JP2023067793A

JP2023067793A - 新規ラテラルフローアッセイ

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Publication number: JP2023067793A
Application number: JP2022168320A
Authority: JP
Inventors: 卓人東條; Takahito Tojo; 真由美和田; Mayumi Wada; 大貴西口; Hiroki Nishiguchi; 彰人川原; Akihito Kawahara
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2022-10-20
Publication date: 2023-05-16
Also published as: WO2023074524A1

Abstract

【課題】新規なラテラルフローアッセイの提供。【解決手段】標識体に固定された抗体を用いて試料中の抗原を検出するラテラルフローアッセイであって、標識体が酸化鉄（ＩＩＩ）粒子である、ラテラルフローアッセイ。【選択図】なし

Description

本発明は、新規ラテラルフローアッセイに関する。

従来から、タンパク質、特に抗体及びその分子認識部位を含む断片を利用したイムノアッセイが医療診断領域で活用されてきた。例えば、鼻ぬぐい液、血液、尿等の臨床試料中に存在する特定の疾病に関与する抗原タンパク質の検出、特定の病原微生物やウイルス及び化学物質を定性的又は定量的に検出する臨床検査が知られている。イムノアッセイの中でもラテラルフローアッセイは、抗原抗体反応によりメンブレン上で生じる発色を目視することで抗原の存在を可視化できるため特殊な検出機器が不要であり、かつ簡便な操作で標的の検出が可能であることから、医療診断領域のみならず、臨床、獣医学、農学、食品産業、生体防御や衛生環境等の幅広い分野で活用されている。

ラテラルフローアッセイは、臨床検査法として感度及び再現性ともに非常に優れた方法であるが、特に医療診断領域以外の分野（農学、食品産業、衛生環境調査等）ではランニングコストの面で課題がある。食物アレルゲン検査用ラテラルフローアッセイや住環境調査用ラテラルフローアッセイ等の検出デバイスが非医療診断用途として市販されているものの、そのほとんどが１試験あたりの費用が１，０００円を超える価格帯で販売されている。例えば、食物アレルゲンや衛生環境調査等については本来消費者がそのようなデバイスを用いて必要なときに適宜行うべきであるが、デバイスが高価格であるために消費者の利用に制限が生じている。これはラテラルフローアッセイが基本的にディスポーザブル形態であり、その検出機能を担う高価な検出用担体や検出用タンパク質を再利用できないことに一因がある。特にラテラルフローアッセイ用の検出用担体については、金ナノ粒子が頻用されているが（例えば、非特許文献１)、金は希少金属であり、かつ世界の金市場の相場の影響を受け高価かつ価格不安定性があることが課題である。またラテックスナノ粒子や着色シリカナノ粒子、着色セルロースナノ粒子等も用いられているが、いずれも高度な技術を用いて製造されるナノ粒子であるために金ナノ粒子と同程度の価格帯で販売されており、そのような材料を用いても担体が高価であるという課題を解決するに至っていない。

一方、酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）（Ｆｅ_３Ｏ_４）ナノ粒子を用いた磁性検出型ラテラルフローアッセイが利用されているが、やはりナノ粒子が高価であることに加え、磁性を検出することに主眼が置かれているため専用の検出装置の利用が前提であることが、一般消費者が利用する上での課題となっている。また、酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）ナノ粒子を利用したラテラルフローアッセイについては、目視での確認も可能とされているものの（非特許文献２)、その視認性は不十分である。

Tanaka, R. et al. A novel enhancement assay for immunochromatographic test strips using gold nanoparticles. Anal Bioanal Chem 385, 1414-1420, 2006 Connolly, R. & O’ Kennedy, R. Magnetic lateral flow immunoassay test strip development -Considerations for proof of concept evaluation. Methods 116, 132-140, 2017

本発明は、従来法と比較して格段に低コストで実施可能な新規ラテラルフローアッセイを提供することに関する。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、ラテラルフローアッセイの検出用抗体を固定する担体、すなわち検出用抗体の標識体として種々の物質について検討したところ、安価に入手が可能であり、金ナノ粒子に類した赤色系統の天然色を有し、化学的に安定、かつ水に不溶な酸化物であり、さらに顔料としても用いられている安全な化合物である酸化鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ_２Ｏ_３）粒子が標識体として適していることを見出した。また、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を固定した場合、及び酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に微生物培養による安価生産が期待される重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン抗体を固定した場合の双方で、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子による発色を目視確認するラテラルフローアッセイを構築できることを見出した。さらに驚くべきことに、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子を用いるラテラルフローアッセイでは、酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）粒子を用いる場合と比較して圧倒的に視認性に優れていることも見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）及び２）に係るものである。
１）標識体に固定された抗体を用いて試料中の抗原を検出するラテラルフローアッセイであって、標識体が酸化鉄（ＩＩＩ）粒子である、ラテラルフローアッセイ。
２）酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体を含む、ラテラルフローアッセイ用試薬。

本発明によれば、従来の金ナノ粒子を標識体として用いるラテラルフローアッセイと同等の検出感度を有し、格段に低コストでのラテラルフローアッセイが可能となる。よって、ラテラルフローアッセイ型デバイスのコストダウンが見込まれ、医療診断領域及び非医療領域を問わず幅広い分野においてラテラルフローアッセイ型デバイスの活用が促進されることが期待される。

ラテラルフローアッセイ用テストストリップの一般的構造。酸化鉄（ＩＩＩ）粒子と酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）粒子の検出ライン視認性の比較。

本明細書において、「ラテラルフローアッセイ」とは、抗原に特異的に結合する抗体であって標識体に固定された標識抗体と、抗原に特異的に結合する抗体であってメンブレンに固定された捕捉抗体とを用いて、試料に含まれる抗原の存在を視覚的に検出する方法のうち、試料をメンブレンと水平方向に展開させる方法をいう。ここで、「標識体」とは、抗体を担持し、且つ視覚的に検知し得るマーカーとして機能する物質を意味する。ラテラルフローアッセイでは、具体的には、標識抗体と試料中の抗原とが複合体を形成し、この複合体をメンブレンに固定された捕捉抗体が捕捉することで複合体が集積して発色するため、試料中の抗原の存在を検出できる。本明細書において、抗体を担体やメンブレンに担持させることあるいは担持させた状態を「固定化」、「固定」と表現する。

本明細書において、目的となる「抗原」としては、特に制限されず、例えば、アレルゲン、バイオマーカー、ウイルス、細菌、真菌、原生動物等に由来する抗原が挙げられる。尚、本明細書において、「検出」という用語は、「測定」とも言い換えることができ、「抗原の検出」とは、抗原の存在又は不存在の証明、及び抗原の定量を含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈されない。

