ES2392123T3 - Anticuerpos anti-hepcidina y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado que une hepcidina-25 humana con una KD de 800 pM o menos determinada por resonancia de plasmón superficial (SPR) a 25 °C y comprende seis CDR seleccionados del grupo constituido por: (i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 52, 60, 62, 65, 71 y 75, respectivamente; (ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 42, 76, 62, 79, 87 y 46, respectivamente; (iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 41, 53, 31, 63, 84 y 46, respectivamente; (iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como 10 se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 30, 31, 32, 44 y 46, respectivamente; (v) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 53, 61, 63, 85 y 46, respectivamente; y (vi) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 57, 61, 63, 84 y 46, respectivamente.

Description

Anticuerpos anti-hepcidina y usos de los mismos

La presente invención está en el campo de la medicina, en particular en el campo de anticuerpos contra hepcidina madura humana. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales selectivos de hepcidina25 que son capaces de neutralizar bioactividad de hepcidina madura humana y por lo tanto, son útiles para incrementar los niveles de hierro sérico, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, y/o hematocrito en un ser humano para propósitos de tratar o evitar una enfermedad, afección, o trastorno promovido por hepcidina madura humana tal como anemia.

Actualmente, las terapias adecuadas y efectivas para anemia, o para la anemia de enfermedades crónicas, son limitadas. Específicamente, la administración de eritropoyetina es efectiva en solamente aproximadamente el 50 % de todos los pacientes y está asociada con efectos secundarios no deseados. Además, las transfusiones son indeseables debido a los riesgos de contaminación, infección y sobrecarga de hierro.

La hepcidina humana, un polipéptido expresado predominantemente por los hepatocitos, se cree que es una proteína de regulación de hierro importante que regula negativamente la absorción intestinal de hierro, el reciclaje de hierro por macrófagos y la movilización de hierro a partir de reservas de hierro hepáticas. La sobreproducción de hepcidina parece jugar un papel principal en la patofisiología de anemia y/o de anemia de enfermedad crónica.

La hepcidina humana está codificada como un prepropéptido de 84 aminoácidos que contiene una secuencia señal que dirige al retículo endoplásmico de 24 aminoácidos N-terminal típica y una prorregión de 35 aminoácidos con un sitio de escisión de furina consenso seguido inmediatamente por la hormona reguladora de hierro bioactiva de 25 aminoácidos C-terminal, hepcidina-25 humana (SEC ID N.º: 1). Diversas formas truncadas N-terminales de hepcidina-25 humana, tales como hepcidina-20 humana (es decir, 6-25 aminoácidos de SEC ID N.º: 1) y hepcidina22 humana (aminoácidos 4-25 de SEC ID N.º: 1) se sabe también que se forman in vivo.

Aunque se han comunicado anteriormente anticuerpos para hepcidina humana (véase, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2004/0096990 y 2007/0224186 y la Publicación de Solicitud de Patente Internacional PCT WO 2008/097461), aún queda una gran necesidad en la técnica de anticuerpos adicionales para tratar enfermedades y trastornos asociados con anemia que incluyen anemia de enfermedad crónica tal como anemia de cáncer y anemia de inflamación. Dado que la hepcidina-25 es la más, si no la única, forma de hepcidina fisiológicamente relevante en seres humanos, anticuerpos que selectivamente tienen como objetivo hepcidina humana-25 comparada con polipéptidos de hepcidina que no son fisiológicamente relevantes, se necesitan particularmente. Por lo tanto, la presente invención proporciona anticuerpos terapéuticos manipulados, de alta afinidad, selectivos contra hepcidina-25 humana que tienen numerosas ventajas en el tratamiento o diagnóstico de trastornos asociados con niveles elevados de hepcidina madura tal como anemia. Por ejemplo, estos anticuerpos, que son de alta afinidad, neutralizantes, manipulados por seres humanos y altamente selectivos para formas fisiológicamente relevantes de hepcidina en seres humanos, reducirán el riesgo de efectos secundarios y la dosis clínica y la frecuencia de dosificación requerida para tratamiento efectivo. La presente invención también incluye ácidos nucleicos preferidos que codifican anticuerpos de hepcidina-25 preferidos en los que los ácidos nucleicos se han diseñado para eliminar los sitios de ayuste críptico que dan como resultado la agregación indeseada de ciertos anticuerpos de la invención tras la expresión por células huésped de mamíferos. Así, los beneficios adicionales derivados de esta la presente invención incluyen rendimiento incrementado del producto de anticuerpo de un grado de pureza deseable, recortando por lo tanto costes de producción, así como un mayor grado de efectividad clínica y seguridad para el producto de anticuerpo administrado.

Además, inmunoensayos comercialmente disponibles para hepcidina humana no diferencian las formas activas, fisiológicamente relevantes de hepcidina humana de especies de hepcidina inactivas, fisiológicamente no relevantes (véase, por ejemplo, Kemma, E.H., y cols., Haematologica, 93 (1): 90-7 (2008)). Actualmente, la mayoría de los procedimientos para ensayar selectivamente para hepcidina-25 implican EM/CL (cromatografía líquida/espectroscopía de masas) o procedimientos engorrosos similares que requieren la separación de diversas formas de hepcidina (véase, por ejemplo, (Gutiérrez, J.A., y cols., BioTechniques, 38: S13-S17 (2005), Murphy, y cols., Blood, 110: 1048-54 (2007) y Kemna, E.H., y cols., Clin. Chem. 53: 620-8 (2007)). Aunque estos ensayos pueden ser exactos y precisos, su complejidad, gasto y nivel alto de conocimientos especializados del operador requerido inhiben su implementación de rutina. De acuerdo con ello, hay también una gran necesidad de anticuerpos adicionales que se unan a hepcidina madura humana con alta afinidad para su aplicación en inmunoensayo relativamente simple, rápido y contundente para la detección específica o medida de las formas maduras de hepcidina humana para aplicaciones de diagnóstico y/o de pronóstico.

La presente invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a hepcidina-25 humana con una KD de 800 pM

o menos como se determina por resonancia de plasmón superficial (SPR) a 25 °C y comprende seis CDR seleccionados del grupo constituido por:

(i)

LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se

muestran en SEC ID N.ºs: 52, 60, 62, 65, 71 y 75, respectivamente;

(ii)

LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 42, 76, 62, 79, 87 y 46, respectivamente;

(iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 41, 53, 31, 63, 84 y 46, respectivamente;

(iv)

LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 30, 31, 32, 44 y 46, respectivamente;

(v)

LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 53, 61, 63, 85 y 46, respectivamente; y

(vi)

LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 57, 61, 63, 84 y 46, respectivamente.

En otros aspectos, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención; vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención, opcionalmente, unidos operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector; células huésped que comprenden vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de la invención; un procedimiento para producir un anticuerpo de la invención que comprende cultivar células huésped que comprenden vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de la invención de tal modo que el ácido nucleico se expresa y opcionalmente, recuperar el anticuerpo del medio de cultivo de células huésped.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, la composición farmacéutica comprende una población homogénea o sustancialmente homogénea de un anticuerpo de la invención y un vehículo

o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD de aproximadamente 800 pM o menos para usar en terapia. La invención también proporciona un anticuerpo que se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD de aproximadamente 800 pM o menos para usar en tratar o evitar anemia en un sujeto.

La presente invención incluye el uso de un anticuerpo que se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD de aproximadamente 800 pM o menos para la preparación de un medicamento para el tratamiento de anemia, incluyendo anemia de enfermedad crónica y anemia de cáncer. La invención incluye adicionalmente el uso de un anticuerpo que se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD de aproximadamente 800 pM o menos para la preparación de un medicamento para incrementar niveles de hierro séricos, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, y/o hematocrito en un animal, preferentemente una especie de mamífero, más preferentemente un sujeto humano.

La presente invención incluye un procedimiento de incrementar niveles de hierro sérico, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, y/o hematocrito que comprende administrar a un sujeto humano en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de un anticuerpo que se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD de aproximadamente 800 pM o menos.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar en un paciente un trastorno promovido por hepcidina madura que se beneficia de un incremento en los niveles de hierro séricos, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, y/o hematocrito, incluyendo, pero no limitados a, anemia, por ejemplo, anemia resultante de infección, inflamación, enfermedad crónica, y/o cáncer comprendiendo dicho procedimiento administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo selectivo de hepcidina-25 de la invención a un paciente en necesidad de la misma.

La presente invención proporciona adicionalmente un inmunoensayo selectivo para hepcidina madura humana. El procedimiento incluye: primero, obtener una muestra para someterla a ensayo para hepcidina madura humana y poner en contacto la muestra con un anticuerpo de la invención en condiciones adecuadas para la unión y dejar que cualquier hepcidina madura humana presente forme un complejo antígeno-anticuerpo; después detectar la presencia

o ausencia del complejo; y/o determinar la cantidad del complejo en la muestra por un procedimiento de inmunoensayo.

La presente invención proporciona adicionalmente procedimientos de diagnosticar una afección promovida por hepcidina madura humana en un paciente determinando el nivel de hepcidina madura humana en una muestra de un fluido biológico del paciente y comparando el nivel de hepcidina madura humana en la muestra con el nivel de hepcidina humana en una muestra de fluido biológico de uno o más individuos de control o con un patrón de referencia.

Se proporciona también un procedimiento de someter a seguimiento un trastorno promovido por hepcidina madura en un paciente. El procedimiento incluye determinar el nivel de hepcidina madura en una muestra de un fluido biológico de un paciente que sufre de, o en riesgo de, un trastorno promovido por hepcidina madura en un primer punto temporal; determinar del nivel de hepcidina madura en una o más muestras del fluido biológico del paciente en uno o más puntos temporales diferentes; comparar los niveles de hepcidina madura determinada en puntos temporales diferentes y someter a seguimiento por lo tanto el trastorno promovido por hepcidina madura. La invención proporciona adicionalmente un kit para llevar a cabo un inmunoensayo, incluyendo un anticuerpo de la invención y un recipiente adecuado.

Descripción de las figuras

La figura 1 representa un espectro de masas MALDI-TOF de múltiples formas de hepcidina humana aisladas a partir de sueros humanos. La señal 1 tiene una masa que es coherente con la masa esperada de hepcidina-25 humana intacta. Las señales 2, 3 y 4 tienen masas que son coherentes con las formas truncadas N-terminalmente de hepcidina madura humana (hepcidina-24, hepcidina-22 y hepcidina-20). El espectro de masas se generó en un espectrómetro de masas MALDI-TOF utilizando un procedimiento de modo lineal, de ión positivo con ácido α-ciano4-hidroxicinámico (matriz peptídica) como matriz de muestra como se describe en el ejemplo 5 más adelante.

La figura 2 representa un espectro de masas MALDI-TOF de la misma muestra que en la figura 1 usando ácido 3,5dimetil-4-hidroxicinámico (matriz de ácido sinapínico) como matriz de muestra. La señal 1 representa hepcidina-25 humana intacta. No se observó ninguna señal para pro-hepcidina. El espectro de masas se generó en un espectrómetro de masas utilizando un procedimiento de modo lineal, de ión positivo como se describe en el ejemplo 5 más adelante.

La figura 3A muestra las secuencias de aminoácidos de marco conservado de cadena ligera totalmente humana 02 con CDR intercaladas. Las cuatro regiones marco conservadas están marcadas como FRL1, 2, 3 y 4 (SEC ID N.ºs: 39, 40, 96 y 97, respectivamente).

La figura 3B muestra la secuencia de aminoácidos del marco conservado de cadena pesada humana VH1-69 con CDR intercaladas. Las cuatro regiones marco conservadas están marcadas FRH1-4 (SEC ID N.ºs: 35-38, respectivamente).

La figura 4A muestra las secuencias de aminoácidos del marco conservado de la cadena ligera humana 018 con CDR intercaladas. Las cuatro regiones marco conservadas están marcadas como FRL1, 2, 3 y 4 (SEC ID N.ºs: 154, 40, 156 y 97, respectivamente).

La figura 4B muestra la secuencia de aminoácidos del marco conservado de cadena pesada humana VH1-18 con CDR intercaladas. Las cuatro regiones marco conservadas están marcadas como FRH, 2, 3 y 4 (SEC ID N.ºs: 157, 36, 158 y 38, respectivamente).

La figura 5A muestra las secuencias de aminoácidos del marco conservado de la cadena ligera humana L12 con CDR intercaladas. Las cuatro regiones marco conservadas están marcadas como FRL1, 2, 3 y 4 (SEC ID N.ºs: 159, 40, 160 y 97, respectivamente).

La figura 5B muestra la secuencia de aminoácidos del marco conservado de cadena pesada humana VH1-46 con CDR intercaladas. Las cuatro regiones marco conservadas están marcadas como FRH1, 2, 3 y 4 (SEC ID N.ºs: 157, 36, 161 y 38, respectivamente).

Se usan las siguientes abreviaturas en el presente documento: ACN: acetonitrilo, BSA: seroalbúmina bovina; DTT: ditiotreitol, EDTA: ácido etilendiaminotetracético, ELISA: enzimoensayo inmunosorbente, IMAC: cromatografía de afinidad de metal inmovilizado, IPTG: isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido de isopropilo, Mab: anticuerpo monoclonal, Mabs: anticuerpos monoclonales, MALDI-TOF: ionización de desorción láser asociada a matriz-tiempo de vuelo, PBS: solución salina tamponada con fosfato; SNP: resonancia de plasmón superficial, TFA: ácido trifluoroacético. Todas las abreviaturas de aminoácidos usadas en esta divulgación son aquellas aceptadas por la Oficina de Patentes y Marcas Registradas de los Estados Unidos como se expone en 37 C.F.R. § 1.822 (B)(2).

Cuando se usa en el presente documento, el término "hepcidina" se refiere a cualquier forma de la proteína hepcidina conocida por estar presente en mamíferos. Cuando se usa en el presente documento, el término "hepcidina madura" se refiere a cualquier forma madura, bioactiva de la proteína hepcidina expresada en mamíferos. Cuando se usa en el presente documento, la frase "hepcidina humana" hace referencia a cualquier forma de la proteína hepcidina presente en seres humanos. Cuando se usa en el presente documento, la frase "hepcidina-25 humana" se refiere a la forma madura de hepcidina humana que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 1.

El término "anticuerpo" en referencia a un anticuerpo anti-hepcidina de la invención (o simplemente, "anticuerpo de la invención"), como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo monoclonal manipulado humano o a un anticuerpo monoclonal totalmente humano, a menos que se indique lo contrario. Preferentemente, los anticuerpos de la invención son anticuerpos manipulados humanos. Los anticuerpos de la invención se pueden producir usando por ejemplo, técnicas recombinantes, tecnologías de presentación de fagos, tecnologías de síntesis, por ejemplo, realización de injertos de CDR, o combinaciones de tales tecnologías u otras tecnologías fácilmente

conocidas en la técnica. “Anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que se deriva de un único ejemplar o

clon, incluyendo por ejemplo, cualquier clon eucariota, procariota, o fágico y no al procedimiento por el que se produce. Un anticuerpo como se usa en el presente documento puede ser un anticuerpo intacto (que comprende una región Fc completa o de longitud total), o una parte o fragmento de un anticuerpo que comprende una parte de unión a antígeno, por ejemplo, un fragmento Fab, fragmento Fab', o fragmento F(ab')2 de un anticuerpo humano manipulado o de un anticuerpo completamente humano. Los fragmentos de unión a antígeno preferidos de un anticuerpo de la invención retienen la capacidad para inhibir o neutralizar una o más bioactividades características de una forma madura de una hepcidina de mamífero in vivo o in vitro. Por ejemplo, en una realización, una parte de unión a antígenos de un anticuerpo de la invención puede inhibir la interacción de hepcidina-25 humana con uno o más receptores, por ejemplo, ferroportina humana (SEC ID N.º: 25), y/o puede inhibir internalización inducida por hepcidina de ferroportina.

Además, un "anticuerpo de la invención" o simplemente “anticuerpo” como se usa en el presente documento puede ser un fragmento de Fv de cadena sencilla que se puede producir incorporando el ADN que codifica la LCVR y la HCVR con una secuencia de engarce. (Véase, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315, 1994). Se entiende que con

independencia de si los fragmentos o partes de unión a antígeno se especifican, el término “anticuerpo” como se usa

en el presente documento incluye tales fragmentos o partes así como las formas de cadena sencilla, a menos que se indique lo contrario.

