ES2759622T3 - Anticuerpos anti-Dps y dispositivos de prueba para la detección de bacterias del género Campylobacter - Google Patents

Anticuerpos anti-Dps y dispositivos de prueba para la detección de bacterias del género Campylobacter Download PDF

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Abstract

Anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH), en el que dicha VL comprende polipéptidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3, y VH comprende polipéptidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en el que LCDR1 es SASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 1), LCDR2 es RTSNLAS (SEQ ID NO: 2), LCDR3 es QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 3), HCDR1 es GFSLTSSGVH (SEQ ID NO: 4), HCDR2 es VIWRGGSTDYNAAFMS (SEQ ID NO: 5) y HCDR3 es NYYYGTSPDYFDY (SEQ ID NO: 6), y se une específicamente a la proteína de unión de ADN de células privadas de nutrientes (Dps) de Campylobacter coli y/o Campylobacter jejuni.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-Dps y dispositivos de prueba para la detección de bacterias del género Campylobacter Campo técnico
La presente invención puede incluirse en el campo de diagnóstico. Específicamente, la presente invención proporciona un anticuerpo que es específico para la proteína de unión de ADN de células privadas de nutrientes (Dps) de bacterias del género Campylobacter y un hibridoma que produce dicho anticuerpo. El anticuerpo puede usarse en un dispositivo de prueba inmunocromatográfico y en un método para detectar bacterias del género Campylobacter.
Antecedentes de la técnica
En humanos, del 85% al 95% de infecciones por la especie Campylobacter implican Campylobacter jejuni, mientras que Campylobacter coli está implicada en la mayoría de los otros casos. C. jejuni es una de la causas más comunes de intoxicación alimentaria en los Estados Unidos y en Europa. La gran mayoría de casos se producen como acontecimientos aislados, no como parte de brotes reconocidos. La vigilancia activa a través de la Red de Vigilancia Activa de Enfermedades (FoodNet) indica que cada año se diagnostican aproximadamente 14 casos por cada 100.000 personas en la población. La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria estimó en 2011 que había aproximadamente nueve millones de casos de campilobacteriosis humana por año en la Unión Europea.
La intoxicación alimentaria causada por la especie Campylobacter puede ser gravemente debilitante, pero rara vez pone en peligro la vida. Se ha relacionado con el desarrollo posterior del síndrome de Guillain-Barré, que se desarrolla normalmente de dos a tres semanas después de la enfermedad inicial. Los individuos con infecciones recientes por C. jejuni desarrollan el síndrome de Guillain-Barré a una velocidad de 0,3 por 1000 infecciones, aproximadamente 100 veces más frecuente que la población general.
Por tanto, actualmente existe la necesidad de detectar especies del género Campylobacter. Los dispositivos previos para la detección de Campylobacter jejuni en muestras de heces han implicado el uso de dispositivos de prueba inmunocromatográficos que detectan una proteína de superficie de Campylobacter jejuni (documento JP5467228B2; documento JP 2009077658 (A); Granato et al., 2010. Comparison of Premier CAMPY Enzyme Immunoassay (EIA), ProSpecT Campylobacter EIA, and Immuno Card STAT! CAMPY test with culture for laboratory diagnosis of Campylobacter enteric infections. J. Clin. Microb. 4022-4027). Sin embargo, los dispositivos de detección actuales pueden carecer de especificidad, lo que produce falsos positivos (Bessede et al., 2011. New Methods for Detection of Campylobacters in Stool samples in comparation to culture. J. Clin. Microb. 941-944; Couturier et al., 2003. Detection of non-jejuni and Campylobacter species from stool specimens with an immunochromatographic antigen detection assay. J. Clin Microbiol. (6):1935-7). Además, estos dispositivos pueden carecer de sensibilidad.
Existe la necesidad de un dispositivo de prueba que produzca menos falsos positivos y que sea más sensible que los dispositivos de prueba actualmente disponibles. Mediante el uso de un anticuerpo que se une a la proteína de unión de ADN de células privadas de nutrientes (Dps) de C. jejuni y C. coli, los inventores de la presente solicitud han desarrollado un dispositivo de prueba que produce menos falsos positivos y es más sensible que otros dispositivos actualmente disponibles.
Hua Piao et al, 2010 [Hua Piao et al, 2010. Tissue Binding Patterns and In Vitro Effects of Campylobacter jejuni DNA-Binding Protein from Starved Cells. Neurochemical Research 36(1):58-66. DOI: 10.1007/s11064-010-0263-7] y el documento WO 2008/008092 divulgan anticuerpos monoclonales anti-proteína de unión de ADN de células privadas de nutrientes (Dps), pero no divulgan el anticuerpo reivindicado en la presente invención que se define con precisión por sus secuencias de aminoácidos VL y VH.
