JP2009271092A - そばアレルゲンの検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】未変性及び変性の乳アレルゲン、未変性及び変性の卵白アレルゲン、未変性及び変性の小麦アレルゲン、未変性及び変性のそばアレルゲン、又は未変性及び変性の落花生アレルゲンを認識する各2種類又はそれ以上のモノクロナール抗体を用いるアレルゲンの検出方法であって、αs1カゼインの主要タンパク質であるαs1αs1カゼイン、ホエーの主要たんぱく質であるβラクトグロブリン、卵白主要タンパク質であるオボアルブミンとオボムコイド、小麦の主要タンパク質であるグリアジン、そばの主要タンパク質である分子量24kDaと76kDaのタンパク質、又は落花生の主要タンパク質であるAra h1を指標とする。
【選択図】なし
Description
1−1 材料及び方法
1)αs1カゼイン(以下「αCN」という)の調製
新鮮な牛乳よりZittle(1959)に従い、αCNの粗画分を得た。この粗画分をさらにTSK gel DEAE 650S(TOSOH)を用いて、50mMのイミダゾール−HCl緩衝液(pH6.4)、4Mの尿素を含むNaClのリニアグラジエント(0から0.3M)により精製を行った。精製したαCN画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行った。生理食塩水でこの凍結乾燥物の0.1%溶液を調製し、1ml容エッペンドルフチューブに500μLずつ分注し、免疫に供するまで−20℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
供試動物として、6週齢のBALB/cマウス(日本クレア株式会社製)5尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のαCNが500μl入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。また、追加免疫は、3週間の間隔で2回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のαCNが500μl入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。
初回あるいは追加免疫でαCNを注射した1週間後に、各BALB/cマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に2時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の10倍希釈段を作製し、非競合法ELISAによりマウス血中の抗αCN抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製)を用いた。
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法(1975)に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、0.1%αCN溶液100μlを尾部静脈より注射した。静脈注射から4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ(Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。1,000rpm×10分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞(P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が10:1になるように混合し、再度1,000rpm×10分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量3,350の45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にRPMI1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地(10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地)に100μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミノプテリン、16μMのチミジンを含むHAT選択培地を加え、5×106cells/wellとなるように24ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に分注し、5%CO2下37℃で培養した。
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ELISAの一次抗体として供試し、抗αCN抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ELISAによりαCNに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、0.9cell/wellとなるように96ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、4週齢BALB/cマウス胸腺細胞を5×106cells/wellとなるように96ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を用いた。
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性αCN(以下「N−αCN」という)、尿素処理αCN(以下「D−αCN」という)、市販のカゼインナトリウムの未変性物(以下「N−CN」という)又は市販のカゼインナトリウムの尿素処理物(以下「D−CN」という)の4種類のたんぱく質に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。D−αCNは、精製αCNを1mg量り、5%EDTA100μl、尿素6.0g、2−メルカプトエタノール0.2ml、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.6)1ml、蒸留水1.5mlを加え、アルミフォイルで蓋をした後、100℃で1時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。培養上清のN−αCN、D−αCN、N−CNあるいはD−CNに対する反応性を非競合法ELISAにて調べた。
Jonesら(1990)に従い、まず、BALB/cマウスに不完全フロイントアジュバントを0.2ml腹腔内に注射した。1週間後、一尾当たり5×106cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein Gカラム(アマシャム ファルマシア)により精製した。
MAbのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoαCNobulin isotyping kit(Pharmingen)により、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)及びIgL(γ)を決定した。
精製したMAbについて、サンドイッチELISAに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。50mMの炭酸緩衝液(pH8.5)を用いて20mg/mlとなるよう調製し、DMSOに3mg/100μlで溶解したNHS−ビオチン溶液を10μl加え、撹拌後、氷冷しながら2時間静置した。その後、20mg/mlとなるようにPBSで置換した。
1)MAbの選択
乳の主要アレルゲンであるαs1カゼイン(αCN)を特異的に認識する6種類のMAbが得られた。これら6種類のMAbにおける、それぞれ固相とした各抗原N−αCN、D−αCN、N−CN、又はD−CNに対する特異性をダイレクトELISAにより調べた。また、これらMAbのクラス、サブクラスについても調べた。結果を表1に示す。表1中、+は各固相抗原に対し陽性であることを、−は陰性であることを示す。表1に示されるように、全ての状態の抗原に結合するMAbであるPas1CN1、Pas1CN2、Pas1CN3を選択した。
ダイレクトELISAで選択したPas1CN1、Pas1CN2、Pas1CN3を用いて、全てのMAbの組合わせについてサンドイッチELISAを行った。Pas1CN1、Pas1CN2、Pas1CN3をそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、αCNあるいはCNを検出するためのMAbの組合せを、サンドイッチELISAにより選出した。その結果、N−αCN、D−αCN、N−CN、D−CNを検出できる組合せとしてPas1CN1(FERM ABP−10263)とPas1CN2(FERM ABP−10264)を選択した。結果を図1に示す。
αs1カゼイン溶液を、リシルエンドプロテアーゼで分解し、分解物をトリシンSDS−PAGE(分離ゲル16.5%、濃縮ゲル5%)により分離した。分離したゲルを用いて、エレクトロブロッティングによりPVDF膜に転写した。転写したPVDF膜にPas1CN1とPas1CN2の培養上清(1/1000)を反応させたのち、発色させて、認識するエピトープを確認した。結果を図2に示す。その結果、認識部位はPas1CN1とPas1CN2ともに、分子量約7000、配列番号1で示されるαs1カゼインのアミノ酸配列の132番目から193番目までの領域を認識した。
上記1.で選択されたPas1CN1とPas1CN2の組合せにより、実際の食品中のカゼインを検出できるかを試みた。
1)モデル食肉製品の作製
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表2に示す配合にて各濃度のカゼインナトリウムを含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、5mmで挽肉にしたものを使用した。
各モデル食肉製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプルを2gを量り取り、1M尿素および0.1%2−メルカプトエタノールを含むPBSTを38g加え100℃、一時間加熱処理を行った。冷却後、3,000rpm×20分の遠心分離を行い、上清0.5mlにPBSTを9.5ml加え、ELISA用サンプルとした。検量線には同様に尿素・2−メルカプトエタノール処理を行ったカゼインナトリウムの段階希釈を用いた。また、分析用サンプルからPBSTを用いて抽出し、PBST(PBSにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを0.5%加えたもの)に溶解したカゼインナトリウムを検量線とした尿素および2−メルカプトエタノールを用いない場合との比較を行った。
サンドイッチELISAによるモデル食肉製品中のカゼインナトリウムの分析について、尿素および2−メルカプトエタノールを用いた結果を表3に、また、PBSTのみで抽出した結果を表4に示す。
4−1 材料および方法
1)金コロイド標識およびコンジュゲートパッドの作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPas1CN1のMAb溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500μl加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液を625μlを加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1%BSA溶液でOD525=1.0になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッドに68μl/cm2となるよう塗布し、乾燥させた。