Los términos "selectivo" o "selectivamente" se usan en el presente documento en referencia a un anticuerpo antihepcidina-25 o a la unión del mismo, respectivamente, hacen referencia a un anticuerpo que se une selectivamente a hepcidina-25 con una KD de 1000, 500, 200, 100, 50, 10, o 5 veces inferior a aquella con que el anticuerpo une al menos una forma precursora de la hepcidina-25 y/o al menos una especie truncada N-terminalmente de hepcidina madura conocida por formarse en la misma especie de mamíferos, según se mide por SPR a 25 ºC. Adicionalmente, o alternativamente, un anticuerpo selectivo de hepcidina-25 de la invención se une a hepcidina-25 pero no se une, o se une mínimamente, a al menos una forma precursora de hepcidina-25 y/o al menos una especie truncada Nterminalmente de hepcidina madura que se sabe que se forma en la misma especie de mamíferos según se determina por procedimientos de inmunoensayo y/o de espectrometría de masas MALDI-TOF usados por aquellos expertos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, el ensayo descrito en el ejemplo 5 en el presente documento. Preferentemente, un anticuerpo selectivo anti-hepcidina-25 de la presente invención se une a hepcidina-25 humana con una KD de 1000, 500, 200, 100, 50, 10, o 5 veces inferior a aquella con que el anticuerpo une pro-hepcidina humana, preferentemente, pro-hepcidina humana que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 34, y/o al menos una forma truncada N-terminalmente de hepcidina madura humana, como se mide por SPR a 25 °C. Adicionalmente, o alternativamente, un anticuerpo selectivo anti-hepcidina-25 de la invención se une a hepcidina-25 humana pero no se une, o se une mínimamente, a pro-hepcidina humana, preferentemente, la prohepcidina humana que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 34, y/o al menos una especie truncada N-terminalmente de hepcidina madura que se sabe que se forma en la misma especie de mamíferos según se determina por procedimientos de inmunoensayo y/o de espectrometría de masas MALDI-TOF usados por aquellos expertos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, el ensayo descrito en el ejemplo 5 en el presente documento. Más preferentemente, un anticuerpo selectivo anti-hepcidina-25 de la presente invención se une a hepcidina-25 humana con una KD de 1000, 500, 200, 100, 50, 10, o 5 veces inferior a aquella con que el anticuerpo une pro-hepcidina humana que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 34 y al menos una forma truncada N-terminalmente de hepcidina madura humana, como se mide por SPR a 25 °C. Adicionalmente, o alternativamente, un anticuerpo selectivo de anti-hepcidina-25 de la invención une a hepcidina-25 humana pero no se une, o se une mínimamente, a pro-hepcidina humana (SEC ID N.º: 34) y a al menos una especie truncada Nterminalmente de hepcidina madura que se sabe que se forma en la misma especie de mamíferos según se determina por procedimientos de inmunoensayo y/o de espectrometría de masas MALDI-TOF usados por aquellos expertos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, el ensayo descrito en el ejemplo 5 en el presente documento. Lo más preferentemente, un anticuerpo selectivo anti-hepcidina-25 de la presente invención i) se une a hepcidina-25 humana con una KD de 1000, 500, 200, 100, 50, 10, o 5 veces inferior a aquella con que el anticuerpo se une a prohepcidina humana (SEC ID N.º: 34) e ii) se une a hepcidina-25 humana con una KD de 1000, 500, 200, 100, 50, 10, o 5 veces inferior a aquella con que el anticuerpo se une a hepcidina-20 humana (es decir, aminoácidos 6-25 de SEC ID N.º: 1) y/o hepcidina-22 humana (aminoácidos 4-25 de SEC ID N.º: 1), se midió por SPR a 25 °C. Adicionalmente,

o alternativamente, un anticuerpo selectivo anti-hepcidina-25 de la invención se une a hepcidina-25 humana, pero no se une, o se une mínimamente, a i) pro-hepcidina humana (SEC ID N.º: 34) e ii) hepcidina-20 humana y/o hepcidina22 humana, como se determina por procedimientos de inmunoensayo y/o de espectrometría de masas MALDI-TOF usados por aquellos expertos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, el ensayo descrito en el ejemplo 5 en el presente documento.

El término "detectar" o "detección" se usa en el sentido más amplio para incluir medidas cuantitativas, semicuantitativas o cualitativas de una molécula objetivo. En un aspecto, los procedimientos descritos en el presente documento solamente pueden determinar la presencia o ausencia de un polipéptido de hepcidina particular en una muestra biológica y así el polipéptido hepcidina es detectable o, alternativamente, indetectable en la muestra como se determina por el procedimiento.

El término “epítopo” se refiere a la parte de una molécula capaz de reconocerse por y unirse por un anticuerpo en una o más de las regiones de unión a antígeno del anticuerpo.

El término "bioactividad", en referencia a un anticuerpo de la invención, incluye, pero no se limita a, afinidad de unión de antígeno o de epítopo, estabilidad del anticuerpo in vivo y/o in vitro, propiedades inmunógenas del anticuerpo, por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano y/o la capacidad de neutralizar o antagonizar una bioactividad de hepcidina, in vivo o in vitro, incluyendo, pero no limitadas a, inhibición de desregulación de nivel de hierro sérico en una inflamación, por ejemplo, IL-6, ensayo de exposición, por ejemplo, según se describe en el ejemplo 4 en el presente documento. Las propiedades o características mencionadas anteriormente pueden observarse o medirse usando técnicas reconocidas en la técnica, incluyendo, pero no limitadas a, ensayos de proximidad de centelleo, ELISA, inmunoensayo de ORIGEN (IGEN), desactivación de fluorescencia, ELISA de fluorescencia, ELISA competitivo, análisis de SPR incluyendo, pero no limitado a, análisis de SPR usando un biosensor BIAcore, ensayos de neutralización in vitro e in vivo sin limite (véase, por ejemplo, Publicación Internacional N.º: WO 2006/062685), unión al receptor e inmunohistoquímica con secciones tisulares de fuentes diferentes incluyendo fuente humana, fuente de primate, o cualquier otra fuente según pueda ser lo necesario.

El término "bioactividad" en referencia a hepcidina madura incluyendo hepcidina-25 incluye, pero no se limita a, unión específica de hepcidina madura a otra proteína madura incluyendo, pero no limitada a, su receptor ferroportina, una o más funciones mediadas por ferroportina de hepcidina madura, tales como la internalización inducida por hepcidina madura y/o la degradación de ferroportina (véase, por ejemplo, Nemeth, E., y cols., Regulates Iron Efflux by Binding to Ferroportin and Inducing Its Internalization, Science 306, 2090-2093, (2004)), regulación de hepcidina madura del flujo de salida de hierro mediado por ferroportina, niveles de hierro sérico, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, y/o hematocrito en un ser humano, estabilidad proteica, es decir, hepcidina madura que afecta a los niveles de actividad de otra proteína in vivo o in vitro y niveles de expresión de hepcidina y/o distribución tisular de hepcidina.

El término "inhibir" o "neutralizar" como se usa en el presente documento con respecto a una bioactividad de un anticuerpo de la invención significa la capacidad para antagonizar, prohibir, impedir, restringir, ralentizar, alterar, eliminar, detener, reducir o revertir sustancialmente una bioactividad de hepcidina madura humana, incluyendo, pero no limitada a, una bioactividad de hepcidina madura humana como se mide en el ejemplo 3 o 4 en el presente documento.

Los anticuerpos de la presente invención se caracterizan por tener una KD para hepcidina-25 humana de menos de 1000 pM, preferentemente, menos de 800 pM, más preferentemente, menos de 400 pM, incluso más preferentemente, menos de 200 pM, incluso más preferentemente, menos de 100 pM, incluso más preferentemente, menos de 75 pM, o lo más preferentemente, menos de 50 pM, determinada por SPR a 25 °C. Preferentemente, el anticuerpo se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD menos de 800 pM, preferentemente, menos de 400 pM, más preferentemente, menos de 200 pM, incluso más preferentemente, menos de 100 pM, incluso más preferentemente, menos de 75 pM, o lo más preferentemente, menos de 50 pM, determinada por SPR a 25 °C también se une selectivamente a al menos una hepcidina-25 de otras especies tales como hepcidina-25 de macaco. Más preferentemente, tales anticuerpos se unen selectivamente a hepcidina-25 de macaco con una KD de menos de 800 pM, incluso más preferentemente, menos de 400 pM, incluso más preferentemente, menos de 200 pM, incluso más preferentemente, menos de 100 pM, incluso más preferentemente, menos de 75 pM, o lo más preferentemente, menos de 50 pM, determinada por SPR a 25 °C.

Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos selectivos de anti-hepcidina-25 que tienen una KD para hepcidina-25 humana entre 800 pM y 30 pM, preferentemente, entre 400 pM y 30 pM, más preferentemente, entre 200 pM y 30 pM, incluso más preferentemente, entre aproximadamente 100 pM y 30 pM, incluso más preferentemente, entre 75 pM y 30 pM, o lo más preferentemente, entre 50 pM y 30 pM, determinada por SPR a 25 °C. Preferentemente, tales anticuerpos también tienen una KD para hepcidina-25 de macaco entre 800 pM y 10 pM, más preferentemente, entre 400 pM y 10 pM, incluso más preferentemente, entre 200 pM y 10 pM, incluso más preferentemente, entre 100 pM y 10 pM, incluso más preferentemente, entre 75 pM y 10 pM, o lo más preferentemente, entre 50 pM y 10 pM, determinada por SPR a 25 °C.

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos que tienen una KD para hepcidina-25 humana y/o para hepcidina-25 de macaco que es al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, al menos 100 veces, o al menos 200 veces menos que la KD del anticuerpo para hepcidina-25 de ratón y/o hepcidina-25 de rata, determinada por SPR a 25 °C.

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos que tienen una tasa de koff de hepcidina-25 humana entre 1 x 10-2 s-1 y 1,8 x 10-4 s-1, preferentemente, entre 8,5 x 10-3 s-1 y 1,8 x 10-4 s-1, más preferentemente, entre 7,7 x 10-4 s-1 y 1,8 x 10-4 s-1, incluso más preferentemente, entre 6,5 x 10-5 s-1 y 1,8 x 10-4 s-1, o lo más preferentemente, entre 5,5 x 10-4 s-1 y 2,0 x 10-4 s-1, determinada por SPR a 25 °C. Preferentemente, un anticuerpo tal también se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD entre 800 pM y 30 pM, incluso más preferentemente, entre 400 pM y 30 pM, incluso más preferentemente, entre 200 pM y 30 pM, incluso más preferentemente, entre 100 pM y 30 pM, incluso más preferentemente, entre 75 pM y 50 pM, o lo más preferentemente, entre 50 pM y 30 pM, determinada por SPR a 25 °C.

La presente invención también incluye anticuerpos que se unen a hepcidina-25 humana, preferentemente, de forma selectiva, con una KD de 200 pM o menos y neutralizan o antagonizan al menos una bioactividad de hepcidina madura humana in vitro o in vivo. Preferentemente, un anticuerpo de la invención tiene una CI50 inferior a 200 nM, más preferentemente, inferior a 100 nM, incluso más preferentemente, inferior a 75 nM, o lo más preferentemente, inferior a 50 nM en un ensayo in vitro o in vivo de bioactividad de hepcidina madura como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 3 o 4 en el presente documento.

Un anticuerpo de la invención también incluye anticuerpos de unión de anti-hepticidina-25 humana, preferentemente, unión selectiva, los anticuerpos que inhiben selectivamente la disminución hierro sérico inducida por IL-6 en un ensayo de macaco como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 4 en el presente documento. Preferentemente, tales anticuerpos inhiben disminuciones de hierro sérico en un macaco inducidos por una dosis de 5 μg/kg de IL-6 humana en al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos en el 50 %, al menos en el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos en el 90 %, o al menos en el 100 % en 6 horas después de recibir una dosis intravenosa del anticuerpo a aproximadamente 10 mg/kg.

Un anticuerpo de la invención tiene una CI50 inferior a 200 nM, preferentemente, menos de 100 nM, más preferentemente, menos de 75 nM, incluso más preferentemente, menos de 50 nM, o lo más preferentemente, menos de 25 nM en el ensayo de internalización de ferroportina inducida por hepcidina madura descrito en el ejemplo 3 en el presente documento. Preferentemente, un anticuerpo de la invención tiene una CI50 entre 200 nM y 25 nM, más preferentemente, entre aproximadamente 100 nM y 50 nM, más preferentemente, entre 100 nM y 25 nM, incluso más preferentemente, entre 75 nM y 25 nM, o lo más preferentemente, entre 75 nM y 50 nM en el ensayo de internalización de ferroportina inducida por hepcidina madura descrito en el ejemplo 3 en el presente documento.

En otra realización, un anticuerpo de la invención tiene una CI50 entre 200 nM y 25 nM, preferentemente, entre 100 nM y 50 nM, más preferentemente, entre 100 nM y 25 nM, incluso más preferentemente, entre 75 nM y 25 nM, o lo más preferentemente, entre 75 nM y 50 nM en el ensayo de internalización de ferroportina inducida por hepcidina descrito en el ejemplo 3, una tasa de koff a partir de hepcidina-25 humana entre 1 x 10-2 s-1 y aproximadamente 1,8 x 10-4 s-1, preferentemente, entre 8,5 x 10-3 s-1 y 1,8 x 10-4 s-1, más preferentemente, entre aproximadamente 7,7 x 10-4 s-1 y 1,8 x 10-4 s-1, incluso más preferentemente, entre 6,5 x 10-4 s-1 y 1,8 x 10-4 s-1, o lo más preferentemente, entre 5,5 x 10-4 s-1 y 2,0 x 10-4 s-1, determinada por SPR a 25 °C y se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD entre 800 pM y 30 pM, preferentemente, entre 400 pM y 30 pM, más preferentemente, entre 200 pM y 30 pM, incluso más preferentemente, entre 100 pM y 30 pM, incluso más preferentemente, entre 75 pM y 50 pM, o lo más preferentemente, de entre 50 pM y 30 pM, determinada por SPR a 25 °C.

El término "numeración de Kabat" como se usa en el presente documento se conoce en la técnica y se refiere a un sistema de numerar residuos de aminoácidos que son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácidos en las regiones de cadena pesada y ligera del anticuerpo (Kabat, y cols., Ann. NY Acad. Sci. 190: 38293 (1971); Kabat, y cols., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N.º: 91-3242 (1991)).

Un polinucleótido está "operativamente unido" cuando está colocado en una relación funcional con otro polinucleótido. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si ello afecta a la transcripción de la secuencia.

Los términos "sujeto" y "paciente" usados intercambiablemente en el presente documento, se refieren a un mamífero, preferentemente, a un ser humano. En ciertas realizaciones, el paciente presenta un trastorno que se beneficiaría de un nivel disminuido de hepcidina-25, una disminución en bioactividad de hepcidina-25, y/o un incremento del nivel de hierro sérico, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, y/o hematocrito.

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido operativamente incluyendo, pero no limitado a, plásmidos y vectores víricos. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped dentro de la que se introducen mientras que otros vectores se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y por lo tanto, se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que ellos están operativamente unidos. Tales vectores se refieren en el presente documento como "vectores de expresión recombinantes” (o simplemente "vectores de expresión"). Los vectores ejemplares se conocen bien en la técnica.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "célula" y "célula huésped" se usan intercambiablemente y se refieren a cualquier célula procariota (por ejemplo, células bacterianas tales como E. coli) o, preferentemente, a una célula eucariota (por ejemplo, células de levadura, células vegetales, células de insecto, o células de mamíferos tales como células CHO), tanto si están localizadas in vitro como si están localizadas in vivo. Una célula huésped incluye células transformadas, transducidas, transfectadas, o infectadas con uno o más vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención. Una célula huésped puede estar localizada in vitro o in vivo. Por ejemplo, las células huésped pueden estar localizadas en un animal transgénico o en una planta transgénica.

Cada cadena pesada de un anticuerpo de longitud total se compone de una región variable de cadena pesada Nterminal (en el presente documento "HCVR") y una región constante de cadena pesada C-terminal. Cada cadena ligera de un anticuerpo de longitud total se compone de una región variable de cadena ligera N-terminal (en el presente documento "LCVR") y una región constante de cadena ligera C-terminal. Las regiones HCVR y LCVR pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad denominadas regiones determinantes de complementariedad ("CDR"), intercaladas con regiones que están más conservadas, que se denominan regiones marco conservadas ("FR"). La capacidad funcional de un anticuerpo para unir un antígeno o epítopo particular está grandemente influenciada por las seis CDR presentes en la región variable del anticuerpo. Cada HCVR y LCVR está compuesta de tres CDR (HCDR1, HCDR2 y HCDR3 en la HCVR y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 en la LCVR) y de cuatro regiones marco conservadas, dispuestas desde el extremo aminoterminal hasta el extremo carboxiterminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

De acuerdo con ello, el término "CDR" o "región de determinación de complementariedad" como se usa en el presente documento se usa para significar los sitios de combinación de antígenos no contiguos encontrados dentro de la región variable tanto de polipéptidos de cadena pesada como de polipéptidos de cadena ligera. Estas regiones particulares han sido descritas por Kabat, y cols., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977), Kabat, y cols., Sequences of protein of immunological interest, (1991) y por Chothia, y cols., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) y por MacCallum, y cols., J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996) donde las definiciones incluyen solapamiento o subgrupos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. En la presente revelación, la asignación de los aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con convenciones bien conocidas (por ejemplo, Kabat, (1991) y/o Chothia (1987)). Las CDR contienen la mayoría de los residuos que forman interacciones específicas con el antígeno.