Figuras
Figura 1: diagrama del dispositivo de prueba inmunocromatográfico. A) Vista panorámica del dispositivo de prueba inmunocromatográfico en forma de una tira. El dispositivo de prueba comprende los siguientes elementos: un material (1) absorbente, una membrana (2) de soporte con una sección (3) de detección y una sección (4) de control, una sección (5) de adición de muestra y una sección (6) del dispositivo que comprende el anticuerpo marcado. La flecha indica la dirección del flujo. B) Vista lateral del dispositivo de prueba inmunocromatográfico en forma de una tira. El dispositivo de prueba comprende además un soporte (7) de plástico. (c) Vista lateral en ángulo del dispositivo de prueba inmunocromatográfico.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Dps, un hibridoma que produce el anticuerpo de la presente invención y un dispositivo de prueba inmunocromatográfico que comprende: (a) un primer anticuerpo que se une específicamente a Dps, (b) un segundo anticuerpo que se une específicamente a Dps, y (c) una membrana de soporte, en el que el primer anticuerpo está inmovilizado en la membrana de soporte y el segundo anticuerpo está marcado. Además, la presente invención proporciona un método para detectar bacterias del género Campylobacter en una muestra aislada que comprende poner en contacto la muestra con el dispositivo de prueba de la presente invención, el uso del anticuerpo de la presente invención para la detección de bacterias del género Campylobacter y el uso del anticuerpo de la presente invención para la fabricación de un dispositivo de prueba de inmunoensayo.
Descripción detallada de la invención
Anticuerpo
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Dps.
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una proteína que comprende al menos una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. El término anticuerpo incluye, por ejemplo, anticuerpos maduros de cadena completa y fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo puede incluir una secuencia de dominio variable de cadena pesada (H) (abreviada en el presente documento como VH), y una secuencia de dominio variable de cadena ligera (L) (abreviada en el presente documento como VL). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos secuencias de dominio variable de cadena pesada (H) y dos secuencias de dominio variable de cadena ligera (L), formando de ese modo dos sitios de unión a antígeno, tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Fd, Fd', Fv, anticuerpos de cadena sencilla (scFv, por ejemplo), anticuerpos de dominio variable único, diacuerpos (Dab) (bivalentes y biespecíficos) y anticuerpos quiméricos (por ejemplo, humanizados), que pueden producirse mediante la modificación de anticuerpos completos o aquellos sintetizados de novo usando tecnologías de ADN recombinante. Estos fragmentos de anticuerpo funcionales retienen la capacidad para unirse selectivamente con su respectivo antígeno o receptor. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pueden ser de cualquier clase de anticuerpos, incluyendo, pero no limitados a, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, y de cualquier subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) de anticuerpos. Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser monoclonales o policlonales. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, injertado con CDR o generado in vitro. El anticuerpo puede tener una región constante de cadena pesada elegida de, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. El anticuerpo también puede tener una cadena ligera elegida de, por ejemplo, kappa o lambda. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de diacuerpo (dAb), que consiste en un dominio VH; (vi) un dominio variable camélido o camelizado; (vii) un Fv de cadena sencilla (scFv), véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883); (viii) un anticuerpo de dominio único. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se seleccionan para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
El término “anticuerpo” incluye moléculas intactas. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden alterarse, por ejemplo, mutarse, para modificar las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, para aumentar o disminuir uno o más de: unión al receptor de Fc, glicosilación del anticuerpo, el número de residuos de cisteína, la función de la célula efectora o función del complemento).
Las moléculas de anticuerpo también pueden ser anticuerpos de dominio único. Los anticuerpos de dominio único pueden incluir anticuerpos cuyas regiones determinantes de complementariedad forman parte de un polipéptido de dominio único. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de cadena pesada, anticuerpos naturalmente desprovistos de cadenas ligeras, anticuerpos de dominio único derivados de anticuerpos convencionales de 4 cadenas, anticuerpos modificados por ingeniería genética y andamiajes de dominio único distintos a los derivados de anticuerpos. Los anticuerpos de dominio único pueden ser cualquiera de la técnica, o cualquier anticuerpo de dominio único futuro. Los anticuerpos de dominio único pueden derivarse de cualquier especie, incluyendo, pero sin limitarse a, ratón, humano, camello, llama, pez, tiburón, cabra, conejo y bovino. Según otro aspecto de la divulgación, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único que se produce de manera natural conocido como anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. Tales anticuerpos de dominio único se divulgan en el documento WO 9404678, por ejemplo. Por motivos de claridad, este dominio variable derivado de un anticuerpo de cadena pesada naturalmente desprovisto de cadena ligera se conoce en el presente documento como VHH o nanocuerpo para distinguirlo de la VH convencional de inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Una molécula de VHH de este tipo puede derivarse de anticuerpos generados en la especie Camelidae, por ejemplo en camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco. Otras especies además de Camelidae pueden producir anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadena ligera.
Las regiones VH y VL pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, denominadas “regiones determinantes de complementariedad” (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas “regiones de entramado” (FR o FW).
La extensión de la región de entramado y las CDR se ha definido con precisión por varios métodos (véanse, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departmento de Salud y Servicios Sociales de los Estados Unidos, publicación NIH n.° 91-3242; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol.196:901-917; y la definición de AbM usada por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, en general, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer- Verlag, Heidelberg).
Los términos “región determinante de complementariedad” y “CDR”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones variables de anticuerpos que confieren especificidad de antígeno y afinidad de unión. En general, existen tres CDR en cada región variable de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, Hc DR3) y tres CDR en cada región variable de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3). Los límites precisos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada pueden determinarse usando cualquier de los esquemas bien conocidos, incluyendo los descritos por Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeración de “Kabat”), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (esquema de numeración de “Chothia”). Tal como se usa en el presente documento, las CDR definidas según el esquema de números de “Chothia” también se denomina a veces “bucles hipervariables”.
