ES2566343T3 - Anticuerpos monoclonales anti-ferroportina 1 y usos de los mismos - Google Patents

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ES2566343T3 ES09760073.8T ES09760073T ES2566343T3 ES 2566343 T3 ES2566343 T3 ES 2566343T3 ES 09760073 T ES09760073 T ES 09760073T ES 2566343 T3 ES2566343 T3 ES 2566343T3
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Abstract

Un anticuerpo monoclonal que comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en: a) SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o en b) SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se une a ferroportina 1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1.

Description

Anticuerpos monoclonales anti-ferroportina 1 y usos de los mismos
La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a ferroportina 1 (FPN1) y a su uso en el tratamiento de anemia.
El hierro es un elemento traza esencial que se requiere para numerosas funciones celulares. En mamíferos, el suministro de hierro al cuerpo se regula de modo que haga concordar los requerimientos de hierro del organismo con el nivel de absorción de hierro por enterocitos duodenales. El transporte de hierro a través de la membrana basolateral del enterocito se cree que está mediado por ferroportina 1 (también conocida como transportador regulado por hierro 1 (IREG-1), proteína transportadora de metales 1 (MTP1) y SLC40A1), referida de ahora en adelante en el presente documento como FPN1.
Se sabe que FPN1 es un receptor para hepcidina, una hormona polipeptítica fabricada por el hígado en respuesta a depósitos de hierro e inflamación. La unión de hepcidina madura a FPN1 conduce a la internalización y degradación de FPN1, evitando la exportación de hierro celular y es un importante factor controlador factor de homeostasia de hierro sistémica..
La patente de los EE.UU. N.º: 7.166.448 divulga, entre otras cosas, secuencias de nucleótidos que codifican proteínas FPN 1 humanas, proteínas FPN 1 humanas que tienen función de transporte de hierro y un antisuero policlonal de conejo generado a un péptido que consiste en los 19 aminoácidos del extremo C-terminal del la FPN1 humana. La publicación de solicitud de patente internacional PCT N.º: WO2009/094551 describe Mabs contra ferroportina y procedimientos de usarlos para tratar trastornos de homeostasis de hierro. Más específicamente, el documento WO2009/094551 describe anticuerpos monoclonales de roedor y anticuerpos monoclonales completamente humanos frente a diversos epítopos de proteínas de FPN1 humanas.
En vista de la implicación de FPN1 en el transporte de hierro y de la asociación de mutaciones de FPN1 con enfermedades de homeostasis de hierro, existe una necesidad de antagonistas de FPN1 terapéuticamente útiles que se unan con alta afinidad a un epítopo extracelular de FPN1 y después de la unión, inhiban internalización de FPN1 mediada por hepcidina madura, manteniendo o potenciando de este modo exportación de hierro a partir de reservorios intracelulares. Adicionalmente, dirigir FPN1 terapéuticamente con un Mab, o fragmento de unión a antígeno del mismo, con el objetivo de inhibir la unión de hepcidina madura a un epítopo extracelular de FPN1 debe llevarse a cabo de forma suficientemente precisa de modo que el anticuerpo no perturbe significativamente el flujo de hierro celular y/o induzca internalización después de la unión a su diana. Adicionalmente, un anticuerpo anti-FPN destinado para uso en terapia médica humana debe presentar características farmacocinéticas y farmacodinámicas suficientes, incluyendo estabilidad in vivo y/o semivida de eliminación para permitir su uso terapéutico. Uno o más de los anticuerpos anti-FPN1 humana divulgados en el presente documento unen específicamente FPN1 humana, incluyendo al menos un fragmento peptídico de la misma seleccionado del grupo que consiste en:
a) 403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422 (SEC ID N.º: 12);
b) 406EDIRSRFIQGESIT419(SEC ID N.º: 13);
c) 409RSRFIQGESITPTK422 (SEC ID N.º: 14);
d) 403SPFEDIRSRFIQG415 (SEC ID N.º: 15);
e) 409RSRFIQGESIT419 (SEC ID N.º: 16); y
f) 409RSRFIQG415 (SEC ID N.º: 95), bloquean la unión de hepcidina a ferroportina, inhiben de forma potente la actividad de hepcidina in vitro, elevan los niveles de hierro sérico de una manera dependiente de la dosis in vivo y tienen características de solubilidad, estabilidad in vivo y semivida de eliminación aceptables, lo que los hace agentes útiles para tratar y/o evitar anemia en un sujeto en necesidad de tal tratamiento por administración por medio de infusión intravenosa o, incluso quizás, por medio de inyección subcutánea.
Por tanto, entre sus diversos aspectos, la presente invención proporciona:
Anticuerpos monoclonales, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que se unen específicamente a ferroportina 1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende aminoácidos localizados en una o más secuencias aminoacídicas seleccionadas del grupo que consiste en:
a.
403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422 (SEC ID N.º: 12);
b.
406EDIRSRFIQGESIT419 (SEC ID N.º: 13);
c.
409RSRFIQGESITPTK422(SEC ID N.º: 14);
d.
403SPFEDIRSRFIQG415 (SEC ID N.º: 15);
e.
409RSRFIQGESIT419 (SEC ID N.º: 16); y
f.
409RSRFIQG415 (SEC ID N.º: 95).
En algunos modos de realización, la presente invención proporciona Mabs, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente o en SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y el Mab, o fragmento de unión a antígeno, une FPN 1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 12 con una kD de aproximadamente 100 nM o menos según se determina por resonancia de plasmón superficial (RPS), preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab.
En algunos modos de realización, el Mab, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende seis CDR seleccionadas del grupo que consiste en:
(a)
LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente; y
(b)
LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente;
y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 en un epítopo que consiste en o que consiste esencialmente en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
a) 403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422 (SEC ID N.º: 12)
b) 406EDIRSRFIQGESIT419 (SEC ID N.º: 13);
c) 409RSRFIQGESITPTK422 (SEC ID N.º: 14);
d) 403SPFEDIRSRFIQG415 (SEC ID N.º: 15);
e) 409RSRFIQGESIT419(SEC ID N.º: 16); y
f) 409RSRFIQG415 (SEC ID N.º: 95)
con una kD de menos de aproximadamente 100 nM según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab.
En modos de realización particulares, los Mabs, o el fragmento de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención, inhiben la internalización y/o degradación de FPN1 humana inducida por hepcidina, manteniendo o incrementando de este modo 1) el transporte de hierro fuera de las células, 2) el nivel de hierro sérico, 3) el recuento de reticulocitos, 4) la cantidad de células rojas de la sangre, 5) la hemoglobina, y/o 6) el hematocrito en un sujeto, preferentemente, un sujeto humano, en al menos aproximadamente el 10 % en comparación con lo de dicho sujeto en ausencia de dichos Mab, o de dicho fragmento de unión a antígeno de los mismos.
En otro aspecto, se proporcionan los polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica Mabs anti-FPN-1 humana, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención.
En otro aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los Mabs, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, descritas en el presente documento y un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable. También se proporciona 1) el uso de los Mabs, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, divulgado en el presente documento en terapia, preferentemente, una terapia para tratar o evitar anemia, 2) el uso de los Mabs, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, divulgado en el presente documento en terapia de combinación, preferentemente, una terapia de combinación para tratar o evitar anemia, 3) el uso de los Mabs, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, divulgado en el presente documento para tratar o evitar anemia, manteniendo o incrementando los niveles de hierro sérico, el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos, la hemoglobina, y/o el hematocrito en un sujeto, preferentemente, un ser humano, 4) el uso de los Mabs, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, divulgado en el presente documento, para la elaboración de un medicamento para tratar o evitar anemia, manteniendo o incrementando los niveles de hierro sérico,el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos, la hemoglobina, y/o el hematocrito en un sujeto, preferentemente, un ser humano y 5) el uso de los Mabs, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, divulgado en el presente documento en la elaboración de un medicamento para su uso en terapia de combinación para tratar o evitar anemia, incrementando los niveles de hierro sérico, el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos,la hemoglobina, y/o el hematocrito en un ser humano, en el que dicho medicamento se va a administrar en combinación con uno o más ESA
u otro agente terapéutico o tratamiento terapéutico empleado convencionalmente para tratar anemia, mantener o incrementar los niveles de hierro sérico, el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos, la hemoglobina, y/o el hematocrito en un ser humano.
Aún en otro aspecto, se proporcionan procedimientos para 1) mantener o incrementar los niveles de hierro sérico, el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos, la hemoglobina, y/o el hematocrito en un sujeto, preferentemente un ser humano, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un Mab, o fragmento de unión a antígeno del mismo, divulgado en el presente documento, 2) tratar o evitar anemia, incluyendo, pero sin limitarse a anemia de enfermedad crónica, anemia de cáncer y anemia de inflamación, que comprenden administrar a un sujeto, preferentemente, un ser humano, que lo necesite una cantidad eficaz de un Mab, o fragmento de unión a antígeno del mismo, divulgado en el presente documento, 3) un procedimiento de tratamiento o de prevención de anemia, incluyendo, pero sin limitarse a anemia de enfermedad crónica, anemia de cáncer y anemia de inflamación, que comprende administrar a un sujeto, preferentemente, un paciente humano que lo necesite una cantidad eficaz de una combinación de Mabs, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, divulgada en el presente documento, o una mezcla de al menos un Mab y al menos un fragmento de unión a antígeno divulgada en el presente documento y 4) uno cualquiera de los procedimientos anteriores 1-3, que comprende además administrar a dicho paciente humano un ESA, u otro agente terapéutico o tratamiento terapéutico administrado para mantener o incrementar los niveles de hierro sérico, el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos, la hemoglobina, y/o el hematocrito en un ser humano.
Aún en otro aspecto, se proporcionan procedimientos para inhibir la internalización inducida por hepcidina madura y la degradación de FPN1, que comprenden poner en contacto dicha FPN1 y una cantidad eficaz de al menos un Mab, o fragmento de unión a antígeno del mismo, divulgados en el presente documento.
También se proporciona un procedimiento de disminuir la unión de hepcidina humana madura a la FPN1 humana que comprende poner en contacto dicha FPN1 humana y una cantidad eficaz de al menos un Mab, y/o fragmento de unión a antígeno del mismo, divulgado en el presente documento.
También se proporciona un procedimiento de disminuir la cantidad de proteínas FPN1 que se internalizan por una célula que expresa proteínas FPN1, que comprende administrar a un paciente humano que lo necesita una cantidad eficaz de al menos uno de los Mabs, y/o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, divulgado en el presente documento.
La figura 1 representa secuencias de diversos péptidos que comprenden fragmentos del inmunógeno usados para generar anticuerpos anti-FPN1 y los resultados de los experimentos de unión péptido-anticuerpo usando los péptidos para definir el epítopo de anti-FPN1 Mab 34A9. Los aminoácidos subrayados indican secuencias de ferroportina reales. Mab 34A9 se une a péptidos FpnE3a, 060719Z, 0708L4C y 0708L4D, que contienen todos la secuencia aminoacídica común de RSRFIQG (SEC ID N.º: 95).
La figura 2A muestra las secuencias de aminoácidos de estructura 02 de cadena ligera totalmente humana con CDR intercaladas. Las cuatro regiones estructurales están etiquetadas como FRL1, 2, 3 y 4 (SEC ID N.º: 74, 75, 76 y 77, respectivamente). La figura 2B muestra la secuencia de aminoácidos de la estructura de cadena pesada humana VH1-69 con CDR intercaladas. Las cuatro regiones estructurales están etiquetadas FRH1-4 (SEC ID N.ºs: 78-81, respectivamente).
La figura 3A muestra las secuencias de aminoácidos de la estructura 018 de cadena ligera humana con CDR intercaladas. Las cuatro regiones estructurales están etiquetadas como FRL1, 2, 3 y 4 (SEC ID N.ºs: 74, 75, 82 y 77, respectivamente). Residuos diferente de residuos 02 están en negrita y subrayados
La figura 3B muestra la secuencia de aminoácidos de la estructura de cadena pesada humana VH1-18 con CDR intercaladas. Las cuatro regiones estructurales están etiquetadas FRH1, 2, 3 y 4 (SEC ID N.ºs: 83, 79, 84 y 81, respectivamente). Residuos diferentes de VH1-69 están en negrita y subrayados.
La figura 4A muestra las secuencias de aminoácidos de la estructura L12 de cadena ligera humana con CDR intercaladas. Las cuatro regiones estructurales están etiquetadas como FRL1, 2, 3 y 4 (SEC ID N.ºs: 85, 75, 86 y 77, respectivamente). Residuos distintos e los residuos 02 están en negrita y subrayados
La figura 4B muestra la secuencia de aminoácidos de la región estructural humana de cadena pesada VH1-46 con CDR intercaladas . Las cuatro regiones estructurales están etiquetadas FRH1, 2, 3 y 4 (SEC ID N.ºs: 83, 79, 87 y 81, respectivamente). Residuos diferentes de VH1-69 están en negrita y subrayados.
La figura 5 muestra las secuencias de aminoácidos de la estructura L1 de cadena ligera humana con CDR intercaladas. Las cuatro regiones estructurales están etiquetadas como FRL1, 2, 3 y 4 (SEC ID N.ºs: 74, 168, 76 y 169, respectivamente). Residuos diferentes de residuos de 02 están en negrita y subrayados. La secuencia de línea germinal para la región FR1 de la estructura L12 de cadena ligera humana es como se muestra en la SEC ID N.º: 85; una variación en la que la secuencia de aminoácidos de la región FR1 región de la estructura de cadena ligera humana L1 es como se muestra en la SEC ID N.º:74 se contempla en determinados modos de realización de la presente invención.
La figura 6 muestra una gráfica de niveles de hepcidina séricos en macacos de Java machos después de la administración de IgG 1 murina 1 de control o de Mab 1G9 murino como una dosis i.v. única de 30 mg/kg. Los datos son de animales individuales. La figura 7 muestra una gráfica de niveles de hierro séricos en macacos de Java machos después de la administración de IgG 1 murina 1 de control o de Mab 1G9 murino administrados como una dosis i.v. única de 30 mg/kg. Los datos son de animales individuales. La figura 8 muestra las secuencias de aminoácidos y la secuencia aminoacídica consenso de las regiones variables de cadena pesada preferidas para los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención. Un periodo (.) indica que el aminoácido en esa posición es idéntico al aminoácido correspondiente de la secuencia número 1. CDR están subrayadas y en negrita para el número de secuencia 1.
La figura 9 muestra las secuencias de aminoácidos y la secuencia aminoacídica consenso de las regiones variables de cadena ligera preferida para los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención. Un periodo (.) indica que el aminoácido en esa posición es idéntico al aminoácido correspondiente de la secuencia número 1. CDR están subrayadas y en negrita para el número de secuencia 1.
La figura 10 representa las concentraciones séricas de Mab 4A10-3 y Mab Combi11 en macacos de Java después de una sola dosis de inyección i.v. rápida de 0,3, 1,0, o 3,0 mg/kg. Las concentraciones séricas de Mab Combi11 a la dosis de 0,3 mg/kg estaban por debajo del límite de detección del ensayo (<20 ng/ml). Los datos son la media ± DT.
La figura 11 representa las concentraciones séricas de Mab 4A10-3 y Mab Combi11 en ratas Sprague Dawley después de una sola dosis de inyección i.v. rápida de 3,0 mg/kg. Los datos son la media ± DT.
Se usan las siguientes abreviaturas en el presente documento: ACB: ácido bicinconínico, BSA: seroalbúmina bovina, CDR: región determinantes de la complementariedad, DTT: ditiotreitol, DMEM: medio de Eagle modificado de Dulbecco, D-PBS: solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, EDTA: etilendiamina de ácido tetraacético, ELISA: ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, ESA: agente estimulante de la eritropoyesis, FAC: citrato de amonio férrico, FBS: suero fetal bovino, Fe:NTA: nitrilotriacetato férrico, FLU: unidades de fluorescencia, GFP: proteína fluorescente verde, i.v.: intravenoso, IPTG: isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido, IMAC: cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, Mab: anticuerpo monoclonal, Mabs: anticuerpos monoclonales, OPD: diclorhidrato de o-fenilendiamina, PBS: solución salina tamponada con fosfato, PBST: solución salina tamponada con fosfato Tween-20, SDS: dodecil sulfato de sodio, TBS: solución salina tamponada con Tris, Tris: tris(hidroximetil)aminometano,
Tritón-X: Éter t-octilfenoxipolietoxietanol-polietilenglicol-terc-octilfenílico de 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenilpolietilenglicol, Tween-20: polisorbato 20.
Los Mabs, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención se unen a un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o en aminoácidos localizados en aminoácidos 403-422 (SEC ID N.º: 12) del polipéptido de FPN1 humano que tiene la secuencia aminoacídica que se muestra en SEC ID N.º: 1. En modos de realización preferentes, estos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inhiben la internalización inducida por heptidina y/o la degradación inducida por heptidina de la FPN1 humana, incrementando de este modo el transporte de hierro fuera de las células in vitro e in vivo y aumentando los niveles de hierro sérico in vivo. Por ejemplo, en modos de realización preferentes, los anticuerpos de la presente invención disminuyen significativamente la acumulación inducida por heptidina madura de ferritina dentro de células Caco-2, una línea celular de enterocitos humanos que expresa de forma endógena FPN1, in vitro (véase, ejemplo 5).
Un anticuerpo de longitud completa según existe de forma natural es una molécula de inmunoglobulina que comprende 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras interconectadas por enlaces disulfuro. La parte aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100-110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de antígenos por medio de las CDR contenidas en ella. La parte carboxiterminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.
