CN103025871B - 抗fdp单克隆抗体、使用其的fdp测定用试剂及试剂盒、以及fdp测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及选自对于FDP的反应性互相不同的第1、第2及第3单克隆抗体的抗FDP单克隆抗体。另外，本发明涉及利用那样的抗FDP单克隆抗体的FDP测定用试剂及试剂盒、以及FDP测定方法。

Description

抗FDP单克隆抗体、使用其的FDP测定用试剂及试剂盒、以及FDP测定方法
【技术领域】
本发明涉及识别作为纤维蛋白及纤维蛋白原的分解产物的FDP的新颖的抗FDP单克隆抗体。另外，本发明涉及使用该抗体的FDP测定用试剂及试剂盒、以及测定FDP的方法。
【背景技术】
由止血或某种病的因素，如果血管内或组织中发生血栓(稳定化纤维蛋白)，为了将其除去，在活体内发生纤溶反应。溶解此血栓的纤溶反应被称为二次纤溶，血栓中的纤维蛋白由纤溶酶等的酶的作用而分解而在血中生成纤维蛋白分解产物(FbnDP；二次纤溶物)。另一方面，在活体内，也发生不伴随血栓的形成而发生的被称为一次纤溶的纤溶反应。在一次纤溶中，纤维蛋白原由纤溶酶等的酶的作用而分解而在血中生成纤维蛋白原分解产物(FbgDP；一次纤溶物)。这些纤维蛋白及纤维蛋白原的分解产物被总称为FDP(fibrinogenandfibrindegradationproducts)。
在血中的FDP的存在成为推测活体的纤溶亢进的指标。所以，现在，血中的FDP的测定在涉及血栓、循环器障碍、纤溶亢进、异常出血等的疾病或弥散性血管内凝血综合征(DIC)等的诊断中利用。特别是，为了分类DIC的病态，要求无关于FDP的种类而测定总FDP量。
在血中的FDP的测定用试剂中，一直以来适用免疫学方法，例如有利用免疫比浊法的试剂在市售。作为那样的FDP测定用试剂，有使用抗人纤维蛋白原抗体等的多克隆抗体的试剂。但是，在使用此试剂的FDP测定中，如果作为待测样品，不使用血清等，除去纤维蛋白原的活体样品，则FDP测定值拟似性地变成高值。但是，制备血清的作业是烦琐的。另外，在如PT(凝血酶原时间)、APTT(活化部分促凝血酶原激酶时间)、Fbg(纤维蛋白原浓度)一样的血液凝固检查中，由于作为待测样品而使用血浆，所以在临床现场中，优选使用可使用血浆的单克隆抗体的血浆FDP测定用试剂(参照专利文献1～5)。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:特公平5-38906号公报
专利文献2:特公平7-46104号公报
专利文献3:专利第3472138号公报
专利文献4:特开2001-354700号公报
专利文献5:特开2002-372536号公报
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
使用血清的FDP测定用试剂对一次纤溶物及二次纤溶物均等地反应。但是，在以往的血浆FDP测定用试剂中，在使用的单克隆抗体的，对一次纤溶物的反应性和对二次纤溶物的反应性之间确认差异。即，在以往的血浆FDP测定用试剂中，相比对一次纤溶物的反应性，对二次纤溶物的反应性有更高的倾向。
一般而言，在生理性的条件下不发生纤维蛋白原的分解。从而，由于在FDP中二次纤溶物占大部分，所以上述的反应性的差在通常的测定中不成问题。但是，在DIC、急性全骨髓性白血病等的患者中，血中的纤溶酶的活性变得过量，一次纤溶成为亢进的状态。即，在从那样的状态的受试者得到的活体样品中含一次纤溶物。从而，在对一次纤溶物的反应性低的以往的血浆FDP测定用试剂中有无法正确地测定在纤溶亢进状态的受试者的总FDP量的担忧。
本发明旨在提供对一次纤溶物及二次纤溶物的两方有反应性的抗FDP单克隆抗体。另外，本发明旨在提供可使用该抗体正确地测定在纤溶亢进状态的受试者的FDP的试剂及试剂盒。再者，本发明旨在提供使用该试剂及试剂盒的FDP的测定方法。
【解决课题的技术方案】
本发明人进行锐意研究的结果发现，通过制备对于FDP的反应性互相不同的多种抗FDP单克隆抗体，使用含吸附有这些的载体的试剂，即便是含一次纤溶物的活体样品，也可高精度测定FDP，从而完成本发明。
即，本发明提供抗FDP单克隆抗体，其选自以下的3种单克隆抗体：
与纤维蛋白原、以及FDP的一次纤溶物的X级分、Y级分及D级分反应，并且与FDP的二次纤溶物的DD级分、DD/E级分及XDP级分反应的第1单克隆抗体、
不与纤维蛋白原反应，但与FDP的一次纤溶物的X级分、Y级分及E级分反应，并且与FDP的二次纤溶物的DD级分、DD/E级分及XDP级分反应的第2单克隆抗体、及
不与纤维蛋白原反应，但与FDP的一次纤溶物的Y级分及E级分反应，并且与FDP的二次纤溶物的DD级分、DD/E级分及XDP级分反应的第3单克隆抗体。
本发明提供FDP测定用试剂，其含：致敏上述的第1、第2及第3单克隆抗体的载体。
另外，本发明提供FDP测定用试剂盒，其含：含缓冲液的第1试剂、及含吸附有上述的第1、第2及第3单克隆抗体的载体的第2试剂。
再者，本发明提供FDP测定方法，其包括：将致敏上述的第1、第2及第3单克隆抗体的载体粒子的悬浮液和活体样品混合的步骤，以及测定由抗原抗体反应产生的，上述载体粒子的凝集的程度的步骤。
【发明效果】
本发明的抗FDP单克隆抗体可提供，即便对于含一次纤溶物的活体样品，也可高精度测定FDP的试剂及试剂盒、以及测定方法。
【附图说明】
【图1】是示“纤溶亢进度高”的待测样品组及“纤溶亢进度低”的待测样品组的FDP浓度的测定结果的坐标图。
