JP5043073B2

JP5043073B2 - 小麦アレルゲンの検出方法

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Publication number: JP5043073B2
Application number: JP2009170624A
Authority: JP
Inventors: 政信秋元; 重城加藤; 真浪岡
Original assignee: Prima Meat Packers Ltd
Current assignee: Prima Meat Packers Ltd
Priority date: 2004-03-05
Filing date: 2009-07-21
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2025-03-04
Also published as: AU2009200519A1; AU2009200519B2; JP5043078B2; JP2009271091A; AU2005218391A1; JP2009271092A; NZ549638A; US7943334B2; KR20070002044A; EP1731907A1; CA2558612C; DE602005024119D1; WO2005085847A1; CN1930474A; AU2005218391B2; CN1930474B; JP4427541B2; EP1731907B1; US20070275427A1; EP1731907A4

Description

本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性及び変性の小麦アレルゲンを指標としたアレルゲンの検出方法や、それに用いられるアレルゲンの検出用キットに関する。

また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性の小麦グリアジンを定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、小麦の主要タンパク質であるグリアジンを指標とした小麦アレルゲンの検出方法や、それに用いられる小麦アレルゲンの検出用キットに関する。

自然環境の減少、車や工場などからの排気ガス、住宅事情等、或いは食べ物の変化など様々な因子により、現在では、３人に１人が何らかのアレルギー疾患をもつといわれている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題を生じている。これらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。そのためには、表示を通じて消費者へ情報提供の必要性も高まっており、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会は、アレルギー物質として知られている８種の原材料を含む食品にあっては、それを含む旨の表示について合意し、加盟国で各国の制度に適した表示方法を検討することとした（１９９９年６月）。日本では過去の健康危害などの程度、頻度を考慮して重篤なアレルギー症状を起した実績のある２４品目の食品について、その表示方法が定められた（２００２年４月より施行）。アレルギーを引き起こす食品としては、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母若しくはゼラチンなどが知られており、特に乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼインや、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリンや、卵白アレルゲン成分としてはオボアルブミンとオボムコイドや、小麦アレルゲンの主要成分としてグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａｈ１が知られている。

従来、アレルゲンを検出する方法としては、例えば、アレルゲンに特異的に反応するイムノグロブリンを定量する方法（特開平０５−２４９１１１号公報参照）や、抗原抗体複合体を含有する検体中の該抗原抗体複合体を酸処理等により解離させ、必要に応じてアルカリを用いて中和処理を行った後、該検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を測定する方法（特開平０７−１４０１４４号公報参照）等が知られている。

また、現在、乳、卵、小麦、そば、落花生の特定原材料を検出するための公定法として、加熱・非加熱複合抗原より得られるポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（特開２００３−１５５２９７号公報参照；以下「市販公定法Ａ」という）、あるいは精製抗原より得られたポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（以下「市販公定法Ｂ」という）が用いられている。これらは、特異的にアレルゲンを検出するために有効な方法であるが問題も多い。例えば、市販公定法Ａでは複合抗原を用いているため、何に対する抗体なのかが不明で、交差性が高く、例えば、イムノブロット法などによる抗原の同定ができず、また非特異反応が増える可能性がある。また、市販公定法Ｂでは、抗原が精製されているため抗体の特異性は明確であるものの、未変性の抗原を用いて作製された抗体を使用しているため、変性／未変性により抗体が結合する程度に違いがあるため、同じ添加量であっても、加熱前、加熱後での定量値が異なるという問題があった。特に、小麦は他の特定原材料（卵、乳、そば、落花生）の中でも過酷な加熱処理が施される場合が多い（例えばパン、唐揚げ等）ため、小麦アレルゲンは未変性から加熱変性まで、広範囲な状態で存在する。そこで、小麦アレルゲンを検出するためには、どの様な状態のアレルゲンに対して結合するかを明らかにしたモノクローナル抗体を作製し、その特性に応じて利用する必要がある。