アレルゲンは、吸入、刺入、摂取又は接触により外部から生体に入り、過敏反応やアレルギー反応を惹起する物質を意味する。アレルゲンとしては、イネ科植物花粉（アシ、オオアワガエリ、オオスズメノテッポウ、カモガヤ、ギョウギシバ、小麦、コヌカグサ、スズメノヒエ、セイバンモロコシ、ナガハグサ、ハルガヤ、ヒロハウシノケグサ、ホソムギ等）；雑草花粉（アキノキリンソウ、イラクサ、オオブタクサ、カナムグラ、シロザタンポポ、ニガヨモギ、ヒメスイバ、ブタクサ、ブタクサモドキ、フランスギク、ヘラオオバコ、ヨモギ等）；樹木花粉（アカシア、オリ一ブ、カエデ、クルミ、クワ、コナラ、シラカンバ、スギニレ、ハンノキ、スギ、ヒノキ、ビャクシン、ブナ、マツ、ヤナギ等）；真菌又は細菌類（アスペルギルス、アルテルナリア、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、カンジダ、クラドスポリウム、トリコフィトン、ピティロスポリウム、ペニシリウム、ヘルミントスポリウム、マラセチア、ムコール等）；動物表皮（アヒル羽毛、猫皮屑、犬皮屑、牛皮屑、馬皮屑、家兎上皮、ハムスター上皮、モルモット上皮、羊上皮、豚上皮、ヤギ上皮、ニワトリ羽毛、ガチョウ羽毛、セキセイインコ羽毛、セキセイインコのふん、マウス、ラット等）；昆虫（アシナガバチ、ガ、ゴキブリ、スズメバチ、ミツバチ、ヤブカ、ユスリカ(成虫)等）；寄生虫（アニサキス、回虫等）；ダニ（アシブトコナダニ、ケナガコナダニ、コナヒョウダニ、サヤアシニクダニ、ヤケヒョウダニ等）；食物（卵、乳、小麦、そば、落花生、えび、かに、アーモンド、あわび、いか、いくら、オレンジ、カシューナッツ、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、ごま、さけ、さば、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチン等）；ヒトインシュリン等に由来するアレルゲンが挙げられる。

バイオマーカーは、血液、だ液、汗などの体液、尿、糞便などに含まれるタンパク質、核酸などの生体内の物質で、病状の変化や治療の効果の指標となり、疾患の診断や予後の予測などに用いられるものをいう。バイオマーカーとしてはＣＫ－ＭＢ、Ｈ－ＦＡＢＰ、ＢＮＰ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、トポロニン、ミオグロビン、アルブミン、セルロプラスミン、カルビンディン、クラステリン、シスタチンＣ、ＫＩＭ－１、ＮＧＡＬ、Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ＴＦＦ３、ＴＩＭＰ－１、ＶＥＧＦ－Ａ、Ｌ-ＦＡＢＰ、絨毛性ゴナドトロピン、インターロイキン、アミラーゼ、ＮＭＰ２２、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＳＬＸ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、ＮＳＥ、ＰｒｏＧＲＰ、ＣＡ１９－９、ＣＡ１９－９、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ－II、ＡＦＰ－Ｌ３、Ｓｐａｎ－１、ＤＵＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＢＴＡ、ＣＡ１５－３等が挙げられる。

ウイルスは、核酸の種類（ＲＮＡ、ＤＮＡ）及びエンベロープの有無を問わず、すべての種類のウイルスであり得る。例えば、核酸としてＲＮＡを有するインフルエンザウイルス；コロナウイルス；ＳＡＲＳコロナウイルス；ＳＡＲＳコロナウイルス－２；ＲＳウイルス；ムンプスウイルス；ラッサウイルス；デングウイルス；風疹ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス、ノロウイルス；ポリオウイルス；エコーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；Ｅ型肝炎ウイルス；ライノウイルス；アストロウイルス；ロタウイルス；コクサッキーウイルス；エンテロウイルス；サポウイルス、核酸としてＤＮＡを有するヒトヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス、アデノウイルス；Ｂ１９ウイルス；パポバウイルス；ヒトパピローマウイルス等が挙げられる。細菌としては、百日咳菌、ジフテリア菌、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクター、髄膜炎菌、緑膿菌、肺炎球菌、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、破傷風菌、レジオネラ菌、結核菌、マイコプラズマ、腸炎ビブリオ、サルモネラ属菌、病原大腸菌、カンピロバクター、ウエルシュ菌、赤痢菌、セレウス菌、ボツリヌス菌、ミュータンス連鎖球菌等が挙げられる。真菌としては、アスペルギルス属真菌（例えばAspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus terreus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus ustus等)、ブラストミセス属真菌（例えば、Blastomyces dermatitidis等）、カンジダ属真菌（例えばCandida albicans等）、コクシジオイデス属真菌（例えばCoccidioides immitis等）、クリプトコッカス属真菌（例えばCryptococcus neoformans、Cryptococcus gattii等）、ヒストプラズマ属真菌（例えばHistoplasma capsulatum等）、パラコクシジオイデス属真菌（例えばParacoccidioides brasiliensis等）、スポロトリクス属真菌（例えばSporothrix schenckii等）等が挙げられる。原生動物としては、マラリア原虫、リーシュマニア、クリプトスポリジウム、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、トリコモナス、トキソプラズマ、バベシア、赤痢アメーバ、ジアルジア等が挙げられる。

本発明のラテラルフローアッセイに供される試料としては、抗原を含有しているか、抗原を含有している可能性のある試料が挙げられる。斯かる試料としては、気管スワブ、鼻腔拭い液、口腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、鼻汁鼻かみ液、唾液、痰、涙、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等の生体試料の他、食品原材料、加工食品、環境試料、硬質又は軟質表面から採取された試料等の何れでもよい。試料は、そのまま又は必要に応じて、試料の粉砕、抗原の抽出、抗原を含む溶液の回収の後にアッセイに供してもよく、また目的の抗原を適宜、濃縮、あるいは水もしくは緩衝液で希釈してもよい。好ましくは、試料は液体試料である。

本発明の方法は、標識体に固定された抗体を用いて試料中の抗原を検出するラテラルフローアッセイであって、標識体が酸化鉄（ＩＩＩ）粒子である、ラテラルフローアッセイである。

酸化鉄（ＩＩＩ）は、化学式Ｆｅ_２Ｏ_３で表される赤褐色固体である（ＣＡＳ登録番号：１３０９－３７－１）。酸化鉄（ＩＩＩ）は、水に不溶で化学的に安定な化合物であり、顔料としての使用実績がある等安全性が高い。また、安価で大量に入手可能である。