【实施方式】
在本说明书中，“FDP”是指纤维蛋白分解产物及纤维蛋白原分解产物二者。
在本说明书中，“纤维蛋白分解产物”也被称为二次纤溶物，是作为由凝血酶等的酶的作用而血液中的纤维蛋白原凝固而形成的聚合物的稳定化纤维蛋白被纤溶酶等的酶分解而发生的蛋白质组。作为纤维蛋白分解产物，可举出DD级分、DD/E级分、XDP级分等。作为XDP级分，可举出DD/E级分的多聚体、例如作为DD/E级分的3聚体的DXD/YY级分、作为DD/E级分的5聚体的YXY/DXXD级分、作为DD/E级分的7聚体的DXXD/YXXY级分等。另外，在所述技术中，XDP级分也被总称为D二聚体。
在本说明书中，“纤维蛋白原分解产物”也被称为一次纤溶物，是血液中存在的纤维蛋白原被纤溶酶等的酶分解而发生的蛋白质组。作为纤维蛋白原分解产物可举出X级分、Y级分、D级分及E级分。
在本说明书中，“对于FDP的反应性”由抗FDP单克隆抗体特异性地反应的FDP的种类而规定。从而，在可在某抗FDP单克隆抗体和别的抗FDP单克隆抗体之间特异性地反应的FDP的种类互相不同之时，这些的抗体的对于FDP的反应性被确定为互相不同。
本发明的抗FDP单克隆抗体是对于FDP的反应性互相不同的3种抗体，至少，以与FDP的一次纤溶物的Y级分、以及FDP的二次纤溶物的DD级分、DD/E级分、及XDP级分反应作为特征。以下，将这3种单克隆抗体各自称为“第1单克隆抗体”、“第2单克隆抗体”及“第3单克隆抗体”。
第1单克隆抗体的特征在于与纤维蛋白原、以及FDP的一次纤溶物的X级分、Y级分及D级分反应，并且与FDP的二次纤溶物的DD级分、DD/E级分及XDP级分反应。
第2单克隆抗体的特征在于，不与纤维蛋白原反应，但与FDP的一次纤溶物的X级分、Y级分及E级分反应，并且与FDP的二次纤溶物的DD级分、DD/E级分及XDP级分反应。
第3单克隆抗体的特征在于，不与纤维蛋白原反应，但与FDP的一次纤溶物的Y级分及E级分反应，并且与FDP的二次纤溶物的DD级分、DD/E级分及XDP级分反应。
上述的第1、第2及第3单克隆抗体是来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、马等之任何的哺乳动物的抗体也可，但在它们之中小鼠也是优选的。另外，抗体的同种型是IgG、IgM、IgE、IgA等之任何也可。在抗体中含抗体的片段及其衍生物。作为具体例，可举出Fab片段、F(ab’)2片段等。
上述的第1、第2及第3单克隆抗体可由所述技术中公知的免疫学方法得到。即，通过作为抗原将FDP(一次纤溶物及/或二次纤溶物)和佐剂任意地混合而免疫动物，将从该动物取得的B淋巴细胞和适当的骨髓瘤细胞融合而制备杂交瘤，纯化该杂交瘤的培养上清，可得到单克隆抗体。
具体而言，由以下的方法可得到本发明的试剂中使用的第1、第2及第3单克隆抗体。
【抗原的取得】
作为抗原使用的FDP可通过使如纤溶酶一样的可分解纤维蛋白及纤维蛋白原的酶作用于纤维蛋白及纤维蛋白原而得到。再有，成为FDP的原料的纤维蛋白及纤维蛋白原有市售。另外，纤维蛋白可通过向纤维蛋白原作用凝血酶、第XIII因子及钙盐而得到。
【免疫方法】
可用将如上述一样得到的抗原与佐剂任意地混合，在适当的缓冲液中溶解或悬浮而得到的抗原液免疫动物。该抗原液中的抗原的浓度是50～500μg/ml左右是优选的。抗原的免疫原性低时，也可将如白蛋白、钥孔青贝血蓝蛋白一样的载体蛋白质任意地与抗原结合。
作为佐剂，可使用在所述技术中公知的佐剂。作为那样的佐剂，可举出例如弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、Ribi(MPL)、Ribi(TDM)、Ribi(MPL+TDM)、百日咳疫苗(Bordetellapertussisvaccine)、胞壁酰二肽(MPD)、铝佐剂(ALUM)及这些的组合。在初次免疫时使用FCA，在追加免疫时使用FIA或Ribi佐剂的组合是特别优选的。
待免疫的动物是小鼠、大鼠、仓鼠、马、山羊、兔等之任何均可，优选为小鼠、更优选是BALB/c小鼠。
免疫法可根据使用的抗原的种类或佐剂的有无而适宜选择。例如使用小鼠时，将佐剂混合抗原液0.05～1ml(抗原10～200μg)注射到腹腔内、皮下、肌肉内或尾静脉内，从初次免疫每约4～21天进行1～4次追加免疫，再者约1～4周后，进行最终免疫。通过使抗原量变多而进行腹腔内注射，不向抗原液使用佐剂而进行免疫也可。追加免疫的约5～10天后，采集血液而测定抗体价。抗体价可根据如后述的抗体价测定一样的本技术中公知的方法测定。从最终免疫约3～5天后，从被免疫的动物摘出脾脏，分离脾脏细胞而可得到产生抗体的细胞。
【单克隆抗体的制备】
单克隆抗体可根据所述技术中公知的方法、例如Kohler及Milstein，Nature，256,495-497(1975)所述的方法制备。
使用的骨髓瘤细胞是小鼠、大鼠、人等任何的哺乳动物来源的细胞均可，可举出例如小鼠骨髓瘤P3×63-Ag8、P3×63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/o-Ag14、P3×63-Ag8·653等的株化骨髓瘤细胞。在骨髓瘤细胞之中有产生免疫球蛋白轻链的种类的骨髓瘤细胞，将其作为融合对象使用，则产生抗体的细胞产生的免疫球蛋白重链和此轻链随机地结合。从而，使用不产生免疫球蛋白轻链的骨髓瘤细胞、例如P3×63-Ag8·653或SP2/o-Ag14等是优选的。产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞是同种动物、特别是同系统的动物来源的细胞是优选的。
