Nottingham, RU; y B. Lo, 2004 “Antibody Engineering: Methods and Protocols”, Humana Press)). Otra estrategia para humanizar anticuerpos es elegir la secuencia de la línea germinal humana más cercana (Tomlinson et al., 1992) como el marco para recibir las CDR donantes. Este enfoque de la línea germinal se basa en los mismos fundamentos que la estrategia del mejor ajuste, pero las secuencias de la línea germinal sólo se buscan en las bases de datos (véase, p.ej., la V BASE, que es un directorio exhaustivo de todas las secuencias de las regiones variables de la línea germinal humana recopiladas de entre más de mil secuencias publicadas, incluyendo aquéllas de las publicaciones recientes del banco de genes y del banco de datos EMBL. La base de datos V BASE ha sido creada a lo largo de varios años en el Centro MRC de Ingeniería de Proteínas (Cambridge, RU) como una prolongación del trabajo realizado sobre la secuenciación y el mapeado de genes de anticuerpos humanos, y como herramienta de fácil uso para su análisis). El procedimiento del marco de la línea germinal es muy útil, porque una secuencia de línea germinal humana no presenta hipermutaciones somáticas que sean potencialmente inmunógenas. Las CDR también se pueden injertar o insertar en marcos humanos usando una estrategia de línea germinal humana de consenso, en la que se use uno de los subgrupos humanos como marco (véase, p.ej., Presta et al., 1993 J. Immunol 151:2623–32; Couto et al., 1994 Hybridoma, 13:215–9; Couto et al., 1995 Cancer Res. (Supl.), 55, 5973s–7s; Werther et al., 1996 J. Immunol., 157:4986–95; O’Connor et al., 1998 Protein Engng 11:321–8).

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Preferiblemente, el polinucleótido generado por la combinación de las regiones marco y las CDR codifican un anticuerpo (o un fragmento del mismo) que se une específica y/o selectivamente con la TGF beta 1 (o epítopo del mismo). Preferiblemente, como se trata en la presente memoria, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos en las regiones marco para mejorar la unión del anticuerpo con su antígeno.

Además, se pueden usar tales procedimientos para hacer sustituciones o eliminaciones de aminoácidos de una o más regiones variables, residuos de cisteína que participan en un enlace de tipo disulfuro entre cadenas para generar moléculas de anticuerpo que carezcan de uno o más enlaces tipo disulfuro entre cadenas. La invención y la técnica del experto habitual como, p.ej., el biólogo molecular, engloban otras modificaciones del polinucleótido.

Alternativamente, se pueden adaptar las técnicas para producir anticuerpos monocatenarios (véase, p.ej., la patente estadounidense n.º 4.946.778; Bird, Science 242:423–42 (1988); Huston, et al., PNAS 85:5879–5883 (1988); y Ward, et al., Nature 334: 544–54 (1989)). Los anticuerpos monocatenarios se forman uniendo los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv con un puente de aminoácidos dando como resultado un polipéptido monocatenario. También se pueden usar técnicas para ensamblar fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skewa, et al. (1988) “Science” 242: 1038–1041).

Fragmentos de polipéptido

La invención también engloba fragmentos de una composición de unión. Un “fragmento o segmento de polipéptido” engloba una secuencia de aminoácidos que es una parte de una secuencia descrita en la presente memoria o una parte de una secuencia polipeptídica de una SEC ID N.º. Los fragmentos o segmentos de proteína y/o polipéptido pueden ser “independientes” o pueden comprender parte de un polipéptido o proteína mayor del/de la que el fragmento o el segmento forme una parte o región, p.ej., una sola región continua de una SEC ID N.º: conectada en la presente memoria en una proteína de fusión.

Preferiblemente, un segmento polipeptídico puede tener una longitud de aminoácidos contiguos que sea al menos de aproximadamente: 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 110, 120, 130, 140 ó 150 aminoácidos contiguos de longitud. En este contexto, “aproximadamente” incluye, p.ej., los intervalos o valores citados específicamente descritos en la presente memoria, y también engloba los valores que difieren de estos valores citados en varios residuos de aminoácido (p.ej., más o menos 5, más o menos 4, más o menos 3, más o menos 2 o más o menos 1 residuo de aminoácido) en cualquiera o ambos extremos del fragmento. También están englobados por la invención los polinucleótidos que codifican tal fragmento de polipéptido.

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Además, la invención engloba proteínas o polipéptidos que comprenden una pluralidad de dichos segmentos o fragmentos de aminoácidos, p.ej., segmentos no solapantes de una longitud especificada. Comúnmente, una pluralidad será de al menos dos, más habitualmente, de al menos tres y, preferiblemente, de al menos: cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más. Aunque se proporcionen longitudes mínimas de un segmento, también se engloban las longitudes máximas de diversos tamaños para cualquier pluralidad específica de segmentos, p.ej., una pluralidad de tres segmentos en toto podría tener un segmento con una longitud de 7 aminoácidos contiguos y dos segmentos solapantes más, cada uno de los cuales tiene una longitud de 12.

También se prefieren los fragmentos o segmentos de polipéptido (y sus correspondientes fragmentos de polinucleótidos) que caracterizan dominios estructurales o funcionales, tales como, fragmentos, o combinaciones de los mismos, que comprenden, p.ej., regiones determinantes de la complementariedad (CDR, tales como VL o VH: CDR1, CDR2 o CDR3), regiones variables (p.ej., de las cadenas pesadas o ligeras, VL o VH), regiones marco (FH1, 2, 3 ó 4), regiones D o J, dominios constantes (p.ej., tales como, CL, CH1, CH2 o CH3), regiones bisagra, regiones de unión a receptores gamma Fc, hélice alfa y regiones formadoras del hélice alfa, lámina beta y regiones formadoras de la lámina beta, curva y regiones formadoras de la curva, cola y regiones formadoras de la cola, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones anfipáticas alfa, regiones anfipáticas beta, regiones flexibles, regiones bucle, dominios de horquilla, motivos beta–alfa–beta, fardos de hélices, fardos de alfa/beta, fardos beta arriba y abajo, motivos de jelly roll o Swiss roll, dominios transmembrana, regiones formadoras de la superficie, regiones de unión a sustratos, regiones transmembrana, ligadores, regiones inmunógenas, regiones epitópicas y regiones de alto índice antigénico. Además, también se engloban los polinucleótidos que codifican estos dominios.

Otros segmentos polipeptídicos preferidos son los fragmentos biológicamente activos. Los fragmentos biológicamente activos son aquéllos que presentan una actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de un polipéptido de la composición de unión (o un fragmento del mismo), tal como Fab, Fv, scFv o F(ab)2. También están contemplados por la invención los polinucleótidos que codifican estos fragmentos polipeptídicos.

Preferiblemente, los fragmentos de polinucleótido codifican un polipéptido que demuestra una actividad funcional. La expresión “actividad funcional” engloba un segmento polipeptídico que puede realizar una o más actividades funcionales conocidas. Tales actividades funcionales incluyen, p.ej., sin limitación, actividad biológica, antigenicidad [capacidad para unirse (o competir con un polipéptido por la unión) con una composición de unión de anticuerpo contra un polipéptido de la invención], inmunogenicidad (capacidad para generar un anticuerpo que se une a un polipéptido de la invención), capacidad para formar multímeros con un polipéptido de la invención y capacidad para unirse a un receptor o ligando de un polipéptido descrito en la presente memoria.

La actividad funcional de un polipéptido (incluyendo fragmentos, variantes, derivados y análogos del mismo) se puede analizar mediante diversos procedimientos. Por ejemplo, cuando se esté analizando la capacidad de unirse o competir con un polipéptido de longitud completa de la invención para unirse a un anticuerpo de un polipéptido de la invención, se pueden usar diversos inmunoanálisis conocidos en la técnica, que incluyen, p.ej., sin limitación, sistemas de análisis competitivo y no competitivo que usan técnicas tales como radioinmunoanálisis, ELISA (análisis de inmunosorbencia ligado a una enzima), inmunoanálisis de tipo “sándwich”, análisis inmunorradiométricos, reacciones de precipitación por difusión de gel, análisis de inmunodifusión, inmunoanálisis in situ (usando oro coloidal, marcadores enzimáticos o de radioisótopo), transferencias Western, reacciones de precipitación, análisis de aglutinamiento (p.ej., análisis de aglutinamiento de gel, análisis de hemaglutinamiento, análisis de fijación de complementos, análisis de inmunofluorescencia, análisis de proteína A y análisis de inmunoelectroforesis, etc.).

En otra realización, la unión del anticuerpo se realiza mediante la detección de un marcador sobre el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta mediante la detección de la unión de un anticuerpo secundario o reactivo con el anticuerpo primario. En otra realización más, el anticuerpo secundario está marcado. Hay muchos procedimientos conocidos en la técnica para detectar la unión en un inmunoanálisis, y pertenecen al alcance de la invención.

En otra realización en la que se identifica un ligando o en la que se evalúa la capacidad de un fragmento, variante o derivado de polipéptido de la invención para multimerizarse, se puede analizar la unión, p.ej., usando una cromatografía sobre gel reductor o no reductor, cromatografía de afinidad de proteínas y transferencia de afinidad (véase, en general, Phizicky, et al. (1995) Microbial. Rev. 59:94–123). En otra realización, se pueden analizar las coincidencias fisiológicas de la unión de un polipéptido a su sustratos (transducción de señales) con técnicas comunes. Además, se pueden aplicar rutinariamente los análisis descritos en la presente memoria (véase, p.ej., el apartado de “Ejemplos” de la solicitud), o aquéllos conocidos en la técnica, para medir la capacidad de una

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composición de unión (sus fragmentos, variantes, derivados y análogos de la misma) para modular una actividad biológica relacionada (bien in vitro o in vivo) de TGF beta 1.

Procedimientos para producir anticuerpos

Es posible producir una composición de unión de anticuerpo usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, en particular, mediante síntesis química o, preferiblemente, mediante técnicas de expresión recombinante.

La expresión recombinante de una composición de unión, o fragmento, derivado o análogo de la misma, (p.ej., una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo de la invención o un anticuerpo monocatenario de la invención) requiere la construcción de un vector de expresión que contiene una secuencia de polinucleótidos que codifica el anticuerpo. Una vez obtenida una secuencia de polinucleótidos que codifique una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o una parte de la misma (preferiblemente, que contenga el dominio variable de la cadena pesada o ligera) de la invención, se puede producir el vector para producir la molécula de anticuerpo mediante técnicas de tecnología de ADN recombinante conocidas.

Se pueden usar procedimientos conocidos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan las secuencias codificantes de la composición de unión y señales de control de la transcripción y la traducción. Estos procedimientos incluyen, p.ej., sin limitación, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y la recombinación genética in vivo. Así pues, la invención engloba vectores replicables que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de la invención (o un fragmento de la misma) o una cadena pesada o ligera del mismo, o un dominio variable de cadena pesada o ligera o una CDR ligada operativamente a un promotor. Tales vectores pueden incluir, p.ej., la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (Véase, p.ej.: WO 86/05807; WO 89/01036; o la patente estadounidense n.º 5.122.464) y se puede clonar el dominio variable del anticuerpo en tal vector para la expresión de toda la cadena pesada o ligera o de cualquier parte de la misma.

En términos generales, se transfiere un vector de expresión a una célula huésped mediante técnicas convencionales y luego se cultivan las células transfectadas para producir un anticuerpo o una parte del mismo. Por lo tanto, la invención también engloba, p.ej., células huésped que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, o un anticuerpo monocatenario de la invención, ligado operativamente a un promotor heterólogo. En realizaciones preferidas para la expresión de anticuerpos bicatenarios, se pueden coexpresar vectores que codifiquen cadenas tanto ligeras como pesadas en una célula huésped para la expresión de la molécula de inmunoglobulina entera, como se detalla en la presente memoria o se conoce en la técnica.

Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión en huéspedes para expresar las moléculas de anticuerpo de la invención. Tales sistemas de expresión en huéspedes representan vehículos mediante los que es posible producir cualquier secuencia codificante de interés y posteriormente purificarla. En cualquier caso, cuando se transforman o transfectan con una secuencia codificante de nucleótidos apropiada, las células de los sistemas de expresión en huéspedes también pueden representar una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estas células incluyen, p.ej., sin limitación, microorganismos tales como bacterias (p.ej., E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (p.ej., Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p.ej., baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p.ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (p.ej., plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamífero (p.ej., células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan constructos de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (p.ej., promotor de la metalotioneína) o de virus de mamífero (p.ej., el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia).

Preferiblemente, se usan células bacterianas, tales como de Escherichia coli, y más preferiblemente, células eucariotas para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero, tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), en combinación con un vector tal como el elemento promotor de genes temprano–intermedio principal del citomegalovirus humano constituyen un sistema de expresión de anticuerpos eficaz (Foecking, et al. (1986) Gene 45:101; Cockett, et al. (1990) Bio/Technology 8:2).

En sistemas bacterianos, se puede seleccionar ventajosamente una serie de vectores de expresión en función del uso que se desee dar a la molécula de anticuerpo expresada. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de proteína, como, p.ej., para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de niveles elevados de productos de proteínas de fusión que sean fácilmente purificados. Tales vectores incluyen, p.ej., sin limitación, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther, et al., EMBO J. 2: 1791 (1983)), en el que se puede ligar la secuencia codificante de anticuerpos individualmente en el vector en marco con la región codificante lac Z, de manera que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye y Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3 101–3 109 (1985); Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503–5509 (1989)); y similares. También se pueden usar vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutationa–S–transferasa (GST).

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En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente de células lisadas mediante la adsorción y la unión a perlas de glutationa–agarosa matriciales seguida por la elución en presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir, p. ej. trombina o sitios de escisión de proteasa de factor Xa, de manera que el producto génico diana clonado se pueda liberar de un resto de GST. Un sistema de insecto usado como vector para expresar un gen foráneo es el sistema del Virus de la Polihedrosis Nuclear (AcNPV) Autographa californica. El virus AcNPV crece en células de Spodopteru frugiperda. La secuencia codificante de anticuerpos se puede clonar individualmente en regiones no esenciales (p.ej., el gen de la polihedrina) del virus y colocarlas bajo el control de un promotor AcNPV (p.ej., el promotor de la polihedrina).

En células huésped de mamífero, se puede utilizar una serie de sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, se puede ligar la secuencia codificante de anticuerpos de interés a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, p.ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico luego se puede insertar en el genoma de adenovirus usando una recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (p.ej., la región E1 o E3) da como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en huéspedes infectados (véase, p.ej., Logan y Shenk, 1984 PNAS 8 1:355–9). Pueden ser necesarias señales de inicio específicas para la traducción eficaz de las secuencias codificantes de anticuerpos. Estas señales incluyen, p.ej., el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar una traducción apropiada del inserto entero. Estas señales de control de la traducción exógenas y los codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos.

Se puede aumentar la eficacia de la expresión mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de la transcripción, etc. (véase, p.ej., Bittner, et al., 1987 Methods in Enzymol. 153:5 1–4). Además, se puede seleccionar una cepa de células huésped que module la expresión de la secuencia insertada o modifique y procese el producto génico de una manera específica deseada. Tales modificaciones (p.ej., glicosilación) y tal procesamiento (p.ej., escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de una proteína.

Las diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento posterior a la traducción y la modificación de proteínas y productos génicos. Se pueden elegir las líneas celulares o los sistemas huésped apropiados para garantizar la correcta modificación y el procesamiento de una proteína foránea que sea expresada. Con este fin, se pueden usar células huésped eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcripto primario, la glicosilación y la fosforilación. Tales células huésped de mamífero incluyen, p.ej., sin limitación, líneas celulares de CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, y, en particular, líneas celulares de cáncer de mama tales como, p.ej., BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, y la línea celular de glándula mamaria normal, tal como, p.ej., CRL7030 y Hs578Bst

La invención engloba anticuerpos fusionados recombinantemente o conjugados químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) con un polipéptido (o una parte del mismo, preferiblemente, que comprenden al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 aminoácidos contiguos del polipéptido) para generar proteínas de fusión. La fusión no requiere necesariamente ser directa, sino que puede producirse a través de secuencias ligadoras.

También se pueden usar anticuerpos fusionados o conjugados a un polipéptido en inmunoanálisis in vitro y en procedimientos de purificación usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, p.ej., Harbor, et al., supra, y WO 9312 1232; EP 439,095; Naramura et al. (1994) Immunol. Lett. 39:91–9; patente estadounidense n.º 5.474.981; Gillies, et al. 1992 PNAS 89:1428–32; Fell, et al. 1991 J. Immunol. 146:2446–52).

La invención incluye además composiciones que comprenden un polipéptido (o un fragmento del mismo) fusionado o conjugado con un dominio de anticuerpo distinto de una región variable. Por ejemplo, se puede fusionar o conjugar un polipéptido de la invención (o un fragmento del mismo) a una región constante de anticuerpo, la región D o J, o una región Fc, o una parte de la misma. La parte de anticuerpo que se fusiona con un polipéptido de la invención (o el fragmento del mismo) puede comprender una región constante, una región bisagra, un dominio CH1, un dominio CH2 y/o un dominio CH3, o cualquier combinación de dominios enteros o sus partes. Un polipéptido (o fragmento del mismo) también se puede fusionar o conjugar con una parte de anticuerpo descrita en la presente memoria para formar multímeros. Por ejemplo, las partes Fc fusionadas con un polipéptido de la invención (o un fragmento del mismo) pueden formar dímeros a través de enlaces de tipo disulfuro entre las partes Fc. Se pueden crear formas multiméricas superiores fusionando los polipéptidos con partes de IgA e IgM. Los procedimientos para fusionar o conjugar un polipéptido de la invención (o un fragmento del mismo) con un aparte de anticuerpo son conocidos (véanse, p.ej., las patentes estadounidenses n.º 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851; 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; WO 96/04388; WO9106.570; Ashkenazi, et al. (1991) PNAS 88: 10535–10539; Zheng, et al. (1995) J. Immunol. 154:5590–5600; y Vie, et al. (1992) PNAS 89: 11337–11341).

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Como se trata en la presente memoria, se puede fusionar o conjugar un polipéptido, o un fragmento de polipéptido, con una parte de anticuerpo descrita en la presente memoria o conocida en la técnica para aumentar la vida media in vivo. Además, se puede fusionar o conjugar un polipéptido, o un fragmento de polipéptido, a una parte de anticuerpo para facilitar la purificación. Un ejemplo usa proteínas quiméricas que comprenden los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de las inmunoglobulinas de mamífero. (Véase, p.ej., EP 394,827; Traunecker, et al. (1988) Nature 33 1:84–86).

En muchos casos, la parte Fc de una proteína de fusión es beneficiosa en terapia y diagnóstico, y puede producir, por tanto, p.ej., mejores propiedades farmacocinéticas (véase, p.ej.: EP A232.262). Alternativamente, se puede favorecer la eliminación de la parte Fc tras haber expresado, detectado y purificado la proteína de fusión. Por ejemplo, la parte Fc puede dificultar la terapia y el diagnóstico si se usa la proteína de fusión como antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, se han fusionado p.ej., proteínas humanas, tales como hIL–5, con partes Fc con el fin de obtener análisis de rastreo de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL–5 (véase, p.ej., Bennett, et al. (1995) J. Molecular Recognition 8:52–58; Johanson, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:9459–9471).

Además, se puede fusionar una composición de unión (o un fragmento de la misma) con secuencias marcadoras, tales como un péptido, para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA), entre otras, muchas de las cuales se encuentran comercialmente disponibles. La hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión (Gentz, et al. (1989) PNAS 86:821–824). Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, p.ej., la etiqueta “HA”, que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe (Wilson et al., Cell 1984: 37 (767)) y la etiqueta “flag”.