El término "CDR" como se usa en el presente documento se pretende que signifique los sitios de combinación de antígenos no contiguos que se encuentran dentro de la región variable tanto de los polipéptidos de cadenas pesadas como de los polipéptidos de cadenas ligeras. Estas regiones particulares se han descrito por Kabat, et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977), Kabat, et al., Sequences of protein of immunological interest, (1991) y por Chotia, et al.,
J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y por MacCallum, et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996) donde las definiciones incluyen solapamiento o subconjuntos de residuos aminoacídicos cuando se comparan entre sí.
Las CDR están intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas “regiones estructurales ("FR"). Cada región variable de cadena ligera (LCVR) y cada región variable de cadena pesada (HCVR) se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo aminoterminal hasta el extremo carboxiterminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las tres CDR de la cadena ligera se denominan "LCDR1, LCDR2 y LCDR3" y las tres CDR de la cadena pesada se denominan "HCDR1, HCDR2 y HCDR3." Las CDR contienen la mayoría de los residuos que forman interacciones específicas con el antígeno. La numeración y la colocación de los residuos aminoacídicos de CDR dentro de las regiones LCVR y HCVR está de acuerdo con convenciones bien conocidas (por ejemplo, Kabat, (1991) y/o Chotia (1987)).
La expresión "numeración de Kabat", como se usa en el presente documento, se reconoce en la técnica y se refiere a un sistema de numeración de residuos aminoacídicos que son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos aminoacídicos en las regiones de cadena pesada y ligera de un anticuerpo (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci., 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH N.º: 91-3242 (1991)).
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de una única copia o clon que incluye, por ejemplo, cualquier clon eucariota, procariota, o de fago y no al procedimiento por el que se produce. Los Mabs de la presente invención preferentemente existen en una población homogénea o sustancialmente homogénea. Los Mabs completos contienen 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras. Los anticuerpos monoclonales, o los fragmentos de unión a antígenos de los mismos, de la presente invención se pueden producir, por ejemplo, por tecnologías recombinantes, tecnologías de presentación en fagos, tecnologías sintéticas, por ejemplo, injertando CDR, o por combinaciones de dichas tecnologías, o por otras tecnologías conocidas en la técnica.
Como se usa en el presente documento, la expresión "fragmentos de unión a antígeno" de Mabs incluye, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fv de cadena simple.
El término "anticuerpo”, o versiones gramaticales del mismo, a menos que se indique de otro modo, se refiere a Mabs, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, así como combinaciones de los mismos, incluyendo, por ejemplo, las combinaciones de Fab y las combinaciones de Mabs y Fab. Anticuerpos adicionales que presentan propiedades funcionales similares como los anticuerpos de acuerdo con la presente invención se pueden generar por procedimientos convencionales. Por ejemplo, los ratones se pueden inmunizar con, por ejemplo, células que expresan FPN1, con FPN1 o con fragmentos de la misma, los anticuerpos resultantes se pueden recuperar y purificar y la determinación de si poseen propiedades de unión, farmacocinéticas y funcionales similares o iguales a los anticuerpos divulgados en el presente documento se puede evaluar por los procedimientos divulgados en los Ejemplos 3-14 en el presente documento a continuación. Los fragmentos de unión a antígeno también se pueden preparar por procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica. Los procedimientos para producir y purificar anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno se conocen también en la técnica.
Como se usa en el presente documento, la expresión "se une específicamente" se refiere a la capacidad de un anticuerpo de la presente invención para unir a un polipéptido o péptido especificado, preferentemente, ferroportina 1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1, o en un fragmento de péptido especificado de la misma, con una KD de menos de aproximadamente 1000 nM, de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 1 nM, de menos de aproximadamente 100 pM, o menos de aproximadamente 10 pM, como se determina por ensayos de ELISA de afinidad o por ensayos de SPR como se describen en el presente documento, por ejemplo, o por ensayos similares conocidos en la técnica. Adicionalmente, o de forma alternativa, la expresión "se une específicamente" en referencia a un anticuerpo de la presente invención indica que la capacidad del anticuerpo que se une a o detecta ferroportina 1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1, o un fragmento peptídico de la misma, es al menos aproximadamente 5 veces mayor, al menos aproximadamente 10 veces mayor, al menos aproximadamente 20 veces mayor, al menos aproximadamente 50 veces mayor, al menos aproximadamente 100 veces mayor, al menos aproximadamente 200 veces mayor, al menos aproximadamente 500 veces mayor, o al menos aproximadamente 1000 veces mayor que su capacidad para unirse a o detectar otro polipéptido (por ejemplo, heparina) u, opcionalmente, otro fragmento peptídico especificado de ferroportina 1 humana.
La presente invención también proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un Mab, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En modos de realización particulares, la presente invención también proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.ºs: 152 y 156, y/o ii) un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID N.º: 154 y 158.
En otro modo de realización, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un Mab, o fragmento de unión a antígeno del mismo. En modos de realización particulares, la presente invención también proporciona un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.ºs: 152 y 156, y/o ii) un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID N.ºs: 154 y 158.
Cuando se usa en el presente documento, el término "hepcidina" se refiere a cualquier forma de la proteína hepcidina conocida por estar presente en mamíferos. Cuando se usa en el presente documento, el término "hepcidina madura" se refiere a cualquier forma madura, bioactiva de la proteína hepcidina expresada en mamíferos. Cuando se usa en el presente documento, la expresión "hepcidina humana" se refiere a cualquier forma de la proteína hepcidina presente en seres humanos. Cuando se usa en el presente documento, la expresión "hepcidina humana madura" se refiere a cualquier forma bioactiva, madura de la proteína hepcidina conocida por estar presente en seres humanos. Preferentemente, "hepcidina humana madura" se refiere a "hepcidina-25 humana», una forma madura de hepcidina humana que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 91.
El término "bioactividad" en referencia a polipéptidos de hepcidina madura tales como hepcidina-25 incluye, pero no se limita a, unión específica de hepcidina madura a su receptor FPN1, una o más funciones mediadas por FPN1 de hepcidina madura, tal(es) como a) internalización y/o degradación de FPN1 inducida por hepcidina madura (véase, por ejemplo, Nemet, E., et al., Science, 306:2090-2093, (2004)), b) regulación por hepcidina madura de i) efluencia de hierro mediada por FPN1, ii) niveles de hierro sérico mediados por FPN1, iii) recuento de reticulocitos mediado por FPN1, iv) recuento de células rojas de la sangre mediado por FPN1, v) niveles de hemoglobina mediados por FPN1, vi) hematocrito mediado por FPN1, vii) niveles de expresión de polipéptidos de hepcidina mediados por FPN1, y/o viii) distribución tisular de polipéptidos de hepcidina mediada por FPN1.
La expresión "anticuerpos humanos manipulados por ingeniería genética " se refiere a determinados anticuerpos divulgados en el presente documento así como a anticuerpos que tienen la unión y las propiedades funcionales de acuerdo con la invención similares a los anticuerpos divulgados en el presente documento y que tienen regiones estructurales que son sustancialmente humanas o completamente humanas rodeando CDR derivadas de un anticuerpo no humano, o fragmento de unión a antígenos de las mismas, divulgados en el presente documento. "Región estructural" o "secuencias estructurales" se refieren a una cualquiera de las regiones estructurales 1 a 4. Anticuerpos manipulados por ingeniería genética humanos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos abarcados por la presente invención incluyen moléculas en las que una cualquiera o más de las regiones estructurales 1 a 4 son sustancialmente o completamente humanas, es decir, en las que cualquiera de las combinaciones posibles de regiones estructurales sustancialmente o completamente humanas individuales 1 a 4 están presentes. Por ejemplo, esto incluye moléculas en las que la región estructural 1 y la región estructural 2, la región estructural 1 y la región estructural 3, las regiones estructurales 1, 2 y 3, etc., son sustancialmente o completamente humanas. Estructuras sustancialmente humanas son aquellas que tienen al menos aproximadamente el 80 % de identidad de secuencia con una secuencia estructural de línea germinal humana conocida. Preferentemente, las estructuras sustancialmente humanas tienen al menos aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 % de identidad de secuencia con una secuencia estructural de línea germinal humana conocida.
Estructuras totalmente humanas son aquellas que son idénticas a una secuencia estructural de línea germinal humana conocida. Se pueden obtener secuencias de línea germinal de la región estructural humana a partir de ImMunoGeneTics (IMGT) por medio de su sitio web http://imgt.cines.fr, o a partir de The Inmunoglobulina Facts Book por Marie-Paule Lefranc y Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por ejemplo, estructuras de cadena ligera de línea germinal se puede seleccionar del grupo que consiste en: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L15, L6, L8, 012, 02 y 08 y las regiones estructurales de cadena pesada se puede seleccionar del grupo que consiste en: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VH1-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH1-18, VH1-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 y VH5-51. Preferentemente, regiones estructurales de cadena ligera de línea germinal se seleccionan del grupo que consiste en 02, 018 y L12, L1 y Las regiones estructurales de cadena pesada se seleccionan del grupo que consiste en VH1-69, VH1-18, o VH1-46. Más preferentemente, las estructuras de cadena ligera de línea germinal se seleccionan del grupo que consiste en 02 y L1 y las estructuras de cadena pesada de línea germinal se seleccionan del grupo que consiste en VH1-69 y VH1-18. Lo más preferentemente, la estructura de cadena ligera de línea germinal es 02 y la región estructural de cadena pesada germinal es VH1-69.
Además de los anticuerpos manipulados por ingeniería genética humanos divulgados en el presente documento, los anticuerpos manipulados por ingeniería genética humanos presentan propiedades funcionales similares ya que los anticuerpos de acuerdo con la presente invención se pueden generar usando varios procedimientos diferentes. Los anticuerpos específicamente divulgados en el presente documento se pueden usar como plantillas o como anticuerpos parentales para preparar anticuerpos adicionales. En un enfoque, las CDR de un anticuerpo parental se injertan en una estructura humana que tiene una identidad de secuencia alta con la estructura de anticuerpo parental. La identidad de secuencia de la nueva estructura será generalmente al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a la secuencia de la estructura correspondiente en el anticuerpo parental. Esta realización de injertos puede dar como resultado una reducción en la afinidad de unión en comparación con la del anticuerpo parental. Si este es el caso, la estructura puede experimentar mutación restauradora a la estructura parental en ciertas posiciones basadas en criterios específicos divulgados por Queen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88:2869 (1991). Otras referencias que describen procedimientos útiles humanización de los anticuerpos de ratón incluyen las patentes de los EE.UU. N.ºs: 4.816.397; 5.225.539 y 5.693.761; los programas informáticos ABMOD y ENCAD como se describen en Levitt, J., Mol. Biol. 168:595-620 (1983); y el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones, et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann, et al., Nature, 332:323-327 (1988); y Verhoeyen, et al., Science, 239:1534-1536 (1988).
La identificación de residuos a tener en cuenta para mutación restauradora se puede llevar a cabo como sigue:
Cuando un aminoácido entra en la siguiente categoría, el aminoácido estructural de la secuencia de la línea germinal humana que se está usando (la "estructura aceptora") se reemplaza por por un aminoácido estructural de una estructura del anticuerpo parental (la "estructura donante"):
(a) el aminoácido en la región estructural humana de la estructura aceptora es inusual para regiones estructurales humanas en esa posición, mientras que el correspondiente aminoácido en la inmunoglobulina donante
es típic para estructuras humanas en esa posición:
(b)
la posición del aminoácido está inmediatamente adyacente a una de las CDR; o
(c)
cualquier átomo de cadena lateral de un aminoácido estructural está dentro de aproximadamente 5-6 angstroms (de centro-a-centro) de cualquier átomo de un aminoácido de CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional.
Cuando cada uno de los aminoácidos en la región estructural humana de la estructura aceptora y un aminoácido correspondiente en la estructura donante es generalmente inusual para estructuras humanas en esa posición, tal aminoácido puede reemplazarse por un aminoácido típico para estructuras humanas en esa posición. Este criterio de mutación restauradora permite a alguien recuperar la actividad del anticuerpo parental.
Otro enfoque para generar anticuerpos manipulados por ingeniaría genética humanos que presenten propiedades funcionales similares a los anticuerpos divulgados en el presente documento implica mutar al azar aminoácidos dentro de las CDR injertadas sin cambiar la estructura y rastrear las moléculas resultantes en busca de afinidad de unión y de otras propiedades funcionales que sean tan buenas como o mejores que aquellas de los anticuerpos parentales. También pueden introducirse mutaciones individuales en cada posición aminoacídica dentro de cada CDR, seguidas por evaluación de los efectos de tales mutaciones en la afinidad de unión y en otras propiedades funcionales. Mutaciones individuales que producen propiedades mejoradas se pueden combinar para evaluar sus efectos en combinación entre sí.
Además, una combinación de ambos de los enfoques anteriores es posible. Después de injertar CDR, alguien puede provocar mutaciones restauradoras en regiones estructurales específicas además de introducir cambios aminoacídicos en las CDR. Esta metodología se describe en Wu, et al., J. Mol. Biol. 294:151-162 (1999). Preferentemente, la sustitución aminoacídica dentro de las estructuras está restringida a una dos o tres posiciones dentro de una o más de las regiones estructurales de la cadena ligera y/o de la cadena pesada divulgadas en el presente documento (es decir, regiones estructurales mostradas en las figuras 2-5). Preferentemente, la sustitución aminoacídica dentro de las CDR está restringida a una dos o tres posiciones dentro de una cualquiera o más de las tres CDR de la cadena ligera y/o de la cadena pesada. Combinaciones de los diversos cambios descritos dentro de las regiones estructurales y las CDR se contemplan también en el presente documento. En modos de realización particulares de este aspecto de la invención, todas las regiones estructurales de regiones variables de cadenas ligeras y de cadenas pesadas de tales Mabs manipulados por ingeniería genética humanos, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, son completamente humanos.
Las tablas 1A y 1B siguientes representan las secuencias de aminoácidos de CDR y las secuencias de aminoácidos consenso de anticuerpos anti-ferroportina, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Las tablas 2A y 2B siguientes representan las secuencias de aminoácidos y las secuencias de aminoácidos consenso de más anticuerpos anti-ferroportina, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
Tabla 1A
Fab
HCDR1 HCDR2 HCDR3
34A9
GYAFTNFLIE (SEC ID N.º: 17) TNPETGGTKYNEKFRG (SEC ID N.º: 18) EFFDY (SEC ID N.º: 18)
1B1
GYAFTSFLIE (SEC ID N.º: 28) (SEC ID N.º: 18) (SEC ID N.º: 19)
1D2
(SEC ID N.º: 17) TINPRTGGTKYNEKFRG (SEC ID N.º: 24) (SEC ID N.º: 19)
1E3
(SEC ID N.º: 17) TINPKTGGTKYNEKFRG (SEC ID N.º: 25) (SEC ID N.º: 19)
2A6
(SEC ID N.º: 17) TINPETGGTKYNEKFRG (SEC ID N.º: 26) (SEC ID N.º: 19)
2H10
(SEC ID N.º: 17) (SEC ID N.º: 18) (SEC ID N.º: 19)
3A8
(SEC ID N.º: 17) (SEC ID N.º: 18) (SEC ID N.º: 19)
2G9
(SEC ID N.º: 17) (SEC ID N.º: 18) (SEC ID N.º: 19)
1A3
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 25) (SEC ID N.º: 19)
2E2
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 24) (SEC ID N.º: 19)
Fab
HCDR1 HCDR2 HCDR3
2A6
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 25) (SEC ID N.º: 19)
2B2
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 25) (SEC ID N.º: 19)
1D1
(SEC ID N.º: 23) TINPKTGGTKYNAKFRG (SEC ID N.º: 34) (SEC ID N.º: 19)
1E2
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 24) (SEC ID N.º: 19)
Hu-1
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 24) (SEC ID N.º: 19)
1G9
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 24) (SEC ID N.º: 19)
huG1
(SEC ID N.º: 23) TSNPRTGGTKYNEKFRG (SEC ID N.º: 35) (SEC ID N.º: 19)
huA2
(SEC ID N.º: 23) TINPRTGGTKYNEKFRG (SEC ID N.º: 36) (SEC ID N.º: 19)
huA3
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 24) (SEC ID N.º: 19)
huB3
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 24) (SEC ID N.º: 19)
huD3
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 24) (SEC ID N.º: 19)
huH5
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 24) (SEC ID N.º: 19)
huH6
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 24) (SEC ID N.º: 19)
1D5
(SEC ID N.º: 23) TSNPRTGGTKYKEKFRG (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
2G5
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
3D8
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
*C1
GTAFX1FLIE (SEC ID N.º: 30) TINPX2TGGTKYNX3KFRG (SEC ID N.º: 31) (SEC ID N.º: 19)
*C2
(SEC ID N.º: 30) TX6NPX2TGGTKYX7X3KFRG (SEC ID N.º: 43) (SEC ID N.º: 19)
*C3
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
*C4
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
*C5
(SEC ID N.º: 30) (SEC ID N.º: 43) (SEC ID N.º: 19)
Tabla 1B
Fab
LCDR1 LCDR2 LCDR3
34A9
RASKSISKYLA (SEC ID N.º: 20) AGSTLHS (SEC ID N.º: 21) QQHNEYPYT(SEC ID N.º: 22)
1B1
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 21) (SEC ID N.º: 22)
1D2
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 21) (SEC ID N.º: 22)
1E3
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 21) (SEC ID N.º: 22)
2A6
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 21) (SEC ID N.º: 22)
2H10
(SEC ID N.º: 20) AGSKLHS (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
Fab
LCDR1 LCDR2 LCDR3
3A8
(SEC ID N.º: 20) AGSRLHS (SEC ID N.º: 28) (SEC ID N.º: 22)
2G9
(SEC ID N.º: 20) AGSTLHS (SEC ID N.º: 21) FQHNEYPYT (SEC ID N.º: 29)
1A3
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 21) (SEC ID N.º: 22)
2E2
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 21) (SEC ID N.º: 22)
2A6
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
2B2
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 29)
1D1
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 21) (SEC ID N.º: 29)
1E2
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 21) (SEC ID N.º: 29)
1G9
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 29)
hu-1
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 29)
huG1
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 29)
huA2
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 29)
huA3
RASKSISKYTA (SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 29)
huB3
RASKSISKYSA (SEC ID N.º: 38) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 29)
huD3
RASKSISKYAA (SEC ID N.º: 39) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 29)
huH5
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
huH6
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 27) HQHNEYPYT (SEC ID N.º: 40)
1D5
(SEC ID N.º: 39) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
2G5
(SEC ID N.º: 38) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
3D8
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
*C1
(SEC ID N.º: 20) AGSX4LHS (SEC ID N.º: 32) X9QHNEYPYT (SEC ID N.º: 33)
*C2
RASKSISKYX8A (SEC ID N.º: 42) (SEC ID N.º: 32) (SEC ID N.º: 33)
*C3
(SEC ID N.º: 42) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
*C4
(SEC ID N.º: 42) (SEC ID N.º: 32) (SEC ID N.º: 33)
*C5
(SEC ID N.º: 42) (SEC ID N.º: 32) (SEC ID N.º: 33)
*Tablas 1A y 1B, secuencias consenso 1-5 (C1-C5), en las que X1 es N o S; X2 es E, K, o R; X3 es E o A; X6 es S o I; X7 es N o K, X4 es T, K, o R; X5 es F, H, Q; X8 es L, T, S, o A.