さらに、卵の同定、定量に関しては、オボムコイドを指標として、すでにポリクローナル抗体を用いた方法（例えば、Int. Archs. Allergy appl. Immun., 75, 8-15, 1984参照）あるいはモノクローナル抗体を用いた方法（例えば、Nutr. Sci. Vitaminol. 45, 491-500, 1999参照）が知られている。また、オボムコイドを認識するモノクローナル抗体で、未変性オボムコイドと反応するが熱変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、熱変性オボムコイドと反応するが未変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、及び未変性オボムコイドと熱変性オボムコイドに反応するモノクローナル抗体を用いて、加熱変性状態をも識別してオボムコイドを定量し、卵アレルゲンの同定と正確な定量を可能とする免疫学的定量方法が報告されている（例えば、特開２００２−２５３２３０号公報参照）。

本発明の課題は、小麦アレルゲンを含む食品において、小麦アレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検出キット等を提供することにある。

本発明者らは、特定原材料である小麦アレルゲンを検出する方法について鋭意検討し、未変性及び変性の小麦アレルゲンを認識する２種類のモノクローナル抗体を用いると、特定原材料の小麦アレルゲンを検出することができることを見い出した。

特定原材料の一つである小麦の検出方法の検討を行うに当たっては、精製グリアジンに対するモノクローナル抗体を作出し、その中から未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチル化小麦グリアジン、０．１Ｍ酢酸可溶化小麦グリアジン、７０％エタノール可溶化小麦グリアジン、及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識することができるＭＡｂを複数選択し、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチル化小麦グリアジン、０．１Ｍ酢酸可溶化小麦グリアジン、７０％エタノール可溶化小麦グリアジン、及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを、１０〜１００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうるＭＡｂの組合わせを見い出した。また、これらのＭＡｂを用いると、食品中の小麦アレルゲンがいかなる加工工程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品からの小麦アレルゲンを検出しうることを確認した。

本発明（小麦アレルゲン）の２種類の抗グリアジンＭＡｂを用いた、各種状態のグリアジンに対するサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。本発明（小麦アレルゲン）のＰＧＬ１およびＰＧＬ２の認識する小麦グリアジンの構成たんぱく質の相違を示す図である。

本発明の小麦アレルゲンの検出方法としては、未変性小麦グリアジン及び還元カルボキシメチル化小麦グリアジンを認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種類の抗小麦グリアジンモノクローナル抗体を併用する小麦アレルゲンの検出方法であれば特に制限されず、また、本発明の小麦アレルゲン検出用キットとしては、未変性小麦グリアジン及び還元カルボキシメチル化小麦グリアジンを認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種類の抗小麦グリアジンモノクローナル抗体を備えた小麦アレルゲン検出用キットであれば特に制限されず、上記抗小麦グリアジンモノクローナル抗体としては、さらに、０．１Ｍ酢酸可溶化小麦グリアジン、７０％エタノール可溶化小麦グリアジン、及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体が好ましく、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２等を好適に例示することができる。これらの抗体を組み合わせることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中の未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチル化小麦グリアジン、０．１Ｍ酢酸可溶化小麦グリアジン、７０％エタノール可溶化小麦グリアジン、及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを、１０〜１００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。

以上の本発明の免疫学的なアレルゲンの検出方法は、未変性及び変性の小麦アレルゲン（以下「食物アレルゲン」ということがある）を含む試料を、標識化した抗小麦グリアジンＭＡｂと接触させ、あるいは標識化した抗体の存在下に小麦グリアジンＭＡｂと接触させ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて分離・測定する検出段階とからなり、かかる免疫反応段階における抗原抗体反応の方法も特に制限されず、例えば、以下の方法を例示することができる。

不溶性担体に結合した本発明の抗小麦グリアジンＭＡｂに試料中の食物アレルゲンを捕捉させた後に標識化抗ＩｇＧ抗体を反応させるサンドイッチ法や、不溶性担体に結合した抗小麦グリアジンＭＡｂと異なるエピトープを認識する標識抗小麦グリアジンＭＡｂ（第二抗体）を用いるサンドイッチ二抗体法や、不溶性担体に結合した抗小麦グリアジンＭＡｂに試料中の小麦アレルゲンを標識化抗原の存在下で反応させる競合法や、小麦アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する磁気ビーズ結合標識抗小麦グリアジンＭＡｂを作用させた後、磁力により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する磁気ビーズ法や、小麦アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する標識抗小麦グリアジンＭＡｂを作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法や、金コロイド等で標識された抗小麦グリアジンＭＡｂと食物アレルゲンである小麦グリアジンが結合した抗原抗体複合体が試験ストリップ上を毛管現象等により移動する途中に、小麦グリアジンと結合する抗小麦グリアジンＭＡｂをあらかじめ固定しておき、抗原抗体複合体を補足させることで現れる着色ラインの有無によって定性分析するイムノクロマト法の他、二重免疫拡散法、放射免疫拡散法など公知の免疫測定法を利用することができるが、抗小麦グリアジンＭＡｂとして、それぞれ異なるエピトープを認識する２以上のモノクローナル抗体を用いる方法、例えば、食品中の未変性アレルゲン及び／又は変性アレルゲンが１００〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる高感度の点でサンドイッチ二抗体法が、定性的には簡便性からイムノクロマト法が好ましい。また、食肉製品等の食品試料中からアレルゲンを抽出する場合、尿素と２−メルカプトエタノールを用いることが望ましい。