La invención engloba además anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con un agente de diagnóstico o agente terapéutico. Los anticuerpos se pueden usar diagnósticamente para, por ejemplo, controlar el desarrollo o la progresión de un tumor como parte de un procedimiento de análisis clínico para determinar la eficacia de una pauta de tratamiento dada. La detección se puede facilitar acoplando el anticuerpo con una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen, p.ej., diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. La sustancia detectable se puede acoplar o conjugar bien directamente al anticuerpo (o al fragmento del mismo) o indirectamente a través de un compuesto intermedio (tal como, p.ej., un ligador conocido en la técnica) usando técnicas establecidas (véase, p.ej., la patente estadounidense n.º 4.741.900 para iones metálicos que se pueden conjugar con anticuerpos para usarlos como herramientas de diagnóstico según la invención). Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, p.ej., sin limitación, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta– galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen, p.ej., sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen, p.ej., sin limitación, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotrizinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye, p.ej., sin limitación, luminol; los ejemplos de materiales bioluminescentes incluyen, p.ej., sin limitación, luciferasa, luciferina y aecuorina; y los ejemplos de un material radiactivo adecuado incluyen, p.ej., I125, I131, I111 o Tc99.

También es posible unir una composición de unión de la invención a un soporte sólido que sea particularmente útil para el inmunoanálisis o la purificación de un antígeno diana. Tales soportes sólidos incluyen, p. ej., sin limitación, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro polivinílico o polipropileno. Las técnicas para conjugar un resto terapéutico con un anticuerpo son conocidas, véase, p.ej., Amon, et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld, et al. (eds.), pp. 243–56 (Alan R. Liss, Inc.1985); Hellstrom, et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (II Ed.), Robinson, et al. (eds.), pp. 623–53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera, et al. (eds.), pp. 475–506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin, et al. (eds.), pp. 303–16 (Academic Press 1985) y Thorpe, et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody–Toxin Conjugates," Immunol. Rev. 62: 119–58 (1982)..

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B. Inmunoanálisis

Una determinada proteína, tales como la TGF beta 1, se puede medir mediante una variedad de procedimientos de inmunoanálisis que incluyen, p.ej., sin limitación, sistemas de análisis competitivo y no competitivo que usan técnicas tales como, p.ej., sin limitación, transferencias Western, radioinmunoanálisis, ELISA (análisis de inmunosorbencia ligado a una enzima), inmunoanálisis de tipo “sándwich”, análisis inmunorradiométricos, reacciones de precipitación, reacciones de precipitación por difusión de gel, análisis de inmunodifusión, análisis de aglutinación, análisis de fijación de complementos, análisis inmunorradiométricos, análisis fluorescentes e inmunoanálisis de proteína A. Para más información sobre los procedimientos inmunológicos y los inmunoanálisis en general, véase Stites y Terr (eds.) (1991) Basic and Clinical Immunology (VII ed.). Además, los inmunoanálisis de la invención se pueden realizar en muchas configuraciones, que se describen ampliamente en Maggio (ed.) (1980) “Enzyme Immunoassay”, CRC Press, Boca Raton, Florida; Gosling J P 2000 “Immunoassays: A Practical Approach” (Practical Approach Series) Oxford Univ Press; Diamandis y Christopoulus, 1996 Immunoassay Academic Press, San Diego, CA; Tijan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; Wild, D. (Ed.), 2001 “The Immunoassay Handbook” (II edición) Nature Pub Group; James T. Wu, 2000 “Quantitative Immunoassay: A Practical Guide for Assay Establishment, Troubleshooting, and Clinical Application”. Amer Assn for Clinical Chemistry; Brousseau y Beaudet (Eds.) “Manual of Immunological Methods”, CRC Press Boca Raton, Florida; y Harlow y Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual”, supra. Véase también Chan (ed.) (1987) “Immunoassay: A Practical Guide”, Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds.) (1991) “Principles and Practice of Immunoassays”, Stockton Press, NY; y Ngo (ed.) (1988) “Non– isotopic Immunoassays” Plenum Press, NY.

Los inmunoanálisis para las mediciones se pueden realizar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. En resumen, los inmunoanálisis para medir la proteína pueden ser análisis de unión bien competitiva o no competitiva. En los análisis de unión competitiva, la muestra que se va a analizar compite con un analito marcado para sitios de unión específicos con un agente de captura unido a una superficie sólida. Preferiblemente, el agente de captura es un anticuerpo específicamente reactivo con una proteína TGF beta 1 según lo descrito en la presente memoria. La concentración de analito marcado unido al agente de captura es inversamente proporcional a la cantidad del analito libre presente en la muestra.

En un inmunoanálisis de unión competitiva, la proteína diana presente en la muestra compite con la proteína marcada por la unión a una composición de unión específica, por ejemplo, una composición de unión, tal como un anticuerpo, que es específica y/o selectivamente reactiva con la proteína diana. La composición de unión se puede unir a una superficie sólida para efectuar la separación de la proteína marcada unida de la proteína marcada sin unir. Alternativamente, el ensayo de unión competitiva se puede realizar en fase líquida, pudiéndose usar una variedad de tecnologías conocidas en la técnica para separar la proteína marcada unida de la proteína marcada sin unir. Tras la separación, se determina la cantidad de proteína marcada unida. La cantidad de proteína presente en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de unión de proteína marcada.

Alternativamente, se puede realizar un inmunoanálisis homogéneo en el que no sea necesaria una etapa de separación. En estos inmunoanálisis, se modifica el marcador de la proteína mediante la unión de la proteína con su composición de unión específica. Esta modificación de la proteína marcada da como resultado una disminución o un aumento de la señal emitida por el marcador, de manera que la medición del marcador al finalizar el inmunoanálisis permite la detección o la cuantificación de la proteína.

Los análisis competitivos también son particularmente útiles cuando las células están en contacto y son incubadas con una pareja de unión marcada o un anticuerpo que tenga una afinidad de unión conocida por la proteína, tal como un anticuerpo marcado con 125I, y una muestra de análisis cuya afinidad de unión con la composición de unión se esté midiendo. Entonces se separan las composiciones de unión marcadas libres y unidas para medir el grado de unión de la proteína. La cantidad de compuesto de prueba unido es inversamente proporcional a la cantidad de unión de la pareja de unión marcada con el origen conocido. Se puede usar una cualquiera de numerosas técnicas para separar la proteína unida de la libre con el fin de medir el grado de unión de la proteína. Esta etapa de separación podría implicar comúnmente un procedimiento, tal como la adhesión a filtros, seguido por un lavado, la adhesión a plástico seguida por un lavado o la centrifugación de membranas celulares. También se podrían usar células viables para rastrear los efectos de fármacos sobre una función mediada por una proteína TGF beta (p.ej., niveles de segundo mensajero, tales como, p.ej., proliferación celular, cambios en mezclas de inositol fosfato, transcripción usando un análisis de tipo luciferasa; y otros). Algunos procedimientos de detección permiten la eliminación de una etapa de separación, p.ej., un sistema de detección sensible a la proximidad.

También se pueden determinar análisis cualitativos o cuantitativos de proteínas mediante una variedad de procedimientos de inmunoanálisis no competitivos. Por ejemplo, se puede usar un inmunoanálisis de tipo sándwich en fase sólida de dos sitios. En este tipo de análisis, se une una composición de unión para la proteína, por ejemplo, un anticuerpo, con un soporte sólido. Se marca una segunda composición de unión de proteína, que también puede ser un anticuerpo, y que se une con la proteína en un sitio diferente. Tras la unión en ambos sitios de la proteína, se retira la composición de unión marcada sin unir y se mide la cantidad de composición de unión marcada unida a la fase sólida. La cantidad de composición de unión marcada unida es directamente proporcional a la cantidad de proteína de la muestra.

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Los formatos de los inmunoanálisis descritos anteriormente emplean componentes de análisis marcados. El marcador se puede acoplar directa o indirectamente al componente deseado del análisis según procedimientos conocidos en la técnica. Se puede usar una variedad de marcadores y procedimientos. Tradicionalmente, se ha usado un marcador radiactivo que incluye 3H, 125I, 35S, 14C o 32P. Los marcadores no radiactivos incluyen proteínas que se unen a anticuerpos marcados, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos que pueden servir como parejas de unión específicas de una proteína marcada. La elección del marcador depende de la sensibilidad que se requiera, la facilidad de conjugación con el compuesto, los requisitos de estabilidad y la instrumentación disponible. Para informarse acerca de diversos sistemas de marcaje o productores de señales que se pueden usar, véase la patente estadounidense n.º 4.391.904.

También se pueden medir las composiciones de unión de anticuerpo reactivas con una determinada proteína mediante una variedad de procedimientos inmunoanalíticos. Para revisar los procedimientos inmunológicos e inmunoanalíticos aplicables a la medición de anticuerpos mediante técnicas inmunoanalíticas véase Stites y Terr (eds.), “Basic and Clinical Immunology” (VII ed.) supra; Maggio (ed.) “Enzyme Immunoassay”, supra; y Harlow y Lane, “Using Antibodies, A Laboratory Manual”, supra.

En resumen, los inmunoanálisis para medir el reactivo anti–suero con la proteína diana pueden ser análisis de unión bien competitiva o no competitiva. En los análisis de unión competitiva, el analito de la muestra compite con un analito marcado para sitios de unión específicos de un agente de captura unido a una superficie sólida. Preferiblemente, el agente de captura es una proteína recombinante purificada. También se pueden usar otras fuentes de proteínas, incluyendo proteína natural parcialmente purificada o aislada. Los análisis no competitivos incluyen análisis de tipo sándwich, en los que la muestra del analito está unida entre dos reactivos de unión específicos del analito. Una de las composiciones de unión se usa como un agente de captura y se une a una superficie sólida. La segunda composición de unión está marcada y se usa para medir o detectar el complejo resultante mediante procedimientos visuales o instrumentales. Se puede usar una serie de combinaciones de agente de captura y composición de unión marcada. Se puede usar una variedad de diferentes formatos de inmunoanálisis, técnicas de separación y marcadores similares a los descritos anteriormente para medir una proteína.

Es posible medir la capacidad del anticuerpo de interés para inmunoprecipitar un determinado antígeno mediante, p.ej, análisis de transferencia Western. El experto en la técnica tendría conocimiento en cuanto que es posible modificar los parámetros para aumentar la unión de un anticuerpo con un antígeno y para disminuir el fondo (p.ej., mediante el preaclaramiento del lisado celular con perlas de sefarosa). Se puede encontrar una mayor descripción de los protocolos de inmunoprecipitación en, p.ej., Ausubel et al, eds., 1994, “Current Protocols in Molecular Biology”, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York.

Un análisis ELISA comprende preparar un antígeno, revestir el pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos con el antígeno, añadir el anticuerpo de interés conjugado con un compuesto detectable, tal como un sustrato enzimático (p.ej., peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) al pocillo e incubar durante un período de tiempo, y detectar la presencia del antígeno. En los ELISA, el anticuerpo de interés no tiene que estar conjugado con un compuesto detectable; en cambio, se puede añadir un segundo anticuerpo (que reconozca al anticuerpo de interés) conjugado con un compuesto detectable al pocillo. Además, en lugar de revestir el pocillo con el antígeno, es posible revestir el pocillo con el anticuerpo. En este caso, se puede añadir un segundo anticuerpo conjugado con un compuesto detectable tras la adición del antígeno de interés al pocillo revestido. El experto en la técnica puede determinar sin necesidad de experimentación qué parámetros hay que ajustar, p.ej., para aumentar la señal, así como qué otras variaciones para un ELISA se han de usar (véase, p.ej., Ausubel, et al., eds., 1994, “Current Protocols in Molecular Biology”, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).

Es posible determinar la afinidad de unión de un anticuerpo contra un antígeno y la velocidad de asociación y de disociación de una interacción de anticuerpo–antígeno mediante, p.ej., un ensayo de unión competitivo. Un ejemplo no restrictivo es un radioinmunoanálisis que comprende incubar antígeno marcado (p.ej., usando 3H o 125I) con un anticuerpo de interés en presencia de cantidades crecientes de antígeno sin marcar y luego detectar la cantidad de anticuerpo unido al antígeno marcado. Es posible determinar la afinidad del anticuerpo de interés por un determinado antígeno y las velocidades de disociación de la unión a partir de los datos mediante, p.ej., el análisis de la gráfica de Scarchard. También se puede determinar la competición con un segundo anticuerpo usando, p.ej., radioinmunoanálisis. En este caso, se incuba el antígeno con anticuerpo de interés conjugado con un compuesto marcado (p.ej., 3H o 125I) en presencia de cantidades crecientes de un segundo anticuerpo sin marcar.

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Variantes físicas

La invención también engloba secuencias polipeptídicas que tienen una similitud y/o identidad sustancial de su secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria. La similitud de las secuencias de aminoácidos o la identidad de las secuencias se determina optimizando las coincidencias de los residuos. Esto cambia cuando se consideran las sustituciones conservadoras como coincidencias. Las sustituciones conservadoras incluyen comúnmente sustituciones en los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Véase también Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443–453; Sankoff, et al. (1983) “Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison”, Capítulo uno, Addison–Wesley, Reading, MA; y los paquetes informáticos de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI.

La invención engloba, pero no se limita a, secuencias polipeptídicas que se relacionan funcionalmente con un polipéptido codificado por un identificador de una secuencia específica de la presente solicitud. Los polipéptidos funcionalmente relacionados incluyen cualquier polipéptido que comparte una característica funcional con una composición de unión (p.ej., la capacidad para unirse selectiva y/o específicamente con TGF beta 1 y no unirse con TGF beta 2 y/o 3). Tales polipéptidos funcionalmente relacionados incluyen, sin limitación, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias descritas en la presente memoria; particularmente, aquéllas que producen un cambio silencioso, produciendo así un polipéptido funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer en base a la similitud de la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados.

Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

Además, se pueden sustituir o añadir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos en una secuencia polipeptídica. Los aminoácidos no clásicos incluyen, p.ej., sin limitación, D–isómeros de los aminoácidos comunes; ácido 2,4–diaminobutírico; ácido α–amino–isobutírico, ácido 4–aminobutírico, Abu, ácido 2–amino–butírico, g–Abu, e–Ahx, ácido 6–amino–hexanoico, Aid, ácido 2–amino–isobutírico, ácido 3–amino–propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cístico, t–butilglicina, t–butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, b–alanina, fluoro–aminoácidos, aminoácidos designadores, tales como b–metil– aminoácidos, Ca–metil–aminoácidos, Na–metil–aminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Además, los aminoácido pueden ser bien dextrogiros (D) o levogiros (L).

Las adiciones de restos peptídicos para facilitar la manipulación son técnicas conocidas y habituales. Además, se puede combinar una composición de unión (incluyendo cualquier fragmento de la misma y, específicamente, un epítopo) con partes del dominio constante de una inmunoglobulina, p.ej., (IgA, IgE, IgG, IgM), partes de las mismas (CH1, CH2, CH3) y cualquier combinación de las mismas, (incluyendo tanto dominios enteros como partes de los mismos), dando como resultado un polipéptido quimérico. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación y son a menudo útiles para aumentar la vida media in vivo de la proteína. Por ejemplo, esto se ha demostrado para proteínas quiméricas que comprenden los dos primeros dominios de un polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de mamífero (EP 394.827; Traunecker, et al., 1988 Nature 331: 84–6). Las proteínas de fusión con estructuras diméricas unidas mediante enlaces de tipo disulfuro (debido al dominio IgG) también pueden ser más eficientes en la unión y la neutralización de otras moléculas que una proteína secretada monomérica o un solo fragmento de proteína (Fountoulakis, et al. 1995

J. Biochem.15 270:3958–64). Se ha demostrado un mayor reparto de un antígeno a través de una barrera epitelial hacia el sistema inmune para los antígenos (p.ej., la insulina) conjugados con una pareja de unión FcyR, tal como IgG o fragmentos Fc (véase, p.ej., WO 96/22024 y WO 99/104813).

Además, una proteína de fusión puede comprender diversas partes de la región constante de una molécula de inmunoglobulina junto con una proteína humana (o una parte de la misma). En muchos casos, la parte Fc de una proteína de fusión es beneficiosa en terapia y diagnóstico, y puede producir, por tanto, p.ej., mejores propiedades farmacocinéticas. Alternativamente, puede ser deseable la eliminación de la parte Fc tras haberse expresado, detectado y purificado la proteína de fusión. Por ejemplo, la parte Fc puede dificultar la terapia y el diagnóstico si la proteína de fusión se usa como un inmunógeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, se han fusionado p.ej., proteínas humanas con partes Fc con el fin de obtener análisis de rastreo de alto rendimiento para identificar antagonistas.

Además, se pueden crear nuevos constructos mediante la combinación de dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, se puede “intercambiar” la unión de proteínas u otros segmentos entre diferentes polipéptidos o fragmentos de fusión nuevos. Así pues, se producirán nuevos polipéptidos quiméricos que presentarán nuevas combinaciones de especificidades a partir de la unión funcional de las especificidades de unión a proteínas y de otros dominios funcionales. Además, se pueden generar construcciones de fusión a través de técnicas de mezclado de genes, mezclado de motivos, mezclado de exones y/o mezclado de codones.

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“Sustancialmente puro/a” se refiere a un ácido nucleico, una proteína o un polipéptido que son retirados de su entorno natural y aislados y/o separados de otras proteínas, ácidos nucleicos y otras sustancias biológicas contaminantes. La “Pureza” o el “aislamiento” se pueden analizar mediante procedimientos estándar, y habitualmente serán al menos aproximadamente un 50% puros, más habitualmente, al menos aproximadamente un 60% puros, generalmente al menos aproximadamente un 70% puros, más generalmente, al menos aproximadamente un 80% puros, a menudo, al menos aproximadamente un 85% puros, más a menudo al menos aproximadamente un 90% puros, preferiblemente, al menos aproximadamente un 95% puros, más preferiblemente, al menos aproximadamente un 98% puros y, en las realizaciones más preferibles, al menos un 99% puros. Se aplican conceptos similares, p.ej., a las composiciones de unión, p.ej., tales como los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, puede ser deseable purificar un polipéptido de proteínas o polipéptidos de células recombinantes.

La “Solubilidad” de una proteína o un polipéptido se refleja en la sedimentación medida en unidades de Svedberg, que son una medida de la velocidad de sedimentación de una molécula en determinadas condiciones. La determinación de la velocidad de sedimentación siempre se ha realizado en un ultracentrifugador analítico, pero actualmente, lo común es realizarla en un ultracentrifugador estándar (véase, Freifelder 1982 “Physical Biochemistry” (II Ed.) W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA; y Cantor y Schimmel (1980) “Biophysical Chemistry”, partes 1–3,

W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA). Como determinación en bruto, se centrifuga una muestra que contiene un polipéptido putativamente soluble en un ultracentrifugador de tamaño completo estándar a aproximadamente 50K rpm durante aproximadamente 10 minutos, y las moléculas solubles permanecerán en el sobrenadante. Una partícula o un polipéptido soluble será comúnmente de menos de aproximadamente 30S; más comúnmente, de menos de aproximadamente 15S; habitualmente, de menos de aproximadamente 10S; más habitualmente, de menos de aproximadamente 6S y, en realizaciones particulares, lo preferible es que sea de menos de aproximadamente 4S, y más preferiblemente, de menos de aproximadamente 3S. La solubilidad de un polipéptido o de un fragmento depende del entorno y del polipéptido. Muchos parámetros afectan a la solubilidad de un polipéptido, incluyendo la temperatura, el entorno electrolítico, el tamaño y las características moleculares del polipéptido, así como la naturaleza del disolvente. Comúnmente, la temperatura a la que se usa el polipéptido varía de aproximadamente 4˚C a aproximadamente 65˚C. Habitualmente, la temperatura en uso es mayor de aproximadamente 18ºC y, más habitualmente, mayor de aproximadamente 22ºC. A efectos de diagnóstico, la temperatura habitualmente será de aproximadamente la temperatura ambiente o más cálida, pero menor que la temperatura de desnaturalización de los componentes del análisis. A efectos terapéuticos, la temperatura será habitualmente la temperatura corporal, comúnmente, de aproximadamente 37ºC para seres humanos, aunque en determinadas situaciones, la temperatura puede ser aumentada o disminuida in situ o in vitro. El tamaño y la estructura del polipéptido deberían estar generalmente en un estado sustancialmente estable, y habitualmente no en un estado desnaturalizado. El polipéptido puede ser asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, p.ej., para conferirle solubilidad, o ser asociado con lípidos o detergentes de manera que se aproxime a las interacciones entre las bicapas de lípidos naturales.