PBSで4mg/mlとなるようPas1CN2のMAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1%BSA、0.1%Tween20を含むPBSで37℃、2時間ブロッキング後、PBSで洗浄し乾燥させた。
上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドをそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。被検液としては、上記調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。
Pas1CN2および金コロイド標識Pas1CN1の組合せによりカゼインナトリウムは加熱、非加熱に係わらず50ppb(食品中2ppm)まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入した未変性カゼインナトリウムが対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
5−1 材料及び方法
1)βラクトグロブリン(以下「βLG」ということがある)の調製
新鮮な牛乳よりZittle(1959)に従い、ホエーの粗画分を得た。この粗画分をさらにTSK gel DEAE 650S(TOSOH)を用いて、50mMのトリス−HCl緩衝液(pH6.5)、NaClのリニアグラジエント(0から0.4M)により精製を行った。精製したβLG画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行い、未変性βLG(以下「N−βLG」ということがある)とした。このN−βLGを10mg量り、1.4Mのトリス−HCl緩衝液(pH8.6)1ml、5%のEDTA100μl、尿素1.2g、2−メルカプトエタノール33μlを加え2.5mlに定容した後、窒素ガス置換を行い、37℃、1時間の還元処理を行い、さらに、1MのNaOH300μlに溶解した89mgのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で1時間のカルボキシメチル化を行い、還元カルボキシメチル化βLG(以下「R−βLG」ということがある)とした。生理食塩水でこれらの凍結乾燥物の0.1%溶液を調製し、1ml容エッペンドルフチューブに500μlずつ分注し、免疫に供するまで−20℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
供試動物として、5週齢のBALB/cマウス(日本クレア株式会社製)5尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のN−βLG又はR−βLGが500μl入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。また、追加免疫は、2週間の間隔で3回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のN−βLG又はR−βLGが500μl入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。
初回あるいは追加免疫でN−βLG又はR−βLGを注射した1週間後に、各BALB/cマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に2時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の10倍希釈段を作製し、非競合法ELISAによりマウス血中の抗N−βLG抗体価及び抗R−βLG抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製)を用いた。
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法(1975)に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、0.1%のN−βLG溶液又はR−βLG溶液100μlを尾部静脈より注射した。静脈注射から4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ(Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。1,000rpm×10分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞(P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が10:1になるように混合し、再度1,000rpm×10分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量3,350の45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にRPMI1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地(10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地)に100μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミノプテリン、16μMのチミジンを含むHAT選択培地を加え、5×106cells/wellとなるように24ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に分注し、5%CO2下37℃で培養した。
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ELISAの一次抗体として供試し、抗N−βLG抗体又は抗R−βLG抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ELISAによりN−βLG又はR−βLGに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、0.9cell/wellとなるように96ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、4週齢BALB/cマウス胸腺細胞を5×106cells/wellとなるように96ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を用いた。
モノクローナル抗体のスクリーニングは、N−βLG、R−βLG及び尿素処理βLG(以下「D−βLG」という)の3種類のたんぱく質に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。D−βLGは、N−βLGを1mg量り、6.0gの尿素、0.2mlの2−メルカプトエタノール、1mlの50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.6)、1.5mlの蒸留水を加え、アルミフォイルで蓋をした後、100℃で1時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。培養上清のN−βLG、R−βLGあるいはD−βLGに対する反応性を非競合法ELISAにて調べた。
Jonesら(1990)に従い、まず、BALB/cマウスに不完全フロイントアジュバントを0.2ml腹腔内に注射した。1週間後、一尾当たり5×106cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム(アマシャム ファルマシア)により精製した。
抗N−βLGMAb又は抗R−βLGMAbの特性を決定するために、固相法を用いた。固相法として、N−βLG、R−βLG又はD−βLGをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原に抗N−βLGMAb又は抗R−βLGMAbを作用させる方法を用いた。MAbのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoαCNobulin isotyping kit(Pharmingen)により、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)及びIgL(γ)を決定した。
精製したMAbについて、サンドイッチELISAに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。50mMの炭酸緩衝液(pH8.5)を用いて20mg/mlとなるよう調製し、DMSOに3mg/100μlで溶解したNHS−ビオチン溶液を10μl加え、撹拌後、氷冷しながら2時間静置した。その後、20mg/mlとなるようにPBSで置換した。
1)抗N−βLGMAbと抗R−βLGMAbの特性とクラス、サブクラス
N−βLGに対する特異性を持つMAb13種類を得た。それぞれ固相の抗原に対する特異性を表5に示した。
固相の抗原に対し陽性反応を示した各MAbをそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、N−βLG及びD−βLGを検出するためのMAbの組合せを、サンドイッチELISAにおける検出感度の点から選出した。その結果、N−βLG及びD−βLGを検出できる組合せとして、プレート固定化抗体PLG2(FERM ABP−10282)と、ビオチン化抗体PLG1(FERM ABP−10281)又はPLG3(FERM ABP−10283)を選択した。PLG2とPLG1のサンドイッチELISAによるN−βLG及びD−βLGに対する反応性の結果を図3に示す。また、PLG2とPLG3のサンドイッチELISAによるN−βLG及びD−βLGに対する反応性を図4に示す。
サンドイッチELISAにより選択した組合せ(固相にPLG2、ビオチン化にPLG1およびPLG3)を用い、N−βLGとD−βLGの検出感度を確認したところ、図5及び図6に示すように、MAb混合系でN−βLG、D−βLGともにMAb混合系の方が吸光値は高く、検出感度を上げることが可能であることが明らかとなった。
上記1.で選択されたPLG2とPLG1、及びPLG2とPLG3の組合せにより、実際の食品中のホエータンパク質を検出できるかを試みた。
材料及び方法
1)モデル食肉製品の作製
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表6に示す配合にて各濃度のホエータンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、5mmで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、75℃で30分の加熱を行った。
各モデル食肉製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル1gを量り取り、10M尿素および0.1%の2−メルカプトエタノールを含むPBST(PBSにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを0.5%加えたもの)を19g加え、ホモジナイザーにて30秒攪拌した。その後、100℃で1時間加熱処理を行った。冷却後、3,000rpm×20分の遠心分離を行い、上清0.5mlにPBSTを9.5ml加え、ELISA用サンプルとした。検量線には同様に10M尿素及び0.1%の2−メルカプトエタノール処理を行ったホエータンパク質の段階希釈を用いた。また、分析用サンプルからPBSTを用いて抽出し、PBSTに溶解したホエータンパク質を検量線とした尿素及び2−メルカプトエタノールを用いない場合との比較を行った。