El término “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad de unión única y afinidad para un epítopo particular. Un anticuerpo monoclonal puede elaborarse mediante tecnología de hibridoma o mediante métodos que no usan tecnología de hibridoma (por ejemplo, métodos recombinantes). El anticuerpo del mismo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. En otras realizaciones, el anticuerpo puede producirse de manera recombinante, por ejemplo, producirse mediante visualización de fagos o mediante métodos combinatorios. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
La visualización de fagos y los métodos combinatorios para generar anticuerpos se conocen en la técnica (tal como se describe en, por ejemplo, Ladner et al. patente estadounidense n.° 5.223.409; Kang et al. publicación internacional n.° WO 92/18619; Dower et al. publicación internacional n.° WO 91/17271; Winter et al. publicación internacional WO 92/20791; Markland et al. publicación internacional n.° WO 92/15679; Breitling et al. publicación internacional WO 93/01288; McCafferty et al. publicación internacional n.° WO 92/01047; Garrard et al. publicación internacional n.° WO 92/09690; Ladner et al. publicación internacional n.° WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982.
En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano (por ejemplo, un anticuerpo elaborado en un ratón que se ha modificado genéticamente por ingeniería para producir un anticuerpo a partir de una secuencia de inmunoglobulina humana), o un anticuerpo no humano, por ejemplo, un anticuerpo de roedor (ratón o rata), cabra, primate (por ejemplo, mono), camello. Preferiblemente, el anticuerpo no humano es un roedor (anticuerpo de ratón o rata). Los métodos de producción de anticuerpos de roedor se conocen en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse usando ratones transgénicos que portan los genes de inmunoglobulina humana en lugar del sistema de ratón. Los esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el antígeno de interés se usan para producir hibridomas que secretan Acm humanos con afinidades específicas para epítopos a partir de una proteína humana (véanse, por ejemplo, Wood et al. solicitud internacional WO 91/00906, Kucherlapati et al. publicación PCT WO 91/10741; Lonberg et al. solicitud internacional WO 92/03918; Kay et al. solicitud internacional 92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326).
Un anticuerpo puede ser uno en el que la región variable, o una parte de la misma, por ejemplo, las CDR, se generan en un organismo no humano, por ejemplo, una rata o un ratón. Los anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados están dentro la invención. Los anticuerpos generados en un organismo no humano, por ejemplo, una rata o un ratón, y luego modificados, por ejemplo, en la región constante o de entramado variable o, para disminuir la antigenicidad en un humano están dentro la invención.
Los anticuerpos quiméricos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica (véanse Robinson et al., publicación de patente internacional PCT/US86/02269; Akira, et al., solicitud de patente europea 184.187; Taniguchi, M., solicitud de patente europea 171.496; Morrison et al., solicitud de patente europea 173.494; Neuberger et al., solicitud internacional WO 86/01533; Cabilly et al. patente estadounidense n.° 4.816.567; Cabilly et al., solicitud de patente europea 125.023; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res.47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al., 1988, J. Natl Cáncer Inst.80:1553-1559).
Un anticuerpo humanizado o injertado con CDR tendrá al menos una o dos, pero generalmente las tres, CDR receptoras (de cadenas de inmunoglobulina pesada y/o ligera) reemplazadas con una CDR donante. El anticuerpo puede reemplazarse con al menos un parte de una CDR no humana o sólo algunas de las CDR pueden reemplazarse con CDR no humanas. Sólo es necesario reemplazar el número de CDR requeridas para la unión del anticuerpo humanizado a Dsp. Preferiblemente, el donante será un anticuerpo de roedor, por ejemplo, un anticuerpo de rata o ratón, y el receptor será una región de entramado humana o una región de entramado consenso humana. Normalmente, la inmunoglobulina que proporciona las CDR se denomina el “donante” y la inmunoglobulina que proporciona la región de entramado se denomina el “aceptor”. En una realización, la inmunoglobulina donante es una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, roedor). La región de entramado aceptora es una región de entramado que se produce de manera natural (por ejemplo, una humana) o una región de entramado consenso, o una secuencia aproximadamente el 85% o superior, preferiblemente el 90%, el 95%, el 99% o superior idéntica a la misma.
Tal como se usa en el presente documento, el término “secuencia consenso” se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) que se producen con mayor frecuencia en una familia de secuencias relacionadas (véase por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987)). En una familia de proteínas, cada posición en la secuencia consenso está ocupada por el aminoácido que se produce con mayor frecuencia en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos se producen con una misma frecuencia, cualquiera puede incluirse en la secuencia consenso. Un “entramado consenso” se refiere a la región de entramado en la secuencia consenso de la inmunoglobulina.
Un anticuerpo puede humanizarse mediante métodos conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207, por Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214, y por Queen et al. Documentos US 5.585.089, US 5.693.761 y US 5.693.762.