Habitualmente, el disolvente será un tampón biológicamente compatible de un tipo usado para conservar las actividades biológicas y, habitualmente, se aproximará a un disolvente fisiológico. Habitualmente, el disolvente tendrá un pH neutro, comúnmente, entre aproximadamente 5 y 10, y preferiblemente, de aproximadamente 7,5. En algunas ocasiones, se añadirá un detergente, comúnmente, uno suave no desnaturalizante, p.ej., CHS (colesteril– hemisuccinato) o CHAPS (3–[3–colamidopropil)–dimetilamonio]–1–propano–sulfonato) o una concentración suficientemente baja como para evitar la interrupción significativa de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína. En una realización preferida, la solubilidad de una composición de unión de la invención (pH 5,0–6,0 y NaCl 150mM) es mayor de 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 mg/ml; en una realización más preferida, mayor de 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 mg/ml; en una realización todavía más preferida, mayor de 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ó 60 mg/ml, en una realización incluso más preferible, mayor de 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 ó 150 mg/ml (o un intervalo entre dos cualquiera de tales valores, intervalo que puede o no incluir cualquiera o ambos puntos inicial y final).

Variantes

También se revelan polipéptidos que comprenden, o que alternativamente constan de, una secuencia de aminoácidos que es el menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a, p.ej., una secuencia de polipéptido de la invención (o fragmentos de la misma). La determinación de si una determinada secuencia presenta identidad con la secuencia de una composición de unión se puede realizar usando procedimientos conocidos en la técnica.

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Comúnmente, en tal comparación de secuencias, una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en un ordenador, se designan las coordenadas sub–secuenciales, en caso de que sean necesarias, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Entonces, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad secuencial para la(s) secuencia(s) de prueba con respecto a la secuencia de referencia en base a los parámetros de un programa designado.

Se puede realizar un alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación, p.ej., mediante el algoritmo de homologías locales de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; mediante el algoritmo de alineamiento de homologías de Needlman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; mediante la búsqueda para el procedimiento de similitudes de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat’l Acad. Sci. EE.UU. 85:2444; mediante las puestas en marcha informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de programas informáticos de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI); el juego informático de Bioinformática LASERGENE, que está producido por DNASTAR (Madison, Wisconsin); mediante el procedimiento de alineamiento de múltiples secuencias creado por de Notredame, et al. (p.ej., 3Dcoffee o Tcoffee en, p.ej., Nucleic Acids Res. 2004:32 (Web Server issue): W37–40; Nucleic Acids Res., 1 de julio de 2003; 31(13):3503–6; o Pharmacogenomics., Enero de 2002; 3(1):131–4)) o mediante examen visual (véase, en general, Ausubel, et al. supra). Hay otros procedimientos para la comparación de secuencias de nucleótidos o aminoácidos mediante la determinación del alineamiento óptimo que son ampliamente conocidos (véase, p.ej., Peruski y Peruski, “The Internet and the New Biology: Tools for Genumic and Molecular Research” (ASM Press, Inc. 1997); Wu, et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins", en Methods in Gene Biotechnology, páginas 123–151 (CRC Press, Inc. 1997); o Bishop (end.), “Guide to Human Genome Computing”, II edición (Academic Press, Inc. 1998)).

Un polipéptido que muestre o que tenga al menos aproximadamente, p.ej., un 95% de “identidad secuencial” con otra secuencia de aminoácidos puede incluir, p.ej., modificaciones de hasta 5 aminoácidos por cada tramo de 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de prueba. En otras palabras, una primera secuencia de aminoácidos que sea al menos un 95% idéntica a una segunda secuencia de aminoácidos puede tener hasta un 5% de su número total de residuos de aminoácido diferente de la segunda secuencia, p.ej., mediante inserción, eliminación o sustitución de un residuo de aminoácido. Las modificaciones de los residuos amino de una secuencia polipeptídica pueden tener lugar, p.ej., en las posiciones terminales amino o carboxilo, o en cualquier sitio entre estas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre residuos de la secuencia o en una o más secciones, porciones o fragmentos de residuos amino contiguos de la secuencia. Como cuestión práctica, es posible determinar si cualquier secuencia polipeptídica particular presenta al menos aproximadamente: 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de similitud con otra secuencia, por ejemplo, tal como la mostrada en una Tabla de la presente memoria, mediante procedimientos conocidos en la técnica.

Las variantes reveladas en la presente memoria pueden contener modificaciones en las regiones codificantes, regiones no codificantes o en ambas. Además, también se revelan variantes en las que hay sustituidos, eliminados o añadidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos en cualquier combinación. Se pueden producir variantes no naturales mediante técnicas de mutagénesis o mediante la síntesis directa usando procedimientos conocidos de ingeniería de proteínas y tecnología de ADN recombinante. Tales variaciones se pueden generar para mejorar o modificar las características de un polipéptido de la composición de unión (o fragmento del mismo). Por ejemplo, se pueden eliminar uno o más aminoácidos del terminal N o del terminal C de un polipéptido secretado de la invención (o un fragmento del mismo) sin una pérdida sustancial de función biológica. Por ejemplo, Ron, et al. 1993 J. Biol. Chem. 268:2984–8, publicó variantes de proteínas KGF que tenían actividad de unión a la heparina incluso tras eliminar 3, 8 ó 27 residuos de aminoácido amino–terminales. Por ejemplo, se puede conservar la antigenicidad y/o la inmunogenicidad (p.ej., la capacidad de una variante de eliminación para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan una forma madura de un polipéptido) cuando se eliminan menos de la mayoría de los residuos de la forma secretada del terminal N o el terminal C. Se puede determinar fácilmente si un polipéptido que carece de residuos N– o C–terminales de una proteína conserva tales actividades mediante procedimientos habituales descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica. Por lo tanto, la invención también engloba, p.ej., variantes de polipéptido que muestran una actividad biológica, tal como, p.ej., inmunogenicidad o antigenicidad. Tales variantes incluyen, p.ej., eliminaciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones seleccionadas de manera que tengan poco efecto sobre la actividad usando las reglas generales conocidas en la técnica. Por ejemplo, se proporcionan enseñanzas sobre cómo hacer sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas, p.ej., mediante Bowie, et al. (1990) Science 247: 1306–1310.

Además de usar sustituciones de aminoácidos conservadoras, otras variantes de la invención incluyen, p.ej., pero se restringen a, p. ej., (i) sustituciones con uno o más residuos de aminoácido no conservados, en las que los residuos de aminoácido sustituidos pueden estar o no codificados por el código genético o (ii) la sustitución con uno o más residuos de aminoácido que tienen un grupo sustituyente o (iii) la fusión del polipéptido maduro con otro compuesto, tal como un compuesto que aumente la estabilidad y/o la solubilidad del polipéptido (p.ej., polietilenglicol) o (iv) la fusión del polipéptido con aminoácidos adicionales, tales como, p.ej., un péptido de la región de fusión de Fc de IgG,

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o una secuencia líder o secretora, o una secuencia que facilite la purificación. La totalidad de tales variantes pertenecería al alcance de los expertos en la técnica de Biología Molecular, dadas las enseñanzas de los solicitantes de la presente memoria, p.ej., especificando las secuencias únicas de polinucleótidos y polipéptidos.

Por ejemplo, las variantes polipeptídicas que contienen sustituciones de aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados o neutros pueden producir polipéptidos con mejores características, tales como, p.ej., una menor agregación. La agregación de formulaciones farmacéuticas tanto reduce la actividad como aumenta el aclaramiento debido a la actividad inmunógena del agregado (Pinckard, et al. (1967) Clin. Exp. Immunol. 2:331–340; Robbins, et al. (1987) “Diabetes” 36:838–845; Cleland, et al. (1993) Crit. Rev. “Therapeutic Drug Carrier Systems” 10:307–377). En una realización preferida, una composición de unión de la invención formulada en un sistema de pH/tampón apropiado (según lo descrito en la presente memoria o conocido en la técnica) no presenta una agregación significativa tras la incubación durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 meses en condiciones térmicas en el intervalo de aproximadamente 1–10˚C, más preferiblemente, 2–8˚C, incluso más preferiblemente, de 3–7˚C e incluso más preferiblemente, de 5–6˚C.

También se revela una composición que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención que contiene al menos la sustitución de un aminoácido, pero no más de 50 sustituciones de aminoácidos, incluso más preferiblemente, no más de 40 sustituciones de aminoácidos, todavía más preferiblemente, no más de 30 sustituciones de aminoácidos e incluso todavía más preferiblemente, no más de 20 sustituciones de aminoácidos ni más de 15 sustituciones de aminoácidos. También se revela un péptido o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención que contiene al menos uno, pero no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 sustitución de aminoácido. El número de adiciones, sustituciones y/o eliminaciones de la secuencia polipeptídica de la invención o de fragmentos de la misma puede ser de al menos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 10–50 ó 50–150, en la que las sustituciones conservadoras de los aminoácidos son más preferibles que las sustituciones no conservadoras.

Usos terapéuticos

La presente invención también proporciona reactivos con un valor terapéutico útil. Las composiciones de unión terapéuticas de la invención incluyen, p.ej., sin limitación, composiciones de unión de anticuerpo de la invención (incluyendo fragmentos, análogos y derivados de las mismas según lo descrito en la presente memoria) y las moléculas de ácido nucleico que las codifican (incluyendo fragmentos, análogos y derivados de las mismas, y anticuerpos anti–idiotípicos según lo descrito en la presente memoria). Tal anticuerpo se puede usar para modular, tratar, inhibir, mejorar o prevenir enfermedades, trastornos o afecciones vinculadas a la expresión anómala y/o la actividad de TGF beta 1 (o un fragmento de la misma), incluyendo, p.ej., sin limitación, una cualquiera o más de las enfermedades, trastornos, síndromes o afecciones descritas en la presente memoria. El tratamiento, la mejoría y/o la prevención de enfermedades, trastornos o afecciones vinculadas a la expresión y/o la actividad anómala de TGF beta 1 incluyen, p.ej., sin limitación, los síntomas de mejoría asociados con esas enfermedades, trastornos o afecciones.

Por ejemplo, una enfermedad o un trastorno vinculado a la expresión anormal o la señalización anormal de TGF beta 1 es una diana de un antagonista de TGF beta 1, tal como una composición de unión de la invención. La invención engloba terapias basadas en la composición de unión que implican administrar una composición de unión a un animal, preferiblemente, un mamífero, lo más preferible, a un primate (p.ej., un ser humano), para modular, tratar, inhibir, afectar o mejorar una o más enfermedades, trastornos o afecciones revelados que se describen en la presente memoria. Por ejemplo, sin quedar vinculados a ninguna teoría, se ha observado que los anticuerpos específicos de las TGF beta humanas son eficaces en modelos animales para el tratamiento de enfermedades en las que se sobre–expresa el receptor de TGF (TGFR). Se ha observado que el antisuero contra las TGF beta es eficaz en el tratamiento de la glomerulonefritis (Border, et al. 1990 Nature 346:371–4); y la fibrosis pulmonar (Giri, et al. 1993 “Thorax” 48:959–66). Por consiguiente, las nuevas composiciones de unión de la invención con mejores características también serían eficaces en la mejoría de afecciones, estados o enfermedades, tales como, p.ej., las enfermedades y afecciones fibróticas vinculadas a TGF beta 1.

Las composiciones de unión recombinantes y/o aisladas de la invención, tales como, p.ej., los anticuerpos, se pueden purificar y administrar a un sujeto para su tratamiento. Estos reactivos se pueden combinar para su uso con ingredientes activos o inertes adicionales, p.ej., en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, p.ej., adyuvantes inmunógenos, junto con estabilizadores y excipientes fisiológicamente inócuos. Estas combinaciones pueden ser filtradas en condiciones estériles y colocadas en formas farmacéuticas como mediante liofilización en viales de dosificación o almacenarlas en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención también contempla el uso de anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos, incluyendo formas que no son de unión a complementos.

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Otro enfoque terapéutico incluido en la invención implica la administración directa de reactivos, formulaciones o composiciones mediante cualquier técnica de administración convencional (tal como, p.ej., sin limitación, inyección local, inhalación o administración sistémica) a un sujeto. La invención también proporciona un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos de uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención e instrucciones, tales como, p.ej., para su eliminación (comúnmente, en una forma prescrita por un organismo gubernamental que regule la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos). Los procedimientos de administración incluyen la administración intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, la difusión transdérmica y otras. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones y otros compuestos descritos, p.ej., en el Índice Merck, Merck & Co., Rahway, NJ.

Se conocen otras afecciones de anomalías del desarrollo englobadas en la presente memoria en los tipos de células que poseen ARNm de TGF beta 1 mediante análisis de transferencia Northern (véase, p.ej., Berkow (ed.) “The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn et al. “Harrison’s Principles of Internal Medicine”, McGraw–Hill, N.Y.; y Rich (ed.) “Clinical Immunology; Principles and Practice”, Mosby, St. Louis (cur. ed.); y más adelante). Las anomalías funcionales o del desarrollo (p.ej., del sistema neuronal, inmune o hematopoyético) provocan anomalías y afecciones médicas relevantes que pueden ser susceptibles a la prevención o el tratamiento con las composiciones proporcionadas en la presente memoria.

Otro enfoque terapéutico incluido en la invención implica la administración directa de reactivos, formulaciones o composiciones mediante cualquier técnica de administración convencional (tal como, p.ej., sin limitación, inyección local, inhalación o administración sistémica) a un sujeto. Los reactivos, las formulaciones o las composiciones englobadas pueden ser dirigidos por cualquier procedimiento descrito en la presente memoria o conocido en la técnica. La dosis real de reactivo, formulación o composición que modula una enfermedad, trastorno, afección, síndrome, etc., depende de muchos factores, incluyendo el tamaño y la salud del organismo, sin embargo, cualquier experto habitual en la técnica puede hacer uso de las siguientes enseñanzas que describen procedimientos y técnicas para determinar las dosis clínicas (véase, p.ej., Spilker (1984) “Guide to Clinical Studies and Developing Protocols”, Raven Press Books, Ltd., Nueva York, pp. 7–13, 54–60; Spilker (1991) “Guide to Clinical Trials”, Raven Press, Ltd., Nueva York, pp. 93–101; Craig y Stitzel (eds. 1986) “Modem Pharmacology”, II ed., Little, Brown y Co., Boston, pp. 127–33; Speight (ed. 1987) “Avery’s Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics”, III ed., Williams y Wilkins, Baltimore, pp. 50–56; Tallarida, et al. (1988) “Principles in General Pharmacology”, Springer–Verlag, Nueva York, pp. 18–20; y las patentes estadounidenses n.º 4.657.760; 5.206.344;

o 5.225.212). Generalmente, se administra en el intervalo de aproximadamente entre 0,5 fg/ml y 500 ug/ml, concentración final incluida, al día a un adulto humano en cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, los experimentos con animales proporcionan una guía fiable para determinar las dosis eficaces para la terapia en seres humanos. El interpolación entre especies de dosis eficaces se puede realizar siguiendo principios conocidos en la técnica (véase, p.ej., Mordenti y Chappell (1989) "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," en Toxicokinetics and New Drug Development; Yacobi, et al. (eds.), Pergamon Press, N.Y.

También se pueden extrapolar las dosis eficaces usando curvas de dosis–respuesta derivadas de sistemas in vitro o sistemas analíticos de modelos de animales. Por ejemplo, para anticuerpos, la dosis es comúnmente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal del receptor. Preferiblemente, una dosis es de entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg de peso corporal del receptor, más preferiblemente, de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal del receptor. Generalmente, los anticuerpos homo–específicos tienen una vida media mayor que los anticuerpos hetero–específicos (p.ej., los anticuerpos humanos duran más en un huésped humano que los anticuerpos de otras especies, p. ej. tales como un ratón, probablemente, debido a la respuesta inmune del huésped hacia la composición foránea). Así pues, a menudo es posible aplicar una dosis más baja de anticuerpos humanos y mediante una administración menos frecuente si los anticuerpos se administran a un sujeto humano. Además, la dosis y la frecuencia de administración de los anticuerpos de la invención se pueden reducir aumentando la absorción y la penetración en el tejido (p.ej., en el cerebro) usando modificaciones tales como, p.ej., la lipidación.

La invención también proporciona un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos de uno

: o más de los ingredientes de las composiciones de la invención, e instrucciones, tales como, p.ej., para su eliminación (comúnmente, en una forma prescrita por un organismo gubernamental que regule la fabricación, el uso

: o la venta de productos farmacéuticos o biológicos).

Las cantidades de reactivos necesarias para un tratamiento eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo los procedimientos de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. Por lo tanto, las dosis de tratamiento han de ser valoradas para optimizar la seguridad y la eficacia. Comúnmente, las dosis usadas in vitro pueden proporcionar una guía útil en las cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. La prueba en animales de las dosis eficaces para el tratamiento de determinados trastornos proporcionará otra indicación predictiva de la dosis humana. Por ejemplo, en Gilman, et al. (eds.) (1990) “Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics” (VIII ed.) Pergamon Press; y (1990) “Remington’s Pharmaceutical Sciences” (XVII ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA, se describen diversas consideraciones. En tales memorias y más adelante, se describen procedimientos de administración, p.ej., de administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica y otras. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones y otros compuestos descritos, p.ej., en el Índice Merck, Merck & Co., Rahway, NJ. Lo que habitualmente cabría esperar son intervalos de dosis en cantidades menores de concentraciones de 1mM, comúnmente, menores de concentraciones de aproximadamente 10μM, habitualmente, menores de aproximadamente 100nM, preferiblemente, menores de aproximadamente 10pM (picomolar), y lo más preferible, menores de aproximadamente 1fM (femtomolar) con un vehículo apropiado. A menudo, se utilizarán formulaciones de liberación lenta o aparatos de liberación lenta para una administración continua.

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Las composiciones de unión se pueden administrar directamente en el huésped que se va a tratar o, en función del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugarlas con proteínas vehículo, tales como ovalbúmina o albúmina de suero antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas se pueden administrar en cualquier formulación de dosificación convencional. Aunque es posible administrar el ingrediente activo solo, es preferible presentarlo en forma de formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden comúnmente al menos un ingrediente activo, según lo definido en la presente memoria, junto con uno o más vehículos aceptables del mismo. Cada vehículo ha de ser tanto farmacéutica como fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con otros ingredientes y no perjudicial para el paciente. Las formulaciones incluyen aquéllas adecuadas para una administración oral, rectal, nasal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en una forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido en el campo de la Farmacia. Véase, p.ej., Gilman, et al. (eds.) (1990) “Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics” (VIII ed.) Pergamon Press; y (1990) “Remington’s Pharmaceutical Sciences” (XVII ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis, et al. (eds.) (1993) “Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker”, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) “Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets”, Dekker, NY; y Lieberman, et al. (eds.) (1990) “Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems”, Dekker, NY. El tratamiento de la presente invención se puede combinar con o usarse en asociación con otros agentes terapéuticos, tales como, p.ej., inhibidores ECA.

La invención también proporciona una composición farmacéutica. Tal composición comprende p.ej., una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente memoria, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” significa un vehículo aprobado por un organismo regulador federal de Estados Unidos, o un organismo regulador/administrativo de un gobierno estatal de Estados Unidos, o un vehículo que esté enumerado en la Farmacopea estadounidense u otra farmacopea; que es reconocido en general por los expertos en la técnica para su uso en un animal, p.ej., un mamífero y, más concretamente, en un primate, p.ej., un primate humano.

