JP2020536117A - カンピロバクター属の細菌の検出のための抗体および試験デバイス - Google Patents
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Abstract
Description
第一側面において、本発明は、Dpsに特異的に結合する抗体を提供する。
本明細書で用いられる際、用語“抗体”は、少なくとも1個の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。抗体という用語は、例えば完全長の成熟抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。例えば、抗体分子は、重(H)鎖可変ドメイン配列(本明細書においてVHと略される)および軽(L)鎖可変ドメイン配列(本明細書においてVLと略される)を含み得る。別の例において、抗体は、2個の重(H)鎖可変ドメイン配列および2個の軽(L)鎖可変ドメイン配列を含み、それにより2個の抗原結合部位を形成し(例えばFab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、単鎖抗体(例えばscFv)、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ(Dab)(二価および二重特異性)およびキメラ(例えばヒト化)抗体)、それは、抗体全体の改変により生成されることができ、または組み換えDNA技術を用いて新規に合成されたものであることができる。これらの機能性抗体フラグメントは、それらのそれぞれの抗原または受容体と選択的に結合する能力を保持している。抗体および抗体フラグメントは、IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEを含むがそれらに限定されないあらゆるクラスからのものならびに抗体のあらゆる下位クラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4)からのものであることができる。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることができる。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、CDR移植抗体またはインビトロで生成された抗体であることもできる。抗体は、例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4から選択された重鎖定常領域を有することができる。抗体は、例えばカッパまたはラムダから選択された軽鎖を有することもできる。抗原結合フラグメントの例は、以下のものを含む:(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価フラグメントであるFabフラグメント;(ii)ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された2個のFabフラグメントを含む二価フラグメントであるF(ab’)2フラグメント;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体の単一のアームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント、(v)VHドメインからなるダイアボディ(dAb)フラグメント;(vi)ラクダ類またはラクダ化(camelized)可変ドメイン;(vii)単鎖Fv(scFv)(例えばBird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照);(viii)単一ドメイン抗体。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の従来の技法を用いて得られ、フラグメントは、完全な抗体がスクリーニングされる方法と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。
SEQ ID NO:9は、CL30Camp中に存在するLCであり、以下の配列を有する:
抗Dps抗体は、標識されることができる。標識は、あらゆる通常の方法を用いることにより実施されることができる。標識のために用いられる標識物質は、好ましくは不溶性粒子である。適切な粒子の例は、以下のものを含む:合成ポリマー、例えばラテックス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレートコポリマー、ポリメタクリル酸グリシジルおよびアクロレイン−エチレングリコールジメタクリレートコポリマーを色素分子で標識することにより得られた着色された合成ポリマー粒子;コロイド性金属粒子(金、銀、銅、鉄、白金、パラジウムおよびそれらの混合物(例えば金および白金の混合物、金および銀の混合物ならびにパラジウムおよび白金の混合物));ならびに赤血球。好ましくは、粒子は、変化が視覚的検査により容易かつ迅速にチェックされることを可能にする。着色された合成ポリマー粒子またはコロイド性金属粒子は、この目的のために用いられることができる。粒子は、着色された合成ポリマー粒子に関して例えば15〜400nm、好ましくは100〜400nm、またはコロイド性金属粒子に関して30〜80nmの粒径を有する。コロイド性金属粒子は、商業的に入手可能な製品であり、または通常の方法を用いることにより調製されることができる。
第2側面において、本発明は、以下のものを含む免疫クロマトグラフィー試験デバイスを提供し:(a)Dpsに特異的に結合する第1抗体、(b)Dpsに特異的に結合する第2抗体、および(c)支持膜、ここで、第1抗体は、支持膜上に固定されており、第2抗体は、標識されている。
第3側面において、本発明は、分離された試料中のカンピロバクター属の細菌を検出するための方法を提供し、それは、試料を本発明の試験デバイスと接触させることを含む。
好ましい態様において、分離された試料は、分離された便試料である。便試料は、便試料をpH8.4のトリス塩基緩衝液中で分散させることにより調製されることができ、その後、試料を本発明の試験デバイスと接触させる。
第4側面において、本発明は、カンピロバクター属の細菌の検出のための本発明の抗体の使用を提供する。好ましくは、カンピロバクター属の細菌は、カンピロバクター・ジェジュニおよび/またはカンピロバクター・コリ種の細菌である。