Las tablas 1 y 2 a continuación representan las secuencias de aminoácidos y las secuencias de aminoácidos consenso que codifican CDR preferidos para los anticuerpos de la presente invención.

Tabla 1 Tabla 2

Fab

LCDR1 LCDR2 LCDR3

JXB7

SASSSVSSTYLH (SEC ID N.º: 26) RTSTLAS (SEC ID N.º: 30) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

31B2

SASSSVSSTYLH (SEC ID N.º: 26) RTSTLAS (SEC ID N.º: 30) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

Hu22

SASSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 43) RTSTLAS (SEC ID N.º: 30) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

1

SLSSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 47) RTSTLAS (SEC ID N.º: 30) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

2

SISSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 48) RTSTLAS (SEC ID N.º: 30) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

3

SWSSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 49) RTSTLAS (SEC ID N.º: 30) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

4

SAGSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 50) RTSTLAS (SEC ID N.º: 30) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

5

SASSRVVSTYLF (SEC ID N.º: 51) RTSTLAS (SEC ID N.º: 30) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

6

SASSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 43) RTSPLAS (SEC ID N.º: 53) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

7

SASSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 43) RTSALAS (SEC ID N.º: 54) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

8

SASSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 43) RTSWLAS (SEC ID N.º: 55) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

9

SASSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 43) RTSTGAS (SEC ID N.º: 56) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

10

SASSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 43) RTSTLTS (SEC ID N.º: 57) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

11

SASSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 43) RTSTLVS (SEC ID N.º: 58) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

12

SASSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 43) RTSTLLS (SEC ID N.º: 59) QQWSGYPFT (SEC ID N.º: 31)

13

SASSRVSSTYLF (SEC ID N.º: 43) RTSTLAS (SEC ID N.º: 30) QQWSGYPFV (SEC ID N.º: 61)

*Consenso

SX1X2SX3VSSTYLF (SEC ID N.º: 52) RTSX4X5X6S (SEC ID N.º: 60) QQWSGYPFX7 (SEC ID N.º: 62)

* X1 es A, L, I, o W: X2 es S o G; X3 es R o S: X4 es T, P, A, o W; X5 es L o G; X6 es A, T, V, o L; X7 es T o V.

Fab

HCDR1 HCDR2 HCDR3

JXB7

GYTFTIYPIE (SEC ID N.º: 27) NFHPYNGDTNYNEKFKG (SEC ID N.º: 28) GGTGSFDY (SEC ID N.º: 46)

31B2

GYTFYIYPIS (SEC ID N.º: 29) NFHPYKGLTNYNEKFKG (SEC ID N.º: 33) GGTGSFDY (SEC ID N.º: 46)

Hu22

GYTFTIYPIS (SEC ID N.º: 32) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEC ID N.º: 44) GGTGSFDY (SEC ID N.º: 46)

14

GYTFLIYPIS (SEC ID N.º: 63) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEC ID N.º: 44) GGTGSFDY (SEC ID N.º: 46)

15

GYTFWIYPIS (SEC ID N.º: 64) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEC ID N.º: 44) GGTGSFDY (SEC ID N.º: 46)

16

GYTFTIYPIS (SEC ID N.º: 32) NFHPYLGTTNYNEKFKG (SEC ID N.º: 66) GGTGSFDY (SEC ID N.º: 46)

17

GYTFTIYPIS (SEC ID N.º: 32) NFHPYLGLTNYNEKFKG (SEC ID N.º: 67) GGTGSFDY (SEC ID N.º: 46)

18

GYTFTIYPIS (SEC ID N.º: 32) NFHPYLGVTNYNEKFKG (SEC ID N.º: 68) GGTGSFDY (SEC ID N.º: 46)

19

GYTFTIYPIS (SEC ID N.º: 32) NFHPYLGMTNYNEKFKG (SEC ID N.º: 69) GGTGSFDY (SEC ID N.º: 46)

20

GYTFTIYPIS (SEC ID N.º: 32) NFHPYLGDANYNEKFKG (SEC ID N.º: 70) GGTGSFDY (SEC ID N.º: 46)

21

GYTFTIYPIS (SEC ID N.º: 32) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEC ID N.º: 44) GGFGSFDY (SEC ID N.º: 72)

22

GYTFTIYPIS (SEC ID N.º: 32) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEC ID N.º: 44) GGTGAFDY (SEC ID N.º: 73)

23

GYTFTIYPIS (SEC ID N.º: 32) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEC ID N.º: 44) GGTGSFPY (SEC ID N.º: 74)

*Consenso

GYTFXSIYPI X9 (SEC ID N.º: 65) NFHPYLGX10XI11NYNEKFKG (SEC ID N.º: 71) GGX12GX13FX14Y (SEC ID N.º: 75)

* X8 es T, W, Y, o L; X9 es S o E; X10 es D, T, L, V, o M; X11 es T o A; X12 es T o F; X13 es S o A; X14 es D o P.

Las SEC ID N.ºs de las secuencias de aminoácidos y de las secuencias de aminoácidos consenso que codifican CDR más preferidas para anticuerpos de la presente invención se proporcionan en la tabla 3 a continuación.

Tabla 3

Fab

LCDR1 SEC ID N.º: LCDR2 SEC ID N.º: LCDR3 SEC ID N.º: HCDR1 SEC ID N.º: HCDR2 SEC ID N.º: HCDR3 SEC ID N.º:

1.5

43 57 61 63 80 46

1.7

43 58 61 32 81 46

1.10

43 53 61 63 82 46

1.13

43 57 61 63 83 46

1.15

43 30 61 63 82 46

3.2

43 53 61 63 84 46

3.6

43 53 61 32 84 46

3.7

43 57 61 63 85 46

3.8

43 53 31 63 84 46

3.9

43 53 61 63 86 46

3.12

43 57 61 63 84 46

3.23

43 53 61 63 85 46

Hu22

43 30 31 32 44 46

L1.5

41 53 31 63 84 46

H1.39

43 53 31 78 84 46

*Consenso

42 76 62 79 87 46

Las regiones constantes de cadena ligera humana se clasifican como regiones constantes kappa o lambda y se caracterizan por una región constante particular como se conoce en la técnica. Las regiones constantes de cadena 5 pesada humana se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Cada tipo de cadena pesada tiene una región constante particular fácilmente conocida en la técnica. La región constante de cadena ligera kappa y las regiones constantes de cadena pesada de IgG1, IgG2 e IgG4 son regiones preferidas constantes en los anticuerpos de la invención. Las regiones constantes de cadena 10 pesada humana preferidas para los anticuerpos de la presente invención son las secuencias de aminoácidos de regiones constantes de cadena pesada como se muestran en SEC ID N.ºs: 90-94 y cualquier variante de las mismas que tenga 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o aproximadamente 15 cambios de aminoácidos (incluyendo sustituciones, inserciones o deleciones). Más preferentemente, las regiones constantes de cadena pesada humana de los anticuerpos de la presente invención son las secuencias de aminoácidos de regiones constantes de cadena 15 pesada como se muestran en SEC ID N.ºs: 93 y 94. Lo más preferentemente, la región constante de cadena pesada humana de los anticuerpos de la presente invención es la secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada mostrada en la SEC ID N.º: 93. Regiones constantes de cadena ligera humana preferidas de los anticuerpos de la presente invención son la secuencia de aminoácidos kappa de región constante de cadena ligera mostrada en la SEC ID N.º: 89 y cualquier variante de la misma que tenga 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o aproximadamente 10 cambios

20 de aminoácidos (incluyendo sustituciones, inserciones o deleciones). Lo más preferentemente, la región constante de cadena ligera humana de los anticuerpos de la presente invención es la secuencia de aminoácidos kappa de región constante de cadena ligera como se muestra en la SEC ID N.º: 89.

Como se usa en el presente documento, la "región de unión a antígeno" o "parte de unión a antígeno” se refiere a

esa parte de una molécula de anticuerpo, dentro de la región variable, que contiene los residuos de aminoácidos que

25 interactúan con un antígeno y confieren en el anticuerpo su especificidad y afinidad por el antígeno. Esta parte de anticuerpo incluye los residuos de aminoácidos estructurales necesarios para mantener la conformación apropiada de los residuos de unión a antígenos.

La presente invención incluye un anticuerpo que se une selectivamente a hepcidina-25 con una KD de

aproximadamente 800 pM o menos determinada por SPR a 25 °C y en el que el anticuerpo comprende al menos una CDR seleccionada del grupo constituido por i) una HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 75 e ii) una LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º:

62. Preferentemente, un anticuerpo tal comprende seis CDR que comprenden secuencias de aminoácidos y secuencias consenso de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por: (i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 52, 60, 62, 65, 71 y 75, respectivamente; y (ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 42, 76, 62, 79, 87 y 46, respectivamente. Más preferentemente, un anticuerpo de la presente invención comprende seis CDR seleccionados del grupo constituido por: (i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 41, 53, 31, 63, 84 y 46, respectivamente; (ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 30, 31, 32, 44 y 46, respectivamente; (iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 53, 61, 63, 85 y 46, respectivamente; y (iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 57, 61, 63, 84 y 46, respectivamente. Incluso más preferentemente, el anticuerpo de la invención comprende dos polipéptidos de cadena pesada y dos polipéptidos de cadena ligera y en los que cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 9 y cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 17. Incluso más preferentemente, el anticuerpo tiene una CI50 de entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 50 nM en el ensayo de internalización de ferroportina inducida por hepcidina descrito en el ejemplo 3, una tasa de koff de hepcidina-25 humana entre aproximadamente 5,5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 2,0 x 10-4 s-1, determinada por SPR a 25 °C y se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD entre aproximadamente 100 pM y aproximadamente 50 pM. Lo más preferentemente, el anticuerpo de la invención comprende dos polipéptidos de cadena pesada y dos polipéptidos de cadena ligera y en los que cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 8 y cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 16, en la que el anticuerpo tiene una CI50 de entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 50 nM en el ensayo de internalización de ferroportina inducida por hepcidina descrito en el ejemplo 3, una tasa de koff de hepcidina-25 humana entre aproximadamente 5,5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 2,0 x 10-4 s-1, determinada por SPR a 25 °C y se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD entre aproximadamente 100 pM y aproximadamente 50 pM.

Otros anticuerpos preferidos de la invención comprenden una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 124, 125, 126 y 127. Más preferentemente, un anticuerpo de la invención comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 148, 128, 150 y 151. Incluso más preferentemente, un anticuerpo de la invención comprende una LCVR de SEC ID N.º: 126 y una HCVR de SEC ID N.º: 148. Incluso más preferentemente, un anticuerpo de la invención comprende una LCVR de SEC ID N.º: 127 y una HCVR de SEC ID N.º: 128. Incluso más preferentemente, un anticuerpo de la invención comprende una LCVR de SEC ID N.º: 125 y una HCVR de SEC ID N.º: 151. Un anticuerpo más preferido de la invención comprende una LCVR de SEC ID N.º: 124 y una HCVR de SEC ID N.º:

150. Tales LCVR están unidas preferentemente a una región constante de cadena ligera de origen humano o derivada de una región constante de cadena ligera de origen humano, preferentemente una cadena kappa humana y lo más preferentemente una cadena kappa de SEC ID N.º: 89. Tales HCVR están unidas preferentemente a una región constante de cadena pesada de origen humano o se derivan de una región constante de cadena pesada de origen humano, preferentemente de IgG1, IgG2, o IgG4, más preferentemente, una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 90, 91, 92, 93 y 94 y lo más preferentemente, una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º: 93. Preferentemente, el anticuerpo tiene una CI50 de entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 50 nM en el ensayo de internalización de ferroportina inducida por hepcidina descrito en el ejemplo 3, una tasa de koff de hepcidina-25 humana entre aproximadamente 5,5 x 10-4 s-1 y aproximadamente 2,0 x 10-4 s-1, determinada por SPR a 25 °C y se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD entre aproximadamente 100 pM y aproximadamente 50 pM.

Un anticuerpo de la invención puede comprender un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 6 y un polipéptido de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 14. Un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 6 puede estar codificado por una secuencia polinucleotídica de SEC ID N.º: 2. Un polipéptido de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 14 puede estar codificado por un polinucleótido que tiene la secuencia de ácidos nucleicos como se muestra en SEC ID N.º: 10.

Un anticuerpo de la invención comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 7 y un polipéptido de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 15. Un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 7 puede estar codificado por una secuencia polinucleotídica de SEC ID N.º: 3. Un polipéptido de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 15 puede estar codificado por un polinucleótido que tiene la secuencia de ácidos nucleicos como se muestra en SEC ID N.º:

11.

5 Un anticuerpo de la invención comprende además un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 8 y un polipéptido de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 16. Un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 8 puede estar codificada por una secuencia polinucleotídica como se muestra en SEC ID N.º: 4. Un polipéptido de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se

10 muestra en SEC ID N.º: 16 puede estar codificado por un polinucleótido que tiene la secuencia de ácidos nucleicos como se muestra en SEC ID N.º: 12.

En otra realización, un anticuerpo de la invención comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 9 y un polipéptido de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 17. Un polipéptido de cadena pesada que tiene una

15 secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 9 puede estar codificado por una secuencia polinucleotídica de SEC ID N.º: 5. Un polipéptido de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 17 puede estar codificado por un polinucleótido que tiene la secuencia de ácidos nucleicos como se muestra en SEC ID N.º: 13.

Los anticuerpos manipulados humanos preferidos de la invención se refieren para el presente documento como Mab

20 L1.5, Hu22, 3.12 y 3.23. Las SEC ID N.ºs de las secuencias de aminoácidos que codifican las cadenas pesadas, las cadenas ligeras, las regiones variables de cadenas pesada y ligera y las CDR para Mabs L1.5, Hu22, 3.12, y 3.23 se proporcionan en la tabla 4 más abajo.

Tabla 4

Mab

Cadena pesada Cadena ligera HCVR HC CDR1 HC CDR2 HC CDR3 LCV R LC CDR1 LC CDR2 LC CDR3

L1.5

6 14 148 63 84 46 126 41 53 31

Hu22

7 15 128 32 44 46 127 43 30 31

3.12

8 16 150 63 84 46 124 43 57 61

3.23

9 17 151 63 85 46 125 43 53 61

25 Las técnicas de biología molecular estándar se usaron para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar transformantes, aislar líneas celulares produciendo un anticuerpo de la invención, cultivar estas células huésped y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo.

La presente invención se refiere también a las células huésped que expresan un anticuerpo de la invención antihepcidina. Una amplia variedad de sistemas de expresión de huésped conocidos en la técnica se pueden usar para

30 expresar un anticuerpo de la presente invención incluyendo sistemas de expresión procariotas (bacterianos) y eucariotas (tales como levadura, baculovirus, células vegetales, células de mamífero y otras células animales, animales transgénicos y células de hibridoma), así como los sistemas de expresión de manifestación en fagos.

Un anticuerpo de la invención se puede preparar por expresión recombinante de genes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas en una célula huésped. Para expresar un anticuerpo recombinantemente, una célula 35 huésped se transforma, transduce, infecta o similar con uno o más vectores de expresión recombinantes que llevan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo de tal forma que las cadenas ligeras y/o pesadas se expresan en la célula huésped. La cadena pesada y la cadena ligera pueden expresarse independientemente a partir de diferentes promotores a los que están operativamente unidos en un vector o, alternativamente, la cadena pesada y la cadena ligera pueden expresarse independientemente a partir de diferentes

40 promotores a los que están unidos operativamente en dos vectores -uno expresando la cadena pesada y uno expresando la cadena ligera-. Opcionalmente, la cadena pesada y la cadena ligera pueden expresarse en células huésped diferentes.

Adicionalmente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena ligera y/o pesada de anticuerpo a partir de una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpo pesada y/o 45 ligera puede clonarse dentro del vector de manera que el péptido señal esté unido operativamente en fase al extremo aminoterminal del gen de cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de

inmunoglobulinas o un péptido señal heterólogo. Preferentemente, los anticuerpos recombinantes se secretan en el medio en el que las células huésped se cultivan, a partir del que los anticuerpos pueden recuperarse o purificarse.

Un ADN aislado que codifica una HCVR puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud total uniendo operativamente el ADN que codifica HCVR a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadenas pesadas. Se conocen en la técnica las secuencias de genes de región constante de cadena pesada, de ser humano, así como de otros mamíferos. Los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por ejemplo, por amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser de cualquier tipo, (por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgM o IgD), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) o subclase de región constante y cualquier variante alotípica de la misma como se describe en Kabat (supra).