Tabla 2A
Fab
HCDR1 HCDR2 HCDR3
3D8
GYAFTSFLIE (SEC ID N.º: 23) TSNPRTGGTK4YKEKFRG (SEC ID N.º: 41) EFFDY (SEC ID N.º: 19)
Fab
HCDR1 HCDR2 HCDR3
1G9
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 24) (SEC ID N.º: 19)
2G2
GRAFTSFLIE (SEC ID N.º: 103) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
2A1
GKAFTSFLIE (SEC ID N.º: 104) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
4H2
GYRFRSFLIE (SEC ID N.º: 105) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
4C2
GYAFRSFLIE (SEC ID N.º: 106) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
4A11
(SEC ID N.º: 23) TSNPRTRGTKYKEKFRG (SEC ID N.º: 108) (SEC ID N.º: 19)
5A2
(SEC ID N.º: 23) TSNPRTGRTKYKEKFRG (SEC ID N.º: 109) (SEC ID N.º: 19)
4A10
(SEC ID N.º: 23) TSNPRTGGTKYKEKFRG (SEC ID N.º: 110) (SEC ID N.º: 19)
1E3
(SEC ID N.º: 23) TSNPRTGGTKYKTKFRG (SEC ID N.º: 111) (SEC ID N.º: 19)
1F10
(SEC ID N.º: 23) TSNPRTGGTKYKSKFRG (SEC ID N.º: 112) (SEC ID N.º: 19)
3D1
(SEC ID N.º: 23) TSNPRTGGTKYKWKFRG (SEC ID N.º: 113) (SEC ID N.º: 19)
1E4
(SEC ID N.º: 23) TSNPRTGGTKYKEVFRG (SEC ID N.º: 114) (SEC ID N.º: 19)
4H6
(SEC ID N.º: 23) TSNPRTGGTKYKEKFRG (SEC ID N.º: 115) (SEC ID N.º: 19)
1G3
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 41) EFFVY (SEC ID N.º: 119)
1B5
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
L2.2
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
L2.6
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
7C8
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
6H4
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
7E4
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
Combi-1
(SEC ID N.º: 23) TSNPRTGRTKYKSKFRG (SEC ID N.º: 116) (SEC ID N.º: 19)
4A10-3
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 110) (SEC ID N.º: 19)
L2.2-4
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 110) (SEC ID N.º: 19)
1F8
GYRFRSFLIE (SEC ID N.º: 105) TSNPRTGRTKYKTKFRG (SEC ID N.º: 116) (SEC ID N.º: 19)
1B7
GYRFRSFLIE (SEC ID N.º: 105) (SEC ID N.º: 41) (SEC ID N.º: 19)
Con11Gy
(SEC ID N.º: 23) (SEC ID N.º: 112) (SEC ID N.º: 19)
Fab
HCDR1 HCDR2 HCDR3
Consenso 6*
GX1X2FX3SFLIE (SEC ID N.º: 105) TSNPRTX4X5X6KYKX7X8FRX9 (SEC ID N.º: 118) EFFX10Y (SEC ID N.º: 120)
Tabla 2B
Fab
LCDR1 LCDR2 LCDR3
3D8
RASKSISKYTA (SEC ID N.º: 37) AGSKLHS (SEC ID N.º: 27) QQHNEYPYT (SEC ID N.º: 22)
1G9
(SEC ID N.º: 20) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 29)
2G2
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
2A1
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
4H2
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
4C2
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
4A11
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
5A2
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
4A10
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
1E3
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
1F10
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
3D1
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
1E4
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
4H6
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
1G3
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 27) (SEC ID N.º: 22)
1B5
(SEC ID N.º: 37) AGSKRHS (SEC ID N.º: 121) (SEC ID N.º: 22)
L2.2
(SEC ID N.º: 37) AGSKLHS (SEC ID N.º: 122) (SEC ID N.º: 22)
L2.6
(SEC ID N.º: 37) AGSKLVS (SEC ID N.º: 123) (SEC ID N.º: 22)
7C8
(SEC ID N.º: 37) AGSKLYS (SEC ID N.º: 124) (SEC ID N.º: 22)
6H4
(SEC ID N.º: 37) AGSKLHW (SEC ID N.º: 125) (SEC ID N.º: 22)
7E4
(SEC ID N.º: 37) AGSKLHY (SEC ID N.º: 126) (SEC ID N.º: 22)
Combi-1
(SEC ID N.º: 37) AGSKRHXW (SEC ID N.º: 127) (SEC ID N.º: 22)
4A10-3
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 125) (SEC ID N.º: 22)
L2.2-4
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 122) (SEC ID N.º: 22)
1F8
(SEC ID N.º: 37) AGSKRYY (SEC ID N.º: 128) (SEC ID N.º: 22)
1B7
(SEC ID N.º: 37) (SEC ID N.º: 128) (SEC ID N.º: 22)
Fab
LCDR1 LCDR2 LCDR3
CON11Gy
(SEC ID N.º: 37) AGSKRHY (SEC ID N.º: 177) (SEC ID N.º: 22)
Consenso 6*
RASKSISKYTA (SEC ID N.º: 37) AGSKX11X12X13 (SEC ID N.º: 129) QQHNEYPYT (SEC ID N.º: 22)
*Tablas 2A y 2B, secuencia consenso 6, en la que X1 es Y, R, o K; X2 es A, o R; X3 es T o R; X4 es G o R; X5 es G o R; X6 es T, o R; X7 es E, T, S, o W; X8 es K o V; X9 es G o R; X10 es D o V; X11 es L o R; X12 es H, R, V, o Y; X13 es S, W, o Y.
Anticuerpos anti-ferroportina adicionales, o fragmentos de unión a antígeno adicionales, comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID N.ºs: 170, 171, 172, 23, 173 y 19, respectivamente, o en las SEC ID N.ºs: 170, 171, 172, 182, 173 y 19, respectivamente. Anticuerpos anti-ferroportina adicionales, o fragmentos de unión a antígeno adicionales, 5 comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID N.ºs: 37, 174, 22, 175, 176 y 120, respectivamente. En base a características farmacocinéticas (por ejemplo, véase, ejemplo 11) y farmacodinámicas (por ejemplo, véanse los ejemplos 10 y 12) así como a las propiedades funcionales de Mabs anti-FPN1 ejemplares, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, (por ejemplo, véanse, los ejemplos 3 (mapeado de epítopos), 4 (afinidad), 5 (efecto sobre concentración de ferritina en 10 las células in vitro), 6 (efecto sobre la unión de hepcidina madura por células manipuladas por ingeniería genética para expresar una fusión FPN1-GFP in vitro), 7 y 9 (efecto sobre la internalización y la degradación de FPN1 inducidas por hepcidina in vitro) y 8 (efecto sobre los niveles de hierro sérico in vivo)), los Mabs más preferidos, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, de la presente invención son los Mabs 4A10-3 y L2.2-4, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos. Las secuencias aminoacídicas que codifican las cadenas pesadas, las cadenas ligeras, las
15 regiones variables de cadenas pesadas y cadenas ligeras y las CDR para Mabs 34A9, 1G9, 3D8, Combi11, 4A10-3, L2.2-4, 1B7, 1F8 y Com11GY se indican a continuación en la tabla 3(a) y en la tabla 3(b) por referencia a las SEC ID N.ºs.
Tabla 3(a)
Mab
Cadena pesada HCVR HC CDR1 HC CDR2 HC CDR2
34A9
50 44 17 18 19
1G9
51 45 23 24 19
3D8
52 46 23 41 19
Combi-11
150 130 23 116 19
4A10-3
152 134 23 110 19
L2.2-4
156 138 23 110 19
1B7
160 145 105 41 19
1F8
164 142 105 117 19
Com11GY
179 179 23 112 19
Tabla 3(b)
Mab
Cadena ligera LCVR LC CDR1 LC CDR2 LC CDR2
34A9
53 47 20 21 22
1G9
54 48 20 27 29
3D8
55 49 37 27 22
Combi-11
151 132 37 127 22
4A10-3
154 136 37 125 22
L2.2-4
158 140 37 122 22
5 10
Mab
Cadena ligera LCVR LC CDR1 LC CDR2 LC CDR2
1B7
162 148 37 128 22
1F8
166 144 37 126 22
Com11GY
161 180 37 127 22
En algunos modos de realización, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, divulgados en el presente documento se pueden usar en combinación con uno o más ESA con el fin de proporcionar beneficios adicionales con respecto a niveles de hierro sérico crecientes, hematocritos crecientes, niveles de hemoglobina crecientes, que reducen la necesidad de transfusión, y/o que mejoran el estado funcional, la productividad y la calidad 5 de vida de pacientes anémicos en comparación con la administración de la terapia de ESA sola. Por el término "tratamiento de combinación" o "en combinación con" se quiere decir que un Mab anti-FPN1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención se administra por separado, de forma simultánea, o de forma secuencial con otro agente destinado a incrementar los niveles de hierro sérico, incrementar hematocritos, incrementar niveles de hemoglobina, reducir la necesidad de transfusiones, y/o mejorar el estado funcional, la productividad y la
10 calidad de vida de pacientes anémicos en comparación con la administración del Mab anti-FPN1, o del fragmento de unión a antígeno del mismo, solo.
En algunos modos de realización, un Mab anti-FPN1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, divulgado en el presente documento se puede administrar en lugar de terapia de ESA en pacientes intolerantes a terapia de ESA o que no responden a terapia de ESA.
15 La expresión "agente estimulador de la eritropoyesis" o "estimulador de la eritropoyesis" quiere decir un compuesto que directa o indirectamente provoca la activación del receptor de eritropoyetina, por ejemplo, uniendo y provocando dimerización del receptor o estimulando expresión de eritropoyetina endógena. ESA incluyen eritropoyetina y variantes, análogos, o derivados de la misma que se unen a y activan receptor de eritropoyetina; anticuerpos que se unen al receptor de eritropoyetina y activan el receptor; o péptidos que se unen a y activan el receptor de
20 eritropoyetina; o compuestos químicos orgánicos pequeños, opcionalmente menos de aproximadamente 1000 Daltons en peso molecular, que se unen a y activan receptor de eritropoyetina. ESA incluyen, pero no se limitan a, la epoyetina alfa, la epoetina beta, la epoetina delta, la epoyetina omega, la epoyetina iota, la epoetina zeta y análogos de las mismas, la eritropoyetina pegilada, a eritropoyetina carbamilada, péptidos miméticos (incluyendo EMP1/hematide), anticuerpos miméticos e inhibidores de HIF (véase la patente de los EE.UU. N.º: 2005/0020487). ESA ejemplares
25 incluyen eritropoyetina, darbepoetina, variantes agonistas de eritropoyetina y péptidos o anticuerpos que se unen y activan receptor de eritropoyetina incluyendo compuestos recogidos en las patentes de los EE.UU. N.ºs: 2003/0215444 y 2006/0040858 así como moléculas de eritropoyetina o variantes o análogos de las mismas también conocidos en la técnica. La eritropoyetina incluye, pero no se limita a, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID N.º: 88. El término "epoetina”, incluye, pero no está limitado a, la epoyetina alfa, la
30 epoetina beta, la epoetina delta, la epoyetina omega, la epoyetina iota, la epoyetina gamma, la epoetina zeta y similares. Adicionalmente, una epoetina también incluye cualquiera de los epoetinas mencionadas anteriormente que están químicamente modificadas, por ejemplo, con uno o más polímeros soluble en agua tales como, por ejemplo, polietilenglicol (incluyendo PEG-EPO-beta). Las secuencias ejemplares, la elaboración, la purificación y el uso de eritropoyetina humana recombinante se describen en varias publicaciones de patentes, incluyendo, pero sin limitarse
35 a, las patentes de los EE.UU. N.ºs: 4.703.008 y 4.667.016. Las secuencias ejemplares, la elaboración, la purificación y el uso de darbepoetina y otros análogos de eritropoyetina se describen en varias publicaciones de patentes, incluyendo Strickland et al., 91/05867 y las publicaciones de solicitudes de patente internacional PCT N.ºs: WO 95/05465, WO 00/24893 y WO 01/81405. Los derivados de polipéptidos que se dan en la naturaleza o análogos incluyen aquellos que se han modificado químicamente, por ejemplo, para unir polímeros solubles en agua (por
40 ejemplo, pegilados), radionúclidos, u otros restos diagnósticos o que señalan como objetivo o restos terapéuticos.
El término "actividad eritropoyética" quiere decir actividad para estimular la eritropoyesis como se demuestra en un ensayo in vivo, por ejemplo, el ensayo de ratón poliquímico, exhipóxico (véase, por ejemplo, Cotes y Bangham, Nature, 191:1065 (1961)).
El término "epítopo" se refiere a esa porción de cualquier molécula que se puede reconocer por y unirse por un
45 anticuerpo a una o más de las regiones de unión a antígeno del anticuerpo. Los epítopos consisten a menudo en un agrupamiento de superficie activo químicamente de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tienen características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Los epítopos de FPN1 humana divulgados en el presente documento se presentan en el contexto de la estructura aminocídica primaria de FPN1 (SEC ID N.º: 1). Sin embargo, algunos de los epítopos pueden ser más
50 discontinuos que continuos ya que los residuos aminoacídicos, en lugar de que estén en enlace peptídico continuo, pueden estar en proximidad espacial entre sí como consecuencia de la estructura terciaria o cuaternaria de FPN1 y su presentación resultante sobre la superficie de esta molécula. Preferentemente, un Mab anti-FPN, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención une FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 a un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un
55 aminoácido o aminoácidos localizados en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 9. Más
preferentemente, un Mab anti-FPN1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención se une a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende
o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95. Incluso más preferentemente, un Mab anti-FPN1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención se une a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 a un epítopo que comprende
o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 pero no se une a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.º: 98, 183-214.
Los anticuerpos de la presente invención también se unen a FPN1 de macaco de Java (SEC ID N.º: 3), facilitando estudios de desarrollo de fármacos terapéuticos de seguridad y eficacia preclínicos obligatorios en uno o más modelos de primates.
La expresión "ferroportina humana 1" o, de forma alternativa, "FPN1 humana" se refiere a una proteína que transporta hierro expresada en seres humanos que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 1, así como a variantes que retienen la capacidad para exportar hierro celular en respuesta a la interacción con hepcidina humana madura.