El término “vehículo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo que se administra con una composición de la invención. Un vehículo farmacéutico puede estar comúnmente en un líquido estéril, tal como agua o aceites (incluyendo aquellos de vaselina, de origen animal, vegetal o sintético, p.ej., tales como el aceite de cacahuete, al aceite de soja, el aceite mineral, al aceite de sésamo y similares). Comúnmente, el agua estéril es un vehículo preferido cuando se administra una composición farmacéutica intravenosamente. Las soluciones salinas y la dextrosa acuosa, así como las soluciones de glicerol también se pueden emplear como vehículos líquidos, particularmente, para soluciones inyectables.

Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen, p. ej., sin limitación, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Una composición de la invención, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH.

Una composición de la invención puede estar en una solución, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, cápsula, polvo, formulación de liberación sostenida, etc., o puede estar formulada como un supositorio (con aglutinantes tradicionales y/o vehículos, p.ej., tales como triglicéridos). Se describen otros ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados en la edición actual de “Remington’s Pharmaceutical Sciences” de E.W. Martin. Tales formulaciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de la invención, preferiblemente, en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar una administración adecuada a un sujeto. Tradicionalmente, la formulación se adaptará al modo de administración.

En una realización preferida, se formula una composición según procedimientos habituales como una composición farmacéutica adaptada a la administración intravenosa a, p.ej., un ser humano. Comúnmente, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, la composición también puede incluir, p.ej., un agente disolvente y un anestésico local, tal como lidocaína, para mayor comodidad con respecto a la zona de inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran bien por separado o mezclados en una forma farmacéutica unitaria, p. ej. como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado (tal como una ampolla o un sobre en el que se indique la cantidad de agente activo). Cuando se va a administrar una composición mediante infusión, se puede dispensar usando una botella de infusión que contenga agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Cuando se va a administrar una composición mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina, de manera que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administración.

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Las composiciones de la invención se pueden formular como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, p.ej., sin limitación, sales aniónicas (tales como las derivadas de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc.) y las sales catiónicas (p.ej., tales como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2–etilamino–etanol, histidina, procaína, etc).

Enfermedades, trastornos o afecciones fibróticas

Una composición de unión, p.ej., tal como un anticuerpo, es útil en el tratamiento de afecciones asociadas con las enfermedades fibróticas. La acumulación de componentes de la matriz extracelular (MEC) o la sustitución del material celular normal por componentes de la MEC en una amplia variedad de células, tejidos y órganos puede producir una fibrosis productora de enfermedades. La fibrosis progresiva puede ser mortal, conduciendo a una insuficiencia orgánica final en múltiples órganos, tales como, por ejemplo, el riñón. Tanto los datos preclínicos como los clínicos indican que la proteína TGF beta 1 contribuye de una manera fundamental en la deposición de las proteínas matriciales en la fibrosis intersticial, y está implicada en el inicio y la progresión de una serie de estados patológicos fibróticos asociados, incluyendo la fibrosis renal, que es común a todas las formas de enfermedad renal crónica (ERC). El grado de fibrosis renal coincide positivamente con la progresión hacia la insuficiencia renal crónica (IRC, también conocida como enfermedad renal en etapa terminal (ERET)), que puede conducir a la diálisis crónica

o al transplante renal y la muerte. La TGF beta 1 es la citocina que se relaciona más sistemáticamente, tanto experimentalmente como por asociación en estudios humanos y animales, con tales procesos fibróticos.

Los profundos efectos de la TGF beta 1 en la MEC, incluyendo su papel en la estimulación de la síntesis y la inhibición de la degradación de los componentes de la matriz extracelular, han sido el objeto de numerosos estudios (véase, p.ej., Rocco y Ziyadeh 1991 en Contemporary Issues in Nephrology v. 23, "Hormones, autocoids and the kidney" Ed. Jay Stein, Churchill Livingston, Nueva York pp.391–410; Roberts, et al. 1988 Rec. Prog. Hormone Res. 44:157–97). La TGF–Beta 1 puede producir la acumulación de la MEC de múltiples modos cooperativos, por ejemplo, la TGF beta 1 estimula la expresión de ARNm y la producción proteica de los componentes clave de la MEC, incluyendo el colágeno de tipo I, el colágeno de tipo IV, la fibronectina y la laminina (Sharma y Ziyadeh 1997, Semin Nephrol 17:80–92). Al mismo tiempo, TGF–Beta 1 impide la degradación de la MEC inhibiendo la producción de proteasas (tales como, p.ej., el activador del plasminógeno, la colagenasa, la elastasa y le estromelisina) que digieren la matriz y mediante la activación de inhibidores de esas proteasas, tales como, p.ej., inhibidores tisulares de metaloproteinasas y el inhibidor 1 del activador del plasminógeno (Sharma y Ziyadeh 1995 Kidney Int 51:S34–6). La TGF beta 1 también sobrerregula las integrinas y los receptores de la superficie celular de la MEC, aumentado así la capacidad de las células para interactuar con proteínas específicas de la MEC (Heino, et al. 1989 J Biol Chem 264:380–8). Además, la TGF beta 1 tiene una potente propiedad quimiotáctica para atraer células de la MEC, tales como fibroblastos y células fagocíticas (Reibman, et al. 1991 PNAS 88:6805–9). Además, la TGF beta 1 tiene una capacidad peculiar para inducir su propia expresión amplificando potencialmente procesos fibróticos anómalos (Kim, et al. 1990 Mol Cell Biol 10:1492–7).

La TGF beta 1 está implicada en las siguientes enfermedades, síndromes y/o afecciones:

 Enfermedad renal: tal como, p.ej., la enfermedad renal crónica (ERC); la insuficiencia renal crónica (IRC); la enfermedad renal en etapa terminal (ERET)); la glomerulonefritis (GN), incluyendo, p.ej., GN proliferativa mesangial, GN mesangiocapilar, GN membranosa, GN focal y segmental, GN inmune y GN crescéntica; glomeruloesclerosis; nefroesclerosis, nefropatía membranosa, nefropatía de la inmunoglobulina A (IgA); fibrosis intersticial renal; esclerosis glomerular segmental focal, fibrosis renal en pacientes transplantados que reciben ciclosporina; rechazo crónico a transplante renal; nefropatía asociada con el VIH; hipertrofia celular renal; fibrosis tubulointersticial que acompaña a las enfermedades renales crónicas, incluyendo la producida por una obstrucción del tracto urinario o nefropatía asociada con analgésicos o la producida tras un episodio de insuficiencia renal aguda, tal como la insuficiencia renal aguda producida por una isquemia renal (Spurgeon et al., Am. J Physiol Renal Physiol 288:F568– F577, 2005); microangiopatía trombótica renal, tal como la asociada con, p.ej., el daño de las células endoteliales glomerulares u otros daños de células endoteliales microvasculares, tales como los vinculados a la preclampsia, endotoxemia y exposición a radiación; vasculitis renal; glomerulonefritis necrotizante focal; nefropatía diabética [la TGF beta 1 está asociada con la IRC a través de diversos eventos complejos que afectan a la mayoría de las células del riñón (Bottinger, 2002, J. Am. Soc. Nephrol. 13, 2600). Estos hechos producen en última instancia tanto fibrosis tubulointersticial como glomerulosclerosis que conducen a la pérdida de la función del nefrón y, finalmente, a la insuficiencia renal crónica. De las tres isoformas de TGF beta, la TGF beta 1 parece predominar en la mediación de la progresión de la enfermedad renal crónica, no sólo por ser la isoforma expresada con mayor predominancia, sino también porque tanto TGF beta 2 como TGF beta 3 parecen mediar sus efectos a través de la sobrerregulación de la expresión de TGF beta 1 (Yu, 2003, Kid. Int. 64, 844). Los estudios tanto in vitro como in vivo implican a TGF–Beta 1 en la patogénesis de la enfermedad renal diabética, incluyendo las complicaciones asociadas con la diabetes mellitus de tipo 1 o tipo 2, tales como, p.ej., la glomeruloesclerosis y la fibrosis tubulointersticial (Ziyadeh 1998 Cur. Pract. Med. 1:87–9). El antisuero contra las TGF beta es eficaz en el tratamiento de la glomerulonefritis (Border et al. 1990 Nature 346:371–4)]; la enfermedad renal fibrótica [TGF beta 1 media la hipertrofia celular renal, otra característica de la nefropatía diabética mediante la interferencia con la regulación normal del ciclo celular induciendo inhibidores de cinasa dependientes de la ciclina, tales como p27Kip1 y p21Cip1 (Wolf y Ziyadeh 1999 Kidney Int 56:393–405). Estos inhibidores también son aumentados por niveles elevados de glucosa y el estado diabético (Wolf, et al. 2001 Am J Pathol; 158:1091–1100; Wolf, et al. 1999 “Diabetologia” 42:1425–32; Wolf, et al. 1997 Am J Physiol 273:F348–56). Inhiben la actividad de las cinasas dependientes de la ciclina, predominantemente, de la cinasa 2 dependiente de la ciclina y la cinasa E de la ciclina (Liu y Preisig 1999 Am J Physiol 277: F186–94), inhibiendo, por tanto, la fosforilación de la proteína del retinoblastoma y deteniendo una célula en la fase G1 tardía. La célula entra en un período de síntesis de proteínas sin la replicación de ADN y sufre una hipertrofia. Por lo tanto, la TGF beta 1 produce cambios a nivel celular que se traducen en características patofisiológicas de nefropatía diabética.]; nefropatía diabética experimental; nefroesclerosis hipertensiva [como la estructura y las propiedades de filtración de los glomérulos se determinan en buena parte por la composición de la matriz extracelular del mesangio y la membrana glomerular, no es de extrañar que la TGF beta 1 tenga profundos efectos en el riñón. La TGF beta 1 media en los cambios patológicos de la enfermedad renal diabética (Ziyadeh 1998 Cur Prac Med 1:87–89). La acumulación de la matriz mesangial en la glomerulonefritis proliferativa (Border, et al. 1990 Kidney Int. 37:689–695) y la nefropatía diabética (Mauer, et al. (1984) J. Clin. Invest. 74:1143–1155) son características patológicas claras y dominantes de las enfermedades. Los niveles de TGF–Beta 1 son elevados en la glomeruloesclerosis diabética humana (nefropatía avanzada) (Yamamoto, et al. 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1814–1818). También se ha descubierto que TGF–Beta 1 es un importante mediador en la génesis de fibrosis renal en una serie modelos animales (Phan, et al. 1990 Kidney Int. 37:426; Okuda, et al. 1990 J. Clin. Invest. 86: 453). Se ha demostrado la supresión de la glomerulonefritis inducida experimentalmente en ratas usando antisuero contra TGF beta (Border, et al. 1990 Nature 346:371) y mediante una proteína de la matriz extracelular, la decorina, que se puede unir a TGF– Beta 1 (Border, et al. 1992 Nature 360:361–363; véase, también, p.ej., Border y Noble 1994 N. Engl. J. Med. 331:1286–92; Border, et al. 1989 Semin. Nephrol. 9:307–17; Han, et al. 2000 Am J Physiol Renal Physiol 278: F628– 34; y Ziyadeh, et al. 2000 PNAS 97:8015–20)]. Por consiguiente, una composición de unión de la invención sería útil para el tratamiento, la mejoría, la modulación, el diagnóstico y/o la inhibición de una enfermedad, un trastorno, un síndrome y/o una afección según lo descrito anteriormente.

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 Enfermedad hepática: tal como, p.ej., cirrosis; fibrosis hepática [la fibrosis hepática es una respuesta habitual a la necrosis o la lesión hepatocelular, que puede ser inducida por una amplia variedad de agentes, p.ej., cualquier procedimiento que perturbe la homeostasis hepática (especialmente, la inflamación, el daño tóxico o la modificación del flujo sanguíneo hepático) e infecciones del hígado (virales, por hongos y parasitarias). Hay numerosos trastornos de almacenamiento debidos a errores inherentes al metabolismo que a menudo están asociados con la fibrosis, incluyendo las anomalías lipídicas (enfermedad de Gaucher); las enfermedes del almacenamiento del glucógeno (especialmente los tipos III, IV, VI, IX y X); la deficiencia de la 1–antritripsina; el almacenamiento de sustancias exógenas, como el observado en los síndromes de sobrecarga de hierro (hemocromatosis) y las enfermedades del almacenamiento del cobre (enfermedad de Wilson); la acumulación de metabolitos tóxicos (como en tirosinemia, fructosemia y galactosemia); y los trastornos peroxisomales (Síndrome de Zellweger). Hay numerosos compuestos químicos y fármacos que producen fibrosis, especialmente, el alcohol, el metotrexato, la isoniazida, la oxifenisatina, la metildopa, la clorpromazina, la tolbutamida y la amiodarona. Las perturbaciones de la circulación hepática (p.ej., la insuficiencia cardiaca crónica, el Síndrome de Budd–Chiari, la enfermedad veno–oclusiva, la trombosis de la vena porta) y la obstrucción crónica del flujo biliar pueden conducir a la fibrosis. Por último, la fibrosis hepática congénita es una malformación recesiva autosomal.

A nivel mundial, la mayoría de las personas que tienen hepatitis viral crónica o esteatohepatitis se asocian bien con el alcohol o con la obesidad, pero otros ataques inductores de fibrosis incluyen, por ejemplo, enfermedad parasitaria (p.ej., esquistosomiasis), ataque autoinmune sobre los hepatocitos o el epitelio biliar, la enfermedad hepática neonatal, trastornos metabólicos, incluyendo la hemocromatosis de Wilson y una variedad de enfermedades del almacenamiento, afecciones inflamatorias crónicas (p.ej., sarcoidosis), toxicidad por fármacos (p.ej., metotrexato o hipervitaminosis A) y trastornos vasculares, bien congénitos o adquiridos.

Las células estelares hepáticas (CEH) son una importante fuente celular de MEC en la fibrosis hepática (Li y Friedman 1999 J. Gastroenterol. Hepatol. 14:618–33). Las CEH residen en el espacio perisinusoidal de Disse, que separa los hepatocitos del endotelio sinusoidal. Los ataques hepáticos como los descritos activan las CEH normalmente quiescentes que conducen a su posterior proliferación y activación. Las CEH activadas sufren una posterior transdiferenciación fenotípica en miofibroblastos (MFB) contráctiles que expresan actina del músculo liso y un exceso de moléculas de MEC observadas en la fibrosis hepática. La transdiferenciación de las CEH en MFB se debe a la sobre–expresión de TGF–β1 en su función como regulador clave de la respuesta fibrótica hepática al estrés y el daño (Gressner, et al. 2002 Front Biosci. 7:d793–807). La TGF–β1 es el inductor más potente que se conoce de la fibrogénesis en las células efectoras de la fibrosis hepática (Schuppan, et al. 2003 Cell Death Differ. 10 Supl 1:S59–67). Por consiguiente, se elevan los niveles en tejido y suero de la TGF–β1 activa en la fibrosis hepática, y se ha observado que la sobre–expresión de TGF–β1 en ratones transgénicos y la aplicación de TGF–β1 exógena induce a la fibrosis orgánica (Kanzler, et al. 1999 Am. J. Physiol. 276:G1059–68; Sanderson, et al. 1995 PNAS 2572–76). Además, la fibrosis experimental se puede inhibir mediante tratamientos contra TGF–β1, p.ej., con anticuerpos neutralizantes o receptores de las TGF solubles (George, et al. 1999 PNAS 12719–24; Qi, et al. 1999 PNAS 2345–49). La expresión observada de TGF–β1 por parte de las CEH y los MFB activados, la posibilidad que tiene TGF–β1 de sobrerregular la expresión de la MEC y la expresión de los receptores de TGF en las CEH ha conducido a un modelo ampliamente aceptado en el que la persistente autoestimulación o la estimulación de la paracrina de las HSC y los MFB activados por parte de TGF–β1 es la respuesta fibrogénica clave en la estimulación de la fibrosis orgánica. Por consiguiente, se prevé que la reducción de TGF–β1 reduce la fibrogénesis hepática (Wu y Zern 2000 J. Gastroenterol. 35:665–72)].

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 Enfermedad pulmonar: tal como, p.ej., fibrosis pulmonar (Giri et al. “Thorax” 48, 959–966, 1993); fibrosis pulmonar idiopática; síndrome de distrés respiratorio en adultos; neumonía organizativa criptogénica, bronquiolitis obliterante (BO), bronquiolitis obliterante (asociada con un trasplante); enfermedad pulmonar inducida por fármacos; enfermedad pulmonar inducida por radiación; fibrosis localizada alrededor de las vías respiratorias en asma y enfisema; neumonitis por hipersensibilidad; neumonía organizativa criptogénica (NOC); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); neumonitis intersticial aguda (NIA); asbestosis; fibrosis pulmonar intersticial asociada con trastornos autoinmunes, tales como el lupus eritematoso sistémico y la esclerodermia, el contacto químico o las alergias; asma; enfermedad pulmonar crónica neonatal (EPC) [La mala regulación de la expresión de TGF–β1 desempeña un papel importante en la patogénesis del desarrollo anómalo de las vías respiratorias en una serie de enfermedades pulmonares crónicas, incluyendo el asma, la fibrosis pulmonar y la enfermedad pulmonar crónica neonatal (EPC) (Holgate, et al. 2001 Int Arch Allergy Immunol 124 1–3:253–8; Khalil, et al. 2001 “Thorax” 56 12:907– 15; Lecart, et al. 2000 Biol Neonate 77 4:217–23; Pulleyn, et al., 2001 Hum Genet 109 6:623–7; Sagara, et al., 2002 J Allergy Clin Immunol 110 2:249–54; Sheppard, 2001 “Chest” 120 1 Supl:49S–53S; Strieter, 2001 “Chest” 120 1 Sup:77S–85S; Toti, et al. 1997 Pediatr Pulmonol 24 1:22–8). La sobre–expresión de la TGF–β1 activa a lo largo de las superficies alveolares de ratones conduce a una fuerte respuesta fibrótica, y la inhibición de TGF–β1 por los anticuerpos o señuelos anula la fibrosis inducida por la bleomicina (Kelly, et al. 2003 Cur. Pharm. Des. 9:3949). Además, el análisis con microdisposiciones de todo el ARNm pulmonar muestra que la mayoría de los genes inducibles por TGF–β1 conocidos son sobrerregulados durante la fibrosis inducida experimentalmente (Kaminski, et al. 2000 PNAS 97:1778–83)];

 Enfermedad cardiovascular: aterosclerosis; [la TGF–β está asociada con la aterosclerosis (véase, p.ej., T.A. McCaffrey: 2000 "TGF–βs and TGF–β Receptors in Atherosclerosis", Cytokine and Growth Factor Reviews 11:103– 114)]; crecimiento cardiaco hipertrófico (Schultz, et al. 2002 J Clin Invest. 109 (6): 787–96; Brand y Schneider 1995 J. Mol. Cell Cardiol. 27:518); esclerosis sistémica progresiva [paralelamente, el aumento de los niveles de TGF–β1 en la vasculatura envejecida son aumentos notables de los niveles de fibronectina (Li et al. 1999). Es indudable que estos cambios contribuyen al cambio de un vaso elástico en un vaso fibrótico/rígido]; la fibrosis microvascular inducida mecánicamente; sarcoidosis; fibrosis ventricular; enfermedad cardiaca isquémica inducida por radiación [se ha publicado un riesgo significativamente más alto de muerte debida a la enfermedad cardiaca isquémica para pacientes tratados con radiación por la enfermedad de Hodgkin y el cáncer de mama. Ciertas citocinas y factores de crecimiento, tales como TGF–β1, pueden estimular la proliferación endotelial inducida por radiación, la proliferación de fibroblastos, la deposición de colágeno y la fibrosis que conduce a lesiones avanzadas de aterosclerosis]; daño arterial (Wolf, et al. 1994 J. Clin. Invest. 93, 1172–8); insuficiencia venosa crónica (IVC); lesión restenótica tras una angioplastia coronaria transluminal percutánea (ACTP) o colocación de stents; Síndrome de Hermansky–Pudlak; polimiositis; esclerodermia; dermatomiositis; fascitis eosinófila; morfea o aquellas asociadas con la aparición del Síndrome de Raynaud; fibrosis perivascular de la vasculatura coronaria intramural de miocardio no infartado; hiperplasias inducidas por lesiones, tales como, p.ej., restenosis, fibrosis por aterosclerosis con enfermedad vascular por colágeno [TGF–β1 puede ser un factor en el engrosamiento progresivo de la pared arterial producido por la proliferación de las células del músculo liso y la deposición de matriz extracelular en la arteria tras una angioplastia de balón. El diámetro de la arteria sometida a la restenosis se puede reducir un 90% mediante este engrosamiento y como la mayor parte de la reducción del diámetro se debe a la matriz extracelular en lugar de a cuerpos de células del músculo liso, puede ser posible abrir estos vasos hasta un 50% simplemente reduciendo la extensa deposición de la matriz extracelular. En arterias de cerdo no dañadas transfectadas in vivo con un gen de TGF–β1, la expresión de genes de TGF–β1 resultó estar asociada tanto con la síntesis de la matriz extracelular como con la hiperplasia (Nabel, et al., 1993 PNAS 90:10759–63)]; histiocitosis X (granuloma eosinófilo);

