WO2005085847A1 - アレルゲンの検出方法 - Google Patents

Abstract

　乳アレルゲン、卵白、小麦、そば、落花生のアレルゲンを含む食品において、これらアレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検出キットを提供するものである。未変性及び変性の乳アレルゲン、未変性及び変性の卵白アレルゲン、未変性及び変性の小麦アレルゲン、未変性及び変性のそばアレルゲン、又は未変性及び変性の落花生アレルゲンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクロナール抗体を用いるアレルゲンの検出方法であって、αｓ１カゼインの主要タンパク質であるαｓ１αｓ１カゼイン、ホエーの主要たんぱく質であるβラクトグロブリン、卵白主要タンパク質であるオボアルブミンとオボムコイド、小麦の主要タンパク質であるグリアジン、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質、又は落花生の主要タンパク質であるＡｒａ ｈ１を指標とする。

Description

明 細 書

アレルゲンの検出方法

技術分野

[0001] 本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性及び変性の乳アレルゲン、未変性及 び変性の卵白アレルゲン、未変性及び変性の小麦アレルゲン、未変性及び変性の そばアレルゲン、又は未変性及び変性の落花生アレルゲンを指標とした乳アレルゲ ンの検出方法や、それに用いられる乳アレルゲンの検出用キットに関する。

[0002] また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性の乳アレルゲンを 定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、カゼインの主要タンパク質であ る a s iカゼイン、あるいは、ホエーの主要たんぱく質である /3ラクトグロブリンを指標と したアレルゲンの検出方法や、それに用いられるアレルゲンの検出用キットに関する

[0003] また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性のオボアルブミンや オボムコイドの卵白アレルゲンを定性的かつ定量的に高感度で分析することができる 、オボアルブミン及び Z又はオボムコイドを指標とした卵白アレルゲンの検出方法や 、それに用いられる卵白アレルゲンの検出用キットに関する。

[0004] また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性の小麦アレルゲンを 定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、小麦の主要タンパク質である グリアジンを指標とした小麦アレルゲンの検出方法や、それに用いられる小麦アレル ゲンの検出用キットに関する。

[0005] また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性のそばアレルゲンを 定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、そばの主要タンパク質である 分子量 24kDaと 76kDaのタンパク質を指標としたそばアレルゲンの検出方法や、そ れに用いられるそばアレルゲンの検出用キットに関する。

[0006] また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性の落花生アレルゲン を定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、落花生の主要タンパク質で ある Am hiを指標とした落花生アレルゲンの検出方法や、それに用いられる落花生 アレルゲンの検出用キットに関する。 背景技術

[0007] 自然環境の減少、車や工場などからの排気ガス、住宅事情等、或いは食べ物の変 化など様々な因子により、現在では、 3人に 1人が何らかのアレルギー疾患をもっとい われている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質 (以下 、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、 消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの 患者が増カロしていることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題を生じている。こ れらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。そのためには 、表示を通じて消費者へ情報提供の必要性も高まっており、 FAOZWHO合同食品 規格委員会は、アレルギー物質として知られている 8種の原材料を含む食品にあつ ては、それを含む旨の表示について合

意し、加盟国で各国の制度に適した表示方法を検討することとした（1999年 6月）。 日本では過去の健康危害などの程度、頻度を考慮して重篤なアレルギー症状を起し た実績のある 24品目の食品について、その表示方法が定められた（2002年 4月より 施行)。アレルギーを引き起こす食品としては、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及 び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母若しくはゼラ チンなどが知られており、特に乳アレルゲンの主要成分としての α siカゼインや、ホ エーアレルゲンの主要成分である j8ラクトグロブリンや、卵白アレルゲン成分としては オボアルブミンとオボムコイドや、小麦アレルゲンの主要成分としてグリアジンや、そ ばの主要タンパク質である分子量 24kDaと 76kDaのタンパク質や、落花生の主要タ ンパク質である Am hiが知られている。

[0008] 従来、アレルゲンの検出する方法としては、例えば、アレルゲンに特異的に反応す るィムノグロブリンを定量する方法 (特開平 05— 249111号公報参照）や、抗原抗体 複合体を含有する検体中の該抗原抗体複合体を酸処理等により解離させ、必要に 応じてアル力リを用いて中和処理を行った後、該検体中のアレルゲン特異的 IgE抗 体を測定する方法 (特開平 07— 140144号公報参照)等が知られて 、る。

[0009] また、現在、現在、乳、卵、小麦、そば、落花生の特定原材料を検出するための公 定法として、加熱 '非加熱複合抗原より得られるポリクローナル抗体を用いた免疫学 的な検出方法 (特開 2003—155297号公報参照；以下「市販公定法 A」 t 、う）、ある いは精製抗原より得られたポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法 (以下「 巿販公定法 B」という）が用いられている。これらは、特異的にアレルゲンを検出する ために有効な方法であるが問題も多い。例えば、巿販公定法 Aでは複合抗原を用い ているため、何に対する抗体なのかが不明で、交差性が高ぐ例えば、ィムノブロット 法などによる抗原の同定ができず、また非特異反応が増える可能性がある。また、巿 販公定法 Bでは、抗原が精製されているため抗体の特異性は明確であるものの、未 変性の抗原を用いて作製された抗体を使用しているため、変性 Z未変性により抗体 が結合する程度に違いがあるため、同じ添加量であっても、加熱前、加熱後での定 量値が異なるという問題があった。特に、小麦は他の特定原材料 (卵、乳、そば、落 花生）の中でも過酷な加熱処理が施される場合が多！、（例えばパン、唐揚げ等)ため 、小麦アレルゲンは未変性力も加熱変性まで、広範囲な状態で存在する。そこで、小 麦アレルゲンを検出するためには、どの様な状態のアレルゲンに対して結合するかを 明らかにしたモノクローナル抗体を作製し、その特性に応じて利用する必要がある。

[0010] さらに、卵の同定、定量に関しては、オボムコイドを指標として、すでにポリクローナ ル抗体を用いた方法（例えば、 Int. Archs. Allergy appl. Immun., 75, 8-15, 1984参照 )あるいはモノクローナル抗体を用いた方法（例えば、 Nutr. Sci. Vitaminol. 45, 491-500, 1999参照）が知られている。また、オボムコイドを認識するモノクローナル抗 体で、未変性オボムコイドと反応するが熱変性オボムコイドとは反応しな 、モノクロ一 ナル抗体、熱変性オボムコイドと反応するが未変性オボムコイドとは反応しな 、モノク ローナル抗体、及び未変性オボムコイドと熱変性オボムコイドに反応するモノクロ一 ナル抗体を用いて、加熱変性状態をも識別してオボムコイドを定量し、卵アレルゲン の同定と正確な定量を可能とする免疫学的定量方法が報告されている（例えば、特 開 2002— 253230号公報参照）。

発明の開示

[0011] 本発明の課題は、乳アレルゲン、卵白アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲ ン、又は落花生アレルゲンを含む食品において、乳アレルゲン、卵白アレルゲン、小 麦アレルゲン、そばアレルゲン、又は落花生アレルゲン力 変性 z未変性のいかなる 状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検 出キット等を提供することにある。

[0012] 本発明者らは、特定原材料である乳、卵白、小麦、そば又は落花生の各アレルゲ ンを検出する方法について鋭意検討し、未変性及び変性の乳アレルゲン、未変性及 び変性の卵白アレルゲン、未変性及び変性の小麦アレルゲン、未変性及び変性の そばアレルゲン、又は未変性及び変性の落花生アレルゲンを認識する各 2種類又は それ以上のモノクロナール抗体を用いると、これら特定原材料の各アレルゲンを検出 することができることを見い出した。

[0013] 特定原材料の一つである乳の検出方法の検討を行うに当たっては、カゼインの主 要たんぱく質である a s iカゼインを指標として、これに対するモノクローナル抗体 (以 下 MAbと記す場合がある）を作出し、その中から未変性 a siカゼイン、尿素処理 a s 1カゼイン、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを認識することが できる MAbを複数選択し、サンドイッチ ELIS Aにより、未変性 a siカゼイン、尿素処 理 a s iカゼイン、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを、 100— 1 OOOppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる MAbの組合わせを 見い出した。また、これらの MAbを用いると、食品中の乳アレルゲンがいかなる加工 工程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便 に検査対象製品からの乳アレルゲンを検出しうることを確認した。

[0014] また、特定原材料の一つである乳の検出方法の検討を行うに当たって、ホエーの 主要たんぱく質である j8ラクトグロブリンを指標として、これに対するモノクローナル抗 体を作出し、その中から未変性 j8ラクトグロブリン、尿素処理 j8ラクトグロブリン、還元 カルボキシメチルイ匕 /3ラクトグロブリンを認識することができる MAbを複数選択し、サ ンドイッチ ELISAにより、未変性 /3ラクトグロブリン、尿素処理 j8ラクトグロブリン、還 元カルボキシメチル化 βラクトグロブリンを、 30— lOOOppbの濃度範囲においても定 性的かつ定量的に分析しうる MAbの組合わせを見い出した。また、これらの MAbを 用いると、食品中の乳アレルゲン力 Sいかなる加工工程を経た場合にでも、本発明によ る検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品からの乳アレルゲ ンを検出しうることを確認した。 [0015] 特定原材料の一つである卵白の検出方法の検討を行うに当たっては、精製ォボア ルブミンやオボムコイドに対するモノクローナル抗体を作出し、その中から未変性抗 原に結合できる MAbと、変性抗原に結合できる MAbとをそれぞれ複数選択し、未変 性抗原結合 MAb群と変性抗原結合 MAb群を組み合わせることで、抗原となるオボ アルブミンやオボムコイドが変性 Z未変性のいかなる状態にあっても高感度で検出 できることを見い出し、特に未変性抗原結合 MAb群と変性抗原結合 MAb群を組み 合わせて用いた場合、未変性オボアルブミンやオボムコイドあるいは変性オボアルブ ミンやオボムコイドのみが存在する場合であっても、未変性抗原結合 MAb (群）単独 使用や変性抗原結合 MAb (群)単独使用におけるよりも優れた検出感度で検出しう ることを確認した。また、卵白アレルゲンであるオボアルブミンとオボムコイドに対する MAbを組み合わせることにより、食品中の卵白力 ^、かなる加工工程を経た場合にで も、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品から の卵白アレルゲンを検出しうることを確認した。

[0016] 特定原材料の一つである小麦の検出方法の検討を行うに当たっては、精製グリア ジンに対するモノクローナル抗体を作出し、その中力 未変性小麦グリアジン、還元 カルボキシメチル化小麦グリアジン、 0. 1M酢酸可溶化小麦グリアジン、 70%ェタノ ール可溶ィ匕小麦グリアジン、及び変性剤で可溶ィ匕した小麦グリアジンを認識すること ができる MAbを複数選択し、サンドイッチ ELISAにより、未変性小麦グリアジン、還 元カルボキシメチルイ匕小麦グリアジン、 0. 1M酢酸可溶ィ匕小麦グリアジン、 70%エタ ノール可溶ィ匕小麦グリアジン、及び変性剤で可溶ィ匕した小麦グリアジンを、 10— 100 ppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる MAbの組合わせを見い 出した。また、これらの MAbを用いると、食品中の小麦アレルゲンがいかなる加工ェ 程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に 検査対象製品からの小麦アレルゲンを検出しうることを確認した。

[0017] 特定原材料の一つであるそばの検出方法の検討を行うに当たっては、精製した 24 kDaタンパク質、又は精製した 76kDaタンパク質に対するモノクローナル抗体を作出 し、その中から 24kDaタンパク質又は 76kDaタンパク質を認識することができる MA bを複数選択し、サンドイッチ ELISAにより、未加熱 (未変性）、加熱 (変性)のいかな る状態のそばタンパク質でも、高感度で分析できる未変性そばタンパク質に結合可 能な MAbと変性そばタンパク質に結合可能な MAbの組合わせを見い出した。また、 これらの MAbを用いると、食品中のそばアレルゲンが!/、かなる加工工程を経た場合 にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製 品からのそばアレルゲンを検出しうることを確認した。

[0018] 特定原材料の一つである落花生の検出方法の検討を行うに当たっては、精製した 未変性の Am hi (以下「NAhl」という場合がある）、又は精製した Am hiを尿素と ml2—メルカプトエタノールを用いて変性した Am hi (以下「DAhl」 t\、う場合がある )に対するモノクローナル抗体を作出し、その中力 NAhl、 DAhl、未変性の落花 生粗タンパク質 (以下「NP - e」 、う場合がある）、及び Z又は尿素処理した落花生 粗タンパク質 (以下「DP-e」と ヽぅ場合がある）を認識することができる MAbを複数選 択し、サンドイッチ ELIS Aにより、未加熱 (未変性）、加熱 (変性)のいかなる状態の落 花生タンパク質でも、高感度で分析できる MAbの組合わせを見い出した。また、これ らの MAbを用いると、食品中の落花生アレルゲンカ^、かなる加工工程を経た場合に でも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品 力もの落花生アレルゲンを検出しうることを確認した。

図面の簡単な説明

[0019] [図 1]本発明（乳アレルゲン）の 2種類の抗 a siカゼイン MAbを用いた、各種状態の a siカゼインに対するサンドイッチ ELISAの結果を示す図である。

[図 2]本発明（乳アレルゲン）の PaslCNlおよび PaslCN2の認識する小麦 a si力 ゼインの構成たんぱく質の相違を示す図である。

[図 3]本発明（乳アレルゲン）の PLG2と PLG1のサンドイッチ ELISAによる各種 13ラ タトグロブリンに対する反応性を示す図である。

[図 4]本発明（乳アレルゲン）の PLG2と PLG3のサンドイッチ ELISAによる各種 13ラ タトグロブリンに対する反応性を示す図である。

[図 5]本発明（乳アレルゲン）の MAb混合系でのサンドイッチ ELISAによる未変性ラ タトグロブリンに対する反応性を示す図である。

[図 6]本発明（乳アレルゲン）の MAb混合系でのサンドイッチ ELISAによる尿素変性 ラクトグロブリンに対する反応性を示す図である。

[図 7]本発明（卵白アレルゲン）の試験 1における各希釈段に対する抗オボアルブミン MAbの反応性を示す図である。

[図 8]本発明（卵白アレルゲン）の試験 2における各希釈段に対する抗ォボアルブミン MAbの反応性を示す図である。

[図 9]本発明（卵白アレルゲン）の試験 3における各希釈段に対する抗ォボアルブミン MAbの反応性を示す図である。

[図 10]本発明（卵白アレルゲン）の PNOM1および PNOM2のサンドイッチ ELISA による変性 Z未変性オボムコイドに対する反応性を示す図である。

[図 11]本発明（卵白アレルゲン）の PDOM1および PDOM2のサンドイッチ ELISAに よる変性 Z未変性オボムコイドに対する反応性を示す図である。

[図 12]本発明（卵白アレルゲン）の PNOM2と PDOM2及び PNOM1と PDOM1に よる変性 Z未変性オボムコイドに対する反応性を示す図である。

[図 13]本発明（小麦アレルゲン）の 2種類の抗グリアジン MAbを用いた、各種状態の グリアジンに対するサンドイッチ ELISAの結果を示す図である。

[図 14]本発明（小麦アレルゲン）の PGL1および PGL2の認識する小麦グリアジンの 構成たんぱく質の相違を示す図である。

[図 15]本発明（そばァレノレゲン）の PBW2および PBW3のサンドイッチ ELISAによる 各種そば粗タンパク質に対する反応性を示す図である。

[図 16]本発明（そばァレノレゲン）の PBW1および PBW2のサンドイッチ ELISAによる 各種そば粗タンパク質に対する反応性を示す図である。

[図 17]本発明（そばアレルゲン）の PBW1、 PBW2及び PBW3の MAb混合系サンド イッチ ELISAによる未変性そば粗タンパク質に対する反応性を示す図である。

[図 18]本発明（そばアレルゲン）の PBW1、 PBW2及び PBW3の MAb混合系サンド イッチ ELISAによる変性そば粗タンパク質に対する反応性を示す図である。

[図 19]本発明（落花生アレルゲン）の PAhl— 1および PAhl— 2のサンドイッチ ELIS

Aによる各種落花生粗タンパク質に対する反応性を示す図である。

[図 20]本発明（落花生アレルゲン）の PAhl—2ぉょびPAhl—3のサンドィッチELIS Aによる各種落花生粗タンパク質に対する反応性を示す図である。

[図 21]本発明（落花生アレルゲン）の PAhl— 1、 PAhl— 2及び PAhl— 3の MAb混 合系サンドイッチ ELISAによる未変性落花生粗タンパク質に対する反応性を示す図 である。

[図 22]本発明（落花生アレルゲン）の PAhl— 1、 PAhl— 2及び PAhl— 3の MAb混 合系サンドイッチ ELISAによる変性落花生粗タンパク質に対する反応性を示す図で ある。

発明を実施するための最良の形態

[0020] 本発明の食品中のアレルゲンの検出方法としては、未変性及び変性の乳アレル ゲン、未変性及び変性の卵白アレルゲン、未変性及び変性の小麦アレルゲン、未変 性及び変性のそばアレルゲン、又は未変性及び変性の落花生アレルゲンを認識す る各 2種類又はそれ以上のモノクロナール抗体を用いるアレルゲンの検出方法であ つて、 a siカゼインの主要タンパク質である a s iカゼイン、ホエーの主要たんぱく質 である j8ラクトグロブリン、卵白主要タンパク質であるオボアルブミンとオボムコイド、 小麦の主要タンパク質であるグリアジン、そばの主要タンパク質である分子量 24kDa と 76kDaのタンパク質、又は落花生の主要タンパク質である Am hiを指標とする食 品等に含まれるアレルゲンの検出方法であれば特に制限されるものではない。

[0021] 本発明の乳アレルゲンの検出方法としては、未変性乳アレルゲンを認識するモノク ロナール抗体と、変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体とを併用する乳ァ レルゲンの免疫学的な検出方法であれば特に制限されず、また、本発明の乳アレル ゲン検出用キットとしては、未変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体と、変 性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体とを備え、未変性乳アレルゲンを認識 するモノクロナール抗体と変性乳アレルゲンとを認識するモノクロナール抗体とを併 用する条件下で用いられる免疫学的なアレルゲン検出用キットであれば特に制限さ れな 、が、未変性乳アレルゲン及び Z又は変性乳アレルゲンを認識するモノクロナ ール抗体として、それぞれ異なるェピトープを認識する 2以上のモノクロナール抗体 を備えたものが好ま 、。力かる未変性乳アレルゲン及び Z又は変性乳アレルゲン を認識するモノクロナール抗体として、抗 s iカゼインモノクロナール抗体ゃ抗 βラ タトグロブリンモノクローナル抗体を具体的に例示することができる。ここで「乳アレル ゲン」とは、乳カゼインの主要タンパク質である α siカゼイン及び Ζ又はホエーの主 要たんぱく質である j8ラクトグロブリンを含むものをいう。

[0022] 上記抗 a s iカゼインモノクロナール抗体としては、未変性 a s iカゼイン、尿素処理 a s iカゼイン、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを認識する抗 a s iカゼインモノクロナール抗体、好ましくは、配列番号 1で示される a s iカゼインの アミノ酸配列の 132番目力 193番目までの領域を認識するモノクローナル抗体を挙 げることができ、具体的には、ハイプリドーマ（FERM ABP-10263)が産生する抗 a s lカゼインモノクロナール抗体 Pas lCN l、ハイプリドーマ（FERM ABP— 1026 4)が産生する抗 (X s iカゼインモノクロナール抗体 Pas lCN2等を好適に例示するこ とができる。また、 Pas lCN lと Pas l CN2を組み合わせることで、特に有利にサンドィ ツチ ELISAやィムノクロマトを行うことができる。例えば、これらの抗体を用いることで 、サンドイッチ ELIS Aにより、食品中の未変性 α s iカゼイン及び尿素処理 α s iカゼ インを、 10— lOOOppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することが できる。

[0023] 上記抗 /3ラクトグロブリンモノクローナル抗体として、未変性 j8ラクトグロブリン、尿素 処理 j8ラクトグロブリン、還元カルボキシメチル化 ラクトグロブリンを認識する抗 j8ラ タトグロブリンモノクロナール抗体を挙げることができ、具体的には、ノ、イブリドーマ（F

ERM ABP-10281 )が産生する抗 13ラクトグロブリンモノクロナール抗体 PLG 1、 ハイプリドーマ（FERM ABP-10282)が産生する抗 j8ラクトグロブリンモノクロナー ル抗体 PLG2、 ノヽイブリドーマ（FERM ABP— 10283)が産生する抗 13ラタトグロブ リンモノクロナール抗体 PLG3等を好適に例示することができる。また、 PLG2と PLG 1や、 PLG2と PLG3や、 PLG2と PLG 1および PLG3を組み合わせることで、特に有 利にサンドイッチ ELISAやィムノクロマトを行うことができる。例えば、これらの抗体を 用いることで、サンドイッチ ELISAにより、食品中の未変性 j8ラクトグロブリン及び尿 素処理 j8ラクトグロブリンを、 30— lOOOppbの濃度範囲においても定性的かつ定量 的に分析することができる。

[0024] 本発明の乳アレルゲンの検出方法においては、検体から、尿素と 2—メルカプトエタ ノールを用いてカゼイン及び Z又はホエータンパク質を抽出することが好ましぐまた

、未変性カゼインを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及び変性カゼインを 認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体、並びに、未変性 j8ラクトグロブリンを認 識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及び変性 βラクトグロブリンを認識する 1又 は 2以上のモノクロナール抗体を用いることが好ましい。また、本発明の乳アレルゲン 検出用キットにおいては、カゼイン及び/又はホエータンパク質を抽出するための尿 素と 2—メルカプトエタノールを含むものが好ましぐまた、未変性カゼインを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及び変性カゼインを認識する 1又は 2以上のモノク ロナール抗体、並びに、未変性 j8ラクトグロブリンを認識する 1又は 2以上のモノクロ ナール抗体及び変性 j8ラクトグロブリンを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗 体を備えるものが好ましい。

[0025] 本発明の卵白アレルゲンの検出方法としては、未変性卵白アレルゲンを認識する モノクロナール抗体と、変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナール抗体とを併用 する卵白アレルゲンの免疫学的な検出方法であれば特に制限されず、また、本発明 の卵白アレルゲン検出用キットとしては、未変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナ ール抗体と、変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナール抗体とを備え、未変性卵 白アレルゲンを認識するモノクロナール抗体と変性卵白アレルゲンとを認識するモノ クロナール抗体とを併用する条件下で用いられる免疫学的なアレルゲン検出用キット であれば特に制限されず、未変性卵白アレルゲン及び Z又は変性卵白アレルゲン を認識するモノクロナール抗体として、それぞれ異なるェピトープを認識する 2以上の モノクロナール抗体を備えたものが好ましい。力かる未変性卵白アレルゲン及び Z又 は変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナール抗体として、抗オボアルブミンモノク ローナル抗体ゃ抗オボムコイドモノクローナル抗体を具体的に例示することができる 。ここで「卵白アレルゲン」とは、卵白の主要タンパク質であるオボアルブミン及び Z 又はオボムコイドを含むものを！、う。