酸化鉄（ＩＩＩ）粒子の形状は、特に限定されるものではなく、例えば、球状、針状、紡錘状であり得る。
また、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、１０ｎｍ以上が好ましく、５０ｎｍ以上がより好ましく、１０００ｎｍ以下が好ましく、５００ｎｍ以下がより好ましい。酸化鉄（ＩＩＩ）粒子の平均粒子径の具体的な範囲としては、１０～１０００ｎｍが好ましく、５０～５００ｎｍがより好ましい。尚、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子の平均粒子径は、レーザー回折／散乱法により測定することができる。

酸化鉄（ＩＩＩ）粒子としては、例えば、酸化第二鉄（粒子径：３００ｎｍ、株式会社高純度化学研究所）、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｏｘｉｄｅ（粒子径：＜５μｍ、シグマアルドリッチ）等が市販されており、これらを用いることができる。

酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定される抗体は、目的の抗原と特異的に結合する抗体であればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。また、抗体のフラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ’）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＶＨ及びＶＬ中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合しているジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、又はｓｃＦｖが二量体化した二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）であってもよい。さらに、目的の抗原と特異的に結合する限りにおいて、抗体の一部を含むペプチド、すなわち抗体を構成するアミノ酸配列の一部を備えるペプチドも抗体のフラグメントに含まれる。抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹの何れのイムノグロブリンクラスであってもよいが、好ましくはＩｇＧである。また、抗体は、非ヒト動物の抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の何れであってもよい。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ラクダ、ラマ、アルパカ等の抗体を挙げることができる。

酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定される抗体は、市販のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を使用することができる。あるいは、公知の手段を用いて作製されたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を使用することもできる。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマから産生されるもの、及び抗体遺伝子又は抗体フラグメント遺伝子を設計し周知の遺伝子工学的手法を用いて生産されるものが包含される。
例えば、抗体は、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡと、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡを、それぞれ適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入した形質転換体からＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域を製造し、これらを連結可能なペプチドで連結させる、或いはＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡとＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡを、公知のリンカーをコードするＤＮＡで繋いで適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞内で発現させる、等により抗原結合能を持った一本鎖の組換え抗体タンパク質（ｓｃＦｖ）を生産することが挙げられる（MacCfferty, J. et al., Nature, 348, 552-554,1990、Tim Clackson et al, Nature, 352, 642-628, 1991等参照）。また、さらに、可変領域をコードするＤＮＡと定常領域をコードするＤＮＡとを結合させて発現させたものを生産することであってもよい。この場合、定常領域は、可変領域の由来する抗体と同一のものであっても、あるいは異なる抗体に由来するものであってもよい。

抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。例えば、抗原ペプチドを、必要に応じて、適当なキャリアータンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）やウシ血清アルブミン等と結合することによって、より免疫原性を高め、非ヒト哺乳動物に免疫することにより作製することができる。尚、感作抗原（免疫原）として用いられる抗原ペプチドは、遺伝子工学的手法又は化学合成により作製することができる。

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞である哺乳動物のミエローマ細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、動物の皮下、皮内、腹腔等に投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宣決定されるが、通常の投与量は１回当たり１０μｇ～１ｍｇ程度が好ましい。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から採血し、血清成分を精製することでポリクローナル抗体を得ることができる。血清成分を精製する際には、感作抗原を固定化したアフィニティーカラム等を使用することができる。

モノクローナル抗体を作製する際には、抗体レベルが上昇した哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合を行う。細胞融合を行う際の好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えばＰ３Ｘ６３、ＮＳ－１、ＭＰＣ－１１、ＳＰ２／０等が適宜使用される。

前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、たとえば、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）等に準じて行うことができる。すなわち、ポリエチレングリコール（平均分子量１０００～６０００のＰＥＧ、３０～６０％濃度）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等の細胞融合促進剤の存在下、所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を添加し、ＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液等の栄養培養液中で、免疫細胞とミエローマ細胞を混合することによって、融合細胞（ハイブリドーマ）の形成が行われる。

融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地で１日～７日間培養し、未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマをその産生する抗体によりさらに選択する。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマが産生する抗体の活性を検出する方法は、公知の方法を使用することができる。例えばＥＬＩＳＡ法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。

得られたハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が採用される。

抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法又はアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行うことができる。

あるいは、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定される抗体は、重鎖可変ドメイン抗体であってもよい。重鎖可変ドメイン抗体としては、ＶＨＨ抗体やＩｇＮＡＲ抗体が挙げられる。ＶＨＨ抗体は、ラクダ科の動物によって産生される軽鎖を持たない重鎖抗体の可変領域を含む単一のドメイン（シングルドメイン）からなる低分子抗体である。ＶＨＨ抗体は、ＩｇＧ抗体のＨ鎖等と同様に３本の抗原結合ループ（抗原相補性決定領域；ＣＤＲ）を有する。ＶＨＨ抗体は、その分子量がＩｇＧ抗体の１０分の１と小さいため、通常のＩｇＧでは立体構造上の問題からエピトープに結合することができない場合でも結合が可能で、また多くの糖鎖で修飾されたウイルス粒子の表面等にも結合できるため、標的分子になり得る幅が広い。さらに、ＶＨＨ抗体は耐酸性や耐熱性にも優れており、ＩｇＧとは異なって培養細胞で産生させる必要がなく、大腸菌、酵母等で生産することができる。このため、大量生産しやすく、精製も容易であるという利点がある。さらに、ＶＨＨ抗体は１本鎖のペプチドで構成されているため、蛋白質工学の技術又は化学修飾等の技術を用いて機能の改変がしやすい。これらの点から、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定される抗体は、重鎖可変ドメイン抗体であることが好ましく、ＶＨＨ抗体であることがより好ましい。

重鎖可変ドメイン抗体の作製方法は特に限定されず、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。例えば、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション（ＮａｔｉｖｅＣｈｅｍｉｃａｌＬｉｇａｔｉｏｎ；ＮＣＬ）法を組み合わせて作製することや遺伝子工学的に作製することができるが、抗体をコードする核酸を適当なベクター（例えば、プラスミド）に組み込んで、これを宿主細胞に導入し、組換え抗体として産生させる方法が好ましい。

ここで、抗体発現用プラスミドとしては、各種の宿主細胞に適したプラスミドを用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１９その他の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＨＹ３００ｐＬＫその他の枯草菌由来のベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５その他の酵母由来ベクター；λファージその他のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスその他のウイルスベクターの他、これらを適宜改変したベクターを用いることができる。

これらの発現プラスミドは、各々のプラスミドに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現プラスミドには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグ等を融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。