Preferentemente, un Mab anti-FPN1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención comprende:
1) una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada como se muestran en la SEC ID N.º: 136 y en la SEC ID N.º: 134, respectivamente;
2) una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada como se muestran en la SEC ID N.º: 140 y en la SEC ID N.º: 138, respectivamente. Incluso más preferentemente, un Mab anti-FPN1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención comprende:
1) una cadena ligera y una cadena pesada como se muestra en la SEC ID N.º: 154 y en la SEC ID N.º: 152, respectivamente;
2) una cadena ligera y una cadena pesada como se muestran en la SEC ID N.º: 158 y en la SEC ID N.º: 156, respectivamente. Incluso más preferentemente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de la invención comprende:
1) dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada y en los que cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 154 y cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 152;
2) dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada y en los que cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 158 y cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 156. Incluso más preferentemente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de la invención se une a ferroportina 1 humana con una kD de menos de aproximadamente 10 nM como se determina por resonancia de plasmón superficial a 25 °C. Incluso más preferentemente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de la invención comprende un Fab, en el que el Fab se une a ferroportina 1 humana con una kD de menos de aproximadamente 100 nM como se determina por resonancia de plasmón superficial a 37 °C. Incluso más preferentemente, el Fab tiene una
-1 -1
velocidad de disociación (kdisoc) entre aproximadamente 7,5 x 10-3 sy aproximadamente 9 x 10-4 ssegún se determina por SPR a 37 °C para ferroportina 1 humana. Incluso más preferentemente, el Fab se une a ferroportina 1 humana con una kD de entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM. Incluso más preferentemente, el Fab se une a ferroportina 1 humana con una kD de entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 5 nM. Incluso más preferentemente, el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno tiene una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Incluso más preferentemente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 10 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Incluso más preferentemente, la bioactividad de hepcidina-25 es internalización y/o degradación de ferroportina 1. Incluso más preferentemente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Incluso más preferentemente, el ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 mide un decrecimiento inducido por IL-6 en niveles de hierro séricos en un primate. Lo más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención se caracterizan por unir FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º:1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una kD menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de
aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM como se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención se caracterizan por unir FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º:1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una kD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, según se determina por SPR, preferentemente a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención se caracterizan por unir FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º:1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una velocidad de disociación (kdisoc) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 e incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención se caracterizan por unir FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º:1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM y una velocidad de disociación (Kdisoc) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 , preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 e incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, como se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención se caracterizan por unir FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º:1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, aún más preferentemente, de entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, de entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM,
o lo más preferentemente desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM y una velocidad de disociación
-1 -1
(kdisoc) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7,5 x 10-3 sy aproximadamente 1 x 10-4 s, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 e incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la
secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o en las SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y unen FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una kD menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM como se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En algunos modos de realización, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o en las SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una kD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, según se determina por SPR, preferentemente a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, los Mabs anti-FPN1,
o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En otros modos de realización, la presente invención proporciona Mab, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente que se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una velocidad de disociación (kdisoc) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 e incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o en SEC ID N.º: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM y
10-3 -1
una velocidad de disociación (Kdisoc) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7,5 x sy aproximadamente 1 x 10-4 s-1, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 ,
-1 -1
más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3 sy aproximadamente 1 x 10-4 se incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, como se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En algunos modos de realización, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a
aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, aún más preferentemente, de entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, de entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM y una velocidad de disociación (kdisoc) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, más preferentemente
10-3 -1 10-4 -1
entre aproximadamente 1 x sy aproximadamente 1 x se incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
El término "inhibir" significa la capacidad para antagonizar, prohibir, evitar, contener, ralentizar, desbaratar, eliminar, detener, reducir, o revertir los efectos biológicos de FPN1 y/o de la bioactividad de hepcidina madura incluyendo, pero sin limitarse a, una bioactividad de hepcidina madura humana según se mide en el presente documento en los ejemplos 5-11, 13, o 14, por ejemplo.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o los fragmentos de unión a antígenos de los mismos, de la presente invención se caracterizan porque tienen una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo de bioactividad de hepcidna-25 in vivo. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico.
Adicionalmente, o de forma alternativa, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención se caracterizan por tener una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferentemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferentemente, de entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Preferentemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide internalización y/o degradación inducidas por hepcidina de ferroportina 1. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno
o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención se caracterizan por unir FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º:1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD de menos de aproximadamente 100 nM, menos de aproximadamente 75 nM, menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 25 nM, o menos de aproximadamente 10 nM según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención se caracterizan por unir FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º:1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, aún más preferentemente, de entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, aún más preferentemente, de entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y se caracterizan además por tener una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmento de unión a antígeno, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención se caracterizan por unir FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º:1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o
aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab, tienen una velocidad de disociación (kdesac) para ferroportina
-1 -1
1 humana entre aproximadamente 7,5 x 10-3 sy aproximadamente 1 x 10-4 s, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3
-
1 10-4 -1 10-4 -1
sy aproximadamente 1 x se incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x sy aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y se caracterizan además por tener una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 . Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 75 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, o de menos de aproximadamente 10 nM según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y una velocidad de disociación (kdisoc) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 ,
-1 -1
más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3 sy aproximadamente 1 x 10-4 se incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y se caracterizan además por tener una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivode bioactividad de hepcidina-25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En algunos modos de realización, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y una velocidad de disociación (kdesac) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, más preferentemente entre aproximadamente 1
-1 -1 -1
x 10-3 sy aproximadamente 1 x 10-4 se incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 sy aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y se caracterizan además por tener una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina 25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En algunos modos de realización de la presente invención, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, se caracterizan por unir FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD de menos de aproximadamente 75 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, o de menos de aproximadamente 10 nM según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y tiene una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente de entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de hepcidina-25 de bioactividad y se caracterizan además por tener una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferentemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Preferentemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide internalización y/o degradación inducidas por hepcidina de ferroportina 1. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, de la presente invención, se caracterizan por unir FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y tiene una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente, entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente, entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 y se caracterizan además por tener una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferentemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Preferentemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide internalización y/o degradación inducidas por hepcidina de ferroportina 1. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En algunos modos de realización, la presente invención proporciona Mabs, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que se caracterizan por unir FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 y 1) una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab, 2) una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente de entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo de bioactividad in vivo de hepcidina-25, 3) una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferentemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25 y 4) una velocidad de disociación (kdisoc) para ferroportina humana 1 entre aproximadamente 7,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 ,
-1 -1
más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3 sy aproximadamente 1 x 10-4 se incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6-en los niveles de hierro sérico. Preferentemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de
hepcidina-25 mide internalización y/o degradación inducidas por hepcidina de ferroportina 1. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se caracterizan por tener una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25.
Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6-en los niveles de hierro sérico. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.º: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o en las SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se caracterizan por tener una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 y una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferentemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferentemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Preferentemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide internalización y/o degradación inducidas por hepcidina de ferroportina 1. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o en las SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD de menos de aproximadamente 100 nM, menos de aproximadamente 75 nM, menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 25 nM, o menos de aproximadamente 10 nM según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina--25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, aún más preferentemente, de entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, aún más preferentemente, de entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y se caracterizan además por tener una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la
presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o en las SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab, tienen una velocidad de disociación
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(kdesac) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7,5 x 10-3 sy aproximadamente 1 x 10-4 s, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 e incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y se caracterizan además por tener una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina 25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o en SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 75 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, o de menos de aproximadamente 10 nM según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y una velocidad de disociación (kdisoc) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 ,
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más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3 sy aproximadamente 1 x 10-4 se incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y se caracterizan además por tener una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivode bioactividad de hepcidina-25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En algunos modos de realización de la presente invención, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o en las SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y unen FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD de menos de aproximadamente 75 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, o de menos de aproximadamente 10 nM según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y tiene una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente de entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de hepcidina-25 de bioactividad y se caracterizan además por tener una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferentemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Preferentemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide internalización y/o degradación inducidas por hepcidina de ferroportina 1. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la
presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o en las SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM,
o lo más preferentemente, desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab y tiene una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente, entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente, entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 y se caracterizan además por tener una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferentemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Preferentemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide internalización y/o degradación inducidas por hepcidina de ferroportina 1. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o en las SEC ID N.ºs: 37, 122, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 y 1) una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab, 2) una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente de entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo de bioactividad in vivo de hepcidina-25, 3) una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferentemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25 y 4) una velocidad de disociación (kdisoc.) para ferroportina humana 1 entre aproximadamente 7,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4
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s-1, más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3 sy aproximadamente 1 x 10-4 se incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Preferentemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide internalización y/o degradación inducidas por hepcidina de ferroportina 1. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.ºs: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 a un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 y se caracterizan porque tienen 1) una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre
aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab, 2) una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente de entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo de bioactividad in vivo de hepcidina-25, 3) una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferentemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25 y 4) una velocidad de disociación (kdisoc) para ferroportina humana 1 entre aproximadamente 7,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 ,
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más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3 sy aproximadamente 1 x 10-4 se incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Preferentemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide internalización y/o degradación inducidas por hepcidina de ferroportina 1. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.º: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 a un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 y se caracterizan por tener 1) una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y 37 °C para Fab, 2) una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25, 3) una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferentemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25 y 4) una velocidad de disociación (kdisoc) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, más preferentemente entre aproximadamente 1
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x 10-3 sy aproximadamente 1 x 10-4 se incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 sy aproximadamente 1 x 10-4 s-1, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6 en los niveles de hierro sérico. Preferentemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide internalización y/o degradación inducidas por hepcidina de ferroportina 1. Incluso más preferentemente, los Mabs anti-FPN1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID N.º: 98, 183-214.
En modos de realización particulares, los Mabs anti-FPN 1 Mabs, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden:
a.
una cadena ligera y una cadena pesada como se muestra en la SEC ID N.º: 154 y en la SEC ID N.º: 152, respectivamente;
b.
una cadena ligera y una cadena pesada como se muestra en la SEC ID N.º: 158 y en la SEC ID N.º: 156, respectivamente,
y se unen a FPN1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1 en un epítopo que comprende o que consiste esencialmente en o que consiste en un aminoácido o aminoácidos localizados en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 y se caracterizan por tener 1) una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,5 nM, preferentemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0,5 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 5 nM a
aproximadamente 0,7 nM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0,7 nM, o lo más preferentemente, desde aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, según se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab, 2) una CI50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferentemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferentemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25, 3) una CI50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferentemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, incluso más preferentemente, de entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un in vitro ensayo de bioactividad de hepcidina-25 y 4) una velocidad de disociación (kdisoc) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, preferentemente entre aproximadamente 2,5 x 10-3 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1 ,
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más preferentemente entre aproximadamente 1 x 10-3 sy aproximadamente 1 x 10-4 se incluso más preferentemente entre aproximadamente 5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 1 x 10-4 s-1, como se determina por SPR, preferentemente, a 25 °C para Mabs y a 37 °C para Fab. Preferentemente, el ensayo in vivo mide un decrecimiento inducido por IL-6-en los niveles de hierro sérico. Preferentemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide internalización y/o degradación inducidas por hepcidina de ferroportina 1.
El término "tratando" (o "tratar" o "tratamiento") se refiere a ralentizar, interrumpir, detener, controlar, parar, reducir, o invertir la progresión o gravedad de un síntoma, trastorno, afección, o enfermedad, pero no necesariamente implica una eliminación total de todos los síntomas, afecciones, o trastornos relacionados con la enfermedad.
El término "evitando" (o "evitar" o "prevención") significa prohibir, restringir, o inhibir la incidencia o aparición de un síntoma, trastorno, afección, o enfermedad. Los episodios agudos y las afecciones crónicas se puede tratar y evitar. En un episodio agudo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra en la aparición de un síntoma, trastorno, afección, o enfermedad y se interrumpe cuando el episodio agudo acaba. Por el contrario, un síntoma crónico, un trastorno crónico, una afección crónica, o una enfermedad crónica se trata durante un período de tiempo más prolongado.
Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría de tratamiento de acuerdo con la presente invención. Los términos "trastorno”, "afección" y "enfermedad" se usan de manera intercambiable en el presente documento e incluyen trastornos promovidos por hepcidina madura crónicos y agudos, incluyendo, pero no limitados a, anemia incluyendo, pero no limitada a, anemia de enfermedad crónica.
El término "anemia de enfermedad crónica" se refiere a cualquier anemia que se desarrolla como resultado de, por ejemplo, infección, inflamación y trastornos neoplásicos. La anemia que se desarrolla a menudo se caracteriza por una vida de eritrocitos acortada y por secuestro de hierro en los macrófagos, lo que da como resultado una disminución en la cantidad de hierro disponible para hacer nuevos eritrocitos. Afecciones asociadas con anemia de enfermedad crónica incluyen, pero no se limitan a, endocarditis bacteriana crónica, osteomielitis, fiebre reumática, colitis ulcerosa y afecciones neoplásicas. Otras afecciones incluyen otras enfermedades y trastornos asociados con la infección, inflamación y neoplasmas, incluyendo, por ejemplo, infecciones inflamatorias (por ejemplo, abcesos pulmonares, tuberculosis), trastornos no infecciosos inflamatorios (por ejemplo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, hepatitis, enfermedad intestinal inflamatoria) y diversos cánceres, tumores y neoplasias malignas (por ejemplo, carcinoma, sarcoma, linfoma). Anemia de enfermedad crónica está asociada con hipoferremia y secuestro de hierro celular reticuloendotelial.
Las citocinas inflamatorias son inductores potentes de expresión de hepcidina y el exceso de hepcidina puede desempeñar un papel clave en la patogénesis de anemia en estos pacientes (Weiss, et al., N. Engl. J. Med., 352:1011-1023 (2005); Pigeon et al., J. Biol. Chem. 276:7811-7819 (2001); Nicolas, et al., J. Clin. Invest. 110:1037-1044 (2002); Nemeth, et al., J. Clin. Invest. 113:1271-1276 (2004); Nemeth, et al., Blood, 101:2461-2463 (2003); Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 102: 1906-1910 (2005)). Mediadores inflamatorios tales como IL-6 pueden regular expresión de hepcidina a través de STAT3 (Wrighting, et al., Blood, 108:3204-3209 (2006); Verga Falzacappa, et al., Blood, 109:353-358 (2007); Pietrangelo et al., Gastroenterology, 132:294-300 (2007)). Los datos presentados en el presente documento proporcionan evidencia in vivo de que Mabs anti-FPN1 de la presente invención incrementan los niveles de hierro sérico.
También se proporcionan por la presente invención procedimientos de tratamiento de anemia que comprenden la administración de Mabs anti-FPN1, o de fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención. En algunos modos de realización, el procedimiento de tratamiento de anemia comprende la etapa de administrar una composición farmacéutica que comprende un Mab de anti-FPN1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, a un sujeto en riesgo de o que presenta patologías como se describen en el presente documento, por ejemplo, trastornos de anemia, usando técnicas de administración estándar.
La expresión "cantidad eficaz" según se usa en el presente documento se refiere a una cantidad necesaria (a dosificaciones y durante periodos de tiempo y para los medios de administración) para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad eficaz del anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, género y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo, se compensa con los efectos terapéuticamente beneficiosos.
Una cantidad eficaz es al menos la cantidad mínima, pero menos de una cantidad tóxica, de un agente activo que es necesaria para impartir un beneficio terapéutico a un sujeto. Dicho de otra forma, una cantidad eficaz o cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención es una cantidad que, en mamíferos, preferentemente seres humanos, (i) incrementa los niveles de hierro sérico, el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos, la hemoglobina, y/o el hematocrito, o (ii) trata un trastorno en el que la presencia de hepcidina madura provoca o contribuye a un efecto patológico no deseado, o (iii) disminuye bioactividad de hepcidina madura dando como resultado un efecto terapéutico beneficioso en un mamífero, preferentemente un ser humano, incluyendo, pero no limitado a, que tiene anemia incluyendo, pero no limitada a, anemia de enfermedad crónica, incluyendo, pero no limitada a, anemia resultante de la infección, inflamación, y/o cáncer. Una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención se puede administrar en una dosis individual o en múltiples dosis. Además, una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención se puede administrar en múltiples dosis de cantidades que podrían ser menos que una cantidad eficaz si no se administrasen más de una vez.
Como se conocen bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para un sujeto cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se va a administrar, el género, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se estén administrando simultáneamente. La dosis puede variar además dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg; preferentemente, de aproximadamente 2 mg a aproximadamente 100 mg; más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg; incluso más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg, incluso más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg; incluso más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 20 mg; incluso más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 15 mg; sin embargo, se prevén dosis por debajo o por encima de este intervalo ejemplar, en especial considerando los factores mencionados anteriormente. Un régimen de dosificación parenteral diario puede ser desde aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, preferentemente, desde aproximadamente 100 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, más preferentemente, desde aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, o lo más preferentemente de desde aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg. El progreso se puede monitorizar por evaluación periódica y la dosis se puede ajustar en consecuencia.
Estas cantidades sugeridas de anticuerpo anti-FPN1 están sometidas a un criterio terapéutico en gran medida. El factor clave en la selección de una dosis apropiada y su planificación es el resultado obtenido. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se esté tratando, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del anticuerpo, el tipo particular de anticuerpo, el procedimiento de administración, la planificación de administración y otros factores conocidos por los médicos.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar como medicamentos en medicina humana, administrados por una diversidad de vías. Lo más preferentemente, tales composiciones son para administración parenteral. Tales composiciones farmacéuticas se pueden preparar por procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª ed. (1995), Gennaro, A., et al., Mack Publishing Co. En consecuencia, esta invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos de la invención en combinación con uno o más vehículos, diluyentes, o excipientes farmacéuticamente aceptables. En un modo de realización particular, la composición farmacéutica comprende adicionalmente uno o más de otros agentes terapéuticos.
El término parenteral como se usa en el presente documento incluye administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal. Se prefiere la administración parenteral por infusión o por inyección intravenosa, intraperitoneal, o subcutánea. La inyección subcutánea es la más preferente. Los vehículos adecuados para dichas inyecciones se conocen bien en la técnica.
Típicamente la composición farmacéutica debe ser estéril y estable en condiciones de elaboración y almacenamiento en el envase proporcionado, incluyendo, por ejemplo, un vial sellado, jeringuilla u otro dispositivo de administración, por ejemplo, una pluma. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas se pueden filtrar de forma estéril después de preparar la formulación, o se pueden preparar de otro modo microbiológicamente aceptable.