Los anticuerpos humanizados o injertados con CDR pueden producirse mediante injerto de CDR o sustitución de CDR, en los que se reemplazan una, dos o todas las CDR de una cadena de inmunoglobulina. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense 5.225.539; Jones et al. 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534; Beidler et al.1988 J. Immunol.141:4053-4060; Winter documento US 5.225.539. Winter describe un método de injerto de CDR que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invención (solicitud de patente británica g B 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; Winter documento US 5.225.539). También están dentro del alcance de la invención anticuerpos humanizados en los que se han sustituido, delecionado o añadido aminoácidos específicos. Los criterios para seleccionar aminoácidos a partir del donante se describen en el documento US 5.585.089, por ejemplo, columnas 12-16 del documento US 5.585.089, por ejemplo, columnas 12-16 del documento US 5.585.089. Otras técnicas para humanizar anticuerpos se describen en Padlan et al. documento EP 519596 A1, publicado el 23 de diciembre de 1992.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo de cadena sencilla. Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) puede diseñarse por ingeniería genética (véanse, por ejemplo, Colcher, D. et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880:263-80; y Reiter, Y. (1996) Clin Cancer Res 2:245-52). El anticuerpo de cadena sencilla puede dimerizarse o multimerizarse para generar anticuerpos multivalentes que tienen especificidades para diferentes epítopos de la misma proteína diana. En aún otras realizaciones, el anticuerpo tiene una región constante de cadena pesada elegida de, por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE; particularmente, elegida de, por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada (por ejemplo, humanas) de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En otra realización, el anticuerpo tiene una región constante de cadena ligera elegida de, por ejemplo, las regiones constantes de cadena ligera (por ejemplo, humanas) de kappa o lambda. La región constante puede alterarse, por ejemplo, mutarse, para modificar las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, para aumentar o disminuir uno o más de: unión al receptor de Fc, glicosilación del anticuerpo, el número de residuos de cisteína, la función de la célula efectora o función del complemento). En una realización, el anticuerpo tiene función efectora y puede fijar el complemento. En otras realizaciones, el anticuerpo no recluta células efectoras o fija el complemento. En otra realización, el anticuerpo tiene capacidad reducida o nula para unirse a un receptor de Fc. Por ejemplo, es un isotipo o subtipo, fragmento u otro mutante, que no admite la unión a un receptor de Fc, por ejemplo, tiene una región de unión al receptor de Fc mutagenizada o delecionada.
Los métodos para alterar una región constante de anticuerpo se conocen en la técnica. Los anticuerpos con función alterada, por ejemplo, afinidad alterada para un ligando efector, tal como FcR en una célula o el componente C1 del complemento, pueden producirse reemplazando al menos un residuo de aminoácido en la parte constante del anticuerpo con un residuo diferente (véanse, por ejemplo, el documento EP 388.151 A1, la patente estadounidense n.° 5.624.821 y la patente estadounidense n.° 5.648.260. Pueden describirse tipos de alteraciones similares que, si se aplican a la inmunoglobulina murina o de otra especie, reducirían o eliminarían estas funciones.
Un anticuerpo puede derivatizarse o unirse a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Tal como se usa en el presente documento, una molécula de anticuerpo “derivatizado” es una que se ha modificado. Los métodos de derivatización incluyen, pero no se limitan a, la adición de un resto fluorescente, un radionucleótido, una toxina, una enzima o un ligando de afinidad tal como biotina. Por consiguiente, las moléculas de anticuerpo de la invención pretenden incluir formas derivatizadas y modificadas de otro modo de los anticuerpos descritos en el presente documento, incluyendo moléculas de inmunoadhesión. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo puede unirse de manera funcional (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares distintas, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o un péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o parte de anticuerpo con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).
Un tipo de molécula de anticuerpo derivatizado se produce reticulando dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los agentes de reticulación incluyen los que son heterobifuncionales, que tiene dos grupos claramente reactivos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifunccionales (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Tales agentes de reticulación están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, III.
Una molécula de anticuerpo puede conjugarse con otra entidad molecular, normalmente un marcador o un agente o resto terapéutico (por ejemplo, un citotóxico o citostático). Los isótopos radiactivos pueden usarse en aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Tales isótopos radiactivos incluyen, pero no se limitan a, yodo (131I o 125I), itrio (90Y), lutecio (177Lu), actinio (225Ac), praseodimio, ástato (211At), renio (186Re), bismuto (212bí o 213Bi), indio (111In), tecnecio (99 mTc), fósforo (32P), rodio (188Rh), azufre (35S), carbono (14C), tritio (3H), cromo (51Cr), cloro (36CI), cobalto (57Co o 58Co), hierro (59Fe), selenio (75Se) o galio (67Ga). Los radioisótopos útiles como marcadores, por ejemplo, para su uso en diagnóstico, incluyen yodo (131I o 125I), indio (111In), tecnecio (99mTc), fósforo (32P), carbono (14C) y tritio (3H), o uno o más de los isótopos terapéuticos enumerados anteriormente. La invención proporciona moléculas de anticuerpo radiomarcadas y métodos de marcado de las mismas. En una realización, se divulga un método de marcado de una molécula de anticuerpo. El método incluye poner en contacto una molécula de anticuerpo, con un agente quelante, para producir de ese modo un anticuerpo conjugado. El anticuerpo conjugado está radiomarcado con un radioisótopo, por ejemplo, indio-111, itrio-90 y lutecio-177, para producir de ese modo una molécula de anticuerpo marcada.
El término “Dps” o “proteína de unión de ADN de células privadas de nutrientes” se refiere a una proteína de la superfamilia de ferritina que puede caracterizarse por las entradas con el número de registro Q0P891 (C. jejuni) y/o A0A0Q2JBU3 (C. coli) en la base de datos UniProtKB. Dps preferiblemente se refiere a la Dps de C. jejuni y/o la Dps de C. coli.