 Fibrosis de tejidos blandos: (Border y Ruoslahti 1992 J Clin Inv 90:1–7; Border y Noble 1994 N Engl J Med 331: 1286–91); disfunción eréctil (Moreland, R. 1998 Int J Impot Res 10:113–20); artritis reumatoide (Wahl, et al 1993

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J. Exp. Medicine 177, 225–30);

 Cicatrización de heridas: cicatrización dérmica; lesión por quemadura; cicatrización hipertrófica; formación de queloide; cicatrización conjuntiva (Cordeiro MF, 2003 Clin Sci (Lond). 104(2): 181–7) [El tratamiento de heridas fetales con diferentes concentraciones de TGF–β1 generó una notable cicatrización de estas heridas, lo que mostró una implicación directa de TGF–β1 en la cicatrización cutánea (Sullivan, et al. 1995 J Pediatr Surg 30:198–203). Se ha observado que los anticuerpos neutralizantes de TGF–β1 inyectados en los bordes de las heridas en cicatrización de ratas inhibe la cicatrización sin interferir en la velocidad de curación de la herida o la fuerza tensil de la herida. Al mismo tiempo, se redujo la angiogénesis, se redujo el número de macrófagos y monocitos en la herida y se redujo la cantidad de deposición de fibra de colágeno desorganizada en el tejido de la cicatriz (Shah, et al. 1992 Lancet 339:213–4; Shah et al. 1994 J. Cell Science 107:1137–57; Shah et al. 1995 J Cell Sci. 108:985–1002). Se produjo una menor respuesta de cicatrización en las heridas de los ratones tratadas tópicamente con TGF–β1 antisentido (Choi, et al. 1996 Immunol Cell Biol 74:144–50). La aplicación tópica de un antagonista sintético de la TGF–β1 redujo la cicatrización de heridas porcinas por quemaduras y excisiones, así como en excisiones cutáneas en conejos (Huang, et al. 2002 FASEB J 16:1269–70; Werner y Grose 2003 Physiol Rev 83(3): 835–70)];

 Enfermedad inflamatoria: enfermedad intestinal inflamatoria (EII) tal como, p.ej., la enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (CU) [La inflamación intestinal depende del equilibrio entre las citocinas inflamatorias, especialmente, IFN–γ, y la actividad de TGF–β1 (Strober, et al. 1997 Immunol. Today 18:61–4; Neurath, et al. 1996

J. Exp. Med. 183, 2605–16; Ludviksson, et al. 1997 J. Immunol. 159; Boirivant, et al. 1998 J. Exp. Med. 188, 1929– 39; Powrie, et al. 1996 J. Exp. Med. 183, 2669–74). La lesión del tejido del aparato digestivo mediada inmunológicamente está asociada con el aumento de la producción de citocinas proinflamatorias, que activa el factor de transcripción NF kappa–B en una variedad de tipos de células diferentes]; artritis reumatoide (AR); hiperplasia sinovial [la TGF–β1 es elevada en el fluido sinovial de la artritis reumatoide humana (Lotz, et al. 1990 J. Immunol. 144:4189–94). La TGF–β1 forma brotes en las articulaciones óseas dolorosos denominados osteofitos (van Beuningen, et al. 1994 Lab. Invest. 71:279–90), hiperplasia sinovial e inflamación en AR (Hamilton, et al. 1991 PNAS 88:7180–4). La inhibición de la TGF–β1 en modelos murinos de artritis da como resultado la prevención de la formación de osteofitos e impide la reparación del cartílago, lo que sugiere su función de estos hechos patológicos (Scharstuhl, et al. 2002 Immunol. 169:507–14)];

 Enfermedades proliferativas celulares: Numerosos datos demuestran que la TGF–β1 no sólo tiene potencial transformante, sino que también dirige la progresión, invasión y metástasis malignas tanto in vitro como in vivo (Derynck, et al. 2001 Nat. Genet 29:117–29; Cui, et al. 1996 Cell 86:531–42). Los ejemplos de estados, enfermedades, trastornos, síndromes y/o afecciones hiperproliferativos incluyen, p.ej., sin limitación, un neoplasma de colon, abdomen, óseo, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, sistema endocrino (p.ej., una glándula suprarrenal, una glándula paratiroidea, la pituitaria, los testículos, el ovario, el timo o el tiroides), ocular, cabeza, cuello, sistema nervioso (central o periférico), el sistema linfático, pelvis, piel, bazo, tórax y sistema urogenital. De igual manera, otras afecciones hiperproliferativas incluyen, p.ej., sin limitación, hipergammaglobulinemia, afecciones linfoproliferativas, paraproteinemias, púrpura, sarcoidosis, Hamartoma, Síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, Síndrome de la enfermedad de Gaucher, histiocitosis y otros estados hiperproliferativos.

A pesar de la actividad de supresión tumoral de TGF–β1, las células tumorales muestran a menudo una mayor producción de este factor de crecimiento (Derynck, et al. 1987 Cancer Res. 47:707–12; Dickson, et al. 1987 PNAS 84:837–41) y hay numerosas pruebas que documentan su papel en el fomento de tumores a través de sus efectos sobre la invasión de las células tumorales y los cambios en el microentorno tumoral. Actualmente, es obvio que la proteína TGF–β1 puede actuar como un supresor tumoral y como un estimulador relevante de la progresión, invasión y metástasis tumoral. En las fases tempranas de la tumorigénesis, tales como cuando el tumor todavía es benigno, TGF–β1 actúa directamente sobre la célula cancerosa para inhibir el brote del tumor. Sin embargo, a medida que progresa el tumor, los cambios genéticos y/o bioquímicos permiten a TGF–β1 estimular la progresión tumoral mediante sus actividades pleyotrópicas tanto sobre la célula cancerosa en sí como sobre los tipos de células estromales no malignas del tumor. La estimulación de la invasión y la metástasis por parte de TGF–β1 podría tener consecuencias clínicas mayores que su papel supresor del tumor, pues la mayoría de los tumores humanos conservan una ruta de señalización de TGF–β funcional (Akhurst y Derynck 2001 Trends Cell Biol. 11:S44–51).

Hay un volumen sustancial de pruebas que demuestran que la producción excesiva de TGF–β1 en enfermedades proliferativas celulares está asociada con un mal pronóstico (Tsushima et al. 1996 Gastroenterology 110:375–82; Adler et al. 1999 J. Urol. 161:182–7). Hay varios tipos de cáncer en los que la TGF–β1 producida por el tumor puede ser perjudicial. Las células de cáncer de próstata de rata MATLyLu (Steiner y Barrack 1992 Mol. Endocrinol 6:15–25) y las células de cáncer de mama humanas MCF–7 (Arteaga, et al. 1993 “Cell Growth and Differ”, 4:193–201) se vuelven más tumorigénicas y metastásicas tras la transfección con un vector que expresa la TGF–β1 de ratón. La TGF–β1 está asociada con la angiogénesis, la metástasis y el mal pronóstico del cáncer gástrico avanzado y de próstata humano (Wikstrom, P., et al. (1998) “Prostate” 37:19–29; Saito, H. et al. (1999) Cancer 86: 1455–62). En el cáncer de mama, el mal pronóstico está asociado con una TGF–β1 elevada (Dickson, et al. 1987 PNAS 84:837–41; Kasid, et al. 1987; Cancer Res. 47:5733–8; Daly, et al. 1990 J. Cell Biochem. 43:199–211; Barrett–Lee, et al. 1990 Br. J Cancer 61: 612–7; King, et al. 1989 J. Steroid Biochem, 34:133–8; Welch, et al. 1990 PNAS 87:7678–82; Walker, et al. 1992 Eur. J. Cancer 238:641–4) y la inducción de TGF–β1 mediante un tratamiento con tamoxifén (Butta, et al. 1992 Cancer Res. 52:4261–4) está asociada con un fallo del tratamiento con tamoxifén para el cáncer de mama (Thompson, et al. 1991 Br. J. Cancer 63:609–14). Los anticuerpos anti–TGF–β1 inhiben el crecimiento de células de cáncer de mama humanas MDA–231 en ratones atímicos (Arteaga, et al. 1993 J. Clin. Invest. 92:2569– 76), un tratamiento que está relacionado con un aumento de la actividad de las células asesinas naturales del bazo. Las células CHO transfectadas con TGF–β1 latente también muestran una menor actividad de las células NK y un mayor crecimiento tumoral en ratones atímicos (Wallick, et al. 1990 J. Exp. Med. 172:1777–84). Así pues, la TGF–β1 secretada por los tumores de mama puede producir una inhibición inmune endocrina. Las concentraciones altas en plasma de la TGF–β1 indican un mal pronóstico para los pacientes con cáncer de mama avanzado (Anscher, et al. 1993 N. Engl. J. Med. 328:1592–8). Los pacientes que tienen un valor alto de TGF–β1 en circulación antes de una dosis alta de quimioterapia y un transplante autólogo de médula ósea tienen un alto riesgo de padecer la enfermedad veno–oclusiva hepática (15–50% de todos los pacientes con una tasa de mortalidad de hasta el 50%) y neumonitis intersticial idiopática (40–60% de todos los pacientes). Las implicaciones de estos descubrimientos son que los niveles elevados en plasma de la TGF–β1 pueden identificar a los pacientes en riesgo y que la reducción de TGF–β1 podría disminuir la morbilidad y la mortalidad en estos tratamientos en los pacientes con cáncer de mama.

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Muchas células malignas segregan TGF–β1, lo que sugiere que la producción de TGF–β1 puede proporcionar un mecanismo para que las células tumorales escapen de la inmunovigilancia del huésped. El establecimiento de una subpoblación de leucocitos con la señalización de TGF–β1 afectada en el huésped que porta un tumor ofrece un posible procedimiento para la inmunoterapia del cáncer. Un modelo animal transgénico con la señalización de TGF– β1 afectada en linfocitos T es capaz de erradicar un tumor de linfoma que sobre–exprese la TGF–β1 letal de manera normal, EL4 (Gorelik y Flavell, 2001 Nature Medicine 7(10): 1118–22). La infrarregulación de la secreción de TGF–β1 en células tumorales da como resultado la restauración de la inmunogenicidad en el huésped, mientras que la falta de sensibilidad de los linfocitos T hacia la TGF–β1 produce una diferenciación acelerada y una autoinmunidad, elementos que pueden ser necesarios para combatir los tumores que expresan autoantígenos en un huésped tolerado. Los efectos inmunosupresores de TGF–β1 también han estado implicados en una subpoblación de pacientes de VIH con una respuesta inmune menor de la predicha en base a sus recuentos de linfocitos T mediante CD4/CD8 (Garba, et al. 2002 J. Immunology 168:2247–54). Un anticuerpo neutralizante de TGF–β1 fue capaz de invertir el efecto en cultivo, lo que indica que puede haber otros inhibidores de anticuerpos contra TGF–β1 de utilidad en la inversión de la supresión inmune presente en este subconjunto de pacientes de VIH.

Los papeles duales de supresión/promoción tumoral de TGF–β1 se aclaran perfectamente en un sistema transgénico que sobre–expresa a TGF–β1 en queratinocitos. Aunque los transgénicos fueron más resistentes a la formación de lesiones cutáneas benignas, la tasa de conversión metastásica de los transgénicos se aumentó de manera espectacular (Cui, et al 1996 Cell 86(4): 531–42). La producción de TGF–β1 por células malignas en los tumores primarios aumenta a medida que avanzan las etapas de la progresión tumoral. Los estudios en muchos de los principales cánceres epiteliales sugieren que el aumento de producción de TGF–β1 por parte de los cánceres humanos tiene lugar como un hecho relativamente tardío durante la progresión tumoral. Además, la TGF–β1 asociada al tumor proporciona células tumorales con una ventaja selectiva y fomenta la progresión tumoral. Los efectos de TGF–β1 sobre las interacciones célula/célula y célula/estroma producen una mayor propensión a la invasión y la metástasis. La TGF–β1 asociada al tumor puede permitir que las células tumorales escapen de la vigilancia inmune, pues es un potente inhibidor de la expansión clonal de los linfocitos activados, como se observa, por ejemplo, en pacientes con tumores cerebrales o de mama agresivos (Arteaga, et al. 1993 J. Clin. Invest. 92:2569–76). La TGF–β1 inhibe la producción de la angiostatina. Las modalidades terapéuticas del cáncer, tales como la radioterapia y la quimioterapia provocan la producción de TGF–β1 activado en el tumor, seleccionando así el brote de células malignas resistentes a los efectos inhibidores del crecimiento de TGF–β1. Así pues, estos tratamientos contra el cáncer aumentan el riesgo y aceleran el desarrollo de la malignidad tumoral. Los agentes que previenen la transducción de señales mediada por la TGF–β1 podrían ser una estrategia terapéutica muy eficaz en tales situaciones. La resistencia de las células tumorales a TGF–β1 invalida muchos de los efectos citotóxicos de la radioterapia y la quimioterapia, y la activación de TGF–β1 dependiente del tratamiento en el estroma puede ser incluso perjudicial, pues puede convertir el microambiente más conductor de la progresión tumoral y contribuir al daño tisular que conduce a la fibrosis. Las células de cáncer de próstata expresan niveles elevados de TGF–β1, lo que parece aumentar el crecimiento y la metástasis del cáncer de próstata, estimulando la angiogénesis e inhibiendo las respuestas inmunes dirigidas contra las células tumorales. Las células de cáncer de próstata pierden con frecuencia sus receptores de las TGF beta y adquieren resistencia a los efectos anti–proliferativos y pro–apoptóticos de TGF–β1. Por consiguiente, la alta expresión de la TGF–β1 y la pérdida de la expresión de los receptores de las TGF beta se ha asociado a un pronóstico particularmente malo de los pacientes humanos de cáncer de próstata (Wikstrom, et al. 2000 Scand J Urol Nephrol. 34(2): 85–94). En el carcinoma hepatocelular (CHC), la inducción de la expresión de la TGF–β1 con la pérdida concomitante de la expresión de los receptores de TGF–β1 en los focos y nódulos hepáticos hace que los hepatocitos alterados se escapen de la apoptosis inducida por TGF–β1, dotando así a los hepatocitos alterados de una ventaja de crecimiento durante la hepatocarcinogénesis (Lim 2003, Mech Ageing Dev. 124(5): 697–708). En los carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello, la sobre–expresión de TGF–β1 en las etapas tempranas proporciona un microambiente de promoción tumoral (Lu, et al. 2004 Cancer Res 64(13): 4405–10); es posible usar una composición de unión para modular, mejorar, tratar, prevenir y/o diagnosticar una enfermedad, afección, trastorno o síndrome hiperproliferativo (tal como, p.ej., un neoplasma) mediante interacciones directas o indirectas. Por ejemplo, tal como mediante la prevención de la inhibición de la proliferación de células que, a su vez, modulan un estado hiperproliferativo (p.ej., la TGF beta 1 inhibe la proliferación y la diferenciación funcional de los linfocitos T, las células asesinas activadas por linfocinas, células NK, neutrófilos, macrófagos y linfocitos B (Letterio y Roberts 1998, "Regulation of the immune response by TGF Beta" Ann Rev Immunol 16:137–61); o mediante el aumento de una respuesta inmune (p.ej., mediante el aumento de la antigenicidad de una proteína implicada en una afección hiperproliferativa); o produciendo la proliferación, diferenciación o movilización de un tipo específico de célula (p.ej., un linfocito T). También se puede conseguir un efecto deseado mediante el uso de una composición de la invención bien, p.ej., aumentando una respuesta inmune existente o iniciando una nueva respuesta inmune. Alternativamente, se puede afectar el resultado deseado bien, p.ej., disminuyendo o bloqueando una respuesta inmune existente o evitando el inicio de una nueva respuesta inmune. La administración local a una célula que prolifera anormalmente se puede realizar mediante cualquier procedimiento o tecnología conocidos en la técnica tratados en la presente memoria, incluyendo, p.ej., sin limitación, transfección, electroporación, microinyección de células, o en vehículos (tales como un liposoma, lipofectina o un polinucleótido desnudo). “Condición de proliferación celular” pretende significar cualquier enfermedad, síndrome, trastorno, afección o estado humano o animal que afecte a cualquier célula, tejido, zona o cualquier combinación de órganos, tejidos o partes del cuerpo, que se caracteriza por una proliferación anómala local simple o múltiple de células, grupos de células o tejidos, bien benigna o maligna.];

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 Enfermedad neuronal: cicatrización neuronal (Logan et al. 1994 Eur. J. Neurosci. 6:355–63); anomalías cerebrovasculares; enfermedad de Alzheimer (Masliah, et al. 2001 Neurochemistry International 39:393–400) [Los niveles de ARNm de TGF–β1 del giro frontal medio se relacionan positivamente con el grado relativo de deposición de amiloide cerebrovascular en esa región cerebral, lo que sugiere un posible papel de TGF–β1 en las anomalías cerebrovasculares humanas. Los ratones transgénicos que sobre–expresan la TGF–β1 en astrocitos desarrollan anomalías cerebrovasculares del tipo de la enfermedad de Alzheimer (EA), incluyendo la astrocitosis perivascular, el engrosamiento de la membrana de la base microvascular y la acumulación del amiloide positivo en tioflavina S en ausencia de degeneración parenquimal. La sobreproducción crónica de TGF–β1 en el cerebro da como resultado daños estructurales y funcionales reminiscentes de aquéllos de los casos de EA con angiopatía amiloide (Buckwalter, et al. 2002 Ann N Y Acad Sci. 977:87–95]; retinopatía proliferativa (Chaturvedi, et al. 2002 Diabetes Care 25:2320–7)); otras enfermedades oculares asociadas con una afección fibroproliferativa vinculadas a la sobreproducción de TGF–β1 incluyen la vitreorretinopatía proliferativa que acompaña a la cirugía reparadora del desprendimiento de retina; extracción de catarata con implante de lente intraocular; y cirugía de drenaje de un glaucoma;