Se puede incorporar un anticuerpo de la invención en una composición farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto humano. Se puede administrar un anticuerpo de la invención a un sujeto humano solo o en combinación con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable en dosis individuales o múltiples. Dichas composiciones farmacéuticas están diseñadas para ser apropiadas para el modo de administración seleccionado y se usan diluyentes, vehículo, y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de dispersión, tampones, tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad incluyendo pero no limitados a cloruro de sodio, agentes estabilizantes y similares según sea apropiado. Dichas composiciones se pueden diseñar de acuerdo con técnicas convencionales divulgadas, por ejemplo, en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19ª Edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 que proporciona un compendio de técnicas de formulación como se conocen generalmente por los médicos. Los vehículos adecuados para las composiciones farmacéuticas incluyen cualquier material que, cuando se combina con un anticuerpo de la invención, retiene la
actividad de la molécula y no es reactivo con el sistema inmunitario del sujeto.
Los términos "sujeto" y "paciente" usados de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a un mamífero, preferentemente un ser humano. En determinados modos de realización, el paciente tiene un trastorno que se beneficiaría de una disminución en el nivel de hepcidina madura, una disminución en la bioactividad de hepcidina madura, y/o un incremento en el nivel de hierro sérico, el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos, la hemoglobina, y/o el hematocrito.
La administración de un compuesto de anticuerpo contra FPN1 solo puede ser útil en pacientes intolerantes a uno o más ESA, bien a cualquier dosis o bien solo a dosis alta, debido a, por ejemplo, efectos secundarios no deseados. Un Mab de FPN1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención administrada sola o en combinación con un ESA, también puede ser útil en los pacientes resistentes a ESA que son incapaces de alcanzar sus objetivos de hematocrito con ESA solamente, bien a dosis convencionales o bien a dosis altas.
Un Mab de FPN1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención también se puede administrar cuando la terapia de combinación de fármacos, incluyendo el uso de ESA, es inadecuada en permitir a los pacientes alcanzar sus objetivos de hematocrito.
En otro modo de realización, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención para la elaboración de un medicamento para aumentar los niveles de hierro sérico, el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos, la hemoglobina, y/o el hematocrito en un ser humano.
En otro modo de realización, la presente invención proporciona el uso del anticuerpo monoclonal o de un fragmento de unión a antígeno del mismo en la elaboración de un medicamento para su uso en terapia de combinación para aumentar los niveles de hierro sérico, el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos, la hemoglobina, y/o el hematocrito en un ser humano, en el que dicho medicamento se va a administrar en combinación con uno o más ESA seleccionados del grupo que consiste en epoetina alfa, epoetina beta, darbepoetina alfa, hematide, metoxi-polietilenglicol-epoetina beta, u otro agente terapéutico o tratamiento terapéutico empleado convencionalmente para incrementar los niveles de hierro sérico, el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos, la hemoglobina, y/o el hematocrito en un ser humano.
Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran diversas propiedades de los anticuerpos anti-FPN1 divulgados en el presente documento.
Ejemplo 1: producción de hepcidina-25 humana
La hepcidina-25 humana se puede obtener a partir de fuentes comerciales (por ejemplo, Peptide International (Louisville, Kentucky) ) o producir por una variedad de técnicas recombinantes conocidas en la técnica. De forma alternativa, una proteína de fusión que comprende los veinticinco aminoácidos de secuencia de hepcidina-25 y que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 91 se expresa en E. coli. Los cuerpos de inclusión se aíslan de 3 litros de E. coli que expresan la proteína de fusión hepcidina humana después de una inducción de 3-6 horas después de una inducción con IPTG 1 mM a 37 °C. Los cuerpos de inclusión se solubilizan en el tampón A (Tris 50 mM y urea 8 M (pH 8,0)). El sobrenadante se hace pasar por una columna IMAC (20 ml de resina). La columna se lavó con tampón A hasta que la absorbancia volvió a punto de partida y los polipéptidos unidos se eluyeron por lotes a partir la columna por imidazol 0,5 M en el tampón A. Se almacenó la proteína de fusión hepcidina-25 humana y se redujo con DTT 50 mM. Esta proteína de fusión se replegó después diluyendo el material almacenado en urea 2 M, cisteína 3 mM, Tris 50 mM (pH 8,0) hasta una concentración final de proteína de menos de 50 µg/ml. Este material se agita a temperatura ambiente y se oxida al aire durante 48 horas. Los polipéptidos oxidados se hacen pasar por una columna de IMAC (20 ml) a un caudal de 5 ml/min y la proteína de fusión hepcidina-25 humana se eluye por lotes a partir de la columna por imidazol 0,5 M en tampón A. Se concentraron las fracciones almacenadas que contenían la proteínas hepcidina-25 humana y se hicieron pasar por una columna de exclusión molecular Superdex 75 (GE Healthcare, XK26/60) equilibrada con Tris 50 mM, urea 4 M, pH 8,0, a un caudal de 3 ml/min. La proteína de fusión monomérica se agrupó y después se diluyó a Tris 50 mM, urea 2M, CaCl2 5 mM, pH 8,0 y a continuación, se escindió con enterocinasa para producir hepcidina-25 humana de SEC ID N.º: 1. La proteína de fusión hepcidina-25 humana no escindida se se retira por cromatografía IMAC pasiva (como se indica anteriormente). El flujo a través de la columna IMAC se hace pasar después por una columna en fase inversa C-18 a un caudal de 4,0 ml/minuto. La columna se lavó con TFA al 0,1 % en agua hasta que la absorbancia volvió al punto de partida y los polipéptidos unidos se eluyen de la columna con un gradiente lineal de acetonitrilo de un 20 % a un 40 % con TFA al 0,1 % a una velocidad del 0,5 %/min. Las fracciones que contienen el polipéptido hepcidina-25 humano se almacenaron y se analizaron por secuenciación de aminoácidos N-terminal y por espectrometría de masas de desorción/ionización por láser ayudada por matriz (MALDI-EM). Los polipéptidos que codifican hepcidina-25 de rata, de ratón, de macaco y diversas formas truncadas en la zona N-terminal, incluyendo hepcidina-22 y hepcidina-20 se obtuvieron comercialmente (por ejemplo, Peptide International).
Ejemplo 2: generación de Fab 34A9
Los anticuerpos anti-FPN1 se pueden obtener inmunizando ratones con un péptido inmunógeno que tiene la
secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 11. Más específicamente, un péptido inmunógeno que comprende un epítopo OVA enlazado por un engarce peptídico a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 12, que se supone que es al menos parte de un bucle extracelular de FPN1 humana, se puede usar para inmunizar ratones. Después de la inmunización, los bazos de ratones se cosechan y las células del bazo se clasifican mediante un Clasificador Celular Activado Magnético usando un péptido biotinilado que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 12 y perlas de estreptavidina. Se aísla el ARN a partir de células de unión a antígeno y se convierte en ADNc usando oligo dT. Las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras se obtuvieron por PCR usando cebadores estructurales de anticuerpos y se clonaron en un vector fágico para preparar una biblioteca de anticuerpos Fab. La biblioteca de anticuerpos en fagos se rastreó con un péptido biotinilado, por ejemplo, 100 nM, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 12. Los clones que se unen positivamente se caracterizan después por secuenciación de ADN, expresión de Fab y unión al péptido de inmunización y/o a células que expresan ferroportina humana. Fab 34A9 se identificó siguiendo el procedimiento esencialmente como se describe anteriormente.
Ejemplo 3: mapeado de epítopos de Mabs anti-FPN1
Los péptidos que contienen secuencias parciales del inmunógeno relacionado con FPN1 se pueden usar en experimentos de hibridación de inmunotransferencia por puntos para determinar los epítopos del Mab 34A9 de ratón. Los siguientes péptidos se pueden sintetizar y disolver en agua (los aminoácidos subrayados indican la secuencia de aminoácidos de FPN1 real):
FpnE3a (SEC ID N.º: 96): GGSPFEDIRSRFIQGESITPTKGC
060719Z (SEC ID N.º: 97): GGSPFEDIRSRFIQGC
060719Y (SEC ID N.º: 98): GCIQGESITPTKIPEITTEGC
0708L4A (SEC ID N.º: 99): GGMPGSPLDLSVSPFEDGC
0708L4B (SEC ID N.º: 100): GGSPLDLSVSPFEDIRSGC
0708L4C (SEC ID N.º: 101): GGEDIRSRFIQGESITGC
0708L4D (SEC ID N.º: 102): GGRSRFIQGESITPTKGC
Para cada péptido, 3 µl de 1 -5 µg/ml péptido se salpicaron sobre una pieza de membrana de nitrocelulosa y se secaron al aire. La membrana se bloqueó con tampón de bloqueo (por ejemplo, PBS que contenía BSA al 1 %), a continuación se incubó con 3-5 µg/ml de anticuerpo FPN1 3-5 mg/ml en tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante una hora. La membrana se lavó tres veces, 5 minutos cada una, con PBST 1x (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,1 %, pH 7,4) antes de incubarse con anticuerpo anti-ratón de cabra marcado con IR700 de acuerdo con el protocolo del fabricante (LiCor, Inc; Lincoln, NE). La membrana se lavó tres veces, cinco minutos cada vez, con PBST 1x, se proyectó en sistema de formación de imágenes Odyssey y programa informático Odyssey (LiCor, Inc).
La figura 1 indica que Mab 34A9 se une a péptidos FpnE3a, 060719Z, 0708L4C y 0708L4D, de los que todos contienen aminoácidos 409 a 415 de SEC ID N.º: 1. Mab 34A9 no requiere la secuencia de aminoácidos de EDI como se indica por la unión a péptido 0708L4D. Mab 34A9 se une más débilmente a péptido 060719Z que 0708L4C; el último péptido contiene aminoácidos 416-419 de FPN1 (SEC ID N.º: 1).
Ejemplo 4: afinidades de Fab y Mabs anti-FPN1 según se determinan por SPR
Las afinidades de unión de FPN1 pueden determinarse en Biacore T100 y usando modelo de unión 1:1 en el sprograma informático de evaluación Biacore T100 (BIAcore® AB, Upsala, Suecia). En resumen, el sistema T-REx, un sistema de expresión regulado por tetraciclina comercialmente disponible sin transactivadores víricos (Invitrogen, Carlsbad, CA) se utiliza para generación de líneas celulares estables en células HEK 293 de T-REx. Todas las condiciones de crecimiento se describen en el manual de T-REx proporcionado por Invitrogen. FPN1 está fusionada en C-terminal con GFP. La expresión de FPN1-GFP se induce mediante 1-10 ng/ml de doxiciclina durante 1-24 horas. Las células inducidas se recogen retirándolas por raspado de matraces y a continuación se lavan con PBS 1x. Los sedimentos celulares se pueden almacenar a -80 ºC antes de su uso. Aproximadamente cinco millones de células inducidas se resuspendieron en tampón fosfato 10 mM con Tween-20 al 0,2 % e inhibidores de proteasas, por ejemplo, Comprimido de Cóctel de Inhibidores de Proteasas Complete™ (Roche Diagnostics Corp., Indianápolis, IN). Tres ciclos de congelar/descongelar/sonicación se usan para lisar las células. El lisado se diluyó dos veces con tampón de desplazamiento de Biacore y se centrifugó para retirar los restos.
En Biacore T100, anticuerpo anti-GFP de conejo o anticuerpo anti-GFP de cabra se inmoviliza sobre celda de flujo 1 a 4 de un chip CM5 a 5000 -15000 Rus. FPN1-GFP se captura sobre celda de flujo 2, 3, o 4 del lisado de células inducidas. La célula de flujo 1 se usó como referencia. A continuación todas las celdas de flujo se inyectan con diferentes concentraciones de anticuerpos para evaluar la unión y la cinética. Medidas basadas en resonancia de
plasmón superficial usando fragmentos de unión a antígenos univalentes tales como Fab, en general se prefieren a las que usan anticuerpos multivalentes en este formato de ensayo para minimizar efectos de avidez. Las tablas 4a y 4b muestran las características de unión para Fab de unión anti-FPN1 humana usando anticuerpo anti-GFP de conejo (Invitrogen, Carlsbad, CA (n.º de catálogo A11122)) y anticuerpo anti-GFP de cabra (R&D Systems, Mineápolis, MN (n.º de catálogo AF4240)), respectivamente.
Tabla 4(a): cinética de unión de Fab de anticuerpos contra FPN1 a FPN1 humana (determinada por Biacore T100 a 37 °C)
Fab
Kactiv. (M-1s -1) Kdesac. (s-1) KD cinética (M)
34A9
6,321E+04 2,620E-03 4,145E-08
1G9
1,269E+05 8,974E-04 7,707-09
3D8
1,920E+05 2,000E-03 1,042E-08
Como se muestra en la tabla 4(a), la KD para FPN1humana del Fab 34A9 de ratón es aproximadamente 41 nM según se determina por SPR a 37 °C en este formato de ensayo. La KD para FPN1 humana del Fab 1G9 de ratón, una forma madura del Fab 34A9 de ratón es aproximadamente 7,7 nM según se determina por SPR a 37 °C, una mejora en la afinidad de unión de aproximadamente 5 veces. Fab 3D8, una forma humanizada del Fab de ratón 1G9 que tiene la VH1-69 estructural de cadena pesada humana y la estructura 02 de cadena ligera, demostraron una KD para FPN1 humana de aproximadamente 10 nM según se determina por SPR a 37 °C en este formato de ensayo.
Tabla 4(b): cinética de unión de Fab de anticuerpos contra FPN1 a FPN1 humana (determinada por Biacore T100 a 37 °C)
Fab
(n) Kactiv. (M-1s -1) Kdesac. (s-1) KD cinética (M)
1G9 de ratón
4 1,726+05 4,968E-04 2,900E-09
3D8 humano
3 3,284E+05 2,061E-03 6,293E-09
4A10-3 humano
4 8,443E+05 1,483E-03 1,761E-09
Combi11 Humano
3 2,309E+06 6,369E-03 2,395E-09
L2.2-4 Humano
3 4,308E+05 7,905E-04 1,959E-09
Como se muestra en la tabla 4(b), la KD para FPN1 humana del Fab 1G9 de ratón, una forma madura del Fab 34A9 de ratón es aproximadamente 2,9 nM según se determina por SPR a 37 °C en este formato de ensayo. Fab 3D8, una forma humanizada del Fab de ratón 1G9 que tiene la VH1-69 estructural de cadena pesada humana y la estructura 02 de cadena ligera, demostraron una KD para FPN1 humana de aproximadamente 6,3 nM según se determina por SPR a 37 °C en este formato de ensayo. Fab 4A10-3 maduros de afinidad, Combi11 y L2.2-4 demostraron una KD para FPN1 humana entre aproximadamente 2,4 nM a aproximadamente 1,8 nM según se determina por SPR a 37 °C en este formato de ensayo.
La tabla 5 muestra las características de unión para unión de FPN1 anti-humana usando anticuerpo anti-GFP de conejo (Invitrogen, Carlsbad, CA (n.º de catálogo A11122)).
Tabla 5: cinética de unión de Mabs a FPN1 humana (determinada por Biacore T100 a 25 ºC o 37 °C)
Mab
Temp. Kactiv. (M-1s -1) Kdesac. (s-1) KD cinética (M)=
34A9 de ratón
25 ºC 6,901E+04 8,155E-05 1,182E-09
1G9 de ratón
25 ºC 1,348E+05 9,81E-05 7,281E-10
3D8 humano
37 ºC 3,25E+05 1,095E-03 3,366E-09
La KD para FPN1 humana del Mab 34A9 de ratón es aproximadamente 1,1 nM según se determina por SPR a 25 °C. La Kd para FPN1 humana del Mab 1G9 de ratón, una forma madura de afinidad del Mab 34A9 de ratón es de aproximadamente 0,73 nM según se determina por SPR a 25 ºC. Una forma humanizada del Mab 1G9, Mab 3D8, que tiene las estructuras de cadena pesada y cadena ligera humanas, VH1-69 y 02, respectivamente, demostró una KD para FPN1 humana de aproximadamente 3,4 nM según se determina por SPR a 37 °C.
La KD para FPN1 humana, determinada como se describe en este ejemplo, ilustra la generación de anticuerpos contra FPN1 humana con alta afinidad y más específicamente, se unen a un epítopo de FPN1 que está presente, incluso cuando la FPN1 humana se expresa por células y se localiza en la membrana celular.
Ejemplo 5: ensayo in vitro de los efectos de Mabs de FPN1 sobre niveles de ferritina celulares
Células Caco-2, una línea celular enterocítica humana, que expresa de forma endógena FPN1 se puede monitorizar para cambios en ferritina. La concentración de ferritina en las células Caco-2 se puede incrementar añadiendo una fuente exógena de hierro y la concentración puede estar adicionalmente aumentada con la adición de hepcidina que previene la exportación de hierro. En consecuencia, el efecto de anticuerpos anti-FPN1 humana en regulación de hierro modulada por hepcidina madura en células Caco-2a se puede determinar como sigue.
Se retiran células Caco-2 del recipiente de cultivo celular usando tripsina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se recogen y se lavan en medio de cultivo (por ejemplo, DMEM + FBS al 10 % + aminoácidos no esenciales + antibióticos/antimicóticos al 1 %) y se recogen por centrifugación suave. Las células se resuspenden en medio de cultivo y se cuentan. La concentración celular se ajusta hasta 1 x 106 células/ml en medio de cultivo y Fe:NTA 2,5 μM (proporción molar 1:4 preparada) se añadió a las células. Se añaden cien μl de células a pocillos de una placa de 96 pocillos planos, seguidos por incubación durante 24 horas a 37 °C, CO2 al 5 % IgG de ratón1, un control negativo y dos anticuerpos con diferente afinidades a FPN1 humana se preparan en medio de cultivo, a 6x la concentración final. Se añadieron a los pocillos por triplicado diluciones de anticuerpos (25 μl) o medio. Se incuban las placas a temperatura ambiente durante 15 minutos momento en el que se añaden a los pocillos apropiados 25 μl de Fe:NTA 5 μM con o sin hepcidina 600 nM (100 nM de concentración final). Las células se incubaron durante 24 horas a 37 °C, CO2 al 5 % y después se lavaron 3x con 200 μl de PBS de Dulbecco y se lisaron en 50 μl de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, SDS al 0,1 %, Tritón-X100® al 1 % y desoxicolato sódico al 0,5 %) más inhibidores de proteasas, por ejemplo, Comprimido de Cóctel de Inhibidores de Proteasas Complete™ (Roche Diagnostics Corp., Indianápolis, IN) se mezclaron y se congelaron a -70 ºC hasta que se sometieron a ensayo para determinar la ferritina usando un ELISA.