En una realización preferida, el anticuerpo no produce ninguna señal en un inmunoensayo tipo sándwich en ausencia de Dps y/o el anticuerpo puede detectar menos de 3 ng/ml de Dps cuando se usa en un inmunoensayo tipo sándwich. Preferiblemente, el inmunoensayo tipo sándwich es un ensayo inmunocromatográfico. Más preferiblemente, los dos anticuerpos usados en el inmunoensayo tipo sándwich son el anticuerpo de la presente invención. En la tabla 1 de los ejemplos, CL30Camp en combinación con CL30Camp no produce ruido de fondo cuando se aplica una muestra que comprende PBS BSA al 0,1% al dispositivo de prueba inmunocromatográfico. En las tablas 2 y 3 de los ejemplos, se muestra que el dispositivo de prueba inmunocromatográfico detecta menos de 3 ng/ml de Dps de C. jejuni y C. coli.
En una realización preferida, el anticuerpo puede detectar menos de 3 ng/ml de Dps cuando se usa en un inmunoensayo tipo sándwich, preferiblemente un ensayo inmunocromatográfico. Preferiblemente, el anticuerpo puede detectar menos de 2 ó 1,5 ng/ml de Dps. Más preferiblemente, el anticuerpo puede detectar menos de 1 ng/ml de Dps.
En una realización preferida, el anticuerpo se obtiene o puede obtenerse inmunizando un animal con Dps nativa o recombinante. En una realización alternativa, el anticuerpo se obtiene o puede obtenerse inmunizando un animal con un inmunogen que comprende SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 12. En una realización preferida, el anticuerpo se une específicamente a SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID No : 12.
SEQ ID NO: 11 es la Dps de C. jejuni y tiene la siguiente secuencia:
MSVTKQLLQMQADAHHLWVKFHNYHWNVKGLQFFSIHEYTEKAYEEMAELFDSCAERVLQLGEK AITCQKVLMENAKSPKVAKDCFTPLEVIELIKQDYEYLLAEFKKLNEAAEKESDTTTAAFAQENIAKY EKSLWMIGATLQGACKM SEQ ID NO: 12 es la Dps de C. coli y tiene la siguiente secuencia:
MSVTKQLLQMQADAHHLWVKFHNYHWNVKGLQFYSIHEYTEKAYEEMAELFDNCAERALQLGEK AITCQKTLMENAKSPKVEKDCFTPVEVMELIKKDYEYLLAEFKKLNEEAEKASDTTTAAFAQENIAK YEKSLWMLASVLQNTCKM
En una realización preferida, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH), en el que dicha VL comprende polipéptidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3, y VH comprende polipéptidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en el que LCDR1 es SASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 1), LCDR2 es RTSNLAS (SEQ ID NO: 2), LCDR3 es QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 3), HCDR1 es GFSLTSSGVH (SEQ ID NO: 4), HCDR2 es VIWRGGSTDYNAAFMS (SEQ ID NO: 5) y HCDR3 es NYYYGTSPDYFDY (SEQ ID NO: 6).
SEQ ID NO: 7 es el fragmento de VL presente en CL30Camp y tiene la siguiente secuencia:
ENVLTQSPAIMAASLGQKVTMTCSASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKPLIHRTSNLASGVPARFSG SGSGTSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPFTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 8 es el fragmento de VH presente en CL30Camp y tiene la siguiente secuencia:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSSGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGSTDYNAAF MSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQPDDTAIYYCAKNYYYGTSPDYFDYWGQGTTLTVSS
En una realización preferida, el anticuerpo comprende una VL y una VH, en el que la VL es SEQ ID NO: 7 y la VH es SEQ ID NO: 8.
SEQ ID NO: 9 es la LC presente en CL30Camp y tiene la siguiente secuencia:
ENVLTQSPAI MAASLGQKVTMTCSASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKPLIHRTSNLASGVPARFSG SGSGTSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGA SWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCE ATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO: 10 es la HC presente en CL30Camp y tiene la siguiente secuencia:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSSGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGSTDYNAAF MSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQPDDTAIYYCAKNYYYGTSPDYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPS VYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPS STWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCV VVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSA AFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYK NTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
En una realización preferida, el anticuerpo comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), y la LC es SEQ ID NO: 9 y la HC es SEQ ID NO: 10. En una realización preferida, el anticuerpo comprende dos LC y dos HC, en el que las lC son SEQ ID NO: 9 y las HC son SEQ ID NO: 10.
El anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal.
El anticuerpo anti-Dps puede estar marcado. El marcado puede realizarse usando cualquier método habitual. La sustancia de marcado usada para marcar es preferiblemente una partícula insoluble. Los ejemplos de partículas adecuadas incluyen: partículas de polímero sintético coloreadas obtenidas mediante el marcado con moléculas de colorante de polímeros sintéticos tales como látex, polietileno, polipropileno, poliestireno, un copolímero de estirenobutadieno, poli(cloruro de vinilo), poli(acetato de vinilo), poliacrilamida, polimetacrilato, un copolímero de estirenometacrilato, poli(metacrilato de glicidilo) y un copolímero de dimetacrilato de acroleína-etilenglicol; partículas metálicas coloidales (oro, plata, cobre, hierro, platino, paladio, y una mezcla de los mismos (por ejemplo, una mezcla de oro y platino, una mezcla de oro y plata, y una mezcla de paladio y platino)); y glóbulos rojos. Preferiblemente, la partícula permite que un cambio se compruebe fácil y rápidamente mediante inspección visual. Las partículas de polímero sintético coloreadas o partículas metálicas coloidales pueden usarse para este fin. Las partículas tienen un tamaño de partícula de, por ejemplo, de 15 a 400 nm, preferiblemente de 100 a 400 nm para partículas de polímero sintético coloreadas, o de 30 a 80 nm para partículas metálicas coloidales. Las partículas metálicas coloidales pueden ser productos comercialmente disponibles, o pueden prepararse usando un método habitual.