 Afecciones/estados hematopoyéticos: [El equilibrio natural entre los estimuladores endógenos y los inhibidores de la angiogénesis es aquél en el que las influencias inhibidoras predominan comúnmente (véase, p.ej., Rastinejad, et al., Cell 56345–355 (1989)). Cuando se produce la neovascularización en condiciones fisiológicas normales, tales como la cicatrización de heridas, la regeneración orgánica, el desarrollo embrionario y los procesos reproductivos femeninos, la angiogénesis está rigurosamente regulada, y delimitada espacial y temporalmente. En la angiogénesis patológica, tal como, p.ej., la producida durante la formación de tumores sólidos, estos controles reguladores fallan y la angiogénesis sin regular se puede convertir en patológica mediante el mantenimiento de la progresión de muchas enfermedades neoplásicas y no neoplásicas. Hay una serie de enfermedades graves que están dominadas por una neovascularización anómala (incluyendo, p.ej., el crecimiento y la metástasis de tumores sólidos, artritis, algunos tipos de afecciones oculares y psoriasis; véanse, p.ej., los artículos de Moses, et al., 1991 Biotech. 9630–634; Folkman, et al., 1995 N. Engl. J. Med., 333: 1757–63; Auerbach, et al., 1985 J. Microvasc. Res. 29:401–11; Folkman, "Advances in Cancer Research", Eds. Klein y Weinhouse, Academic Press, Nueva York, pp. 175–203 (1985); Patz, 1982 Am. J. Opthalmol. 94:715–43; y Folkman, et al., 1983 Science 221:719–25. La angiogénesis tumoral es crucial en el crecimiento y la invasión tumoral, pues los vasos sanguíneos llevan nutrientes y oxígeno a las células tumorales, permitiéndolas intravasarse en el sistema sanguíneo, lo que conduce a la metástasis. La TGF–Beta 1 actúa como un potente inductor de la angiogénesis en varios análisis (Roberts, et al. 1986 PNAS 83:4167–71; Madri, et al. 1988 J. Cell Biol. 106:1375–84; Yang y Moses 1990 J. Cell Biol. 111:731–74; Gajdusek, et al. 1993 J. Cell. Physiol. 157:133–44; Choi y Ballermann 1995 J. Biol. Chem. 270:21144–50), y modelos de ratón defectuosos en componentes de señalización de las TGF indican la importancia de la TGF–1 en el desarrollo vascular normal. Además, la TGF beta 1 y sus receptores ALK–5 y ALK–1 están implicados en la fase de maduración vascular de la angiogénesis (véase, p.ej., Bull Acad Natl Med. 2000; 184 (3):537–44). En una serie de condiciones patológicas, la angiogénesis contribuye a un estado patológico, p.ej., se han acumulado datos relevantes que sugieren que la formación de tumores sólidos depende de la angiogénesis (véase, p.ej., Folkman y Klagsbrun 1987 Science 235:442–7). En otra realización de la invención, la administración de una composición de unión proporciona el tratamiento, la mejoría, la modulación, el diagnóstico y/o la inhibición de una enfermedad, un trastorno, un síndrome y/o una afección asociados con la neovascularización o la expansión celular hematopoyética. Las afecciones malignas y metastásicas que pueden ser afectadas de una manera deseada con una composición de unión incluyen, p.ej., sin limitación, una malignidad, un tumor sólido y un cáncer como los descritos en la presente memoria, como los conocidos en la técnica (para más información sobre tales trastornos, síndromes, etc., véase, p.ej., Fishman, et al., Medicine, Ed. actual, J. B. Lippincott Co., Filadelfia 2002). Por ejemplo, los cánceres que se pueden ver afectados de este modo con el uso de una composición de la invención incluyen, p.ej., sin limitación, un tumor sólido, incluyendo, p.ej., cáncer de próstata, pulmón, mama, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótidas, tracto biliar, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, riñón, vejiga, tiroides; tumores primarios y metástasis; melanomas; glioblastoma; sarcoma de Kaposi; leyomiosarcoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer colorrectal; tumores malignos avanzados; y tumores en la sangre, tales como, p.ej., leucemia;

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 Infecciones: sepsis; [la infección por Leishmania en ratones es alterada de manera espectacular por el TFG– β1. Los ratones genéticamente resistentes se vuelven susceptibles a la infección por Leishmania tras la administración de TFG–β1. El TFG–β1 agravó la enfermedad, mientras que los anticuerpos contra el TFG–β1 detuvieron la progresión de la misma (Barral–Netto, et al. 1992 Science 257: 545–7)];.

 Pérdida de cabello: alopecia; pérdida de cabello [un anticuerpo anti–TFG–β1 neutralizante invirtió la inhibición del crecimiento de los queratinocitos provocada por andrógenos de una manera dependiente de la dosis, lo que sugiere que el TFG–β1 inducible por andrógenos derivado de las células de las papilas dérmicas en proceso de calvicie media la inhibición del crecimiento capilar en la alopecia androgenética y que, por tanto, cumple una función en la calvicie de patrón humano (Inui, et al. 2002 FASEB J. 16(14): 1967–9)]; así pues, la invención

proporciona un procedimiento para mejorar, modular, tratar, prevenir y/o diagnosticar una enfermedad y/o un trastorno relacionados con la angiogénesis que comprende la administración a un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad beneficiariamente eficaz de una composición de unión.

El amplio alcance de la presente invención se comprende mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar la invención a realizaciones específicas.

Ejemplos

Procedimientos generales

Muchos de los procedimientos estándar descritos en la presente memoria se describen o se hace referencia a ellos, p.ej., en Sambrook, et al. (2001) “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; y su página web asociada: (www.MolecularCloning.com); Ausubel, et al., “Biology”, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 y suplementos) “Current Protocols in Molecular Biology”, Wiley/Greene, NY; Bartlett y Stirling (2003) “PCR Protocols: Methods in Molecular Biology”, Vol. 226 Humana Press, NJ. Los procedimientos para la purificación de proteínas incluyen procedimientos tales como la precipitación en sulfato de amonio, la cromatografía en columna, la electroforesis, la centrifugación, la cristalización y otros; véase, p.ej., Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology vol. 182, y otros volúmenes de esta serie: Coligan, et al. (1995 y suplementos), “Current Protocols in Protein Science”, John Wiley and Sons, Nueva York, NY; Matsudaira (ed.) (1993) “A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing”, Academic Press, San Diego, CA; y la bibliografía del fabricante sobre el uso de los productos de purificación de proteínas, p.ej., Pharmacia, Piscataway, NJ, o Bio–Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión con segmentos apropiados (etiquetas epitópicas), p.ej., con una secuencia FLAG o un equivalente que se puede fusionar, p.ej., mediante una secuencia eliminable con proteasas. Véase, p.ej., Hochuli (1989) “Chemische Industrie” 12:69–70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87–98, Plenum Press, NY; y Crowe, et al. (1992) “QIAexpress: The High Level Expression and Protein Purification System”, QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

En, p.ej., Hertzenberg, et al. (eds.) V ed. 1996 “Weir’s Handbook of Experimental Immunology”, vols. 1–4, Blackwell Science; Bierer, et al., Eds. (2004) “Current Protocols in Immunology Wiley/Greene”, NY; y “Methods in Enzymology”, volúmenes: 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 y 163 Elsevier, EE.UU, se describen técnicas inmunológicas estándar.

Ejemplo 1: Construcción y rastreo de fragmentos Fab usando las CDR y los marcos humanos

Se usan enfoques estándar para caracterizar y sintetizar los bancos de CDR de regiones variables de anticuerpo de mutaciones simples (véase, p.ej., Wu et al, 1998, PNAS 95:6037–42). Los bancos se construyen en vectores de expresión de bacteriófago M13 que contienen genes de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo compuestos por las secuencias marco de regiones constantes y regiones variables humanas descritas en la presente memoria junto con las secuencias de las CDR de la invención. En algunos casos, primero se elimina la CDR diana antes del apareamiento de los nucleótidos. Se emplea una mutagénesis basada en codones para la síntesis de oligonucleótidos con el fin de producir las secuencias de las CDR de la invención.

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Los bancos se rastrean inicialmente mediante una ascensión de captura para identificar las variantes de mayor afinidad. El procedimiento de ascensión de captura (Watkins, 2002 Methods Mol. Biol. 178:187–93) se conoce en la técnica y se describe en los documentos WO/0164751 y US2002/0098189. Posteriormente, se siguen caracterizando los clones deseados mediante una valoración sobre antígeno inmovilizado en un ELISA y un análisis de la potencia de proliferación celular según lo descrito en la presente memoria. Tras tal rastreo, se determinan las constantes de disociación (Kd), las velocidades de asociación (Kon) y las velocidades de disociación (Koff) para un clon de interés.

Para identificar las posibles composiciones de unión de anticuerpo que comprenden las CDR donantes insertadoras de la invención, se insertan bancos de CDR sintéticas en un molde de eliminación según lo descrito en la presente memoria o como se conoce en la técnica. Se emplean técnicas de mutagénesis estándar (Kunkel, 1985 PNAS 82:488–92) para reemplazar una determinada CDR usando una mezcla de oligonucleótidos mutagénicos. Comúnmente, la colocación de la CDR en un marco se realiza usando el sistema definido por Kabat, a excepción de CDRH1, que es la suma de las definiciones de Kabat y Chothia. Los oligonucleótidos mutagénicos se aparean con un molde de fago uridinilado en el que se ha eliminado la CDR correspondiente.

El apareamiento se realiza incubando una reacción a 85˚C durante 5 minutos seguida por el enfriamiento lento hasta 20˚C en el transcurso de 45 minutos. Las muestras apareadas se colocan sobre hielo, se añade ADN polimerasa de T4 y ADN ligasa de T4 para generar ADN bicatenario y se incuba la reacción durante 5 minutos a 4˚C y después durante 90 minutos a 37˚C. Se extrae la reacción en fenol, se precipita en etanol y se somete el ADN resultante a electroporación en células DH10B. Se añaden células XLOLR a la reacción para permitir la amplificación de fagos antes de colocar los bancos en placas. Se preparan los cultivos patrón de fago mediante la adición de 8 ml de medio de crecimiento a las placas, tras lo que se incuban a 4˚C durante un mínimo de 4 horas. Se cosecha el medio que contiene fago, se aclara mediante centrifugación y se añade azida de sodio (0,02%) como conservante.

El rastreo inicial de los bancos se hace mediante elevación de las placas según lo descrito en Watkins, et al 1998 Anal Biochem 256: 169–77; y Watkins, 2002 Methods Mol. Biol., 178:187–93. Se incuban los filtros que contienen los fragmentos Fab expresados de las placas individuales unidos a anticuerpo kappa anti–humano inmovilizado consecutivamente con TGF beta 1 biotinilado (bio–TGF beta 1), fosfatasa alcalina con neutravidina (NA–AP) con lavados cortos entre cada incubación. Se secuencian los clones de interés y se siguen caracterizando mediante ELISA. En el ELISA se usaron, en general, placas de microtitulación Costar 3366 revestidas durante una noche a 4˚C con 0,4 ug/ml de TGF beta 1, TGF beta 2 o TGF beta 3. Posteriormente, se lavan las placas dos veces antes de la adición de 100 ul de solución de bloqueo (10 mg/ml de ASB en tampón de lavado) en cada pocillo. Se incuban las diluciones de los Fab en los pocillos revestidos durante 1,5 h a 22˚C. Tras lavar, se añade conjugado de kappa anti– humano–fosfatasa alcalina y se incuba durante 1 hora a 22˚C. Se añade sustrato colométrico tras un exhaustivo lavado y se mide la absorbancia a A560 para identificar clones positivos.

Análisis de los Fab mediante ELISA

En un ejemplo no restrictivo, se emplea un ELISA que usa placas de microtitulación Costar 3366 revestidas durante una noche a 4˚C con 0,4 ug/ml de TGF beta 1, TGF beta 2 o TGF beta 3 (TGF beta 1 (R&D Systems, n.º de cat. 240–B/CF, 239 ug/ml), TGF beta 2 (RDI, n.º de cat. RDI–1035, 50 ug/ml y TGF beta 3 (RDI, n.º de cat. RDI– 1036/CF, 50 ug/ml) diluidos hasta 0,4 ug/ml en tampón de revestimiento). Posteriormente, se lava la placa dos veces antes de la adición de 100 ul de solución de bloqueo (10 mg/ml de ASB en tampón de lavado) en cada pocillo. Se incuban las diluciones de los Fab de la invención en los pocillos revestidos (1,5 h a 22˚C). Tras lavar, se añade conjugado de kappa anti–humano–fosfatasa alcalina y se incuba (1 hora a 22˚C). Se añade sustrato colométrico tras un exhaustivo lavado y se mide la absorbancia a A560.

En otro ejemplo, se analizan las composiciones de unión de la invención en un análisis ELISA competitivo. Comúnmente, se realiza un análisis en fase de solución en el que se combina un compuesto que podría competir con un antígeno por la unión con la composición de unión, tal como un anticuerpo, primero con el anticuerpo en fase de solución, y luego se mide el grado de unión del anticuerpo con el antígeno.

Materiales:

El tampón de revestimiento de carbonato consta de carbonato sódico 50mM, pH 9,6. Los antígenos son TGF beta 1 (R&DSystems, n.º de cat.: 240–B/CF, 239 ug/ml), TGF beta 2 (RDI, n.º de cat.: RDI–1035, 50 ug/ml) y TGF beta 3 (RDI, n.º de cat.: RDI–1036/CF, 50 ug/ml) diluidos hasta 0,4 ug/m en tampón de revestimiento. El tampón de lavado consiste en Tris 0,02M, pH 7,4; NaCl 0,15M; Tween 20 al 0,1% y solución de bloqueo de 10 mg/ml de ASB (Sigma A–4503) disueltos en tampón de lavado. Las proteínas usadas como controles positivos son TGF beta 1, 2 o 3 anti– humano de ratón (R&D Systems, n.º de cat.: 1D11), TGF beta 2 anti–humano de ratón (R&D Systems, n.º de cat.: BAF302), TGF beta 3 anti–humano de ratón (R&D Systems, n.º de cat.: BAF243), que se diluyen hasta 1 ug/ml en tampón de bloqueo. El conjugado de anticuerpo de detección usado es conjugado de kappa anti–ratón–peroxidasa (Southern Biotech, n.º de cat.: 1050–05) a una concentración de trabajo de 1:2000 en solución de bloqueo. El sustrato usado para la reacción de color es ofenilendiamina (OPD) en comprimidos (Sigma n.º de cat.: P–6912), que se disuelve en tampón de sustrato: Na2HPO4 0,1M, pH a 5,0 con ácido cítrico 0,05M. La solución de trabajo de sustrato de OPD (es decir, el volumen para una placa de 196 pocillos) se prepara justo antes de cada revelación de la placa disolviendo 1 x 5 mg de comprimido de OPD en 12,5 ml de tampón de sustrato seguido por la adición de 5 ul de H2O2 al 30%.

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Protocolo:

Se reviste una sola placa de 96 pocillos con antígeno (TGF beta 1, 2 ó 3 a 0,4 ug/ml y se dispensan 50 ul por pocillo) y luego se cierra herméticamente con cinta adhesiva antes de su almacenamiento (16–20 horas a 4˚C). Posteriormente, se lava la placa dos veces con tampón de lavado (descrito anteriormente) antes de la adición de 100 ul de solución de bloqueo (10 mg/ml de ASB en tampón de lavado) en cada pocillo. Tras la incubación (aproximadamente 1 hora a 22˚C), se lava la placa (x2) con tampón de lavado. Luego, se añaden 100 ul de cada muestra (diluida en tampón) o control (diluido en PBS) a cada pocillo y se incuban (1,5 horas a 22˚C). Tras la incubación, se lava la placa (x6) con tampón de lavado antes de añadir 100 ul por pocillo bien de conjugado de kappa anti–ratón–peroxidasa (diluido hasta 1:2.000 en solución de bloqueo) o SA–HRP (diluido 1:10.000 en solución de bloqueo). Se dejan incubar las muestras de análisis (1 hora a 22˚C) antes de añadir 100 ul de sustrato de OPD a cada pocillo. Tras la coloración (aproximadamente 10 minutos), se mide la placa de 96 pocillos a una absorbancia de 490nm.

Los resultados positivos en tales condiciones son las realizaciones de Fab que producen una absorbancia mayor de 1,6 unidades a 490 nm con TGF beta 1, pero que muestran valores significativamente inferiores con TGF beta 2 y TGF beta 3, demostrando así la unión específica y/o selectiva por la TGF beta 1.

Análisis de los Acm de un análisis basado en células

Para medir la capacidad de una composición de unión de la invención para neutralizar la bioactividad de las TGF beta y neutralizar una determinada isoforma de TGF beta, es posible adaptar el análisis de proliferación de células HT–2 de Tsang, et al., (1995 Cytokine 7:389–97). El análisis de la proliferación de células HT–2 se utiliza para determinar la potencia in vitro de las composiciones de Fab y Acm. En síntesis, las células HT–2 proliferan en presencia de IL–4, pero sufren apoptosis en presencia de TGF beta. La muerte celular inducida por las TGF beta se evita mediante la adición de un Fab o Acm neutralizante de TGF beta 1.

La línea celular humana HT–2 prolifera como respuesta a IL–4, pero la proliferación inducida por IL–4 es inhibida por TGF beta 1, TGF beta 2 o TGF beta 3. Por consiguiente, una composición de unión que sea específica y/o selectiva de TGF beta 1 es neutralizante si evita el efecto inhibidor normal que TGF beta 1 tiene sobre las células HT–2 inducidas por IL–4. Por consiguiente, la proliferación celular inducida por IL–4 podría proseguir libremente si se añadiera suficiente composición de unión específica de TGF beta 1 a la mezcla de células HT–2 que contiene TGF beta 1. Por consiguiente, se mide la capacidad neutralizante en respuesta de la dosis de las composiciones de unión de la invención usando el análisis de HT–2 en presencia de determinadas isoformas de TGF y la señal de proliferación de IL–4. El grado de proliferación celular se mide usando una medida de proliferación celular colorimétrica comercial (p.ej., el análisis de proliferación celular CellTiter 96® AQueous One Solution de Promega).

Las células HT–2 se mantienen en RPMI 1640 complementado con SBF al 10%, penicilina/estreptomicina a 100 U/ml y 100 ug/ml respectivamente, betamercaptoetanol 50uM y 10 ng/ml de IL–2 humana (R&D Systems). Las células se centrifugan a 1.000 rpm en un centrifugador Jouan CR422 y se vuelven a suspender en PBS. Tras dos lavados con PBS, finalmente, se vuelven a suspender las células a 0,15 x 106 células/ml en medio de análisis que consiste en RPMI 1640 libre de rojo fenol complementado con SBF al 2%, penicilina/estreptomicina a 100 U/ml y 100 ug/ml respectivamente y beta–mercaptoetanol 50uM. Se añaden a cada pocillo de una placa de 96 pocillos 50 ul de células en medio de análisis. Antes de añadir los Acm de análisis al bioensayo celular, se preincuban concentraciones variables de Acm con 300 pg/ml de TGF beta 1, TGF beta 2 o TGF beta 3 (en medio de análisis). Tras una incubación de 30 min, se añaden 50 ul de mezcla de TGF beta/Fab a las células, seguidos inmediatamente después de 50 ul de medio de análisis que contiene 45 ng/ml de IL–4 murino (15 ng/ml final). Tras una incubación de 20–48 h, se añaden 35 ul de solución acuosa CellTiter 96 (Promega Corp). Tras otra incubación de 2 a 3 h (37˚C en una atmósfera de CO2 al 5% humidificada), se cuantifica el ensayo mediante el análisis sobre una lector de placas de ELISA a 490nM usando el ensayo colorimétrico Cell Titer 96® (la cantidad de producto de formazán generado [y medida mediante la cantidad de absorbancia a 490 nm] es directamente proporcional al número de células vivas del

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cultivo). Los datos modales se muestran en la tabla 2.

Tabla 2: Bioensayo de células HT–2 in vitro: se utiliza un ensayo de proliferación de células HT–2 para determinar la potencia in vitro de las composiciones de unión de Fab y Acm de la invención. Las células HT– 2 proliferan en presencia de IL–4, pero sufren apoptosis en presencia de TGF beta. La muerte celular inducida por las TGF beta se evita mediante la adición de una composición neutralizante de TGF beta (tal como, p.ej., un Fab o Acm de la invención). En comparación con el Fab de IgG1 murina n.º 2471, las composiciones de unión de la invención muestran una mejora de al menos más de 100 veces o mayor de la potencia de neutralización en la prevención de la muerte celular inducida por las TGF beta. Las CI50 para las composiciones de Acm varía de aproximadamente 0,1–1,0 ng/ml (la CI50 del Acm 2471 es de aproximadamente 0,1 μg/ml).