作为将产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞融合而制备杂交瘤的方法，可举出使用聚乙二醇(PEG)的方法、使用仙台病毒的方法、使用电融合装置的方法等。使用PEG时，在含约30～60％的PEG(平均分子量1000～6000)的适当的培养基或缓冲液中将脾脏细胞和骨髓瘤细胞以1～10:1、优选为5～10:1的混合比悬浮，在温度约25～37℃、pH6～8的条件下反应约30秒钟～3分钟左右即可。反应结束后，清洗细胞，除去含有PEG的溶液而再悬浮于培养基中，接种到微滴定板上培养。
将如上述一样融合的细胞在选择培养基上培养，可进行杂交瘤的选择。作为选择培养基，只要是仅融合细胞可增殖的培养基即可，可使用例如次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶(HAT)培养基。杂交瘤的选择，通常、可在细胞融合的1～7天后，与培养基之一部分、优选为约半量的选择培养基交换，再每2～3天同样重复培养基交换而培养，在培养结束后，通过显微镜观察选择杂交瘤的集落生长的孔来进行。
如此得到的杂交瘤是否产生所望的抗体，可通过采集该杂交瘤的培养上清，进行抗体价分析来确认。抗体价分析可通过所述技术中公知的方法进行。例如，可通过向固定化到固相的抗原蛋白质添加阶段稀释的培养上清，再与用荧光物质、酶或放射性同位素(RI)标记的第二抗体(抗球蛋白抗体、抗IgG抗体、抗IgM抗体等)反应而检测抗体。
由上述的抗体价测定确认产生所望的抗体的杂交瘤，可由有限稀释法、软琼脂法、使用荧光激发细胞分选仪的方法等，分离单一克隆。例如在有限稀释法的情况中，通过在培养基中阶段稀释而培养至杂交瘤的集落成1细胞/孔左右，可单离产生目的抗体的杂交瘤。
从杂交瘤的单克隆抗体的取得方法可根据单克隆抗体的必要量或杂交瘤的性状适宜选择。可举出例如，从移植该杂交瘤的小鼠的腹水取得的方法、由细胞培养从培养上清取得的方法等。只要是可在小鼠的腹腔内增殖的杂交瘤，从腹水可得到数mg/ml的高浓度的单克隆抗体。在体内无法增殖的杂交瘤的情况中，可从细胞培养的培养上清取得单克隆抗体。此时，尽管产生抗体的量低，但免疫球蛋白或其他杂质的混入少而容易纯化。
从移植杂交瘤的小鼠腹腔内取得抗体时，向预先施用例如如姥鲛烷(2,6,10,14-四甲基十五烷)一样的有免疫抑制作用的物质的BALB/c小鼠的腹腔内移植杂交瘤(约1×106个以上)，约1～3周后，采集贮留的腹水。在移植异种杂交瘤时，使用裸鼠、放射线处理小鼠等是优选的。
从细胞培养上清取得抗体时，例如除了细胞维持使用的静置培养之外，由高密度培养法或旋转瓶培养法等培养杂交瘤，可得到含有抗体的培养上清。如果向培养基添加血清，则含其他抗体或白蛋白等的杂质，抗体的纯化多会变得烦琐，所以使向培养基的血清的添加量尽可能少是优选的。将杂交瘤由惯用的方法在无血清培养基中驯化，在无血清培养基中培养是更优选的。由此，抗体纯化变得容易。
从腹水或培养上清的单克隆抗体的纯化可通过公知的方法进行，可举出例如通过使用硫酸铵、硫酸钠等的盐的盐析的分级分离法、聚乙二醇分级分离法、乙醇分级分离法、DEAE离子交换层析法、基于凝胶过滤层析法等的方法。
目的的抗体是小鼠IgG时，可利用使用蛋白A结合载体或抗小鼠免疫球蛋白结合载体的亲和层析法来纯化抗体。
在本发明的抗FDP单克隆抗体中，作为第1单克隆抗体，可举出例如由以保藏号NITEBP-949在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(邮政编码292-0818、日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)，于2010年6月1日保藏的杂交瘤“FDP3-2920”产生的抗体(以下，也被称为“FDP3-2920抗体”)。
作为第2单克隆抗体，可举出例如由以保藏号NITEBP-950在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(邮政编码292-0818、日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)，于2010年6月1日保藏的杂交瘤“FDP3-797”产生的抗体(以下，也被称为“FDP3-797抗体”)。
作为第3单克隆抗体，可举出例如由以保藏号NITEBP-951在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(邮政编码292-0818、日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)，于2010年6月1日保藏的杂交瘤“FDP3-2935”产生的抗体(以下，也被称为“FDP3-2935抗体”)。
在本发明的FDP测定用试剂(以下，也被称为本发明的试剂)中的第1单克隆抗体和第2单克隆抗体和第3单克隆抗体的浓度比不特别限定，本领域技术人员可适宜决定。