上記抗原抗体反応において用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等を挙げることができ、また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管、ラテックスビーズ状等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は特に限定されるものでなく、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。

本発明の小麦アレルゲンの検出方法や小麦アレルゲン検出用キットに用いられる抗小麦グリアジンＭＡｂの免疫グロブリンのクラス及びタイプは特に制限されないが、抗小麦グリアジンＭＡｂとして、ＩｇＧクラス、タイプκの抗体が好適に用いられる。また、モノクローナル抗体の形態としては、全抗体又はＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ等の断片を用いることもできる。抗体の由来は特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ヒト、兎、鶏等を挙げることができるが、作製の簡便性からマウスに由来するモノクローナル抗体が好適に用いられる。また、抗小麦グリアジンＭＡｂは、未変性又は変性の小麦グリアジンで免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造することができる。

抗小麦グリアジンＭＡｂ産生ハイブリドーマは、例えば、未変性及び／又は変性の小麦グリアジンを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗小麦グリアジンＭＡｂ産生ハイブリドーマを作出することができる。上記の抗体産生細胞としては、例えば未変性及び／若しくは変性の小麦グリアジン又はこれを含有する組成物を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等を挙げることができる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えば未変性及び／又は変性の小麦グリアジンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。

細胞融合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、抗小麦グリアジンＭＡｂを産生するハイブリドーマを得ることができる。また、小麦グリアジン等の未変性の食物アレルゲンのみを用いて免疫した抗免疫動物から、有利に抗変性小麦グリアジンＭＡｂを得ることができる場合もある。この場合、抗変性小麦グリアジンＭＡｂ等の抗変性食物アレルゲンＭＡｂ産生ハイブリドーマをスクリーニングしてもよいし、あるいは、固相状態でのＥＬＩＳＡで未変性の小麦グリアジン等の未変性の食物アレルゲンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択し、この抗体産生ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体から液相状態で未変性の食物アレルゲンに対してのみ特異的に反応する抗食物アレルゲンＭＡｂを得ることができる。前記のように、抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取することができるが、培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、例えば、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。

また、標識化抗体作製に用いられる標識物質としては、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質であればよく、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、金コロイド等を使用するのができ、酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等を、蛍光物質としては、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等を、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等を、放射性物質としては^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ若しくは^１３１Ｉ等を例示することができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、発光剤等が用いることができる。

本発明の食物アレルゲン検出用キットには、有効成分としての抗食物アレルゲンＭＡｂ、好ましくはそれぞれ異なるエピトープを認識する２以上の抗小麦グリアジンＭＡｂを含むが、これらは保存安定性の点から、溶液状態よりも凍結乾燥物として収容されていることが好ましく、検出用キットにはかかる抗小麦グリアジンＭＡｂを溶解する緩衝液や培養液の他、試料を調製するための緩衝液等を含んでいてもよい。また、より好ましい別の態様の本発明の抗食物アレルゲン検出用キットとしては、前記イムノクロマト法における試験ストリップを挙げることができる。この場合、異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つを、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体とすることが好ましい。

本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２を挙げることができ、これらハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