[0026] 上記抗オボアルブミンモノクローナル抗体としては、未変性オボアルブミン及び Z 又は還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識する抗オボアルブミンモノクロ一 ナル抗体が好ましぐ具体的には、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10265)が産生 する抗オボアルブミンモノクロナール抗体 PNOAl、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10266)が産生する抗オボアルブミンモノクロナール抗体 PNOA2、ノ、イブリドーマ（ FERM ABP-10275)が産生する抗オボアルブミンモノクロナール抗体 PDOAl、 ハイプリドーマ（FERM ABP-10276)が産生する抗オボアルブミンモノクロナール 抗体 PDOA2等を好適に例示することができる。また、 PNOA1と PNOA2等の抗未 変性オボアルブミンモノクローナル抗体や、 PDOA1と PDOA2等の抗変性オボアル ブミンモノクローナル抗体の組み合せ、特に PNOA1と PNOA2等の抗未変性オボ アルブミンモノクローナル抗体と PDOA1と PDOA2等の抗変性オボアルブミンモノク ローナル抗体を組み合わせることで、特に有利にサンドイッチ ELISAやィムノクロマト を行うことができる。例えば、これらの抗体を用いることで、サンドイッチ ELISAにより 、食品中の未変性オボアルブミン及び Z又は変性オボアルブミンを、 1. 0— 10. Op pbの濃度範囲にぉ 、ても定性的かつ定量的に分析することができる。

[0027] 上記抗ォボムコイドモノクローナル抗体として、未変性オボムコイド及び Z又は尿素 変性オボムコイドを認識する抗オボムコイドモノクローナル抗体を挙げることができ、 具体的には、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10279)が産生する抗オボムコイドモノ クロナール抗体 ΡΝΟΜ1、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10280)が産生する抗ォ ボムコイドモノクロナール抗体 PNOM2、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10277)力 S 産生する抗オボムコイドモノクロナール抗体 PDOMl、ハイプリドーマ（FERM ABP 10278)が産生する抗オボムコイドモノクロナール抗体 PDOM2等を好適に例示す ることができる。また、 PNOM1と PNOM2等の抗未変性オボムコイドモノクローナル 抗体や、 PDOM1と PDOM2等の抗変性オボムコイドモノクローナル抗体の組み合 せ、特に PNOM1と PNOM2等の抗未変性オボムコイドモノクローナル抗体と PDO Mlと PDOM2等の抗変性オボムコイドモノクローナル抗体を組み合わせることで、 特に有利にサンドイッチ ELISAやィムノクロマトを行うことができる。例えば、これらの 抗体を用いることで、サンドイッチ ELISAにより、食品中の未変性オボムコイド及び Z 又は変性オボムコイドを、 10— lOOppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に 分析することができる。

[0028] 本発明の卵白アレルゲンの検出方法においては、尿素と 2 メルカプトエタノールを 用いてオボアルブミン及び z又はオボムコイドを抽出するすることが好ましぐまた、 未変性オボアルブミンを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及び変性オボァ ルブミンを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体、並びに、未変性オボムコイド を認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及び変性オボムコイドを認識する 1又 は 2以上のモノクロナール抗体を用いることが好ましい。また、本発明の卵白アレルゲ ン検出用キットにおいては、オボアルブミン及び Z又はオボムコイドを抽出するため の尿素と 2—メルカプトエタノールを含むものが好ましぐまた、未変性オボアルブミン を認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及び変性オボアルブミンを認識する 1 又は 2以上のモノクロナール抗体、並びに、未変性オボムコイドを認識する 1又は 2以 上のモノクロナール抗体及び変性オボムコイドを認識する 1又は 2以上のモノクロナ ール抗体を備えるものが好まし 、。

本発明の小麦アレルゲンの検出方法としては、未変性小麦グリアジン及び変性剤 で可溶ィ匕した小麦グリアジンを認識する抗小麦グリアジンモノクロナール抗体を用い る小麦アレルゲンの免疫学的な検出方法や、未変性小麦グリアジン及び変性剤で可 溶ィ匕した小麦グリアジンを認識し、かつ異なるェピトープを認識する 2種類の抗小麦 グリアジンモノクロナール抗体を併用する小麦アレルゲンの免疫学的な検出方法で あれば特に制限されず、また、本発明の小麦アレルゲン検出用キットとしては、未変 性小麦グリアジン及び変性剤で可溶ィ匕した小麦グリアジンを認識する抗小麦ダリアジ ンモノクロナール抗体を備えた免疫学的なアレルゲン検出用キットや、未変性小麦グ リアジン及び変性剤で可溶ィ匕した小麦グリアジンを認識し、かつ異なるェピトープを 認識する 2種類の抗小麦グリアジンモノクロナール抗体を備えた免疫学的なアレルゲ ン検出用キットであれば特に制限されず、上記抗小麦グリアジンモノクロナール抗体 としては、未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチルイ匕小麦グリアジン、 0. 1M酢 酸可溶ィ匕小麦グリアジン、 70%エタノール可溶ィ匕小麦グリアジン、及び変性剤で可 溶ィ匕した小麦グリアジンを認識する抗小麦グリアジンモノクロナール抗体が好ましぐ 具体的には、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10267)が産生する抗小麦グリアジン モノクロナール抗体 PGL1、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10268)が産生する抗 小麦グリアジンモノクロナール抗体 PGL2等を好適に例示することができる。これらの 抗体を組み合わせることで、特に有利にサンドイッチ ELISAやィムノクロマトを行うこ とができる。例えば、サンドイッチ ELISAにより、食品中の未変性小麦グリアジン、還 元カルボキシメチルイ匕小麦グリアジン、 0. 1M酢酸可溶ィ匕小麦グリアジン、 70%エタ ノール可溶ィ匕小麦グリアジン、及び変性剤で可溶ィ匕した小麦グリアジンを、 10— 100 ppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。

本発明のそばアレルゲンの検出方法としては、未変性そば粗タンパク質及び加熱 変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体を用いるそ ばアレルゲンの免疫学的な検出方法や、未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そ ば粗タンパク質を認識し、かつ異なるェピトープを認識する 2種類の抗そば粗タンパ ク質モノクロナール抗体を併用するそばアレルゲンの免疫学的な検出方法であれば 特に制限されず、また、本発明のそばアレルゲン検出用キットとしては、未変性そば 粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクロ ナール抗体を備えた免疫学的なアレルゲン検出用キットや、未変性そば粗タンパク 質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識し、かつ異なるェピトープを認識する 2種類 の抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体を備えた免疫学的なアレルゲン検出用キ ットであれば特に制限されず、抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体としては、 24 Daタンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノク ロナール抗体、又は 76kDaタンパク質及び未変性そば粗タンパク質を認識する抗そ ば粗タンパク質モノクロナール抗体が好ましぐ具体的には、ハイプリドーマ（FERM ABP-10272)が産生する抗 24kDaタンパク質モノクロナール抗体 PBW1、ハイブ リドーマ（FERM ABP-10273)が産生する抗 76kDaタンパク質モノクロナール抗 体 PBW2、ハイプリドーマ（FERM ABP—10274)が産生する抗 76kDaタンパク質 モノクロナール抗体 PBW3等を好適に例示することができる。また、 PBW1等の 24D aタンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクロ ナール抗体と、 PBW2等の 76kDaタンパク質及び未変性そば粗タンパク質を認識す る抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体との組合せや、 PBW2と PBW3等の未変 性そば粗タンパク質と加熱変性そば粗タンパク質を共に認識する抗そば粗タンパク 質モノクロナール抗体との組み合わせ、中でも、これらのモノクローナル抗体の混合 系として組み合わせることで、特に有利にサンドイッチ ELISAやィムノクロマトを行うこ とができる。例えば、サンドイッチ ELISAにより、未変性そば粗タンパク質及び加熱 変性そば粗タンパク質を、 10— lOOOppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的 に分析することができる。

[0031] さらに、本発明ののそばアレルゲンの検出方法においては、検体から、尿素と 2— メルカプトエタノールを用いて加熱変性そば粗タンパク質を抽出することが好ましぐ また、本発明のそばアレルゲン検出用キットとしては、検体からのそば粗タンパク質抽 出剤としての、尿素と 2—メルカプトエタノールが備えられて 、るものが好ま 、。

[0032] 本発明の落花生アレルゲンの検出方法としては、未変性落花生 Am hiタンパク 質及び加熱変性落花生 Am hiタンパク質を認識する抗 Am hiタンパク質モノクロ ナール抗体を用いる落花生アレルゲンの免疫学的な検出方法や、未変性落花生 Ar a hiタンパク質及び加熱変性落花生 Am hiタンパク質を認識し、かつ異なるェピト ープを認識する 2種類の抗 Am hiタンパク質モノクロナール抗体を併用する落花生 アレルゲンの免疫学的な検出方法であれば特に制限されず、また、本発明の落花生 アレルゲン検出用キットとしては、未変性落花生 Am hiタンパク質及び加熱変性落 花生 Am hiタンパク質を認識する抗落花生 Am hiタンパク質モノクロナール抗体を 備えた免疫学的なアレルゲン検出用キットや、未変性落花生 Am hiタンパク質及び 加熱変性落花生 Am hiタンパク質を認識し、かつ異なるェピトープを認識する 2種 類の抗落花生 Am hiタンパク質モノクロナール抗体を備えた免疫学的なアレルゲン 検出用キットであれば特に制限されず、抗 Am hiタンパク質モノクロナール抗体とし ては、未変性 Am hiタンパク質と未変性落花生粗タンパク質、及び Z又は、尿素処 理 Am hiタンパク質と尿素処理落花生粗タンパク質を認識する抗 Am hiタンパク 質モノクロナール抗体が好ましぐ具体的には、ハイプリドーマ（FERM ABP-102 69)が産生する抗未変性 Am hiタンパク質モノクロナール抗体 PAhl— 1、ハイブリド 一マ（FERM ABP— 10270)が産生する抗未変性 Am hiタンパク質モノクロナー ル抗体 PAhl - 2、ハイプリドーマ（FERM ABP - 10271)が産生する抗加熱変性 A ra hiタンパク質モノクロナール抗体 PAhl— 3等を好適に例示することができる。また 、 PAhl-1等の未変性 Am hiタンパク質と未変性落花生粗タンパク質を認識する 抗 Am hiタンパク質モノクロナール抗体と、 PAhl— 2等の未変性 Z変性 Am hiタ ンパク質と未変性 Z変性落花生粗タンパク質を認識する抗 Am hiタンパク質モノク ロナール抗体との組合せや、 PAhl—2と？八！^ー 等の未変性 変性八 hiタンパ ク質と未変性 Z変性落花生粗タンパク質を認識する抗 Am hiタンパク質モノクロナ ール抗体同士の組み合わせ、中でも、これらのモノクローナル抗体の混合系として組 み合わせることで、特に有利にサンドイッチ ELISAやィムノクロマトを行うことができる 。例えば、サンドイッチ ELISAにより、未変性落花生 Am hiタンパク質及び加熱変 性落花生 Am hiタンパク質を、 10— lOOOppbの濃度範囲においても定性的かつ 定量的に分析することができる。

[0033] さらに、本発明のの落花生アレルゲンの検出方法においては、検体から、尿素と 2 メルカプトエタノールを用いて加熱変性落花生粗タンパク質を抽出することが好まし ぐまた、本発明の落花生アレルゲン検出用キットとしては、検体からの加熱変性落 花生粗タンパク質抽出剤としての、尿素と 2—メルカプトエタノールが備えられているも のが好ましい。

[0034] 以上の本発明の免疫学的なアレルゲンの検出方法は、未変性 Z変性の乳アレル ゲン、未変性及び変性の卵白アレルゲン、未変性及び変性の小麦アレルゲン、未変 性及び変性のそばアレルゲン、又は未変性及び変性の落花生アレルゲン (以下「食 物アレルゲン」ということがある）を含む試料を、標識ィ匕した抗食物アレルゲン MAbと 接触させ、あるいは標識ィ匕した抗体の存在下に食物アレルゲン MAbと接触させ、抗 原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免 疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて分離'測定する検出段階とから なり、力かる免疫反応段階における抗原抗体反応の方法も特に制限されず、例えば 、以下の方法を例示することができる。

[0035] 不溶性担体に結合した本発明の抗食物アレルゲン MAbに試料中の食物アレル ゲンを捕捉させた後に標識ィ匕抗 IgG抗体を反応させるサンドイッチ法や、不溶性担 体に結合した抗食物アレルゲン MAbと異なるェピトープを認識する標識抗食物ァレ ルゲン MAb (第二抗体)を用いるサンドイッチ二抗体法や、不溶性担体に結合した 抗食物アレルゲン MAbに試料中の食物アレルゲンを標識ィ匕抗原の存在下で反応さ せる競合法や、食物アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する磁気ビ ーズ結合標識抗食物アレルゲン MAbを作用させさせた後、磁力により分離した免疫 複合体中の標識物質を検出する磁気ビーズ法や、食物アレルゲンを含有する試料 にこれらと特異的に反応する標識抗食物アレルゲン MAbを作用させて凝集沈殿さ せた後、遠心分離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法 や、金コロイド等で標識された抗食物アレルゲン MAbと食物アレルゲンであるタンパ ク質が結合した抗原抗体複合体が試験ストリップ上を毛管現象等により移動する途 中に、食物アレルゲンと結合する抗食物アレルゲン MAbをあらかじめ固定しておき、 抗原抗体複合体を補足させることで現れる着色ラインの有無によって定性分析する ィムノクロマト法の他、二重免疫拡散法、放射免疫拡散法など公知の免疫測定法を 利用することができる力 抗食物アレルゲン MAbとして、それぞれ異なるェピトープ を認識する 2以上のモノクローナル抗体を用いる方法、例えば、食品中の未変性ァレ ルゲン及び Z又は変性アレルゲンが 100— lOOOppbの濃度範囲においても定性的 かつ定量的に分析しうる高感度の点でサンドイッチ二抗体法が、定性的には簡便性 からィムノクロマト法が好ましい。また、食肉製品等の食品試料中力 アレルゲンを抽 出する場合、尿素と 2—メルカプトエタノールを用いることが望ま 、。

[0036] 上記抗原抗体反応にぉ 、て用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレ ン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素榭脂、架 橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子 及びこれらの組み合わせ等を挙げることができ、また、不溶性担体の形状としては、 例えば、トレィ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験 管、ラテックスビーズ状等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担 体への抗原又は抗体の固定化方法は特に限定されるものでなぐ物理的吸着法、共 有結合法、イオン結合法等を用いることができる。

[0037] 本発明の食物アレルゲンの検出方法や食物アレルゲン検出用キットに用いられる 抗食物アレルゲン MAbの免疫グロブリンのクラス及びタイプは特に制限されないが、 抗食物アレルゲン MAbとして、 IgGクラス、タイプ κの抗体が好適に用いられる。また 、モノクローナル抗体の形態としては、全抗体又は F (ab' ) 、 Fab等の断片を用いる こともできる。抗体の由来は特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ヒト、兎、 鶏等を挙げることができるが、作製の簡便性力もマウスに由来するモノクローナル抗 体が好適に用いられる。また、抗食物アレルゲン MAbは、未変性又は変性の a si力 ゼインで免疫した動物力 採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によ り調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水 内で増殖させた後、該培養物又は腹水力 採取することにより製造することができる。

[0038] 抗食物アレルゲン MAb産生ノ、イブリドーマは、例えば、未変性及び Z又は変性の 食物アレルゲンを用いて BALBZcマウスを免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細 胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによ りスクリーニングすることにより、抗食物アレルゲン MAb産生ハイブリドーマを作出す ることができる。上記の抗体産生細胞としては、例えば未変性及び Z若しくは変性の 食物アレルゲン又はこれを含有する組成物を投与して免疫した動物から得られる脾 臓細胞、リンパ節細胞、 B—リンパ球等を挙げることができる。免疫する動物としてはマ ウス、ラット、ゥサギ、ゥマ等が挙げられる。免疫は、例えば未変性及び Z又は変性の 食物アレルゲンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は 腹腔内に 1一 2回 Z月、 1一 6ヶ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の 分離は、最終免疫から 2— 4日後に免疫動物力 採取することにより行なわれる。ミエ ローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細 胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。

[0039] 細胞融合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)等の培地中で抗体産 生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合 することにより行なうことができる。細胞融合終了後、 DMEM等で適当に希釈し、遠 心分離し、沈殿を HAT培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイプリドー マを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを 検索し、限界希釈法等によりクローユングを行ない、抗食物アレルゲン MAbを産生 するハイプリドーマを得ることができる。また、 a siカゼイン等の未変性の食物アレル ゲンのみを用いて免疫した抗免疫動物から、有利に抗変性食物アレルゲン MAbを 得ることができる場合もある。この場合、抗変性 a siカゼイン MAb等の抗変性食物ァ レルゲン MAb産生ハイブリドーマをスクリーニングしてもよいし、あるいは、固相状態 での ELISAで未変性の oi siカゼイン等の未変性の食物アレルゲンに対するモノクロ ーナル抗体産生ハイプリドーマを選択し、この抗体産生ハイプリドーマが産生するモ ノクローナル抗体力 液相状態で未変性の食物アレルゲンに対してのみ特異的に反 応する抗食物アレルゲン MAbを得ることができる。前記のように、抗体産生ノ、イブリド 一マを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物カゝら採取することが できるが、培養物又は腹水力ものモノクローナル抗体の分離 ·精製方法としては、タ ンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよぐ例えば 、 IgG精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテイン A、 G等の カラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。

[0040] また、標識化抗体作製に用いられる標識物質としては、単独でまたは他の物質と 反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質であればよく 、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、金コロイド等を使用するのができ、 酵素としてはペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、 j8— D—ガラクトシダーゼ、 グノレコースォキシダーゼ、グノレコースー6—ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ァノレコーノレ 脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ぺ-シリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースォキ シダーゼ、ゥレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等を、蛍 光物質としては、フルォレスセインイソチオシァネート、フィコピリタンパク、希土類金 属キレート、ダンシルク口ライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシァネート等を 、発光物質としては、ルミノール類、ジォキセタン類、アタリジ-ゥム塩類等を、放射性 物質としては³ H、 ¹⁴C、 ¹²⁵1若しくは¹³¹1等を例示することができる。標識物質が酵素で ある場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、発光剤 等が用いることができる。

[0041] 本発明の食物アレルゲン検出用キットには、有効成分としての抗食物アレルゲン M Ab、好ましくはそれぞれ異なるェピトープを認識する 2以上の抗食物アレルゲン MA bを含むが、これらは保存安定性の点から、溶液状態よりも凍結乾燥物として収容さ れていることが好ましぐ検出用キットには力かる抗食物アレルゲン MAb溶解する緩 衝液ゃ培養液の他、試料を調製するための緩衝液等を含んでいてもよい。また、より 好ましい別の態様の本発明の抗食物アレルゲン検出用キットとしては、前記ィムノク 口マト法における試験ストリップを挙げることができる。この場合、異なるェピトープを 認識する 2種類のモノクロナール抗体の少なくとも一つを、ィムノクロマト用に用いら れる金コロイドで標識されたモノクロナール抗体とすることが好ましい。

本発明のモノクローナル抗体としては、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10263)力 産生する抗 (X siカゼインモノクロナール抗体 PaslCNlや、

ハイプリドーマ（FERM ABP-10264)が産生する抗 a siカゼインモノクロナール 抗体 PaslCN2や、ノヽイブリドーマ（FERM ABP— 10281)が産生する抗 j8ラタトグ ロブリンモノクロナール抗体 PLG1や、

ハイプリドーマ（FERM ABP— 10282)が産生する抗 j8ラクトグロブリンモノクロナー ル抗体 PLG2や、ノヽイブリドーマ（FERM ABP— 10283)が産生する抗 13ラクトグロ ブリンモノクロナール抗体 PLG3や、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10265)が産生 する抗オボアルブミンモノクロナール抗体 PNOA1や、ハイプリドーマ（FERM ABP -10266)が産生する抗オボアルブミンモノクロナール抗体 PNOA2や、ハイプリドー マ（FERM ABP— 10275)が産生する抗オボアルブミンモノクロナール抗体 PDOA 1や、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10276)が産生する抗オボアルブミンモノクロ ナール抗体 PDOA2や、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10279)が産生する抗オボ ムコイドモノクロナール抗体 PNOM1や、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10280)力 産生する抗オボムコイドモノクロナール抗体 PNOM2や、ハイプリドーマ（FERM A BP— 10277)が産生する抗オボムコイドモノクロナール抗体 PDOM1や、ハイブリド 一マ（FERM ABP— 10278)が産生する抗オボムコイドモノクロナール抗体 PDOM 2や、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10267)が産生する抗小麦グリアジンモノクロ ナール抗体 PGL1や、ハイプリドーマ（FERM ABP - 10268)が産生する抗小麦グ リアジンモノクロナール抗体 PGL2や、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10272)が産 生する抗 24kDaタンパク質モノクロナール抗体 PBW1や、ノ、イブリドーマ（FERM ABP— 10273)が産生する抗 76kDaタンパク質モノクロナール抗体 PBW2や、ハイ ブリドーマ（FERM ABP— 10274)が産生する抗 76kDaタンパク質モノクロナール 抗体 PBW3や、ハイプリドーマ（FERM ABP - 10269)が産生する抗未変性 Am h 1タンパク質モノクロナール抗体 PAhl—lや、ハイプリドーマ（FERM ABP— 1027

0)が産生する抗未変性 Am hiタンパク質モノクロナール抗体 PAhl— 2や、ハイブリ ドーマ（FERM ABP-10271)が産生する抗加熱変性 Am hiタンパク質モノクロナ ール抗体 PAhl— 3を挙げることができ、これらハイプリドーマは、平成 17 (2005)年 2 月 24日（受領日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター ( T 305-5466 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に受領されてい る。なお、上記 PaslCNl (FERM P— 20206)、 PaslCN2 (FERM P— 20207)、 PNOA1 (FERM P— 20208)、 PNOA2 (FERM P— 20209)、 PGL1 (FERM P— 20210)、 PGL2 (FERM P— 20211)は平成 16 (2004)年 9月 7日（受託日）付 で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託されていたも のである。