En resumen, las placas de microvaloración están recubiertas con 110 μl/pocillo de 1 μg/ml de anti-ferritina humana (Leinco Technologies, San Luís, MO) y se incubaron durante la noche a 4 ºC. Las placas se lavan 2 veces con tampón de lavado (Tris 0,02 M, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,1 %, pH 7,4) y se bloquean con 150 μl de caseína al 1 % en PBS (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Se incuban las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añaden cien microlitros (μl) de los lisados y estándares (ferritina hepática humana, Calbiochem/EMD Biosciences, La Jolla, CA) a los pocillos apropiados y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan 3 veces y la ferritina unida se detecta usando un conjugado de anti-ferritina-HRP (Leinco Technologies) a dilución 1:2000 en 100 ml por pocillo e incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan 4 veces y se dispensan 100 ml de sustrato OPD (comprimido de 5 mg de sustrato, en 12,5 ml de Na2HPO4 0,1 M, ácido cítrico 0,05 M, pH 5,0 con 5 ml de H2O2 al 30 %) a todos los pocillos. La reacción se detiene con 100 ml de HCl 1 N después de 10 minutos. La absorbancia a 490 nm (A4gg) se lee usando un lector de placas de ELISA apropiado. La concentración de proteínas en cada muestra también se mide usando un kit de ensayo de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific). Para dar cuenta de posibles diferencias pocillo a pocillo en número de células, los datos de concentración de ferritina se normalizan a la concentración de proteínas y el efecto de los anticuerpos añadidos se expresa como inhibición porcentual.
Los experimentos llevados a cabo como se describe en este ejemplo indican que los efectos de hepcidina-25 humana sobre concentración de ferritina en las células se inhiben por Mabs 34A9 y 1G9 (tabla 6). Además, los resultados muestran que la afinidad del Mab anti-FPN1 tiene implicaciones directas sobre su funcionalidad. Más específicamente, el Mab de afinidad menor 34A9, incluso a la concentración más alta (200 µg/ml) solo inhibió ligeramente efectos inducidos por hepcidina madura (inhibición al 25 % ± 0,5 %), mientras que el Mab 1G9 de afinidad más alta presentó inhibición marcada de una manera dependiente de dosis.
Tabla 6
Muestra
Ferritina (mg)/proteína (µg) DTS Inhibición en %
NTA:Fe solamente
5,11 0,25 NA
NTA+Fe + hepcidina
9,95 0,86 NA
200 µg/ml mIgG1
9,40 0,25 11,6
100 µg/ml mIgG1
9,78 0,88 3,5
50 µg/ml mIgG1
10,06 0,96 0
25 µg/ml mIgG1
9,6 1,29 7,2
12,5 µg/ml mIgG1
10,01 1,11 0
6,25 µg/ml mIgG1
10,45 2,05 0
Muestra
Ferritina (mg)/proteína (µg) DTS Inhibición en %
200 µg/ml Mab 1G9
6,07 0,34 80,2
100 µg/ml Mab 1G9
5,58 0,34 88,2
50 µg/ml Mab 1G9
7,11 0,54 58,7
12,5 µg/ml Mab 1G9
7,93 0,43 41,7
6,25 µg/ml Mab 1G9
8,02 0,45 39,9
200 µg/ml Mab 349
8,74 0,50 25
50 µg/ml Mab 349
9,65 0,50 6,2
Estos datos ilustran que Mabs 1G9 y 34A9 bloquean la capacidad de hepcidina-25 humana para inducir internalización y degradación de ferroportina y por tanto reducir hierro exportado a partir de las células.
Ejemplo 6: ensayo para la inhibición de unión de hepcidina-25 humana a FPN1
Las células FPN-GFP/293 transfectadas de forma estable se plaquean en placas revestidas de poli-D-lisina a 60.000
5 células por pocillo en 80 µl de medio de ensayo (DMEM 11965, FBS dializado al 10 %, FAC 20 µM, penicilina-estreptomicina) y se incuban 4 horas a 37 °C, CO2 al 10 %. La doxiciclina se añade a una concentración final de 11,2 nM para inducir expresión de FPN1. Las células control inducidas con doxiciclina y no inducidas con doxiciclina se incubaron durante toda una noche a 37 °C. A continuación, el medio de crecimiento se desecha y se reemplaza con anticuerpo de prueba o con un anticuerpo de control de isotipo en 30 µl de medio de ensayo o en 30 µl de control solo
10 de medio de ensayo y se incubó a 37 °C durante 1 hora. A continuación, se añaden 20 µl de hepcidina humana madura biotinilada a los pocillos a una concentración final de 30 nM. Las muestras se establecen además durante 1 hora, a 37 °C antes del lavado 4 veces con 200 µl de FBS al 2 %, D-PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA). A continuación, se añaden 65 µl de tampón de lisis (Tritón X-100 al 0,5 %, EDTA 10 mM) y se agitan las placas durante 10 minutos. A continuación, 50 µl de la solución en cada pocillo se transfieren a pocillos individuales de una placa revestida con
15 estreptavidina (60 µl de 2 µg/ml de estreptavidina en PBS, se incuban a 4 ºC durante toda una noche, se lavan 2 veces (Tween 20 al 0,1 %, TBS), se bloquean con caseína/PBS) y a continuación se incuban durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, los pocillos de la placa se lavan 3 veces (Tween 20 al 0,1 %, TBS) y se añaden 50 μl de Mab
3.23 anti-hepcidina-25 humana a 0,5 μg/ml y las muestras se incuban una hora a temperatura ambiente. El Mab 3.23 anti-hepcidina-25 humana se describe en la publicación de solicitud de patente internacional WO 2009/058797. A
20 continuación, las placas se lavan tres veces y se añaden a dilución 1:2000 50 μl de IgG antihumana-peroxidasa de rábano picante (HRP). Después de incubar una hora a temperatura ambiente, se añaden 50 μl de sustrato OPD. La reacción se detiene con 100 μl de HCl 1 N después de 4 minutos. La absorbancia a 490 nm (A490) se lee usando un lector de placas de ELISA apropiado.
Tabla 7
Inhibición en %
Concentración de anticuerpos
Anticuerpo
1,2 uM 0,3 uM 0,75 uM 0,019 uM
1G9
Media 58,1 55,5 33,7 17,5
DT
1,7 6,7 20,4 8,7
Concentración de anticuerpos
6,0 uM
1,2 uM 0,24 uM 0,048 uM
34A9
Media 26,4 31,2 9.6 -7,2
DT
26,8 6,9 6,0 12,1
Ms IgG1
Media -3,4 0,5 -4,0 -11,0
DT
8,8 6,1 7,3 9,6
25 Los datos generados en experimentos llevados a cabo esencialmente descritos en el ejemplo 6 demuestran que Mabs 1G9 y 34A9 inhiben la capacidad de hepcidina-25 humana para unir FPN1 humana.
Ejemplo 7: ensayo basado en células para inhibición por anticuerpos anti-FPN1 de internalización y de degradación inducidas por hepcidina-25
Un ensayo basado en células in vitro se puede usar para medir la actividad de neutralización de hepcidina madura de Mabs, o de fragmentos de unión a antígeno de los mismos, dirigida contra FPN1 humana. Un ensayo tal puede estar basado en internalización y degradación inducidas por hepcidina madura de su receptor, FPN1. Por ejemplo, se prepara una línea celular estable HEK 293 que permite la expresión inducible de FPN1. FPN1 se fusiona en su extremo C-terminal con GFP para propósitos de seguimiento. La expresión inducible de la molécula FPN1-GFP está controlada usando el sistema T-REx (Invitrogen, Carlsbad, CA). La secuencia codificante FPN1-GFP está clonada en el vector pCADN4/TO, que contiene un promotor inducible y un marcador de resistencia a zeocina. La construcción resultante se transfectó en células T-REx-293 que expresan la proteína reguladora requerida para expresión inducible de doxiciclina. Clones resistentes a zeocina se someten a prueba para la expresión inducible de FPN-GFP. Las condiciones de crecimiento celular son esencialmente como se describen en el manual de usuario del fabricante para el Sistema de T-REx (Invitrogen). En resumen, las células se hacen crecer en DMEM, FBS dializado al 10 %, FAC 20 µM, más 5 µg/ml de penicilina-estreptomicina. La selección se mantiene con 100 µg/ml de zeocina y 5 µg/ml de blasticidina. Las células se plaquearon sobre placas negras/transparentes de 96 pocillos que están recubiertas con poli-D-lisina. Un lector de placa fluorescente de alta resolución Acumen Explorer HTS, se usó para leer la fluorescencia total por pocillo.
Tras tripsinización, se sembró placa de ensayo de 96 pocillos con 9.000 células/pocillo usando la línea celular estable FPN1-GFP/TREx 293. El volumen de siembra por pocillo es 80 ml. Las células se dejaron unir durante la noche. Temprano a la mañana siguiente, se añaden 9 µl de 30 ng/ml de doxicilina a cada pocillo para inducir expresión de FPN1-GFP. Después de 8 horas de inducción a 37 °C, el medio se aspira y los pocillos se lavan cuidadosamente con 150 µl/pocillo de PBS.
Los tratamientos deseados (por ejemplo, hepcidina-25 humana y/o anticuerpos de prueba) se ajustan en un formato de 96 pocillos para adición rápida a una placa de ensayo después de lavar. El volumen de ensayo final por pocillo es 45 µl. Inmediatamente después de añadir los tratamientos, la placa de ensayo se lee usando el Acumen Explorer (fijado a 550 voltios en canal 1). Esta es en general la lectura de la hora 0 y se usa para normalizar el número de células por pocillo, lo que correlaciona con las unidades de fluorescencia totales (FLU) por pocillo. Para la internalización inducida por hepcidina humana madura y la degradación de FPN1, el efecto máximo se observa a hepcidina humana madura 0,5 µM. La CI50 de hepcidina humana madura es aproximadamente 10 nM. Para ensayos de neutralización de anticuerpos anti-FPN1, la concentración de hepcidina-25 humana se mantiene a 120 nM y los Mabs anti-FPN1 se pusieron a prueba a 600 nM, 200 nM, 67 nM, 22 nM y 7,4 nM. Las placas se incubaron durante 24 horas, después de lo que, se leen de nuevo y los datos se generan como la proporción de FLU totales por pocillo a las 24 horas divididas por las FLU totales por pocillo a las 0 horas. Todos los puntos de datos se realizan en cuadruplicado. La inhibición en porcentaje (%) se determina sustrayendo los valores para tratamiento de hepcidina humana madura 120 nM y a continuación dividiendo los valores tratados de anticuerpo contra FPN1 por el valor no tratado con hepcidina-25 humana.
En un ensayo in vitro llevado a cabo esencialmente como se describe anteriormente, la bioactividad de hepcidina-25 humana se neutralizó con diversos Mabs anti-FPN1 con un porcentaje de inhibición medido como se muestra en la tabla 8 a continuación.
Tabla 8: inhibición en porcentaje (%) por Mab anti-FPN1 de internalización y degradación inducidas por hepcidina humana madura in vitro
Mab 349A9
Mab 1G9 Mab 3D8
Mab a 600 nM
39,0 % 67,9 % 66,4 %
Mab a 200 nM
30,8 % 62,4 % 63,9 %
Mab a 67 nM
23,6 % 61,8 % 55,7 %
Mab a 22 nM
14,1 % 49,9 % 50,2 %
Mab a 7,4 nM
4,8 % 24,3 % 28,1 %
Los datos generados en experimentos llevados a cabo esencialmente como se describe en el ejemplo 7 apoyan la conclusión de que los Mabs 1G9, 34A9 y 3D8 inhiben grandemente la capacidad de hepcidina-25 humana para provocar la internalización y degradación de FPN1 humano in vitro.
Ejemplo 8: bioactividad de Mab 1G9 relacionada con una IgG1 murina de control después de una dosis intravenosa individual a los macacos de Java
Los efectos fisiológicos de Mab 1G9 murino anti FPN1 humana sobre niveles de hepcidina sérica y hierro sérico se investigaron administrando el Mab como una dosis intravenosa individual a macacos de Java machos (Macaca
fascicularis; 3-4 kg) y comparando sus efectos con una administración control de IgG 1 murina. Tras la administración se recogieron muestras de sangre para el análisis de hierro sérico y hepcidina sérica. La dosis (30 mg/kg) se administra como una inyección por medio de una vena safena. Inmediatamente después de la administración de la dosis, pero antes de que la aguja se retirase del animal, el aparato de dosis se purgó con aproximadamente 2 ml de solución salina.
Tabla 9
Concentración (mg/ml)
Volumen (ml/kg)
1
Control de IgG1 murino 9,53 3,15
2
1G9 murino 12,6 2,38
Toma de muestras para hepcidina sérica:
Se recogió sangre antes de la dosificación y a 0,5, 1, 3, 6, 10, 24, 48, 72, 96 y 168 horas después de la dosis. Se recogió sangre (aproximadamente 0,5 ml) por medio de una vena femoral en tubos que no contienen ningún anticoagulante. Se dejó que la sangre coagule en condiciones ambientales antes de la centrifugación para obtener suero. Las muestras de suero se colocaron en hielo seco antes de almacenamiento a aproximadamente -70 °C.
Toma de muestras para hierro sérico:
Se recogió sangre antes de la dosificación y a 1, 3, 6, 24, 48, 72, 96 y 168 horas después de la dosis. Todas las muestras de sangre se recogieron, manipularon, procesaron, almacenaron y analizaron de acuerdo con procedimientos considerados aceptables en la comunidad médica. Los niveles de hierro sérico se pueden medir por cualquier procedimiento conocido en la técnica que en general se considere dentro la comunidad médica que es un procedimiento aceptable de medir hierro (Fe) sérico total. Las concentraciones séricas de hepcidina se determinaron por cromatografía líquida-espectrometría de masas esencialmente como se describe en Murphy, et al., Blood, 110:1048-54 (2007). Se conocen bien en la técnica ensayos para medir hierro sérico (véanse, por ejemplo, Goodwin, J.F., et al., Clinical Chemistry 12: 47-57 (1966) y J. Clin. Path., 24:334-335 (1971)).
Las concentraciones de hepcidina séricas no se afectaron por la administración de IgG1 murina de control y variaron desde 1,5 hasta 31 ng/ml a lo largo del curso temporal estudiado. Los niveles de hepcidina promedio en los animales de control fueron 11,5 ± 8,8 ng/ml (media ± DT). Después de la administración de Mab 1 G9 murino, los niveles de hepcidina sérica se elevaron desde un punto de partida de 7,6 y 14,7 ng/ml hasta un máximo de 49,7 y 79,1 ng/ml, respectivamente. El máximo en hepcidina sérica tuvo lugar aproximadamente 10 horas después de la administración de Mab 1G9 murina (figura 6). La elevación de hepcidina sérica se debe probablemente a la interacción de Mab 1G9 murina con su FPN1 objetivo, que, tras unirse a FPN1 bloquea la interacción de FPN1 y hepcidina, ralentizando de este modo la depuración y/o la internalización de FPN1.
El hierro sérico no se elevó en animales tratados con IgG murino de control y varió desde 64 hasta 97 µg/dl a lo largo del marco temporal estudiado. Después de la administración de Mab 1 G9 murino, los niveles de hierro sérico se elevaron desde un punto de partida de 136 y 144 µg/dl hasta un máximo de 306 y 292 µg/dl, respectivamente. El máximo en hierro sérico tuvo lugar aproximadamente 48 h después de la administración de Mab 1G9 murino (figura 7). Los niveles de hierro sérico volvieron gradualmente al punto de partida en 96 horas después de la administración, indicando que la elevación de los niveles de hierro sérico no es irreversible.
Ejemplo 9: ensayo basado en células para inhibición por anticuerpos anti-FPN1 de internalización y de degradación inducidas por hepcidina-25
Los experimentos llevados a cabo esencialmente como se describe en el ejemplo 7 anterior demuestran que los Mabs Combi-11, 4A10-3 y L2.2-4 inhiben internalización y degradación de FPN1 humana inducidas por hepcidina-25 humana de forma más eficaz in vitro en comparación con los Mabs 34A9, 3D8 y 1G9 (véase la tabla 10). Más específicamente, los Mabs anti-FPN1 se sometieron a prueba en una curva de concentración de 9 puntos comenzando a 900 nM y realizando diluciones en serie de 3 veces. La inhibición en porcentaje (%) se determinó sustrayendo los valores para tratamiento de hepcidina humana madura 120 nM y a continuación dividiendo los valores tratados de Mab por el valor no tratado con hepcidina. La CI50 relativa se determinó en trazado Sigma. La inhibición porcentual (%) máxima así como la CI50 relativa y absoluta se muestran en la tabla 10.