En el caso de marcado con partículas metálicas coloidales, se añaden normalmente de 0,1 a 100 mg, preferiblemente de 0,5 a 20 mg de anticuerpo anti-Dps a 1 l de una disolución de partículas metálicas coloidales (normalmente, una absorbancia de aproximadamente 2,0 a 540 nm), y la mezcla se refrigera, o se agita a temperatura ambiente durante de 5 minutos a 24 horas. Después del bloqueo con albúmina sérica bovina (BSA; normalmente de 0,01 a 10 g, preferiblemente de 0,1 a 2 g), se centrifuga la disolución, y el precipitado resultado se obtiene como anticuerpos anti-Dps marcados con las partículas metálicas coloidales.
En una realización preferida, el anticuerpo está marcado con una partícula de polímero sintético coloreada y/o una partícula metálica coloidal. Preferiblemente, la partícula de polímero sintético coloreada comprende poliestireno. Dispositivo de prueba inmunocromatográfico
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo de prueba inmunocromatográfico que comprende: (a) un primer anticuerpo que se une específicamente a Dps, (b) un segundo anticuerpo que se une específicamente a Dps, y (c) una membrana de soporte, en el que el primer anticuerpo está inmovilizado en la membrana de soporte y el segundo anticuerpo está marcado.
Tal como se usa en el presente documento, el término “inmovilizar” se refiere a la unión de un anticuerpo en un soporte tal como una membrana de manera que el anticuerpo ya no puede moverse de su posición en el soporte. El primer anticuerpo es un anticuerpo de captura, y constituye una sección de detección al estar inmovilizado en el soporte. Tal como se usa en el presente documento, “sección de detección” se refiere a un sitio en el que la presencia de un antígeno se detecta capturando el antígeno de muestra que está unido a o se une al segundo anticuerpo.
La membrana de soporte puede ser de cualquier material que permita que el primer anticuerpo se inmovilice a través de interacciones electrostáticas, interacciones hidrófobas o acoplamiento químico, y en la que sustancias tales como la muestra y el segundo anticuerpo puedan moverse al sitio de detección. Los ejemplos de membranas de soporte adecuadas incluyen nitrocelulosa, poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) y acetato de celulosa.
En una realización preferida, la membrana de soporte comprende una sección de control para comprobar si la muestra se ha desarrollado de manera apropiada. Una sustancia que puede unirse a una sustancia de control se inmoviliza en la sección de control. Las ubicaciones de la sección de detección y la sección de control en el soporte no están particularmente limitadas. Normalmente, la sección de control está aguas abajo de la sección de detección. En el dispositivo de prueba de la presente invención, una muestra líquida que cae sobre la sección de adición de muestra del dispositivo se mueve hacia una sección del dispositivo que comprende el segundo anticuerpo, y la mezcla de la muestra y el anticuerpo marcado migra a través de la membrana de soporte, y la señal se desarrolla en el sitio de detección (véase la figura 1A). El antígeno y el anticuerpo marcado forman un inmunocomplejo cuando la muestra contiene Dps. En la sección de detección, el primer anticuerpo captura el complejo a través de una interacción antígeno-anticuerpo, y el conjugado se acumula y desarrolla color. A continuación, la presencia o ausencia de antígeno en la muestra puede determinarse mediante comprobación visual del grado del color en la sección de detección. Cuando el soporte tiene una sección de control, el dispositivo de prueba puede comprender además una sustancia marcada de control en o adyacente a la sección del dispositivo que comprende el segundo anticuerpo. La sustancia marcada de control puede capturarse mediante una sustancia que se une a la sustancia marcada de control en la sección de control, y la sustancia marcada de control se acumula y desarrolla color. Cuando el segundo anticuerpo también se usa como sustancia marcada de control, el segundo anticuerpo residual que no formó un complejo con el antígeno en la muestra pasa a través del sitio de detección, y se captura mediante una sustancia que está inmovilizada en la sección de control aguas abajo. El anticuerpo marcado se acumula y desarrolla color.
En una realización, el primer anticuerpo es el anticuerpo de la presente invención, es decir, una cualquiera de las realizaciones de anticuerpo divulgadas previamente. En una realización alternativa, el segundo anticuerpo es el anticuerpo de la presente invención. En una realización preferida, tanto el primer como el segundo anticuerpo son el anticuerpo de la presente invención. Más preferiblemente, el primer y el segundo anticuerpo comprenden una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH), en los que dicha VL comprende polipéptidos de LCDR1, LCDr2 y LCDR3, y VH comprende polipéptidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en los que LCDR1 es SASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 1), LCDR2 es RTSNLAS (SEQ ID NO: 2), LCDR3 es QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 3), HCDR1 es GFSLTSSGVH (SEQ ID NO: 4), HCDR2 es VIWRGGSTDYNAAFMS (SEQ ID NO: 5) y HCDR3 es NYYYGTSPDYFDY (SEQ ID nO: 6). Incluso más preferiblemente, el primer y el segundo anticuerpo comprenden una VL y una VH, en los que la VL es SEQ ID NO: 7 y la VH es SEQ ID NO: 8. Lo más preferiblemente, el primer y el segundo anticuerpo comprenden una LC y una HC, en los que la LC es SEQ ID NO: 9 y la HC es SEQ ID NO: 10.