[0043] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。

実施例 1

[0044] 1.抗 a siカゼインモノクロナール抗体の確立

1-1 材料及び方法

1) 0；51カゼィン（以下「0；じ?^」とぃぅ）の調製

新鮮な牛乳より Zittle (1959)に従い、 a CNの粗画分を得た。この粗画分をさらに T SK gel DEAE 650S (TOSOH)を用いて、 50mMのイミダゾールー HC1緩衝液（pH 6. 4)、4Mの尿素を含む NaClのリニアグラジェント（0から 0. 3M)により精製を行つ た。精製した《CN画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行った。生理食塩水でこ の凍結乾燥物の 0. 1%溶液を調製し、 1ml容エツペンドルフチューブに 500 1ずつ 分注し、免疫に供するまで - 20°Cで凍結保管し、抗原溶液とした。

[0045] 2)免疫

供試動物として、 6週齢の BALBZcマウス（日本クレア株式会社製） 5尾を用いた。 初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco)を 0. 1%の0；じ?^カ 00 1入った エツペンドルフチューブに等量カ卩え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマ ルジョンを供試した。このェマルジヨンを 1尾当たり 150 1腹腔内に注射した。また、 追加免疫は、 3週間の間隔で 2回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（ Difco)を 0. 1 %の at CN力 00 μ 1入ったエツペンドルフチューブに等量カ卩え、ボルテ ックスミキサーにて攪拌して作製したェマルジヨンを供試した。このェマルジヨンを 1尾 当たり 150 μ 1腹腔内に注射した。

[0046] 3)血中抗体価の測定

初回あるいは追加免疫で a CNを注射した 1週間後に、各 BALBZcマウスの尾部 静脈より採血を行った。採血した血液は室温に 2時間放置後、遠心分離を行い、血 清を得た。これらの血清の 10倍希釈段を作製し、非競合法 ELISAによりマウス血中 の抗 a CN抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マ ウス IgU^H + L)饥体 (JacKson ImmunoReserch Laboratories Inc.製) 用 ヽた。

[0047] 4)ハイプリドーマの作製

ノ、イブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（1975)に従った。すなわち 、十分に抗体価が上がったマウスに、 0. 1 % a CN溶液 100 1を尾部静脈より注射 した。静脈注射から 4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、 RP MI 1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson )を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。 1 , OOOrpm X IO分の遠心分離により脾臓細胞を 集め、再度 RPMI 1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマ ウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が 10 : 1になるように混合し、再 度 1 , OOOrpm X IO分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子 量 3, 350の 45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液に R PMI 1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイプリドーマ 用培地（10%牛胎児血清、 40mMの 2—メルカプトエタノール、 lOOUZmlのぺ-シ リン、 lOOmgZmlのストレプトマイシンを含む RPMI 1640培地）に 100 μ Μのヒポキ サンチン、 0. 4 μ Μのアミノプテリン、 16 μ Μのチミジンを含む HAT選択培地をカロえ 、 5 X 10⁶cells/wellとなるように 24ゥエルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson)に 分注し、 5%CO下 37°Cで培養した。

2

[0048] 5)限界希釈法によるクローユング

細胞培養用プレートの各ゥエルの培養上清にっ 、て、 ELISAの一次抗体として供 試し、抗 a CN抗体を産生しているハイプリドーマの存在を調べた。 ELISAにより oc CNに対して陽性を示したゥエルのハイプリドーマについて、 0. 9 cell/wellとなるよう に 96ゥエルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクロ 一ユングを行った。なお、フィーダ一細胞として、 4週齢 BALBZcマウス胸腺細胞を 5 X 106cells/wellとなるように 96ゥエル細胞培養用プレートの各ゥエルに加えた。 クロー-ングされたハイプリドーマの培養には、 10%牛胎児血清、 40mMの 2—メル カプトエタノール、 lOOUZmlのペニシリン、 100 gZmlのストレプトマイシンを含む RPMI 1640培地を用 、た。

[0049] 6)抗体のスクリーニング

モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性 _α CN (以下「Ν— a CN」と!、う）、尿 素処理 (X CN (以下「D— a CN」と 、う）、市販のカゼインナトリウムの未変性物（以下「 N-CNJ t\、う）又は市販のカゼインナトリウムの尿素処理物（以下「D— CN」 t\、う）の 4種類のたんぱく質に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを 得ることとした。 D— a CNは、精製 a CNを lmg量り、 5%EDTA100 μ 尿素 6. Og 、 2—メルカプトエタノール 0. 2ml、 50mMトリスー塩酸緩衝液（pH8. 6) 1ml,蒸留水 1. 5mlをカ卩え、アルミフオイルで蓋をした後、 100°Cで 1時間オイルバスで加熱、変 性処理を行った。培養上清の N— a CN、 D— a CN、 N— CNあるいは D— CNに対す る反応性を非競合法 ELISAにて調べた。

[0050] 7)腹水の採取及び MAbの精製

Jonesら（1990)に従い、まず、 BALBZcマウスに不完全フロイントアジュバントを 0 . 2ml腹腔内に注射した。 1週間後、一尾当たり 5 X 106cellsのクローユングされたハ イブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水 を Protein Gカラム（アマシャムフアルマシア）により精製した。

[0051] 8) MAbのクラス、サブクラス及びタイプ

MAbのクラス及びサブクラスについては、 Monoclonal mouse immuno CNobulin isotyping kit (Pharmingen)により、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM、 IgA、 IgL ( « )及び し（ ）を決定した。

[0052] 9) MAbのピオチン化 精製した MAbについて、サンドイッチ ELISAに供試するため、それぞれピオチン 化処理を行った。 50mMの炭酸緩衝液 (pH8. 5)を用いて 20mg/mlとなるよう調 製し、 DMSOに 3mgZlOO 1で溶解した NHS-ピオチン溶液を 1加え、撹拌 後、氷冷しながら 2時間静置した。その後、 20mgZmlとなるように PBSで置換した。

[0053] 1-2 結果

1) MAbの選択

乳の主要アレルゲンである a siカゼイン（ α CN)を特異的に認識する 6種類の MA bが得られた。これら 6種類の MAbにおける、それぞれ固相とした各抗原 N— a CN D— a CN N— CN、又は D— CNに対する特異性をダイレクト ELISAにより調べた。 また、これら MAbのクラス、サブクラスについても調べた。結果を表 1に示す。表 1中、 +は各固相抗原に対し陽性であることを、—は陰性であることを示す。表 1に示される ように、全ての状態の抗原に結合する MAbである PaslCNl PaslCN2 PaslCN 3を選択した。

[0054] [表 1]

[0055] 2)サンドイッチ ELISAにおける組合せ条件

ダイレクト ELISAで選択した PaslCNl PaslCN2 PaslCN3を用いて、全て の MAbの組合わせについてサンドイッチ ELISAを行った。 PaslCNl PaslCN2 PaslCN3をそれぞれ固相あるいはピオチン化抗体として、 a CNあるいは CNを検 出するための MAbの組合せを、サンドイッチ ELISAにより選出した。その結果、 N— a CN D— a CN N— CN D— CNを検出できる組合せとして PaslCNl (FERM ABP— 10263)と PaslCN2 (FERM ABP— 10264)を選択した。結果を図 1に示 す。

2. PaslCNlと PaslCN2の認識するェピトープ

α siカゼイン溶液を、リシルエンドプロテアーゼで分解し、分解物をトリシン SDS— P AGE (分離ゲル 16. 5%、濃縮ゲル 5%)により分離した。分離したゲルを用いて、ェ レクトロブロッテイングにより PVDF膜に転写した。転写した PVDF膜に PaslCNlと P aslCN2の培養上清（1Z1000)を反応させたのち、発色させて、認識するェピトー プを確認した。結果を図 2に示す。その結果、認識部位は PaslCNlと Pas 1CN2とも に、分子量約 7000、配列番号 1で示される a s 1カゼインのアミノ酸配列の 132番目 力も 193番目までの領域を認識した。

[0056] 3.サンドイッチ ELISAによる食品中の変性および未変性カゼインの検出

上記 1.で選択された PaslCNlと PaslCN2の組合せにより、実際の食品中の力 ゼインを検出できるかを試みた。

[0057] 3-1 材料及び方法

1)モデル食肉製品の作製

定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表 2に示す配合にて各濃 度のカゼインナトリウムを含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より 脂、スジを除去し、 5mmで挽肉にしたものを使用した。

[0058] [表 2]

肉 品の

各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充 填を行い、 75°Cで 30分の加熱を行った。

2)サンドイッチ ELISAによる定量分析

各モデル食肉製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サン プルとした。サンプルを 2gを量り取り、 1M尿素および 0. 1% 2—メルカプトエタノー ルを含む PBSTを 38gカロえ 100°C、一時間加熱処理を行った。冷却後、 3, OOOrpm X 20分の遠心分離を行い、上清 0. 5ml〖こ PBSTを 9. 5ml加え、 ELISA用サンプル とした。検量線には同様に尿素 · 2—メルカプトエタノール処理を行ったカゼインナトリ ゥムの段階希釈を用いた。また、分析用サンプル力も PBSTを用いて抽出し、 PBST (PBSにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを 0. 5%加え

たもの）に溶解したカゼインナトリウムを検量線とした尿素および 2—メルカプトエタノー ルを用いな 、場合との比較を行った。

[0060] 3-2 結果

サンドイッチ ELISAによるモデル食肉製品中のカゼインナトリウムの分析について 、尿素および 2—メルカプトエタノールを用いた結果を表 3に、また、 PBSTのみで抽 出した結果を表 4に示す。

[0061] [表 3]

* ι ： ( ^折 ffiz添加. χ ι α ο

：検出せず

[0062] [表 4]

：

：†i¾出せす-

[0063] 以上の結果から、尿素および 2—メルカプトエタノールを抽出液に加えた場合に、 高い回収率でモデル食肉製品中のカゼインナトリウムを検出可能であり、 PBST抽出 では非常に低い回収率となった。これらのことから、食品中力ものカゼインナトリウム の抽出には尿素および 2—メルカプトエタノールを用いることが有効であり、その場合 に利用する MAbの特性には、尿素可溶ィ匕カゼインに結合可能であることが必要であ ることが明ら力となった。

[0064] 4.ィムノクロマトによる変性および未変性カゼインナトリウムの検出 44 -- 11材材料料おおよよびび方方法法

11))金金ココロロイイドド標標識識おおよよびびココンンジジュュゲゲーートトパパッッドドのの作作製製

22mmMMホホウウ酸酸緩緩衝衝液液 ((ppHH99.. 00))でで llmmgg//mmllととななるるよよううにに PPaassllCCNNllのの MMAAbb溶溶液液をを調調 製製ししたた。。ああららかかじじめめ 00.. 22MM炭炭酸酸カカリリウウムム溶溶液液でで ppHH99.. 00にに調調製製ししたた金金ココロロイイドド溶溶液液 ((シシ ダダママ社社製製）） 55mmllにに MMAAbb溶溶液液をを 550000 11カカ卩卩ええ、、室室温温でで 3300分分間間反反応応ししたた後後、、 1100%%BBSSAA 溶溶液液をを 662255 11ををカカ卩卩ええ、、ささららにに 1155分分間間反反応応ささせせたた。。遠遠心心分分離離をを行行いい、、 11%%BBSSAA溶溶液液でで OODD552255 == ll.. 00ににななるるよようう調調製製ししたた。。ガガララススウウーールル製製ココンンジジュュゲゲーートトパパッッドドにに 6688 11//cc mm22ととななるるよようう塗塗布布しし、、乾乾燥燥ささせせたた。。

[0065] 22))抗抗体体固固定定化化メメンンブブレレンンのの作作製製

PPBBSSでで 44mmgg//mmllととななるるよようう PPaassllCCNN22のの MMAAbb溶溶液液をを調調製製しし、、ニニトトロロセセルルロローーススメメンン ブブレレンンにに直直線線状状にに塗塗布布しし乾乾燥燥ささせせたた。。そそのの後後、、 11%%BBSSAA、、 00.. ll%%TTwweeeenn2200をを含含むむ PP BBSSでで 3377°°CC、、 22時時間間ブブロロッッキキンンググ後後、、 PPBBSSでで洗洗浄浄しし乾乾燥燥ささせせたた。。

[0066] 33))ィィムムノノククロロママトトスストトリリッッププのの組組立立とと評評価価

上上記記でで作作製製ししたたササンンププルルパパッッドド、、ココンンジジュュゲゲーートトパパッッドド、、抗抗体体固固定定化化メメンンブブレレンン、、吸吸収収 パパッッドドををそそれれぞぞれれ貼貼りり付付けけ、、ィィムムノノククロロママトトスストトリリッッププととししたた。。被被検検液液ととししててはは、、上上記記調調製製 ししたたモモデデルル食食肉肉製製品品をを適適宜宜希希釈釈ししてて用用いいたた。。

[0067] 44--22 結結果果

PPaassllCCNN22おおよよびび金金ココロロイイドド標標識識 PPaassllCCNNllのの組組合合せせにによよりりカカゼゼイインンナナトトリリウウムムはは加加 熱熱、、非非加加熱熱にに係係わわららずず 5500ppppbb ((食食品品中中 22ppppmm))ままでで検検出出すするるここととががででききたた。。ここのの結結果果かか らら、、製製造造工工程程中中にに混混入入ししたた未未変変性性カカゼゼイインンナナトトリリウウムムがが対対象象ととななっっててもも、、加加熱熱後後のの製製 品品がが対対象象ととななっっててもも、、いいかかななるる場場合合ににででもも対対応応ででききるるィィムムノノククロロママトトスストトリリッッププのの設設計計がが 可可能能ととななっったた。。

[0068] 市市販販ののアアレレルルゲゲンン検検出出用用ィィムムノノククロロママトトスストトリリッッププでではは、、ブブラランンククととししてて 00.. 0011MMのの尿尿素素 ののみみをを含含むむ PPBBSSをを滴滴下下ししたたととこころろ、、非非特特異異的的ななババンンドドがが生生じじててししままいい、、擬擬陽陽性性ととななつつ ててししままっったた。。ここれれでではは、、加加熱熱ななどどにによよりり変変性性ししたた食食品品たたんんぱぱくく中中力力もも効効率率よよくくアアレレルルゲゲ ンンをを抽抽出出すするるたためめののたたんんぱぱくく質質変変性性剤剤をを使使用用ででききずず、、アアレレルルゲゲンンととししてて検検出出ででききるる対対 象象がが極極めめてて狭狭いい範範囲囲にに限限らられれててししままうう危危険険性性がが考考ええらられれたた。。

[0069] * 5-1 材料及び方法

1) βラクトグロブリン (以下「 j8 LGj t 、うことがある）の調製

新鮮な牛乳より Zittle (1959)に従い、ホエーの粗画分を得た。この粗画分をさらに T SK gel DEAE 650S (TOSOH)を用いて、 50mMのトリス— HCl緩衝液（pH6. 5)、 NaClのリニアグラジェント（0から 0. 4M)により精製を行った。精製した /3 LG画分を 蒸留水による透析後、凍結乾燥を行い、未変性 |8 LG (以下「N - j8 LG」ということが ある）とした。この N— j8 LGを 10mg量り、 1. 4Mのトリス HC1緩衝液（pH8. 6) 1ml, 5%の EDTA100 1、尿素 1. 2g、 2—メルカプトエタノール 33 1を加え 2. 5mlに定 容した後、窒素ガス置換を行い、 37°C、 1時間の還元処理を行い、さらに、 1Mの Na OH300 1に溶解した 89mgのモノョード酢酸をカ卩ぇ窒素ガス置換した後、室温で 1 時間のカルボキシメチル化を行 、、還元カルボキシメチル化 β LG (以下「R— β LGJ ということがある）とした。生理食塩水でこれらの凍結乾燥物の 0. 1%溶液を調製し、 lml容エツペンドルフチューブに 500 μ 1ずつ分注し、免疫に供するまで 20°Cで凍 結保管し、抗原溶液とした。

[0070] 2)免疫

供試動物として、 5週齢の BALBZcマウス（日本クレア株式会社製） 5尾を用いた。 初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco)を 0. l%(DN- β L·GXltR- β L·G 力 00 μ 1入ったエツペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて 攪拌して作製したェマルジヨンを供試した。このェマルジヨンを 1尾当たり 150 1腹腔 内に注射した。また、追加免疫は、 2週間の間隔で 3回行った。免疫には、不完全フ ロイントアジュバント（Difco)を 0. 1%のN— β LG又は R— β LG力 00 μ 1入ったエツ ペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したェ マルジヨンを供試した。このェマルジヨンを 1尾当たり 150 1腹腔内に注射した。

[0071] 3)血中抗体価の測定

初回あるいは追加免疫で Ν— 18 LG又は R— 18 LGを注射した 1週間後に、各 BALB Zcマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に 2時間放置後、遠心 分離を行い、血清を得た。これらの血清の 10倍希釈段を作製し、非競合法 ELISA によりマウス血中の抗 N— j8 LG抗体価及び抗 R— j8 LG抗体価を調べた。なお、二次 抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウス IgG (H + L)抗体 (Jackson

ImmunoReserch Laboratories Inc.製)を用 ヽた。

[0072] 4)ハイプリドーマの作製

ノ、イブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（1975)に従った。すなわち 、十分に抗体価が上がったマウスに、 0. 1%の N— β LG溶液又は R— β LG溶液 100 1を尾部静脈より注射した。静脈注射力も 4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出し た。脾臓を細切後、 RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。 1, OOOrpm X 10分の遠心 分離により脾臓細胞を集め、再度 RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この 脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が 10： 1に なるように混合し、再度 1, OOOrpmX 10分の遠心分離を行い、ペレットを得た。この ペレットに平均分子量 3, 350の 45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行 つた。細胞溶液に RPMI 1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレツ トに、ハイプリドーマ用培地（10%牛胎児血清、 40mMの 2—メルカプトエタノール、 1 00U/mlのペニシリン、 100mg/mlのストレプトマイシンを含む RPMI1640培地） に 100 μ Μのヒポキサンチン、 0. 4 Μのアミノプテリン、 16 μ Μのチミジンを含む Η AT選択培地を加え、 5 X 10⁶cells/wellとなるように 24ゥエルの細胞培養用プレート（ Becton Dickinson)に分注し、 5%CO下 37°Cで培養した。

2

[0073] 5)限界希釈法によるクローユング

細胞培養用プレートの各ゥエルの培養上清にっ 、て、 ELISAの一次抗体として供 試し、抗 N— β LG抗体又は抗 R— β LG抗体を産生して 、るハイブリドーマの存在を 調べた。 ELISAにより N— β LG又は R— β LGに対して陽性を示したゥエルのハイブリ ドーマについて、 0. 9cell/wellとなるように 96ゥエルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクローユングを行った。なお、フィーダ一細胞と して、 4週齢 BALBZcマウス胸腺細胞を 5 X 10⁶cells/wellとなるように 96ゥエル細胞 培養用プレートの各ゥエルにカ卩えた。クローユングされたノヽイブリドーマの培養には、 10%牛胎児血清、 40mMの 2—メルカプトエタノール、 lOOUZmlのペニシリン、 10 0 μ gZmlのストレプトマイシンを含む RPMI 1640培地を用いた。 [0074] 6)抗体のスクリーニング

モノクローナル抗体のスクリーニングは、 N— β LG、 R— β LG及び尿素処理 β LG ( 以下「D— β LGj t 、う）の 3種類のたんぱく質に対する反応性の違 、を調べることで 特異性の異なるクローンを得ることとした。 D—|8 LGは、 N— |8 LGを lmg量り、 6. Og の尿素、 0. 2mlの 2—メルカプトエタノール、 1mlの 50mMトリスー塩酸緩衝液（pH8. 6)、 1. 5mlの蒸留水をカ卩え、アルミフオイルで蓋をした後、 100°Cで 1時間オイルバ スで加熱、変性処理を行った。培養上清の N— β LG、 R— β LGあるいは D— β LGに 対する反応性を非競合法 ELISAにて調べた。

[0075] 7)腹水の採取及び MAbの精製

Jonesら（1990)に従い、まず、 BALBZcマウスに不完全フロイントアジュバントを 0 . 2ml腹腔内に注射した。 1週間後、一尾当たり 5 X 10⁶cellsのクローユングされたハ イブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水 を Protein Gカラム（アマシャムフアルマシア）により精製した。

[0076] 8) MAbのクラス、サブクラス及びタイプ

抗 N— β LGMAb又は抗 R— β LGMAbの特性を決定するために、固相法を用いた 。固相法として、 N— j8 LG、 R— j8 LG又は D— j8 LGをあら力じめ細胞培養用プレート のゥエル内に固定し、この固定化された抗原に抗 N— j8 LGMAb又は抗 R— j8 LGM Abを作用させる方法を用いた。 MAbのクラス及びサブクラスについては、

Monoclonal mouse immuno し Nobulin isotyping kit (Pharmingen)【こより、 IgG丄、 Ig G2aゝ IgG2bゝ IgG3、 IgM、 IgA、 IgL ( κ )及び IgL ( y )を決定した。

[0077] 9) MAbのビォチン化

精製した MAbについて、サンドイッチ ELISAに供試するため、それぞれピオチン 化処理を行った。 50mMの炭酸緩衝液 (pH8. 5)を用いて 20mg/mlとなるよう調 製し、 DMSOに 3mgZl00 1で溶解した NHS-ピオチン溶液を 1加え、撹拌 後、氷冷しながら 2時間静置した。その後、 20mgZmlとなるように PBSで置換した。

[0078] 5-2 結果

1)抗 N— β LGMAbと抗 R— β LGMAbの特性とクラス、サブクラス

N— 18 LGに対する特異性を持つ MAb 13種類を得た。それぞれ固相の抗原に対す る特異性を表 5に示した。

[0079] [表 5]

[0080] 2)サンドイッチ ELISAにおける組合せ条件

固相の抗原に対し陽性反応を示した各 MAbをそれぞれ固相あるいはピオチン化 抗体として、 N— i3 LG及び D— i3 LGを検出するための MAbの組合せを、サンドイツ チ ELISAにおける検出感度の点から選出した。その結果、 N— i3 LG及び D— i3 LG を検出できる組合せとして、プレート固定ィ匕抗体 PLG2 (FERM ABP— 10282)と、 ピオチン化抗体 PLG1 (FERM ABP—10281)又は PLG3 (FERM ABP— 1028 3)を選択した。 PLG2と PLG1のサンドイッチ ELISAによる N— LG及び D— LG に対する反応性の結果を図 3に示す。また、 PLG2と PLG3のサンドイッチ ELISAに よる N— β LG及び D— β LGに対する反応性を図 4に示す。