サンドイッチELISAによるモデル食肉製品中のホエータンパク質の分析について、尿素および2−メルカプトエタノールを用いて抽出したモデル食肉製品中のホエータンパク質の分析結果を表7に、また、PBSTのみで抽出したモデル食肉製品中のホエータンパク質の分析結果を表8に示す。
7−1 材料および方法
1)金コロイド標識およびコンジュゲートパッドの作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPLG1及びPLG3のMAb溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500μl加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液625μlを加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1%BSA溶液でOD525=2.0になるよう調製し、1:1の割合で混合した。ガラスウール製コンジュゲートパッドに68μl/cm2となるよう塗布し、乾燥させた。
PBSで4mg/mlとなるようPLG2のMAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1%BSAを含む10mMリン酸バッファー(pH7.5)で37℃で1時間ブロッキング後、10mMリン酸バッファー(pH7.5)で洗浄し乾燥させた。
上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドをそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。被検液としては、上記2.で調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。
メンブレン塗布MAbであるPLG2、および金コロイド標識MAbであるPLG1+PLG3の組合せにより、ホエータンパク質は加熱、非加熱に係わらず50ppb(食品中2ppm)まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入したホエーたんぱく質が対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
1−1 材料及び方法
1)ニワトリオボアルブミン(以下「OA」ということがある)の調製
新鮮なニワトリ卵より卵白のみを採取し、泡立てないように均質化後、等量の飽和硫酸アンモニウムを加え、濾紙No.1(アドバンテック東洋)で濾過した。そして、得られたろ液に0.5Mの硫酸を添加しpH4.6に調整後、一晩放置した。8,000rpm×20分の遠心分離により得られた沈殿を蒸留水に溶解し、同じ方法で再結晶化し、粗OA画分を得た。粗OAはさらに、TSK gel DEAE 650S(Tosoh)を用いたイオン交換クロマトグラフィにより精製した。移動相には50mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH6.4)を用い、NaClの0から0.3MのリニアグラジェントによりOAを分画し、透析による脱塩後、凍結乾燥を行った。この凍結乾燥OAを用い、生理食塩水で0.1%のOA溶液を作製し、1ml容エッペンドルフチューブに500μlずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−20℃で凍結保管した。
供試動物として、6週齢のBALB/cマウス(日本クレア株式会社製)4尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のOAが500μl入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。また、追加免疫は、3週間の間隔で2回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のOAが500μl入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。なお、抗変性OAMAbを得る場合、最終免疫のみに後述する還元カルボキシメチル化OAを用いた。
初回あるいは追加免疫でOAを注射した1週間後に、各BALB/cマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に2時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の10倍希釈段を作製し、非競合法ELISAによりマウス血中の抗OA抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製)を用いた。
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法(1975)に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、0.1%OA溶液100μlを尾部静脈より注射した。静脈注射から4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ(Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。1,000rpm×10分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞(P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が10:1になるように混合し、再度1,000rpm×10分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量3,350の45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にRPMI1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地(10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地)に100μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミノプテリン、16μMのチミジンを含むHAT選択培地を加え、5×106cells/wellとなるように24ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に分注し、5%CO2下37℃で培養した。
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ELISAの一次抗体として供試し、抗OA抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ELISAによりOAに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、0.9cell/wellとなるように96ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、4週齢BALB/cマウス胸腺細胞を5×106cells/wellとなるように96ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100g/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を用いた。
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性OA(以下「NOA」ということがある)あるいは還元カルボキシメチル化OA(以下「RCMOA」ということがある)に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。RCMOAは、精製OA(上記凍結乾燥物)を10mg量り、1.4Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.6)1ml、5%のEDTA100μl、1.2gの尿素、33μlの2−メルカプトエタノールを加え2.5mlに定容した後、窒素ガス置換を行い、37℃、1時間の還元処理を行った。さらに、1MのNaOH300μlに溶解した89mgのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で1時間のカルボキシメチル化を行い、RCMOAとした。培養上清のNOAあるいはRCMOAに対する反応性を非競合法ELISAにより調べた。
Jonesら(1990)に従い、まず、BALB/cマウスに不完全フロイントアジュバントを0.2ml腹腔内に注射した。1週間後、一尾当たり5×106cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム(アマシャム ファルマシア)により精製した。
抗OAMAbの特性を決定するために、固相法と液相法を用いた。固相法として、NOA又はRCMOAをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原(NOA又はRCMOA)に抗未変性/変性OAMAbを作用させる方法を用い、また、液相法として、ウサギ抗OAポリクローナル抗体をあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、このポリクローナル抗体にNOA又はRCMOAを結合させた状態で、抗未変性/変性OAMAbを作用させる方法を用いた。また、MAbのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotypingkit(Pharmingen)
により、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)及びIgL(γ)を決定した。
精製したMAbについて、サンドイッチELISAに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。50mMの炭酸緩衝液(pH8.5)を用いて20mg/mlとなるよう調製し、DMSOに3mg/100μlで溶解したNHS−ビオチン溶液を10μl加え、撹拌後、氷冷しながら2時間静置した。その後、20mg/mlとなるようにPBSで置換した。
1)抗OAMAbの特性とクラス、サブクラス
NOAに対する特異性を持つMAb9種類、及び、RCMOAに対する特異性を持つMAb10種類を得た。それぞれ液相あるいは固相の抗原に対する特異性を表9に示した。
NOAを検出するためのMAbあるいはRCMOAを検出するためのMAbの組合せは、サンドイッチELISAにおける検出感度の点から選出した。その結果、NOAでは301B5と316G1や304E4(PNOA1;FERM ABP−10265)と306B2(PNOA2;FERM ABP−10266)、RCMOAでは117F9と119D11や948G11(PDOA1;FERM ABP−10275)と962B8(PDOA2;FERM ABP−10276)を高い組合せとして選択した。
2−1 材料及び方法
NOA溶液は、精製OAをPBSで100ppb溶液となるように調製し、3倍の希釈段を作製した(希釈段A)。一方、ガラス試験管に精製OAを1mg量り、6gの尿素、0.2mlの2−メルカプトエタノール、1mlの50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.6)、1.5mlの蒸留水を加え、アルミフォイルで蓋をした後、100℃で1時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。冷却後、100ml容メスフラスコに移し、PBSで100mlにメスアップした。これをさらにPBSで100倍希釈し、尿素変性OA(以下「UDOA」という)100ppb溶液とした。さらに尿素濃度を0.01Mに保ちながら3倍の希釈段を作製した(希釈段B)。また、NOA100ppb溶液とUDOA100ppb溶液を等量ずつ混ぜ(NOA及びUDOAは各50ppb溶液となる)、尿素濃度を0.005Mに保ちながら3倍の希釈段を作製した(希釈段C)。また、サンドイッチELISAに供試した条件を表10に示す。コーティングMAb濃度は単独の場合は25μg/mlに、また混合した場合には各12.5μg/mlとし、合計で25μg/mlとなるようにした。
