JP4954009B2

JP4954009B2 - アレルゲンの検出方法及び検出用キット

Info

Publication number: JP4954009B2
Application number: JP2007256550A
Authority: JP
Inventors: 政信秋元; 重城加藤
Original assignee: Prima Meat Packers Ltd
Current assignee: Prima Meat Packers Ltd
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2027-09-28
Also published as: JP2008107339A

Description

本発明は、食品等の試料中に含まれるＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いるキウイアレルゲンの検出方法や、それに用いられるアレルゲンの検出用キットに関する。

キウイはマタタビ科の植物で、サルナシ、マタタビが同属の植物となる。キウイは、ビタミンＣが豊富なフルーツとして世界中で食されている一方で、キウイは平成１３年３月２１日付けの厚生労働省からの通知「アレルギー物質を含む食品に関する表示について」（食企発第２号食監発第４６号）により、表示が推奨される２０品目の一つに指定されている。表示推奨品目の果物類の中でキウイは最も患者数が多く、口腔内アレルギー症候群（Oral Allergy Syndrome；OAS）や重篤なアレルギー症状を示すものとして知られている。キウイアレルギーの原因物質としては、アクチニジン（ＥＣ３．４．２２．１４）が知られており、キウイに含まれる総たんぱく質の４０〜５０％を占め、分子量２７ｋＤａ、２２０残基のアミノ酸よりなるシステインプロテアーゼである。

従来、アレルゲンの検出する方法としては、例えば、アレルゲンに特異的に反応するイムノグロブリンを定量する方法（例えば、特許文献１参照）や、抗原抗体複合体を含有する検体中の該抗原抗体複合体を酸処理等により解離させ、必要に応じてアルカリを用いて中和処理を行った後、該検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を測定する方法（例えば、特許文献２参照）等が知られている。

また、現在、乳、卵、小麦、そば、落花生の特定原材料を検出するための公定法として、加熱・非加熱複合抗原より得られるポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（例えば、特許文献３参照；以下「市販公定法Ａ」という）、あるいは精製抗原より得られたポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（以下「市販公定法Ｂ」という）が用いられている。これらは、特異的にアレルゲンを検出するために有効な方法であるが問題も多い。例えば、市販公定法Ａでは複合抗原を用いているため、何に対する抗体なのかが不明で、交差性が高く、例えば、イムノブロット法などによる抗原の同定ができず、また非特異反応が増える可能性がある。また、市販公定法Ｂでは、抗原が精製されているため抗体の特異性は明確であるものの、未変性の抗原を用いて作製された抗体を使用しているため、変性／未変性により抗体が結合する程度に違いがあるため、同じ添加量であっても、加熱前、加熱後での定量値が異なるという問題があった。

特開平０５−２４９１１１号公報特開平０７−１４０１４４号公報特開２００３−１５５２９７号公報

本発明の課題は、キウイアレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳを用いて、キウイアレルゲンであるアクチニジンを抽出し、上記アレルゲンがＳＤＳ変性／ＳＤＳ未変性のいかなる状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検出キット等を提供することにある。

本発明者らは、キウイのアレルゲンを検出する方法について鋭意検討し、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いると、これら特定原材料のＳＤＳ抽出液を用いてキウイアレルゲンを正確に検出することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は（１）キウイアレルゲンであるアクチニジン含有又は未含有試料を、ＳＤＳ未変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体と、ＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体とを用いて免疫反応に供することを特徴とするキウイアレルゲンの検出方法や、（２）キウイアレルゲンであるアクチニジン含有又は未含有試料として、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールによる抽出液を用いることを特徴とする前記（１）記載のキウイアレルゲンの検出方法や、（３）ＳＤＳ未変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７７）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ１とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７８）が産生するモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ２、又は、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１０４６）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ３とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１０４７）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ４であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のキウイアレルゲンの検出方法や、（４）ＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８１）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ４とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８２）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ５、又は、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７９）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ５とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８０）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ３であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のキウイアレルゲンの検出方法に関する。