ハイブリドーマ
第6側面において、本発明は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
CL30Campモノクローナル抗体を、同じ名前のハイブリドーマから得た。簡潔には、モノクローナル抗体CL30Campを産生するハイブリドーマを、当該技術で既知の標準的なプロトコルを実施することにより得た(KOEHLER G Milstein C Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity Nature 1975 Aug 7 0028-0836 256 5517 495-497)。
抗Dps抗体を、着色されたポリスチレンナノ粒子(K1 020 Estapor(登録商標),Merck,ダルムシュタット、ドイツ)で標識した。着色されたナノ粒子は、表面上にカルボキシル基を含んでおり、約300nmの平均直径を有していた。抗体を、以下のように標識した:10%(w/v)粒子を含有する1mLの溶液を洗浄し、遠心分離し、6.0のpHを有する10mM MES(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸)緩衝液中で再懸濁した。次いでEDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)を5mMの終濃度になるように添加した。その溶液を37℃で1時間インキュベートし、次いで溶液を遠心分離して上清を除去することにより過剰な試薬を除去した。
1mg/mLの抗Dps抗体を含有するPBS緩衝液を、25mmの薄層状の幅(laminated width)および10〜30ミクロンの孔径を有するニトロセルロース膜上に線状の様式で堆積させた。抗体溶液を、1μL/cmの速度で堆積させた。次いで、膜をチャンバー中で30℃および20%相対湿度において24時間乾燥させた。
コンジュゲート材料(試料添加区画および標識された抗体を含む区画)、支持膜および吸収性材料を、図1Bおよび1Cにおいて示されているように、接着性ホイルを有するプラスチック支持体上で組み立てた。その細片を、4mmの幅になるように横方向に切断した。
Dpsの1/2系列希釈物を、上記の分散溶液中で調製した。100μlの試料を本発明の免疫クロマトグラフィー試験デバイスに適用した。試験デバイスを、室温で10分間現像させた後、結果を視覚的に評価した。同じ実験を、同じ緩衝液中で分散させた便試料中でDpsを希釈することにより実施した。結果が、表2および3において示されている。解釈:+=陽性反応;−=陰性反応;+/−=弱い陽性反応。
C.コリまたはC.ジェジュニに関して陽性または陰性であることが示された便試料20mgを、実施例4で記載された分散溶液1mL中で分散させた。100μlの試料を本発明の免疫クロマトグラフィー試験デバイスに適用した。試験デバイスを室温で10分間現像させた後、結果を視覚的に評価した。解釈:+=陽性反応;−=陰性反応;+/−=弱い陽性反応。
Claims (13)
- 軽鎖可変領域(VL)および重鎖可変領域(VH)を含み、カンピロバクター・コリおよび/またはカンピロバクター・ジェジュニのDps(飢餓細胞由来DNA結合タンパク質)に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、VLが、LCDR1、LCDR2およびLCDR3ポリペプチドを含み、VHが、HCDR1、HCDR2およびHCDR3ポリペプチドを含み、ここで、LCDR1は、SASSSVSSSYLH(SEQ ID NO:1)であり、LCDR2は、RTSNLAS(SEQ ID NO:2)であり、LCDR3は、QQWSGYPFT(SEQ ID NO:3)であり、HCDR1は、GFSLTSSGVH(SEQ ID NO:4)であり、HCDR2は、VIWRGGSTDYNAAFMS(SEQ ID NO:5)であり、HCDR3は、NYYYGTSPDYFDY(SEQ ID NO:6)である、上記抗体。
- 抗体が、VLおよびVHを含み、VLが、SEQ ID NO:7であり、VHが、SEQ ID NO:8である、請求項1に記載の抗体。
- 抗体が、軽鎖(LC)および重鎖(HC)を含み、LCが、SEQ ID NO:9であり、HCが、SEQ ID NO:10である、先行する請求項のいずれか1項に記載の抗体。
- 以下:
(a)Dps(飢餓細胞由来DNA結合タンパク質)に特異的に結合する第1抗体;
(b)Dps(飢餓細胞由来DNA結合タンパク質)に特異的に結合する第2抗体;および
(c)支持膜;
を含む免疫クロマトグラフィー試験デバイスであって、第1抗体が、支持膜上に固定されており、第2抗体が、標識されており、第1抗体が、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体であり、かつ/または第2抗体が、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体である、上記試験デバイス。 - 第2抗体が、着色された合成ポリマー粒子および/またはコロイド性金属粒子で標識されている、請求項4に記載の試験デバイス。
- 抗体が、ポリスチレンを含む着色された合成ポリマー粒子で標識されている、請求項5に記載の試験デバイス。
- 分離された試料中のカンピロバクター属の細菌を検出するための方法であって、該試料を請求項4〜6のいずれか1項に記載の試験デバイスと接触させることを含む、上記方法。
- カンピロバクター属の細菌が、カンピロバクター・ジェジュニおよび/またはカンピロバクター・コリである、請求項7に記載の方法。
- 分離された試料が、分離された便試料である、請求項7または8のいずれか1項に記載の方法。
- カンピロバクター属の細菌の検出のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体のインビトロでの使用。
- カンピロバクター属の細菌が、カンピロバクター・ジェジュニおよび/またはカンピロバクター・コリである、請求項10に記載の使用。
- 免疫アッセイ試験デバイス、好ましくは請求項4〜6のいずれか1項に記載の免疫クロマトグラフィー試験デバイスの製造のための請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
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