本发明的试剂含吸附有上述的第1、第2及第3单克隆抗体的载体。作为那样的载体，可举出有机高分子化合物、无机化合物、红细胞等。作为有机高分子化合物，可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、纤维素、乳胶、聚苯乙烯、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-缩水甘油基(甲基)丙烯酸共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚醋酸乙烯基丙烯酸酯等。作为无机化合物，可举出氧化硅、氧化铝等。
上述的载体粒子的形状不特别限定，是球状、平面状等任何的形状也可。是球状时，载体粒子的平均径可根据测定机器等适宜选择，但通常是0.05～0.5μm为适当的。作为粒子的材质，乳胶是特别优选的。
作为用第1、第2及第3单克隆抗体吸附到载体粒子的方法，所述技术中公知的物理的吸附法及化学结合法之任何也可，但由于操作简便，物理吸附法是优选的。
上述的载体是粒子的情况中，该载体粒子是吸附有第1、第2及第3单克隆抗体的3种的载体粒子也可，是各单克隆抗体各自个别地吸附的载体粒子的混合物也可。第1、第2及第3单克隆抗体之间向载体粒子的吸附条件互相不同时，用各抗体个别地吸附到载体粒子是优选的。
上述的载体粒子是乳胶粒子时，将吸附有第1、第2及第3单克隆抗体的载体粒子在适当的缓冲液中悬浮。悬浮液中的乳胶粒子的浓度优选为0.5～10mg/ml、更优选是0.75～5mg/ml。另外，该悬浮液中的单克隆抗体的总浓度优选为10～100μg/ml、更优选是20～50μg/ml。
作为上述的缓冲液，可举出在pH5～10、优选为pH6～9有缓冲作用的缓冲液。具体而言，可举出例如磷酸缓冲液、咪唑缓冲液、三乙醇胺-盐酸、Good缓冲液等。作为Good缓冲液，可举出MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、HEPES、HEPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPS等的缓冲液。它们之中MOPSO也是优选的。
上述的缓冲液可再含蛋白质稳定化剂(例如BSA等)、防腐剂(例如叠氮化钠、苯基甲磺酰氟等)、pH调节剂、增感剂(例如聚乙烯基吡咯烷酮、聚阴离子、聚乙二醇、多糖类等)、无机盐(例如氯化钠、氯化钙等)、背景抑制剂(例如人抗小鼠抗体(HAMA)吸收剂等)等的添加物。
作为本发明的试剂之一实施方式，可举出FDP测定用试剂盒(以下，也被称为本发明的试剂盒)。本发明的试剂盒含：含缓冲液的第1试剂，和含吸附有上述的第1、第2及第3单克隆抗体的载体粒子的悬浮液的第2试剂。
本发明的试剂盒是用于由免疫测定、例如使吸附有上述的第1、第2及第3单克隆抗体的乳胶粒子和与活体样品中的FDP反应的测定(乳胶凝集法)等检测该样品中的FDP的试剂盒。
作为本发明的试剂盒中使用的第1、第2及第3单克隆抗体之一例，各自可举出FDP3-2920抗体、FDP3-797抗体及FDP3-2935抗体。
本发明的试剂盒的形态是如上所述含第1试剂和第2试剂的2试剂型的形态，但是含1个试剂的1试剂型的形态也可。从测定精度的观点等，作为试剂盒的形态，含第1试剂和第2试剂的2试剂型是优选的。更优选为，本发明的试剂盒是含：含缓冲液的第1试剂，和含上述的本发明的FDP测定用试剂的第2试剂的形态。
作为可在构成本发明的试剂盒的第1试剂中使用的缓冲液，可举出与在本发明的试剂中可在载体粒子的悬浮中使用的缓冲液相同的缓冲液。第1试剂含上述的蛋白质稳定化剂、防腐剂、pH调节剂、增感剂、无机盐等的添加物也可。
本发明的FDP测定方法可使用本发明的FDP测定用试剂或试剂盒实施。作为本发明的FDP测定方法之一实施方式，对于使用本发明的FDP测定用试剂盒测定活体样品中的FDP的方法，接下来具体说明。
首先，将含缓冲液的第1试剂和活体样品混合而温育。其中，作为活体样品，可举出从受试者得到的血清、血浆、尿等。将第1试剂和活体样品混合之时的容量比是5:1～50:1左右即可。另外，温育时间是1～10分钟左右即可。
接下来，向第1试剂和活体样品的混合物添加含吸附有上述的第1、第2及第3单克隆抗体的载体粒子的悬浮液的第2试剂。将该混合物和第2试剂混合之时的容量比是1:0.05～1:1.5左右即可。
如果添加第2试剂而混合，则由抗原抗体反应，发生FDP和第2试剂中的载体粒子的凝集。将此凝集的程度作为每1分钟的吸光度的变化量测定。此测定用可测定散射光强度、吸光度或透射光强度的光学机器进行是优选的。另外，测定波长可选择300～2400nm、优选为300～1000nm、更优选为从500～1000nm的范围适宜的波长。
活体样品中的FDP的浓度及/或量可使用由浓度已知的FDP标准物质的测定得到的标准曲线，从测定的吸光度的变化量算出。
在本发明的试剂盒中，将第1试剂和第2试剂混合之后，向两试剂的混合物添加活体样品而可将载体粒子的凝集的程度也在以光学方法测定的方法中利用。
再有，作为本发明的FDP测定方法中使用的第1、第2及第3单克隆抗体之一例，各自可举出FDP3-2920抗体、FDP3-797抗体及FDP3-2935抗体。
接下来对实施例进行说明，但本发明不限于这些实施例。
【实施例】
【实施例1：产生抗FDP单克隆抗体的杂交瘤的制备及该抗体的取得】
(1)免疫原(抗原)的制备
(1-1)一次纤溶的抗原的制备
向纤维蛋白原(Sigma公司)241mg(39.7mg/ml)添加纤溶酶(Sigma公司)至终浓度达60mU/ml，于37℃反应8小时。其后，加抑肽酶至终浓度达1U/ml，停止分解反应。将得到的反应液用12000×g离心20分钟，将得到的上清填充到用50mMTris缓冲液(pH7.4)平衡化的赖氨酸-琼脂糖4B柱(硼8ml)而进行层析之后，用旋柱除琼脂糖。