図7に示すように、未変性OAを対象とした(試験1)では301B5単独と、301B5と119D11の混合の曲線はほとんど重なったが、10ppb以下のより希薄な状態において301B5単独よりも301B5と119D11の混合の曲線では若干混合の方が吸光値は高く、検出感度が上げられる可能性が考えられた。また、変性OAを対象とした(試験2)のUDOAでは、301B5単独では吸光値が認められず、301B5及び316G1はUDOAに関与しないものと考えられたが、119D11単独と301B5と119D11の混合の曲線では明らかに混合の方が吸光値は高く、MAbを混合することにより検出感度を上げることができるものと考えられた(図8)。これは未変性/変性OAを対象とした(試験3)でも認められ、301B5単独よりも301B5と119D11の混合の方が明らかに吸光値が高かった(図9)。試験1〜3のいずれの場合も、単独でコーティングされた抗体濃度は25g/mlであり、混合ではそれぞれ半分の濃度の12.5mg/mlであったことから、MAbの種類を増やす混合系を用いることで、抗体濃度が同じあるいは少なくても、より抗原の検出感度を上げることが可能であることが明らかとなった。
3−1 材料及び方法
1)金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるように119D11及び316G1のMAb単独あるいは混合溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500μl加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液を625μlを加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1%BSA溶液でOD525=1.0になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド(日本ミリポア社製)に68μl/cm2となるよう塗布し、乾燥させた。
PBSで4mg/mlとなるよう117F9及び301B5のMAb単独あるいは混合溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1%BSA、0.1%Tween20を含むPBSで37℃、2時間ブロッキング後、PBSで洗浄し乾燥させた。
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。被検液としては、上記2.で調製したNOA並びにUDOAを適宜希釈して用いた。
301B5及び金コロイド標識316G1の組合せによりNOAは10ppbまで検出することができたが、UDOAは1ppmでも検出できなかった。一方、117F9及び金コロイド標識119D11の組合せにより、UDOAは10ppbまで検出することができたが、NOAは1ppmでも検出できなかった。これに対して、301B5及び117F9の固定化抗体混合物、並びに316G1及び119D11の金コロイド抗体混合物を用いたイムノクロマトストリップを作製した場合、変性OAあるいは未変性OAを10ppbまで検出可能であった。この様に変性OAに結合可能なMAbと未変性OAに結合可能なMAbを組み合わせることにより、製造工程中に混入した未変性卵白が対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
4−1 材料及び方法
1)ニワトリオボムコイド(以下「OM」という)の調製
新鮮なニワトリ卵より卵白のみを採取し、泡立てないように均質化後、等量の0.1M酢酸緩衝液(pH3.8)と混合した。さらに0.1M酢酸緩衝液に対し透析後、8,000rpm×20分遠心し、上精を回収した。さらに、TSK gel DEAE 650S(Tosoh)を用いたイオン交換クロマトグラフィにより精製した。移動相には50mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH6.4)を用い、NaClの0から0.3MのリニアグラジェントによりOMを分画し、透析による脱塩後、凍結乾燥を行い、これを未変性OM(以下「NOM」ということがある)とした。この精製OMを1mg量り、6gの尿素、0.2mlの2−メルカプトエタノール、1mlの50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.6)、1.5mlの蒸留水を加え、アルミフォイルで蓋をした後、100℃で1時間オイルバスで加熱、変性処理を行い尿素変性OM(以下「DOM」ということがある)とした。生理食塩水でこれらの凍結乾燥物の0.1%溶液を調製し、1ml容エッペンドルフチューブに500μlずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−20℃で凍結保管した。
供試動物として、それぞれ6週齢のBALB/cマウス(日本クレア株式会社製)4尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のNOM又はDOMが500μl入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。また、追加免疫は、3週間の間隔で2回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のNOM又はDOMが500μl入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。
初回あるいは追加免疫でNOM又はDOMを注射した1週間後に、各BALB/cマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に2時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の10倍希釈段を作製し、非競合法ELISAによりマウス血中の抗OM抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.製)を用いた。
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法(1975)に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、0.1%NOM溶液又はDOM溶液100mlを尾部静脈より注射した。静脈注射から4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ(Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。1,000rpm×10分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞(P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が10:1になるように混合し、再度1,000rpm×10分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量3,350の45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にRPMI1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地(10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地)に100μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミノプテリン、16μMのチミジンを含むHAT選択培地を加え、5×106cells/wellとなるように24ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に分注し、5%CO2下37℃で培養した。
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ELISAの一次抗体として供試し、抗NOM抗体又は抗DOM抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ELISAによりNOM又はDOMに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、0.9cell/wellとなるように96ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、4週齢BALB/cマウス胸腺細胞を5×106cells/wellとなるように96ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100g/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を用いた。
Jonesら(1990)に従い、まず、BALB/cマウスに不完全フロイントアジュバントを0.2ml腹腔内に注射した。1週間後、一尾当たり5×106cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム(アマシャム ファルマシア)により精製した。
抗NOMMAb及び抗DOMMabの特性を決定するために、固相法と液相法を用いた。固相法として、NOM又はDOMをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化されたNOM又はDOMにMAbを作用させる方法を用い、また、液相法として、ウサギ抗オボムコイドポリ抗体をあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、このポリ抗体にNOM又はDOMを結合させた状態で、MAbを作用させる方法を用いた。また、MAbのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotypingkit(Pharmingen)により、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)及びIgL(γ)を決定した。
精製したMAbについて、サンドイッチELISAに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。50mMの炭酸緩衝液(pH8.5)を用いて20mg/mlとなるよう調製し、DMSOに3mg/100μlで溶解したNHS−ビオチン溶液を10ml加え、撹拌後、氷冷しながら2時間静置した。その後、20mg/mlとなるようにPBSで置換した。
1)抗NOMMAb及び抗DOMMabの特性とクラス、サブクラス
NOMに対する特異性を持つMAb7種類、DOMに対する特異性を持つMAb10種類を得た。それぞれ液相あるいは固相の抗原に対する特異性を表11に示した。
NOMを検出するためのMAbの組合せは、サンドイッチELISAにおける検出感度の点から選出した。その結果、47E5(PNOM1;FERM ABP−10279)と50A12(PNOM2;FERM ABP−10280)とを高い組合せとして選択した。また、上記、10個のモノクローナル抗体を用いてサンドイッチELISAを行い、最も感度の高い628E1(PDOM1;FERM ABP−10277)と648A9(PDOM2;FERM ABP−10278)とを高い組合せとして選択した。