[0081] 3) MAb混合系での N— β LG、 D— j3 LGの検出

サンドイッチ ELISAにより選択した組合せ（固相に PLG2、ビォチンィ匕に PLG1お よび PLG3)を用い、 N— |8 LGと D— |8 LGの検出感度を確認したところ、図 5及び図 6 に示すように、 MAb混合系で N— i3 LG、 D— i3 LGともに MAb混合系の方が吸光値 は高ぐ検出感度を上げることが可能であることが明ら力となった。 [0082] 6.サンドイッチ ELISAによる食品中のホエータンパク質の検出

上記 1.で選択された PLG2と PLG1、及び PLG2と PLG3の組合せにより、実際の 食品中のホエータンパク質質を検出できるかを試みた。

[0083] 6-1 材料及び方法

1)モデル食肉製品の作製

定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表 6に示す配合にて各濃 度のホエータンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より 脂、スジを除去し、 5mmで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量 し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、 75°Cで 30分の加 熱を行った。

[0084] [表 6]

[0085] 2)サンドイッチ ELISAによる定量分析

各モデル食肉製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サン プルとした。サンプル lgを量り取り、 10M尿素および 0. 1%の 2—メルカプトエタノー ルを含む PBST(PBSにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを 0. 5%加えた もの）を 19gカ卩え、ホモジナイザーにて 30秒攪拌した。その後、 100°Cで 1時間加熱 処理を行った。冷却後、 3, 000rpmX 20分の遠心分離を行い、上清 0. 5mlに PBS Tを 9. 5mlカ卩え、 ELISA用サンプルとした。検量線には同様に 10M尿素及び 0. 1 %の 2—メルカプトエタノール処理を行ったホエータンパク質の段階希釈を用いた。ま た、分析用サンプル力も PBSTを用いて抽出し、 PBSTに溶解したホエータンパク質 を検量線とした尿素及び 2—メルカプトエタノールを用いな 、場合との比較を行った。

[0086] 6-2 結果

サンドイッチ ELISAによるモデル食肉製品中のホエータンパク質の分析について、 尿素および 2—メルカプトエタノールを用いて抽出したモデル食肉製品中のホエータ ンパク質の分析結果を表 7に、また、 PBSTのみで抽出したモデル食肉製品中のホ エータンパク質の分析結果を表 8に示す。

[0087] [表 7]

* 1： (分析値ノ添加量） X 100

*2： 検出せず

[0088] [表 8]

* 1： (分析値 Z添加量） X 100

*2： 検出せず

[0089] 以上の結果から、尿素および 2—メルカプトエタノールを抽出液に加えた場合に、 高 ヽ回収率でモデル食肉製品中のホエータンパク質を検出可能であり、 PBST抽出 では検出できな力つた。これらのことから、食品中からのホエータンパク質の抽出には 尿素および 2—メルカプトエタノールを用いることが有効であり、その場合に利用する MAbの特性には、尿素で変性させた j8 LGに結合可能であることが必要であること が明らかとなった。

[0090] 7.ィムノクロマトによる変性および未変性カゼインナトリウムの検出

7-1 材料および方法

1)金コロイド標識およびコンジュゲートパッドの作製

2mMホウ酸緩衝液 (pH9. 0)で lmg/mlとなるように PLG1及び PLG3の MAb 溶液を調製した。あらかじめ 0. 2M炭酸カリウム溶液で pH9. 0に調製した金コロイド 溶液 (シグマ社製） 5mlに MAb溶液を 500 1カロえ、室温で 30分間反応した後、 10 %BSA溶液 625 1を加え、さらに 15分間反応させた。遠心分離を行い、 1%BSA 溶液で OD525 = 2. 0〖こなるよう調製し、 1 : 1の割合で混合した。ガラスウール製コン ジュゲートパッドに 68 lZcm²となるよう塗布し、乾燥させた。

[0091] 2)抗体固定化メンブレンの作製

PBSで 4mg/mlとなるよう PLG2の MAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレ ンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、 1%BSAを含む 10mMリン酸バッファー（ pH7. 5)で 37°Cで 1時間ブロッキング後、 10mMリン酸バッファー（pH7. 5)で洗浄 し乾燥させた。

[0092] 3)ィムノクロマトストリップの組立と評価

上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収 ノ ッドをそれぞれ貼り付け、ィムノクロマトストリップとした。被検液としては、上記 2.で 調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。

[0093] 7-2 結果

メンブレン塗布 MAbである PLG2、および金コロイド標識 MAbである PLG1 +PL G3の組合せにより、ホエータンパク質は加熱、非加熱に係わらず 50ppb (食品中 2p pm)まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入したホエーたんぱ く質が対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応で きるィムノクロマトストリップの設計が可能となった。

[0094] 市販のアレルゲン検出用ィムノクロマトストリップでは、ブランクとして 0. 1M尿素、 0 . 2%2— MEを含む PBSを滴下したところ、非特異的なバンドが生じてしまい、擬陽 性となってしまった。これでは、加熱などにより変性した食品たんぱく中から効率よく アレルゲンを抽出するためのたんばく質変性剤を使用できず、アレルゲンとして検出 できる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。

実施例 2

[0095] 1.変性 Z未変性オボアルブミンに結合可能な MAbの確立

1-1 材料及び方法 1) -ヮトリオボアルブミン (以下「OA」と 、うことがある）の調製

新鮮な-ヮトリ卵より卵白のみを採取し、泡立てないように均質ィ匕後、等量の飽和硫 酸アンモ-ゥムをカ卩え、濾紙 No. 1 (アドバンテック東洋)で濾過した。そして、得られ たろ液に 0. 5Mの硫酸を添カ卩し pH4. 6に調整後、ー晚放置した。 8, 000rpmX 20 分の遠心分離により得られた沈殿を蒸留水に溶解し、同じ方法で再結晶化し、粗 O A画分を得た。粗 OAはさらに、 TSK gel DEAE 650S (Tosoh)を用いたイオン交換クロ マトグラフィにより精製した。移動相には 50mMイミダゾールー塩酸緩衝液 (pH6. 4) を用い、 NaClの 0力 0. 3Mのリニアグラジェントにより OAを分画し、透析による脱 塩後、凍結乾燥を行った。この凍結乾燥 OAを用い、生理食塩水で 0. 1%の OA溶 液を作製し、 1ml容エツペンドルフチューブに 500 1ずつ分注して抗原溶液とし、免 疫に供するまで 20°Cで凍結保管した。

[0096] 2)免疫

供試動物として、 6週齢の BALBZcマウス（日本クレア株式会社製) 4尾を用いた。 初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco)を 0. 1%の OAが 500 1入ったェ ッペンドルフチューブに等量カ卩え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したェマル ジョンを供試した。このェマルジヨンを 1尾当たり 150 1腹腔内に注射した。また、追 加免疫は、 3週間の間隔で 2回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（ Difco)を 0. 1%の OAが 500 1入ったエツペンドルフチューブに等量カ卩え、ボノレテツ タスミキサーにて攪拌して作製したェマルジヨンを供試した。このェマルジヨンを 1尾 当たり 150 1腹腔内に注射した。なお、抗変性 OAMAbを得る場合、最終免疫のみ に後述する還元カルボキシメチルイ匕 OAを用いた。

[0097] 3)血中抗体価の測定

初回あるいは追加免疫で OAを注射した 1週間後に、各 BALBZcマウスの尾部静 脈より採血を行った。採血した血液は室温に 2時間放置後、遠心分離を行い、血清を 得た。これらの血清の 10倍希釈段を作製し、非競合法 ELISAによりマウス血中の抗 OA抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウス Ig G (H + L) j W- (Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製)を用 ヽた。

[0098] 4)ハイプリドーマの作製 ノ、イブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（1975)に従った。すなわち 、十分に抗体価が上がったマウスに、 0. 1%ΟΑ溶液 100 1を尾部静脈より注射し た。静脈注射から 4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、 RPM 11640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を 通し、脾臓細胞懸濁液を得た。 1, OOOrpmX IO分の遠心分離により脾臓細胞を集 め、再度 RPMI 1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウス ミエローマ細胞（P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が 10 : 1になるように混合し、再度 1 , OOOrpm X IO分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量 3, 350の 45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液に RPMI1 640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイプリドーマ用培 地（10%牛胎児血清、 40mMの 2—メルカプトエタノール、 lOOUZmlのペニシリン、 lOOmgZmlのストレプトマイシンを含む RPMI1640培地）に 100 μ Μのヒポキサン チン、 0. 4 Μのアミノプテリン、 16 μ Μのチミジンを含む HAT選択培地をカ卩え、 5 X 10⁶cells/wellとなるように 24ゥエルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson)に分 注し、 5%CO下 37°Cで培養した。

2

[0099] 5)限界希釈法によるクローユング

細胞培養用プレートの各ゥエルの培養上清にっ 、て、 ELISAの一次抗体として供 試し、抗 OA抗体を産生しているハイプリドーマの存在を調べた。 ELISAにより OAに 対して陽性を示したゥエルのハイプリドーマについて、 0. 9 cell/wellとなるように 96ゥ エルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクローニン グを行った。なお、フィーダ一細胞として、 4週齢 BALBZcマウス胸腺細胞を 5 X 10⁶ cells/wellとなるように 96ゥエル細胞培養用プレートの各ゥエルに加えた。クローニン グされたハイプリドーマの培養には、 10%牛胎児血清、 40mMの 2—メルカプトエタノ ール、 100U/mlのペニシリン、 100g/mlのストレプトマイシンを含む RPMI1640 培地を用いた。

[0100] 6)抗体のスクリーニング

モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性 OA (以下「NOA」 t\、うことがある） あるいは還元カルボキシメチル化 OA (以下「RCMOA」と!、うことがある）に対する反 応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。 RCMOAは、精 製 OA (上記凍結乾燥物）を lOmg量り、 1. 4Mトリス-塩酸緩衝液 (pH⁸. 6) 1ml, 5 %( EDTA100 μ 1. 2gの尿素、 33 1の 2—メノレカプトエタノーノレをカ卩免 2. 5ml【こ 定容した後、窒素ガス置換を行い、 37°C、 1時間の還元処理を行った。さらに、 1M の NaOH300 /z 1に溶解した 89mgのモノョード酢酸をカ卩ぇ窒素ガス置換した後、室 温で 1時間のカルボキシメチル化を行い、 RCMOAとした。培養上清の NOAあるい は RCMOAに対する反応性を非競合法 ELISAにより調べた。

[0101] 7)腹水の採取及び MAbの精製

Jonesら（1990)に従い、まず、 BALBZcマウスに不完全フロイントアジュバントを 0 . 2ml腹腔内に注射した。 1週間後、一尾当たり 5 X 10⁶cellsのクローユングされたハ イブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水 を Protein Gカラム（アマシャムファノレマシア）により精製した。

[0102] 8) MAbの特性と MAbのクラス、サブクラス及びタイプ

抗 OAMAbの特性を決定するために、固相法と液相法を用いた。固相法として、 N OA又は RCMOAをあらかじめ細胞培養用プレートのゥエル内に固定し、この固定化 された抗原 (NO A又は RCMOA)に抗未変性 Z変性 OAMAbを作用させる方法を 用い、また、液相法として、ゥサギ抗 OAポリクローナル抗体をあら力じめ細胞培養用 プレートのゥエル内に固定し、このポリクローナル抗体に NOA又は RCMOAを結合 させた状態で、抗未変性 Z変性 OAMAbを作用させる方法を用いた。また、 MAbの クフス及びサブクフスにつ ヽて ίま、 Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit ( Pharmingen)により、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM、 IgA、 IgL ( κ )及び IgL ( γ )を決定した。

[0103] 9) MAbのピオチン化

精製した MAbについて、サンドイッチ ELISAに供試するため、それぞれピオチン 化処理を行った。 50mMの炭酸緩衝液 (pH8. 5)を用いて 20mg/mlとなるよう調 製し、 DMSOに 3mgZl00 1で溶解した NHS-ピオチン溶液を 1加え、撹拌 後、氷冷しながら 2時間静置した。その後、 20mgZmlとなるように PBSで置換した。

[0104] 1-2 結果 1)抗 OAMAbの特性とクラス、サブクラス

NOAに対する特異性を持つ MAb9種類、及び、 RCMOAに対する特異性を持つ MAblO種類を得た。それぞれ液相あるいは固相の抗原に対する特異性を表 9に示 した。

[0105] [表 9]

[0106]

[0107] 2)組合せ条件

NO Aを検出するための MAbあるいは RCMOAを検出するための MAbの組合せ は、サンドイッチ ELISAにおける検出感度の点力も選出した。その結果、 NOAでは 301B5と 316G1や 304E4 (PNOA1； FERM ABP-10265)と 306B2 (PNOA2 ； FERM ABP-10266)、 RCMOAでは 117F9と 119D11や 948G 11 (PDOA1； FERM ABP— 10275)と 962B8 (PDOA2 ; FERM ABP— 10276)を高い組合 せとして選択した。

以下の実施 ί列を、 301B5と 316G1/117F9と 119D11力ら、 304Ε4と 306Β2/9 48G11と 962Β8に書き変えた方力よ! /、のでしょう力、。 [0108] 2.サンドイッチ ELIS Aによる変性及び未変性抗原の検出

2-1 材料及び方法

NO A溶液は、精製 OAを PBSで lOOppb溶液となるように調製し、 3倍の希釈段を 作製した (希釈段 A)。一方、ガラス試験管に精製 OAを lmg量り、 6gの尿素、 0. 2m 1の 2 メルカプトエタノール、 1mlの 50mMトリスー塩酸緩衝液（pH8. 6)、 1. 5mlの 蒸留水を加え、アルミフオイルで蓋をした後、 100°Cで 1時間オイルバスで加熱、変 性処理を行った。冷却後、 100ml容メスフラスコに移し、 PBSで 100mlにメスアップし た。これをさらに PBSで 100倍希釈し、尿素変性 OA (以下「UDOA」という） lOOppb 溶液とした。さらに尿素濃度を 0. 01Mに保ちながら 3倍の希釈段を作製した (希釈 段 B)。また、？^0八100 1)溶液と1；00八100 1)溶液を等量ずっ混ぜ（?^0八及び UDOAは各 50ppb溶液となる）、尿素濃度を 0. 005Mに保ちながら 3倍の希釈段を 作製した (希釈段 C)。また、サンドイッチ ELISAに供試した条件を表 10に示す。コー ティング MAb濃度は単独の場合は 25 /z g/mlに、また混合した場合には各 12. 5 μ gZmlとし、合計で 25 μ gZmlとなるようにした。

[0109] [表 10]

[0110] 2-2 結果

図 7に示すように、未変性 OAを対象とした (試験 1)では 301B5単独と、 301B5と 1 19D11の混合の曲線はほとんど重なった力 lOppb以下のより希薄な状態において 301B5単独よりも 301B5と 119D11の混合の曲線では若干混合の方が吸光値は高 ぐ検出感度が上げられる可能性が考えられた。また、変性 OAを対象とした (試験 2) の UDOAでは、 301B5単独では吸光値が認められず、 301B5及び 316G1は UD OAに関与しないものと考えられた力 119D11単独と 301B5と 119D11の混合の 曲線では明らかに混合の方が吸光値は高ぐ MAbを混合することにより検出感度を 上げることができるものと考えられた（図 8)。これは未変性 Z変性 OAを対象とした（ 試験 3)でも認められ、 301B5単独よりも 301B5と 119D11の混合の方が明らかに吸 光値が高かった（図 9)。試験 1一 3のいずれの場合も、単独でコーティングされた抗 体濃度は 25gZmlであり、混合ではそれぞれ半分の濃度の 12. 5mgZmlであった ことから、 MAbの種類を増やす混合系を用いることで、抗体濃度が同じあるいは少な くても、より抗原の検出感度を上げることが可能であることが明らかとなった。

[0111] 3.ィムノクロマトによる変性及び未変性 OAの検出

3-1 材料及び方法

1)金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製

2mMホウ酸緩衝液（pH9. 0)で lmg/mlとなるように 119D11及び 316G1の M Ab単独あるいは混合溶液を調製した。あらかじめ 0. 2M炭酸カリウム溶液で pH9. 0 に調製した金コロイド溶液 (シグマ社製） 5mlに MAb溶液を 500 1加え、室温で 30 分間反応した後、 10%BSA溶液を 625 1をカ卩え、さらに 15分間反応させた。遠心 分離を行い、 1%BSA溶液で OD525 = l. 0になるよう調製した。ガラスウール製コ ンジュゲートパッド（日本ミリポア社製）に lZcm2となるよう塗布し、乾燥させた。

[0112] 2)抗体固定化メンブレンの作製

PBSで 4mg/mlとなるよう 117F9及び 301B5の MAb単独ある!/、は混合溶液を調 製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、 1%BSA、 0. l%Tween20を含む PBSで 37°C、 2時間ブロッキング後、 PBSで洗浄し乾燥さ せた。

[0113] 3)ィムノクロマトストリップの組立と評価

上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンにカ卩えて、被検液スポ ット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを 別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッ ドの順にそれぞれ貼り付け、ィムノクロマトストリップとした。被検液としては、上記 2. で調製した NO A並びに UDO Aを適宜希釈して用いた。

[0114] 3-2 結果 301B5及び金コロイド標識 316G1の組合せにより NOAは lOppbまで検出すること ができたが、 UDOAは lppmでも検出できなかった。一方、 117F9及び金コロイド標 識 119D11の組合せにより、 UDOAは lOppbまで検出することができた力 NOAは lppmでも検出できなかった。これに対して、 301B5及び 117F9の固定化抗体混合 物、並びに 316G1及び 119D11の金コロイド抗体混合物を用いたィムノクロマトストリ ップを作製した場合、変性 OAあるいは未変性 OAを lOppbまで検出可能であった。 この様に変性 OAに結合可能な MAbと未変性 OAに結合可能な MAbを組み合わせ ることにより、製造工程中に混入した未変性卵白が対象となっても、加熱後の製品が 対象となっても、 V、かなる場合にでも対応できるィムノクロマトストリップの設計が可能 となった。

[0115] 市販の卵アレルゲン検出用ィムノクロマトストリップでは、ブランクとして 0. 01Mの尿 素のみを含む PBSを滴下したところ、非特異的なバンドが生じてしまい、擬陽性とな つてしまった。これでは卵白アレルゲン検査において、熱などにより不溶ィ匕した卵白 アレルゲンを抽出するためのたんぱく質変性剤である尿素を使用できず、アレルゲン として検出できる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。

[0116] 4.変性 Z未変性オボムコイドに結合可能な MAbの確立

4-1 材料及び方法

1) -ヮトリオボムコイド (以下「OM」と 、う）の調製

新鮮な-ヮトリ卵より卵白のみを採取し、泡立てないように均質ィ匕後、等量の 0. 1M 酢酸緩衝液 (PH3. 8)と混合した。さら〖こ 0. 1M酢酸緩衝液に対し透析後、 8, OOOr pm X 20分遠心し、上精を回収した。さらに、 TSK gel DEAE 650S (Tosoh)を用いたィ オン交換クロマトグラフィにより精製した。移動相には 50mMイミダゾールー塩酸緩衝 液（pH6. 4)を用い、 NaClの 0から 0. 3Mのリニアグラジェントにより OMを分画し、 透析による脱塩後、凍結乾燥を行い、これを未変性 OM (以下「NOM」ということがあ る）とした。この精製 OMを lmg量り、 6gの尿素、 0. 2mlの 2—メルカプトエタノール、 1 mlの 50mMトリスー塩酸緩衝液（pH8. 6)、 1. 5mlの蒸留水をカ卩え、アルミフオイル で蓋をした後、 100°Cで 1時間オイルバスで加熱、変性処理を行い尿素変性 OM (以 下「DOM」ということがある）とした。生理食塩水でこれらの凍結乾燥物の 0. 1%溶液 を調製し、 1ml容エツペンドルフチューブに 500 1ずつ分注して抗原溶液とし、免疫 に供するまで 20°Cで凍結保管した。

[0117] 2)免疫

供試動物として、それぞれ 6週齢の BALBZcマウス（日本クレア株式会社製) 4尾 を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco)を 0. 1%の NOM又は DOMが 500 μ 1入ったエツペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサ 一にて攪拌して作製したェマルジヨンを供試した。このェマルジヨンを 1尾当たり 150 1腹腔内に注射した。また、追加免疫は、 3週間の間隔で 2回行った。免疫には、不 完全フロイントアジュバント（Difco)を 0. 1%の NOM又は DOMが 500 μ 1入ったエツ ペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したェ マルジヨンを供試した。このェマルジヨンを 1尾当たり 150 1腹腔内に注射した。

[0118] 3)血中抗体価の測定

初回あるいは追加免疫で ΝΟΜ又は DOMを注射した 1週間後に、各 BALBZcマ ウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に 2時間放置後、遠心分離 を行い、血清を得た。これらの血清の 10倍希釈段を作製し、非競合法 ELISAにより マウス血中の抗 OM抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ 標减抗マウス IgG (H + L)饥体 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. ) 用 いた。

[0119] 4)ハイブリドーマの作製

ノ、イブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（1975)に従った。すなわち 、十分に抗体価が上がったマウスに、 0. 1%ΝΟΜ溶液又は DOM溶液 100mlを尾 部静脈より注射した。静脈注射から 4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓 を細切後、 RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。 1, OOOrpm X 10分の遠心分離 により脾臓細胞を集め、再度 RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓 細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が 10： 1になる ように混合し、再度 1, OOOrpm X 10分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレ ットに平均分子量 3, 350の 45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。 細胞溶液に RPMI 1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、 ハイプリドーマ用培地（10%牛胎児血清、 40mMの 2—メルカプトエタノール、 100U Zmlのペニシリン、 lOOmgZmlのストレプトマイシンを含む RPMI1640培地）に 10 0 μ Μのヒポキサンチン、 0. 4 Μのアミノプテリン、 16 μ Μのチミジンを含む HAT選 択培地を加え、 5 X 10⁶cells/wellとなるように 24ゥエルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson)に分注し、 5%CO下 37°Cで培養した。

2

[0120] 5)限界希釈法によるクローユング

細胞培養用プレートの各ゥエルの培養上清にっ 、て、 ELISAの一次抗体として供 試し、抗 NOM抗体又は抗 DOM抗体を産生して 、るノ、イブリドーマの存在を調べた 。 ELISAにより NOM又は DOMに対して陽性を示したゥエルのハイプリドーマにつ いて、 0. 9cell/wellとなるように 96ゥエルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson) に移し、限界希釈法によるクローユングを行った。なお、フィーダ一細胞として、 4週 齢 BALBZcマウス胸腺細胞を 5 X 106cells/wellとなるように 96ゥヱル細胞培養用プ レートの各ゥエルに加えた。クローユングされたハイプリドーマの培養には、 10%牛胎 児血清、 40mMの 2—メルカプトエタノール、 100U/mlのペニシリン、 lOOgZmlの ストレプトマイシンを含む RPMI 1640培地を用 、た。