将得到的溶液由超滤用离心管(Amicon1550K；Millipore公司)用样品缓冲液(62.5mMTris、192mM甘氨酸、1％SDS(pH6.8))取代2次。将得到的溶液填充到SephacrylS-300(GEHealthcare公司)中，使用蠕动泵使以流速70～80μl/分流动而每10分钟回收级分。对于得到的各级分，通过使用分子量标志物的SDS-PAGE解析，回收含X级分、Y级分及D级分的级分。
将回收的级分填充到SephacrylS-300(GEHealthcare公司)，使用蠕动泵使以流速2ml/分流动而每30秒钟回收级分。对于得到的各级分，与上述同样地由SDS-PAGE解析，回收含一次纤溶的高分子级分(X级分及Y级分)的级分。将其由Amicon1550K(Millipore公司)用磷酸缓冲液(PBS)取代2次，作为一次纤溶的抗原。
(1-2)二次纤溶的抗原的制备
向纤维蛋白原(Sigma公司)92mg(23mg/ml)加氯化钙、人凝血酶(三菱Pharma公司)及第XIII因子(NIPRO公司)至终浓度分别达25mM、4U/ml及0.05U/ml，于37℃反应一晚，将纤维蛋白原变换为纤维蛋白。将反应液中产生的纤维蛋白凝胶用Tris缓冲液(TBS(pH7.4))50ml清洗，在4℃、3000×g离心10分钟而回收纤维蛋白凝胶。将此操作重复2次之后，使用50ml注射器将纤维蛋白凝胶弄碎。将纤维蛋白凝胶再悬浮于TBS(pH7.4)4.6ml。向悬浮液添加纤溶酶至终浓度达75mU/ml，于37℃反应6小时。其后，加抑肽酶至终浓度达1U/ml，停止分解反应。
将得到的反应液用12000×g离心20分钟，将得到的上清填充到用50mMTris缓冲液(pH7.4)平衡化的赖氨酸-琼脂糖4B柱(硼3.5ml)而进行层析之后，用旋柱除琼脂糖。
将得到的溶液由超滤用离心管(Amicon1550K；Millipore公司)用样品缓冲液(62.5mMTris、192mM甘氨酸、1％SDS(pH6.8))取代3次。将得到的溶液填充到SephacrylS-300(GEHealthcare公司)，使用蠕动泵使以流速2ml/分流动而每30秒钟回收级分。对于得到的各级分，由使用分子量标志物的SDS-PAGE解析，回收含XDP级分、DD/E级分、DD级分及E级分的级分。
将回收的级分填充到SephacrylS-300(GEHealthcare公司)，使用蠕动泵使以流速2ml/分流动而每30秒钟回收级分。对于得到的各级分与上述同样地由SDS-PAGE解析，回收含DD/E级分及DD级分的级分。将其由Amicon1550K(Millipore公司)用磷酸缓冲液(PBS)取代2次，作为二次纤溶的抗原。
(2)向动物的抗原的施用
作为被免疫动物，使用5周龄的近交系BALB/c系雌性小鼠(日本CharlesRiver株式会社)。将该小鼠在动物饲育室内(23±1℃、湿度70％)使用标准颗粒饲料，任意地给水而饲育。
将上述(1-1)及(1-2)中制备的各抗原用PBS稀释，作为200μg/ml的抗原溶液。将各抗原溶液0.5ml和同量的弗氏完全佐剂(Difco公司制)混合而乳化。将此乳化状的抗原给4只的5周龄的BALB/c系雌性小鼠腹腔内施用各200μl。再者，每2周，将用Ribi佐剂制备成100μg/ml的上述抗原给小鼠施用各20μg，计4次。再1个月后，将用Ribi佐剂制备成100μg/ml的上述抗原追加免疫之后，由后述的方法测定小鼠的抗体价。对抗体价高的小鼠，2周后，将用PBS制备成100μg/ml的抗原由小鼠的尾静脉施用而最终免疫。
(3)抗体价的测定
自免疫开始时定期由小鼠眼底网膜采集少量的血液，从这些血液分离血清。对于得到的血清，由以下的方法研究对纤维蛋白及纤维蛋白原分解产物的抗体价。
将上述(1-1)及(1-2)中制备的各抗原溶液用PBS稀释为10μg/ml，各自将各100μl分注于96孔微滴定板的孔，于4℃静置18小时。其后，用含0.05％Tween20的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)(以下，被称为清洗液)将孔清洗3次。接下来，向孔填充含1％BSA的10mM磷酸缓冲液(以下，被称为封闭缓冲液)，得到一次纤溶及二次纤溶的抗原固相。
向该抗原固相的各孔加血清20μl及封闭缓冲液80μl，于室温反应1小时。反应结束后，将孔用清洗液清洗5次之后，将用封闭缓冲液稀释2000倍的抗小鼠IgG-POD标记抗体(DAKO公司)100μl加到各孔，于室温反应30分钟。反应结束后，将孔用清洗液清洗5次之后，向各孔各加100μlODP底物液(国际试剂株式会社)，于室温反应15分钟。接下来，向各孔各加100μl2N硫酸而停止反应，测定在490nm的吸光度。
再有，作为阴性对照，代替血清而添加从非免疫小鼠得到的血清。
(4)细胞融合
自最终免疫3天后，从BALB/c小鼠摘出脾脏，在EMEM培养液中分散脾脏细胞。接下来，将脾脏细胞用EMEM培养液清洗4次之后，测量细胞数，得到7.0×108个的脾脏细胞。