PNOM1およびPNOM2のサンドイッチELISAでは、未変性オボムコイドは検出できたが、変性オボムコイドはまったく検出できなかった(図10)。また、PDOM1およびPNOM2のサンドイッチELISAでは、変性OMを検出できたが、未変性OMでは10〜100ppbの間で、感度が低かった(図11)。しかし、プレート抗体としてPNOM2及びPDOM2を用い、ビオチン抗体としてPNOM1及びPDOM1を用いる各モノクローナル抗体を組み合わせたサンドイッチELISAでは、特に未変性OMの10〜100ppbで検出感度の向上が認められた(図12)。
5−1 材料及び方法
1)金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPNOM1のMAb溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500μl加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液を625μlを加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1%BSA溶液でOD525=1.0になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド(日本ミリポア社製)に68μl/cm2となるよう塗布し、乾燥させた。
PBSで4mg/mlとなるようPNOM2のMAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1%BSA、0.1%Tween20を含むPBSで37℃、2時間ブロッキング後、PBSで洗浄し乾燥させた。
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。被検液としては、凍結乾燥卵白粉末の0.1%溶液をそれぞれ室温、50℃、75℃、100℃で1時間処理したものを適宜希釈して用いた。
PNOM1及び金コロイド標識PNOM2の組み合わせにより、室温及び50℃で1時間処理した卵白溶液は10ppbまで検出できた。また、75、100℃で1時間処理した卵白は、100ppbまで検出することができた。この結果から、100℃で1時間に相当する加熱処理をされた食品では、尿素の様な変性剤を用いなくても、この抗OMMAbのイムノクロマトストリップを用いることで、卵白として100ppbまでは、簡便な抽出により検出可能であった。しかし、100℃を越えた熱処理ではOMのイムノクロマトでは検出できないため、上記のように尿素による可溶化処理が必要であった。
6−1 方法
上記の結果より、PNOA1、PDOA1及びPNOM1の固定化抗体混合物、並びにPNOA2、PDOA2及びPNOM2の金コロイド抗体混合物を用いたイムノクロマトストリップを上記のように作製し、卵白の検出を試みた。
PNOA1とPNOA2、PDOA1とPDOA2およびPNOM1とPNOM2の組み合わせは、それぞれ上記に示したように目的の変性/未変性オOAあるいはOMをそれぞれの感度で検出することが可能であった。このことから、加工食品の製造過程において未加熱状態の場合には未変性OA及びOMに対するMAbが反応し、50から100℃の場合には、未変性/変性OA、及びOMに対するMAbが反応、それ以上の場合には尿素による可溶化処理により変性OAが反応する卵白の検出方法を開発することができた。
1−1 材料及び方法
1)小麦グリアジン(以下「GL」という)の調製
小麦粉に2倍量のn−ブタノールを加え脱脂を行い、一晩風乾した。得られた脱脂小麦粉に0.1%塩化ナトリウム溶液を2倍量加え、10,000rpm×15分遠心分離した。得られた沈殿に20倍量の0.01N酢酸を加え、撹拌後、10,000rpm×15分遠心分離した。得られた上清を蒸留水で透析し、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物に70%となるようにエタノールを加え、10,000rpm×15分遠心分離した。得られた上清を蒸留水で透析し、粗GL画分を得た。粗GL画分はさらに、Sephacryl S-200HR(AmershamBiosciences)を用いたゲルろ過により精製した。移動相には0.1N酢酸を用いてGLを分画し、蒸留水に透析後、凍結乾燥を行った。生理食塩水でこの凍結乾燥物の0.1%溶液を調製し、1ml容エッペンドルフチューブに500μlずつ分注し、免疫に供するまで−20℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
供試動物として、5週齢のBALB/cマウス(日本クレア株式会社製)5尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のGLが500μl入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。また、追加免疫は、3週間の間隔で2回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のGLが500μl入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。
初回あるいは追加免疫でGLを注射した1週間後に、各BALB/cマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に2時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の10倍希釈段を作製し、非競合法ELISAによりマウス血中の抗GL抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製)を用いた。
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法(1975)に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、0.1%GL溶液100μlを尾部静脈より注射した。静脈注射から4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ(Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。1,000rpm×10分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞(P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が10:1になるように混合し、再度1,000rpm×10分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量3,350の45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にRPMI1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地(10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地)に100μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミノプテリン、16μMのチミジンを含むHAT選択培地を加え、5×106cells/wellとなるように24ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に分注し、5%CO2下37℃で培養した。
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ELISAの一次抗体として供試し、抗GL抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ELISAによりGLに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、0.9cell/wellとなるように96ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、4週齢BALB/cマウス胸腺細胞を5×106cells/wellとなるように96ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を用いた。
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性GL(以下「NGL」という)あるいは還元カルボキシメチル化GL(以下「RCMGL」という)、0.1M酢酸可溶化GL(以下「AGL」という)、70%エタノール可溶化GL(以下「EGL」という)、変性剤で可溶化したGL(以下「DGL」という)に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。RCMGLは、精製GLを10mg量り、1.4Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.6)1ml、5%EDTA100μl、1.2g尿素、33μlの2−メルカプトエタノールを加え2.5mlに定容した後、窒素ガス置換を行い、37℃、1時間の還元処理を行った。さらに、1MのNaOH300μlに溶解した89mgのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で1時間のカルボキシメチル化を行い、RCMGLとした。培養上清のNGL、RCMGL、AGL、EGL及びDGLに対する反応性を非競合法ELISAにより調べた。
Jonesら(1990)に従い、まず、BALB/cマウスに不完全フロイントアジュバントを0.2ml腹腔内に注射した。1週間後、一尾当たり5×106cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム(アマシャム ファルマシア)により精製した。
MAbのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit(Pharmingen)により、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)及びIgL(γ)を決定した。
精製したMAbについて、サンドイッチELISAに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。50mMの炭酸緩衝液(pH8.5)を用いて20mg/mlとなるよう調製し、DMSOに3mg/100μlで溶解したNHS−ビオチン溶液を10μl加え、撹拌後、氷冷しながら2時間静置した。その後、20mg/mlとなるようにPBSで置換した。
1)MAbの選択
小麦の主要アレルゲンであるグリアジン(GL)は、水に不溶性で、酢酸やエタノールに溶けるタンパク質である。そこで、PBSに溶かしたGL(NGL)、還元カルボキシメチル化GL(RCMGL)、0.1M酢酸可溶化GL(AGL)、70%エタノール可溶化GL(EGL)、変性剤で可溶化したGL(DGL)を調製し、どの状態のGLに特異的に結合するMAbであるかを検証した。抗GLMAbの各状態のGLに対するダイレクトELISAの結果を表12に示す。表1に示されるように、全ての状態のGLに結合するMAbであるPGL1(FERM ABP−10267)、PGL2(FERM ABP−10268)、PGL4、PGL7を選択した。
ダイレクトELISAで選択したPGL1、PGL2、PGL4、PGL7を用いて、全てのMAbの組合わせについてサンドイッチELISAを行った。グリアジンはNGL、RCMGL、AGL、EGL、DGLを用いた。その結果、いずれの状態のGLでも最も高く検出できたのは、PGL1とPGL2の組合わせであった。PGL1とPGL2を用いたサンドイッチELISAの結果を図13に示す。その他の組み合わせについてはサンドイッチELISAにて全てのGLを検出できない、または検出感度が極めて低かった。以上の結果から、食品に様々な状態で含まれるGLを検出するMAbとして、PGL1とPGL2を選択した。