Un ADN aislado que codifica una región LCVR puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud total (así como en un gen de cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica LCVR a otra molécula de ADN que codifica una región constante de cadena ligera. Se conocen en la técnica las secuencias de genes de región constante de cadena ligera, de ser humano, así como de otros mamíferos. Los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Además del/de los gen(es) que codifica(n) cadena(s) pesada(s) o ligera(s) de anticuerpo(s), un vector de expresión recombinante de la invención lleva secuencias reguladoras que controlan la expresión del/de los gen(es) que codifica(n) cadena(s) pesada(s) o ligera(s) de anticuerpo(s) en una célula huésped. Se pretende que el término "secuencia reguladora" incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación), según sea necesario, que controlen la transcripción o la traducción del/de los gen(es) de cadena(s) de anticuerpo(s). El diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformarse, el nivel de expresión de la proteína deseada. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión de células huésped de mamíferos incluyen elementos víricos que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), Virus de los Simios 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y/o poliomavirus.

Adicionalmente, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y uno o más genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector. Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr) (para usar en células huésped dhfr-minus con selección/amplificación de metotrexato), el gen neo (para selección de G418) y glutamina sintetasa (GS) en una línea celular GS-negativa (tal como NS0) para selección/amplificación.

Para expresión de las cadenas ligeras y/o pesadas, el/los vector(es) de expresión que codifica(n) la(s) cadena(s) pesada(s) y/o ligera(s) se introduce(n) en una célula huésped por técnicas estándar por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano, transducción, infección y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención bien en células huésped procariotas o bien en células huésped eucariotas, se prefieren células eucariotas y lo más preferentemente células huésped de mamíferos, debido a que es más probable que tales células se ensamblen y segreguen un anticuerpo apropiadamente plegado e inmunológicamente activo. Las células huésped de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) [incluyendo células CHO dhfr menos, como se describe en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77: 4216-20, 1980, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601-21, 1982], células de mieloma NS0, células COS y células SP2/0. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpo se introducen dentro de células huésped de mamíferos, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que las células huésped se cultivan en condiciones apropiadas conocidas en la técnica. Los anticuerpos pueden recuperarse a partir de la célula huésped y/o a partir del medio de cultivo usando procedimientos de purificación estándar.

Las células huésped pueden también usarse para producir partes, o fragmentos, de los anticuerpos intactos, por ejemplo, fragmentos Fab o moléculas scFv por técnicas que son convencionales. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula huésped con ADN que codifica bien la cadena ligera o bien la cadena pesada de un anticuerpo de esta invención. La tecnología de ADN recombinante puede usarse también para eliminar algunos o todos los ADN que codifican una o ambas de las cadenas ligeras y pesadas que no son necesarias para unirse a hepcidina-25 humana. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de ADN truncadas están también abarcadas por los anticuerpos de la invención.

La invención proporciona una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Preferentemente, una célula huésped de la invención comprende uno o más vectores o construcciones que comprenden una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Por ejemplo, una célula huésped de la invención es una célula en la que se ha introducido un vector de la invención, comprendiendo dicho vector un polinucleótido que codifica una LCVR de un anticuerpo de la invención y/o un polinucleótido que codifica una HCVR de la invención. La invención también proporciona una célula huésped en la que se han introducido dos vectores de la invención; uno que comprende un polinucleótido que codifica un LCVR de un anticuerpo de la invención y uno que comprende un polinucleótido que codifica un HCVR presente en un anticuerpo de la invención y cada uno unido operativamente a elementos reguladores potenciadores/promotores (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como un elemento regulador potenciador de CMV/promotor AdMLP o un elemento regulador potenciador de CMV/promotor AdMLP) para dirigir altos niveles de transcripción de los genes.

Una vez expresados, los anticuerpos intactos, las cadenas ligeras o pesadas individuales, u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención se pueden purificar de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluyendo precipitación por sulfato de amonio, intercambio iónico, afinidad (por ejemplo, Proteína A), fase inversa, cromatografía en columna de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel y similares. Procedimientos estándar para la purificación de anticuerpos terapéuticos se describen, por ejemplo, por Feng Li, Joe

X. Zhou, Xiaoming Yang, Tim Tressel, y Brian Lee en un artículo titulado "Current Therapeutic Antibody Production and Process Optimization" (BioProcessing Journal, sept./oct. 2005), por ejemplo. Adicionalmente, las técnicas habituales para eliminar los virus de preparaciones de anticuerpos expresados recombinantemente se conocen también en la técnica (véase, por ejemplo, Gerd Kern y Mani Krishnan, "Viral Removal by Filtration: Points to Consider" (Biopharm International, oct. 2006)). La eficacia de filtración para eliminar los virus de preparaciones de anticuerpos terapéuticos se conoce por ser al menos en parte dependiente de la concentración de proteína y/o del anticuerpo en la solución a filtrarse. El procedimiento de purificación para los anticuerpos de la presente invención puede incluir una etapa de filtración para eliminar los virus de la corriente principal de una o más operaciones de cromatografía. Preferentemente, antes de filtrar a través de un nanofiltro de calidad farmacéutica para eliminar virus, se diluye o concentra una corriente principal de cromatografía que contiene un anticuerpo de la presente invención para dar concentración de proteínas total y/o concentración de anticuerpos total de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 3 g/l. Incluso más preferentemente, el nanofiltro es un nanofiltro DV20 (por ejemplo, Pall Corporation; East Hills, NY). Se prefieren inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 94 %, o aproximadamente el 96 % de homogeneidad y las más preferidas son de aproximadamente el 98 % a aproximadamente el 99 % o más de homogeneidad, para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta homogeneidad según se desee, los anticuerpos estériles pueden después usarse terapéuticamente, como se indica en el presente documento.

En vista de la discusión mencionada anteriormente, la presente invención se refiere adicionalmente a un anticuerpo obtenible por un procedimiento que comprende las etapas de cultivar una célula huésped incluyendo, pero no limitada a una célula de mamífero, vegetal, bacteriana, animal transgénica o vegetal transgénica que se ha transformado por un polinucleótido o un vector que comprende moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención de tal manera que el ácido nucleico se expresa y opcionalmente, recuperar el anticuerpo del medio de cultivo de células huésped. Preferentemente, la célula huésped comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.ºs: 14, 15, 16, o 17. Más preferentemente, la célula huésped comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se muestra en SEC ID N.º: 12 o 13. Incluso más preferentemente, la célula huésped transformada es una célula de ovario de hámster Chino, mieloma NS0, COS, o SP2/0.

La presente invención se refiere adicionalmente a un procedimiento de producción de un anticuerpo de la invención que comprende las etapas de transformar una célula huésped incluyendo, pero no limitada a una célula de mamífero, vegetal, bacteriana, animal transgénica o vegetal transgénica con un polinucleótido o un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la invención de tal forma que el ácido nucleico se expresa y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo de células huésped. Preferentemente, la célula huésped está transformada con un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.ºs: 14, 15, 16, o

17. Más preferentemente, la célula huésped se ha transformado con un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se muestra en SEC ID N.º: 12 o 13. Incluso más preferentemente, la célula huésped es una célula de ovario de hámster Chino, mieloma NS0, COS, o SP2/0.

El término "polinucleótido aislado" como se usa en el presente documento significará un polinucleótido de origen genómico, de ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen el polinucleótido aislado (1) no se asocia con la totalidad o con una parte de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, (2) está unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no se da en la naturaleza como parte de una secuencia más larga.

El término "proteína aislada" referido en el presente documento quiere decir que una proteína sujeto (1) está libre de al menos algunas otras proteínas que se encontrarían normalmente, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de los polinucleótidos, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los que está asociada en la naturaleza, (5) no está asociada (por interacción covalente o no covalente) con partes de una proteína con la que la "proteína aislada" está asociada en la naturaleza, (6) está asociada operativamente (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociado en la naturaleza, o (7) no se da en la naturaleza. Una proteína aislada tal puede estar codificada por ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético, o por cualquier combinación de los mismos. Preferentemente, la proteína aislada está purificada sustancialmente a partir de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirían con su uso (terapéutico, diagnóstico, profiláctico, de investigación

o de otra manera).

Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su

ambiente natural. Componentes contaminantes del ambiente natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En realizaciones preferidas, un anticuerpo se purificará (1) a más del 95 % en peso de anticuerpo según se determina por el procedimiento de Lowry y lo más preferentemente a más del 99 % en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia N-terminal o secuencia de aminoácidos internos mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) para homogeneizar por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. Anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente.

Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" o "sustancialmente purificado" significa un compuesto o especie que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En ciertas realizaciones, una composición sustancialmente purificada es una composición en la que la especie comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En ciertas realizaciones, una composición sustancialmente pura estará compuesta por más de aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En ciertas realizaciones, la especie se purifica a homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por los procedimientos de detección convencionales) en la que la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.

La presente invención proporciona adicionalmente un polinucleótido aislado que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 124, 125, 126, 127, 128, 148, 150 y 151.

En otra realización, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 124, 125, 126, 127, 128, 148, 150 y 151.

La expresión “anticuerpos manipulados humanos" como se usa en el presente documento hace referencia a un anticuerpo en el que al menos una parte es de origen humano. Además, como se usa en el presente documento, la expresión “anticuerpos manipulados humanos" hace referencia a los anticuerpos específicos revelados en el presente documento así como a anticuerpos adicionales que tienen propiedades funcionales similares de acuerdo con la invención como los anticuerpos revelados en el presente documento y tienen regiones marco conservadas que son CDR sustancialmente humanas o totalmente humanas que se derivan de un anticuerpo no humano. Los marcos conservados sustancialmente humanos son aquellos que tienen al menos el 80 % de identidad de secuencia para una secuencia de marco conservado de línea germinal humana conocida. Preferentemente, los marcos conservados sustancialmente humanos tienen al menos aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, o aproximadamente el 99 % de identidad de secuencia a una secuencia de marco conservado de línea germinal humana. Lo más preferentemente, anticuerpos manipulados humanos de la presente invención contienen secuencia mínima derivada de un anticuerpo no humano.

Por ejemplo, el anticuerpo manipulado humano puede comprender partes derivadas de un anticuerpo de origen no humano, tal como un ratón y partes derivadas de un anticuerpo de origen humano, unidas conjuntamente, por ejemplo, químicamente por técnicas convencionales (por ejemplo, sintéticas) o preparadas como un polipéptido contiguo usando técnicas de ingeniería genética. Como se usa en el presente documento, el término "marco conservado" cuando se usa en referencia a una región variable de anticuerpo se introduce para querer decir todos los residuos de aminoácidos fuera de las CDR dentro de la región variable de un anticuerpo. Como se usa en el presente documento, el término "región marco conservada" se desea para querer decir cada dominio del marco conservado que está separado por las CDR. Las regiones marco conservadas para la cadena ligera están similarmente separadas por cada una de las CDR de regiones variables de cadena ligera. Preferentemente, la región variable de cadena ligera y/o la región variable de cadena pesada comprende un marco conservado o al menos una parte de una región marco conservada (por ejemplo, que contiene 2 o 3 subregiones, tales como FR2 y FR3). Más preferentemente, al menos FRL1, FRL2, FRL3, o FRL4 es completamente humana o al menos FRH1, FRH2, FRH3, o FRH4 es completamente humana. Incluso más preferentemente, al menos FRL1, FRL2, FRL3, o FRL4 es una secuencia de línea germinal (por ejemplo, línea germinal humana) o comprende secuencias consenso humanas para el marco conservado particular conocido en la técnica y/o al menos FRH1, FRH2, FRH3, o FRH4 es una secuencia de línea germinal (por ejemplo, línea germinal humana) o comprende secuencias consenso humanas para el marco conservado particular. En realizaciones preferidas, un anticuerpo de la presente invención comprende las secuencias de marco conservado de cadena ligera de línea germinal humana y las secuencias de marco conservado de cadena pesada de línea germinal humana (véase, por ejemplo, documento PCT WO 2005/005604). Más preferentemente, marcos conservados de cadena ligera de línea germinal humana se seleccionan del grupo constituido por: A 11, A 17, A 18, A 19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L6, L8, 012, 018, 02 y 08. Incluso más preferentemente, el marco conservado de cadena ligera de línea germinal humana es 02 o 018. Lo más preferentemente, el marco conservado de cadena ligera de línea germinal humana es 02. Adicionalmente, los marcos conservados de cadena pesada de línea germinal humana preferidos están seleccionados del grupo constituido por: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VH1-24, VH1-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, PH118, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, VH5-51, VH3-73, VH158, VH1-3 y VH1-2. Incluso más preferentemente, el marco conservado de cadena pesada de línea germinal humana es VH1-69 o VH1-18. Lo más preferentemente, el marco conservado de cadena pesada de línea germinal humana es VH1-69.

Los anticuerpos manipulados humanos además de aquellos revelados en el presente documento que se unen selectivamente a hepcidina-25 humana con las propiedades funcionales de acuerdo con la invención pueden generarse usando varios enfoques diferentes. Los anticuerpos específicos revelados en el presente documento se pueden usar como un molde o como un anticuerpo parental para fabricar anticuerpos adicionales. En un enfoque las CDR de anticuerpo parental se injertan en un marco conservado humano que tiene una identidad de secuencia alta con el marco conservado de anticuerpo parental. La identidad de secuencia del marco conservado nuevo será generalmente al menos el 80 %, al menos el 85 %, o al menos el 90 % con el marco conservado correspondiente en el anticuerpo parental. Este injerto puede dar como resultado una reducción en afinidad de unión comparada con el anticuerpo parental. Si esta es la causa, el marco conservado puede retromutarse al marco conservado parental en ciertas posiciones en base a los criterios específicos publicados por Queen y cols. La identificación de los residuos a considerar para retromutación puede llevarse a cabo como sigue: cuando un aminoácido cae en las categorías siguientes, el aminoácido estructural de la secuencia de línea germinal humana que se está usando (marco conservado aceptor) se reemplazó por un aminoácido estructural a partir de un marco conservado del anticuerpo parental (marco conservado donante):

(a)

el aminoácido en la región marco conservada humana del marco conservado aceptor es inusual para marcos conservados humanos en esa posición, mientras que el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante es típico para marcos conservados humanos en esa posición;

(b)

la posición del aminoácido está inmediatamente adyacente a una de las CDR; o

(c)

cualquier átomo de cadena lateral de un aminoácido estructural está aproximadamente dentro de 5-6 angstroms (de centro a centro) de cualquier átomo de carbono de un aminoácido de CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional [Queen, y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88, 2869 (1991)].

Cuando cada uno de los aminoácidos en el marco conservado humano del marco conservado aceptor y un aminoácido correspondiente en el marco conservado donante es inusual generalmente para marcos conservados humanos en esa posición, un aminoácido tal se puede reemplazar por un aminoácido típico para marcos conservados humanos en esa posición. Estos criterios de retromutación permiten a alguna recuperar la actividad del parental.

Otro enfoque sería mutar aleatoriamente las CDR injertadas sin cambiar el marco conservado y rastrear tales anticuerpos para afinidad de unión que sea tan buena o mejor que la del anticuerpo parental. Adicionalmente, una combinación de ambos de estos planteamientos es posible. Después de injertar, las regiones marco conservadas específicas pueden retromutarse además de hacer cambios en las CDR. Esta metodología general se describe por Wu, y cols., (1999), "Humanization of a murine monoclonal antibody by simultaneous optimization of framework and CDR residues", J. Mol. Biol., 294: 151-162.

Como se usa en el presente documento, el término "donante" se usa para decir una molécula de anticuerpo parental

o un fragmento de la misma de la que una parte se deriva, se da o contribuye a otra molécula de anticuerpo o fragmento de la misma así como para conferir bien una característica estructural o bien una característica funcional de la molécula parental sobre la molécula receptora. Para el ejemplo específico de injertar CDR, la molécula parental de la que se derivan las CDR injertadas es una molécula donante. El CDR donante confiere afinidad de unión de la molécula parental sobre la molécula receptora. Se debería entender que una molécula donante no tiene que ser de una especie diferente que la molécula receptora de fragmento de la misma. En cambio, es suficiente que el donante sea una molécula separada y distinta.

Como se usa en el presente documento, el término "aceptor" se usa para decir una molécula de anticuerpo o fragmento de la misma que está para recibir la parte donada de la molécula de anticuerpo parental o donante o fragmento de la misma. Una molécula de anticuerpo aceptor o un fragmento de la misma está dotado por lo tanto con la característica estructural o funcional de la parte donante de la molécula parental. Para el ejemplo específico de injerto de CDR, la molécula receptora para la que se injertan las CDR es una molécula aceptora. La molécula de anticuerpo aceptora o el fragmento aceptor está dotado con la afinidad de unión de las CDR del donante o molécula parental. Como con una molécula donante, se entiende que una molécula aceptora no tiene que ser de una especie diferente al donante.