抗体産生菌は、所望の方法、例えば、エレクトロポレーション、プロトプラスト－ＰＥＧ法などによって、上記の発現プラスミドを所望の菌に導入することにより作製できる。組換え抗体の産生に使用される宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、コリネ菌、各種のカビ、動物細胞、植物細胞その他の細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞又は酵母細胞等を挙げることができる。これらのうちでも、コリネ菌と枯草菌が好適に使用でき、生産性が高い枯草菌がより好ましい。

発現させた抗体を培養菌体又は培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体又は培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体又は細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。また分泌発現の場合は培養液の遠心上清から発現させた抗体を取得することもできる。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的のペプチドを取得することができる。

公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法又は等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。

一例において、目的の抗原が卵に含まれるリゾチームである場合、ＶＨＨ抗体の具体例としては、配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（後記実施例においては「１ＺＶＹ」と称する）、配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（後記実施例においては「１ＺＶＨ」と称する）等が挙げられる。別の一例において、目的の抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の抗原であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１タンパク質である場合、ＶＨＨ抗体の具体例としては、配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（後記実施例においては「Ｅ９」と称する）等が挙げられる。別の一例において、目的の抗原がイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）である場合、ＶＨＨ抗体の具体例としては、配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（後記実施例においては「ＶＨＨ２８－Ｈｉｓ」と称する）等が挙げられる。

酸化鉄（ＩＩＩ）粒子への抗体の固定化は、物理的吸着によるものであっても、官能基を介した共有結合等の化学的な結合によるものであっても、素材吸着ペプチドなどを用いた吸着によるものであってもよいが、操作性の点から、物理的吸着又は素材吸着ペプチドなどを用いた吸着が好適に用いられる。物理的吸着又は素材吸着ペプチドなどを用いた吸着は、通常、所定の緩衝液中で実施することができる。緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等通常使用される緩衝液を挙げることができる。緩衝液のｐＨは、６．０～９．５が好ましく、６．５～８．５がより好ましく、７．０～８．０がさらに好ましい。抗体の濃度は、０．０１～１００μｇ／ｍＬが好ましく、０．１～２０μｇ／ｍＬがより好ましく、１～１０μｇ／ｍＬがさらに好ましい。
抗体の固定化にあたって、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子は、そのまま用いてもよいし、抗体固定化前に、固定化対象以外のタンパク質の非特異的な固定化を減少させるべく、タンパク質固定化に関する化学修飾、例えば、ＰＥＧ、ＮＨＳ、カルボキシル基、アミン基、ストレプトアビジン等による修飾を予め行ってもよいが、本発明においては、抗体固定化前に斯かる化学修飾を受けていない未修飾の酸化鉄（ＩＩＩ）粒子を用いるのが好ましい。
抗体固定化後、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子は、さらに、通常使用されるブロッキング剤によりブロッキングしてもよい。ブロッキングには、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質や、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ＰＥＧ等の高分子化合物が使用可能である。
斯くして酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体、すなわち酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体は、変性を阻止するための保存試薬中に分散させて保存すればよい。変性阻止剤としては、ＢＳＡ等のタンパク質、グリセリン、糖等が用いられる。

本発明のラテラルフローアッセイにおいては、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体を用いて試料中の抗原を検出する。具体的には、当該アッセイは、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体と試料とを接触させることを含む。一実施形態において、本発明のラテラルフローアッセイは、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体を含む試薬、好ましくは酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体、及び捕捉抗体が固定されたメンブレンを含む試薬を用いて行うことができる。

ここで、捕捉抗体は、目的の抗原と特異的に結合する抗体であればよく、上記の酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定される抗体と同様のものが挙げられる。検出感度の点から、捕捉抗体としては、所謂サンドイッチアッセイにより抗原を検出することができるように、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定される抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を用いることが好ましい。

メンブレンとしては、任意の材質のものが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロプレン、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体等の多糖類、セラミックス等をメンブレン状にしたものが使用できる。メンブレンの孔径と構造を適宜選択することにより、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体と抗原とから形成される複合体が該メンブレン上を展開する速度を制御することが可能である。メンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレンを用いるのが好ましく、その孔径は、展開速度の点から、１～２０μｍが好ましく、５～１０μｍがより好ましい。

メンブレンには、捕捉抗体が固定されている。捕捉抗体は、メンブレン上に検出ラインを形成するように固定されるのが好ましい。捕捉抗体のメンブレンへの固定化は、物理的吸着によるものであっても、官能基を介した共有結合等の化学的な結合によるものであっても、素材吸着ペプチドなどを用いた吸着によるものであってもよいが、操作性の点から、物理的吸着又は素材吸着ペプチドなどを用いた吸着が好適に用いられる。捕捉抗体のメンブレンへの固定化は、公知の方法により実施することができる。例えば、捕捉抗体を所定の濃度に調整し、その液をノズルから一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置等を用いて、メンブレンにライン状に塗布することにより行われる。この際、捕捉抗体の濃度は、０．０１～１００ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．１～１０ｍｇ／ｍＬがより好ましい。また、捕捉抗体のメンブレンへの固定量は、０．５～２μＬ／ｃｍが好適である。メンブレン上の捕捉抗体を固定化する位置は、アッセイ系の設計に適合するよう適宜選択することができる。
また、上記の捕捉抗体液は、通常所定の緩衝液を用いて調製することができる。その緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等通常使用される緩衝液を挙げることができる。緩衝液のｐＨは６．０～９．５の範囲が好ましく、６．５～８．５がより好ましく、７．０～８．０がさらに好ましい。
捕捉抗体固定化後、メンブレンは、さらに、通常使用されるブロッキング剤によりブロッキングしてもよい。ブロッキングには、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質や、ＰＶＡ、ＰＶＰ、ＰＥＧ等の高分子が使用可能である。
捕捉抗体が塗布されたメンブレンを乾燥することにより、適当な量の捕捉抗体が固定されたメンブレンを得ることができる。

メンブレンには、さらにコントロール捕捉抗体が固定されていてもよい。コントロール捕捉抗体は、メンブレン上にコントロールラインを形成するように固定されるのが好ましい。コントロール捕捉抗体は、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体と結合できる抗体であればよく、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体の種類、由来等に応じて、適宜選択することができる。コントロールラインは、アッセイの信頼性を担保するためのものである。コントロール捕捉抗体のメンブレンへの固定化方法は、上述の捕捉抗体の場合と同様である。メンブレン上のコントロール捕捉抗体を固定化する位置は、アッセイ系の設計に適合するよう適宜選択することができ、検出ラインよりも下流とすることが好ましい。