Tabla 10
Mab (IgG4)
Inhibición en % superior (n = 3) CI50 relativa (nM) (n = 3) CI50 absoluta (nM) (n = 3)
Comb11
92,6 ± 4,5 3,7 ± 0,2 3,8 ± 0,1
Mab (IgG4)
Inhibición en % superior (n = 3) CI50 relativa (nM) (n = 3) CI50 absoluta (nM) (n = 3)
4A10-3
85,9 ± 2,2 4,7 ± 1,5 5,7 ± 1,7
L2.2-4
81,6 ± 1,0 4,8 ± 1,2 6,2 ± 1,6
3D8
86,8 ± 7,0 10,2 ± 2,2 13,7 ± 3,4
1G9
69,0 ± 8,0 9,2 ± 3,3 18,8 ± 8,1
34A9
55,2 ± 7,1 58,9 ± 18,6 N.C.
N.C.: parte superior ajustada de la curva no alcanza el 50 % de tal modo que no se puede calcular la CI50 absoluta.

Ejemplo 10: efecto farmacodinámico de anticuerpos 4A10-3 monoclonales anti-ferroportina humanizados en macacos de Java
Las propiedades farmacodinámicas de los Mabs anti-ferroportina pueden ser estudiados después de la administración de dosis intravenosas a macacos de Java machos de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, en cinco estudios independientes Mab 4A10-3 se administró a macacos de Java como una sola inyección intravenosa rápida (n=4/grupo) a dosis de 0,3, 1,0, 3,0, 10 y 30 mg/kg. Se tomaron muestras de sangre (aproximadamente 0,5 ml para los parámetros de hierro) antes de la primera dosis y a 1, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168 y 264 horas después de la dosis. A niveles de dosis más altos, se tomaron muestras de sangre adicionales a 360, 456, 552 y 648 horas después de la dosis. En el momento de la dosificación, los animales pesaban entre 2 a 3 kg. Se recogieron muestras de sangre de cada animal por medio de una vena femoral en tubos que no contenían ningún anticoagulante.
Los perfiles de concentración-tiempo de hierro sérico tras la administración intravenosa de 0,3, 1,0, 3,0, 10 y 30 mg/kg de Mab 4A10-3 a macacos de Java machos estaban asociados con un incremento dependiente de dosis en hierro sérico que alcanzó su máximo a las 24 horas después de la dosificación. Las respuestas de hierro máximas (aproximadamente incremento de dos veces) y la duración de la repuesta entre las dosis de 10 mg/kg y 30 mg/kg fueron similares. En los animales que recibieron dosis de 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg el hierro sérico volvió a los valores del punto de partida aproximadamente 48 horas después de la dosificación. En los animales que recibieron dosis de 10 mg/kg y 30 mg/kg el hierro sérico volvió a los valores del punto de partida aproximadamente 72 horas después de la dosificación.
Además, en un único estudio, la administración de una inyección subcutánea única de Mab 4A10-3 a una dosis de 10 mg/kg produjo una respuesta idéntica (n=2; media ± DT) en hierro sérico, tanto en intensidad como en duración, como ser observa después de la dosis intravenosa equivalente (n=4; media ± DT).
Ejemplo 11: farmacocinética de anticuerpos monoclonales anti-ferroportina humanizados en ratas y macacos de Java
La farmacocinética de Mabs anti-ferroportina se pueden estudiar in vivo de acuerdo con procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. La farmacocinética de Mabs 4A10-3 y Combi 11 anti-FPN1 se investigó tras una sola dosis intravenosa a macacos de Java machos y ratas Sprague Dawley ratas, por ejemplo. En el momento de dosificación los macacos de Java usados pesaban entre 2,2 y 5,5 kg y las ratas Sprague Dawley pesaban entre 240 y 265 g.
El estudio farmacocinético llevado a cabo en macacos de Java se realizó en tres fases, con dosis a 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg y 0,3 mg/kg administradas a intervalos de aproximadamente 2 semanas. En cada fase, bien Mab 4A10-3 o bien Mab Combi11 se administró como un solo bolo intravenoso (n = 4 por grupo). Se tomaron muestras de sangre antes de la primera dosis y a 1, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168 y 264 horas después de la dosis.
En ratas, Mab 4A10-3 o Mab Combi 11 se administró como una dosis de bolo intravenoso única de 3 mg/kg (n = 3 por grupo). Se tomaron muestras de sangre seriadas antes de la dosis y a 0,08, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 120 y 168 horas después de la dosis.
Las concentraciones séricas de Mabs 4A10-3 y Combi 11 se determinaron usando un formato de ELISA de tipo sándwich de IgG humana. El intervalo de curva estándar era 5 a 400 ng/ml, con un límite inferior de trabajo de cuantificación (LLOQ) definido como 10 ng/ml. Se determinaron los parámetros farmacocinéticos usando análisis no compartimental en WinNonLin versión 5.2.
Perfiles de concentración sérica-tiempo tras la administración intravenosa a macacos de Java machos se representan en la figura 10. Mab 4A10-3 se depuró mucho más lentamente (aproximadamente 5 veces) que Mab Combi11 en todas las dosis estudiadas. Las diferencias fueron evidentes en el primer punto temporal examinado (1 hora) cuando las concentraciones séricas de Mab Combi11 fueron aproximadamente el 50 % de aquella observada para Mab 4A10-3. A
24 horas después de la dosis, las concentraciones séricas de Mab 4A10-3 fueron el 20-33 % de Cmáx en comparación con solo 6-9 % para Combi11. Las concentraciones periféricas de Mab Combi11 no fueron evidentes después de la dosis de 0,3 mg/kg. La depuración de Mab 4A10-3 era de algún modo más rápida a las dos dosis más bajas en comparación con la dosis de 3 mg/kg. El T1/2 para Mab 4A10-3 varía de 2 a 3 días. Sin embargo, el T1/2 para Mab Combi11 varía de aproximadamente 12 a aproximadamente 27 horas.
La depuración potenciada de Mab Combi11 en relación a Mab 4A10-3 se hipotetiza que resulta de interacciones no específicas incrementadas de Mab Combi11 con proteínas de la superficie celular que no se dan para Mab 4A10-3. Con el fin de evaluar esta hipótesis la farmacocinética de Mab 4A10-3 y la de Mab Combi11 se estudiaron en ratas puesto que ningún Mab se une eficazmente a ferroportina de rata.
Perfiles concentración sérica-tiempo tras la administración intravenosa a las ratas macho se representan gráficamente en la figura 11. De forma similar a la observación en primates, Mab 4A10-3 se depura más lentamente (aproximadamente 5 veces) que Mab Combi11 en ratas (datos no mostrados). De nuevo, las diferencias fueron evidentes en el primer punto temporal examinado (0,08 horas) cuando las concentraciones séricas de Mab Combi11 fueron aproximadamente el 50 % de aquella observada para Mab 4A10-3. El T1/2 para Mab 4A10-3 y Mab Combi11 fue aproximadamente de 4,5 días y de 3 días, respectivamente, en ratas (datos no mostrados).
Estos datos sugieren fuertemente que la más rápida depuración observada para Mab Combi11 no fue atribuible a la depuración mediada por receptor diana dado que ningún Mab 4A10-3 ni Mab Combi11 unen ferroportina de rata.
Ejemplo 12: Mabs anti-FPN1 humana con depuración retardada y/o unión baja no específica (heparina)
Los estudios farmacocinéticos de Mab Combi11 descritos anteriormente en el ejemplo 11 sugirieron que Mab Combi11 se depuró más rápido del suero comparado con Mab 4A10-3. Los datos también sugirieron que la más rápida depuración de Mab Combi11 en comparación con Mab 4A10-3 no era atribuible a depuración mediada por receptor objetivo incrementada de Mab Combi11 con relación a la de Mab 4A10-3.
Debido a que múltiples residuos de arginina se habían introducido durante la manipulación de Mab Combi11, se sospecha que el incremento resultante en carga positiva de Mab Combi11 en comparación con Mab 4A10-3, por ejemplo, dio como resultado un incremento no deseado de unión no específica a superficies de membrana cargadas negativamente y a heparina. De hecho, el modelo de la estructura de Mab Combi11 mostró un parche cargado positivamente fuerte sobre la superficie de Mab Combi11 que fue más pronunciado en Mab Combi11 que en algunos de los otros Mabs anti-FPN1 manipulados humanos, incluyendo Mab 4A10-3 y Mab L2.2-4.
Mabs Combi11, 4A10-3 y L2.2-4 se sometieron a prueba para determinar la unión a heparina no específica usando un ELISA de heparina de acuerdo con procedimientos bien conocidos por un experto en la técnica. Mabs Combi11, 4A10-3, 3D8 y L2.2-4 también se sometieron a prueba para determinar la unión a células HEK 293 que expresan FPN1 humana así como a células HEK 293 control que carecen de FPN1 humana expresada sobre su superficie.
El ELISA de heparina usando Mab Combi-11 mostró que Mab Combi11 se une fuertemente a heparina mientras que Mabs 4A10-3 y L2.2-4 no. Además, Mab Combi-11 también se une fuertemente tanto a células HEK 293 que expresan FPN1 humana como a células HEK 293 control que carecen de FPN1 humana expresada sobre su superficie. Por otra parte, Mabs 4A10-3, 3D8 y L2.2-4 se unen de forma significativa a células HEK 293 que expresan FPN1 humana peno no a células HEK 293 control.
Mab Com11GY se generó por lo tanto para reducir la unión inespecífica observada con Mab Combi11 reemplazando el residuo de aminoácido de arginina en la HCDR2 con un residuo de aminoácido de glicina. Además, otro residuo aminoacídico potencialmente problemático que se encuentra en Mab Combi11, el residuo de aminoácido triptófano en la LCDR2, se sustituye con un residuo de aminoácido tirosina en Mab Com11GY. Datos de unión preliminares, usando sobrenadantes de células que expresan Mabs Com11GY, demostraron una falta de unión no específica a células HEK 293 control, es decir, células que no expresan FPN 1 humana, mientras que tanto Mabs 1B7 como 1F8 demostraron significativamente más unión no específica a las mismas células de control.
Ejemplo 13: ensayo para la inhibición de unión de hepcidina-25 humana a FPN1
Anticuerpos anti-FPN1 humana maduros de afinidad, manipulados humanos se pueden someter a ensayo para determinar la capacidad para inhibir unión de hepcidina-25 humana a FPN1 humana expresada en células HEK 293. En resumen, células FPN/293 transfectadas se plaquean en placas revestidas de poli-D-Lisina en placas de 96 pocillos (BD Biosciences, San José, CA; placas BD Biocoat número 35 4640) a 40.000 células por pocillo en 80 μl de medio de ensayo (DMEM 11965, FBS dializado al 10 %, FAC 20 µM, penicilina-estreptomicina), se centrifugan durante 1 minuto a 1000 revoluciones por minuto y después se incuban 4 horas a 37 °C, CO2 al 10 %. La expresión de FPN1 se indujo añadiendo 20 μl de doxiciclina a 10 nM a las células plaqueadas (concentración final de doxiciclina 2 nM). Células control inducidas y no inducidas por doxiciclina se incuban durante 5 horas a 37 °C, CO2 al 10 %. A continuación, el agente inductor se elimina lavando la placa 2X con DMEM. Las células se incuban durante la noche en 100 μl de medio de ensayo. A continuación, el medio de ensayo se retira y se reemplaza con 40 μl de anticuerpo de prueba o con una solución de anticuerpo de control de isotipo por triplicado y se incuba a 37 °C, CO2 al 10 % durante 20 minutos. A continuación, se añaden 20 μl de hepcidina humana madura biotinilada a los pocillos a una concentración final de 30
nM por pocillo. Las muestras se incubaron durante 1 hora, a 37 °C, CO2 al 10 % antes de lavar 4 veces con 200 µl de FBS al 2 %, D-PBS (Gibco, n.º de catálogo 14040). A continuación, se añaden 65 μl de tampón de lisis (Tritón X-100 al 0,5 %, EDTA 10 mM) a todos los pocillos y las placas se agitan durante 10 minutos. A continuación, 50 μl de la solución en cada pocillo se transfieren a pocillos individuales de una placa de microtitulación Greiner revestida con 5 estreptavidina (60 μl de 2 μg/ml de estreptavidina (Sigma, San Luís MO, número de catálogo 54762) en PBS, incubados a 4 ºC durante toda una noche, lavados 2 veces (Tween 20 al 0,1 %, TBS), bloqueados con caseína/PBS) y a continuación se incuban durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, los pocillos de la placa se lavan 3 veces (Tween 20 al 0,1 %, TBS) y se añaden 50 μl de Mab 3.23 anti-hepcidina-25 humana a 0,5 μg/ml y las muestras se incuban una hora a temperatura ambiente. El Mab 3.23 anti-hepcidina-25 humana se describe en la publicación de 10 solicitud de patente internacional WO 2009/058797. A continuación, las placas se lavaron tres veces y 50 μl de IgG anti-humano de cabra-peroxidasa de rábano picante (Southern Biotech, n.º de catálogo 2060-05) se añaden a dilución 1:2000. Después de incubar una hora a temperatura ambiente, se lava la placa 4X y se añaden 50 μl de sustrato OPD (Sigma; n.º de catálogo P6912). La reacción se detiene con 100 μl de HCl 1 N después de 4 minutos. La absorbancia a 490 nm (A490) se lee usando un lector de placas de ELISA apropiado. El intervalo de ensayo se determina restando la
15 A490 de pocillos no inducidos de la de pocillos inducidos que reciben anticuerpo de control.
Los datos mostrados en la tabla 11 demuestran que Mab 3D8 humanizados y variantes maduras de afinidad inhiben significativamente la capacidad de hepcidina-25 humanas de unir FPN1 humana. Más específicamente, Mab 3D8, una forma humanizada del Fab de ratón 1G9 que tiene la VH1-69 estructural de cadena pesada humana y la estructura 02 de cadena ligera, demostraron una CI50 de aproximadamente 400 nM según se determina en este formato de ensayo.
20 Mabs 4A10-3, Combi11 y L2.2-4 maduros de afinidad demostraron inhibición mejorada significativamente de unión según se determina en este formato de ensayo.
Tabla 11
Inhibición en %
Concentración de anticuerpos
Anticuerpo
2000 nM 500 nM 125 nM 31,25 nM 7,8 nM
3D8
Media 54,7 64,7 21,8 4,0 -2,8
DT
9,0 2,5 14,9 11,5 2,7
4ª10-3
Media 95,3 84,9 59,3 13,4 5,4
DT
2,1 1,7 6,4 4,2 14,4
combi 11
Media 79,9 81,6 88,4 32,1 18,7
DT
8,0 8,8 4,8 3,1 8,4
L2.2-4
Media 85,1 99,8 76,5 27,5 -0,1
DT
20,8 6,5 9,3 3,9 2,9
IgG control
Media -2,5 -0,7 1,9 7,9 2,5
DT
5,8 10,3 6,2 6,5 14,1
Nota: 75 kg/mol fue el peso molecular usado para calcular la concentración de anticuerpos.
Ejemplo 14: ensayo in vitro de los efectos de Mabs de FPN1 sobre niveles de ferritina celulares
Como se describe en el ejemplo 5, células Caco-2, una línea celular enterocítica humana, que expresa de forma endógena FPN1 se puede monitorizar para cambios en ferritina. En experimentos llevados a cabo esencialmente como se describe en el ejemplo 5, el efecto de anticuerpos anti-FPN1 humana en regulación de hierro modulada por
5 hepcidina madura en células Caco-2 se determina y se expresa como porcentaje de inhibición, se realiza el promedio de un número de experimentos independientes en la tabla 12 más adelante.
Los datos indican que los efectos de hepcidina sobre concentración de ferritina en las células se pueden inhibir por Mabs anti-FPN1 humana en una manera dependiente de la dosis. Como se indica por los valores de CE50, algunos Mabs anti-humanos son más potentes en la inhibición del efecto de hepcidina que otros, por ejemplo, Combi11≈
10 4A10-3 > L2-2-4 > 3D8.

Tabla 12: Porcentaje de inhibición (± SEM) por Mabs anti FPN1 humana en incrementos inducidos por hepcidina madura en niveles de ferritina celular en células Caco-2 in vitro
Concentración (M)
Combi11 4A10-3 L2-2-4 3D8 IgG4 humana de control
6,67E-7 M
75,2 (7,4) 61,9 (6,3) 61,7 (3,9) 28,8 (6,1) 18,7 (3,8)
2,22E-7 M
69,3 (6,2) 59,6 (5,4) 53,8 (11,7) 25,2 (4,4) 24,2 (5,2)
7,4E-8 M
61,1 (5,6) 45,6 (5,1) 40,6 (10,3) 12,0 (5,6) 22,1 (4,4)
2,47E-8 M
45,3 (6,5) 36,2 (8,1) 30,1 (4,4) 3,4 (4,7) 16,01 (3,7)
8,0E-9 M
31,6 (9,1) 26,0 (7,5) 39,5 (7,5) 14,9 (3,6) 22,4 (3,6)
2,7E-9 M
34,8 (5,7) 24,9 (7,6) 24,4 (8,2) 10,6 (10,6) 17,5 (3,9)
9,0E-10 M
23,3 (6,3) 19,5 (4,8) 24,1 (9,8) 8,6 (6,4) 15,5 (3,2)
3,0E-10 M
14,2 (5,6) 12,0 (10,6) 24,1 (9,8) 7,3 (6,6) 15,5 (3,2)
Número de experimentos(n)
6 6 3 4 16
CE50 (nm)
28 37 183 360 N.C.
N.C.: la CE50 del control negativo no puede calcularse.