作为用于细胞融合的亲本细胞株，使用8-氮杂鸟嘌呤(2-氨基-6-氧基8-氮杂嘌呤)抗性的BALB/c小鼠来源骨髓瘤培养细胞株(P3×63-Ag8·653；以下，被称为“X63细胞”)。将X63细胞在静置的含10％的胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基(含有20μg/ml8-氮杂鸟嘌呤)中继代培养。自细胞融合的3天前，在不含8-氮杂鸟嘌呤的含有10％的FCS的RPMI-1640培养基中再培养，使用处于对数增殖期的X63细胞。将X63细胞用RPMI-1640培养基清洗3次之后，测量细胞数，得到7.0×107个的细胞。
向RPMI-1640培养基溶解聚乙二醇-4000至达50(w/v)％，在得到的培养基中混合至上述的脾脏细胞和X63细胞的细胞数的比达到10:1。然后，使用电融合装置SSH-2(岛津制作所制)将细胞融合。再有，此细胞融合是在向脾脏细胞和骨髓瘤细胞的混合液通电交流电压(40V)10秒钟之后，施加直流脉冲(2.3kV/cm、脉宽40μ秒)的条件下进行。
向使含有10％的FCS的RPMI-1640培养基含有1×10-4M的次黄嘌呤、4×10-7M的氨基喋呤及1.6×10-5M的胸腺嘧啶(HAT)的HAT选择培养基中悬浮融合的细胞至达2.0×106个/ml。接下来，将此细胞悬浮液各50μl分注到96孔微滴定板的各孔之后，用CO2温育器于温度37℃、湿度95％、8％CO2气氛下培养。自培养开始第1天及第2天，将上述的HAT选择培养基各1滴添加到各孔。在第7天及第9天，将HAT选择培养基各2滴添加到各孔，再进行培养。约10天～2周后，将培养基交换为不含HAT的培养基，得到杂交瘤。
(5)杂交瘤的筛选
(5-1)1次筛选
在上述得到的杂交瘤之中，通过以下的方法选择产生对一次纤溶及二次纤溶的抗原的各自示反应性的抗体的株。
向上述(3)中使用的抗原固相的各孔加各杂交瘤的培养上清20μl及封闭缓冲液80μl，于室温反应1小时。反应结束后，将孔用清洗液清洗5次之后，将用封闭缓冲液稀释2000倍的抗小鼠IgG-POD标记抗体(DAKO公司)各100μl加到各孔，于室温反应30分钟。反应结束后，将孔用清洗液清洗5次之后，向各孔各加100μlODP底物液(国际试剂株式会社)，于室温反应15分钟。接下来，向各孔各加100μl2N硫酸而停止反应，测定在490nm的吸光度。再有，作为阴性对照，代替杂交瘤的培养上清而添加仅培养液。
基于测定结果，选择产生与一次纤溶的高分子级分反应的抗体的杂交瘤、以及产生与DD/E级分及DD级分反应的抗体的杂交瘤。
(5-2)2次筛选
将在1次筛选中选择的各杂交瘤用有限稀释法克隆，选择稳定地产生与一次纤溶的高分子级分反应的抗体的杂交瘤(1克隆；以下，称之为“FDP3-2920”)，和稳定地产生与DD/E级分及DD级分反应的抗体的杂交瘤(2克隆；以下，各自称之为“FDP3-797”及“FDP3-2935”)。
再有，上述的FDP3-2920、FDP3-797及FDP3-2935各自以保藏号NITEBP-949、保藏号NITEBP-950及保藏号NITEBP-951，在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(邮政编码292-0818、日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)于2010年6月1日保藏。
(6)从腹水的单克隆抗体的纯化
(6-1)腹水的制备
向6周龄、雌性BALB/c裸鼠(日本CharlesRiver株式会社)的腹腔内接种上述的各杂交瘤(1×107个/只)。自接种1周后，向该小鼠追加接种杂交瘤(1×107个/只)。自追加接种2周后，使用注射器从该小鼠采集腹水。再有，对于各杂交瘤，使用各5只上述的小鼠。
(6-2)硫酸铵盐析
向得到的腹水17.5ml各少量加至50％饱和的量的硫酸铵，边冷却边搅拌而得到沉淀。接下来，回收此沉淀，用PBS溶解而作为溶液。然后，将该溶液放入透析管，用4L的PBS透析12天。透析后，通过将管内的溶液用0.45μm滤器过滤，得到纯化的各单克隆抗体。
将由FDP3-2920的杂交瘤得到的抗体作为第1单克隆抗体使用(以下，称之为FDP3-2920抗体)。将由FDP3-797的杂交瘤得到的抗体作为第2单克隆抗体使用(以下，称之为FDP3-797抗体)。将由FDP3-2935的杂交瘤得到的抗体作为第3单克隆抗体使用(以下，称之为FDP3-2935抗体)。
(7)各单克隆抗体的反应性的检查
将对作为第1、第2及第3单克隆抗体的FDP3-2920抗体、FDP3-797抗体及FDP3-2935抗体的纤维蛋白及纤维蛋白原分解产物的反应性的差异，通过如以下一样的ELISA法检查。
(7-1)纤维蛋白原分解产物(FbgDP)的制备
向纤维蛋白原(Sigma公司)241mg(39.7mg/ml)添加纤溶酶(Sigma公司)至终浓度达60mU/ml，于37℃反应8小时。其后，加抑肽酶至终浓度达1U/ml，停止分解反应。将得到的反应液用12000×g离心20分钟，将得到的上清填充到用50mMTris缓冲液(pH7.4)平衡化的赖氨酸-琼脂糖4B柱(硼8ml)而进行层析之后，用旋柱除琼脂糖，制备FbgDP溶液。使用蛋白质定量试剂(Bio-Rad公司)测定得到的FbgDP溶液的蛋白质浓度。另外，Fb将gDP溶液之一部分在后述的本发明的FDP测定用试剂的向FDP的反应性的确认中使用。