また本発明は（５）ＳＤＳ未変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体と、ＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体とを備えたことを特徴とするキウイアレルゲンの検出セットや、（６）ＳＤＳ未変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７７）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ１とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７８）が産生するモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ２、又は、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１０４６）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ３とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１０４７）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ４であることを特徴とする前記（５）記載のキウイアレルゲンの検出セットや、（７）ＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８１）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ４とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８２）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ５、又は、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７９）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ５とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８０）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ３であることを特徴とする前記（５）記載のキウイアレルゲンの検出セットに関する。

本発明によると、食品等に含まれるキウイアレルゲンについての免疫学的な検出方法において、キウイアレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても、正確に定性かつ定量的に検出することができる。

本発明のキウイアレルゲンの検出方法としては、キウイアレルゲンであるアクチニジン含有又は未含有試料を、ＳＤＳ未変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体と、ＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体とを用いて免疫反応に供する方法であれば特に制限されず、また、上記キウイアレルゲンであるアクチニジン含有又は未含有試料としては、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールによる抽出液を用いることが好ましく、より具体的には、０．５％ＳＤＳ及び０．５％２−メルカプトエタノールを含む緩衝液による抽出液を用いることが好ましい。

また、本発明のキウイアレルゲンの検出キットとしては、ＳＤＳ未変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体と、ＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体とを備えたキットであれば特に制限されず、２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることが好ましい。

上記ＳＤＳ未変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７７）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ１とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７８）が産生するモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ２との組み合わせ、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１０４６）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ３とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１０４７）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ４との組み合わせ等を好適に例示することができ、また、ＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体として、プリマハム株式会社基礎研究所（茨城県土浦市中向原６３５）にて所有するハイブリドーマが産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ１と、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１０４５）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ２との組み合わせ、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７９）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ５と、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８０）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ３との組み合わせ、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８１）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ４とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８２）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ５との組み合わせ等を好適に例示することができる。抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ５とＤ−ＡＣＴ３との組み合わせは、１００℃・３０分、１２１℃・１５分の加熱変性したアクチニジンを認識することができる。

したがって、抗アクチニジンモノクローナル抗体である、Ｎ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２とＤ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２との組み合わせや、Ｎ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２との組み合わせや、Ｎ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２とＮ−ＡＣＴ５とＤ−ＡＣＴ３との組み合わせや、Ｎ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４とＮ−ＡＣＴ５とＤ−ＡＣＴ３との組み合わせや、Ｎ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２とＤ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ５との組み合わせや、Ｎ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ５との組み合わせや、Ｎ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２とＮ−ＡＣＴ５とＤ−ＡＣＴ３とＤ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ５との組み合わせや、Ｎ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４とＮ−ＡＣＴ５とＤ−ＡＣＴ３とＤ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ５との組み合わせを用いることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができ、ＳＤＳ未変性及びＳＤＳ変性のアクチニジンを定量することができる。

以上の本発明の免疫学的なキウイアレルゲンの検出方法は、未変性／変性のキウイアレルゲンを含む試料を、標識化した前記本件モノクローナル抗体と接触させ、あるいは標識化した抗体の存在下に前記本件モノクローナル抗体と接触させ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて分離・測定する検出段階とからなり、かかる免疫反応段階における抗原抗体反応の方法も特に制限されず、例えば、以下の方法を例示することができる。

不溶性担体に結合した本件モノクローナル抗体に試料中のキウイアレルゲンを捕捉させた後に標識化抗ＩｇＧ抗体を反応させるサンドイッチ法や、不溶性担体に結合した本件モノクローナル抗体と異なるエピトープを認識する標識本件モノクローナル抗体（第二抗体）を用いるサンドイッチ二抗体法や、不溶性担体に結合した本件モノクローナル抗体に試料中のキウイアレルゲンを標識化抗原の存在下で反応させる競合法や、キウイアレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する磁気ビーズ結合標識本件モノクローナル抗体を作用させた後、磁力により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する磁気ビーズ法や、キウイアレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する標識本件モノクローナル抗体を作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法や、金コロイド等で標識された本件モノクローナル抗体とキウイアレルゲンであるアクチニジンが結合した抗原抗体複合体が試験ストリップ上を毛管現象等により移動する途中に、キウイアレルゲンと結合する本件モノクローナル抗体をあらかじめ固定しておき、抗原抗体複合体を捕捉させることで現れる着色ラインの有無によって定性分析するイムノクロマト法の他、二重免疫拡散法、放射免疫拡散法など公知の免疫測定法を利用することができるが、本件モノクローナル抗体として、それぞれ異なるエピトープを認識する２以上のモノクローナル抗体を用いる方法、例えば、食品中の未変性キウイアレルゲン及び／又は変性キウイアレルゲンが１００〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる高感度の点でサンドイッチ二抗体法が、定性的には簡便性からイムノクロマト法が好ましい。