Listado de secuencias
<110> Eli Lilly y Company 15 <120> Anticuerpos monoclonales anti-ferroportina 1 y usos de los mismos
<130> X8276
<150> US 61/120076
<151> 5-12-2.008
<150> US 61/239818 20 <151> 4-9-2.009
<160> 214
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 571 25 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 1716
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 573
<212> PRT
<213> Macaca irus
<400> 3
<210> 4
<211> 1320
<212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 4
<210> 5
<211> 570
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 5
<210> 6
<211> 1713
<212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 6
<210> 7
<211> 570
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 7
<210> 8
<211> 1713
<212> ADN
<213> Mus sp.
<400> 8
<210> 9
<211> 56
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10 10 <211> 642
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 15 <223> Sintético
<400> 10
<210> 11
<211> 39
<212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 11
<210> 12
<211> 20
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
<210> 14 10 <211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210> 16
<211> 11 25 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 10
<212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 17
<210> 18
<211> 17
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
20 <400> 18
<210> 19
<211> 5
<212> PRT 25 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
30 <400> 19
<210> 20
<211> 11
<212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 20
<210> 21
<211> 7
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
20 <400> 21
<210> 22
<211> 9
<212> PRT 25 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
30 <400> 22
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 23
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
15
<220>
<223> Sintético
<400> 24
20
<210> 25
<211> 17
<212> PRT 25 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
30 <400> 25
Gly
<210> 26
<211> 17
<212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 26
<210> 27
<211> 7
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
20 <400> 27
<210> 28
<211> 7
<212> PRT 25 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
30 <400> 28
<210> 29
<211> 8
<212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 29
<210> 30
<211> 10
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<220> 20 <221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (6)..(6)
<223> Xaa es Asn o Ser
<400> 30
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
5 <220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (5)..(5)
<223> Xaa es Glu, Lys, o Arg
10 <220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (13)..(13)
<223> Xaa es Glu o Ala
15 <400> 32
<212> PRT
<223> Sintético
<400> 31
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial 25
<220>
<223> Sintético
<220> 30 <221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (4)..(4)
<223> Xaa es Th, Lys o Arg
<400> 32
<210> 33
<211> 9
5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (1)..(1)
<223> Xaa es Phe, His o Gln
15
<400> 33
<210> 34
<211> 17 20 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 25
<400> 34
<210> 35
<211>
17 30 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 35
<210> 36
<211>
17 10 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 15
<400> 36
<210> 37
<211> 11 20 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 25
<400> 37
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 38
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 39
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 40
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 41
10 <210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
15 <220>
<223> Sintético
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA 20 <222> (2)..(2)
<223> Xaa es Leu, Thr, Ser o Ala
<400> 42
25 <210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
30 <220> <223> Sintético
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 5 <222> (2)..(2)
<223> Xaa es Ser o Ile
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 10 <222> (5)..(5)
<223> Xaa es Glu, Lys, o Arg
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 15 <222> (12)..(12)
<223> Xaa es Asn o Lys
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 20 <222> (13)..(13)
<223> Xaa es Glu o Ala
<400> 43
25 <210> 44
<211> 114
<212> PRT
<213> Mus sp.
30 <400> 44
<210> 45
<211> 114
<212>
PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<210> 46
<211> 114
<212>
PRT 5 <213> Artificial
10 <400> 45 <220>
<223> Sintético
10 <400> 46
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 47
<210> 48
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 48
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 49 <210> 50
<211> 438
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 50
Ser His Ser Pro Gly Lys 435
<210> 51
<211> 438
>212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 51
Ser His Ser Pro Gly Lys 435
<210> 52
<211> 440 >212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 52
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440
<210> 53
<211> 214
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 53 <210> 54
<211> 214
˂212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 54 <210> 55
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 55
<210> 56
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (28)..(28)
<223> Xaa es Alt o Arg
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (57)..(57)
<223> Xaa es Gly, o Arg
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (58)..(58)
<223> Xaa es Thr o Lys
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (62)..(62)
<223> Xaa es Glu, Ser o Thr
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (102)..(102)
<223> Xaa es Asp o Val
<400> 56
<210> 56 10 <211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
15 <223> Sintético
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (54)..(54)
<223> Xaa es Leu o Arg
<220>
5 <221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (55)..(55)
<223> Xaa es His, Arg o Tyr
<220>
10 <221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (58)..(58)
<223> Xaa es Ser o Lys
<400> 57
<210> 58
<211> 342
<212> ADN
<213> Mus sp.
<400> 58
<210> 59
<211> 321
<212> ADN
<213> Mus sp.
<400> 59
10 <210> 60
<211> 342
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 15 <223> Sintético
<400> 60
<210> 61
<211> 321
<212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 61
<210> 62
<211> 342
<212> ADN 15 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
20 <400> 62
<210> 63
<211> 214
<212>ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 63
<210> 64
<211> 342
<212> ADN 15 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
20 <400> 64
<210> 65
<211> 321
<212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 65
<210> 66
<211> 329
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
20 <400> 66
<210> 67
<211> 329
<212>
PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 67
<210> 68
<211> 325
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
<210> 69
<211> 326
<212>
PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<210> 70
<211> 326
<212>
PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<210> 71
<211> 978
<212>
ADN 5 <213> Artificial
10 <400> 69
10 <400> 70
<220>
<223> Sintético
10 <400> 71
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
<210> 73
<211> 321
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
<210>
74 10 <211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
<210>
76 10 <211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
<210> 77
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
<210> 78 <211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
<210> 79
<211> 14
<212> PRT 10 <213> Homo sapiens
<400> 79
<210>
80 15 <211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 81
<210> 82
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
<210>
83 10 <211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
<210> 84
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
<210> 85 <211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
<210> 86
<211> 32
<212> PRT 10 <213> Homo sapiens
<400> 86
<210> 87 15 <211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
<210> 88
<211> 193
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
<210> 89
<211> 84
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
<210> 90
<211> 61
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
<210> 91
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
<210> 92
<211> 25
<212> PRT
<213> Mono
<400> 92
10 <210> 93
<211> 25
<212> PRT
<213> Rattus sp.
15 <400> 93
<210> 94
<211> 25
<212>
PRT 20 <213> Mus sp.
<400> 94
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 95
<210> 96
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 96
<210> 97
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 97
<210> 98
<211> 21
<212>
PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 98
<210> 99
<211> 19
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
20 <400> 99
<210> 100
<211> 19
<212> PRT 25 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 100
<210> 101 5 <211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 10 <223> Sintético
<400> 101
<210> 102 15 <211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 20 <223> Sintético
<400> 102
<210> 103 25 <211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 103
<210> 104
<211> 10
<212> PRT 10 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
15 <400> 104
<210> 105
<211> 10
<212> PRT 20 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
25 <400> 105
<210> 106
<211> 10
<212>
PRT 30 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 106
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 108
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 109
<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 110
<210> 111
<211> 17
<212>
PRT 5 <213> Artificial
10
<210> 107 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial
<220> <223> Sintético
15
<220> <221> MISC_CARACTERÍSTICA <222> (2)..(2) <223> Xaa es Tyr, Arg, o Lys
20
<220> <221> MISC_CARACTERÍSTICA <222> (3)..(3) <223> Xaa es Ala o Arg
25 30
<220> <221> MISC_CARACTERÍSTICA <222> (5)..(5) <223> Xaa es Thr o Arg <400> 107
<220>
<223> Sintético
10 <400> 111
<210> 112
<211> 17
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
20 <400> 112
<210> 113
<211> 17 25 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 113
<210> 114
<211> 17
<212> PRT 10 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
15 <400> 114
<210> 115
<211> 17
<212> PRT 20 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
25 <400> 115
<210> 116 <211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 116
10 <210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
15 <220>
<223> Sintético
<400> 117
20 <210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
25 <220>
<223> Sintético
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 30 <222> (7)..(7)
<223> Xaa es Gly o Arg
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 5 <222> (8)..(8)
<223> Xaa es Gly o Arg
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 10 <222> (9)..(9)
<223> Xaa es Thr, o Arg
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 15 <222> (13)..(13)
<223> Xaa es Glu, Thr, Ser
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 20 <222> (14)..(14)
<223> Xaa es Lys o Val
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 25 <222> (17)..(17)
<223> Xaa es Gly o Arg
<400> 118
30 <210> 119
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 119
<210> 120
<211> 5
<212> PRT 10 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
15 <220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (4)..(4)
<223> Xaa es Asp o Val
20 <400> 120
<210> 121
<211> 7
<212> PRT 25 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
30 <400> 121
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 122 <210> 125
10
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
15
<220>
<223> Sintético
<400> 123
20
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
25
<220>
<223> Sintético
<400> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 125 <210> 128
10
<210> 126
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
15
<220>
<223> Sintético
<400> 126
20
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
25
<220>
<223> Sintético
<400> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 128
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial 15
<220>
<223> Sintético
<220>
20 <221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (5)..(5)
<223> Xaa es Leu o Arg
<220>
25 <221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (6)..(6)
<223> Xaa es His, Arg, Val, o Tyr
<220>
30 <221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (7)..(7)
<223> Xaa es Ser, Trp, o Tyr
<400> 129
<210> 130
<211> 114
<212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 130
<210> 131
<211> 342
<212>
ADN 15 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 131
<210> 132
<211> 107
<212>
ADN 10 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
15 <400> 132
<210> 133
<211> 321
<212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 133
<210> 134
<211> 114 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 134
<210> 135 10 <211> 342
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 15 <223> Sintético
<400> 135
<210> 136
<211> 107
<212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 136
<210> 137
<211> 321
<212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 137
<210> 138
<211> 114 10 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 15
<400> 138
<210> 139
<211> 342
<212>
ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<210> 140
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 140
<210> 141
<211> 321
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 141
<210> 142
<211> 114
<212>
PRT 5 <213> Artificial
10 <400> 139
<220>
<223> Sintético
10 <400> 142
<210> 143 <211> 107
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 143
10 <210> 144
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
15 <220>
<223> Sintético
<400> 144 <210> 145
<211> 321
<212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 145
<210> 146
<211> 114
<212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 146
<210> 147
<211> 342 10 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 15
<400> 147
<210> 148
<211> 107
<212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 148
<210> 149
<211> 321
<212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 149
<210> 150
<211> 440 10 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 15
<400> 150
<210> 151
<211> 214
<212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 151 <210> 152
<211> 440
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 152
<210> 153
<211> 1320
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 153
<210> 154
<211> 214 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 154
<210> 155
<211> 642
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 155
<210> 156
<211> 440 10 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 15
<400> 156
<210> 157
<211> 1320
<212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 157
<210> 158
<211> 24 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 158
<210> 159
<211> 642
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 159
<210> 160
<211> 440 10 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 15
<400> 160
<210> 161
<211> 1320
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 161
<210> 162
<211> 214 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 162
<210> 163
<211> 642
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 163
<210> 164
<211> 440 10 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 15
<400> 164
<210> 165
<211> 1320
<212>
ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<210> 166
<211> 214
<212>
PRT 5 <213> Artificial
10 <400> 165 <220>
<223> Sintético
10 <400> 166 <210> 167
<211> 642
<212> ADN 164
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 167
<210> 168
<211> 14 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 168
15 <210> 169
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
20 <400> 169
<210> 170
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial 5
<220>
<223> Sintético
<220> 10 <221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (10)..(10)
<223> Xaa es Leu o Thr
<400> 170
<210> 171
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial 20
<220>
<223> Sintético
<220>
25 <221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (5)..(5)
<223> Xaa es Leu o Arg
<220>
30 <221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (7)..(7)
<223> Xaa es Ser, Tyr o Trp
<400> 171
<210> 172
<211> 11
<212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (1)..(1)
<223> Xaa es Gh o Phe
15 <400> 172
<210> 173
<211> 17
<212> PRT 20 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
25 <220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (2)..(2)
<223> Xaa es Ser o Ile
30 <220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (8)..(8)
<223> Xaa es Arg o Gly
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 5 <222> (12)..(12
<223> Xaa es Lys o Asn
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 10 <222> (13)..(13)
<223> Xaa es Ser o Glu
<400> 173
15 <210> 174
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> Sintético
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 25 <222> (5)..(5)
<223> Xaa es Leu o Arg
<220>
<221>
MISC_CARACTERÍSTICA 30 <222> (6)..(6)
<223> Xaa es His, Arg, o Tyr
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (7)..(7)
<223> Xaa es Ser, Trp o Tyr
<400> 174
<210> 175
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es Ala o Arg
<400> 175
<210> 176
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (8)..(8)
<223> Xaa es Gly o Arg
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (9)..(9)
<223> Xaa es Thr o Arg
5 <220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (13)..(13)
<223> Xaa es Glu, Thr o Ser
10 <400> 176
<210> 177
<211> 7 15 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 20
<400> 177
<210> 178
<211> 114 25 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 30
<400> 178
<210> 179
<211> 440
<212>
PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<210> 180
<211> 107
<212>
PRT 5 <213> Artificial
10 <400> 179
<220>
<223> Sintético
10 <400> 180
<210> 181
<211> 214
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 181
<210> 182
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es Ala o Arg
<400> 182
10 <210> 183
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
15 <400> 183
<210> 184
<211> 10
<212> PRT 20 <213> Homo sapiens
<400> 184
<210> 185 25 <211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 185
<210> 186
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 186
<210> 187
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 187
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 188
<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 189
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 190
<210> 191
<211> 8 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 191
15 <210> 192
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
20 <400> 192
<210> 193
<211> 7
<212> PRT 25 <213> Homo sapiens
<400> 193
<210> 194
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 194
<210> 195 10 <211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 195
<210> 196
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 196
<210> 197
<211> 10 25 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 197
<210> 198
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 198
1 5 10
<210> 199
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 199
<210> 200
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 200
<210> 201
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 201
<210> 202
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 202
<210> 203 10 <211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 203
<210> 204
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 204
<210> 205
<211> 10 25 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 205
<210> 206
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 206
<210> 207 10 <211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 207
<210> 208
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 208
<210> 209
<211> 10 25 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 209
<210> 210
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 210
<210> 211 10 <211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 211
15
<210> 212
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
20
<400> 212
<210> 213
<211> 10 25 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 213
<210> 214
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 214

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo monoclonal que comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en:
    a) SEC ID N.ºs: 37, 125, 22, 23, 110 y 19, respectivamente, o en
    b) SEC ID N.ºs: 37, 122, 22, 23, 110 y 19, respectivamente y se une a ferroportina 1 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 1.
  2. 2.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada como se muestran en la SEC ID N.º: 136 y en la SEC ID N.º: 134, respectivamente.
  3. 3.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada como se muestran en la SEC ID N.º: 140 y en la SEC ID N.º: 138, respectivamente.
  4. 4.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende
    una cadena ligera y una cadena pesada como se muestran en la SEC ID N.º: 154 y en la SEC ID N.º: 152, respectivamente.
  5. 5.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende una cadena ligera y una cadena pesada como se muestran en la SEC ID N.º: 158 y en la SEC ID N.º: 156, respectivamente.
  6. 6.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada, en el que cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 154 y cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 152.
  7. 7.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada y en el que cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 158 y cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 156.
  8. 8.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que inhibe la internalización inducida por hepcidina-25 y/o la degradación de ferroportina 1 humana.
  9. 9.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en terapia.
  10. 10.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento o prevención de anemia, anemia de cáncer, anemia de cáncer asociada con niveles elevados de hepcidina, o anemia de enfermedad crónica asociada con niveles elevados de hepcidina en un sujeto.
  11. 11.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el incremento de los niveles de hierro sérico, el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos, la hemoglobina, y/o el hematocrito en un sujeto.
  12. 12.
    Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  13. 13.
    Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende además un agente estimulante de la eritropoyesis u otro agente terapéutico, empleado convencionalmente para incrementar los niveles de hierro sérico, el recuento de reticulocitos, el recuento de eritrocitos, la hemoglobina, y/o el hematocrito en un sujeto.
    FIGURA 1 A. Secuencia de aminoácidos de estructura O2 de cadena ligera humana con residuos de CDR intercalados
    B. Secuencia de aminoácidos de una estructura VH1-69 de cadena pesada humana con residuos de CDR intercalados
    FIGURA 2 A. Secuencia de aminoácidos de estructura O18 de cadena ligera humana con residuos de CDR intercalados
    B. Secuencia de aminoácidos de una estructura VH1-18 de cadena pesada humana con residuos de CDR intercalados
    FIGURA 3 A. Secuencia de aminoácidos de estructura de cadena ligera humana L12 con residuos de CDR intercalados
    B. Secuencia de aminoácidos de una estructura VH1-46 de cadena pesada humana con residuos de CDR intercalados
    FIGURA 4 Secuencia de aminoácidos de estructura de cadena ligera humana L1 con residuos de CDR intercalados
    FIGURA 5
    Tiempo después de la administración i.v. (h) FIGURA 6
    Tiempo después de la administración i.v. (h) FIGURA 7
    1 1F8
    2
    Combi11
    3
    Com11Gy
    4
    1B7
    5
    5
    3D8
    6
    4A10-3
    7
    L2. 2-4
    8
    Consenso*
    FIGURA 8
    1
    1F8
    2
    Combi11
    3
    Com11Gy
    4
    1B7
    5
    5
    3D8
    6
    4A10-3
    7
    L2. 2-4
    8
    Consenso*
    10 *X6es L o R; X7es H, R o Y; y X8es S, W, o Y.
    FIGURA 9
    Tiempo después de la administración i.v. (h) FIGURA 10
    Tiempo después de la administración i.v. (h) FIGURA 11
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