将得到的FbgDP溶液由超滤用离心管(Amicon1550K；Millipore公司)用样品缓冲液(62.5mMTris、192mM甘氨酸、1％SDS(pH6.8))取代2次。将得到的溶液填充到SephacrylS-300(GEHealthcare公司)，使用蠕动泵使以流速70～80μl/分流动而每10分钟回收级分。对于得到的各级分，通过使用分子量标志物的SDS-PAGE解析，各自回收含X级分、Y级分、D级分、及E级分的级分。将其由Amicon1550K(Millipore公司)用磷酸缓冲液(PBS)取代2次，作为FbgDP抗原。
(7-2)纤维蛋白分解产物(FbnDP)的制备
向纤维蛋白原(Sigma公司)92mg(23mg/ml)加氯化钙、人凝血酶(三菱Pharma公司)及第XIII因子(NIPRO公司)至终浓度分别达25mM、4U/ml及0.05U/ml，于37℃反应一晚，将纤维蛋白原变换为纤维蛋白。将反应液中产生的纤维蛋白凝胶用Tris缓冲液(TBS(pH7.4))50ml清洗，在4℃、3000×g离心10分钟而回收纤维蛋白凝胶。将此操作重复2次之后，使用50ml注射器将纤维蛋白凝胶弄碎。将纤维蛋白凝胶再悬浮于TBS(pH7.4)4.6ml。向悬浮液添加纤溶酶至终浓度达75mU/ml，于37℃反应6小时。其后，加抑肽酶至终浓度达1U/ml，停止分解反应。将得到的反应液用12000×g离心20分钟，将得到的上清填充到用50mMTris缓冲液(pH7.4)平衡化的赖氨酸-琼脂糖4B柱(硼3.5ml)而进行层析之后，用旋柱除琼脂糖，制备FbnDP溶液。使用蛋白质定量试剂(Bio-Rad公司)测定得到的FbnDP溶液的蛋白质浓度。另外，将FbnDP溶液之一部分在后述的本发明的FDP测定用试剂的向FDP的反应性的确认中使用。
将得到的FbnDP溶液由超滤用离心管(Amicon1550K；Millipore公司)用样品缓冲液(62.5mMTris、192mM甘氨酸、1％SDS(pH6.8))取代3次。将得到的溶液填充到SephacrylS-300(GEHealthcare公司)，使用蠕动泵使以流速2ml/分流动而每30秒钟回收级分。对于得到的各级分，通过使用分子量标志物的SDS-PAGE解析，各自回收含XDP级分、DD/E级分、DD级分的级分。将其由Amicon1550K(Millipore公司)用磷酸缓冲液(PBS)取代2次，作为FbnDP抗原。
(7-3)纤维蛋白原抗原的制备
将纤维蛋白原溶解于TBS而得到的纤维蛋白原溶液(50mg/ml)作为纤维蛋白原抗原。
(7-4)由ELISA法的测定
将各抗FDP单克隆抗体溶液用PBS稀释为0.5μg/ml，各自将各100μl分注于96孔微滴定板的孔，于4℃静置18小时。其后，用含0.05％Tween20的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)(以下，被称为清洗液)将孔清洗3次。接下来，填充含1％BSA的10mM磷酸缓冲液(以下，被称为封闭缓冲液)，得到抗FDP单克隆抗体的固体固相。
将孔用清洗液清洗3次之后，向该抗体固相的各孔各加100μl上述制备的FbgDP各抗原及FbnDP各抗原，于室温反应30分钟。反应结束后，将孔用清洗液清洗3次之后，向各孔各加100μl过氧化物酶标记抗纤维蛋白原抗体(DAKO公司)，于室温反应1小时。反应结束后，将孔用清洗液清洗3次之后，向各孔各加100μlODP底物液(国际试剂株式会社)，于室温反应15分钟。接下来向各孔各加100μl2N硫酸，停止反应，测定在490nm的吸光度。
由ELISA法得到的结果示于表1。再有，在表1中，“+”示抗体与级分反应，“-”示抗体不与级分反应。
【表1】
由表1知，FDP3-2920抗体、FDP3-797抗体及FDP3-2935抗体对于FDP的反应性互相不同。
更具体而言，
-FDP3-2920抗体与纤维蛋白原、以及FDP的一次纤溶物的X级分、Y级分及D级分反应，并且与FDP的二次纤溶物的DD级分、DD/E级分及XDP级分反应；
-FDP3-797抗体不与纤维蛋白原反应，但与FDP的一次纤溶物的X级分、Y级分及E级分反应，并且与FDP的二次纤溶物的DD级分、DD/E级分及XDP级分反应；
-FDP3-2935抗体不与纤维蛋白原反应，但与FDP的一次纤溶物的Y级分及E级分反应，并且与FDP的二次纤溶物的DD级分、DD/E级分及XDP级分反应。
【实施例2：FDP测定用试剂及试剂盒的制备】
(1)含缓冲液的第1试剂的制备
通过将各试剂混合至示于表2的终浓度的缓冲液在1M氢氧化钠水溶液中将pH调节到7.1之后，用超纯水混合至1L来制备缓冲液。
【表2】
试剂 终浓度 制造商
MOPSO 75.5mM 株式会社同仁化学研究所
氯化钠 225mM MANAC株式会社
叠氮化钠 0.10％ 岸田化学株式会社
BSA 0.5％ PROLIANT公司
超纯水 适量
(2)含吸附有抗FDP单克隆抗体的载体粒子的悬浮液的FDP测定用试剂的制备
(2-1)FDP3-2920抗体的向乳胶粒子的吸附
混合于50mM2-羟基-3-吗啉代丙烷磺酸/150mMNaCl溶液至FDP3-2920抗体的终浓度达1mg/ml。然后，将此混合液与20％(重量比)乳胶溶液(粒径0.238μm；JSR株式会社)混合。
向得到的混合液等量加50mM2-羟基-3-吗啉代丙烷磺酸/150mMNaCl溶液/2％BSA溶液而混合之后，于10℃、38400×g离心30分钟。除去上清，向得到的沉淀物添加与上清等量的50mM2-羟基-3-吗啉代丙烷磺酸/150mMNaCl溶液/2％BSA/1.5％蔗糖溶液而混合。
将得到的混合液，在冰冷条件下，使用超声波破碎机(大岳公司制)、超声波处理装置(Dr.HielscherGmbhUP-200S相当品)实施超声处理，得到吸附有FDP3-2920抗体的乳胶粒子的悬浮液(抗体浓度39μg/ml)。