上記抗原抗体反応において用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等を挙げることができ、また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管、ラテックスビーズ状等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は特に限定されるものでなく、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。

本発明のアレルゲンの検出方法やアレルゲン検出用キットに用いられる本件モノクローナル抗体の免疫グロブリンのクラス及びタイプは特に制限されないが、本件モノクローナル抗体として、ＩｇＧクラス、タイプκの抗体が好適に用いられる。また、モノクローナル抗体の形態としては、全抗体又はＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ等の断片を用いることもできる。抗体の由来は特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ヒト、兎、鶏等を挙げることができるが、作製の簡便性からマウスに由来するモノクローナル抗体が好適に用いられる。また、本件モノクローナル抗体は、未変性又はＳＤＳ変性のキウイアレルゲンであるアクチニジンで免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造することができる。

本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、未変性又はＳＤＳ変性のキウイアレルゲンであるアクチニジンを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。上記の抗体産生細胞としては、例えばＳＤＳ未変性及び／若しくはＳＤＳ変性のキウイアレルゲンであるアクチニジン又はこれを含有する組成物を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等を挙げることができる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えば未変性又はＳＤＳ変性のキウイアレルゲンであるアクチニジンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。

細胞融合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、本件モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。また、未変性のキウイアレルゲンであるアクチニジンのみを用いて免疫した抗免疫動物から、有利に抗変性アクチニジンモノクローナル抗体を得ることができる場合もある。この場合、抗変性アクチニジンモノクローナル抗体等の本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングしてもよいし、あるいは、固相状態でのＥＬＩＳＡで未変性のアクチニジンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択し、この抗体産生ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体から液相状態で未変性のアクチニジンに対してのみ特異的に反応する本件モノクローナル抗体を得ることができる。前記のように、抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取することができるが、培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、例えば、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。

また、標識化抗体作製に用いられる標識物質としては、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質であればよく、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、金コロイド等を使用するのができ、酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等を、蛍光物質としては、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等を、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等を、放射性物質としては^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ若しくは^１３１Ｉ等を例示することができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、発光剤等が用いることができる。

本発明のアレルゲン検出用キットには、有効成分としての本件モノクローナル抗体、好ましくはそれぞれ異なるエピトープを認識する２以上の本件モノクローナル抗体を含むが、これらは保存安定性の点から、溶液状態よりも凍結乾燥物として収容されていることが好ましく、検出用キットにはかかる本件モノクローナル抗体溶解する緩衝液や培養液の他、試料を調製するためのＳＤＳと２−メルカプトエタノールを含む緩衝液等を含んでいてもよい。また、より好ましい別の態様の本発明のアレルゲン検出用キットとしては、前記イムノクロマト法における試験ストリップを挙げることができる。この場合、異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つを、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体とすることが好ましい。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

Ｉ．抗アクチニジンＭＡｂの作製
１．材料および方法
１）アクチニジンの精製
アクチニジンは、Pastorello et al .（Identification of actinidin as the major allergen of kiwi fruit. J Allergy Clin Immunol. 101; 531-7.1998）を一部改変し、精製した。すなわち、新鮮なキウイ果実（ヘイワード種、Actinidia deliciosa、以下キウイ）の皮をむき、最終濃度２％ＰＶＰＰ、２μｇ／ｍＬＥ−６４を含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と混合し（１：２ｗｔ／ｖｏｌ）、ホモジナイズした。４℃で１２，０００ｇ×３０分の遠心分離後、上清を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）に対し４８時間、４℃で透析した。透析後、４℃で３０００ｇ×３時間の遠心分離を行い、粗画分を得た。粗画分をRESOURCE Q カラムを用いた陰イオンクロマトグラフィで分画した。分離には２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用い、０から０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌのグラジエントにより分画した。得られたアクチニジンを含む画分をさらにゲルろ過カラムにより精製後、蒸留水に対し透析し、凍結乾燥したものを精製未変性アクチニジン（以下Ｎ−ＡＣＴ）とした。一方、粗画分よりＰｒｅｐセル（日本バイオラッド）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法によりアクチニジンを精製後、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥したものを精製変性アクチニジン（以下Ｄ−ＡＣＴ）とした。