イムノブロッティングで、各抗体が認識するエピトープを限定するため、A−PAGEとエレクトロブロッティングに続いてイムノブロッティングを行った。まず、小麦グリアジンをLafiandra,D.&Kasarda,D.D.に従いA−PAGE(Cereal Chemistry,,62,314-319,1985)により分離した。分離したゲルを用いて、エレクトロブロッティングによりPVDF膜に転写した。転写したPVDF膜にPGL1とPGL2の培養上清(1/1000)を反応させたのち、発色させて、認識するエピトープを確認した。その結果、図14に示されるように、PGL1で認識されるタンパク質分解バンドがPGL2では認識されなかった。このことから、PGL1とPGL2とは異なるエピトープを認識することがわかった。
3−1 材料及び方法
1)金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPGL1(又はPGL2)溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500μl加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液を625μlを加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1%BSA溶液でOD525=1.0になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド(日本ミリポア社製)に68μl/cm2となるよう塗布し、乾燥させた。
PBSで4mg/mlとなるようPGL2(又はPGL1)溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1%BSA、0.1%Tween20を含むPBSで37℃、2時間ブロッキング後、PBSで洗浄し乾燥させた。
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。
サンドイッチELISAにより様々な状態のGLを検出できたことから、より簡易な検出方法としてイムノクロマトによる検出系を構築し、評価した。評価にあたっては、現在市販されているアレルゲン検出キットと同じ抗体を用いている市販A及び市販Bと比較した。結果を表13に示す。なお、表13中、「非特異反応」は、緩衝液のみを供したときに陽性と判定されたとき「あり」とした。その結果、市販Aでは、未変性小麦粉抽出物は検出できたが、変性小麦粉抽出物は非特異反応が見られ判定できなかった。また、市販Bでは、未変性小麦粉抽出物では1ppmでも検出できず、変性小麦粉抽出物は非特異反応が見られ判定できなかった。本発明のキットを用いる方法では、未変性小麦粉抽出物、変性小麦粉抽出物のどちらも50ppb程度まで検出することができた。また、変性小麦粉抽出物での非特異反応は見られなかった。
1−1 材料及び方法
1)そば24kDaタンパク質MAb及び抗76kDaタンパク質の調製
市販そば粉に5倍量の精製水を加え、攪拌後12000rpmで遠心分離を行い沈殿を得た。得られた沈殿に1M塩化ナトリウムを5倍量加え、攪拌後12000rpmで遠心分離を行い、上清を得た。上清を透析により脱塩し、凍結乾燥を行って得られた画分をそば粗タンパク質画分とした。このそば粗タンパク質画分をさらにプレップセル960(BioRad)を用いて精製を行った。24kDaタンパク質の精製は、そば粗タンパク質画分を2.0%SDSと5%2−メルカプトエタノールが含まれるサンプルバッファーに溶解後、95℃で4分間加熱したものをサンプルとして供試し、アクリルアミド12%分離ゲルを用いたプレップセル960にて分画し、24kDaタンパク質を得た。76kDaタンパク質の精製は、そば粗タンパク質画分を2.0%SDSが含まれ、2−メルカプトエタノールが含まれないサンプルバッファーに溶解したものをサンプルとして供試し、アクリルアミド12%分離ゲルを用いたプレップセル960にて分画し、76kDaタンパク質を得た。得られた各画分は透析後、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥を用い、生理食塩水で0.1%の24kDaタンパク質溶液及び0.1%の76kDaタンパク質溶液それぞれを作製し、1ml容エッペンドルフチューブに500μlずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−20℃で凍結保管した。
供試動物として、5週齢のBALB/cマウス(日本クレア株式会社製)5尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%の24kDaタンパク質溶液及び0.1%の76kDaタンパク質溶液がそれぞれ500μl入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。また、追加免疫は、3週間の間隔で2回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%の24kDaタンパク質溶液及び0.1%の76kDaタンパク質溶液がそれぞれ500μl入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。
初回あるいは追加免疫で24kDaタンパク質溶液又は76kDaタンパク質溶液を注射した1週間後に、各BALB/cマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に2時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の10倍希釈段を作製し、非競合法ELISAによりマウス血中の抗24kDaタンパク質抗体価及び抗76kDaタンパク質抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製)を用いた。
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法(1975)に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、0.1%の24kDaタンパク質溶液又は0.1%の76kDaタンパク質溶液それぞれ100μlを尾部静脈より注射した。静脈注射から4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ(Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。1,000rpm×10分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞(P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が10:1になるように混合し、再度1,000rpm×10分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量3,350の45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にRPMI1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地(10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地)に100μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミノプテリン、16μMのチミジンを含むHAT選択培地を加え、5×106cells/wellとなるように24ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に分注し、5%CO2下37℃で培養した。
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ELISAの一次抗体として供試し、抗24kDaタンパク質抗体又は76kDaタンパク質抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ELISAにより24kDaタンパク質又は76kDaタンパク質に対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、0.9cell/wellとなるように96ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、4週齢BALB/cマウス胸腺細胞を5×106cells/wellとなるように96ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100g/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を用いた。
モノクローナル抗体のスクリーニングは、24kDaタンパク質、76kDaタンパク質、PBSで希釈したそば粗タンパク質(以下「NBW」ということがある)、あるいは変性剤により可溶化したそば粗タンパク質(以下「DBW」ということがある)に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。そば粗タンパク質は、そば粉に20倍量のPBSTを加え4℃で一晩撹拌し、遠心分離後に脱脂処理した上清を回収し、透析後、凍結乾燥したものをそば粉抽出物として調製した。変性剤による可溶化は、そば粗タンパク質を10mg量り、尿素6g、2−メルカプトエタノール0.2ml、50mMのTris−HCl緩衝液(pH8.6)1ml、蒸留水1.5mlを加え、アルミフォイルで蓋をした後、100℃で1時間オイルバスで加熱、変性処理を行い、これをDBWとした。培養上清の24kDaタンパク質、76kDaタンパク質、NBW、及びDBWに対する反応性を非競合法ELISAにて調べた。
Jonesら(1990)に従い、まず、BALB/cマウスに不完全フロイントアジュバントを0.2ml腹腔内に注射した。1週間後、一尾当たり5×106cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム(アマシャム ファルマシア)により精製した。
抗24kDaタンパク質MAb又は抗76kDaタンパク質MAbの特性を決定するために、固相法を用いた。固相法として、24kDaタンパク質、76kDaタンパク質、NBW又はDBWをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原に抗24kDaタンパク質MAb又は76kDaタンパク質MAbを作用させる方法を用いた。また、MAbのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotypingkit(Pharmingen)により、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)及びIgL(γ)を決定した。
精製したMAbについて、サンドイッチELISAに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。50mMの炭酸緩衝液(pH8.5)を用いて20mg/mlとなるよう調製し、DMSOに3mg/100μlで溶解したNHS−ビオチン溶液を10μl加え、撹拌後、氷冷しながら2時間静置した。その後、20mg/mlとなるようにPBSで置換した。
1)抗24kDaタンパク質MAbと76kDaタンパク質MAbの特性とクラス、サブクラス
24kDaタンパク質に対する特異性を持つMAb5種類、及び、76kDaタンパク質に対する特異性を持つMAb4種類を得た。それぞれ固相の抗原に対する特異性を表15及び表16に示した。