[0121] 6)腹水の採取及び MAbの精製

Jonesら（1990)に従い、まず、 BALBZcマウスに不完全フロイントアジュバントを 0 . 2ml腹腔内に注射した。 1週間後、一尾当たり 5 X 106cellsのクローユングされたハ イブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水 を Protein Gカラム（アマシャムファノレマシア）により精製した。

[0122] 7) MAbの特性と MAbのクラス、サブクラス及びタイプ

抗 NOMMAb及び抗 DOMMabの特性を決定するために、固相法と液相法を用 いた。固相法として、 NOM又は DOMをあらかじめ細胞培養用プレートのゥエル内に 固定し、この固定ィ匕された NOM又は DOMに MAbを作用させる方法を用い、また、 液相法として、ゥサギ抗オボムコイドポリクロナール抗体をあらカゝじめ細胞培養用プレ 一トのゥエル内に固定し、このポリクロナール抗体に NOM又は DOMを結合させた 状態で、 MAbを作用させる方法を用いた。また、 MAbのクラス及びサブクラスについ て【ま、 Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit (Pharmingen)により、 IgGl、 Ig G2aゝ IgG2bゝ IgG3、 IgM、 IgA、 IgL ( κ )及び IgL ( y )を決定した。

[0123] 8) MAbのピオチン化

精製した MAbについて、サンドイッチ ELISAに供試するため、それぞれピオチン 化処理を行った。 50mMの炭酸緩衝液 (pH8. 5)を用いて 20mg/mlとなるよう調 製し、 DMSOに SmgZlOO /z lで溶解した NHS-ピオチン溶液を 10mlカ卩え、撹拌後 、氷冷しながら 2時間静置した。その後、 20mg/mlとなるように PBSで置換した。

[0124] 4-2 結果

1)抗 NOMMAb及び抗 DOMMabの特性とクラス、サブクラス

NOMに対する特異性を持つ MAb 7種類、 DOMに対する特異性を持つ MAb 10 種類を得た。それぞれ液相あるいは固相の抗原に対する特異性を表 11に示した。

[0125] [表 11]

2)組合せ条件

NOMを検出するための MAbの組合せは、サンドイッチ ELISAにおける検出感度 の点から選出した。その結果、 47E5 (PNOMl ;FERM ABP— 10279)と 50A12 ( PNOM2 ;FERM ABP— 10280)とを高い組合せとして選択した。また、上記、 10 個のモノクローナル抗体を用いてサンドイッチ ELISAを行 、、最も感度の高!、628E l (PDOMl ;FERM ABP— 10277)と 648A9 (PDOM2 ;FERM ABP— 10278 )とを高 、組合せとして選択した。

[0127] 3)サンドイッチ ELISAによる各モノクローナル抗体と OMの反応性

PNOM1および PNOM2のサンドイッチ ELISAでは、未変性オボムコイドは検出 できたが、変性オボムコイドはまったく検出できな力つた（図 10)。また、 PDOM1およ び PNOM2のサンドイッチ ELISAでは、変性 OMを検出できた力 未変性 OMでは 10— lOOppbの間で、感度が低かった（図 11)。し力し、プレート抗体として PNOM2 及び PDOM2を用 、、ピオチン抗体として PNOM 1及び PDOM 1を用 、る各モノク ローナル抗体を組み合わせたサンドイッチ ELISAでは、特に未変性 OMの 10— 10 Oppbで検出感度の向上が認められた（図 12)。

5.ィムノクロマトによる OMを指標とした卵白の検出

[0128] 5-1 材料及び方法

1)金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製

2mMホウ酸緩衝液 (pH9. 0)で lmgZmlとなるように PNOM1の MAb溶液を調 製した。あらかじめ 0. 2M炭酸カリウム溶液で pH9. 0に調製した金コロイド溶液 (シ ダマ社製） 5mlに MAb溶液を 500 1カ卩え、室温で 30分間反応した後、 10%BSA 溶液を 625 1をカ卩え、さらに 15分間反応させた。遠心分離を行い、 1%BSA溶液で OD525 = l. 0になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（日本ミリポア 社製）に 68 μ lZcm2となるよう塗布し、乾燥させた。

[0129] 2)抗体固定化メンブレンの作製

PBSで 4mg/mlとなるよう PNOM2の MAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブ レンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、 1%BSA、 0. l%Tween20を含む PB Sで 37°C、 2時間ブロッキング後、 PBSで洗浄し乾燥させた。

[0130] 3)ィムノクロマトストリップの組立と評価

上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンにカ卩えて、被検液スポ ット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを 別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッ ドの順にそれぞれ貼り付け、ィムノクロマトストリップとした。被検液としては、凍結乾燥 卵白粉末の 0. 1%溶液をそれぞれ室温、 50°C、 75°C、 100°Cで 1時間処理したもの を適宜希釈して用いた。

[0131] 5-2 結果

PNOM1及び金コロイド標識 PNOM2の組み合わせにより、室温及び 50°Cで 1時 間処理した卵白溶液は lOppbまで検出できた。また、 75、 100°Cで 1時間処理した 卵白は、 lOOppbまで検出することができた。この結果から、 100°Cで 1時間に相当す る加熱処理をされた食品では、尿素の様な変性剤を用いなくても、この抗 OMMAb のィムノクロマトストリップを用いることで、卵白として lOOppbまでは、簡便な抽出によ り検出可能であった。し力し、 100°Cを越えた熱処理では OMのィムノクロマトでは検 出できないため、上記のように尿素による可溶ィ匕処理が必要であった。

[0132] 6.抗 OAMAbと抗 OMMAbとの併用効果

6-1 方法

上記の結果より、 PNOAl、 PDOA1及び PNOM1の固定化抗体混合物、並びに P NOA2、 PDOA2及び PNOM2の金コロイド抗体混合物を用いたィムノクロマトストリ ップを上記のように作製し、卵白の検出を試みた。

[0133] 6-2 結果

PNOA1と PNOA2、 PDOA1と PDOA2および PNOM 1と PNOM2の組み合わ せは、それぞれ上記に示したように目的の変性 Z未変性ォ OAあるいは OMをそれ ぞれの感度で検出することが可能であった。このことから、加工食品の製造過程にお V、て未加熱状態の場合には未変性 OA及び OMに対する MAbが反応し、 50から 10 0°Cの場合には、未変性 Z変性 OA、及び OMに対する MAbが反応、それ以上の場 合には尿素による可溶ィヒ処理により変性 OAが反応する卵白の検出方法を開発する ことができた。

実施例 3

[0134] 1.変性 Z未変性小麦グリアジンに結合可能な MAbの確立

1-1 材料及び方法

1)小麦グリアジン (以下「GL」 、う）の調製 小麦粉に 2倍量の n—ブタノールを加え脱脂を行い、一晩風乾した。得られた脱脂 小麦粉に 0. 1%塩ィ匕ナトリウム溶液を 2倍量カ卩え、 10, 000rpm X 15分遠心分離し た。得られた沈殿に 20倍量の 0. 01N酢酸をカ卩え、撹拌後、 10, 000rpm X 15分遠 心分離した。得られた上清を蒸留水で透析し、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾 燥物に 70%となるようにエタノールをカ卩え、 10, 000rpmX 15分遠心分離した。得ら れた上清を蒸留水で透析し、粗 GL画分を得た。粗 GL画分はさらに、 Sephacryl S-200HR(Amersham Biosciences)を用いたゲルろ過により精製した。移動相には 0. 1N酢酸を用いて GLを分画し、蒸留水に透析後、凍結乾燥を行った。生理食塩水で この凍結乾燥物の 0. 1%溶液を調製し、 1ml容エツペンドルフチューブに 500 1ず つ分注し、免疫に供するまで 20°Cで凍結保管し、抗原溶液とした。

[0135] 2)免疫

供試動物として、 5週齢の BALBZcマウス（日本クレア株式会社製） 5尾を用いた。 初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco)を 0. 1%の GLが 500 1入ったェ ッペンドルフチューブに等量カ卩え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したェマル ジョンを供試した。このェマルジヨンを 1尾当たり 150 1腹腔内に注射した。また、追 加免疫は、 3週間の間隔で 2回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（ Difco)を 0. 1%の GLが 500 1入ったエツペンドルフチューブに等量カ卩え、ボノレテツ タスミキサーにて攪拌して作製したェマルジヨンを供試した。このェマルジヨンを 1尾 当たり 150 μ 1腹腔内に注射した。

[0136] 3)血中抗体価の測定

初回あるいは追加免疫で GLを注射した 1週間後に、各 BALBZcマウスの尾部静 脈より採血を行った。採血した血液は室温に 2時間放置後、遠心分離を行い、血清を 得た。これらの血清の 10倍希釈段を作製し、非競合法 ELISAによりマウス血中の抗 GL抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウス IgG (H + L) ίηίΦ (jac son ImmunoReserch Laooratones Inc.製) 用 ヽた。

[0137] 4)ハイブリドーマの作製

ノ、イブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（1975)に従った。すなわち 、十分に抗体価が上がったマウスに、 0. 1%GL溶液 100 1を尾部静脈より注射した 。静脈注射力も 4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、 RPMI1 640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通 し、脾臓細胞懸濁液を得た。 1, OOOrpmX IO分の遠心分離により脾臓細胞を集め、 再度 RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエ ローマ細胞（P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が 10 : 1になるように混合し、再度 1, 0 OOrpm X IO分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量 3, 35 0の 45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液に RPMI164 0を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイプリドーマ用培地（ 10%牛胎児血清、 40mMの 2—メルカプトエタノール、 lOOUZmlのペニシリン、 10 OmgZmlのストレプトマイシンを含む RPMI 1640培地）〖こ 100 μ Μのヒポキサンチン 、 0. 4 Μのアミノプテリン、 16 μ Μのチミジンを含む HAT選択培地をカ卩え、 5 X 10 6cells/wellとなるように 24ゥエルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson)に分注し、 5%CO下 37°Cで培養した。

2

[0138] 5)限界希釈法によるクローユング

細胞培養用プレートの各ゥエルの培養上清にっ 、て、 ELISAの一次抗体として供 試し、抗 GL抗体を産生しているハイプリドーマの存在を調べた。 ELISAにより GLに 対して陽性を示したゥエルのハイプリドーマについて、 0. 9 cell/wellとなるように 96ゥ エルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクローニン グを行った。なお、フィーダ一細胞として、 4週齢 BALBZcマウス胸腺細胞を 5 X 10⁶ cells/wellとなるように 96ゥエル細胞培養用プレートの各ゥエルに加えた。クローニン グされたハイプリドーマの培養には、 10%牛胎児血清、 40mMの 2—メルカプトエタノ ール、 100U/mlのペニシリン、 100 /z g/mlのストレプトマイシンを含む RPMI164 0培地を用いた。

[0139] 6)抗体のスクリーニング

モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性 GL (以下「NGL」 t\、う）ある ヽは還 元カルボキシメチル化 GL (以下「RCMGL」 t 、う）、 0. 1M酢酸可溶化 GL (以下「A GLj t 、う）、 70%エタノール可溶ィ匕 GL (以下「EGL」 t 、う）、変性剤で可溶化した GL (以下「DGL」 t 、う）に対する反応性の違 、を調べることで特異性の異なるクロー ンを得ることとした。 RCMGLは、精製 GLを lOmg量り、 1. 4Mトリス—塩酸緩衝液 (p H8. 6) 1ml, 5%EDTA100 μ 1. 2g尿素、 33 1の 2—メノレカプトエタノーノレをカロ え 2. 5mlに定容した後、窒素ガス置換を行い、 37°C、 1時間の還元処理を行った。 さらに、 1Mの NaOH300 μ 1に溶解した 89mgのモノョード酢酸をカ卩ぇ窒素ガス置換 した後、室温で 1時間のカルボキシメチル化を行い、 RCMGLとした。培養上清の N GL、 RCMGL, AGL、 EGL及び DGLに対する反応性を非競合法 ELISAにより調 ベた。

[0140] 7)腹水の採取及び MAbの精製

Jonesら（1990)に従い、まず、 BALBZcマウスに不完全フロイントアジュバントを 0 . 2ml腹腔内に注射した。 1週間後、一尾当たり 5 X 106cellsのクローユングされたハ イブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水 を Protein Gカラム（アマシャムファノレマシア）により精製した。

[0141] 8) MAbのクラス、サブクラス及びタイプ

MAbのクラス及びサブクラスについては、 Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit (Pharmingen)により、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM、 IgA、 IgL ( « )及び し（ ）を決定した。

[0142] 9) MAbのピオチン化

精製した MAbについて、サンドイッチ ELISAに供試するため、それぞれピオチン 化処理を行った。 50mMの炭酸緩衝液 (pH8. 5)を用いて 20mg/mlとなるよう調 製し、 DMSOに 3mgZl00 1で溶解した NHS-ピオチン溶液を 1加え、撹拌 後、氷冷しながら 2時間静置した。その後、 20mgZmlとなるように PBSで置換した。

[0143] 2-2 結果

1) MAbの選択

小麦の主要アレルゲンであるグリアジン（GL)は、水に不溶性で、酢酸やエタノール に溶けるタンパク質である。そこで、 PBSに溶かした GL (NGL)、還元カルボキシメチ ル化 GL (RCMGL)、 0. 1M酢酸可溶化 GL (AGL)、 70%エタノール可溶化 GL (E GL)、変性剤で可溶ィ匕した GL (DGL)を調製し、どの状態の GLに特異的に結合す る MAbであるかを検証した。抗 GLMAbの各状態の GLに対するダイレクト ELISAの 結果を表 12に示す。表 1に示されるように、全ての状態の GLに結合する MAbである PGL1 (FERM ABP-10267) PGL2 (FERM ABP-10268) PGL4 PGL7 を選択した。

[0144] [表 12]

[0145] 2)サンドイッチ ELISAにおける組合せ条件

ダイレクト ELISAで選択した PGL1 PGL2 PGL4 PGL7を用いて、全ての M Abの組合わせについてサンドイッチ ELISAを行った。グリアジンは NGL RCMGL AGL EGL DGLを用いた。その結果、いずれの状態の GLでも最も高く検出でき たのは、 PGL1と PGL2の組合わせであった。 PGL1と PGL2を用いたサンドイッチ E LIS Aの結果を図 13に示す。その他の組み合わせについてはサンドイッチ ELISAに て全ての GLを検出できない、または検出感度が極めて低力つた。以上の結果から、 食品に様々な状態で含まれる GLを検出する MAbとして、 PGL1と PGL2を選択した

[0146] 2. PGL1と PGL2の認識するェピトープの相違

ィムノブロッテイングで、各抗体が認識するェピトープを限定するため、 A— PAGEと エレクトロブロッテイングに続いてィムノブロッテイングを行った。まず、小麦グリアジン を Lafiandra,D.&Kasarda,D.D.に従 、A— PAGE (Cereal

Chemistry„62,314-319,1985)により分離した。分離したゲルを用いて、エレクトロブ口 ッティングにより PVDF膜に転写した。転写した PVDF膜に PGL1と PGL2の培養上 清（1Z1000)を反応させたのち、発色させて、認識するェピトープを確認した。その 結果、図 14に示されるように、 PGL1で認識されるタンパク質分解バンド力 SPGL2で は認識されなかった。このこと力ら、 PGL1と PGL2とは異なるェピトープを認識するこ とがわかった。

[0147] 3.ィムノクロマトによる変性及び未変性 GLの検出 3-1 材料及び方法

1)金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製

2mMホウ酸緩衝液 (pH9. 0)で lmg/mlとなるように PGL1 (又は PGL2)溶液を 調製した。あらかじめ 0. 2M炭酸カリウム溶液で pH9. 0に調製した金コロイド溶液（ シグマ社製） 5mlに MAb溶液を 500 1カロえ、室温で 30分間反応した後、 10%BSA 溶液を 625 1をカ卩え、さらに 15分間反応させた。遠心分離を行い、 1%BSA溶液で OD525 = l. 0になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（日本ミリポア 社製）に 68 μ lZcm2となるよう塗布し、乾燥させた。

[0148] 2)抗体固定化メンブレンの作製

PBSで 4mgZmlとなるよう PGL2 (又は PGL1)溶液を調製し、ニトロセルロースメン ブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、 1%BSA、 0. l%Tween20を含む P BSで 37°C、 2時間ブロッキング後、 PBSで洗浄し乾燥させた。

[0149] 3)ィムノクロマトストリップの組立と評価

上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンにカ卩えて、被検液スポ ット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを 別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッ ドの順にそれぞれ貼り付け、ィムノクロマトストリップとした。

[0150] 被検液としては、小麦粉に 20倍量の PBST(PBSにポリオキシエチレンソルビタン モノラウレートを 0. 5%加えたもの）を加え 4°Cで一晩撹拌し、遠心分離後に脱脂処 理した上清を回収し、透析後、凍結乾燥したものを小麦粉抽出物として調製した。調 製した小麦粉抽出物を用いて、未変性のもとして PBSで希釈したもの、変性のものと して変性剤で可溶ィ匕したものを用いた。

[0151] 3-2 結果

サンドイッチ ELISAにより様々な状態の GLを検出できたことから、より簡易な検出 方法としてィムノクロマトによる検出系を構築し、評価した。評価にあたっては、現在 市販されて 、るアレルゲン検出キットと同じ抗体を用いて 、る巿販 A及び巿販 Bと比 較した。結果を表 13に示す。なお、表 13中、「非特異反応」は、緩衝液のみを供した ときに陽性と判定されたとき「あり」とした。その結果、市販 Aでは、未変性小麦粉抽出 物は検出できたが、変性小麦粉抽出物は非特異反応が見られ判定できな力つた。ま た、市販 Bでは、未変性小麦粉抽出物では lppmでも検出できず、変性小麦粉抽出 物は非特異反応が見られ判定できな力つた。本発明のキットを用いる方法では、未 変性小麦粉抽出物、変性小麦粉抽出物のどちらも 50ppb程度まで検出することがで きた。また、変性小麦粉抽出物での非特異反応は見られな力つた。

[0152] [表 13]

小麦^油出物 （未変性）

[0153] 次に、実際の食品からのアレルゲン検出を想定して、市販の食パンを用いて評価し た。評価にあたっては、現在市販されているアレルゲン検出キットを用いる巿販 A及 び市販 Bと比較した。結果を表 14に示す。なお、表 14中、「非特異反応」は、緩衝液 のみを供したときに陽性と判定されたとき「あり」とした。食パンのたんぱく質は約 8% であるため、以下の濃度は 8%を全量抽出したと仮定した数字となる。評価した結果 、巿販 Aでは、未変性食パンを 4ppm以下の濃度では検出できず、変性食パンでは 非特異反応が見られ、判定できな力つた。巿販 Bでは、 4ppm程度は検出できたもの の、それ以外の濃度では検出できず、また変性食パンでは非特異反応が見られ、判 定できなかった。本発明のキットを用いる方法では、未変性食パン、変性食パンのど ちらも 40ppb程度の低濃度でも検出ができ、変性では非特異反応もなぐ検出できる ことがわかった。

[0154] [表 14]

ft.' ン （iStSiiたんばく 濃 IS換算)

4 IJppia 40 b ■iQppb 非特異反^

明方法 ϋ 〇 C △ なし

ϊ!ϊ¾Α X Q なし

MB Ο y. x ' なし

. 食パン （濃度はたんばく SJSS換算 1

棚 ppm 400[ipt

yj r c' O Λ なし

- ― 一 あり

- - - ！ あり 実施例 4

[0155] 1.抗 24kDaタンパク質 MAb及び抗 76kDaタンパク質 MAbの確立

1-1 材料及び方法

1)そば 24kDaタンパク質 MAb及び抗 76kDaタンパク質の調製

市販そば粉に 5倍量の精製水を加え、攪拌後 12000rpmで遠心分離を行い沈殿 を得た。得られた沈殿に 1M塩ィ匕ナトリウムを 5倍量加え、攪拌後 12000rpmで遠心 分離を行い、上清を得た。上清を透析により脱塩し、凍結乾燥を行って得られた画分 をそば粗タンパク質画分とした。このそば粗タンパク質画分をさらにプレップセル 960 (BioRad)を用いて精製を行った。 24kDaタンパク質の精製は、そば粗タンパク質画 分を 2. 0%SDSと 5%2 メルカプトエタノールが含まれるサンプルバッファーに溶解 後、 95°Cで 4分間加熱したものをサンプルとして供試し、アクリルアミド 12%分離ゲル を用いたプレップセル 960にて分画し、 24kDaタンパク質を得た。 76kDaタンパク質 の精製は、そば粗タンパク質画分を 2. 0%SDS力 S含まれ、 2—メルカプトエタノールが 含まれな 、サンプルバッファーに溶解したものをサンプルとして供試し、アクリルアミド 12%分離ゲルを用いたプレップセル 960にて分画し、 76kDaタンパク質を得た。得 られた各画分は透析後、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥を用い、生理食塩水 で 0. 1%の 24kDaタンパク質溶液及び 0. 1%の 76kDaタンパク質溶液それぞれを 作製し、 1ml容エツペンドルフチューブに 500 1ずつ分注して抗原溶液とし、免疫に 供するまで 20°Cで凍結保管した。

[0156] 2)免疫

供試動物として、 5週齢の BALBZcマウス（日本クレア株式会社製） 5尾を用いた。 初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco)を 0. 1%の 24kDaタンパク質溶液 及び 0. 1%の 76kDaタンパク質溶液がそれぞれ 500 μ 1入ったエツペンドルフチュー ブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したェマルジヨンを供試 した。このェマルジヨンを 1尾当たり 150 1腹腔内に注射した。また、追加免疫は、 3 週間の間隔で 2回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco)を 0. 1% の 24kDaタンパク質溶液及び 0. 1%の 76kDaタンパク質溶液がそれぞれ 500 μ 1入 つたエツペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作 製したェマルジヨンを供試した。このェマルジヨンを 1尾当たり 150 1腹腔内に注射し た。

[0157] 3)血中抗体価の測定

初回あるいは追加免疫で 24kDaタンパク質溶液又は 76kDaタンパク質溶液を注 射した 1週間後に、各 BALBZcマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液 は室温に 2時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の 10倍希釈段 を作製し、非競合法 ELISAによりマウス血中の抗 24kDaタンパク質抗体価及び抗 7 6kDaタンパク質抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標 减抗マウス IgG (H + L)饥体 (Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製) 用 ヽた