具体的なアッセイの一例を以下に示す。酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体と試料とを接触させて試料液を調製し、捕捉抗体が固定されたメンブレンに試料液を滴下する、あるいは捕捉抗体が固定されたメンブレンを試料液に浸漬すると、試料液は毛細管現象によりメンブレン上を展開していく。試料中に目的の抗原を含む場合には、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体と試料中の目的の抗原とが複合体を形成し、これをメンブレン上の捕捉抗体が捕捉して複合体が集積することで、検出ラインに酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に由来する赤色の発色を生じる。一方、試料中に目的の抗原を含まない場合は、検出ラインには発色を生じない。斯かる発色を指標に、試料中の目的の抗原の有無を測定できる。すなわち、検出ラインに発色が認められれば、試料には目的の抗原が含まれていると判定でき、検出ラインに発色が認められなければ、試料には目的の抗原が含まれていないと判定することができる。尚、メンブレンがコントロールラインを有する場合、試料中の目的の抗原の有無にかかわらず、コントロール捕捉抗体が余剰の酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体を捕捉して酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体が集積することで、コントロールラインに酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に由来する赤色の発色を生じる。斯かる発色を指標に、アッセイの妥当性を評価することができる。すなわち、コントロールラインに発色が認められれば、アッセイが正常に行われたと判定でき、コントロールラインに発色が認められなければ、アッセイが正常に行われなかったと判定することができる。

別の一実施形態において、本発明のラテラルフローアッセイは、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、メンブレン、及び吸収パッドで構成される一般的なラテラルフローアッセイ用試薬（テストストリップ）を用いて行うことができる。テストストリップの一般的構造を図１に示す。本発明において、コンジュゲートパッドには酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体が保持され、メンブレンには捕捉抗体が固定されている。

サンプルパッドとは、試料を滴下する部位であり、パッドに成型された状態で試料を吸収し、試料が通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。サンプルパッドに適した材料としては、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が挙げられるが、これらに限定されない。サンプルパッドには、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることもできる。

コンジュゲートパッドとは、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体を保持し、試料が該コンジュゲートパッドを通過する際、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体と試料中の目的の抗原とが複合体を形成する機能を有する部位をいう。
コンジュゲートパッドに適した材料としては、紙、セルロース混合物、ニトロセルロース、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、ガラス繊維又はレーヨンのような不織繊維が挙げられるが、これらに限定されない。

メンブレンとしては、上述と同様のものを用いることができる。メンブレンには、捕捉抗体が固定された検出ラインを含み、さらに、コントロール捕捉抗体が固定されたコントロールラインを含むことが好ましい。メンブレンへの捕捉抗体、コントロール捕捉抗体又はこれら両方の固定化方法は、上述したとおりである。

吸収パッドとは、最下流に位置し、メンブレン上を展開した試料を吸収することにより試料の展開を制御する液体吸収性を有する部位である。吸収パッドに適した材料としては、例えば、ろ紙を挙げることができるが、これに限定されない。

上記試薬は、メンブレンにサンプルパッド、コンジュゲートパッド、吸収パッドが配置装着されたものである。配置については、適宜に変更可能であるが、サンプルパッドに滴下された試料が、毛細管現象によってサンプルパッドを通過し、コンジュゲートパッドに移送され、さらに毛細管現象によってコンジュゲートパッドを通過してメンブレンに移送され、メンブレン上を展開し、吸収パッドに吸収されるように、各部位を配置するのが好ましい。これらは、通常、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配列させる。固相支持体は、試料の展開を妨げない物質で構成することが好ましく、また、接着剤の成分も試料の展開を妨げない物質とすることが好ましい。尚、メンブレンの機械的強度を上げ、且つアッセイ中の水分の蒸発（乾燥）を防ぐ目的でポリエステルフィルム等をラミネートすることも可能である。該試薬は、試薬の大きさや、試料の添加方法・位置、捕捉抗体の固定化位置等を考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができる。このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。

具体的なアッセイの一例を以下に示す。試料液をサンプルパッドに滴下すると、試料液は毛細管現象によりサンプルパッド、コンジュゲートパッドを順次通過し、メンブレン上を展開していく。試料中に目的の抗原を含む場合には、コンジュゲートパッドに保持された酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体と試料中の目的の抗原とが複合体を形成し、これをメンブレン上の捕捉抗体が捕捉して複合体が集積することで、検出ラインに酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に由来する赤色の発色を生じる。一方、試料中に目的の抗原を含まない場合は、検出ラインには発色を生じない。斯かる発色を指標に、試料中の目的の抗原の有無を測定できる。すなわち、検出ラインに発色が認められれば、試料には目的の抗原が含まれていると判定でき、検出ラインに発色が認められなければ、試料には目的の抗原が含まれていないと判定することができる。尚、メンブレンがコントロールラインを有する場合、試料中の目的の抗原の有無にかかわらず、コントロール捕捉抗体が余剰の酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体を捕捉して酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体が集積することで、コントロールラインに酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に由来する赤色の発色を生じる。斯かる発色を指標に、アッセイの妥当性を評価することができる。すなわち、コントロールラインに発色が認められれば、アッセイが正常に行われたと判定でき、コントロールラインに発色が認められなければ、アッセイが正常に行われなかったと判定することができる。

後記実施例に示すように、ラテラルフローアッセイにおいて、抗原に特異的に結合する抗体を固定化する標識体として酸化鉄（ＩＩＩ）粒子を用いると、酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）粒子（前記非特許文献２）を用いる場合と比較して、圧倒的に視認性に優れる。斯かるアッセイでは、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子の磁性を指標とせずに、発色を指標とすることから、専用の検出装置が不要であり、目視という簡便な手法で試料中の抗原を検出することができる。また、標識体として酸化鉄（ＩＩＩ）粒子を用いると、標識体として汎用されている金コロイド粒子と同等の検出感度が得られる。酸化鉄（ＩＩＩ）粒子は、容易に安価で入手可能であることから、金コロイド粒子と比べて、１アッセイあたりの標識体のコストが１００分の１以下であり、ラテラルフローアッセイの格段のコストダウンが可能である。さらに、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定する抗体として、通常のＩｇＧ抗体より安価大量生産できるＶＨＨ抗体を用いれば、量産性向上やさらなるコストダウンも可能である。