固相の抗原に対し陽性反応を示した各MAbをそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、NBWおよびDBWを検出するためのMAbの組合せを、サンドイッチELISAにおける検出感度の点から選出した。その結果、NBWを検出できる組合せとして、プレート固定化抗体PBW2(FERM ABP−10273)とビオチン化抗体PBW3(FERM ABP−10274)を、また、DBWを検出できる組み合わせとして、プレート固定化抗体PBW1(FERM ABP−10272)とビオチン化抗体PBW2を選択した。PBW2およびPBW3のサンドイッチELISAによる各種そば粗タンパク質に対する反応性の結果を図15に示す。また、PBW1およびPBW2のサンドイッチELISAによる各種そば粗タンパク質に対する反応性を図16に示す。
サンドイッチELISAにより選択したMAbを混合し、NBW、DBWの検出感度を確認した。すなわち、NBWでは、プレート固定化抗体をPBW2単独とした場合と、PBW1およびPBW2を混合した場合で、ビオチン化PBW3を二次抗体として比較した。また、DBWでは、高い検出感度であったプレート固定化抗体PBW1、ビオチン化PBW2の組み合わせと、PBW1およびPBW2を混合したプレート固定化抗体と、ビオチン化PBW3を二次抗体とした場合を比較した。図17及び図18に示すように、NBW、DBWともにプレート抗体を混合した方が吸光値が高く、検出感度を上げることが可能であることが明らかとなった。
上記1.で選択されたPBW1、PBW2、PBW3の組合せにより、実際の食品中のそば粗タンパク質を検出できるかを試みた。
1)モデル食肉製品の作製
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表17に示す配合にて各濃度のそば粗タンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、5mmで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、75℃で30分の加熱を行った。
(モデル塩漬肉)
各モデル塩漬肉を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル1gを量り取り、PBST19gを加えホモジナイザーにて30秒攪拌した。3,000rpm×20分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを0.5ml測り取り、PBSTを9.5ml加え、ELISA用サンプルとした。検量線には同様にPBSTを用いたそば粗タンパク質の段階希釈を用いた。
(モデル加熱製品)
各モデル加熱製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル1gを量り取り、1%SDS、1%2−メルカプトエタノールを含むPBS 19gを加えホモジナイザーにて30秒攪拌した。その後、100℃1時間加熱処理を行った。冷却後3,000rpm×20分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを0.5ml測り取りPBSTを9.5ml加え、ELISA用サンプルとした。検量線には同様にSDS、2−メルカプトエタノール処理を行ったそば粗タンパク質の段階希釈を用いた。
サンドイッチELISAによるモデル食肉製品中のそば粗タンパク質の分析について、モデル塩漬肉の結果を表18に、また、モデル加熱製品の結果を表19に示す。
3−1 材料及び方法
1)金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPBW3MAb溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500μl加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液を625μlを加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1%BSA溶液でOD525=1.0になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド(日本ミリポア社製)に68μl/cm2となるよう塗布し、乾燥させた。
PBSで8mg/mlとなるようPBW1とPBW2のMAb溶液を調製し、1:1の割合で混合したものをニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1% スキムミルクを含む10mMリン酸バッファー(pH7.5)で37℃、1時間ブロッキング後、10mMリン酸バッファー(pH7.5)で洗浄し乾燥させた。
上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドをそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。非検液としては、上記2.で調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。
メンブレン塗布MAb PBW1+PBW2、および金コロイド標識MAb PBW3の組合せにより、そばタンパク質は加熱、非加熱に係わらず50ppb(食品中2ppm)まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入したそばタンパクが対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
1−1 材料及び方法
1)Ara h1タンパク質の調製
市販生落花生に5倍量の20mM bis-tris-propanebuffer(pH7.2)を加え、室温で2時間攪拌後3000×gで遠心分離を行い沈殿および油分を除去した。得られた水溶性画分を再度10000×gで遠心分離を行い上清を得た。上清をさらにSourceQ(アマシャム ファルマシア)を用いて、20mMのbis-tris-propane buffer(pH7.2)、NaClのリニアグラジエント(0〜1M)により精製を行った。精製したAra h1画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行い、未変性Ara h1(以下NAh1と記す)とした。また、変性Ara h1(以下DAh1と記す)はNAh1を10mg量り、尿素6g、2−メルカプトエタノール(以下2−MEと記す)0.2ml、50mMのTris−HCl緩衝液(pH 8.6)1ml、蒸留水1.5mlを加え、アルミフォイルで蓋をした後、100℃で1時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。その後透析し、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥を用い、生理食塩水で0.1%のDAh1溶液及び0.1%のDAh1溶液それぞれを作製し、1ml容エッペンドルフチューブに500μlずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−20℃で凍結保管した。
供試動物として、5週齢のBALB/cマウス(日本クレア株式会社製)5尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のNAh1溶液及び
0.1%のDAh1溶液がそれぞれ500μl入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。また、追加免疫は、2週間の間隔で3回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のNAh1溶液及び0.1%のDAh1溶液がそれぞれ500μl入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。
初回あるいは追加免疫でNAh1溶液又はDAh1溶液を注射した1週間後に、各BALB/cマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に2時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の10倍希釈段を作製し、非競合法ELISAによりマウス血中の抗NAh1抗体価及び抗DAh1抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製)を用いた。
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法(1975)に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、0.1%のNAh1溶液又は0.1%のDAh1溶液それぞれ100μlを尾部静脈より注射した。静脈注射から4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ(Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。1,000rpm×10分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞(P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が10:1になるように混合し、再度1,000rpm×10分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量3,350の45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にRPMI1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地(10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地)に100μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミノプテリン、16μMのチミジンを含むHAT選択培地を加え、5×106cells/wellとなるように24ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に分注し、5%CO2下37℃で培養した。
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ELISAの一次抗体として供試し、抗NAh1抗体又はDAh1抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ELISAによりNAh1又はDAh1に対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、0.9 cell/wellとなるように96ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、4週齢BALB/cマウス胸腺細胞を5×106cells/wellとなるように96ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100g/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を用いた。
モノクローナル抗体のスクリーニングは、NAh1、DAh1、あるいは落花生粗タンパク質の未変性物(以下NP−eと記す)、尿素処理(以下DP−eと記す)の4種類に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。なお、NP−eは落花生に5倍量の20mMbis-tris-propanebuffer(pH7.2)を加え、室温で2時間攪拌後遠心分離を2回行い得られた上清を透析した後、凍結乾燥したものとした。また、DP−eはNP−eを10mg量り、尿素6g、2−ME0.2ml、50mMのTris−HCl緩衝液(pH8.6)1ml、蒸留水1.5mlを加え、アルミフォイルで蓋をした後、100℃で1時間オイルバスで加熱、変性処理を行ったものとした。培養上清のNAh1、NP−e、DAh1あるいはDP−eに対する反応性を非競合法ELISAにて調べた。