Composiciones de unión de Acm anti–TGF β1: Veces que se mejora la CI50 en comparación con el Acm 2471

21D1: 106,8 + 16,1

DM4: 391,0 + 5,2

DM7: 140,0 + 29,2

C27: 401,0 +132,3

Medición de las constantes cinéticas de los Fab

Se usó un instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Inst. Inc.) para medir las cinéticas de unión. En síntesis, se acopla covalentemente un antígeno a perlas de alzactona y se detecta en el instrumento la unión de una composición de unión de Fab libre de la invención a las perlas. Para medir la Kd, se incuban tubos individuales que contienen 20pM de Fab (200pM para el Acm) con antígeno diluido en series decrecientes (0–250nM) durante 1–6 días a 25˚C en PBS que contiene ASB al 1%, azida al 0,02% y Tween20 al 0,01%. Tras la incubación, se determina el Fab libre de cada muestra equilibrada en el KinExa 3000 según las instrucciones del fabricante. Los valores de Kd se determinan usando el programa informático KinExA 3000.

Para medir la kon, se mezclan los Fab individuales a 2nM con 0–240nM de antígeno usando el procedimiento de inyección según las instrucciones del fabricante y se detecta el Fab sin unir. Los datos resultantes se usan para calcular la kon con el programa KinExA 3000. La koff se calcula usando la fórmula Kd = koff/kon.

Medición de las constantes cinéticas para los Acm

Se conocen procedimientos alternativos para medir las constantes cinéticas, por ejemplo, se mide la afinidad de una composición de unión por la TGF beta 1 humana (R&D Systems, n.º de cat. 240–B/CF), TGF beta 2 (RDI, n.º de cat RDI–1035) y TGF beta 3 (RDI, n.º de cat RDI–1036/CF) con un instrumento BIAcore® 2000. El BIAcore® utiliza las propiedades ópticas de resonancia de plasmones superficiales para detectar la alteración de la concentración proteica de las moléculas que interactúan en la matriz de un biosensor de dextrano. A excepción que se indique lo contrario, todos los reactivos y los materiales son adquiridos en BIAcore® AB (Upsala Suecia). Todas las mediciones se realizan a temperatura ambiente. Las muestras se disuelven en tampón de HBS–EP (cloruro sódico 150mM; EDTA 3mM; tensioactivo P–20 al 0,01% (p/v) y HEPES 10mM, pH 7,4). Se inmoviliza la proteína recombinante A en las cuatro celdas de flujo del chip sensor CM4 a un nivel de 400–450 unidades de respuesta (UR) usando un kit de acoplamiento de amina.

La unión se evalúa usando múltiples ciclos analíticos. Cada ciclo se realiza a un caudal de 50 μl/minuto y consta de las siguientes etapas: inyección de 12 μl de una composición de unión de anticuerpo a 0,5 μg/ml; inyección de 250 μl de TGF beta 1 (partiendo de 5nM y usando diluciones en serie del doble hasta 0,13nM para cada ciclo, con dos inyecciones por cada concentración) seguida bien por un retardo corto (5 minutos) o largo (120 minutos) para la disociación y la regeneración usando dos inyecciones de 50 μl de clorhidrato de glicina 10mM, pH 1,5. Las velocidades de asociación y disociación para cada ciclo se determinan ajustando los datos del biosensor con un modelo de asociación simple usando ClampXP (Centro de Análisis de Interacciones Biomoleculares, Univ. de Utah) para extraer las constantes de velocidad kon y koff; la constate de unión en equilibrio Kd se calcula usando la relación Kd = koff/kon. Los datos modales de las composiciones de la invención se muestran en la siguiente tabla 3.

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Tabla 3: Afinidad de unión y medidas cinéticas de los Fab y los Acm de la invención. Los parámetros de unión en equilibrio (Kd) y cinéticos (kon) se determinan usando Kinexa (la koff se calculó a partir de Kd y kon). Las propiedades de unión cinética y en equilibrio de los Acm se determinan con BIAcore. La constate de unión en equilibrio Kd se calcula a partir de kon y koff. La comparación se realiza con Fab de IgG1 murina n.º 2471. Debido a la tan lenta disociación, la koff para 21D1 y DM7 es el límite superior detectable y tienden a ser más lentas y, por tanto, los valores de Kd calculados también son límites superiores. Los valores son la media de las medidas de repetición (n = 3–4).

Datos de unión de los Fab (Kincxa): Datos de unión de los Acm (BIAcore)

kon (M–1 s–1) (x 10–6): koff (sec–1) calc. (x 106) Kd (pM) kon (M–1 s – 1) (x 10–7) koff (sec–1), (x 105) Kd (pM) (calc)

2.471: 1,7 664 406 nd nd nd

21D1 DM4 DM7 C27 23A3: 4,0 4,2 4,5 4,1 4,8 3,4 5,1 2,3 17 19 0,9 1,2 0,5 4,2 4,0 1,3 ± 0,1 1,6 ± 0,3 13 ± 0,3 1,3 ± 0,1 1,9 ± 0,4 <0,6 ± 0,6 1,4 ± 0,9 <0,7 ± 0,4 0,8 ± 0,5 10 ± 0,8 <0,5 ± 0,5 0,9± 0,4 <0,5 ± 0,4 0,6 ± 0,4 0,8 ± 0,6

Determinación de la especificidad de los Acm

Se usan procedimientos BIAcore para determinar la capacidad de las composiciones de Acm de la invención para unirse con otras entidades, específicamente, con la forma latente de TGF beta 1 o TGF beta 3. Todas las

5 mediciones se realizan a temperatura ambiente. Las muestras se disuelven en tampón de HBS–EP (cloruro sódico 150mM; EDTA 3mM; tensioactivo P–20 al 0,01% (p/v) y HEPES 10mM, pH 7,4). La proteína recombinante A se inmoviliza en las cuatro celdas de flujo del chip sensor CM4 a un nivel de 400–450 unidades de respuesta (UR) usando un kit de acoplamiento de amina.

La unión se evalúa usando múltiples ciclos analíticos. Cada ciclo se realiza a un caudal de 100 μl/minuto y consta de

10 las siguientes etapas: inyección de 15 μl de una composición de unión de anticuerpo a 1 μg/ml; inyección de 250 μl bien de TGF beta 1 5nM, TGF beta 1 latente 5nM o TGF beta 3 5nM seguida de un retardo corto (5 minutos) para la disociación y la regeneración usando dos inyecciones de 50 μl de clorhidrato de glicina 10mM, pH 1,5. La cantidad de señal tras capturar primero el Acm y después el ligando se determina usando el programa informático de control instrumental. Como la señal es proporcional a la masa de la proteína capturada, se puede calcular fácilmente la

15 estequiometría del ligando capturado (Tabla 4).

Tabla 4: Unión de TGF beta 1, TGF beta 1 latente y TGF beta 3 a Acm (analizada a ligando 5nM)

Estequiometría de unión al ligando

Acm: TFG–β1 TFG–β1 latente TFG–β3

21D1: 1,29 0,05 0,16

DM4: 1,55 0,03 ND

DM7: 1,23 0,04 0,54

C27: 1,74 0,08 ND

23A3: 1,63 0,07 1,26

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Especificidad por TGF beta 1

Las afinidades de los Acm de la composición de unión por TFG–β3 se determinan con BIAcore. Todas las mediciones se realizan a temperatura ambiente. Las muestras se disuelven en tampón de HBS–EP (cloruro sódico 150mM; EDTA 3mM; tensioactivo P–20 al 0,01% (p/v) y HEPES 10mM, pH 7,4). Se inmoviliza la proteína recombinante A en cuatro celdas de flujo de un chip sensor CM4 a un nivel de 400–450 unidades de respuesta (UR) usando un kit de acoplamiento de amina. Se evalúa la unión durante múltiples ciclos analíticos. Cada ciclo se realiza a un caudal de 100 μl/minuto y consta de las siguientes etapas: inyección de 15 μl de una composición de unión de anticuerpo a 0,5 μg/ml; inyección de 250 μl de TFG–β3 (partiendo de 5nM y usando diluciones en serie del doble hasta 0,13nM para cada ciclo, con dos inyecciones por cada concentración) seguida de un retardo corto (5 minutos) para la disociación y la regeneración usando dos inyecciones de 50 μl de clorhidrato de glicina 10mM, pH 1,5.

Las afinidades se determinan en base a la señal en equilibrio alcanzada variando las concentraciones de TFG–β3 mediante la medición de la señal media durante los 10 últimos segundos de las inyecciones de TFG–β3, y luego ajustando las señales resultantes a la totalidad de las concentraciones de TFG–β3 con un modelo en equilibrio de unión simple en SCRUBBER (Centro de Análisis de Interacciones Biomoleculares, Univ. de Utah). A continuación, en la Tabla 5, se muestran los datos del modelo determinados para la composición de Acm humano analizada de la invención de Kd y especificidad (calculadas dividiendo la Kd de la unión a TFG–β3 entre la Kd para la unión a TFG–β1 (en la presente memoria)).

Tabla 5: Afinidad y especificidad relativa de los Acm analizados de ka composición de unión por la unión a TGF beta 3. Los errores, cuando se muestran, representan la desviación estándar de múltiples mediciones repetidas (n = 3).

Acm: Kd (TFG–β3), nM Especificidad (Kd,β3/Kd,β1)

21D1: 4,90 9.800

DM4: 0,53 ± 0,01 621

DM7: 1,16 ± 0,18 2.320

C27: 2,20 3.670

23A3: 0,66 ± 0,04 1.050

Ejemplo 2: Modelo in vivo de unión del conducto biliar de fibrosis hepática

El modelo de unión del conducto biliar se utiliza de una manera similar a la publicada por Arias et al. (BMC Gastroenterology 3(29), 2003) para evaluar la eficacia in vivo de la terapia contra TFG–β1. En síntesis, se anestesiaron ratas Sprague Dawley macho (250–300 g) mediante inhalación de isoflurano (2–3%). Se afeita el abdomen y se frota con betadine y alcohol etílico al 70%. En condiciones estériles, se hace una incisión en la línea media (~4 cm), y se aísla el conducto biliar común para ligarlo con seda quirúrgica 6–0 en dos puntos separados aproximadamente 1 cm y luego se realiza una transección entre las ligaduras. Se cierra la pared abdominal con una sutura de seda 4–0 y se grapa a la piel. Se comienza a administrar una composición anti–TFG–β1 y el Acm control de isotipo de ratón (IgG) el día de la cirugía y después, cada 7 días. Los días 4 y 12 posteriores a la cirugía, se practica la eutanasia a las ratas y se procesan las enzimas hepáticas en suero, el recuento sanguíneo completo y la histología hepática (tricromo y colorantes H&E) para determinar el efecto del tratamiento.

Ejemplo 3: Modelo in vivo de fibrosis pulmonar

Hay una serie de modelos disponibles para la evaluación de la eficacia in vivo de las composiciones anti–TGF beta sobre la fibrosis pulmonar. Por ejemplo, se usa un modelo de bleomicina aplicado de la manera publicada por Pittet, et al (JCI 107, 1537–1544, (2001)) para evaluar la mejoría de un enfoque anti–TGF beta. Otro modelo es el modelo del reovirus respiratorio 1/L (véase, p.ej., Bellum et al., Am. J. Pathol, 150, 2243; o London et al, Clin. Immunol. 103, 284; y London et al, Exp.Mol.Pathol, 72, 24–36). En síntesis, usando ratones, el día 1, se aplican 1 x 107 ufp (30 ul totales) de Reovirus I/L, i.n. por la narina seguidos los días 3, 7, 12 con concentraciones variables de la composición de unión anti–TGF beta de la invención o un Acm control de isotipo según lo descrito en la presente memoria o conocido en la técnica. Durante el tratamiento, se controlan los signos de distrés respiratorio, pérdida de peso y mortalidad de los animales. El día 14 de haberse iniciado el tratamiento, se someten los animales a eutanasia y se preparan muestras de pulmón para su examen histopatológico (H/E) con el fin de evaluar el desarrollo y/o la progresión de la enfermedad pulmonar (con contenido de hidroxiprolina analizado para la medida de la fibrosis).

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Ejemplo 4: Modelo in vivo de glomerulonefritis anti–Thy1.1

El modelo anti–Thy1.1 en ratas es un modelo ampliamente establecido de glomerulonefritis mesangioproliferativa (véase, p.ej., Morita, et al., 1998 Am. J. Kidney Dis 31:559–73; Bagchus, et al., 1986 Lab. Invest. 55:680–7 y Yamamoto y Wilson 1987 Kidney Int. 32:514–25) en el que la inyección de un anticuerpo dirigido contra el antígeno Thy ubicado sobre la superficie de células mesangiales induce la mesangiolisis seguida de una fase de sobreproliferación compensatoria de células mesangiales que produce niveles elevados de proteína urinaria (proteinuria). El modelo de nefritis anti–Thy1.1 se asemeja a la nefritis de IgA humana o a la púrpura de Henoch– Schonlein en muchos aspectos (O’Donoghue, et al., 1991 J Clin Invest 88:1522–30) y se ha usado para analizar enfoques potencialmente terapéuticos de la enfermedad renal mediante la determinación de la capacidad de las composiciones de prueba para efectuar disminuciones relacionadas con la dosis de la proteinuria (véase, p.ej., Burg, et al., 1997 Lab Invest 76:505–16; Johnson, et al., 1995 Kidney Int 47:62–9).

Para analizar las composiciones de unión de la invención en tal modelo, se aclimatan ratas Sprague Dawley macho marcadas individualmente (200–260 gramos; de aproximadamente 9 semanas de edad) durante un pretratamiento de cinco días con acceso libre a comida y agua en una dieta estándar. Se determina la proteína preurinaria el día 5 del pretratamiento. Las ratas reciben una identificación individual marcándoles la cola con un marcador de color, así como etiquetándoles la oreja antes de realizarles una sangría retro–orbital y repartirlas aleatoriamente en 5 grupos en base al peso corporal el día I.

El estudio se realiza ciego con respecto a los grupos de tratamiento y no ciego al finalizar el estudio. Los grupos reciben bien 1,25 mg de Acm anti–Thy 1.1 o PBS como inyección control por la vena del pene el día 0. Las composiciones de unión se preparan y se purifican en condiciones estándar o según lo descrito en la presente memoria. El Acm de IgG1 de ratón control (11513) es material purificado de proteína A resuspendido en PBS, pH 7,2, y se adquiere en Harlan Bioproducts para Science, Indianapolis, IN 46229–0176.

Se produce el anti–Thy 1.1 de ratón en 2 cultivos de 10 l de hibridoma de ratón. Se combinan los medios acondicionados, se concentran hasta 18 veces y, después, se purifican. Se mezclan aproximadamente 764 ml de sobrenadante cosechado concentrado con glicina 1,5M/NaCl 3,0M, pH 8,9 y se aplican a una columna de 137 ml de proteína A sefarosa virgen que es pre–equilibrada en glicina 1,5M/NaCl 3,0M, pH 8,9. Luego se lava la columna de proteína A con glicina 1,5M/NaCl 3,0M, pH 8,9. Se eluye la columna con ácido cítrico 100mM, pH 3,0. Se mezclan las fracciones seleccionadas de eluido que corresponden a la IgG, se ajustan hasta un pH 7,4 con NaOH 1M y se aplican a una columna Superdex 200 de Pharmacia de 318 ml equilibrada en PBS, pH 7,4, cloruro de sodio. Se mezcla el máximo correspondiente al tamaño con respecto a la IgG, se extrae una alícuota y se almacena a –20˚C.

Una hora después de la administración de los Acm anti–Thy 1.1, se administra a los animales subcutáneamente las composiciones de anticuerpo anti–TGF beta 1 o de isotipo de la invención. Se vuelven a administrar los anticuerpos el día 7, se analizan los animales en los cuatro siguientes grupos de tratamiento:

1) Shams; inyección de PBS

2) Anti–thy 1.1 con anticuerpo control de isotipo a ~12,5 mg/kg o 2,5 mg/dosis

3) Anti–thy 1.1 con anticuerpo DM4 a ~5 mg/kg o 1 mg/dosis

4) Anti–thy 1.1 con anticuerpo DM7 a ~12,5 mg/kg o 2,5 mg/dosis

5) Anti–thy 1.1 con anticuerpo C27 a ~12,5 mg/kg o 2,5 mg/dosis

Se colocaron las ratas en jaulas metabólicas durante un período de tiempo de 24 h los días –5 y 13. El día 14, se sacrificaron las ratas con CO2 y se sangraron mediante una punción cardiaca para obtener sangre para su análisis. Se fijó el riñón izquierdo con paraformaldehído al 4% en PBS y se almacenó en etanol al 70% para un análisis histológico posterior. Se sacrifican (CO2) las ratas moribundas y se procesan para analizar las concentraciones de proteína urinaria y de nitrógeno de la urea sanguínea. Las concentraciones de proteína urinaria y de nitrógeno de la urea sanguínea (NUS) se analizan en un analizador automático HITACHI 911 con controles de Biorad según las instrucciones de los fabricantes.

Los datos del modelo de la Tabla 6 que se presenta a continuación muestran que las composiciones de unión de la invención tienen una capacidad significativa para atenuar el daño renal in vivo y reducir la protoneuria elevada asociada con el daño renal inducido por los Acm anti–Thy 1.1.

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Tabla 6. Se inyectan a las ratas i.v. 2,5 mg/kg de Acm α–Thy1.1, y 30 min después, 1 mg de herceptina para los estudios de 21D1 y DM4. Se administra una segunda dosis de Acm anti–TGF beta 1 y control el día 7 y se someten los animales a una eutanasia el día 14. Ambas composiciones de unión de Acm 21D1 y DM4 disminuyen los niveles de proteína urinaria (proteinuria) de una manera dependiente de la dosis.

Proteína en orina el día 14 (mg/24 h): % de IgG de control

Ac anti–Thy 1.1: Grupo de Ac Estudio n.º Dosis (mg) Media EE Media E.E.

Sham: 7,0 3,0

2,5 mg/kg: 21–D1 HS4606 0 73,4 9,5 100,0 14,3

i.v.: 0,1 65,7 7,3 88,5 11,1

0,5: 35,2 6,2 42,5 9,3

1: 29,1 3,8 33,3 5,8

Sham: 9,9 2,3

2,5 mg/kg: DM4 HS4607 0 67,2 6,5 100,0 11,3

i.v.: 0,1 54,7 6,2 78,1 10,8

0,5: 49,7 6,2 69,4 10,7

1: 28,9 4,7 33,2 8,2

EJEMPLO 5: mapeado de epítopos de las composiciones de unión a TGF–β1

Se usa una combinación de H/Dex y marcaje químico para mapear los epítopos de las composiciones de unión al

TFG–β1 de la invención, tales como, por ejemplo, anticuerpos. Como tanto el intercambio de H/D como la

5 modificación química dependen de la accesibilidad del disolvente a los residuos de aminoácido, se pueden usar los

cambios producidos en la accesibilidad del disolvente tras la formación de un complejo de composición de unión:TGF

beta 1 para identificar los residuos implicados en la unión del anticuerpo. Tras el intercambio H/D o la modificación

química, la digestión proteolítica en fragmentos peptídicos de escisión del antígeno anteriormente unido permite

hacer comparaciones del peso molecular entre los fragmentos (usando CL/EM) para determinar qué residuos de 10 aminoácido son bloqueados por el intercambio H/D o la modificación química tras la formación del complejo de

unión.

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Marcaje químico de la superficie de proteínas. Se transfieren alícuotas de 15 μg de 1 mg/ml de TFG–β1 en una solución de HCl 4mM a viales de plástico, a los que se añaden 180 μg bien de un control o de una composición de anticuerpo contra TFG–β1 de la invención (TFG–β1/anticuerpo = ½ en proporción molar). Se añade solución salina tamponada con fosfato (PBS) a cada vial hasta un volumen final de 150 μl y se deja que se incuben las soluciones (para permitir la formación de un complejo de unión) a temperatura ambiente durante al menos 10 min antes del marcaje de la superficie de las proteínas. Para el marcaje químico, se añaden 7,5 μl de 5 mg/ml de solución de éster de hidroxilsuccinimida de ácido acético (AHSE) a cada vial de complejo y luego se incuban las mezclas a temperatura ambiente (AHSE/anticuerpo = 200/1 en proporción molar). En diferentes puntos temporales (p.ej., 10, 20 y 60 min), se enfrían 50 μl de solución de la mezcla mezclándola con 50 μl de 1 mg/ml de K en tampón de Tris 0,1M, pH 8,0. La solución se analiza directamente mediante CL/EM (según lo descrito en la presente memoria). Se trata la solución restante de cada muestra con 3–5 μl de 50 mg/ml de solución de DTT a 37˚C (10–15 min) para reducir los enlaces de tipo disulfuro de la proteína TFG–β1 madura.