En una realización preferida, el segundo anticuerpo está marcado, preferiblemente con una partícula de polímero sintético coloreada y/o una partícula metálica coloidal. Más preferiblemente, el segundo anticuerpo está marcado con una partícula de polímero sintético coloreada.
Método
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar bacterias del género Campylobacter en una muestra aislada que comprende poner en contacto la muestra con el dispositivo de prueba de la presente invención.
En una realización preferida, la bacteria del género Campylobacter es de la especie Campylobacter jejuni y/o Campylobacter coli.
En una realización preferida, la muestra aislada es una muestra de heces aislada. La muestra de heces puede prepararse dispersando una muestra de heces en un tampón base de Tris a pH 8,4 antes de poner en contacto la muestra con el dispositivo de prueba de la presente invención.
Usos del anticuerpo
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso del anticuerpo de la presente invención para la detección de bacterias del género Campylobacter. Preferiblemente, la bacteria del género Campylobacter es de la especie Campylobacter jejuni y/o Campylobacter coli.
En una realización preferida, el anticuerpo de la presente invención se usa para detectar bacterias del género Campylobacter en una muestra de heces. Preferiblemente, la bacteria del género Campylobacter es de la especie Campylobacter jejuni y/o Campylobacter coli.
En un quinto aspecto, la presente solicitud proporciona el uso del anticuerpo de la presente invención para la fabricación de un dispositivo de prueba de inmunoensayo. El término “dispositivo de prueba de inmunoensayo” puede referirse a cualquier dispositivo de prueba que comprende al menos un anticuerpo. Los ejemplos de dispositivos de prueba incluyen dispositivos de prueba inmunocromatográficos, dispositivos de prueba de ELISA y dispositivos de prueba de inmunoprecipitación. A continuación, el dispositivo de prueba de inmunoensayo puede usarse en un método para detectar bacterias del género Campylobacter en una muestra aislada que comprende poner en contacto la muestra con el dispositivo de prueba de inmunoensayo. Preferiblemente, la bacteria del género Campylobacter es de la especie Campylobacter jejuni y/o Campylobacter coli. Más preferiblemente, la bacteria del género Campylobacter es de la especie Campylobacter jejuni y/o Campylobacter coli y la muestra aislada es una muestra de heces aislada.
En una realización preferida, el anticuerpo de la presente invención se usa para fabricar el dispositivo de prueba inmunocromatográfico de la presente invención.
Hibridoma
En un sexto aspecto, la presente divulgación proporciona un hibridoma que produce el anticuerpo de la presente invención.
Los anticuerpos monoclonales pueden generarse inmunizando ratones con un antígeno derivado de Dps. Los esplenocitos de estos ratones inmunizados con el antígeno de interés se usan para producir hibridomas que secretan Acm con afinidades específicas para epítopos (véanse, por ejemplo, Wood et al. solicitud internacional Wo 91/00906, Kucherlapati et al. publicación PCT WO 91/10741; Lonberg et al. solicitud internacional WO 92/03918; Kay et al. solicitud internacional 92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326).
Ejemplos
Ejemplo 1: Producción de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a Dps
Se obtuvo anticuerpo monoclonal CL30Camp a partir del hibridoma del mismo nombre. De manera breve, se obtuvo un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal CL30Camp realizando protocolos convencionales conocidos en la técnica (KOHLEr G Milstein C Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity Nature 7 de agosto de 19750028-08362565517495-497).
Se inmunizaron ratones de tipo BALB/c con Dps nativa purificada (la Dps nativa purificada se obtuvo a través de los métodos descritos en Ishikawa et al., 2003. J. Bacteriol. 185(3): 1010-1017). Se fusionaron linfocitos de ratones inmunizados con una línea celular de mieloma, específicamente una línea celular SP20, y los hibridomas que se obtuvieron se cribaron mediante ELISA para encontrar clones que producen anticuerpos que se unen a Dps. Para realizar el ELISA, se recubrieron los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos con un anticuerpo anti-Dps policlonal de conejo en tampón carbonato 100 mM, pH 9 a 37°C durante 2 h. Se lavaron los pocillos y después se añadió una disolución de Dps en PBS que contenía BSA (albúmina sérica bovina) al 1% (p/v). Se lavaron de nuevo los pocillos y después se añadió el sobrenadante de un cultivo de línea celular de hibridoma a cada pocillo. La presencia de anticuerpos que pueden unirse a Dps se reveló usando un conjugado de peroxidasa anti-IgG de ratón (Sigma-Aldrich) y el correspondiente sustrato.
Se seleccionaron los hibridomas que secretaron anticuerpos con alta especificidad y afinidad para Dps. Entre los hibridomas seleccionados, se seleccionaron adicionalmente los que produjeron buenos títulos de anticuerpo que funcionaron favorablemente en pruebas de estrés térmico.
Los anticuerpos se purificaron usando cromatografía de afinidad de proteína A usando métodos que son comunes en la técnica (véase el manual “Affinity Chromatography vol. 1: Antibodies” 18103746 AF publicado en 04/2016 por GE Healthcare Bio-Sciences AB).
Se seleccionó CL30Camp porque tenía alta especificidad y sensibilidad en pruebas de ELISA así como en pruebas de inmunocromatografía (tabla 1, la muestra usada fue PBS que contenía bSa al 0,1% (p/v)).