上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の態様を開示する。
＜１＞標識体に固定された抗体を用いて試料中の抗原を検出するラテラルフローアッセイであって、標識体が酸化鉄（ＩＩＩ）粒子である、ラテラルフローアッセイ。
＜２＞酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体と試料とを接触させることを含む、＜１＞記載のラテラルフローアッセイ。
＜３＞酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体と試料中の抗原とから形成される複合体を捕捉抗体により捕捉することを含む、＜１＞又は＜２＞記載のラテラルフローアッセイ。
＜４＞捕捉抗体がメンブレンに固定されたものである、＜３＞記載のラテラルフローアッセイ。
＜５＞酸化鉄（ＩＩＩ）粒子による発色を指標として抗原を検出することを含む、＜１＞～＜４＞のいずれか１項記載のラテラルフローアッセイ。
＜６＞発色が、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体と試料中の抗原とから形成される複合体が集積して生じるものであり、好ましくは、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体と試料中の抗原とから形成される複合体が捕捉抗体により捕捉されて集積して生じるものである、＜５＞記載のラテラルフローアッセイ。
＜７＞発色が認められる場合に試料中に抗原が含まれていると判定し、発色が認められない場合に試料中に抗原が含まれていないと判定することを含む、＜５＞又は＜６＞記載のラテラルフローアッセイ。
＜８＞酸化鉄（ＩＩＩ）粒子の平均粒子径が１０～１０００ｎｍ、好ましくは５０～５００ｎｍである、＜１＞～＜７＞のいずれか１項記載のラテラルフローアッセイ。
＜９＞酸化鉄（ＩＩＩ）粒子が抗体固定前にタンパク質固定化に関する化学修飾を受けていない酸化鉄（ＩＩＩ）粒子である、＜１＞～＜８＞のいずれか１項記載のラテラルフローアッセイ。
＜１０＞酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体が、好ましくはＩｇＧ抗体又は重鎖可変ドメイン抗体であり、より好ましくは重鎖可変ドメイン抗体であり、さらに好ましくはＶＨＨ抗体であり、さらに好ましくは配列番号１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体である、＜１＞～＜９＞のいずれか１項記載のラテラルフローアッセイ。
＜１１＞捕捉抗体が、好ましくはＩｇＧ抗体又は重鎖可変ドメイン抗体であり、より好ましくは重鎖可変ドメイン抗体であり、さらに好ましくはＶＨＨ抗体であり、さらに好ましくは配列番号１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体である、＜３＞～＜１０＞のいずれか１項記載のラテラルフローアッセイ。
＜１２＞酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体を含む、ラテラルフローアッセイ用試薬。
＜１３＞捕捉抗体が固定されたメンブレンをさらに含む、＜１２＞記載の試薬。
＜１４＞サンプルパッド、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体を保持するコンジュゲートパッド、捕捉抗体が固定されたメンブレン、及び吸収パッドを含む、＜１２＞又は＜１３＞記載の試薬。
＜１５＞酸化鉄（ＩＩＩ）粒子の平均粒子径が１０～１０００ｎｍ、好ましくは５０～５００ｎｍである、＜１２＞～＜１４＞のいずれか１項記載の試薬。
＜１６＞酸化鉄（ＩＩＩ）粒子が抗体固定前にタンパク質固定化に関する化学修飾を受けていない酸化鉄（ＩＩＩ）粒子である、＜１２＞～＜１５＞のいずれか１項記載の試薬。
＜１７＞酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体が、好ましくはＩｇＧ抗体又は重鎖可変ドメイン抗体であり、より好ましくは重鎖可変ドメイン抗体であり、さらに好ましくはＶＨＨ抗体であり、さらに好ましくは配列番号１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体である、＜１２＞～＜１６＞のいずれか１項記載の試薬。
＜１８＞捕捉抗体が、好ましくはＩｇＧ抗体又は重鎖可変ドメイン抗体であり、より好ましくは重鎖可変ドメイン抗体であり、さらに好ましくはＶＨＨ抗体であり、さらに好ましくは配列番号１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体である、＜１３＞～＜１７＞のいずれか１項記載の試薬。

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産１
（１）使用菌株
枯草菌株はＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８株の派生株を用いた。細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ、ａｐｒＸ）の欠損については特許第４４８５３４１号公報に記載されている方法に従い行った（欠損株はそれぞれΔｅｐｒ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ、ΔｎｐｒＢ、Δｂｐｒ、ΔｎｐｒＥ、Δｖｐｒ、ΔａｐｒＥ、ΔａｐｒＸと記載。全て欠損している株は１６８Ｄｐｒ９と記載）。また胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子の欠損については特許第４３３６０８２号公報に記載されている方法に従い行った（欠損株はΔｓｉｇＦと記載）。また遺伝子構築のための大腸菌株についてはＥＣＯＳＣｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．ｃｏｌｉＤＨ５ α株（ニッポンジーン）を用いた。

（２）使用培地
ＬＢ培地：１％Ｂａｃｔｏ^ＴＭＴｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％Ｂａｃｔｏ^ＴＭＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、１％塩化ナトリウム。平板培地には１．５％の寒天を加えた。必要に応じてテトラサイクリン（５０ｐｐｍ）を加えた。
ＳＭＭＰ溶液：ＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＭｅｄｉｕｍ３（Ｄｉｆｃｏ）（３５ｇ／Ｌ）、スクロース（１７１．５ｇ／Ｌ）、マレイン酸２Ｎａ（３．２ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（４．０６ｇ／Ｌ）
ＰＥＧ溶液：スクロース（８５．７５ｇ／Ｌ）、マレイン酸２Ｎａ（１．６ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（２．０３ｇ／Ｌ）、ＰＥＧ８０００（４００ｇ／Ｌ）
ＤＭ３培地：１％ＣＭＣ（関東化学）、０．５％Ｂａｃｔｏ^ＴＭＣａｓａｍｉｎｏＡｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％Ｂａｃｔｏ^ＴＭＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、８．１％コハク酸二ナトリウム・６Ｈ_２Ｏ、０．３５％リン酸水素二カリウム、０．１５％リン酸二水素カリウム、０．５％グルコース、２０ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、５０ｐｐｍテトラサイクリン。平板培地には１％の寒天を加えた。
２×Ｌ－ｍａｌ培地：２％Ｂａｃｔｏ^ＴＭＴｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）、１％Ｂａｃｔｏ^ＴＭＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、１％塩化ナトリウム、７．５％マルトース一水和物、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン、１５ｐｐｍテトラサイクリン
試薬は特に記述が無い場合は富士フイルム和光純薬社製を用いた。