Posteriormente, se trata la solución de proteína reducida con 3 μl de 0,1 mg/ml de solución de quimiotripsina a 37˚C durante 2–3 horas y luego se trata con 1 μl de 0,25 mg/ml de solución de Glu–C a 37˚C durante otras 2–3 horas. Se detiene esta reacción añadiendo 0,5 μl de ácido acético glacial y luego se analiza mediante CL/EM, usando una CLAR 2795 de Waters y un espectrómetro de masas LTC Premier de Micromass. La CLAR usó una columna Zorbax, SB C18, 2,1 x 50 mm a temperatura ambiente, y se eluyeron las proteínas y los péptidos con un gradiente de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,15%; se usa un tiempo de ejecución de 14 min para la proteína intacta y un tiempo de ejecución de 75 minutos para los digestos proteolíticos.

Para los residuos de lisina (K) de la superficie de TFG–β1 o bien del interior o estructuralmente cerca del epítopo, se bloquea la acetilación del grupo amino de K (bien parcial o completamente) después de que una composición de prueba se uniera al TFG–β1. La comparación del grado de acetilación entre un péptido de una muestra con complejo (TFG–β1 + anticuerpo que se une a TFG–β1) o sin complejo (TFG–β1 + anticuerpo control que no se une a TFG–β1) permite identificar los residuos de aminoácido bloqueados a partir de la acetilación mediante la formación el complejo de unión. En la siguiente Tabla 7, se muestra un modelo de datos de acetilación obtenido con tal análisis de CL/EM.

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Tabla 7. Mol de grupo amino acetilado por mol de péptido obtenido mediante CL/EM para el mapeado de epítopos

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Tiempo ac.: Complejo Mol de acetilación/mol de péptido

1–6: 9–21 22–30 22–32 31–39 33–43 51–62 53– 62 66–90 91– 112 9,1–99 100– 112

10 min: TFG–β1 + cont. 0,97 0,10 0,07 0,94 0,74 0,22 0,64 0,60 0,00 1,09 1,28 0,03

TFG–β1+21D1: 0,95 0,09 0,07 0,95 0,78 0,26 0,50 0,45 0,00 0,49 0,71 0,02

TFG–β1+DM4*: 0,91 0,10 0,04 0,88 0,56 0,05 0,31 0,29 0,00 0,35 0,59 0,02

TFG–β1+DM4#: 0,91 0,07 0,06 0,92 0,62 0,13 0,30 0,28 0,00 0,39 0,66 0,02

20 min: TFG–β1 + cont. 1,00 0,25 0,14 0,99 0,89 0,35 0,82 0,79 0,00 1,32 1,57 0,05

TFG–β1+21D1: 1,00 0,27 0,15 1,00 0,95 0,42 0,76 0,71 0,00 1,01 0,96 0,04

TFG–β1+DM4*: 1,00 0,23 0,06 0,95 0,76 0,09 0,52 0,51 0,00 0,55 0,81 0,03

TFG–β1+DM4#: 1,00 0,21 0,12 0,97 0,85 0,22 0,59 0,58 0,00 0,63 0,88 0,04

60 min: TFG–β1 + cont. 0,97 0,67 0,30 1,03 1,03 0,56 0,87 0,82 0,00 1,68 1,85 0,10

TFG–β1+21D1: 0,97 0,79 0,36 1,08 1,21 0,73 0,93 0,92 0,00 1,24 1,39 0,08

TFG–β1+DM4*: 0,91 0,80 0,16 0,99 0,95 0,26 0,85 0,80 0,00 0,91 1,13 0,08

TFG–β1+DM4#: 0,99 0,66 0,36 1,06 1,10 0,51 0,93 0,91 0,00 1,14 1,25 0,09

* y # indican los dos lotes diferentes del anticuerpo DM4 caracterizados por separado.

Dados los datos de tal modelo, se pueden discernir diferencias entre los complejos de TFG–β1:anticuerpo y los controles para varios fragmentos de péptido TFG–β1, especialmente, los mostrados para los períodos cortos de acetilación (p.ej., 10 min). Los fragmentos que engloban los residuos 31–39, 33–43, 53–62 y 91–112 demuestran tales diferencias discernibles. Ambos fragmentos 31–39 y 33–43 comprenden el residuo K37. El fragmento 22–32,

5 que comprende K26 y K31, no muestra una diferencia relevante con los controles, por lo tanto, las diferencias de acetilación del fragmento 31–39 son atribuibles al K37 bloqueador de la acetilación tras la formación del complejo de antígeno:anticuerpo.

Los fragmentos 53–62 y 91–112 presentan diferencias persistentes en el intervalo analizado y para cada anticuerpo analizado. El fragmento 53–62 muestra menores diferencias en el intervalo superior de acetilación (60 min), sin

10 embargo, en las condiciones de proporción inferior de AHSE/anticuerpo, tales diferencias permanecen invariables a lo largo del intervalo. Sin quedar vinculados a la teoría, una interpretación de tales datos es que K60 no está implicado directamente en la unión de antígeno:anticuerpo, pero que su proximidad al complejo de unión es lo suficiente como para bloquear la accesibilidad de AHSE al residuo K60, bloqueando así la acetilación. No obstante, alternativamente, K60 puede comprender el epítopo definido por el anticuerpo analizado.

15 El fragmento 91–112 muestra diferencias en la acetilación a lo largo del intervalo analizado, lo que sugiere que al menos uno de los tres residuos de lisina de este fragmento (K95, K97 o K110) participa en el complejo de composición de unión:TGF beta 1. Para identificar el o los residuos de lisina implicados, se trata además el digesto quimiotríptico con Glu–C produciendo dos fragmentos más (91–99 y 100–112). El último (el fragmento 100–112) contiene K110, sin embargo, no muestra una diferencia relevante en la acetilación, lo que sugiere que es inaccesible

20 bien para el disolvente o para la modificación química.

El primero (el fragmento 91–99) que contiene K95 y K97 se sigue analizando usando TFG–β1 que no forma complejo tratado con AHSE y un análisis de EM/EM para determinar los puntos temporales de elución de la especie acetilada individualmente y cuantificar el grado de acetilación de K95 o K97 (los datos del modelo en tales condiciones se muestran a continuación, en la Tabla 8). Tales datos muestran que la acetilación de K97 permanece

25 invariable con o sin formación de complejo, sin embargo, la presencia de una composición de anticuerpo de la invención afecta significativamente a la acetilación de K95, lo que indica que K95 está implicado directamente en la formación del complejo de unión.

Tabla 8. Acetilación de K95 y K97

Tiempo de acetilación: Complejo de TFG–β1 y anticuerpo Acetilación (%)

K97: K95

10 min: TFG–β1 + control 54 73

TFG–β1+LA307–21D1: 51 20

TFG–β1+LA307–DM4*: 44 16

TFG–β1+LA307–DM4#: 46 18

20 min: TFG–β1 + control 71 86

TFG–β1+LA307–21D1: 66 27

TFG–β1+LA307–DM4*: 59 22

TFG–β1+LA307–DM4#: 63 25

60 min: TFG–β1 + control 87 95

TFG–β1+LA307–21D1: 86 53

TFG–β1+LA307–DM4*: 75 38

TFG–β1+LA307–DM4#: 82 42

* y # indican que se han caracterizado dos lotes diferentes de anticuerpo DM4. Intercambio H/D

En el mapeado de epítopos, la técnica de intercambio de deuterio/hidrógeno (H/D) se asemeja al marcaje de la

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superficie de la proteína/EM, sin embargo, el intercambio de H/D no es específico del residuo y puede, por tanto, detectar los cambios producidos en cualquier residuo de aminoácido. Al comparar un complejo de composición de unión:TGF beta 1 con una proteína TFG–β1 madura que no forma complejo, el peso molecular de la proteína del complejo es de aproximadamente 20 Da (o 30 Da en D2O al 100%) más baja que la del TFG–β1 libre. Por lo tanto, mediante el cálculo de las diferencias de peso de D2O entre el TFG–β1 en complejo y el TFG–β1 libre, se puede observar que aproximadamente treinta residuos de aminoácido del dímero de TFG–β1 maduro pueden participar en la formación de un complejo de unión de la invención.

Se intercambian en tampón alícuotas de 120 μg (~140 ó 280 μl) de soluciones de anticuerpo en PBS mediante la concentración y dilución sucesivas con un concentrador de proteínas de ultrafiltración Microcon (30 kD) (Millipore). Tras dos concentraciones y diluciones sucesivas con PBS, se concentran las soluciones de anticuerpo, se eliminan y se ajustan hasta un volumen final de 70 μl con PBS. Luego, se añaden 10 μl de 1 mg/ml de TFG–β1 en solución de HCl 4mM y 2 μl de tampón Tris 1M, pH 8,0, a cada vial de anticuerpo para formar un complejo de TFG– β1:anticuerpo. Se prepara una muestra control de TFG–β1 mezclando 70 μl de 1 x PBS, 20 μl de TFG–β1 en solución de HCl 4mM y 2 μl de tampón de Tris 1M, pH 8,0. Posteriormente, se transfieren 9 μl de TFG–β1 o de complejo de anticuerpo contra TFG–β1 a un microvial de plástico y luego se añaden 21 μl de D2O al 100% para formar una solución de D2O al 70%. Se incuba la solución a temperatura ambiente durante 10 min y luego a 0˚C durante 1 min.

Tras la incubación, se detiene el intercambio de H/D y se digiere la proteína añadiendo 15 μl de solución de ácido fórmico al 1% (a 0˚C) y 4 μl de 2 mg/ml de solución de pepsina (a 0˚C) y luego incubando a 0˚C durante 5 min. Se inyecta inmediatamente el digesto en la columna manualmente para el análisis de CL/EM (según lo descrito anteriormente, a excepción de que el tubo y la columna de CLAR son sumergidos en un baño de agua con hielo).

La TFG–β1 madura resiste la digestión con pepsina a un pH bajo (~2,5) y una temperatura baja (0˚C) debido a la formación de enlaces tipo disulfuro. Como resultado de ello, se producen pocos péptidos de escisión y la mayoría de TFG–β1 queda intacta a pesar de los tiempos de digestión más largos y las mayores concentraciones de enzima:proteína. Los fragmentos proteolíticos de TFG–β1 identificables se generan comúnmente en el C–terminal y en las regiones medias de la proteína (p.ej., los fragmentos 58–64 ó 61–64). En la siguiente Tabla 9, se muestran los datos del modelo para el cambio de masa (masa delta) tras el intercambio de D/H usando tales fragmentos. La masa delta del fragmento 61–64 es aproximadamente cero, mientras que la masa delta para el fragmento 58–64 es de aproximadamente 1 Da, lo que sugiere que la región protegida del intercambio de deuterio (tras la formación del complejo con una composición de unión de la invención) comprende los residuos de aminoácido 58–61.

Tabla 9. Masas delta del péptido péptico identificado de TGF beta 1 tras el intercambio de D/H

Masa delta (D2O al 100%)*: Péptido péptico de TFG–β1

61–64: 59–64 58–64 58–61 91–104 90–1114

Media para DM4 (n = 3): 0,04 –0,87 –1,02 –0,30 –1,85 –1,87

DE para DM4 (n = 3): 0,01 0,11 0,21 0,05 0,30 0,30

para 21D1 (n = 1): 0,01 –0,34 –0,99 –0,18 –1,90 –1,51

Mutagésis de TGF beta 1

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Para seguir definiendo los epítopos de las composiciones unión de la invención, se usan técnicas de mutagénesis tradicionales para identificar los residuos de TGF beta 1 fundamentales para la formación de los complejos de unión con las composiciones de la invención. Se usa la estructura cristalina del complejo TGF beta 3/TGF beta RII (2002 Nat Struct Biol. 3:203–8) como modelo para definir los sitios de mutagénesis relevantes de la proteína TGF beta 1 (R25K, K26R, V33I, P87T, V89L y K95T (anteriormente mostrados)).

Se analiza la capacidad para unirse de la muteína de TGF beta 1 usando las composiciones de unión específicas de las isoformas de TGF beta y los Acm comercialmente disponibles (1D11 y 240; R&DSystems) que evitan la unión de TGF beta 1 con su receptor afín (TGF beta RII). La prueba se lleva a cabo en un análisis con espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización inducido por láser. Se mezclan los Acm de prueba, tales como, p.ej., el Acm 3821 y 2471, que se unen específicamente al TGF beta 1 (revelados en la publicación internacional n.º WO2005/010049) y los controles, tales como, p.ej., Acm 1D11, que se une a las tres isoformas de TGF beta, (dando una oportunidad a la formación de complejo con la proteína TGF beta 1 (bien muteína o de tipo natural)), se inmovilizan en chips de detección, se ionizan y, posteriormente, se analizan usando un programa informático estandarizado en las condiciones de los fabricantes (Ciphergen Diagnostics).

Los resultados del modelo muestran que un subconjunto distinto de residuos de aminoácido de la interfase de unión de TGF beta 1/TGF beta RII difiere de las otras isoformas de TGF beta (TGF beta 2 y TGF beta 3). El Acm n.º 2471 de prueba (con una afinidad de unión específica por TGF beta 1) se une a TGF beta 1 de tipo natural a una velocidad cinco veces mayor que la muteína de TGF beta 1, mientras que los Acm 3821 y 1D11 se unen a la muteína de TGF beta 1 a una velocidad que es dos o media vez menor que la TGF beta 1 de tipo natural.

LISTADO DE SECUENCIAS [0198]

SEC ID N.º 1 es la secuencia de aminoácidos de TGF beta 1 madura de Homo sapiens. SEC ID N.º 2 y 141 son la secuencia de aminoácidos artificiales de VHCDR1. SEC ID N.º 3 y 142 son la secuencia de aminoácidos artificiales de VHCDR2. SEC ID N.º 4 y 143 son la secuencia de aminoácidos artificiales de VHCDR3. SEC ID N.º 5 y 138 son la secuencia de aminoácidos artificiales de VLCDR1. SEC ID N.º 6 y 139 son la secuencia de aminoácidos artificiales de VLCDR2. SEC ID N.º 7 y 140 son la secuencia de aminoácidos artificiales de VLCDR3. SEC ID N.º 8 es la secuencia de aminoácidos del marco FR1 de HCVR de Homo sapiens. SEC ID N.º 9 es la secuencia de aminoácidos del marco FR2 de HCVR de Homo sapiens. SEC ID N.º 10 es la secuencia de aminoácidos del marco FR3 de HCVR de Homo sapiens. SEC ID N.º 11 es la secuencia de aminoácidos del marco FR4 de HCVR de Homo sapiens. SEC ID N.º 12 es la secuencia de aminoácidos del marco FR1 de LCVR de Homo sapiens. SEC ID N.º 13–36 es la secuencia de aminoácidos del marco FR2 de LCVR de Homo sapiens. SEC ID N.º 37 es la secuencia de aminoácidos del marco FR3 de LCVR de Homo sapiens. SEC ID N.º 38 es la secuencia de aminoácidos del marco FR4 de LCVR de Homo sapiens. SEC ID N.º 39 es la secuencia de aminoácidos de las regiones constantes de las cadenas pesadas de IgG1 de

Homo sapiens.

SEC ID N.º 40 es la secuencia de aminoácidos de las regiones constantes de las cadenas pesadas de IgG4 de Homo sapiens. SEC ID N.º 41 es la secuencia de aminoácidos de las regiones constantes de la cadena kappa de Homo sapiens.

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SEC ID N.º 42–86 son las secuencias de aminoácidos artificiales de la región variable de la cadena ligera. SEC ID N.º 87–125 son las secuencias de aminoácidos artificiales de HCVR.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Eli Lilly y Compañía

<120> Composiciones de unión; Reactivos relacionados

<130> X–16598

<160> 135

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 112

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<223> El xaa de la posición 3 = Thr o Asp

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<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> El xaa de la posición 5 = Thr, Glu o Phe

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<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> El xaa de la posición 9 = Met, Ile, Leu o Val

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<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> El xaa de la posición 10 = His, Val o Ala

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<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> El xaa de la posición 1 = Tyr, Gln o Ser

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<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> El xaa de la posición 2 = Ile o Val

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<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> El xaa de la posición 8 = Asp o Glu

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<221> MISC_FEATURE

<222> (11) .. (11)

<223> El xaa de la posición 11 = Tyr, Thr, His o Leu

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<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> El xaa de la posición 13 = Gln, Lys, Pro o Ser

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<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> El xaa de la posición 15 = Phe o Tyr

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<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> El xaa de la posición 4 = Trp o Ala

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<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> El xaa de la posición 5 = Phe o Leu

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<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> El xaa de la posición 6 = Ala, Glu o Tyr

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<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> El xaa de la posición 1 = Arg, Tyr, Glu o Gln

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<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> El xaa de la posición 3 = Ser o Thr

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<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> El xaa de la posición 4 = Ser, Val o Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> El xaa de la posición 5 = Ser o Leu

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<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> El xaa de la posición 7 = Ser, Pro, Leu o Tyr

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<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5) El xaa de la posición 5 = Leu, Asn o Pro

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<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> El xaa de la posición 7 = Ser, Lys, Tyr, Leu, Met, Phe, Glu, Gln, Arg o His

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<222> (1)..(1)

<223> El xaa de la posición 1 = Gln o Ser

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<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> El xaa de la posición 5 = Leu, Asp o Pro

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<221> MISC_FEATURE

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<223> El xaa de la posición 6 = Asn o Arg

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<222> (7)..(7)

<223> El xaa de la posición 7 = Pro, Phe, Tyr o Arg

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<213> Primate

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<213> Primate

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<213> Primate

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<212> PRT

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<213> Primate

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<213> Primate

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<213> Primate

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<213> Primate

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<212> PRT

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<213> Primate

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<213> Primate <400> 96

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<212> PRT

<213> Primate

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<212> PRT

<213> Primate

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<212> PRT

<213> Primate

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<212> PRT

<213> Primate

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<212> PRT

<213> Primate <400> 101

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<212> PRT

<213> Primate

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> Primate

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<212> PRT

<213> Primate

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<212> PRT

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<212> PRT

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<213> Primate

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<213> Primate

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<212> PRT

<213> Primate

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<213> Primate <400> 121

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<212> PRT

<213> Primate

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<212> PRT

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<212> PRT <213> Primate

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<400> 128

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo que neutraliza la proteína TGF–β1 humana y tiene una Kd de menos de 40pM para la TGF–β1 humana, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en:

i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 90 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 43;

ii) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 92 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 42;

iii) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 107 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 57; y

iv) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 119 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 73.
2.

Un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo según la reivindicación 1 que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 90 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada den SEC ID N.º 43.
3.

El anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además una región constante de IgG4 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 40 y una región constante de cadena kappa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada den SEC ID N.º 41.
4.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5.

Un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso como un medicamento.
6.

Un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de una enfermedad fibrótica en un sujeto humano.
7.

Un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de una enfermedad renal crónica en un sujeto humano.
8.

Un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en una terapia de combinación para tratar una enfermedad fibrótica en un sujeto humano, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión antigénica del mismo se administra en combinación con un inhibidor ECA.
9.

Un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en una terapia de combinación para tratar una enfermedad renal crónica en un sujeto humano, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión antigénica del mismo se administra en combinación con un inhibidor ECA.
10.

Un anticuerpo o un fragmento de unión antigénica del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento del cáncer.