[0158] 4)ハイブリドーマの作製

ノ、イブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（1975)に従った。すなわち 、十分に抗体価が上がったマウスに、 0. 1%の 24kDaタンパク質溶液又は 0. 1%の 76kDaタンパク質溶液それぞれ 100 μ 1を尾部静脈より注射した。静脈注射から 4日 後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、 RPMI1640で洗浄して、滅 菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通し、脾臓細胞懸濁 液を得た。 1, OOOrpmX IO分の遠心分離により脾臓細胞^^め、再度 RPMI1640 で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（ P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が 10 : 1になるように混合し、再度 1, OOOrpmX IO 分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量 3, 350の 45%ポリ エチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液に RPMI 1640を加え希釈 後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイプリドーマ用培地（10%牛胎児 血清、 40mMの 2—メルカプトエタノール、 100U/mlのペニシリン、 100mg/mlの ストレプトマイシンを含む RPMI 1640培地）に 100 μ Μのヒポキサンチン、 0. 4 Μ のアミノプテリン、 16 μ Μのチミジンを含む HAT選択培地を加え、 5 X 10⁶cells/well となるように 24ゥエルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson)に分注し、 5%CO

2 下 37°Cで培養した。

[0159] 5)限界希釈法によるクローユング 細胞培養用プレートの各ゥエルの培養上清にっ 、て、 ELISAの一次抗体として供 試し、抗 24kDaタンパク質抗体又は 76kDaタンパク質抗体を産生して!/、るハイブリド 一マの存在を調べた。 ELISAにより 24kDaタンパク質又は 76kDaタンパク質に対し て陽性を示したゥエルのハイプリドーマについて、 0. 9 cell/wellとなるように 96ゥエル の細胞培養用プレート（Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクローユングを 行った。なお、フィーダ一細胞として、 4週齢 BALBZcマウス胸腺細胞を 5 X 10⁶ cells/wellとなるように 96ゥエル細胞培養用プレートの各ゥエルに加えた。クローニン グされたハイプリドーマの培養には、 10%牛胎児血清、 40mMの 2—メルカプトエタノ ール、 100U/mlのペニシリン、 100g/mlのストレプトマイシンを含む RPMI1640 培地を用いた。

[0160] 6)抗体のスクリーニング

モノクローナル抗体のスクリーニングは、 24kDaタンパク質、 76kDaタンパク質、 P BSで希釈したそば粗タンパク質 (以下「NBW」と ヽぅことがある）、ある ヽは変性剤に より可溶ィ匕したそば粗タンパク質 (以下「DBW」と 、うことがある）に対する反応性の違 いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。そば粗タンパク質は、そ ば粉に 20倍量の PBSTを加え 4°Cで一晩撹拌し、遠心分離後に脱脂処理した上清 を回収し、透析後、凍結乾燥したものをそば粉抽出物として調製した。変性剤による 可溶化は、そば粗タンパク質を 10mg量り、尿素 6g、 2—メルカプトエタノール 0. 2ml 、 50 mMの Tris—HCl緩衝液（pH8. 6) lml、蒸留水 1. 5mlを加え、アルミフォイ ルで蓋をした後、 100°Cで 1時間オイルバスで加熱、変性処理を行い、これを DBWと した。培養上清の 24kDaタンパク質、 76kDaタンパク質、 NBW、及び DBWに対す る反応性を非競合法 ELISAにて調べた。

[0161] 7)腹水の採取及び MAbの精製

Jonesら（1990)に従い、まず、 BALBZcマウスに不完全フロイントアジュバントを 0 . 2ml腹腔内に注射した。 1週間後、一尾当たり 5 X 10⁶cellsのクローユングされたハ イブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水 を Protein Gカラム（アマシャムファノレマシア）により精製した。

[0162] 8) MAbの特性と MAbのクラス、サブクラス及びタイプ 抗 24kDaタンパク質 MAb又は抗 76kDaタンパク質 MAbの特性を決定するために 、固相法を用いた。固相法として、 24kDaタンパク質、 76kDaタンパク質、 NBW又は DBWをあら力じめ細胞培養用プレートのゥエル内に固定し、この固定ィ匕された抗原 に抗 24kDaタンパク質 MAb又は 76kDaタンパク質 MAbを作用させる方法を用いた 。また、 MAbのクラス及びサブクラスについては、 Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit (Pharmingen)により、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM、 IgA、 IgL ( « )及び し（ ）を決定した。

[0163] 9) MAbのピオチン化

精製した MAbについて、サンドイッチ ELISAに供試するため、それぞれピオチン 化処理を行った。 50mMの炭酸緩衝液 (pH8. 5)を用いて 20mg/mlとなるよう調 製し、 DMSOに 3mgZl00 1で溶解した NHS-ピオチン溶液を 1加え、撹拌 後、氷冷しながら 2時間静置した。その後、 20mgZmlとなるように PBSで置換した。

[0164] 1-2 結果

1)抗 24kDaタンパク質 MAbと 76kDaタンパク質 MAbの特性とクラス、サブクラス

24kDaタンパク質に対する特異性を持つ MAb5種類、及び、 76kDaタンパク質に 対する特異性を持つ MAb4種類を得た。それぞれ固相の抗原に対する特異性を表 15及び表 16に示した。

[0165] [表 15]

[0166] [表 16] M A b名 7 6 k N B W D B W クラス、 サブクラ

D a スおよびタイプ

5 0 5 ( P B W + + + I g G 1 ( κ )

2 ) o

十 + + I g G 1 ( κ )

5 0 4 + + I g G 1 ( K )

5 1 2 十 + I g G 1 ( K )

5 0 1 + + 一 I g G 1 ( K )

[0167] 2)組合せ条件

固相の抗原に対し陽性反応を示した各 MAbをそれぞれ固相あるいはピオチン化 抗体として、 NBWおよび DBWを検出するための MAbの組合せを、サンドイッチ ELI SAにおける検出感度の点から選出した。その結果、 NBWを検出できる組合せとし て、プレート固定化抗体 PBW2 (FERM ABP— 10273)とピオチン化抗体 PBW3 ( FERM ABP— 10274)を、また、 DBWを検出できる組み合わせとして、プレート固 定化抗体 PBWl (FERM ABP-10272)とピオチン化抗体 PBW2を選択した。 PB W2および PBW3のサンドイッチ ELISAによる各種そば粗タンパク質に対する反応 性の結果を図 15に示す。また、 PBW1および PBW2のサンドイッチ ELISAによる各 種そば粗タンパク質に対する反応性を図 16に示す。

[0168] 3) MAb混合系でのNBW、DBWの検出

サンドイッチ ELISAにより選択した MAbを混合し、 NBW、 DBWの検出感度を確 認した。すなわち、 NBWでは、プレート固定ィ匕抗体を PBW2単独とした場合と、 PB W1および PBW2を混合した場合で、ピオチンィ匕 PBW3を二次抗体として比較した。 また、 DBWでは、高い検出感度であったプレート固定ィ匕抗体 PBW1、ピオチン化 P BW2の組み合わせと、 PBW1および PBW2を混合したプレート固定化抗体と、ピオ チンィ匕 PBW3を二次抗体とした場合を比較した。図 17及び図 18に示すように、 NB W、 DBWともにプレート抗体を混合した方が吸光値が高ぐ検出感度を上げることが 可能であることが明ら力となった。 [0169]

1 10 100

antigen concentrations(ppb)

[0170] 2.サンドイッチ ELISAによる食品中の NBW、 DBWの検出

上記 1.で選択された PBW1、 PBW2、 PBW3の組合せにより、実際の食品中の そば粗タンパク質を検出できるかを試みた。

[0171] 2-1 材料及び方法

1)モデル食肉製品の作製

定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表 17に示す配合にて各 濃度のそば粗タンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉 より脂、スジを除去し、 5mmで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計 量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、 75°Cで 30分の 加熱を行った。

[0172] [表 17]

[0173] 2)サンドイッチ ELISAによる定量分析

(モデル塩漬肉） 各モデル塩漬肉を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプ ルとした。サンプル lgを量り取り、 PBST19gをカ卩ぇホモジナイザーにて 30秒攪拌し た。 3, 000rpm X 20分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを 0. 5ml測り 取り、 PBSTを 9. 5ml加え、 ELISA用サンプルとした。検量線には同様に PBSTを 用いたそば粗タンパク質の段階希釈を用いた。

(モデル加熱製品）

各モデル加熱製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サン プルとした。サンプル lgを量り取り、 1%SDS 1% 2—メルカプトエタノールを含む PB S 19gをカ卩ぇホモジナイザーにて 30秒攪拌した。その後、 100°C1時間加熱処理を 行った。冷却後 3, 000rpmX 20分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを 0. 5ml測り取り PBSTを 9. 5mlカ卩え、 ELISA用サンプルとした。検量線には同様に SDS 2—メルカプトエタノール処理を行ったそば粗タンパク質の段階希釈を用いた。

[0174] 2-2 結果

サンドイッチ ELISAによるモデル食肉製品中のそば粗タンパク質の分析について 、モデル塩漬肉の結果を表 18に、また、モデル加熱製品の結果を表 19に示す。

[0175] [表 18]

* l ： (分析値 z添加量）

* 2 ：検出せず

[0176] [表 19]

[0177] * ！ ； (分析値/添加 ¾ ) X！ 0 0

* 2 ：検出せず [0178] 以上の結果から、モデル塩漬肉のように未加熱のそば粗タンパク質でも、モデル 加熱製品のような加熱変性したそば粗タンパク質でも、高い回収率でそば粗タンパク 質を検出可能であった。これらのことから、未変性そばタンパク質に結合可能な MAb と変性そばタンパク質に結合可能な MAbを組み合わせることにより、未加熱 (未変性 )、加熱 (変性)のいかなる状態のそばタンパク質でも、高感度で分析できることがわ かった。

[0179] 3.ィムノクロマトによる変性及び未変性そば粗タンパク質の検出

3-1 材料及び方法

1)金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製

2mMホウ酸緩衝液 (pH9. 0)で lmgZmlとなるように PBW3MAb溶液を調製し た。あらかじめ 0. 2M炭酸カリウム溶液で pH9. 0に調製した金コロイド溶液 (シグマ 社製） 5mlに MAb溶液を 500 1カ卩え、室温で 30分間反応した後、 10%BSA溶液 を 625 1を加え、さらに 15分間反応させた。遠心分離を行い、 1%BSA溶液で OD 525 = 1. 0になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（日本ミリポア社 製）に 68 μ lZcm2となるよう塗布し、乾燥させた。

[0180] 2)抗体固定化メンブレンの作製

PBSで 8mgZmlとなるよう PBW1と PBW2の MAb溶液を調製し、 1： 1の割合で混 合したものを-トロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、 1% スキムミルクを含む 10mMリン酸バッファー（pH7. 5)で 37°C、 1時間ブロッキング 後、 10mMリン酸バッファー（pH7. 5)で洗浄し乾燥させた。

[0181] 3)ィムノクロマトストリップの組立と評価

上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収 ノ ッドをそれぞれ貼り付け、ィムノクロマトストリップとした。非検液としては、上記 2.で 調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。

[0182] 3-2 結果

メンブレン塗布 MAb PBW1 + PBW2、および金コロイド標識 MAb PBW3の組 合せにより、そばタンパク質は加熱、非加熱に係わらず 50ppb (食品中 2ppm)まで 検出することができた。この結果から、製造工程中に混入したそばタンパクが対象と なっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるィムノクロ マトストリップの設計が可能となった。

[0183] 市販のアレルゲン検出用ィムノクロマトストリップでは、ブランクとして 0. 1M尿素 +

0. 2%2—メルカプトエタノールを含む PBSを滴下したところ、非特異的なバンドが生 じてしまい、擬陽性となってしまった。これでは、加熱などにより変性した食品タンパク 中力も効率よくアレルゲンを抽出するためのタンパク質変性剤を使用できず、アレル ゲンとして検出できる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。 実施例 5

[0184] 1.抗 Ara hlMAbの確立

1-1 材料及び方法

1) Am hiタンパク質の調製

巿販生落花生に 5倍量の 20mM bis- tris- propane buffer (pH7. 2)を加え、室温で 2時間攪拌後 3000 X gで遠心分離を行!ヽ沈殿および油分を除去した。得られた水 溶性画分を再度 10000 X gで遠心分離を行い上清を得た。上清をさらに Source Q (アマシャム フアルマシア）を用いて、 20mMの bis- tris- propane buffer (pH7. 2)、 NaClのリニアグラジェント（0— 1M)により精製を行った。精製した Am hi画分を蒸 留水による透析後、凍結乾燥を行い、未変性 Am hi (以下 NAhlと記す）とした。ま た、変性 Am hi (以下 DAhlと記す）は NAhlを 10mg量り、尿素 6g、 2 メルカプト エタノール（以下 2— MEと記す） 0. 2ml、 50mMの Tris— HC1緩衝液（pH 8. 6) lm

1、蒸留水 1. 5mlをカ卩え、アルミフオイルで蓋をした後、 100°Cで 1時間オイルバスで 加熱、変性処理を行った。その後透析し、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥を用 い、生理食塩水で 0. 1%の DAhl溶液及び 0. 1%の DAhl溶液それぞれを作製し

、 1ml容エツペンドルフチューブに 500 1ずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供する まで 20°Cで凍結保管した。

[0185] 2)免疫

供試動物として、 5週齢の BALBZcマウス（日本クレア株式会社製） 5尾を用いた。 初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco)を 0. 1%の NAhl溶液及び 0. 1 %の DAhl溶液がそれぞれ 500 μ 1入ったエツペンドルフチューブに等量ずつ加え、 ボノレテックスミキサーにて攪拌して作製したェマルジヨンを供試した。このエマノレジョ ンを 1尾当たり 150 /z l腹腔内に注射した。また、追加免疫は、 2週間の間隔で 3回行 つた。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco)を 0. 1 %の NAhl溶液及び 0. 1 %の DAhl溶液がそれぞれ 500 μ 1入ったエツペンドルフチューブに等量ずつ加え 、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したェマルジヨンを供試した。このェマルジョ ンを 1尾当たり 150 1腹腔内に注射した。

[0186] 3)血中抗体価の測定

初回あるいは追加免疫で NAhl溶液又は DAhl溶液を注射した 1週間後に、各 Β ALBZcマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に 2時間放置後、 遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の 10倍希釈段を作製し、非競合法 ELI SAによりマウス血中の抗 NAhl抗体価及び抗 DAhl抗体価を調べた。なお、二次 抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウス IgG (H + L)抗体 (Jackson

ImmunoReserch Laboratories Inc. ) 用 ヽた。

[0187] 4)ハイプリドーマの作製

ノ、イブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（1975)に従った。すなわち 、十分に抗体価が上がったマウスに、 0. 1 %の NAhl溶液又は 0. 1 %の DAhl溶液 それぞれ 100 1を尾部静脈より注射した。静脈注射力ら 4日後、マウスより脾臓を無 菌的に摘出した。脾臓を細切後、 RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（ Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。 1 , 000rp m X 10分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度 RPMI 1640で再懸濁し細胞数を カウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653)懸濁液を 細胞数が 10 : 1になるように混合し、再度 1 , OOOrpm X IO分の遠心分離を行い、ぺ レットを得た。このペレットに平均分子量 3, 350の 45%ポリエチレングリコールを滴 下し細胞融合を行った。細胞溶液に RPMI1640をカ卩ぇ希釈後、遠心分離でペレット にした。このペレットに、ハイプリドーマ用培地（10%牛胎児血清、 40mMの 2—メル カプトエタノーノレ、 lOOUZmlのペニシリン、 lOOmgZmlのストレプトマイシンを含む RPMI1640培地）【こ 100 μ Μのヒポキサンチン、 0. 4 μ Μのアミノプテリン、 16 Μ のチミジンを含む HAT選択培地をカ卩え、 5 X 10⁶cells/wellとなるように 24ゥエルの細 胞培養用プレート（Becton Dickinson)に分注し、 5%CO下 37°Cで培養した。

2

[0188] 5)限界希釈法によるクローユング

細胞培養用プレートの各ゥエルの培養上清にっ 、て、 ELISAの一次抗体として供 試し、抗 NAhl抗体又は DAhl抗体を産生して ヽるハイブリドーマの存在を調べた。 ELISAにより NAhl又は DAhlに対して陽性を示したゥエルのハイプリドーマについ て、 0. 9 cell/wellとなるように 96ゥエルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson)に 移し、限界希釈法によるクローユングを行った。なお、フィーダ一細胞として、 4週齢 B ALBZcマウス胸腺細胞を 5 X 10⁶cells/wellとなるように 96ゥエル細胞培養用プレー トの各ゥエルにカ卩えた。クローユングされたノヽイブリドーマの培養には、 10%牛胎児 血清、 40mMの 2—メルカプトエタノール、 lOOUZmlのペニシリン、 lOOgZmlのスト レプトマイシンを含む RPMI 1640培地を用いた。

[0189] 6)抗体のスクリーニング

モノクローナル抗体のスクリーニングは、 NAhl、 DAhl、あるいは落花生粗タンパ ク質の未変性物（以下 NP - eと記す）、尿素処理 (以下 DP - eと記す)の 4種類に対す る反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。なお、 NP— eは落花生に 5倍量の 20mMbis-tris- propane buffer (pH7. 2)を加え、室温で 2時間 攪拌後遠心分離を 2回行い得られた上清を透析した後、凍結乾燥したものとした。ま た、 DP— eは NP— eを lOmg量り、尿素 6g、 2— MEO. 2ml、 50mMの Tris— HCl緩衝 液 (pH8. 6) lml、蒸留水 1. 5mlをカ卩え、アルミフオイルで蓋をした後、 100°Cで 1時 間オイルバスで加熱、変性処理を行ったものとした。培養上清の NAhl、 NP—e、 DA hiあるいは DP— eに対する反応性を非競合法 ELISAにて調べた。

[0190] 7)腹水の採取及び MAbの精製

Jonesら（1990)に従い、まず、 BALBZcマウスに不完全フロイントアジュバントを 0 . 2ml腹腔内に注射した。 1週間後、一尾当たり 5 X 10⁶cellsのクローユングされたハ イブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水 を Protein Gカラム（アマシャムファノレマシア）により精製した。

[0191] 8) MAbの特性と MAbのクラス、サブクラス及びタイプ

抗 NAhlMAb又は抗 DAhlMAbの特性を決定するために、固相法を用いた。固 相法として、 NAhl、 DAhl、 NP—e又は DP— eをあら力じめ細胞培養用プレートのゥ エル内に固定し、この固定化された抗原に抗 NAh 1 MAb又は DAh 1 MAbを作用さ せる方法を用いた。また、 MAbのクラス及びサブクラスについては、 Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit (Pharmingen)【こより、 IgGl、 Ig 2a、 IgG2b、 Ig G3、 IgM、 IgA、 IgL ( K )及び IgL ( γ )を決定した。

[0192] 9) MAbのピオチン化

精製した MAbについて、サンドイッチ ELISAに供試するため、それぞれピオチン 化処理を行った。 50mMの炭酸緩衝液（pH8. 5)を用いて 20mgZmlとなるよう調 製し、 DMSOに 3mgZl00 μ 1で溶解した NHS—ピオチン溶液を 10 1加え、撹拌 後、氷冷しながら 2時間静置した。その後、 20mg/mlとなるように PBSで置換した。

[0193] 1-2 結果

1)抗 NAhlMAbと DAhlMAbの特性とクラス、サブクラス

NAhlに対する特異性を持つ MAb 7種類、及び、 DAh 1に対する特異性を持つ M Ab3種類を得た。それぞれ固相の抗原に対する特異性を表 20及び表 21に示した。

[0194] [表 20]

[0195] [表 21]

M A b名 N A h D A h N P - D P— クラス， サブクラ

1 1 e e スおよびタイプ

9 6 7 一 * 十 - 十 I g G 1 ( κ )

9 7 0 一 + + I g G 3 ( κ )

9 7 1 ( P A + + I g G 1 ) h 1 - 3 ) [0196] 2)組合せ条件

固相の抗原に対し陽性反応を示した各 MAbをそれぞれ固相あるいはピオチン化 抗体として、 NP— eおよび DP— eを検出するための MAbの組合せを、サンドイッチ EL ISAにおける検出感度の点から選出した。その結果、 NP— eを検出できる組合せとし て、プレート抗体に PAhl—2 (FERM ABP— 10270)とピオチン抗体に PAh 1—1 ( FERM ABP— 10269)、また、 DP— eを検出できる組合せとしてプレート抗体に PA hi— 2とピオチン抗体に PAhl— 3 (FERM ABP— 10271)の組合せを選択した（図 19と図 20)。

3) MAb混合系でのNP—e、 DP— eの検出

固相に PAhl— 2 (細胞寄託番号）、ピオチンィヒに PAhl— 1 (細胞寄託番号）および PAhl— 3 (細胞寄託番号)を混合し、 NP— e、 DP— eの検出感度を確認した。それぞ れの MAb濃度は 50 gZmlに設定した。その結果、 MAb混合系で NP— e、 DP— e ともに検出することが可能であった（図 21と図 22)。

2.サンドイッチ ELISAによる食品中の落花生粗タンパク質の検出

上記 1.で選択された PAhl— 1、 PAhl— 2および PAhl— 3の組合せにより、実際 の食品中の落花生粗タンパク質を検出できるかを試みた。

[0197] 2-1 材料及び方法

1)モデル食肉製品の作製

定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表 22に示す配合にて各 濃度の落花生粗タンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース 肉より脂、スジを除去し、 5mmで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を 計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、 75°Cで 30分 の加熱を行った。

[0198] [表 22] 原材料 TE S T 1 TEST 2 TE ST 3 o n t r o l 豚赤肉 （％) 83. 0 83. 0 83. 0 83. 0

N a C 1 ( % ) 2. 0 2. ϋ 2. 0 2. 0 [0199]

ポリ リ ン酸 N a ( % ) 0. 2 0. 2 0. 2 0. 1 亜硝酸ナ ト リウム（ p p m ) 1 20 1 0 1 20 1 20 ァスコルビン酸ナ ト リ ウム 300 300 300 300 p m )

水 1 4. 5 14. 5 1 4. 5 1 4. 5 落花生粗タンパク質 （ p p 200 20 2 0

m )

合計 ( ) 99. 762 99. 744 99. 7422 99. 742

[0200] 2)サンドイッチ ELISAによる定量分析

(モデル塩漬肉）

各モデル塩漬肉を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプ ルとした。サンプル lgを量り取り、 PBST19gを加えホモジナイザーにて 30秒攪拌し た。 3000rpmX 20分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを 0. 5ml測り 取り、 PBSTを 9. 5ml加え、 ELISA用サンプルとした。検量線には同様に PBSTに 溶解した落花生粗タンパク質の段階希釈を用いた。