１．変性／未変性小麦グリアジンに結合可能なＭＡｂの確立
１−１材料及び方法
１）小麦グリアジン（以下「ＧＬ」という）の調製
小麦粉に２倍量のｎ−ブタノールを加え脱脂を行い、一晩風乾した。得られた脱脂小麦粉に０．１％塩化ナトリウム溶液を２倍量加え、１０，０００ｒｐｍ×１５分遠心分離した。得られた沈殿に２０倍量の０．０１Ｎ酢酸を加え、撹拌後、１０，０００ｒｐｍ×１５分遠心分離した。得られた上清を蒸留水で透析し、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物に７０％となるようにエタノールを加え、１０，０００ｒｐｍ×１５分遠心分離した。得られた上清を蒸留水で透析し、粗ＧＬ画分を得た。粗ＧＬ画分はさらに、Sephacryl S-200HR（AmershamBiosciences）を用いたゲルろ過により精製した。移動相には０．１Ｎ酢酸を用いてＧＬを分画し、蒸留水に透析後、凍結乾燥を行った。生理食塩水でこの凍結乾燥物の０．１％溶液を調製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管し、抗原溶液とした。

２）免疫
供試動物として、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＧＬが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＧＬが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。

３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＧＬを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＧＬ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。

４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％ＧＬ溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００mｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０^６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ_２下３７℃で培養した。

５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＧＬ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＧＬに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ cell/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０^６cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。

６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性ＧＬ（以下「ＮＧＬ」という）あるいは還元カルボキシメチル化ＧＬ（以下「ＲＣＭＧＬ」という）、０．１Ｍ酢酸可溶化ＧＬ（以下「ＡＧＬ」という）、７０％エタノール可溶化ＧＬ（以下「ＥＧＬ」という）、変性剤で可溶化したＧＬ（以下「ＤＧＬ」という）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。ＲＣＭＧＬは、精製ＧＬを１０ｍｇ量り、１．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％ＥＤＴＡ１００μｌ、１．２ｇ尿素、３３μｌの２−メルカプトエタノールを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行った。さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行い、ＲＣＭＧＬとした。培養上清のＮＧＬ、ＲＣＭＧＬ、ＡＧＬ、ＥＧＬ及びＤＧＬに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。

７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム（アマシャムファルマシア）により精製した。

８）ＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。

９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。

２−２結果
１）ＭＡｂの選択
小麦の主要アレルゲンであるグリアジン（ＧＬ）は、水に不溶性で、酢酸やエタノールに溶けるタンパク質である。そこで、ＰＢＳに溶かしたＧＬ（ＮＧＬ）、還元カルボキシメチル化ＧＬ（ＲＣＭＧＬ）、０．１Ｍ酢酸可溶化ＧＬ（ＡＧＬ）、７０％エタノール可溶化ＧＬ（ＥＧＬ）、変性剤で可溶化したＧＬ（ＤＧＬ）を調製し、どの状態のＧＬに特異的に結合するＭＡｂであるかを検証した。抗ＧＬＭＡｂの各状態のＧＬに対するダイレクトＥＬＩＳＡの結果を表１に示す。表１に示されるように、全ての状態のＧＬに結合するＭＡｂであるＰＧＬ１（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６７）、ＰＧＬ２（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６８）、ＰＧＬ４、ＰＧＬ７を選択した。

２）サンドイッチＥＬＩＳＡにおける組合せ条件
ダイレクトＥＬＩＳＡで選択したＰＧＬ１、ＰＧＬ２、ＰＧＬ４、ＰＧＬ７を用いて、全てのＭＡｂの組合わせについてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。グリアジンはＮＧＬ、ＲＣＭＧＬ、ＡＧＬ、ＥＧＬ、ＤＧＬを用いた。その結果、いずれの状態のＧＬでも最も高く検出できたのは、ＰＧＬ１とＰＧＬ２の組合わせであった。ＰＧＬ１とＰＧＬ２を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を図１に示す。その他の組み合わせについてはサンドイッチＥＬＩＳＡにて全てのＧＬを検出できない、または検出感度が極めて低かった。以上の結果から、食品に様々な状態で含まれるＧＬを検出するＭＡｂとして、ＰＧＬ１とＰＧＬ２を選択した。

２．ＰＧＬ１とＰＧＬ２の認識するエピトープの相違
イムノブロッティングで、各抗体が認識するエピトープを限定するため、Ａ−ＰＡＧＥとエレクトロブロッティングに続いてイムノブロッティングを行った。まず、小麦グリアジンをLafiandra,D.&Kasarda,D.D.に従いＡ−ＰＡＧＥ（Cereal Chemistry,,62,314-319,1985）により分離した。分離したゲルを用いて、エレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写した。転写したＰＶＤＦ膜にＰＧＬ１とＰＧＬ２の培養上清（１／１０００）を反応させたのち、発色させて、認識するエピトープを確認した。その結果、図２に示されるように、ＰＧＬ１で認識されるタンパク質分解バンドがＰＧＬ２では認識されなかった。このことから、ＰＧＬ１とＰＧＬ２とは異なるエピトープを認識することがわかった。