２）供試動物
６週齢のオスのＢＡＬＢ／ｃマウスを計１０尾供試した。

３）抗原溶液の作製
生理食塩水で０．１％のＮ−ＡＣＴあるいはＤ−ＡＣＴ溶液を作製し、１ｍＬ容エッペンドルフチューブに５００μＬずつ分注し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。

４）免疫
初回免疫には、complete Freund's adjuvant（Difco）を０．１％のＮ−ＡＣＴあるいはＤ−ＡＣＴが５００μＬ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。Ｎ−ＡＣＴに５尾、Ｄ−ＡＣＴに５尾を充て、各エマルジョンを１尾当たり１５０μＬ腹腔内に注射した。

追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、incomplete Freund's adjuvant（Difco）を０．１％のＮ−ＡＣＴあるいはＤ−ＡＣＴが５００μＬ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μＬ腹腔内に注射した。

５）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＮ−ＡＣＴあるいはＤ−ＡＣＴを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗Ｎ−ＡＣＴあるいはＤ−ＡＣＴ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いた。

６）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、Kolher and Milstein (1975)に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％Ｎ−ＡＣＴあるいはＤ−ＡＣＴ溶液１００μＬを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, ７０ｍｍ,Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞懸濁液（P3X63Ag8.653）を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭ２−メルカプトエタノール（以下２-ＭＥ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０^６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ_２下で培養した。

７）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗Ｎ−ＡＣＴあるいはＤ−ＡＣＴ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＮ−ＡＣＴあるいはＤ−ＡＣＴに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６穴細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６穴細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭ２-ＭＥ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。

８）腹水の採取およびＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスにincomplete Freund's adjuvantを０．２ｍＬ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０^６ cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム（アマシャムファルマシア）により精製し、以下に供試した。

９）ＭＡｂのクラス、サブクラスおよびタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouseimmunoglobulinisotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。

１０）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に２０ｍｇ／ｍＬとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで置換した。

２．結果および考察
１）各抗Ｎ−ＡＣＴＭＡｂおよび抗Ｄ−ＡＣＴＭＡｂの特異性とクラス、サブクラス、抗Ｎ−ＡＣＴＭＡｂ８種類、抗Ｄ−ＡＣＴＭＡｂ２０種類を得た。それぞれの特異性およびクラス・サブクラスおよびタイプを表１に示す。

２）組合せ条件
Ｎ−ＡＣＴを検出するためのＭＡｂあるいはＤ−ＡＣＴを検出するためのＭＡｂの組合せは、サンドイッチＥＬＩＳＡにより選出した。その結果、最も感度の高い組み合わせとして、Ｎ−ＡＣＴではキウイのみ検出できるＮ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２、近縁種であるサルナシも検出できるＮ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４を、またＤ−ＡＣＴではサルナシも検出できるＤ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２、Ｄ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ５、１２１℃・１５分加熱したキウイでも検出できるＮ−ＡＣＴ３とＤ−ＡＣＴ３を選択した。

II．サンドイッチＥＬＩＳＡによるＮ−ＡＣＴあるいはＤ−ＡＣＴの検出
１．材料および方法
１）Ｎ−ＡＣＴ検出系の検討
〔１〕抽出後のアクチニジン検出率の変化
アクチニジンはプロテアーゼであることから、キウイあるいは被検食品から抽出後、自己消化する可能性が考えられるため、抽出液中での安定性を調べた。Ｉ．１．１）に従い、Ｅ−６４を加えずにキウイから抽出した粗画分を４℃、２５℃、３７℃に置き、６、１２、２４および４８時間後にサンプリングし−４０℃でＥＬＩＳＡに供するまで保管した。キウイのみ検出できるＮ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２、近縁種であるサルナシも検出できるＮ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４のサンドイッチＥＬＩＳＡにより残存するアクチニジンを測定した。