（３）遺伝子プラスミドの構築
遺伝子発現プラスミド構築は以下の手順で行った。配列番号１及び２の人工合成遺伝子（サーモフィッシャー社）を混合し後述のプロトプラスト形質転換法に従ってＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株に導入した。形質転換されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株よりｐＫプラスミドを抽出した。ｐＫプラスミドをテンプレートとし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）及び配列番号３と４のプライマーセットとを用いて増幅したＰＣＲ断片、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号５と６のプライマーセットを用いて増幅したＳｐｏＶＧプロモーター（ＰｓｐｏＶＧ）のＰＣＲ断片、特開２０１４－１５８４３０号公報に記載の組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７をテンプレートとし、それぞれ配列番号７と８及び配列番号９と１０のプライマーセットを用いて増幅したＳ２３７セルラーゼ遺伝子由来の分泌シグナル（Ｓ２３７ｐｒｅ）と転写ターミネーター（Ｔｓ２３７）のＰＣＲ断片を混合し、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて連結し、大腸菌へと形質転換することでＰｓｐｏＶＧ－Ｓ２３７ｐｒｅ－Ｔｓ２３７－ｐＫプラスミドを構築した。ＰｓｐｏＶＧ－Ｓ２３７ｐｒｅ－Ｔｓ２３７－ｐＫプラスミドをテンプレートとし、配列番号９と１１のプライマーセット及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘを用いて増幅したＰＣＲ断片、及び配列番号１２（リゾチームに対するＶＨＨ抗体：１ＺＶＹをコードする遺伝子、翻訳アミノ酸配列は配列番号１３）、配列番号１４（リゾチームに対するＶＨＨ抗体：１ＺＶＨをコードする遺伝子、翻訳アミノ酸配列は配列番号１５）、配列番号１６（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１タンパク質に対するＶＨＨ抗体：Ｅ９をコードする遺伝子、翻訳アミノ酸配列は配列番号１７）で示す人工合成遺伝子（サーモフィッシャー社）を混合してＩｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて連結し、大腸菌へと形質転換することで各遺伝子の発現プラスミドを構築した。構築したプラスミドは後述のプロトプラスト形質転換法に従ってＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株に導入した。用いたプライマーを表１に示す。

（４）プロトプラスト形質転換法
枯草菌へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした各種枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧ１００μＬを添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰ３５０μＬを加えて転倒混和し、エッペンチューブのまま３０℃で２時間インキュベートした後、ＤＭ３寒天培地プレートに塗布した。ＤＭ３寒天培地プレートを３０℃で２～３日間インキュベートして形質転換体のコロニーを得た。

（５）培養条件
プラスミドを保持する枯草菌株を１ｍＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。前培養液を三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時の培養液を７，５００ｒｐｍ、５分遠心し、上清を回収した。上清にＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フイルム和光純薬）を添加し、上清中に含まれるＨｉｓタグ連結ドメイン抗体をキットのプロトコルに従って精製後、透析によってバッファーをＰＢＳ（３０ｍＭイミダゾール含有）へと置換した。

実施例２ラテラルフローアッセイ１
（１）方法
ニトロセルロースメンブレンはＦＦ１２０ＨＰ（ｃｙｔｉｖａｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。５ｍｍ×１００ｍｍに切断したメンブレンの下端より２０ｍｍの位置に検出用の抗体を塗布した。実施例１において枯草菌で生産したドメイン抗体（１ＺＶＨ又は１ＺＶＹ）については１ｍｇ／ｍＬの溶液を、市販ＩｇＧ抗体（ＬｙｓｏｚｙｍｅＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ）及びＳＡＲＳ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓＳｐｉｋｅＰｒｏｔｅｉｎ（ｓｕｂｕｎｉｔ１）ＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）（以下ＳＡＲＳＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ））については０．１ｍｇ／ｍＬの溶液を、絵筆を用いて検出ラインを描画した後、３７℃で１時間静置して乾燥させた。乾燥したメンブレンを３倍希釈したＮ１０１（日油）に１５分間浸し、イオン交換水で２回洗浄した後３％スクロース溶液に浸して５分間静置した。スクロース溶液から取り出したメンブレンを室温で一晩乾燥させた。
酸化鉄（ＩＩＩ）粒子（３００ｎｍ、高純度化学）は３０ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉ－Ｑ水に懸濁した。酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）粒子（１０ｎｍ、５ｍｇ／ｍＬトルエン、和光純薬）は２００μＬを１ｍＬのエタノールに懸濁した後に５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清除去した。沈殿にエタノールを１ｍｌ添加し５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清除去した。沈殿に２０％エタノールを１ｍＬ添加し５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清除去しＭｉｌｌｉ－Ｑ水２００μＬを添加して懸濁した。酸化鉄（ＩＩＩ）粒子又は酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）粒子６μｇ、ないしは金粒子（４０ｎｍ、１ＯＤ（５３０ｎｍａｂｓｍａｘ）、Ｇ－４０－２０、コスモバイオ）１００μＬに、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）を５００μＬ添加し、超音波処理を１０秒間行った（Ｅ９では酸化鉄（ＩＩＩ）粒子１００μｇ）（金粒子使用時は１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８ないしは９））。枯草菌で生産したドメイン抗体（１ＺＶＨ又は１ＺＶＹ：１０μｇ、Ｅ９：１ｍｇ）、又は市販ＩｇＧ抗体（ＬｙｓｏｚｙｍｅＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ：１μｇ）を添加して１５分間静置した。１％ＢＳＡ及び０．１％ＰＥＧ２００００を含む１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）を２００μＬ添加し、さらに１５分間静置した。５，０００ｒｐｍで１５分間遠心したのちに上清を除去し、０．１％ＢＳＡ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）を２００μＬ添加し、超音波処理を１０秒行った（酸化鉄（ＩＩＩ）粒子側にＬｙｓｏｚｙｍｅＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ又はＥ９使用時はＴｗｅｅｎ２０非含有、金粒子使用時は０．１％ＢＳＡ及び０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０）。
抗体として１ＺＶＨ、１ＺＶＹ又はＬｙｓｏｚｙｍｅＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙを用いたアッセイについては、抗原として卵白リゾチーム（富士フイルム和光純薬）１０μｇを、抗体としてＥ９又はＳＡＲＳＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙを用いたアッセイについては、抗原としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳｐｉｋｅＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１），ＳｈｅｅｐＦｃ－Ｔａｇ（ＨＥＫ２９３）（ＮａｔｉｖｅＡｎｔｉｇｅｎ）（以下ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１）１μｇを、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体又は酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）粒子標識抗体の溶液に添加した。また、抗体として１ＺＶＨ、１ＺＶＹ又はＬｙｓｏｚｙｍｅＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙを用いたアッセイについて、抗原として卵白リゾチーム１０μｇを、金粒子標識抗体の溶液に添加した。抗原を添加した溶液をメンブレンに作用させてラテラルフローアッセイを行った。

（２）結果
酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）粒子と酸化鉄（ＩＩＩ）粒子の検出視認性の差異を確認するため、検出ライン側に１ＺＶＨ、酸化鉄粒子側に１ＺＶＹを使用したラテラルフローアッセイを行った。その結果を図２に示す。酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）粒子と酸化鉄（ＩＩＩ）粒子とも同量の粒子及び抗体・抗原を使用しているが、酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）粒子と比較して酸化鉄（ＩＩＩ）粒子は明瞭な検出ラインを呈した。