Tabla 1: Estudio del ruido de fondo de diferentes combinaciones de anticuerpos aislados
Marcado |
I
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Ejemplo 2: Preparación del anticuerpo conjugado
Se marcaron anticuerpos anti-Dps con nanopartículas de poliestireno coloreadas (K1 020 Estapor®, Merck, Darmstadt, Alemania). Las nanopartículas coloreadas comprendían grupos carboxilo en la superficie y tenían un diámetro promedio de alrededor de 300 nm. Los anticuerpos se marcaron de la siguiente manera: se lavó una disolución de 1 ml que contenía el 10% (p/v) de partículas, se centrifugó y se resuspendió en un tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) 10 mM con un pH de 6,0. Después se añadió e Dc (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) hasta una concentración final de 5 mM. Se incubó la disolución durante 1 hora a 37°C y después se retiró el reactivo en exceso centrifugando la disolución y retirando el sobrenadante.
Se resuspendieron las partículas activadas en MES 10 mM, pH 6, y se añadió el anticuerpo a una concentración de superficie de 2 mg/m2. A continuación, se incubó la disolución durante 4 horas a 25°C y después se lavaron los anticuerpos marcados con una disolución que contenía Tween-20 al 0,1% (p/v). Se diluyeron los anticuerpos marcados en una disolución de tampón de Tris (tris(hidroximetil)aminometano) al 0,05% (p/v), pH 8,0, que contenía sacarosa al 10% (p/v), BSA al 2% (p/v), PEG-6000 al 1% (p/v) y Tween-20 al 2% (p/v).
Se depositó esta disolución a una velocidad de 15 |il/cm sobre fibras de poliéster tejidas con una anchura de 29 mm. Se secaron las fibras de poliéster durante 24 horas en una cámara a 30°C y humedad relativa del 20%.
Ejemplo 3: Preparación de las secciones de detección y de control
Se depositó un tampón de PBS que contenía 1 mg/ml de anticuerpo anti-Dps de manera lineal sobre una membrana de nitrocelulosa que tenía una anchura de laminado de 25 mm y un tamaño de poro de entre 10 y 30 micrómetros. Se depositó la disolución de anticuerpos a una velocidad de 1 |il/cm. A continuación, se secó la membrana durante 24 horas en una cámara a 30° C y humedad relativa del 20%.
Se depositó anticuerpo anti-IgG de ratón de conejo policlonal en la sección de control a la vez que el depósito del anticuerpo anti-Dps en la sección de detección. Se usaron las mismas condiciones para el depósito del anti-IgG de ratón de conejo policlonal en la membrana de nitrocelulosa.
Ejemplo 4. Montaje del dispositivo de prueba inmunocromatográfico
Se montaron el material conjugado (sección de adición de muestra y sección que comprende el anticuerpo marcado), la membrana de soporte y el material absorbente tal como se indica en la figura 1B y 1C sobre un soporte de plástico con una lámina adhesiva. Las tiras se cortaron de manera transversal a una anchura de 4 mm.

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH), en el que dicha VL comprende polipéptidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3, y VH comprende polipéptidos de hCd R1, HCDR2 y Hc DR3, en el que LCDR1 es SASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 1), LCDR2 es RTSNLAS (SEQ ID NO: 2), LCDR3 es QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 3), HCDR1 es GFSLTSSGVH (SEQ ID NO: 4), HCDR2 es VIWRGGSTDYNAAFMS (SEQ ID NO: 5) y HCDR3 es NYYYGTSPDYFDY (SEQ ID NO: 6), y se une específicamente a la proteína de unión de a Dn de células privadas de nutrientes (Dps) de Campylobacter coli y/o Campylobacter jejuni.
  2. 2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una VL y una VH, en el que la VL es SEQ ID NO: 7 y la VH es SEQ ID NO: 8.
  3. 3. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), y la LC es SEQ ID NO: 9 y la HC es SEQ Id NO: 10.
  4. 4. Dispositivo de prueba inmunocromatográfico que comprende:
    (a) un primer anticuerpo que se une específicamente a Dps (proteína de unión de ADN de células privadas de nutrientes);
    (b) un segundo anticuerpo que se une específicamente a Dps (proteína de unión de ADN de células privadas de nutrientes); y
    (c) una membrana de soporte,
    en el que el primer anticuerpo está inmovilizado en la membrana de soporte y el segundo anticuerpo está marcado, y en el que el primer anticuerpo es el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o el segundo anticuerpo es el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  5. 5. Dispositivo de prueba según la reivindicación 4, en el que el segundo anticuerpo está marcado con una partícula de polímero sintético coloreada y/o una partícula metálica coloidal.
  6. 6. Dispositivo de prueba según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo está marcado con una partícula de polímero sintético coloreada que comprende poliestireno.
  7. 7. Método para detectar bacterias del género Campylobacter en una muestra aislada que comprende poner en contacto la muestra con el dispositivo de prueba según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
  8. 8. Método según la reivindicación 7, en el que la bacteria del género Campylobacter es Campylobacter jejuni y/o Campylobacter coli.
  9. 9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en el que la muestra aislada es una muestra de heces aislada.
  10. 10. Uso in vitro del anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la detección de bacterias del género Campylobacter.
  11. 11. Uso según la reivindicación 10, en el que la bacteria del género Campylobacter es Campylobacter jejuni y/o Campylobacter coli.
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