(モデル加熱製品）

各モデル加熱製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サン プルとした。サンプル lgを量り取り、 1M尿素および 0. 1%2— MEを含む PBS 19g をカ卩ぇホモジナイザーにて 30秒攪拌した。その後、 100°Cで 1時間加熱処理を行つ た。冷却後 3000rpmX 20分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを 0. 5 ml測り取り PBSTを 9. 5mlカ卩え、 ELISA用サンプルとした。検量線には同様に 1M 尿素および 0. 1% 2— ME処理を行った落花生粗タンパク質の段階希釈を用いた。 また、分析用サンプル力 PBSTを用いて抽出し、 PBSTに溶解した落花生粗タンパ ク質を検量線とした尿素および 2— MEを用いな!/、場合との比較を行った。

[0201] 2-2 結果

サンドイッチ ELISAによるモデル食肉製品中の落花生粗タンパク質の分析につい て、モデル塩漬肉の結果を表 23に、モデル加熱製品の結果を表 24に、また、 PBST のみで抽出した結果を表 25に示す。

[0202] [表 23] TEST 1 TEST 2 TES T3 Con t r o 1 添加量 （ p p m ) 20. 0 2. 0 0. 0

分析 fit ( p p m ) 1 8. 4 1 . 8 N. D . n 回収率 （％) * 1 92. 0 90. 0 一

* 1 ： (分析値 添加量）

* 2 ：検出せず

[0203] [表 24]

* 1 ： (分析値 Z添加量）

* 2 ：検出せず

[0204] [表 25]

[0205] 以上の結果から、モデル塩漬肉のように未加熱の落花生粗タンパク質でも、モデル 加熱製品のような加熱変性した落花生粗タンパク質でも、高い回収率で落花生粗タ ンパク質を検出可能であった。これらのことから、未変性タンパク質に結合可能な M Abと変性タンパク質に結合可能な MAbを組み合わせることにより、未加熱 (未変性） 、加熱 (変性)のいかなる状態の落花生タンパク質でも、高感度で分析できることがわ かった。また、食品中力 の落花生粗タンパク質の抽出には尿素および 2— MEを用 いることが有効であり、尿素で変性させた Ahlに結合可能であることが必要であること が明らかとなった。

[0206] 3.ィムノクロマトによる未変性および変性落花生粗タンパク質の検出

3-1 材料及び方法

1)金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製

2mMホウ酸緩衝液（pH9. 0)で lmgZmlとなるように PAhl— 1と PAhl— 3の MA b溶液を調製した。あらかじめ 0. 2M炭酸カリウム溶液で pH9. 0に調製した金コロイ ド溶液 (シグマ社製） 5mlに MAb溶液を 500mlカ卩え、室温で 30分間反応した後、 10 %BSA溶液 625 1を加え、さらに 15分間反応させた。遠心分離を行い、 1% BSA 溶液で OD525 = 2. 0〖こなるよう調製し、 1 : 1の割合で混合した。ガラスウール製コン ジュゲートパッドに 68 lZcm²となるよう塗布し、乾燥させた。

[0207] 2)抗体固定化メンブレンの作製

PBSで 4mg/mlとなるよう PAhl— 2の MAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブ レンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、 1%スキムミルクを含む lOmMリン酸バッ ファー（pH7. 5)で 37°C、 1時間ブロッキング後、 lOmMリン酸バッファー（pH7. 5) で洗浄し乾燥させた。

[0208] 3)ィムノクロマトストリップの組立と評価

上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収 ノ ッドをそれぞれ貼り付け、ィムノクロマトストリップとした。非検液としては、上記 2.で 調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。

[0209] 3-2 結果

メンブレン塗布 MAb PAhl—2、および金コロイド標識 MAb PAhl— 1と PAhl— 3 の組合せにより、落花生粗タンパク質は加熱、非加熱に係わらず 50ppb (食品中 2ppm)まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入した落花生タン ノ ク質が対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応 できるィムノクロマトストリップの設計が可能となった。

[0210] 市販のアレルゲン検出用ィムノクロマトストリップでは、ブランクとして 0. 01M尿素、 0. 2%2— MEを含む PBSを滴下したところ、非特異的なバンドが生じてしまい、擬陽 性となってしまった。これでは、加熱などにより変性した食品タンパク中から効率よくァ レルゲンを抽出するためのタンパク質変性剤を使用できず、アレルゲンとして検出で きる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。

産業上の利用可能性

[0211] 本発明によると、食品等に含まれる乳アレルゲン、卵白アレルゲン、小麦アレルゲン、 そばアレルゲン、落花生アレルゲンについての免疫学的な検出方法において、これ らアレルゲン力 変性 Z未変性のいかなる状態にあっても正確に定性かつ定量的に 検出することができる _c 書式 7 (第 7条第 1項 係） 原寄託についての受領 氏名 〔名称）

プリマ 株式会上

寄託者 代表取締役社長 貴納 順二

あて名 T M0-8529

東京都品川区東大并

I. 微生物の表示

； (寄託者が付した識別の 表示） I (受頜番号）

； Pas l C l * FERM AB P - 11)263

：. 原寄託 の受領

本国際^託当局は、 年 月 日に I欄の微生物を受領した。

移管申 の受領

本国際寄1¾当局は、 2004年 9 H 7 日（：！^受託ョ）に受託した 1撊の微生物を受領した。

^際寄 当局

お立行 特許生物寄託センタ- 名称 international Patent 0 rgiinis m

N ational Institute of Advanced

あて名 ョ本国 茨成県つくば 東 I T目 i番地丄 中央第 6 〔郵便番号 305- 8566)

A1ST Tsu'-:uba Central 6, 1 - 1 , Higashi 1 - choms Tsukuba- sM,

Ibaraki-ken 305 -S566 Japan

平成 17 年 （05) 2 月

耆式 7 (第 7杂第 1項[¾係.) 原寄託についての受領書 ί 名 （名称）

プリマ 株式会社

代衷敢締役社長 貴納 順二

あて名 〒 140-8529

東京都品川区東大； 17- 4

(寄託者が付一 識 S'jのための表示） (受頃萏号）

FERM ABP-10264

II. 原 ^¾申請の受^

本国際^ 当局は、 年 Ά iに:欄の微生物を受領した。

in. 移管申 ii-の受領

本国際击 ¾当局は 年 9 月 7 日（囯內受託ョ）に受託した I欄の微生物を受領した。

IV. 国際寄託当局

行 ¾法人産業抆^総合研究所 特許牛-物寄 E

名称 In-e;natior.al Patent Orgaつ ism Depos ary ΰ」 ■

Naticna； Inst injtf? nf Advanced InduiLria'. S - i e n . e and ech ajifog ϊ_ ¾； 'τ

二 ' --"

センタ一長 山岡 1¾ _;

Dr.Masakazu Yaroanka i e—cH — '

あて名 茨^県つくぱ巿東 1 Γ目 番地 1 屮央第 G (郵便番号 305- -8556)

A【ST T≤ukub し' a: 6, Kigashi Tsttkuba-shi .

ibaraki- ken ¾ 05 - 8566 Japan

^成 17 (05) 2 月

書式 (第 条第 項関係） 原 *S託についての受領書

^名 （名^)

プリマハム楝式 社

代表取締役社長 貴納 順：:

あて名

東^都品川区東大井

生物の表示

(寄託者が付 た識別のための ¾示） I (受領番号） 原寄^申請の受鵠

際寄託当局は， 年 月 日に 欄の ½生吻を受^した.

移管 ¾詰の受馐

本国際寄託当局は、 年 月 ョ (国內受^ 〉に受託した 禰の微生 を受髌した。

国際 局

独立行政法人^業技術 fe:合研究所 ^許生物寄託 名称

【

長 山岡 正:^: あて名 日本国 茨¾県つくば 東 丁 番地 屮央第 成 年 （ 月

書式 〔 条第 項関係） 原寄託についての受領書 氏名 （名称)

プリマハム株式会社

寄託者 代表取締役^長 貴納 順二

あて名

束京都品川区束大井

微生物の表示

(寄 者が (寸した識別のための衷示） (受傾番号） ^寄託 Φ請の受領

本国際寄託当局は、 年 月 日に 镧の微生物を受碩した。

移管申請の受領

本 Θ際寄託当局は、 年 月 ョ （国内受託ョ）に受託 た欄の微生物を受領した。

国際寄託当局

独立行政法人産 ¾技術総合研究所 特許生物寄託センタ

^成 日

W

式 〔第 条第 項関係） 原寄託についての受領書 氏名 （名称）

プリマハム^式会社

代表取締役社長 ¾納 順二

て名 〒

京都品 ： I区東大；

微生^の表⁷

(寄託. が付した ^のための表示） (受 番

Ρし G3

ΪΙ . 原^託申^の受萌

月 に檷の微生物を受^した ₃

移管申^の受^

本国際 ¾ 当局は、 年 月 S 受託日）に g託した ί檷 微生物を受¾した

国際寄託当局

独立行政法人産棻技術総合研究所 特許生物寄託 センター ¾ 山岡

一

曰本^ 茨 県つくば市東 丁目 番地 中央箅 (郵便番号

： ： 平成 年 月

書式 7 (第 7 ¾第 1项関係;' 原寄託についての受領書 氏名 （名称）

プリマハム株式佥ネニ

代表取締役什-長 扉:納 頓ニ 殿

て名 〒 140 8529

東京都品川区東大井 3-17 4

(寄 者が付した 別のための表示） (受領番号）

PN0A1 PERM ΛΒΡ-10265

原寄託申 tilの受領

本国際寄託当局は、 .1欄の微生物を受頡 L

移管申請の受領

本 IE際寄託当局は、 年 月 (国内受託 S )に¾託した [攔 微生物を¾頡した。

^^.^

独立行攻法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ- 名称 Internationa] Patent Organism

National Inst itute of Advanced

あて-名 曰本: H 茨城県つくぱ？Γ粟 ίΤ Μ 1番地 1 中央第 6 (郵便番弓-^ 5- 6 '

A I S T ?ijki.i n¾ Central 6, 1 Higashi l-chome T^ukuba-shi,

[baraki ken 305-8566 Jnpan

平成 17 年 （05) 2 月 24 日

害式 7 (第 7灸第 1項関係） 原寄託についての受領書 氏名 （名称:'

プリマハム铢式会社

代表改締役社長 貴納 順

あて名 〒 L40-8529

東京都品川区東大井: 5- 17-4

微生物の表示

(寄託者が付した識別のための表示） (受領番号）

ΡΝΌΑ FE M ADP 10266

Ί. 原寄託申請の受^

本国際寄 K当局は、 年 月 口に 1槲の微生物を受^した

III. 移管申請の

本国際寄託当局は、 2004年 9 月 曰〔国内受 円）に受託した I樺の微生物を受領した，

/. 国際寄託当 β

立行政法人産窠技術総合研究所 荇許生物寄託 'ター

名称 International Patent Organism

National institute of AdvaiiCRd

あて名 日本^ ^城県つくば巿東 1丁 SlS^l 中央第 fi (郵便. 号: ¾05-S5fiS)

A 1ST Tsukuba Central 6 , 1-1, ト ligashi 1 chome Tsukuba -shi,

Ibfirak: - ken 305-8566 Japan

平 17 年 （05) 2 \ 24 S

書式 7 (第 7条第 1項関係） 原寄託についての受領害 氏名 （名称）

プリマハム株式会社

代表-取締 ¾社長 貴納 順二 殿 あて名 〒 L40 - 8529

東京都品 j 11区東大井 , 17~4

式 7 (第 7¾第 1項 0 係） 原寄託についての受領書 氏名 （名称）

プリマハム^式会扎

代表取締役社長 贵納 順二

あて名 亍 140-8529

^京都品川 東大井 3- Π-4

微生物の表示

(寄託者が付した識別のための表示） ！〔受^番 ）

PDOA2 ^; H RM ABP-10276

II. 原寄託甲請の受横

本囯際寄託当局は、 2005 年 2 .3 2 日に ί欏の微生物を受^した。

移 1"申請の受頃

本国際寄 ¾当局は， 月 （国内 日）に受 し 欄の微生物を受^した

国際寄託 3局

. 独立行政法人產業技^総合研^所 特許生物 託

：名 ： International Patent Organism Depositary

^Jat Institute cf Advanced industrial Scifincc ar.d ec

曰本 茨城 つくぱ 柬 1 目 1番地 1 中央第 6 ^号

A] Ts jkuoa central 6, 1— 1 Higashi 1 -chome Tsukuba-siii,

Ibiiraki-ken 305-S566 Japan

平成 ] 7 年 （05) 2 月 24

書式？ （第 7条笋 1項関係） 原寄託についての受領書 氏名 （名称）

プリマハム株式会社

^託^ 代表 ¾締役 ^長 貴納 順— 殿

あて名 f 140-8529

東^都品川区東大井 3- -4

微生物の表示

(寄託者が付した誡別 ため - 示） (受^番 )

PNOM1 ί F巳 ΒΡ 10279

に 原寄託 受領

本国際寄 e当局は， 2005 年 :1惲の微生物を受領した。

Hi.移管申 頒

木国際寄 ¾ 局は， 月 曰（国内受託 ）に ' ¾した 1欄の微生物を受領した。

[V, 国際寄 ¾当

独立行政法入産業技術 ¾合研究所 特許生物寄託

International Patent Organism

Nationa. Institute of Advanced

ョ不国 茨城^つくば ϊΐΤ東 丁ョ 1 地 1 千夬第 6 (郵便番号； 05-8566)

Al≥ i'sukuha entral 6, 1-1, Kigashi - chume Tsuktiba shi.

Ibaraki-ken ύ0ο-856ο Japan

' '成 17 年 （05) 2 月

害式 (第 条第 項関係） 原寄託についての受領書 氏名 （名 尔）

プリマハム株式 ±社

代表取 役社 J¾ 貴納 順二

あて名 〒 140-8529

東.京都品川区柬大井

¾生物の.表示

(寄託者が 識別のための 示） (¾領番号) 寄託丰請の受敏

本 ¾際寄 局は， ョに 櫚の '卞物を ¾領した _u

移管申 青の受領

本闳際寄託当 は、 月 日 受 日）に受 した欄の微牛物 受領した,

国際寄託当局

3¾立行玫法人產荬技術総合研究所 ¾ =生 ¾)寄託 ；

口本国 茨 つくば 東 丁目 番地 中央第 (郵便番号 平成 年 （ 月 日

書式 7 (第 7条第 l項関係) 原寄託についての受領書 氏名 （名称）

プリマハム株式会社

ί弋表取締役社長 ^納 順二

あて名 〒 140-8529

粜京者: ί品 J 11区東大井 3_ ί 7 -4

！. 微生物の麦示

(寄託者が付した識刖のための表示） (受領番 )

PDOM1 FE M

II. ^寄託申請の受頜

本国際寄託 局は. 年 2 月 24 日に [欖の微生物を受領した ₃

移管申請の受領

本国際寄託当局 年 月 〔3内受託 =1)に受託した ί欄の微生物を受領した。

国際寄託当局

独 '':行政法人産業技 総合研究所 特^生物寄託センタ- 名称 international Patent

National Institute of

あて名 Π本^ 茨 .県つくば市束 1丁 S 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 ·305-8566)

ALi Γ sukuba -entrai , 1, Htgashi 1— chome 'sukuba— sh

iba aKi-ken 305-S566 Japan

成 年 （05) 2

*弍 7 (第 7条第 1項関係） 原寄託についての受領書 氏名 '：名称）

プリマハム株式会社

代表取締役社長 貴納 順二

て名 〒 140- S529

東京都品川区東大井 3- 4

1. 微生^の表示

(寄託^が付した識別のための表示） i (受領番号）

PDO 2 ί FERM ABP- 10278

il. 原寄託申請の受領

本囯際寄 Ιΐ当局は、 2005 年 Ά 24 日に 1櫊の微生物を受領し

U:. 移管申請の受領

本同際 局は、 〔囯內受託日 )に受^した 1欄の微生物を受領した

国^寄託当局

独立 政法人産樂技術総合研究所 特許生物寄 Ιΐセンタ一

名 International F :y cH Org nism

National [ns: i:n te of Advanced

あて名 i本国 茨 ¾ ^つくば巿東 1丁 S i番地 1 屮央第 G (郵便番 ·335-8566)

A [ST Tbuk biiし ei --)^ c, 1-1 , Higashi 1- chome f sukuba-sh

[barak.i-k.en 305 - 856b Jdpan

平成 Π 年 （05> 2月

害式 (第 条第 項関係） 原寄託についての受領書 氏名 （名称)

プリマハム株式会社

代表取締役 ¾長 貴納 順二 殿 あて名 〒

東京都品川区東大井

曹弍 7 〔第 7条第 l項関 ¾J 原寄託についての受領書 氏名 （名称）

プリマハム株式会社

代表取^役社長 賁納 順二

あて名 τ 140-8529

^京都品川区東人并 3- 17-4

に 微生物の表示

(寄^者が付した識 のための表 (受領荐号-)

PGL2 ； FER

に 原寄託申 ¾の受領

本国際寄託^局は、 月 日に I†¾の微生物を受領した。

III. 移管申^の受^

本国凝 託当局は、 2004 (^内受託日）に δ託した 1櫚の微生物を受 した。

"iV. 国際寄 当局

独立 政法人産業技術総合研究所 特許生物寄 ¾ 名称 !nt-yrnational Pa: ent Depc it ry

N [ n s : i : u t e o Advancpd industris Science

長 山岡 TF和 _s

Dr. asakiizu Yam a oka ■ Ciii.e t r'-' " " '

；あて名 b本国 茨 県つくば市東 1丁 1番地 1 夬第 6 (郵便番号 305- 855*3)

ΑΓ5Τ Tsukuba Central 6, I ί' Mtgashi i -chome

I aral::-kcn 305 85oo Ja m

平成 1ァ年 （05) 2 月

鲁 ' (第 条第 項^係） 原寄託についての受領書 氏名 （名^ '

プリマハム株式会社

代表取締役社長 贵納 順

あて名 〒 140-8529

東京都品川区東大井 3-L7-4

表示

(寄託者が付した識^ ための表示） (受領番号）

PBVV I FE M

原寄託申請の ¾領

国際寄 当 ^は， 年 月 に [襴の微生物を受碩した

[. 移管中請の受領

本国際寄^当局は、 年 .月 日（国内受託日）に受託した 欄の微生物を した。

国^寄託当局

独立行政沾人産業技術総合 究所 特許生物寄 ¾ 名称 センター長 山岡 ' '

；あて名 ]本£ 茨域 つくば 束 丁目！■番地 ≠央第 (郵 番 平成 年 （ n

9

*式 7 (第 7条第 i項関係） 原寄託についての受領書 氏名 （名称〕

プリマハム洙式会社

代 ¾¾締役社長 貴衲 順二

あて名 〒

東京都品ル区^大井 3- 17- 4

： [. 微生物の表示 ：

― j

； (寄託者が付した敲别 表 i( 領番号） ！ PBW2 I PERM ABP-10273 ：

； 1；. 原 ¾託申請の受領 ！

： 本国際寄託当局は、 2005 2 Ά 2 ョに I櫊の 生物を受領した。

ΠΙ. 移 ¾·申^ 受頜

j 本国際^ ¾当局は、 年 月 曰（国內受託日）に受託した ί«の微生物を受頃した。

！ [v. 国際寄託当局

独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託

あて名

AiST T^ukuba CeiUral 6, Higashi 1-chome Tsukuba-shi,

fbiiraki-kcn 305~35ΰϋ japan

平成 1Y 年 5) 2 月 24 日

書式 (第 第 項閉係） 原寄託についての受領書 （名称）

プリマ 株式 社

代表取締役社長 貴衲 .噴二

あて名 τ

東京都品川 束大井

微^物の表

〔寄託者が付した識別のための表示） 受領番号） 本^ ^寄託当局は、 年 に櫊の微生物を受領した

移^ 誇の受^

際寄託当局は、 年 月 日 〔 内 日）に受託した の微生物を受領した _u

国際寄託当局

独 行政法人產業技術総合 究所 特許生物寄託

；名^ 長 山岡 二名 日 国 茨减 つくば市東 目 番地 中夬第 (郵便番号 了 平成 年 （ 月 日

書式了 (第 7条第 1項閣係) 原寄託についての受領書 氏名 （名称）

プリマ 株式会社

表取締役社長 貴納 顺ニ

あて名 〒 0-8529

東京都品川区東大井

微生物の表示

(寄託者が付した識別のための表示) (受領番号)

If . 原寄^ 受領

本 s際^ re a局は、 年 月 日に 微生物を受領した- il!. 移管申請の受領

月 日【¾内受託日）に受託した 1欄の微生^を受領した。

国際寄託当局

平成 ₁₇ 年 月

¾i T (第 7条第 l¾t¾S 原寄託についての受領書 氏名 （名称）

プリマ 株式会社

代表取締役社長 貴納 I頃

あて名 =f 140-3529

東京都品川区東大井 3- 17 4

I. 微生物の表

； (寄^者が付した識別のための表示） i (受^番号）

PAhl-2 FERM ABP-10270

： Π. 原^^ョ請の

本国際寄託当局は 2 05 年 2 月 24 Iに I欄の微生物を受領し-/:

移管申請の受領

本国際寄託当局は， 月 曰（国內受 r 日）に受 した 1欄の微生物を受領した。

IV. 国際寄託 ^

独立行攻法人産^ 術^ 研究所 特 玍物 託 'ター

名杯

あて名

AiiT Tsa uba Central 1—】， Higashi 1 -cho me -shi,

!baraki-kcn 305-8566 Japan

-成 17 年 （05) 2月

書式 7 (第 7条第 1項 ¾係） 原寄託についての受領書 氏名 （名称〕

プリマハム株式会社

代表取締役社長 貴納 順二

あて名

東京都品川区.東大井

¾生物の表-示

〔寄託者が付した識別のため 表 (受^巷号）

PAhl-3

^寄 ¾申 の受^

本国際寄託当局に， 2005 2 月 24 口に I櫊の微生物を受 した。

移管申 の受領

際寄託当局は、 年 ョ（国内受託ョ）に受託した I櫊の微生物を受領した _η

国凝寄託当

fi立行政法人産菜技術総合研究所 特許生物茶託 夕一

名称 inte aatiunai p tent Organism Depositary

National

あて名 日本 S

AI S T?; iik a Central 6, 1 1， Higasiii 1 -chomc Tsukjba-shi,

[ araki-kpn 305-8566 Japan

平成 17 年 （05〕 2 月

«317 (第 7条関係）

受 託 証 通知番号 ： 16産生寄 第 206号 通知年月日 ： 平成 16年 9月 7 日 プリマハム株式会社

代表取締役社長 貴納 順二 独立行政法人産業技術総合研 將 託センタ- 山岡

一—一—— H卜 'B ' fc： i

「 1.微生物の識別のための表示

'(寄託者が付した識別のための表 ） T(¾fi#¥)

PaslC l PERM P- 20206

2.科学的性質及び分類学上の伩置

1欄の微生物には、次の事項を記載した文書が添付されてレ、た。

科学的性質

F 分類学上の位

"3.受領及ぴ受 2ίΓ

当センターは、平成 16 年 9 月 7 曰に受領した 1欄の微生物を受託する。

*式:'（第 条闊係）

受 託 証 通知番号 ： 16産生寄 第 207号 通知年月日 ： 平成 16年 9月 7 λ プリマハム株式会社

代表取締 ¾社長 貴納 順： 殿 独立行政法人産業技術総合研 p¾ ¾¾i¾託センター長 ύ岡 '

Ιιτリ - i

1.微生物の識別のための表示'" ―

(受託番号) PaslCN2 FERM P- 20207

2-科学的性質及び分類学上の位置

1欄の微生物には、次の事項を記載した文書が添付されてレ、た。

F 科学的性質

^ 分類学上の位置

3.受領及び受託

;3センタ- 平成 L6 年 9 月 7 日に受領した 1欄の微生物を受託する。

*式 (第 条関係）

受 託 証 通知番号 ： 16産生寄 第 208号 通 ¾年月日 ： 平成 16年 9月 7 H プリマハム株式会上

殿

代表取締役社長 *納 順二 独立行玫法人産業技術総合研う センタ -長 山岡 lis

1.微生物の識別のための表示

が付した fi tり ί (受託番号)

PN0A1 FER P - 20208

2.科学的性質及び分類学上の位置

レ欄の微生物には、次の事¾を記載した文書が添付されていた

つ

ツ

科学的性質 パ一.