Una "región variable" cuando se usa para referirse a un anticuerpo o una cadena pesada o ligera de la misma se desea para querer decir la parte aminoterminal de un anticuerpo que confiere unión a antígeno sobre la molécula y que no es la región constante. El término se usa para incluir fragmentos funcionales de la misma que mantienen algo

o todo de la función de unión de la región variable completa. Por lo tanto, el término "fragmentos de unión de región variable heteroméricos" se usa para referirse a al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera o fragmentos funcionales de las mismas ensambladas en un complejo heteromérico. Los fragmentos de unión de región variable heteroméricos incluyen, por ejemplo, fragmentos funcionales tales como Fab, F(ab)2, Fv, Fv monocatenarios (scFv) y similares. Tales fragmentos funcionales se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. De acuerdo con ello, el uso de estos términos en describir fragmentos funcionales de una región variable heteromérica se usa para corresponder a las definiciones bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Tales términos se describen en, por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), Nueva York: VCH Editorial, Inc.); Huston y cols., Cell Biophysics, 22: 189-224 (1993); Pluckthun y Skerra, Meth. Enzymol., 178: 497-515 (1989) y en Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Segunda Edición, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY (1990).

Preferentemente, un anticuerpo humano manipulado tiene CDR que se originan de o se derivan de un anticuerpo parental, es decir, un anticuerpo no humano, preferentemente un anticuerpo de ratón o fragmento del mismo tal como el Fab JXB7 de ratón, mientras que la región marco conservada y la región constante, en la medida en que están presentes, (o una parte significativa o una parte sustancial de las mismas, es decir, al menos aproximadamente el 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) están codificadas por información de secuencia de ácido nucleico se da en la región de inmunoglobulina de línea germinal humana (véase, por ejemplo, la International ImMunoGeneTics Database) o en formas recombinadas o mutadas de las mismas se produzcan sí o no dichos anticuerpos en una célula humana. Preferentemente, al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de un anticuerpo humano manipulado se optimizan a partir de las CDR de un anticuerpo parental no humano a partir del que se deriva el anticuerpo manipulado humano, para generar una propiedad deseada, por ejemplo, especificidad, afinidad o neutralización mejoradas, lo que puede identificarse por un ensayo de rastreo, por ejemplo, un ensayo de ELISA. Preferentemente, un anticuerpo de la invención comprende una HCDR3 idéntica a la HCDR3 del Fab JXB7 de ratón parental (es decir, SEC ID N.º: 46) y HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 comprenden al menos una sustitución de aminoácidos cuando se comparan con aquella presente en el Fab JXB7 de ratón parental. Ciertas sustituciones de aminoácidos en las CDR de anticuerpos manipulados humanos de la invención según se comparan con aquellas del Fab JXB7 de ratón parental disminuyen la probabilidad de inestabilidad del anticuerpo (por ejemplo, eliminación de uno o más residuos de Asn de CDR) o disminuyen la probabilidad de inmunogenicidad del anticuerpo

cuando se administra a un sujeto humano (por ejemplo, como se predice por Tecnología IMMUNOFILTER™

(Xencor, Inc., Monrovia, CA)).

Anticuerpos manipulados humanos pueden someterse a mutagénesis in vitro usando procedimientos de uso rutinario en la técnica y así, las secuencias de aminoácidos de regiones marco conservadas de las HCVR y LCVR de los anticuerpos recombinantes manipulados humanos son secuencias que, ya que se derivan de aquellas relacionadas con secuencias de HCVR y LCVR de línea germinal humana, no pueden existir en la naturaleza con el repertorio de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. Se considera que tales secuencias de aminoácidos de los marcos conservados de HCVR y LCVR de los anticuerpos humanos recombinantes son al menos aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 98 % o, más preferentemente, al menos aproximadamente el 99 % o, lo más preferentemente, el 100 % idénticas a una secuencia de línea germinal humana. De acuerdo con ello, los anticuerpos humanos manipulados pueden comprender residuos que se no encuentren ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR o secuencias de marco conservado importadas del anticuerpo parental.

Hay múltiples procedimientos disponibles en la técnica para generar anticuerpos manipulados humanos (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Internacional PCT N.º: WO2006 06046935; Queen, y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88: 2869 (1991); Jones y cols., Nature, 321: 522 (1986); Riechmann y cols., Nature, 332: 323-327 (1988); y Verhoeyen y cols., Science, 239: 1534 (1988)). Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos manipulados humanos obteniendo secuencias de ácidos nucleicos que codifican las HCVR y LCVR de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo murino o anticuerpo elaborado mediante un hibridoma) que se unen selectivamente a hepcidina-25, identificando las CDR en dichas HCVR y LCVR (no humanas) e injertando tales secuencias de ácidos nucleicos que codifican CDR en secuencias de ácidos nucleicos que codifican marcos conservados humanos. Opcionalmente, una región CDR puede optimizarse mutagenizando aleatoriamente o en localizaciones particulares con el fin de sustituir uno o más aminoácidos en la CDR con un aminoácido diferente antes de injertar la región CDR dentro del marco conservado. Alternativamente, una región CDR puede optimizarse subsiguientemente a inserción en el marco conservado humano usando procedimientos disponibles para alguien de habilidad en la técnica.

Después las secuencias que codifican CDR se injertan en las secuencias que codifican marcos conservados humanos seleccionados, las secuencias de ADN resultantes que codifican las secuencias pesadas variables y ligeras variables manipuladas se expresan después para producir un anticuerpo manipulado humano que se une selectivamente a hepcidina-25. Las HCVR y LCVR manipuladas humanas se pueden expresar como parte de una molécula de anticuerpo anti-hepcidina completa, es decir, como una proteína de fusión con secuencias de dominios constantes humanos. Sin embargo, las secuencias HCVR y LCVR se pueden expresar también en ausencia de secuencias constantes para producir un Fv o Fab selectivo anti-hepcidina-25 manipulado humano, por ejemplo (véase, por ejemplo, Watkins, J., y cols., Anal. Biochem., 253: 37-45 (1997) y Watkins, J., y cols., Anal. Biochem.

256: 169-177, (1998)).

Se apreciará que aplicando la enseñanza de la presente invención la persona experta en la técnica puede usar técnicas comunes por ejemplo mutagénesis dirigida a sitio, para sustituir, añadir, o eliminar aminoácidos dentro de las secuencias de CDR y de marcos conservados específicos revelados en el presente documento y al hacerlo así genera secuencias de aminoácidos de región variable adicionales derivadas de las secuencias proporcionadas en el presente documento. Todos los 21 aminoácidos que se dan en la naturaleza alternativos se pueden introducir en un sitio de sustitución específico. Finalmente, las tecnologías de rastrear in vitro o in vivo tales como aquellas descritas en el ejemplo 2 en el presente documento están disponibles para el trabajador para la selección de secuencias de aminoácidos de regiones variables para fragmentos Fab que tienen la afinidad de unión deseada a polipéptidos de hepcidina. De esta manera pueden identificarse fragmentos Fab que son adecuados para preparar un anticuerpo anti-hepcidina de acuerdo con la invención actual. Preferentemente, la sustitución, adición o deleción de aminoácidos dentro de los marcos conservados está restringida a una, dos, tres o cuatro posiciones en una o en cada una de las secuencias de regiones marco conservadas (es decir, FRL1, FRL2, FRL3, FRL4, FRH1, FRH2, FRH3, FRH4) reveladas en el presente documento. Preferentemente, la sustitución, adición o deleción de aminoácidos dentro de las CDR está restringida a una a tres posiciones dentro de una o de cada una de las CDR, más preferentemente se lleva a cabo sustitución, adición y deleción en una o dos posiciones de aminoácidos dentro de una o de cada una de las CDR. Adicionalmente preferido, se lleva a cabo sustitución, adición y deleción de aminoácidos en una o dos posiciones de aminoácidos en las CDR de la región variable de la cadena pesada. Lo más preferentemente la sustitución, adición y deleción se lleva a cabo en una o dos posiciones de aminoácidos dentro de CDRH2.

Las secuencias de ADN resultantes que codifican las secuencias ligeras variables y las secuencias pesadas variables manipuladas humanas se expresaron después para producir un anticuerpo manipulado humano que se une selectivamente a hepcidina-25 humana con afinidad alta. Las HCVR y LCVR manipuladas humanas pueden expresarse como parte de una molécula de anticuerpo anti-hepcidina-25 entera, es decir, como una proteína de fusión con secuencias de dominios constantes humanos.

Otro aspecto de la invención proporciona procedimientos de uso de los anticuerpos de la invención en inmunoensayos relativamente simples todavía altamente sensibles y selectivos para la detección y medida de la hepcidina madura en tejidos humanos y fluidos biológicos para propósitos diagnósticos y pronósticos.

Los anticuerpos de la presente invención proporcionan los medios para detectar o determinar con exactitud las cantidades de hepcidina madura en un tejido o fluido biológico de un ser humano para evaluación de predisposiciones a trastornos promovidos por hepcidina maduros y para detección y diagnóstico en pacientes que sufren de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden incorporar en inmunoensayos sensibles y fiables tales como ELISA, RIA, ensayos de inmunodifusión, o ensayos de inmunodetección, tales como ensayos SPR. Asimismo, los anticuerpos de la presente invención son también útiles para ensayos de inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (SI) de muestras de fluidos biológicos o muestras de tejidos. Tales análisis pueden usarse para detectar niveles aberrantes de hepcidina-25 y así para diagnosticar trastornos promovidos por hepcidina-25. Más específicamente, la presente invención proporciona procedimientos de diagnosticar un trastorno promovida por hepcidina madura humana en un paciente determinando el nivel de hepcidina madura humana en una muestra de un tejido biológico o de un fluido biológico del paciente y de comparar el nivel de hepcidina madura humana en la muestra con el nivel de hepcidina madura humana en una muestra correspondiente a partir de uno o más individuos control o con un estándar de referencia detectando por lo tanto un trastorno asociado con niveles elevados de hepcidina madura humana. El estado de enfermedad puede comprender una o más de una enfermedad genética o no genética asociada con niveles de hierro sérico, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, y/o hematocrito disminuidos. Preferentemente el estado de enfermedad comprende un o más de un trastorno asociado con anemia.

Se proporciona también un procedimiento de seguimiento de una enfermedad, trastorno o afección promovido por hepcidina madura humana en un paciente. El procedimiento incluye determinar el nivel de hepcidina madura humana en una muestra de un tejido o fluido biológico de un paciente que sufre de, o en riesgo de, una enfermedad, trastorno o afección en un primer punto temporal; determinar del nivel de hepcidina madura humana en una o más muestras de tejido o fluido biológico del paciente en uno o más puntos temporales diferentes; comparar los niveles de hepcidina madura humana determinada en puntos temporales diferentes y seguir de este modo la enfermedad o afección promovida por hepcidina madura humana.

Los anticuerpos selectivos de hepcidina madura humana de la presente invención son particularmente útiles cuando se aplican a los procedimientos de alto rendimiento. Tales procedimientos incluyen procedimientos de micro-chip y microensayo, de tal forma que muchas muestras pueden ponerse a prueba en una microplaca o portaobjetos, o en otro sustrato de ensayos conocido en la técnica.

La presencia de hepcidina madura humana o niveles de la misma en una muestra biológica se pueden establecer combinando la muestra biológica con, por ejemplo, un anticuerpo de la invención en condiciones adecuadas para formar un complejo antígeno-anticuerpo. El anticuerpo está marcado directamente o, más preferentemente, indirectamente con un resto detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Se conoce bien en la técnica una amplia variedad de procedimientos de detección de la formación de inmunocomplejos, por ejemplo, ELISA, RIA, inmunotransferencia (por ejemplo, transferencia por puntos, transferencia en ranura, transferencia de western, etc.), técnicas de inmunofluorescencia indirecta y procedimientos que se basan en la detección de cambios en los parámetros físicos, tales como por ejemplo, SPR y similares. Tales aplicaciones incluyen procedimientos que utilizan un anticuerpo selectivo de hepcidina-25 de la invención conjugado con un resto detectable para detectar hepcidina en una muestra biológica, por ejemplo, en un fluido biológico humano o en un extracto celular o tisular. Los anticuerpos de la invención se pueden usar en tales ensayos con o sin modificación con un resto detectable. Si se modifican con un resto detectable, los anticuerpos de la invención pueden modificarse por la unión covalente o no covalente del resto detectable. Como se usa en el presente documento, el término "detectable" describe una característica de una sustancia (un conjugado, compuesto, o resto) que permite identificar o localizar la sustancia por un detector, usando técnicas analíticas conocidas. Ejemplos representativos de restos detectables incluyen, sin limitación, cromóforos, restos fluorescentes, restos fosforescentes, restos luminiscentes, restos radiactivos, diversas enzimas (tales como fosfatasa alcalina, o peroxidasa de rábano picante), restos magnéticos (por ejemplo, materiales diamagnéticos, paramagnéticos y ferromagnéticos) y agrupaciones de metales pesados, así como cualesquiera otros restos detectables conocidos. La cantidad de un complejo anticuerpo-antígeno formado puede cuantificarse por diversos procedimientos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, medios fotométricos o colorimétricos. Preferentemente, los anticuerpos de la invención se usan sin modificación, es decir, se marcan indirectamente, de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica.

La invención abarca un procedimiento para detectar la proteína hepcidina madura humana en una muestra biológica, que comprende incubar un anticuerpo de la invención con una muestra biológica en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir a dicho anticuerpo unirse a proteínas hepcidina madura humana y detectar dicha unión.

La presente invención también proporciona composiciones, procedimientos y kits para rastrear muestras sospechosas de contener polipéptidos de hepcidina madura humana. Dicho rastreo puede llevarse a cabo en muestras de pacientes, o en muestras de laboratorio sospechosas de contener o producir tal polipéptido. Un kit puede contener un anticuerpo selectivo de hepcidina-25 de la presente invención. El kit puede contener un tampón adecuado y reactivos para detectar una interacción entre una muestra y un anticuerpo selectivo de hepcidina-25 de la presente invención. El reactivo proporcionado puede ser un agente radiomarcado, marcado fluorescentemente o marcado enzimáticamente capaz de unir o de interaccionar con un anticuerpo de la presente invención tal como un anticuerpo de IgG antirratón.

El reactivo del kit puede proporcionarse como una solución líquida, unido a un soporte sólido o como un polvo secado. Cuando el reactivo se proporciona en una solución líquida, preferentemente, la solución líquida es una solución acuosa. Preferentemente, cuando el reactivo proporcionado está unido a un soporte sólido, el soporte sólido puede ser medio cromatográfico, una placa de ensayo puede tener una pluralidad de pocillos, o un portaobjetos de microscopio. Cuando el reactivo proporcionado es un polvo seco, el polvo puede reconstituirse por la adición de un disolvente adecuado, que puede proporcionarse en el kit también.

El kit de la invención se proporciona en un recipiente que incluye generalmente un vial en el que puede situarse el anticuerpo, antígeno o reactivo de la invención y preferentemente puede alicuotarse adecuadamente. Los kits de la presente invención incluirán típicamente también un medio para contener los recipientes de anticuerpos, antígenos y reactivos para venta comercial. Tales recipientes pueden incluir envases de plástico dentro de los que se retienen los viales deseados y uno o más productos químicos necesarios, tales como materiales cromatográficos, disolventes y eluyentes, tubos de ensayo, anticuerpos y productos químicos para la reacción de detección.

Un anticuerpo de la invención se puede usar para diagnosticar un trastorno o enfermedad asociado con la actividad de hepcidina madura. En una manera similar, el anticuerpo de la invención puede usarse en un ensayo para realizar seguimiento de niveles de hepcidina madura en un sujeto tratándose de una afección, enfermedad, o trastorno promovido por hepcidina madura. Tales aplicaciones incluyen procedimientos que utilizan un anticuerpo de la invención y una marca para detectar hepcidina madura en una muestra biológica, por ejemplo, en un fluido corporal humano o en una célula o extracto tisular humano. Los anticuerpos de la invención se pueden usar con o sin modificación y pueden estar marcados por unión covalente o no covalente de un resto detectable.

Se conocen en la técnica una diversidad de protocolos convencionales para medir los niveles de proteína en una muestra biológica, incluyendo por ejemplo, ELISA, RIA y FACS y proporcionan una base para diagnosticar niveles alterados o anormales de expresión de hepcidina humana. Los niveles normales o estándar de hepcidina presentes en una muestra se establecen usando cualquier técnica conocida, por ejemplo, combinando una muestra que comprende un polipéptido de hepcidina maduro con, por ejemplo, un anticuerpo de la invención en condiciones adecuadas para formar un complejo antígeno:anticuerpo. El anticuerpo está marcado directamente o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. La cantidad de un complejo formado estándar se cuantifica por diversos procedimientos, tales como, por ejemplo, medios fotométricos. Las cantidades del polipéptido hepcidina maduro presente en las muestras se comparan después con los valores estándar. Un anticuerpo preferido para usar en los ensayos, kits y procedimientos diagnósticos, pronósticos y/o de seguimiento tiene (i) un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 6 y un polipéptido de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 14; (ii) un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 7 y un polipéptido de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 15; (iii) un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 9 y un polipéptido de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 17; o (iv) un polipéptido de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 8 y un polipéptido de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 16.