〔２〕加熱温度による検出率の変化
加工食品は加工工程中で加熱処理を行われる場合があるため、アクチニジンの加熱による安定性を調べた。キウイ粗たんぱく質画分を、ＢＳＡを標準物質としてプロテインアッセイキット（日本バイオラッド）でたんぱく質濃度を測定後１，０００ｐｐｍに調製し、６３℃・３０分、８０℃・３０分、１００℃・３０分加熱した。冷却後、Ｎ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２、およびＮ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４のサンドイッチＥＬＩＳＡによりアクチニジンを測定した。

〔３〕他の食品への交差性
市販食品２４種類に対する交差性を調べた。各食品を、フードカッターで粉砕後、１ｇ量り、ＰＢＳＴを１９ｍＬ加えホモジナイズし、遠心分離後、フィルターろ過したろ液をさらにＰＢＳで２０倍に希釈し、サンプルとした。

２）Ｄ−ＡＣＴ検出系の検討
〔１〕抽出後のアクチニジン検出率の変化
特定原材料の通知法（食発第１１０６００１号、最終改正平成１７年１０月１１日食安発第１０１１００２号）の抽出液によりキウイより抽出した粗たんぱく質を、４℃、２５℃、３７℃に置き、５、１０、２４および４８時間後にサンプリングし−４０℃でＥＬＩＳＡに供するまで保管した。Ｄ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２のサンドイッチＥＬＩＳＡにより残存するアクチニジンを測定した。

〔２〕加熱温度による検出率の変化
キウイ粗画分を、ＢＳＡを標準物質としてプロテインアッセイ（日本バイオラッド）で１０００ｐｐｍに調製後、６３℃・３０分、８０℃・３０分、１００℃・３０分、１２１℃・１５分加熱しサンプルとした。冷却後、未加熱のものを対照として、サンプルを特定原材料の通知法の抽出液で１００００倍に希釈後、１２時間振とう抽出し、Ｄ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２のサンドイッチＥＬＩＳＡによりアクチニジンを測定した。また、同様に、Ｎ−ＡＣＴ５とＤ−ＡＣＴ３、及びＤ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ５の他、Ｎ−ＡＣＴ５とＤ−ＡＣＴ３とＤ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ５の４種類を組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡによりアクチニジンを測定した。

〔３〕他の食品への交差性
市販食品２４種類に対する交差性を調べた。各食品を、フードカッターで粉砕後、特定原材料の通知法に従い抽出液を加え１２時間震とう抽出し、遠心分離後、フィルターろ過したろ液をサンプルとした。

２．結果および考察
１）Ｎ−ＡＣＴ検出系の検討
〔１〕抽出後のアクチニジンの検出率の変化
抽出後のアクチニジンの検出率を図１ａ、１ｂに示した。４℃保管されたアクチニジンは４８時間後もＮ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２、およびＮ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４で９５％以上検出され、また、２５℃保管でも４８時間後で９０％検出された。一方、３７℃保管ではＮ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２で８０％、Ｎ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４で７２％検出された。これらの結果から、アクチニジンはプロテアーゼではあるものの自己消化は少なく、サンプル抽出後、低温に保管することで、検出率の低下は防げるものと考えられた。

〔２〕加熱温度による検出率の変化
加熱温度によるアクチニジンの検出率の変化を、Ｎ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２の結果を図２ａ、Ｎ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４の結果を２ｂに示した。いずれの組み合わせでも、６３℃・３０分で約６０％、８０℃・３０分で約２０％、１００℃・３０分で約３％にまでアクチニジンの検出率は低下した。このことから、Ｎ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２、及びＮ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４の組合せは未加熱のアクチニジンを特異的に検出するときに有利に用いることができ、加熱後のジュース、缶詰などに混入したキウイを検出するには適していないと考えられた。