(2-2)FDP3-797抗体的向乳胶粒子的吸附
混合于50mM2-羟基-3-吗啉代丙烷磺酸/150mMNaCl溶液至FDP3-797抗体的终浓度达1mg/ml。以下，如同上述的(2-1)FDP3-2920抗体的向乳胶粒子的吸附，得到吸附有FDP3-797抗体的乳胶粒子的悬浮液(抗体浓度39μg/ml)。
(2-3)FDP3-2935抗体的向乳胶粒子的吸附
混合于50mM2-羟基-3-吗啉代丙烷磺酸/150mMNaCl溶液至FDP3-2935抗体的终浓度达1mg/ml。以下，如同上述的(2-1)FDP3-2920抗体的向乳胶粒子的吸附，得到吸附有FDP3-2935抗体的乳胶粒子的悬浮液(抗体浓度39μg/ml)。
(2-4)第2试剂的制备
通过将吸附有FDP3-2920抗体、FDP3-797抗体及FDP3-2935抗体的各抗体的乳胶粒子的悬浮液各自等量混合，得到含吸附有3种单克隆抗体的载体粒子的FDP测定用试剂。以下，将此FDP测定用试剂作为第2试剂。
另外，为了检查FDP3-797抗体和FDP3-2935抗体的对于FDP的反应性的差异，将吸附有FDP3-797抗体及FDP3-2935抗体的各抗体的乳胶粒子的悬浮液各自等量混合，得到含吸附有2种单克隆抗体的载体粒子的FDP测定用试剂。
【实施例3：本发明的FDP测定用试剂盒的向FDP的反应性的检查】
使用上述的实施例2中制备的本发明的FDP测定用试剂盒和其他公司制品测定血浆中的FDP。
作为本发明的FDP测定用试剂盒的第1试剂，使用上述的实施例2(1)中制备的试剂。另外，作为第2试剂，使用上述的实施例2(2)中制备的试剂。在第2试剂中，各自个别地吸附有各抗体的乳胶粒子的悬浮液的混合率(体积比)是1：1：1。
向FDP高值的Paer血浆(GoldenWestBiologicals,Inc.)添加SDS-PAGE用样品缓冲液(10％甘油、2％SDS、含0.01％BPB的62.5mMTris-HCl(pH6.8))，制备样品。将其由SDS-PAGE分离，将分离的蛋白质转印到PVDF膜后，使用抗人纤维蛋白原兔多克隆抗体进行蛋白印迹。从蛋白印迹的结果测定含D级分的一次纤溶级分的出现量，将一次纤溶级分是高值的组作为“纤溶亢进度高”，将其以外的组作为“纤溶亢进度低”而将Paer血浆分类为2组。
将上述的Paer血浆作为待测样品，将待测样品6μl和第1试剂84μl混合，于37℃反应20秒钟。将得到的反应液和第2试剂84μl混合，开始乳胶凝集反应。对于其他公司制品A～C，也根据各制品附带的手册将Paer血浆和试剂混合，开始乳胶凝集反应。使用CS-2000i(Sysmex株式会社)测定自反应开始1分钟后及2分钟后的在波长800nm的吸光度。从这些的测定结果，对各组求出每1分钟的吸光度的变化量，从其值算出FDP浓度。另外，检验2组的测定结果之间的显著差异。结果示于图1。再有，在图1中，待测样品组H示纤溶亢进度高的组，待测样品组L示纤溶亢进度低的组。另外，◆示中位值。
由图1知，本发明的FDP测定用试剂的显著概率是不足0.01(p＝0.0057)，但其他公司制品的显著概率是0.01以上。从而知，本发明的FDP测定试剂盒可区别纤溶亢进度高的血浆和纤溶亢进度低的血浆。
从而示，本发明的FDP测定用试剂及试剂盒，相比其他公司制品，对于从处于纤溶亢进状态的受试者得到的待测样品，也可更正确地测定FDP浓度。
本申请与2010年7月30日申请的日本国专利申请特愿2010-172222号相关，这些的专利权利要求、说明书、附图及摘要的全部通过引用并入本说明书中。

Claims (5)

1.抗FDP单克隆抗体，由以保藏号NITEBP-949在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心，于2010年6月1日保藏的杂交瘤产生。
2.FDP测定用试剂，其含
吸附有第1单克隆抗体的载体粒子、
吸附有第2单克隆抗体的载体粒子、和
吸附有第3单克隆抗体的载体粒子，
其中第1单克隆抗体是由以保藏号NITEBP-949在独立行正法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心，于2010年6月1日保藏的杂交瘤产生；
第2单克隆抗体是由以保藏号NITEBP-950在独立行正法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心，于2010年6月1日保藏的杂交瘤产生；
第3单克隆抗体是由以保藏号NITEBP-951在独立行正法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心，于2010年6月1日保藏的杂交瘤产生。
3.FDP测定用试剂盒，其含：
第1试剂，其由缓冲液构成、及
第2试剂，其为权利要求2中所述的FDP测定用试剂。
4.权利要求1的抗FDP单克隆抗体在制备FDP测定用试剂中的用途。
5.权利要求1的抗FDP单克隆抗体在制备FDP测定用试剂盒中的用途。
CN201180036439.4A 2010-07-30 2011-07-28 抗fdp单克隆抗体、使用其的fdp测定用试剂及试剂盒、以及fdp测定方法 Active CN103025871B (zh)

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