Un anticuerpo selectivo de hepcidina-25 aislado de la invención puede usarse en terapia, preferentemente, terapia humana.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención puede usarse para incrementar niveles de hierro sérico, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, y/o hematocrito en un ser humano cuando se administra una cantidad efectiva a un sujeto humano en necesidad de la misma. Además, un anticuerpo de la invención puede ser útil para el tratamiento de afecciones, enfermedades, o trastornos en el que la presencia de hepcidina-25 causa o contribuye a efectos patológicos indeseados o un decrecimiento de niveles de hepcidina-25

o de bioactividad de hepcidina-25 tiene un beneficio terapéutico en sujetos humanos. Tales afecciones, enfermedades o trastornos incluyen, pero no se limitan a, anemia incluyendo, pero no limitada a, anemia resultante de infección, inflamación, enfermedad crónica, y/o cáncer. Los sujetos pueden ser masculinos o femeninos.

La presente invención incluye un procedimiento de incrementar niveles de hierro sérico, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, y/o hematocrito que comprende administrar a un sujeto humano en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de un anticuerpo de la presente invención que se une selectivamente a hepcidina25 humana con una KD de aproximadamente 800 pM o menos. Además, o alternativamente, la presente invención incluye un procedimiento para tratar una enfermedad, afección o trastorno, en un sujeto humano, que se beneficia de un incremento en los niveles de hierro sérico, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, y/o hematocrito, incluyendo, pero no limitados a, anemia, por ejemplo, anemia resultante de infección, inflamación, enfermedad crónica, y/o cáncer. Preferentemente, el sujeto tiene o está en riesgo de tener un nivel de hierro sérico indeseablemente bajo, recuento de reticulocitos bajo, recuento de eritrocitos bajo, hemoglobina baja, y/o hematocrito bajo. Más preferentemente, el sujeto está en riesgo de, o está sufriendo de, anemia incluyendo, pero no limitada a, anemia resultante de infección, inflamación, enfermedad crónica, y/o cáncer. Incluso más preferentemente, el anticuerpo comprende un LCVR que comprende;

i) una LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 41 y 43;

ii) una LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 30, 53, 56, 57, 58 y 76; y

iii) una LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 31, 61 y 60; y una HCVR que comprende;

i) una HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 32, 63, 78 y 79;

ii) una HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 44, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 y 87; y

iii) una HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 46. Incluso más preferentemente, el anticuerpo comprende un polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera que tiene (i) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 6 y 14, respectivamente; (ii) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 7 y 15, respectivamente; (iii) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 9 y 17, respectivamente; o (iv) secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 8 y 16, respectivamente. Lo más preferentemente, el anticuerpo comprende un polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera que tiene las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 8 y 16, respectivamente.

Además, se contempla el uso de un anticuerpo de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de anemia o de al menos uno de los trastornos mencionados anteriormente. Preferentemente, el anticuerpo comprende una LCVR que comprende;

i) una LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 41 y 43;

ii) una LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 30, 53, 56, 57, 58 y 76; y

iii) una LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 31, 61 y 60; y una HCVR que comprende;

i) una HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 32, 63, 78 y 79;

ii) una HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.ºs: 44, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 y 87; y

iii) una HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 46. Más preferentemente, el anticuerpo comprende un polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera que tiene (i) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 6 y 14, respectivamente; (ii) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 7 y 15, respectivamente; (iii) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 9 y 17, respectivamente; o (iv) secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 8 y 16, respectivamente. Lo más preferentemente, el anticuerpo comprende un polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera que tiene las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 8 y 16, respectivamente.

El término "tratando" (o "tratamiento" y "tratar") se usan para referirse a todos los procedimientos en los que puede existir un cierto retraso, interrupción, detención, control, o parada de la progresión de los trastornos descritos en el presente documento, pero no necesariamente indican una eliminación total de todos los síntomas de trastornos. "Tratamiento", como se usa en el presente documento, incluye administración de un compuesto de la presente invención para tratamiento de una enfermedad o afección en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) inhibir progresión adicional de la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (b) aliviar la enfermedad, es decir, causar la regresión de la enfermedad o trastorno o aliviar los síntomas o complicaciones del mismo. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o puede reducirse o aumentarse la dosis proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica.

El término "evitando" (o "evitar" o "prevención") significa prohibir, restringir, o inhibir la incidencia o aparición de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad. Las afecciones de eventos agudos y afecciones crónicas se pueden tratar y evitar. En un evento agudo, se administra un anticuerpo de la invención en la aparición de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad y se abandona cuando termina el evento agudo. En contraste, un síntoma, trastorno, afección, o enfermedad crónica se trata durante un período de tiempo más prolongado.

Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría de tratamiento de acuerdo con la presente invención. Los términos "trastorno", "afección" y "enfermedad" se usan intercambiablemente en el presente documento e incluyen trastornos promovidos por hepcidina madura crónicos y agudos, incluyendo, pero no limitados a, anemia incluyendo, pero no limitada a, anemia de enfermedad crónica, incluyendo, pero no limitada a, anemia resultante de infección, inflamación, y/o cáncer.

Un anticuerpo de la invención se puede incorporar en una composición farmacéutica adecuada para administración a un sujeto humano. Un anticuerpo de la invención se puede administrar a un sujeto humano solo o en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente en dosis individuales o múltiples. Tales composiciones farmacéuticas están diseñadas para ser apropiadas para el modo seleccionado de administración y se usan diluyentes, vehículo, y/o excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de dispersión, tampones, tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad incluyendo pero no limitados a cloruro sódico, agentes estabilizantes y similares según sea apropiado. Dichas composiciones pueden diseñarse de acuerdo con técnicas convencionales reveladas en, por ejemplo, Remington, The Science y Practice of Pharmacy, 19ª Edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 que proporciona un compendio de las técnicas de formulación como se conocen generalmente por los médicos. Los vehículos adecuados para las composiciones farmacéuticas incluyen cualquier material que, cuando se combina con un anticuerpo de la invención, mantenga la actividad de la molécula y sea no reactivo con el sistema inmune del sujeto. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención comprende i) un anticuerpo de la invención, ii) un tampón citrato y iii) cloruro de sodio. Preferentemente, el anticuerpo está presente en una concentración que varía desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 35 mg/ml, citrato está presente en una concentración que varía de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM, cloruro de sodio está presente en una concentración que varía de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM y el pH de la composición está entre aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,2. Más preferentemente, el anticuerpo está presente en una concentración que varía desde aproximadamente 5 mg/ml hasta aproximadamente 30 mg/ml, citrato está presente en una concentración que varía de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM, cloruro de sodio está presente en una concentración que varía de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 300 mM y el pH de la composición está entre aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5. Incluso más preferentemente, el anticuerpo está presente en una concentración que varía de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, el citrato está presente a aproximadamente 10 mM, el cloruro de sodio está presente en una concentración que varía de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 300 mM y el pH de la composición está entre aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-hepcidina-25 de la presente invención se puede administrar a un sujeto en riesgo para o presentando patologías como se describen en el presente documento, por ejemplo, trastornos de anemia, usando técnicas de administración estándar.

La expresión "cantidad efectiva" como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad necesaria (a dosificaciones y durante períodos de tiempo y por los medios de administración) para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad efectiva del anticuerpo puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o parte del anticuerpo para facilitar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad efectiva es también una en la que cualesquiera efectos tóxicos o nocivos del anticuerpo, se compensan por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Una cantidad efectiva es al menos la cantidad mínima, pero menos de una cantidad tóxica, de un agente activo que es necesaria para conferir beneficio terapéutico a un sujeto. Dicho de otro modo, una cantidad efectiva o una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención es una cantidad que en mamíferos, preferentemente seres humanos, (i) incrementa niveles de hierro sérico, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, y/o hematocrito, o (ii) trata un trastorno en el que la presencia de hepcidina madura causa o contribuye a un efecto patológico indeseable, o (iii) un decrecimiento en niveles de hepcidina madura o en la actividad de hepcidina madura da como resultado un efecto terapéutico beneficioso en un mamífero, preferentemente un ser humano, incluyendo, pero no limitado a, anemia incluyendo, pero no limitada a, anemia de enfermedad crónica, incluyendo, pero no limitada a, anemia resultante de infección, inflamación, y/o cáncer. Una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención se puede administrar en una dosis única o en dosis múltiples. Además, una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención se puede administrar en dosis múltiples de cantidades que serían menos de una cantidad efectiva si no se administrasen más de una vez.

Como se conoce bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para cualquier sujeto dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del sujeto, el área de la superficie corporal, la edad, el compuesto concreto a administrarse, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se estén administrando simultáneamente. La dosis puede variar adicionalmente dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 200 mg; preferentemente, de aproximadamente 2 mg a aproximadamente 200 mg; más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 200 mg; incluso más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg, incluso más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg; incluso más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 20 mg; incluso más preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 15 mg; sin embargo, se prevén dosis por debajo o por encima de este intervalo ejemplar, especialmente teniendo en cuenta los factores mencionados

anteriormente. Un régimen de dosificación parenteral diario puede ser desde aproximadamente 10 μg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, preferentemente desde aproximadamente 25 μg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, más preferentemente desde aproximadamente 50 μg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 100 μg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, incluso más preferentemente desde aproximadamente 200 μg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 300 μg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 400 μg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, incluso más preferentemente desde aproximadamente 500 μg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 600 μg/kg hasta aproximadamente 20 μg/kg, desde aproximadamente 700 μg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 800 μg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 900 μg/kg hasta

aproximadamente 20 mg/kg, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 2 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 4 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 6 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 7 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg y todavía más preferentemente, desde aproximadamente 8 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg. La evolución se puede seguir por evaluación periódica y las dosis se pueden ajustar de acuerdo con ello.

Estas cantidades sugeridas de anticuerpo están sometidas a una gran cantidad de discreción terapéutica. El factor clave para seleccionar una dosis adecuada y programarla es el resultado obtenido. Los factores para tomar en cuenta en este contexto incluyen el trastorno particular que se esté tratando, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del anticuerpo, el tipo particular del anticuerpo, el procedimiento de administración, la programación de administración y otros factores conocidos por los practicantes médicos.

La vía de administración de un anticuerpo de la presente invención puede ser oral, parenteral, por inhalación, o tópica. Preferentemente, los anticuerpos de la invención se pueden incorporar en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal, o intraperitoneal. Se prefiere la administración parenteral por inyección intravenosa o intraperitoneal o subcutánea. La inyección subcutánea es la más preferida. Los vehículos adecuados para tales inyecciones son bien conocidos en la técnica.

La composición farmacéutica típicamente debe ser estéril y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento en el envase proporcionado, incluyendo, por ejemplo, un vial sellado, jeringuilla u otro dispositivo de administración, por ejemplo, una pluma. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse por filtración después de hacer la formulación, o pueden hacerse microbiológicamente aceptables de otra manera.

Ejemplos

Ejemplo 1: Producción de hepcidina-25 humana

La hepcidina-25 puede obtenerse de fuentes comerciales (por ejemplo, Peptide International (Louisville, Kentucky)) o puede producirse por una diversidad de técnicas de síntesis o recombinantes conocidas en la técnica. Alternativamente, una proteína de fusión que comprende los veinticinco aminoácidos de secuencia de hepcidina-25 humana y que tiene la secuencia como se muestra en SEC ID N.º: 95 se expresa en E. coli. Los cuerpos de inclusión se aíslan a partir de 3 litros de E. coli que expresan la proteína de fusión de hepcidina humana después de 3-6 horas con IPTG 1 mM a 37 °C. Los cuerpos de inclusión se solubilizan en tampón A (Tris 50 mM y urea 8 M (pH 8,0)). El sobrenadante se pasa sobre una columna IMAC (20 ml de resina). La columna se lava con tampón A hasta que la absorbancia volvió al valor basal y los polipéptidos unidos se eluyeron de la columna por imidazol 0,5 M en tampón A. La proteína de fusión hepcidina-25 se reune y se reduce con DTT 50 mM. Esta proteína de fusión se volvió a plegar después diluyendo material almacenado en urea 2 M, cisteína 3 mM, Tris 50 mM (pH 8,0) hasta una concentración final de proteína de menos de 50 μg/ml. Este material se agita a temperatura ambiente y se oxida al aire durante 48 horas. Los polipéptidos oxidados se hacen pasar sobre una columna IMAC (20 ml) a una velocidad de flujo de 5 ml/min y la proteína de fusión de hepcidina-25 humana se eluye por lotes a partir de la columna por imidazol 0,5 M en tampón A. Las fracciones reunidas que contienen la proteína de fusión de hepcidina-25 se concentran y se hacen pasar por una columna por tamaño Superdex 75 (GE Healthcare, XK26/60) equilibrada con Tris 50 mM, urea 4 M, pH 8,0, a un caudal de 3 ml/min. La proteína de fusión monomérica se agrupa y después se diluye con Tris 50 mM, urea 2M, CaCl2 5 mM, pH 8,0 y después se escinde con enterocinasa produciendo hepcidina25 humana de SEC ID N.º: 1. La proteína de fusión de hepcidina-25 humana no escindida se elimina por cromatografía IMAC pasiva (como se señaló anteriormente). El flujo a través de la columna IMAC se hace pasar después sobre una columna en fase inversa C-18 a una velocidad de flujo de 4,0 ml/minuto. La columna se lava con TFA al 0,1 % en agua hasta que la absorbancia volvió al valor basal y los polipéptidos unidos se eluyen de la columna con un gradiente lineal de ACN del 20 % al 40 % con TFA al 0,1 % a una velocidad del 0,5 %/minuto. Las fracciones que contienen el polipéptido hepcidina-25 humano se almacenan y analizan por secuenciación de aminoácidos N-terminal y por espectrometría de desorción láser ayudada por matriz/espectrometría de masas con ionización (MALDI-EM). Los polipéptidos que codifican hepcidina-25 de rata, ratón y macaco y diversas formas truncadas N-terminalmente de hepcidina-25 humana que incluyen hepcidina-22 y hepcidina-20 se obtuvieron comercialmente (por ejemplo, Peptide International).

Ejemplo 2: Medidas de unión de afinidad de Fab y Mab anti-hepcidina-25

Para medir las cinéticas y afinidad de unión puede usarse un biosensor de resonancia de plasmón superficial tal como el BIAcore® T100 puede usarse midiendo cinéticas de unión y afinidad de los anticuerpos revelados en el presente documento. El sistema BIAcore® utiliza las propiedades ópticas de SPR detectando alteración en 5 concentración de proteínas de moléculas que interaccionan con una matriz de biosensor de dextrano. Salvo mención expresa de lo contrario, todos los reactivos y materiales se adquirieron de BIAcore® AB (Upsala, Suecia). Todas las mediciones se llevaron a cabo a 25 °C. Las muestras se disuelven en tampón HBS-EP (cloruro de sodio 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P-20 al 0,05 % (p/v) y HEPES 10 mM, pH 7,4). Para capturar Fab con kappa humana, se inmoviliza kappa anti-humano de cabra en células de flujo 1 a 4 de un chip sensor CM5 a un nivel de 5000-10000 10 unidades de respuesta (Rus) usando un kit de acoplamiento de amina. Para capturar Mab con IgG1 de ratón, se inmoviliza Fc gamma de anti-ratón de cabra en las células de flujo 1 a 4 de un chip sensor CM5 a un nivel de 500010000 Rus usando un kit de acoplamiento de amina. Para capturar anticuerpos con IgG4 humana se inmoviliza proteína A en las células de flujo 1 a 4 de un chip sensor CM4 a un nivel de 400-700 Rus usando un kit de acoplamiento de amina. Se evaluaron Fab preparados a partir de periplasma de E. coli y Mabs preparados a partir 15 de cultivos de células de mamífero usando múltiples ciclos analíticos. Cada ciclo constó de las etapas siguientes: inyección de 0,3-2 minutos de un Fab o un Mab a ~10 μl/minuto encaminadas a una captura de 200-1000 Rus, inyección de 2 minutos a 50 μl/minuto de diversas concentraciones de hepcidina-25 humana (desde 600 nM a 0,1 nM) obtenidas como se describe en el Ejemplo 1 anterior seguido por 2-10 minutos para disociación y regeneración usando 30 μl de clorhidrato de glicina 10 mM, pH 1,5. Las mediciones se obtuvieron a 25 °C y las velocidades de

20 asociación y disociación para cada ciclo se evaluaron usando un modelo de unión "1:1 con transferencia de masas" en el software BIAevaluation.

Los parámetros de unión de hepcidina-25 humanos de Fab JXB7 de ratón y ciertos Fab anti-hepcidina manipulados humanos se muestran en la tabla 5. La afinidad de unión de hepcidina-25 humana (KD) de los otros Fab manipulados humanos enumerados en la tabla 3 se determinó que estaba entre 214 pM y aproximadamente 54 pM con cada una

25 de ellas teniendo una tasa koff de hepcidina-25 entre aproximadamente 7,68 x 10-4s-1 y aproximadamente 2,22 x 104s-1. Por lo tanto, se identificaron los Fab anti-hepcidina manipulados humanos que tienen una KD para hepcidina-25 humana hasta 52 veces más baja que aquella de Fab JXB7 de ratón. Los Fab anti-hepcidina manipulados humanos mostrados en la tabla 5 comprenden los marcos conservados 02 y VH1-69 de las cadenas ligeras y pesadas de la línea germinal humana, respectivamente.