〔３〕他の食品への交差性
Ｎ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２の標準曲線を図３ａ、およびＮ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４の標準曲線を図３ｂに示した。これらの標準曲線を用いて市販食品２４種に対する交差性を調べた。その結果、Ｎ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２、およびＮ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４はいずれも、他の食品への交差性を示さなかった。特に、アクチニジンはシステインプロテアーゼとしてパパイン、ブロメラインと相同性が認められているが、パパイア、パイナップルに対して交差性を示すことは無く、特異的にキウイを検出できる抗体の組み合わせであった。

２）Ｄ−ＡＣＴ検出系の検討
〔１〕抽出後のアクチニジンの安定性
抽出後のアクチニジンのＤ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２による検出率を図４に示した。ＳＤＳと２-ＭＥを含む通地法の抽出液で抽出後、各温度で保管されたアクチニジンは４８時間後の残存率は１００％であった。システインプロテアーゼであるアクチニジンは、２-ＭＥ存在下で活性化される（http://www1.ttv.ne.jp/~kiwi/actinidin-0.html）とされているが、試料の保管は４８時間程度であれば問題ないものと考えられた。

〔２〕加熱温度による検出率の変化
Ｄ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２を用いた加熱温度によるアクチニジンの検出率を図５に示した。６３℃・３０分、８０℃・３０分、１００℃・３０分で加熱したものは未加熱のものとほぼ同等の検出率となった。一方、１２１℃・１５分も未加熱に比較し、４０％程度検出可能であった。同様に、Ｄ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ５とＮ−ＡＣＴ５とＤ−ＡＣＴ３を用いた加熱温度によるアクチニジンの検出率を図６に示した。Ｄ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ５の組み合わせでは６３℃・３０分、８０℃・３０分、１００℃・３０分で１００％程度の検出となり、１２１℃・１５分では４０％の検出率であった。また、Ｎ−ＡＣＴ５とＤ−ＡＣＴ３の組み合わせでは６３℃・３０分で３００％、８０℃・３０分で４３０％、１００℃・３０分で５７０％、１２１℃・１５分では６１０％の検出となり、１２１℃・１５分のようなレトルト処理したアクチニジンを高く検出する組み合わせであった。さらに、Ｎ−ＡＣＴ５とＤ−ＡＣＴ３とＤ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ５の４種類を組み合わせた場合、１２１℃・１５分で８５％程度の検出となり、４種類を組み合わせることによって、未加熱から１２１℃・１５分処理したアクチニジンまで検出できるものと考えられた。

〔３〕他の食品への交差性
Ｄ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２の標準曲線を図７に示す。この標準曲線を用いて市販食品２４種に対する交差性を調べた。その結果、Ｄ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２は、他の食品への交差性を示さず、また、サルナシやアクチニジンの含有量が極めて低いゼスプリゴールドキウイ（Actinidia chinensis）も検出可能であった。

III．イムノクロマト法によるＮ−ＡＣＴあるいはＤ−ＡＣＴの検出
１．材料および方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍＬとなるようにＮ−ＡＣＴ２、Ｎ−ＡＣＴ４およびＤ−ＡＣＴ２のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍＬにＭＡｂ溶液を５００μＬ加え室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μＬを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）に６８ｍＬ／ｃｍ^２となるよう塗布し、乾燥させた。

２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍＬとなるようにＮ−ＡＣＴ１、Ｎ−ＡＣＴ３およびＤ−ＡＣＴ１のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。

３）イムノクロマトストリップの組立
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、Ｎ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２、Ｎ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４をＮ−ＡＣＴ検出用、またＤ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２をＤ−ＡＣＴ検出用として３組のイムノクロマトストリップを作製した。

４）検出感度の検証
〔１〕Ｎ−ＡＣＴ溶液の調製
ＰＢＳによりキウイ粗たんぱく質画分を抽出し、ＢＳＡを標準物質としてプロテインアッセイキットでたんぱく質濃度を測定後、ＰＢＳで１００ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、１ｐｐｂ、０ｐｐｂ溶液を調製し、６３℃・３０分、８０℃・３０分、１００℃・３０分加熱した。冷却後、未加熱を対照として、作製したＮ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２、Ｎ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４の２組のイムノクロマトキットに１００μＬずつ供試した。