３．イムノクロマトによる変性及び未変性ＧＬの検出
３−１材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＧＬ１（又はＰＧＬ２）溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（日本ミリポア社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。

２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようＰＧＬ２（又はＰＧＬ１）溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。

３）イムノクロマトストリップの組立と評価
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。

被検液としては、小麦粉に２０倍量のＰＢＳＴ（ＰＢＳにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを０．５％加えたもの）を加え４℃で一晩撹拌し、遠心分離後に脱脂処理した上清を回収し、透析後、凍結乾燥したものを小麦粉抽出物として調製した。調製した小麦粉抽出物を用いて、未変性のもとしてＰＢＳで希釈したもの、変性のものとして変性剤で可溶化したものを用いた。

３−２結果
サンドイッチＥＬＩＳＡにより様々な状態のＧＬを検出できたことから、より簡易な検出方法としてイムノクロマトによる検出系を構築し、評価した。評価にあたっては、現在市販されているアレルゲン検出キットと同じ抗体を用いている市販Ａ及び市販Ｂと比較した。結果を表２に示す。なお、表２中、「非特異反応」は、緩衝液のみを供したときに陽性と判定されたとき「あり」とした。その結果、市販Ａでは、未変性小麦粉抽出物は検出できたが、変性小麦粉抽出物は非特異反応が見られ判定できなかった。また、市販Ｂでは、未変性小麦粉抽出物では１ｐｐｍでも検出できず、変性小麦粉抽出物は非特異反応が見られ判定できなかった。本発明のキットを用いる方法では、未変性小麦粉抽出物、変性小麦粉抽出物のどちらも５０ｐｐｂ程度まで検出することができた。また、変性小麦粉抽出物での非特異反応は見られなかった。

次に、実際の食品からのアレルゲン検出を想定して、市販の食パンを用いて評価した。評価にあたっては、現在市販されているアレルゲン検出キットを用いる市販Ａ及び市販Ｂと比較した。結果を表３に示す。なお、表３中、「非特異反応」は、緩衝液のみを供したときに陽性と判定されたとき「あり」とした。食パンのたんぱく質は約８％であるため、以下の濃度は８％を全量抽出したと仮定した数字となる。評価した結果、市販Ａでは、未変性食パンを４ｐｐｍ以下の濃度では検出できず、変性食パンでは非特異反応が見られ、判定できなかった。市販Ｂでは、４ｐｐｍ程度は検出できたものの、それ以外の濃度では検出できず、また変性食パンでは非特異反応が見られ、判定できなかった。本発明のキットを用いる方法では、未変性食パン、変性食パンのどちらも４０ｐｐｂ程度の低濃度でも検出ができ、変性では非特異反応もなく、検出できることがわかった。

本発明によると、食品等に含まれる小麦アレルゲンについての免疫学的な検出方法において、アレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても正確に定性かつ定量的に検出することができる。

Claims

未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチル化小麦グリアジン、０．１Ｍ酢酸可溶化小麦グリアジン、７０％エタノール可溶化小麦グリアジン、及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種類の抗小麦グリアジンモノクローナル抗体を併用し、食品中の小麦グリアジンを指標として分析することを特徴とする小麦アレルゲンの検出方法。
抗小麦グリアジンモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２であることを特徴とする請求項１記載の小麦アレルゲンの検出方法。
サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中の小麦グリアジンを、１０〜１００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうることを特徴とする請求項１又は２記載の小麦アレルゲンの検出方法。
未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチル化小麦グリアジン、０．１Ｍ酢酸可溶化小麦グリアジン、７０％エタノール可溶化小麦グリアジン、及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種類の抗小麦グリアジンモノクローナル抗体を備え、食品中の小麦グリアジンを指標として分析することを特徴とする小麦アレルゲン検出用キット。
抗小麦グリアジンモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２であることを特徴とする請求項４記載の小麦アレルゲン検出用キット。
異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４又は５記載の小麦アレルゲン検出用キット。
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１。
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２。