Jonesら(1990)に従い、まず、BALB/cマウスに不完全フロイントアジュバントを0.2ml腹腔内に注射した。1週間後、一尾当たり5×106cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム(アマシャム ファルマシア)により精製した。
抗NAh1MAb又は抗DAh1MAbの特性を決定するために、固相法を用いた。固相法として、NAh1、DAh1、NP−e又はDP−eをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原に抗NAh1MAb又はDAh1MAbを作用させる方法を用いた。また、MAbのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotypingkit(Pharmingen)により、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)及びIgL(γ)を決定した。
精製したMAbについて、サンドイッチELISAに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。50mMの炭酸緩衝液(pH8.5)を用いて20mg/mlとなるよう調製し、DMSOに3mg/100μlで溶解したNHS−ビオチン溶液を10μl加え、撹拌後、氷冷しながら2時間静置した。その後、20mg/mlとなるようにPBSで置換した。
1)抗NAh1MAbとDAh1MAbの特性とクラス、サブクラス
NAh1に対する特異性を持つMAb7種類、及び、DAh1に対する特異性を持つMAb3種類を得た。それぞれ固相の抗原に対する特異性を表20及び表21に示した。
固相の抗原に対し陽性反応を示した各MAbをそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、NP−eおよびDP−eを検出するためのMAbの組合せを、サンドイッチELISAにおける検出感度の点から選出した。その結果、NP−eを検出できる組合せとして、プレート抗体にPAh1−2(FERM ABP−10270)とビオチン抗体にPAh1−1(FERM ABP−10269)、また、DP−eを検出できる組合せとしてプレート抗体にPAh1−2とビオチン抗体にPAh1−3(FERM ABP−10271)の組合せを選択した(図19と図20)。
固相にPAh1−2(細胞寄託番号)、ビオチン化にPAh1−1(細胞寄託番号)およびPAh1−3(細胞寄託番号)を混合し、NP−e、DP−eの検出感度を確認した。それぞれのMAb濃度は50μg/mlに設定した。その結果、MAb混合系でNP−e、DP−eともに検出することが可能であった(図21と図22)。
上記1.で選択されたPAh1−1、PAh1−2およびPAh1−3の組合せにより、実際の食品中の落花生粗タンパク質を検出できるかを試みた。
1)モデル食肉製品の作製
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表22に示す配合にて各濃度の落花生粗タンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、5mmで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、75℃で30分の加熱を行った。
(モデル塩漬肉)
各モデル塩漬肉を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル1gを量り取り、PBST19gを加えホモジナイザーにて30秒攪拌した。3000rpm×20分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを0.5ml測り取り、PBSTを9.5ml加え、ELISA用サンプルとした。検量線には同様にPBSTに溶解した落花生粗タンパク質の段階希釈を用いた。
(モデル加熱製品)
各モデル加熱製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル1gを量り取り、1M尿素および0.1%2−MEを含むPBS 19gを加えホモジナイザーにて30秒攪拌した。その後、100℃で1時間加熱処理を行った。冷却後3000rpm×20分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを0.5ml測り取りPBSTを9.5ml加え、ELISA用サンプルとした。検量線には同様に1M尿素および0.1% 2−ME処理を行った落花生粗タンパク質の段階希釈を用いた。また、分析用サンプルからPBSTを用いて抽出し、PBSTに溶解した落花生粗タンパク質を検量線とした尿素および2−MEを用いない場合との比較を行った。
サンドイッチELISAによるモデル食肉製品中の落花生粗タンパク質の分析について、モデル塩漬肉の結果を表23に、モデル加熱製品の結果を表24に、また、PBSTのみで抽出した結果を表25に示す。
3−1 材料及び方法
1)金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPAh1−1とPAh1−3のMAb溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500ml加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液625μlを加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1% BSA溶液でOD525=2.0になるよう調製し、1:1の割合で混合した。ガラスウール製コンジュゲートパッドに68μl/cm2となるよう塗布し、乾燥させた。
PBSで4mg/mlとなるようPAh1−2のMAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1%スキムミルクを含む10mMリン酸バッファー(pH7.5)で37℃、1時間ブロッキング後、10mMリン酸バッファー(pH7.5)で洗浄し乾燥させた。
上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドをそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。非検液としては、上記2.で調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。
メンブレン塗布MAb PAh1−2、および金コロイド標識MAb PAh1−1とPAh1−3 の組合せにより、落花生粗タンパク質は加熱、非加熱に係わらず50ppb(食品中2ppm)まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入した落花生タンパク質が対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
Claims (15)
- 未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体を用いることを特徴とするそばアレルゲンの検出方法。
- 未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識し、かつ異なるエピトープを認識する2種以上の抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体を併用することを特徴とするそばアレルゲンの検出方法。
- 抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体が、24Daタンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体、又は76kDaタンパク質及び未変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項1又は2記載のそばアレルゲンの検出方法。
- 抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ(FERM ABP−10272)が産生する抗24kDaタンパク質モノクローナル抗体PBW1及び/又はハイブリドーマ(FERM ABP−10273)が産生する抗76kDaタンパク質モノクローナル抗体PBW2及び/又はハイブリドーマ(FERM ABP−10274)が産生する抗76kDaタンパク質モノクローナル抗体PBW3であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載のそばアレルゲンの検出方法。
- サンドイッチELISAにより、未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を、10〜1000ppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載のそばアレルゲンの検出方法。
- 検体から、尿素と2−メルカプトエタノールを用いて加熱変性そば粗タンパク質を抽出することを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載のそばアレルゲンの検出方法。
- 未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体を備えたことを特徴とするそばアレルゲン検出用キット。
- 未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識し、かつ異なるエピトープを認識する2種以上の抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体を備えたことを特徴とするそばアレルゲン検出用キット。
- 抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体が、24Daタンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体、又は76kDaタンパク質及び未変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項7又は8記載のそばアレルゲン検出用キット。
- 抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ(FERM BP−10272)が産生する抗24kDaタンパク質モノクローナル抗体PBW1及び/又はハイブリドーマ(FERM BP−10273)が産生する抗76kDaタンパク質モノクローナル抗体PBW2及び/又はハイブリドーマ(FERM BP−10274)が産生する抗76kDaタンパク質モノクローナル抗体PBW3であることを特徴とする請求項7〜9のいずれか記載のそばアレルゲン検出用キット。
- 異なるエピトープを認識する2種以上のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項7〜10のいずれか記載のそばアレルゲン検出用キット。
- 検体からのそば粗タンパク質抽出剤としての、尿素と2−メルカプトエタノールが備えられていることを特徴とする請求項7〜11のいずれか記載のそばアレルゲン検出用キット。
- ハイブリドーマ(FERM BP−10272)が産生する抗24kDaタンパク質モノクローナル抗体PBW1。
- ハイブリドーマ(FERM BP−10273)が産生する抗76kDaタンパク質モノクローナル抗体PBW2。
- ハイブリドーマ(FERM BP−10274)が産生する抗76kDaタンパク質モノクローナル抗体PBW3。
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