〔２〕Ｄ−Ａｃｔ溶液の調製
ＰＢＳによりキウイ粗たんぱく質画分を抽出し、ＢＳＡを標準物質としてプロテインアッセイキットでたんぱく質濃度を測定後、２０００ｐｐｂ、２００ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、０ｐｐｂ溶液を調製し、６３℃・３０分、８０℃・３０分、１００℃・３０分、１２１℃・１５分加熱した。冷却後、未加熱を対照として、サンプルに特定原材料の通知法の抽出液を２０倍量加え、１２時間震とう抽出を行い、Ｄ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２の組合せのイムノクロマトキットに１００μＬずつ供試した。

２．結果および考察
１）Ｎ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２のイムノクロマトキット
１ｐｐｂの濃度のキウイ粗たんぱく質を検出可能であった。また、各加熱温度の影響では、１００ｐｐｂでは、８０℃・３０分でわずかに検出したが１００℃・３０分は検出できず、ＥＬＩＳＡの結果と一致するものとなった。特異性に関しては、ＥＬＩＳＡと同様、キウイのみ検出するイムノクロマトキットであった。

２）Ｎ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４のイムノクロマトキット
１ｐｐｂの濃度のキウイ粗たんぱく質を検出可能であった。また、各加熱温度の影響では、１００ｐｐｂでは、８０℃・３０分でわずかに検出したが１００℃・３０分は検出できず、ＥＬＩＳＡの結果と一致するものとなった。特異性に関しては、ＥＬＩＳＡと同様、キウイのみならず、サルナシやアクチニジンをほとんど含まないゼスプリゴールドキウイなどキウイ類を幅広く検出できるイムノクロマトキットであった。

３）Ｄ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２のイムノクロマトキット
低濃度のキウイ粗たんぱく質を検出可能であった。特異性に関しては、ＥＬＩＳＡと同様、キウイのみならず、サルナシやアクチニジンをほとんど含まないゼスプリゴールドキウイなどキウイ類を幅広く検出できるイムノクロマトキットであった。

抽出後のアクチニジン検出率の変化を示した図である。加熱温度による検出率の変化を示した図である。Ｎ−ＡＣＴ１とＮ−ＡＣＴ２（ａ）、およびＮ−ＡＣＴ３とＮ−ＡＣＴ４（ｂ）の標準曲線を示した図である。抽出後のアクチニジンのＤ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２による検出率の変化を示した図である。Ｄ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２を用いた加熱温度による検出率の変化を示した図である。Ｄ−ＡＣＴ４とＤ−ＡＣＴ５とＮ−ＡＣＴ５とＤ−ＡＣＴ３を用いた加熱温度による検出率の変化を示した図である。Ｄ−ＡＣＴ１とＤ−ＡＣＴ２の標準曲線を示した図である。

Claims

キウイアレルゲンであるアクチニジン含有又は未含有試料を、ＳＤＳ未変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体と、ＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体とを用いて免疫反応に供することを特徴とするキウイアレルゲンの検出方法。
キウイアレルゲンであるアクチニジン含有又は未含有試料として、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールによる抽出液を用いることを特徴とする請求項１記載のキウイアレルゲンの検出方法。
ＳＤＳ未変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７７）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ１とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７８）が産生するモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ２、又は、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１０４６）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ３とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１０４７）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ４であることを特徴とする請求項１又は２記載のキウイアレルゲンの検出方法。
ＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８１）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ４とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８２）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ５、又は、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７９）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ５とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８０）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ３であることを特徴とする請求項１又は２記載のキウイアレルゲンの検出方法。
ＳＤＳ未変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体と、ＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体とを備えたことを特徴とするキウイアレルゲンの検出セット。
ＳＤＳ未変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７７）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ１とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７８）が産生するモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ２、又は、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１０４６）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ３とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１０４７）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ４であることを特徴とする請求項５記載のキウイアレルゲンの検出セット。
ＳＤＳ変性のアクチニジンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８１）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ４とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８２）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ５、又は、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３７９）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｎ−ＡＣＴ５とハイブリドーマ（ＦＥＲＭＰ−２１３８０）が産生する抗アクチニジンモノクローナル抗体Ｄ−ＡＣＴ３であることを特徴とする請求項５記載のキウイアレルゲンの検出セット。