30 Tabla 5: propiedades de unión a hepcidina-25 humana

Fab

Kon (M1, s1) Koff (s-1) Kd (M)

JXB7

2,49E + 06 6,98E -03 2,80E -9

Hu22

7,05E + 06 4,56E -03 6,47E -10

1.7

3,80E + 06 1,48E -03 4,22E -05

3.12

3,94E + 06 3,47E -04 8,83E -11

3.23

3,53E + 06 2,78E -04 7,88E -11

Los parámetros de unión a hepcidina-25 humana del Mab JXB7 de ratón y ciertos Mab anti-hepcidina manipulados humanos de ratón se muestran en la tabla 6. Por lo tanto, se identificaron Mab anti-hepcidina manipulados humanos que tienen una afinidad de unión (KD) para hepcidina-25 hasta aproximadamente 33 veces más baja que aquella de

35 Mab JXB7 de ratón. Las regiones constantes de cadena para Mab JXB7 y 31B2 son IgG1 de ratón. Las regiones constantes de cadena pesada para las otras Mab en la Tabla 6 fueron IgG4 humana (SEC ID N.º: 94).

Tabla 6: unión a hepcidina-25 humana

Mab

Kon (M-1, s-1) Koff (s-1) KD cinética (M)

JXB7

3,70E + 07 7,37E -03 1,99E -9

31B2

1,89E + 06 1,27E -04 7,52E -11

Hu22

1,09E + 07 8,64E -03 7,64E -10

3.23

6,20E + 06 6,59E -04 9,94E -11

3.8

5,58E + 06 7,68E -04 1,05E -10

L1.5

5,31E + 06 1,82E -04 3,42E -11

3.12

3,68E + 06 2,20E -04 5,99E -11

Los parámetros de unión de hepcidina-25 de macaco y de hepcidina-25 de ratón de diversos Mab anti-hepcidina manipulados humanos se muestran en las tablas 7 y 8, respectivamente. La unión a hepcidina-25 de rata fue

5 indetectable para Mabs Hu22, 3.23 y 3.8. Generalmente, los Mab Hu22 y 3.23 han mostrado tener una KD para hepcidina de macaco madura que era comparable a aquella de hepcidina-25 humana. Sin embargo, se mostró que Mab 3.8 tiene una KD para hepcidina-25 de macaco por encima de 10 veces menos que para hepcidina-25 humana. Por otro lado, se mostró que los Mab Hu22, 3.23, y 3.8 tienen una KD mucho más baja para hepcidina-25 humana que para hepcidina-25 de ratón.

10 Tabla 7: unión a hepcidina-25 de macaco

Mab

Kon (M-1, s-1) Koff (s-1) KD cinética (M)

Hu22

8,13E + 06 8,16E -03 9,86E -10

3.23

6,51E + 06 5,77E -04 8,88E -11

3.8

7,07E + 07 6,60E -04 9,33E -12

Tabla 8: unión a hepcidina-25 de ratón

Mab

Kon (M-1, s-1) Koff (s-1) KD cinética (M)

Hu22

1,62E + 06 1,26E -01 7,76E -08

3.23

3,83E + 06 1,92E -01 5,01E -08

3.8

3,57E + 06 1,24E -01 3,46E -08

Ejemplo 3: Ensayo basado en células para internalización y degradación de ferroportina inducidas por 15 hepcidina

Para medir la actividad de neutralización de Mab dirigidos contra hepcidina humana se puede usar un ensayo

basado en células in vitro se puede usar . Un ensayo basado en células in vitro útil para medir la actividad de

neutralización de los anticuerpos de la presente invención se basa en internalización y degradación inducida por

hepcidina de su receptor, ferroportina. Brevemente, se preparó una línea celular estable HEK 293 que permite la 20 expresión inducible de ferroportina (FPN). FPN se condensó C-terminalmente con proteína fluorescente verde (GFP)

para propósitos de seguimiento. La expresión inducible de la molécula FPN-GFP se controló usando el sistema T-

REx, un sistema de expresión regulado por tetraciclina comercialmente disponible sin transactivadores víricos

(Invitrogen, Carlsbad, CA). La secuencia de codificación FPN-GFP se clona en el vector pCDNA4/TO, que contiene

un promotor inducible y un marcador de resistencia a zeozina. La construcción resultante se transfectó en células T25 REx-293 que expresan la proteína reguladora requerida para la expresión inducible de doxiciclina. Los clones

resistentes a zeocina se probaron para la expresión inducible de FPN-GFP. Las condiciones de crecimiento celular

fueron esencialmente como se describen en el manual de instrucciones del fabricante para el Sistema T-REx.

Brevemente, las células se cultivaron en DMEM, FBS dializado al 10 %, FAC (citrato de amonio férrico) 20 μM, más 5 µg/ml de penicilina-estreptomicina. La selección se mantiene con 100 µg/ml de zeocina y con 5 µg/ml de blasticidina. Las células se aplican sobre placas negras/transparentes de 96 pocillos que estaban revestidas con poli-D-lisina. Se usó un lector de placa fluorescente de alta resolución para leer la fluorescencia total por pocillo.

5 Esencialmente el ensayo se lleva a cabo como sigue: tras tripsinización, se sembró una placa de 96 pocillos con

9.000 células/pocillo usando la línea celular estable FPN-GFP/TREx 293. El volumen de siembra por pocillo fue de 80 μl. Se dejó que las células se unieran durante toda una noche. Temprano a la mañana siguiente, se añadieron a cada pocillo 9 μl de 30 ng/ml de doxiciclina induciendo expresión FPN-GFP. Esta inducción se deja tener lugar durante 8 horas. Después de la inducción, se aspiraron los medios y los pocillos se lavaron cuidadosamente con 120

10 μl/pocillo de PBS. Es importante eliminar todo el líquido de cada pocillo ya que cualesquiera medios remanentes continuarán induciendo expresión de FPN-GFP.

Los tratamientos deseados se montaron en un formato de 96 pocillos para adición rápida a una placa de ensayo después de lavar. El volumen de ensayo final por pocillo fue de 45 μl. Inmediatamente después de añadir los tratamientos, la placa de ensayo se leyó usando el lector de placa fluorescente de alta resolución (ajustado a 550 15 voltios en el canal 1). Esta lectura es la lectura de la hora 0 y se usa para normalizar el número de células por pocillo, que correlaciona con las FLU totales por pocillo. Internalización inducida por hepcidina-25 induce la internalización y degradación máximas de ferroportina a 0,5 μM. La CI50 para hepcidina-25 humana fue aproximadamente 8 nM. Para ensayos de neutralización de anticuerpos anti-hepcidina, la concentración de hepcidina-25 humana se mantuvo en 100 nM y los anticuerpos anti-hepcidina se corrieron a diluciones 2x desde 0,5

20 μM a 8 nM. Las placas se incubaron durante 24 horas, después de lo cual, se leyeron de nuevo y los datos se generaron como la proporción de unidades de fluorescencia totales (FLU) por pocillo en 24 horas divididas por FLU totales por pocillo a 0 horas.

En este ensayo in vitro, la bioactividad de hepcidina-25 humana se neutralizó con diversos Mab anti-hepcidina con una CI50 que se mide como se muestra en la tabla 9.

25 Tabla 9. Actividad de neutralización in vitro de Mab manipulados humanos anti-hepcidina-25

Mab

CI50 (nM) ± error estándar (n > 4)

3.23

59,1 ± 1,2

3.12

62,2 ± 5,9

3.6

54,6 ± 1,5

3.9

51,1 ± 1,8

Hu22

163 ± 12,4

Ejemplo 4: La administración de anticuerpos monoclonales anti-hepcidina eleva los niveles de hierro sérico en macacos tratados subcutáneamente con interleucina-6

La actividad de anticuerpos anti-hepcidina sobre desregulación de hierro sérico inducida por IL-6 en macacos se 30 puede determinar como se describe más adelante.

Brevemente, se administran anticuerpos anti-hepcidina a macacos machos a 1 y 10 mg/kg como un bolo i.v. Aproximadamente una hora después de la administración de anticuerpos, los animales reciben una administración subcutánea simple de IL-6 humana a 5 µg/kg. Las muestras de sangre se recogieron a -1 horas (antes de la dosificación de anticuerpos), 0 horas (inmediatamente antes de dosis IL-6) y a 1, 3, 6, 12, 24, 48, 96, 168, 336, 504 y

35 672 horas después del tratamiento de IL-6. Preferentemente, cada grupo de tratamiento consta de al menos 3 animales. Los niveles de hierro sérico se pueden medir por cualquier procedimiento conocido en la técnica que se considera generalmente dentro de la comunidad médica como que es un procedimiento aceptable midiendo niveles de hierro sérico.

Tabla 10. Inhibición de Mab anti-hepcidina de decrecimientos inducidos por IL-6 en niveles de hierro sérico en macacos

Grupo

n.º de machos Artículos de prueba/control Vía de la dosis Nivel de dosis objetivo Concentración de dosis objetivo Dosis objetivo Volumen (ml/kg)

1

3 PBS 1X PBS 1X con rHSA I.V. S.C. 0 mg/kg 0 µg/kg 0 mg/ml 0 µg/ml 3,3 1

2

3 PBS 1X IL-6* I.V. S.C. 0 mg/kg 5 µg/kg 0 mg/kg 5 µg/ml 3,3 1

3

3

Hu22 IL-6* I.V. S.C. 1 mg/kg 5 µg/kg 0,3 mg/ml 5 µg/ml 3,3 1

4

3 Hu22 IL-6* I.V. S.C. 10 mg/kg 5 µg/kg 3 mg/ml 5 µg/ml 3,3 1

5

3 3.23 IL-6* I.V. S.C. 1 mg/kg 5 µg/kg 0,3 mg/ml 5 µg/ml 3,3 1

6

3 3.23 IL-6* I.V. S.C. 10 mg/kg 5 µg/kg 3 mg/ml 5 µg/ml 3,3 1

*Todas las dosis de IL-6 se administran en un vehículo constituido por PBS 1X que contiene 0,1 mg/ml de seroalbúmina humana recombinante. S.C. Inyección subcutánea; dada por medio de sitio de inyección 1. I.V. Intravenosa; dada como una inyección dentro de la vena safena.

En comparación con el grupo de control de PBS, el tratamiento de IL-6 humana produce una reducción transitoria de

5 niveles de hierro sérico, alcanzando una concentración mínima a las 12 horas después del tratamiento con IL-6. La administración intravenosa de Hu22 y 3.23 a 10 mg/kg aproximadamente 1 hora antes de la dosis de IL-6 humana evita la caída de niveles de hierro debida a tratamiento de IL-6 y los resultados en un incremento en hierro sérico de aproximadamente el 52 % y el 108 %, respectivamente, a las 3 a 6 horas tras el tratamiento de IL-6. Después de alcanzar los niveles de pico, las concentraciones de hierro sérico disminuyen posteriormente en estos dos grupos y

10 alcanzan niveles similares a aquellos de otros grupos en 24 horas. Tanto Hu22 (p < 0,01, 3 y 6 horas) como 3.23 (p < 0,01, 3, 6 y 12 horas) a 10 mg/kg, producen incrementos estadísticamente significativos de concentraciones de hierro sérico con respecto al grupo IL-6 con tratamiento de PBS. En contraste, ni Hu22 ni 3.23 a 1 mg/kg, dan lugar a diferencias estadísticamente significativas en los niveles de hierro sérico comparados con el control. Por lo tanto, estos resultados demuestran que los anticuerpos de la presente invención serán útiles en el tratamiento de la

15 anemia que resulta de bioactividad de hepcidina madura.

Ejemplo 5: Determinación de selectividad de anticuerpos anti-hepcidina usando MALDI-TOF

La diagnosis de rutina clínica de biomarcadores se basa mayoritariamente en técnicas inmunológicas, cuantitativas por ejemplo, ELISA. Estos procedimientos son a menudo no aplicables para antígenos pequeños o para isoformas de antígenos (Sparbier, K., International Meeting of the Association of Biomolecular Resource Facilities, Salt Lake

20 City, Cartel V28-S, (2008); y Gutiérrez, J.A., y cols., (2005)).

El Mab 31B2 anti-hepcidina humana se conjugó con resina 6MB de sefarosa activada por CNBr (GE healthcare, Piscataway, NJ) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, la resina de sefarosa se lavó con HCl 1 mM tres veces y el anticuerpo se diluyó en tampón de acoplamiento (NaHCO3 100 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,3). Aproximadamente se usó 1,7 mg de anticuerpo para conjugación a 4 °C durante una noche para cada mg de resina. 25 El anticuerpo en exceso se retiró por lavado por tampón de acetato 0,1 M a pH 4. Aproximadamente 100 ml de

muestra de suero humano se incubó con 0,8 ml de esta resina de sefarosa-31B2 a 4 °C. Después de incubación durante toda una noche, la mezcla de resina/suero se envasó en una columna y se lavó con 10-20 volúmenes de columna de fosfato de sodio 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,4. La columna se lavó con 5-10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 10 mM pH 7,4 sin NaCl. Finalmente, la columna se eluyó con TFA al 0,2 %. Las fracciones eluidas se analizaron determinando los pesos moleculares en un instrumento Voyager-DE STR (Applied Biosystems, Foster City, CA) en modo lineal.

Para pesos moleculares más pequeños que el de la hepcidina-25 humana, el espectro de masas se generó usando una matriz peptídica. Se identificó un pico dominante correspondiente a la hepcidina-25 humana, (2.790 daltons). Fueron también detectables los picos menos dominantes para diversas formas truncadas de hepcidina, a saber hepcidina-24 (2.674 daltons), hepcidina-22 (2.436 daltons) y hepcidina-20 (2.192 daltons).

Para pesos moleculares más grandes que el de la hepcidina-25 humana, el espectro de masas se generó usando una matriz proteica. Un pico correspondiente a la hepcidina-25 humana (25 aa, 2.790 daltons) identificadó aún, pero no fue detectable ningún pico correspondiente a prepro-hepcidina (84 aa, 9.400 daltons) o pro-hepcidina (60 aa,

6.929 daltons).

Así, los inmunoensayos usando el Mab 31B2 y versiones manipuladas humanas del mismo son selectivos para hepcidina-25 humana, la forma más fisiológicamente relevante de hepcidina en suero humano, activa, según se compara con las formas precursoras y truncadas N-terminalmente de la misma que se sabe que existen en el suero humano.

Ejemplo 6: Corrección de ayuste críptico de ARNm que codifica anticuerpos anti-hepcidina-25 tras expresión en células CHO

Pueden usarse las técnicas de biología molecular estándar para preparar los vectores de expresión recombinantes, transfectar las células huésped, seleccionar transformantes, aislar líneas de células huésped capaces de expresar un anticuerpo de la invención, cultivar las células huésped y recuperar los anticuerpos expresados a partir del medio de cultivo. Sorprendentemente, después de la producción de los Mab 3.12 y 3.23 por cultivos de suspensión de células de ovario de hámster chino (CHO) usando un sistema de expresión de glutamina sintetasa (GS) recombinante (Lonza Biologics, Inc., Slough, Reino Unido), se observó nivel inusualmente alto de agregación de anticuerpo-proteína (~15 % y ~30 %, como se mide por cromatografía de exclusión por tamaño, respectivamente). Sin embargo, no se observó un nivel alto de agregación cuando los dos Mabs se expresaron de forma transitoria en células HEK-293 de origen humano. El examen de los ARNm de cada una de las dos líneas celulares de CHO reveló la presencia de transcritos de tamaños inesperados, sugiriendo que las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas anticuerpos de Mab 3.12 y 3.23 fueron susceptibles a eventos de ayuste críptico. Adicionalmente, un examen de las muestras de proteínas agregadas reveló la presencia de truncación en la proteína de cadena ligera. La secuenciación de ADNc preparado a partir de ARNm aislado a partir de células CHO que expresan Mab 3.12 y 3.23 confirmó la presencia de intrones crípticos en los genes de cadena ligera. El donante de ayuste estaba contenido en los codones que codifican los residuos de aminoácidos R/VS de LC CDR1 (aminoácidos 5-7 de SEC ID N.º: 43 y "/" denota el empalme de ayuste, en fase). Además, se encontró un punto de ramificación probable en los codones que codifican los residuos de aminoácidos LI de FRL2 (SEC ID N.º: 40) con una extensión de poli-pirimidina probable en los codones que codifican los residuos de aminoácidos STL y SPL en la LCDR2 de Mab 3.12 y 3.23, respectivamente. Y por último, los sitios de aceptor se identificaron en los codones que codifican los residuos de aminoácidos C/Q/Q en LCDR3 de ambos Mab 3.12 y 3.23 (aminoácidos de SEC ID N.º: 61; "/" denota los empalmes de ayuste probables).