酸化鉄（ＩＩＩ）粒子を用いたラテラルフローアッセイが種々の抗原の検出に対して適用できることを確認するため、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子側及び検出ライン側の抗体を変化させて検討を行った。その結果を表２に示す。この結果より、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子側及び検出ライン側のＩｇＧ又はドメイン抗体の組み合わせに拠らず、検出ラインの視認を介して任意の抗原を検出可能であることが示された。なお、標識体として金粒子を用い、粒子側抗体として１ＺＶＹ、１ＺＶＨを使用したリゾチーム検出系（表２の上３段に相当）でも検出ラインを視認できることを確認している。また本検討で用いたドメイン抗体間のアミノ酸配列相同性は１ＺＶＹと１ＺＶＨでは６８％、１ＺＶＹとＥ９では６３％、１ＺＶＨとＥ９では７１％となっており、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子を用いたラテラルフローアッセイはドメイン抗体の配列に依存することなく利用可能であることも示された。

実施例３プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産２
（１）使用菌株
実施例１（１）と同じ菌株を用いた。

（２）使用培地
実施例１（２）と同じ培地を用いた。

（３）遺伝子プラスミドの構築
遺伝子発現プラスミド構築は以下の手順で行った。配列番号１８（Ｈｉｓタグを含むＩｇＧに対するＶＨＨ抗体：ＶＨＨ２８－Ｈｉｓをコードする遺伝子、翻訳アミノ酸配列は配列番号１９）の人工合成遺伝子（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）をテンプレートとし、ＫＯＤＯｎｅＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）及び配列番号２０と２１のプライマーセットとを用いて増幅したＰＣＲ断片と、ＰｓｐｏＶＧ－Ｓ２３７ｐｒｅ－Ｔｓ２３７－ｐＫプラスミドをテンプレートとし、配列番号９と１１のプライマーセット及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘ（Ｔａｋａｒａ）を用いて増幅したＰＣＲ断片を混合して、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて連結し、大腸菌へと形質転換することでＶＨＨ２８－Ｈｉｓ遺伝子の発現プラスミドを構築した。
また、配列番号１８の人工合成遺伝子（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）をテンプレートとし、ＫＯＤＯｎｅＤＮＡポリメラーゼ及び配列番号２０と２２のプライマーセットとを用いて増幅したＰＣＲ断片と、ＰｓｐｏＶＧ－Ｓ２３７ｐｒｅ－Ｔｓ２３７－ｐＫプラスミドをテンプレートとし、配列番号２３と１１のプライマーセット及びＫＯＤＯｎｅＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅したＰＣＲ断片を混合して、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて連結し、大腸菌へと形質転換することでＶＨＨ２８－Ｈｉｓ－ＦＬＡＧ遺伝子の発現プラスミドを構築した。用いたプライマーを表３に示す。
構築したプラスミドは実施例１（４）のプロトプラスト形質転換法に従ってＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株に導入した。得られたプラスミドを保持する枯草菌株は、実施例１（５）の培養条件に従って培養し、ドメイン抗体を生産した。

実施例４ラテラルフローアッセイ２
（１）方法
ニトロセルロースメンブレンはＦＦ１２０ＨＰ（ｃｙｔｉｖａｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。５ｍｍ×１００ｍｍに切断したメンブレンの下端より２０ｍｍの位置に検出用の抗体を塗布した。実施例３において枯草菌で生産したドメイン抗体（ＶＨＨ２８－Ｈｉｓ－ＦＬＡＧ）については０．５ｍｇ／ｍＬの溶液を、市販ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｃａｔ、Ｒａｂｂｉｔ－Ｐｏｌｙ（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａ２０－１１５Ａ））については０．１ｍｇ／ｍＬの溶液を、絵筆を用いて検出ラインを描画した後、３７℃で１時間静置して乾燥させた。乾燥したメンブレンを５倍希釈したＮ１０１（日油）に１５分間浸し、イオン交換水で２回洗浄した後３％スクロース溶液に浸して５分間静置した。スクロース溶液から取り出したメンブレンを室温で一晩乾燥させた。
酸化鉄（ＩＩＩ）粒子（３００ｎｍ、高純度化学）は３０ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉ－Ｑ水に懸濁した。酸化鉄（ＩＩＩ）粒子３０ｍｇ／ｍＬ２０μＬを１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）５００μＬに添加し、超音波処理を１０秒間行った。枯草菌で生産したドメイン抗体（ＶＨＨ２８－Ｈｉｓ：３μｇ）を添加して１５分間静置した。１％ＢＳＡ及び０．１％ＰＥＧ２００００を含む１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）を４００μＬ添加し、さらに１５分間静置した。５，０００ｒｐｍで１５分間遠心したのちに上清を除去し、０．１％ＢＳＡ及び０．０２５％－０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）を５００μＬ添加し、超音波処理を１０秒間行った。抗原についてはＣｈｒｏｍＰｕｒｅＣａｔＩｇＧ，ｗｈｏｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．）１μｇを、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子標識抗体の溶液に添加した。抗原を添加した溶液をメンブレンに作用させてラテラルフローアッセイを行った。

（２）結果
酸化鉄（ＩＩＩ）粒子を用いたラテラルフローアッセイがＣａｔＩｇＧの検出に対して適用できることを確認するため、検出ライン側の抗体を変化させて検討を行った。その結果を表４に示す。この結果より、検出ライン側のＩｇＧ又はドメイン抗体の組み合わせに拠らず、検出ラインの視認を介してＣａｔＩｇＧを検出可能であることが示された。

Claims

標識体に固定された抗体を用いて試料中の抗原を検出するラテラルフローアッセイであって、標識体が酸化鉄（ＩＩＩ）粒子である、ラテラルフローアッセイ。
酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体と試料とを接触させることを含む、請求項１記載のラテラルフローアッセイ。
酸化鉄（ＩＩＩ）粒子による発色を指標として抗原を検出することを含む、請求項１又は２記載のラテラルフローアッセイ。
酸化鉄（ＩＩＩ）粒子の平均粒子径が１０～１０００ｎｍである、請求項１～３のいずれか１項記載のラテラルフローアッセイ。
酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体がＶＨＨ抗体である、請求項１～４のいずれか１項記載のラテラルフローアッセイ。
酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体を含む、ラテラルフローアッセイ用試薬。
捕捉抗体が固定されたメンブレンをさらに含む、請求項６記載の試薬。
サンプルパッド、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体を保持するコンジュゲートパッド、捕捉抗体が固定されたメンブレン、及び吸収パッドを含む、請求項６又は７記載の試薬。
酸化鉄（ＩＩＩ）粒子に固定された抗体がＶＨＨ抗体である、請求項６～８のいずれか１項記載の試薬。