Las secuencias de ADN originales que codifican las cadenas ligeras de Mab 3.12 y 3.23 (SEC ID N.ºs: 153 y 155, respectivamente) se modificaron subsiguientemente eliminando las secuencias que confieren el donante de ayuste, el punto de ramificación, el aceptor y el tracto de poli-pirimidina al ión críptico. Más específicamente, el sitio donante se cambió de GCC GTA AGT a AGA GTC TCC (SEC ID N.º: 45). El punto de ramificación se cambió de CTG ATC a CTC ATC (SEC ID N.º: 162); el tracto de polipirimidina de TCC ACC CTG a AGC CCN CTG (SEC ID N.º: 77) y de TCC CCC CTG a AGC CCA CTG (SEC ID N.º: 78) en 3.12 y 3.23, respectivamente; y los aceptores de TGT CAG CAG TGG a TGC CAA CAA TGG (SEC ID N.º: 100).

De acuerdo con ello, la expresión subsiguiente de las cadenas ligeras de Mab 3.12 y 3.23 se efectuó por vectores de expresión recombinantes que albergan las secuencias de ADN modificadas como se muestran en SEC ID N.ºs: 12 y 13, respectivamente. La cantidad de anticuerpo agregado producido tras la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos modificados en células CHO se determinó que fue el 1 % o menos tanto para el Mab 3.12 como para el Mab 3.23.

Asimismo se esperaría que las modificaciones en las secuencias de ADN que codifican las cadenas ligeras de diversos otros anticuerpos de la presente invención serían de gran beneficio ya que el donante de ayuste, el tracto de polipirimidina y los aceptores de ayuste son a partir del codón que codifica LCDR que da especificidad al anticuerpo. El punto de ramificación está en FRL2 y la secuencia LLIY está altamente conservada en marcos conservados de cadena ligera. Además, el motivo QQ, cuya secuencia de nucleótidos codificante abarca la región aceptora de ayuste identificada, se conserva dentro de la LCDR3 de muchos de los mAb anti-hepcidina de la invención. En general, muchas secuencias de línea germinal de cadena ligera contienen uno o ambos codones Q (CAG) que pueden servir como el aceptor de intrones crípticos potenciales.

Listado de secuencias

<110> Cai, YuPing A. Gately, Dennis P. He, Luhong Leung, Donmienne D.M. Luan, Peng Swanson, Barbara A. Witcher, Derrick R.

<120> ANTICUERPOS ANTI-HEPCIDINA Y USOS DE LOS MISMOS

<130> X-17737

<150> 60/984910

<151> 2-1-2.007

<160> 162

<170> pATENTiN VERSION 3.4

<210> 1

<211> 25

<212> PROTEÍNA

<213> HOMO SAPIENS

<400> 1

<210> 2

<211> 1329

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 2

<210> 3

<211> 1329

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 3

<210> 4

<211> 1329

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 4

<210> 5

<211> 1329

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 5

<210> 6

<211> 443

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 6 35

<210> 7

<211> 443

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 7

<210> 8

<211> 443

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 8

<210> 9

<211> 443

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 9

<210> 10

<211> 645

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 10

10 <210> 11

<211> 645

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

15 <400> 11

<210> 12

<211> 645

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 12

<210> 13

<211> 645

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 13

10

<210> 14

<211> 215

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

15

<400> 14

<210> 15

<211> 215

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 15

<210> 16

<211> 215

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 16

<210> 17

<211> 215

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 17

<210> 18

<211> 25

<212> PROTEÍNA

<213> VACA

<400> 18

10 <210> 19

<211> 25

<212> PROTEÍNA

<213> CERDO

15 <400> 19

<210> 20 20 <211> 25

<212> PROTEÍNA

<213> MONO

<400> 20 25

<210> 21

<211> 25

<212> PROTEÍNA

<213> PERRO

<400> 21

<210> 22

<211> 25

<212>

PROTEÍNA 15 <213> RATÓN

<400> 22

<210> 23

<211> 25

<212> PROTEÍNA

<213> RATA

<400> 23

<210> 24

<211> 17

<212>

PROTEÍNA 10 <213> SINTÉTICA

<400> 24

15

<210> 25

<211> 571

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

20

<400> 25

<210> 26

<211> 12

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 26

<210> 27

<211> 10

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 27

<210> 28

<211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 28 <210> 29

<211> 10

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 29

<210> 30

<211> 7

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 30

<210> 31

<211> 9

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 31

<210> 32

<211> 10

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA <400> 32

5

<210> 33

<211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

10

<400> 33

15 <210> 34

<211> 61

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

20 <400> 34

<210> 35

<211> 25

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400> 35

<210> 36

<211> 14

<212> PROTEÍNA 15 <213> HUMANA

<400> 36

<210> 37

<211> 32

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400> 37

10

<210> 38

<211> 11

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

15

<400> 38

20 <210> 39

<211> 23

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

25 <400> 39

<210> 40

<211> 15

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400> 40

<210> 41

<211> 12

<212>

PROTEÍNA 15 <213> SINTÉTICA

<400> 41

<223> Xaa en posición 3 = Glu o Ser

<400> 42

<210> 43

<211> 12

<212>

PROTEÍNA 10 <213> SINTÉTICA

20

<210> 42

<211> 12

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

25

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (3)..(3)

<400> 43

15

<210> 44

<211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

20

<400> 44

25 <210> 45

<211> 9

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 45 agagtctcc 9

<210> 46 5 <211> 8

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 46 10

<210> 47

<211> 8 15 <212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 47

<210> 48

<211> 12

<212> PROTEÍNA 25 <213> SINTÉTICA

<400> 48

<210> 49

<211> 12

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 49

10

<210> 50

<211> 12

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

15

<400> 50

20 <210> 51

<211> 12

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

25 <400> 51

<210> 52

<211> 12

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (2)..(2)

<223> Xaa en posición 2 = Ala, Leu o Ile

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (3)..(3)

<223> Xaa en posición 3 = Ser o Gly

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa en posición 3 = Arg o Ser

<400> 52

<210> 53

<211> 7

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 53 <210> 54

<211> 7

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 54

<210> 55

<211> 7

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 55

<210> 56

<211> 7

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 56

<210> 57

<211> 7

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA <400> 57

5

<210> 58

<211> 7

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

10

<400> 58

15 <210> 59

<211> 7

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

20 <400> 59

<210> 60 25 <211> 7

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<220> 30 <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa en posición 4 = Thr, Pro, o Ala

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa en posición 5 = Leu o Gly

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (6)..(6)

<223> Xaa en posición 6 = Ala, Thr o VaI

<400> 60

<210> 61

<211> 9

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 61

<210> 62

<211> 9

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (9)..(9)

<223> Xaa en posición 4 = Thr o Val

<400> 62

<210> 63

<211> 10

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 63

<210> 64

<211> 10

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 64

<210> 65

<211> 10

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222>

(5)..(5) 5 <223> Xaa en posición 5 = Thr, Trp, Tyr o Leu

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222>

(10)..(10) 10 <223> Xaa en posición 10 = Ser o Glu

<400> 65

15

<210> 66

<211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

20

<400> 66

25 <210> 67

<211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

30 <400> 67

<210> 68 5 <211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 68 10

<210> 69

<211> 17 15 <212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 69

<210> 70

<211> 17

<212> PROTEÍNA 25 <213> SINTÉTICA

<400> 70

5 <210> 71

<211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

10 <220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (8)..(8)

<223> Xaa en posición 8 = Asp, Thr, Leu o Val

15 <220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (9)..(9)

<223> Xaa en posición 9 = Thr o Ala

20 <400> 71

<210> 72 25 <211> 8

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 72

<210> 73

<211> 8

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 73

<210> 74

<211> 8

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 74

<210> 75

<211> 8

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (3)..(3)

<223> Xaa en posición 3 = Thr o Phe

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa en posición 5 = Ser o Ala

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (7)..(7)

<223> Xaa en posición 7 = Asp o Pro

<400> 75

<210> 76

<211> 7

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa en posición 4 = Pro o Thr

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (6)..(6)

<223> Xaa en posición 6 = Ala, Thre, o Leu

<400> 76 <210> 77

<211> 9

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 77 agcacactg 9

<210> 78

<211> 9

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 77 agccatg 9

<210> 79

<211> 9

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (3)..(3)

<223> Xaa en posición 3 = Thr o Glu

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa en posición 5 = Leu o Thr

<400> 79

<210> 80

<211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 80

<210> 81

<211> 17

<212> PROTEÍNA 15 <213> SINTÉTICA

<400> 81

20

<210> 82

<211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

25

<400> 82

<210> 83 5 <211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 83 10

<210> 84

<211> 17 15 <212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 84

<210> 85

<211> 17

<212> PROTEÍNA 25 <213> SINTÉTICA

<400> 85

<210> 86 5 <211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 86 10

<210> 87

<211> 17 15 <212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA DIVERSA 20 <222> (8)..(8)

<223> Xaa en posición 8 = Val o Asp

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA DIVERSA 25 <222> (10)..(10)

<223> Xaa en posición 10 = Asn, Lys o Arg

<220>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA

<222> (12)..(12)

<223> Xaa en posición 12 = Val, Leu o Thr, o Asn

<400> 87

<210> 88 10 <211> 9

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 88 15

<210> 89

<211> 107 20 <212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400> 89

<210> 90

<211> 329

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400> 90

<210> 91

<211> 329

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400> 91

<210> 92

<211> 325

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400> 92

<210> 93

<211> 326

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 93

<210> 94

<211> 326

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 94

<210> 95

<211> 97

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 95

10

<210> 96

<211> 32

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

15

<400> 96

<210> 97

<211> 10

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400> 97

10

<210> 98

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> RATÓN

15

<400> 98

<210> 99

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400> 99

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 100 10 tgccaacaat gg 12

<210> 101

<211> 108

<212> PROTEÍNA 15 <213> SINTÉTICA

<400> 101

<210> 102

<211> 107

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 102 <210> 103

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 103 <210> 104

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 104 <210> 105

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 105

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400>

106 10

<210> 107

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 107

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400>

107 10

<210> 109

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 109

<210> 110

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 110

<210> 111

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 111

<210> 112

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 112

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400>

113 10

<210> 114

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 114

<210> 115

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 115

<210> 116

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 116

<210> 117

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 117

<210> 118

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 118

<210> 119

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 119

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400>

120 10

<210> 121

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 121

<210> 122

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 122

<210> 123

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 123

<210> 124

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 124

<210> 125

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 125

<210> 126

<211> 108

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 126

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400>

127 10

<210> 128

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 128

<210> 129

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 129

<210> 130

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 130

<210> 131

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 131

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400>

132 10

<210> 133

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 133

<210> 134

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 134

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400>

135 10

<210> 136

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 136

<210> 137

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 137

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400>

138 10

<210> 139

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 139

<210> 140

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 140

<210> 141

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 141

<210> 142

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 142

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400>

143 10

<210> 144

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 144

<210> 145

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 145

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400>

146 10

<210> 147

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 147

<210> 148

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 148

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400>

149 10

<210> 150

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 150

<210> 151

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 151

<210> 152

<211> 117

<212> PROTEÍNA

<213> SINTÉTICA

<400> 152

<210> 153

<211> 645

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 153

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400>

154 10

<210> 155

<211> 645 15 <212> ADN

<213> SINTÉTICO

<400> 155

<210> 156

<211> 32

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400> 156

<210> 157

<211> 25

<212>

PROTEÍNA 15 <213> HUMANA

<400> 157

<210> 158

<211> 32

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400> 158

<210> 159

<211> 23

<212>

PROTEÍNA 15 <213> HUMANA

<400> 159

<210> 160

<211> 32

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

<400> 160

5

<210> 161

<211> 32

<212> PROTEÍNA

<213> HUMANA

10

<400> 161

15 <210> 162

<211> 6

<212> ADN

<213> SINTÉTICO

20 <400> 162 ctcatc

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo aislado que une hepcidina-25 humana con una KD de 800 pM o menos determinada por resonancia de plasmón superficial (SPR) a 25 °C y comprende seis CDR seleccionados del grupo constituido por:

   (i)

   LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 52, 60, 62, 65, 71 y 75, respectivamente;

   (ii)

   LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 42, 76, 62, 79, 87 y 46, respectivamente;

   (iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 41, 53, 31, 63, 84 y 46, respectivamente;

   (iv)

   LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 30, 31, 32, 44 y 46, respectivamente;

   (v)

   LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 53, 61, 63, 85 y 46, respectivamente; y

   (vi)

   LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 57, 61, 63, 84 y 46, respectivamente.

2. 2.

   El anticuerpo de la reivindicación 1, teniendo el anticuerpo una KD para hepcidina-25 humana entre 400 pM y 30 pM determinada por SPR a 25 °C.

3. 3.

   El anticuerpo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, teniendo el anticuerpo una KD para hepcidina-25 humana entre 200 pM y 30 pM determinada por SPR a 25 °C.

4. 4.

   El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, teniendo el anticuerpo una CI50 entre 100 nM y 50 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25, midiendo dicho ensayo internalización y/o degradación de ferroportina inducida por hepcidina.

5. 5.

   El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, teniendo el anticuerpo una CI50 entre 100 nM y 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25, midiendo dicho ensayo un decrecimiento en niveles de hierro sérico inducido por IL-6.

6. 6.

   El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, siendo el anticuerpo un anticuerpo manipulado humano.

7. 7.

   El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en el que el marco conservado de la región variable de la cadena ligera está seleccionado entre 02, 018, o L12.

8. 8.

   El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el marco conservado de la región variable de la cadena pesada está seleccionado entre VH1-69, VH1-18, o VH1-46.

9. 9.

   El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR) en la que (i) la HCVR y la LCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 148 y 126, respectivamente; (ii) la HCVR y la LCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 128 y 127, respectivamente; (iii) la HCVR y la LCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 150 y 124, respectivamente; o

   (iv) la HCVR y la LCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 151 y 125, respectivamente.

10. 10.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen (i) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 6 y 14, respectivamente; (ii) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 7 y 15, respectivamente; (iii) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 9 y 17, respectivamente; o (iv) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 8 y 16, respectivamente.

11. 11.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que comprende dos polipéptidos de cadena pesada y dos polipéptidos de cadena ligera y en la que cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 8 y cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 16.

12. 12.

    Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

13. 13.

    El polinucleótido de la reivindicación 12 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.ºs: 14, 15, 16, o

14. 17.

15. 14.

    El polinucleótido de la reivindicación 12 que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en SEC 5 ID N.º: 12 o 13.

16. 15.

    Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

17. 16.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para usar en terapia.

18. 17.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para usar en el tratamiento y/o prevención de 10 anemia.

19. 18.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para usar en incrementar niveles de hierro sérico, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, o hematocrito en un sujeto.

20. 19.

    Un inmunoensayo que comprende a) obtener una muestra para someterla a ensayo para hepcidina madura humana; b) poner en contacto la muestra con un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones

    15 1-11 en condiciones adecuadas para la unión de anticuerpo y dejar que cualquier hepcidina madura humana presente forme un complejo con el anticuerpo; y c) detectar la presencia o ausencia del complejo; y/o determinar la cantidad del complejo en la muestra por un procedimiento de inmunodetección.
21. 20. El inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el procedimiento de inmunodetección es un enzimoensayo inmunosorbente (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo de inmunohistoquímica (IHC), un

    20 ensayo de inmunofluorescencia (IF), un ensayo de aglutinación, un ensayo de transferencia de western, un ensayo de transferencia por puntos, un ensayo de transferencia en ranura o un procedimiento de detección de resistencia de plasmón superficial.

    Masa (m/z)

    Picos:

    1.

    Hepcidina-25: P.M. 2.790

22. 2.

    Hepcidina-24: P.M. 2.674

23. 3.

    Hepcidina-22: P.M. 2.436

24. 4.

    Hepcidina-20: P.M. 2.192

    FIGURA 1

    Masa (m/z)

    Picos:

    1.

    Hepcidina-25 (25 aa): P.M. 2.790

25. 2.

    Pro-hepcidina (60 aa): P.M. 6.929

    FIGURA 2

    A. Secuencia de aminoácidos de marco conservado de cadena ligera humana O2 con residuos de CDR interdispersos

    B. Secuencia de aminoácidos de un marco conservado de cadena pesada humana VH1-69 con residuos de CDR interdispersos

    FIGURA 3

    A. Secuencia de aminoácidos de marco conservado de cadena ligera humana O18 con residuos de CDR interdispersos

    B. Secuencia de aminoácidos de un marco conservado de cadena pesada humana VH1-18 con residuos de CDR interdispersos

    (SEC ID N.º: 157) (SEC ID N.º: 36)

    (SEC ID N.º: 158)

    (SEC ID N.º: 38)

    Los residuos diferentes de los residuos de O2 están en negrita y subrayados.

    A. Secuencia de aminoácidos de marco conservado de cadena ligera humana

    L12 con residuos de CDR interdispersos

    FIGURA 4

    B. Secuencia de aminoácidos de un marco conservado de cadena pesada humana VH1-46 con residuos de CDR interdispersos

    Los residuos diferentes de los residuos de O2 están en negrita y subrayados.

    FIGURA 5