分類学上の位置 ΐΐ:

3.受領及ぴ受託

i当センターは、平成 16 年 9 月 7 日に受領した 1欄の微生物を受託する，

¾式 7 (第 7条^係）

受 託 証 通知番号 ： 16産生 f 第 209号 通知年月日 ： 平成 16年 9月 7 日 プリマハム株式会社

代表取締役社長 貴鈉 順二

； F 科学的性質

ί 分類''了':上の位置

3.受領及び受 Κ

；当センターは、平成 ₁₆ 年 9 月 7 日に受領した 1欄の微生物を受託する。

著式 7 (第 7¾関係）

受 託 証 通知番号 ： 16産生寄 第 210号 通知年月 S ： 平成 16年 9月 7 日 プリマハム株式会社

代表取締役社長 貴納 順:

β式 7 (第 7条閱係）

受 託 証 通知番号 ： 16産生寄 第 2U号 通知年月日 ： 平成 16年 9月 7 日 プリマハム株式会社

殿

代表取締役社長 貴納 順二

S/10

差替え周紙（« 6) 9/10

PCT

ift® A t fflift JK S ¾ί ί¾ ft t

受理官庁記入櫊

差替え钼紙（細 β)

Claims

請求の範囲 [1] 未変性及び変性の乳アレルゲン、未変性及び変性の卵白アレルゲン、未変性及び 変性の小麦アレルゲン、未変性及び変性のそばアレルゲン、又は未変性及び変性 の落花生アレルゲンを認識する各 2種類又はそれ以上のモノクロナール抗体を用い るアレルゲンの検出方法であって、 α siカゼインの主要タンパク質である α si α s i カゼイン、ホエーの主要たんぱく質である 13ラクトグロブリン、卵白主要タンパク質で あるオボアルブミンとオボムコイド、小麦の主要タンパク質であるグリアジン、そばの主 要タンパク質である分子量 24kDaと 76kDaのタンパク質、又は落花生の主要タンパ ク質である Am hiを指標とすることを特徴とするアレルゲンの検出方法。 [2] 未変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体と、変性乳アレルゲンを認識する モノクロナール抗体とを併用することを特徴とする乳アレルゲンの検出方法。 [3] 未変性乳アレルゲン及び Z又は変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体と して、それぞれ異なるェピトープを認識する 2以上のモノクロナール抗体を用いること を特徴とする請求項 2記載の乳アレルゲンの検出方法。 [4] 未変性乳アレルゲン及び Z又は変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体が、抗 a siカゼインモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 2又は 3記載の乳 アレルゲンの検出方法。 [5] 抗 a s iカゼインモノクロナール抗体力 未変性 a s iカゼイン、尿素処理 a s iカゼィ ン、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを認識する抗 a siカゼィ ンモノクロナール抗体であることを特徴とする請求項 4記載の乳アレルゲンの検出方 法。 [6] 抗 α s iカゼインモノクロナール抗体力 配列番号 1で示される a siカゼインのァミノ 酸配列の 132番目力 193番目までの領域を認識するモノクローナル抗体であること を特徴とする請求項 4又は 5記載の乳アレルゲンの検出方法。 [7] 抗 a s iカゼインモノクロナール抗体が、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10263)が産 生する抗 (X s iカゼインモノクロナール抗体 PaslCNl及び Z又はハイプリドーマ（FE RM ABP-10264)が産生する抗 a siカゼインモノクロナール抗体 Pas lCN2であ ることを特徴とする請求項 4一 6のいずれか記載の乳アレルゲンの検出方法。 [8] サンドイッチ ELISAにより、食品中の未変性 a siカゼイン及び尿素処理 a siカゼィ ンを、 10— lOOOppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうることを特 徴とする請求項 4一 7のいずれか記載の乳アレルゲンの検出方法。 [9] 未変性乳アレルゲン及び Z又は変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体が 、抗 j8ラクトグロブリンモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 2又は 3記載 の乳アレルゲンの検出方法。 [10] 抗 βラクトグロブリンモノクロナール抗体力 未変性 βラクトグロブリン、尿素処理 βラ タトグロブリン、還元カルボキシメチル化 βラクトグロブリンを認識する抗 /3ラタトグロブ リンモノクロナール抗体であることを特徴とする請求項 9記載の乳アレルゲンの検出 方法。 [11] 抗 j8ラクトグロブリンモノクロナール抗体が、ハイプリドーマ（FERM ABP-10281) が産生する抗 βラクトグロブリンモノクロナール抗体 Ρ β LG1及び Ζ又はハイプリドー マ（FERM ABP-10282)が産生する抗 j8ラクトグロブリンモノクロナール抗体 P β LG2及び Ζ又はハイプリドーマ（FERM ΑΒΡ— 10283)が産生する抗 βラクトグロ ブリンモノクロナール抗体 Ρ β LG3であることを特徴とする請求項 9又は 10記載の乳 アレルゲンの検出方法。 [12] サンドイッチ ELISAにより、食品中の未変性 j8ラクトグロブリン及び尿素処理 j8ラクト グロブリンを、 30— lOOOppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる ことを特徴とする請求項 9一 11のいずれか記載の乳アレルゲンの検出方法。 [13] 検体から、尿素と 2—メルカプトエタノールを用いてカゼイン及び/又はホエータンパ ク質を抽出することを特徴とする請求項 2— 12のいずれか記載の乳アレルゲンの検 出方法。 [14] 未変性カゼインを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及び変性カゼインを認 識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体、並びに、未変性 j8ラクトグロブリンを認識 する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及び変性 /3ラクトグロブリンを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体を用いることを特徴とする請求項 1一 13のいずれか記載 の乳アレルゲンの検出方法。 [15] 未変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体と、変性乳アレルゲンを認識する 97 請求の範囲

[1] 未変性及び変性の乳アレルゲン、未変性及び変性の卵白アレルゲン、未変性及び 変性の小麦ァレノレゲン、未変性及び変性のそばアレルゲン、又は未変性及び変性 の落花生アレルゲンを認識する各 2種類又はそれ以上のモノクロナール抗体を用い るアレルゲンの検出方法であって、 a siカゼインの主要タンパク質である a; si a si カゼイン、ホエーの主要たんぱく質である Pラクトグロプリン、卵白主要タンパク質で あるオボアルブミンとオボムコイド、小麦の主要タンパク質であるグリアジン、そばの主 要タンパク質である分子量 24kDaと 76kDaのタンパク質、又は落花生の主要タンパ ク質である Ara hiを指標とすることを特徴とするアレルゲンの検出方法。

[2] 未変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体と、変性乳アレルゲンを認識する モノクロナ一ル抗体とを併用することを特徴とする乳アレルゲンの検出方法。

[3] 未変性乳アレルゲン及び Z又は変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体と して、それぞれ異なるェピトープを認識する 2以上のモノクロナール抗体を用いること を特徴とする請求項 2記載の乳アレルゲンの検出方法。

[4] 未変性乳アレルゲン及び/又は変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体が

、抗 a siカゼインモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 2又は 3記載の乳 ァレノレゲンの検出方法。

[5] 抗 a siカゼインモノクロナール抗体力 未変性 a siカゼイン、尿素処理 a siカゼィ ン、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを認識する抗 a s 1カゼィ ンモノクロナール抗体であることを特徴とする請求項 4記載の乳アレルゲンの検出方 法。

[6] 抗 a siカゼインモノクロナール抗体力 配列番号 1で示される a siカゼインのァミノ 酸配列の 132番目から 193番目までの領域を認識するモノクローナル抗体であること を特徴とする請求項 4又は 5記載の乳アレルゲンの検出方法。

[7] 抗 a siカゼインモノクロナール抗体力 ハイプリドーマ（FERM ABP— 10263)が 産生する抗 a siカゼインモノクロナーノレ抗体 PaslCNl及び Ζ又はハイプリドーマ（ FERM ABP— 10264)が産生する抗 a slカゼインモノクロナール抗体 PaslCN2 であることを特徴とする請求項 4〜6のいずれか記載の乳アレルゲンの検出方法。

差替え用紙 （規則 26) 98

[8] サンドイッチ ELISAにより、食品中の未変性 a siカゼイン及び尿素処理 _α siカゼィ ンを、 10〜1000ppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうることを特 徴とする請求項 4〜7のいずれか記載の乳アレルゲンの検出方法。

[9] 未変性乳アレルゲン及ひ、 又は変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体が 、抗 βラクトグロブリンモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 2又は 3記載 の乳アレルゲンの検出方 fe。

[10] 抗 βラクトグロブリンモノクロナール抗体が、未変性 13ラクトグロブリン、尿素処理 ]3ラ タトグロブリン、還元カルボキシメチル化 ラクトグロブリンを認識する抗 βラクトグロブ リンモノクロナ一ル抗体で ることを特徴とする請求項 9記載の乳アレルゲンの検出 方法。

[11] 抗 βラクトグロブリンモノクロナール抗体力 ハイブリドーマ（FERM ABP- 10281) が産生する抗 βラクトグロブリンモノクロナール抗体 Ρ β LG1及び Ζ又はハイプリドー マ（FERM ΑΒΡ- 10282)が産生する抗 βラクトグロブリンモノクロナール抗体 Ρ β LG2及び 又はハイプリドーマ（FERM ABP— 10283)が産生する抗 |3ラクトグロ ブリンモノクロナール抗体 P β LG3であることを特徴とする請求項 9又は 10記載の乳 アレルゲンの検出方法。

[12] サンドイッチ ELISAにより、食品中の未変性 βラクトグロブリン及び尿素処理 βラクト グロブリンを、 30〜1000_Ppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる ことを特徴とする請求項 9〜 11の 、ずれか記載の乳アレルゲンの検出方法。 .

[13] 検体から、尿素と 2—メルカプトエタノールを用いてカゼイン及び/又はホエータンパ ク質を抽出することを特徴とする請求項 2〜12のいずれか記載の乳アレルゲンの検 出方法。

[14] 未変性カゼインを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及ぴ変性カゼインを認 識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体、並びに、未変性 ラクトグロブリンを認識 する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及び変性 βラクトグロブリンを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体を用レヽることを特徴とする請求項 1〜 13のレ、ずれか記載 の乳アレルゲンの検出方 fe。

[15] 未変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体と、変性乳アレルゲンを認識する

差替え用紙 （規則 26) 99 モノクロナール抗体とを備え、未変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体と 変性乳アレルゲンとを認識するモノクロナール抗体とを併用する条件下で用いられる ことを特徴とする乳アレルゲン検出用キット。

[16] 未変性乳アレルゲン及び Z又は変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体と して、それぞれ異なるェピトープを認識する 2以上のモノクロナール抗体を備えたこと を特徴とする請求項 15記載の乳アレルゲン検出用キット。

[17] 未変性乳アレルゲン及び/又は変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体が

、抗 a s iカゼインモノクロナール抗体であることを特徴とする請求項 15又は 16記載 の乳アレルゲン検出用キット。

[18] 抗 a siカゼインモノクロナール抗体力 未変性 a s iカゼイン、尿素処理 a s iカゼィ ン、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを認識する抗 a s iカゼィ ンモノクロナール抗体であることを特徴とする請求項 17記載の乳アレルゲン検出用 キット。

[19] 抗 s iカゼインモノクロナール抗体力 配列番号 1で示される a s iカゼインのァミノ 酸配列の 132番目から 193番目までの領域を認識するモノクローナル抗体であること を特徴とする請求項 17又は 18記載の乳アレルゲン検出用キット。

[20] 抗 a s iカゼインモノクロナール抗体力 ハイプリドーマ（FERM ABP— 10263)が 産生する抗 a s iカゼインモノクロナール抗体 Pas l CNl及ぴ Z又はハイプリドーマ（ FERM ABP— 10264)が産生する抗 a s lカゼインモノクロナール抗体 Pas l CN2 であることを特徴とする請求項 17〜： 19のいずれか記載の乳アレルゲン検出用キット

[21] 未変性乳ァレノレゲン及びノ又は変性乳アレルゲンを認識するモノクロナール抗体が 、抗 βラクトグロブリンモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 15又は 16記 載の乳アレルゲン検出用キット。

[22] 抗 βラクトグロブリンモノクロナ一ル抗体が、未変性 βラクトグロブリン、尿素処理 βラ クトグロブリン、還元カルボキシメチル化 βラクトグロブリンを認識する抗 βラクトグロプ リンモノクロナ一ノレ抗体であることを特徴とする請求項 21記載の乳アレルゲン検出用 キット。

差替え用紙 （規則 26) 100

[23] 抗 |3ラクトグロブリンモノクロナール抗体力 ハイブリドーマ（FERM ABP— 10281) が産生する抗 βラクトグロブリンモノクロナ一ル抗体 Ρ β LG1及びノ又はハイプリドー マ (FERM ΑΒΡ— 10282)が産生する抗 ラクトグロブリンモノクロナール抗体 Ρ ;3 LG2及び/又はハイプリドーマ（FERM ABP- 10283)が産生する抗 βラクトグロ ブリンモノクロナール抗体 Ρ β LG3であることを特徴とする請求項 21又は 22記載の 乳アレルゲン検出用キット。

[24] 異なるェピトープを認識する 2種類のモノクロナール抗体の少なくとも一つ力 ィムノ クロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクロナール抗体であることを特徴と する請求項 15〜23のいずれか記載の乳アレルゲン検出用キット。

[25] 未変性カゼインを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及ぴ変性カゼインを認 識する 1又は 2以上のモノクロナ一ル抗体、並びに、未変性 βラクトグロブリンを認識 する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及び変性 βラクトグロプリンを認識する 1又は 2以上のモノクロナー/レ抗体を備えることを特徴とする請求項 15〜24のいずれか記 載の乳アレルゲン検出用キット。

[26] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10263)が産生する抗 α siカゼインモノクロナール 抗体 PaslCNl。

[27] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10264)が産生する抗 α siカゼインモノクロナール 抗体 PaslCN2。

[28] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10281)が産生する抗 ]3ラクトグロブリンモノクロナ —ル抗体 P i8 LGl。

[29] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10282)が産生する抗 j3ラクトグロブリンモノクロナ ール抗体 p β LG2。

[30] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10283)が産生する抗 j3ラクトグロブリンモノクロナ ール抗体 P β LG3。

[31] 未変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナ一ル抗体と、変性卵白アレルゲンを認 識するモノクロナール抗体とを併用することを特徴とする卵白アレルゲンの検出方法

[32] 未変性卵白アレルゲン及ぴ Z又は変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナール抗

差替え用紙 （規則 26) 101

体として、それぞれ異なるェピトープを認識する 2以上のモノクロナール抗体を用いる ことを特徴とする請求項 31記載の卵白アレルゲンの検出方法。

[33] 未変性卵白アレルゲン及びノ又は変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナール抗 体力 S、抗オボアルブミンモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 31又は 32 記載の卵白アレルゲンの検出方法。

[34] 抗オボアルブミンモノクローナル抗体力 S、未変性オボアルブミン及び/又は還元カル ボキシメチノレ化オボアルブミンを認識する抗オボアルブミンモノクローナル抗体であ ることを特徴とする請求項 33記載の卵白アレルゲンの検出方法。

[35] 抗オボアルブミンモノクローナル抗体力 S、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10265)カ 産生する抗才ボアルブミンモノクロナール抗体 PNOA1及び/又はハイプリドーマ（F ERM ABP一 10266)が産生する抗オボアルブミンモノクロナール抗体 PNOA2及 び/又はハイプリドーマ（FERM ABP— 10275)が産生する抗オボアルブミンモノ クロナール抗体 PDQA1及び Z又はハイプリドーマ（FERM ABP- 10276)が産 生する抗オボアルブミンモノクロナール抗体 PDOA2であることを特徴とする請求項 3 3又は 34記載の卵白アレルゲンの検出方法。

[36] サンドイッチ ELISAにより、食品中の未変性オボアルブミン及ぴ Z又は変性オボァ ルブミンを、 1. 0-10. Oppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる ことを特徴とする請求項 33〜35のいずれか記載の卵白アレルゲンの検出方法。

[37] 未変性卵白アレルゲン及び 又は変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナール抗 体力 S、抗ォポムコイドモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 31又は 32記 载の卵白アレルゲンの検出方法。

[38] 抗ォボムコイドモノクローナル抗体が、未変性オボムコイド及び Z又は尿素変性オボ ムコイドを認識する抗オボムコイドモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 3 7記載の卵白アレルゲンの検出方法。

[39] 抗ォボムコイドモノクローナル抗体力 S、ハイブリドーマ（FERM ABP— 10279)が産 生する抗オボムコイドモノクロナール抗体 PNOM1及び 又はハイプリドーマ（FER M ABP— 10280)が産生する抗オボムコイドモノクロナール抗体 PNOM2及びノ 又はハイプリドーマ（FERM ABP- 10277)が産生する抗オボムコイドモノクロナ^"

差替え用紙 （規則 26) 102 ル抗体 PDOM1及び/又はハイプリドーマ（FERM ABP— 10278)が産生する抗 オボムコイドモノクロナール抗体 PDOM2であることを特徴とする請求項 37又は 38記 載の卵白アレルゲンの検出方法。

[40] サンドイッチ ELISAにより、食品中の未変性オボムコイド及ぴ Z又は変性オボムコィ ドを、 10~100ppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうることを特徴 とする請求項 34〜36のレ、ずれか記載の卵白アレルゲンの検出方法。

[41] 検体から、尿素と 2—メルカプトエタノールを用いてオボアルブミン及び/又はォボム コイドを抽出することを特徴とする請求項 31〜40のいずれか記載の卵白アレルゲン の検出方法。

[42] 未変性オボアルブミンを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及び変性オボァ ルブミンを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体、並びに、未変性オボムコイド を認識する 1又は 2以上のモノクロナ一ル抗体及び変性オボムコイドを認識する 1又 は 2以上のモノクロナール抗体を用いることを特徴とする請求項 31〜41のいずれか 記載の卵白アレルゲンの検出方法。

[43] 未変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナール抗体と、変性卵白アレルゲンを認 識するモノクロナール抗体とを備え、未変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナー ル抗体と変性卵白アレルゲンとを認識するモノクロナール抗体とを併用する条件下で 用いられることを特徴とする卵白アレルゲン検出用キット。

[44] 未変性卵白アレルゲン及び/又は変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナール抗 体として、それぞれ異なるェピトープを認識する 2以上のモノクロナール抗体を えた ことを特徴とする請求項 43記載の卵白アレルゲン検出用キット。

[45] 未変性卵白アレルゲン及び Z又は変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナール抗 体力 抗オボアルブミンモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 43又は 44 記載の卵白アレルゲン検出用キット。

[46] 抗オボアルブミンモノクローナル抗体が、未変性オボアルブミン及び/又は還元カル ボキシメチルイヒオボアルブミンを認識する抗オボアルブミンモノクローナル抗体であ ることを特徴とする請求項 45記載の卵白アレルゲン検出用キット。

[47] 抗オボアルブミンモノクローナル抗体力 ハイプリドーマ（FERM ABP— 10265)力 S

差替え用紙 （規則 26) 103

産生する抗オボアルブミンモノクロナール抗体 PNQA1及び Z又はハイプリドーマ (F ERM ABP- 10266)が産生する抗オボアルブミンモノクロナール抗体 PNOA2及 び Z又はハイプリドーマ (FERM ABP- 10275)が産生する抗オボアルブミンモノ クロナール抗体 PDOA1及び Z又はハイプリドーマ（FERM ABP- 10276)が産 生する抗オボアルブミンモノクロナール抗体 PDOA2であることを特徴とする請求項 4 5又は 46記載の卵白アレルゲン検出用キット。

[48] 未変性卵白アレルゲン及び Z又は変性卵白アレルゲンを認識するモノクロナール抗 体力 S、抗オボムコイドモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 439又は 44 記載の卵白アレルゲン検出用キット。

[49] 抗オボムコイドモノクローナル抗体力 S、未変性オボムコイド及び Z又は尿素変性オボ ムコイドを認識する抗オボムコイドモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 4 8記載の卵白アレルゲン検出用キット。

[50] 抗ォボムコイドモノクローナル抗体力 ハイブリドーマ（FERM ABP— 10279)力；産 生する抗オボムコイドモノクロナール抗体 PNOM1及び/又はハイプリドーマ（FER M ABP- 10280)が産生する抗オボムコイドモノクロナール抗体 PNOM2及び 又はハイプリドーマ（FERM ABP- 10277)が産生する抗オボムコイドモノクロナー ル抗体 PDOM1及びノ又はハイプリドーマ (FERM ABP— 10278)が産生する抗 オボムコイドモノクロナール抗体 PDOM2であることを特徴とする請求項 48又は 49記 載の卵白アレルゲン検出用キット。

[51] 異なるェピトープを認識する 2以上のモノクロナール抗体の少なくとも一つ力 S、ィムノ クロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクロナール抗体であることを特徴と する請求項 43〜50のいずれか記載の卵白アレルゲン検出用キット。

[52] 未変性オボアルブミンを認識する 1又は 2以上のモノクロナ一ル抗体及ぴ変性オボァ ルブミンを認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体、並びに、未変性オボムコイド を認識する 1又は 2以上のモノクロナール抗体及び変性オボムコイドを認識する 1又 は 2以上のモノクロナール抗体を備えることを特徴とする請求項 43〜51のいずれか 記載の卵白アレルゲン検出用キット。

[53] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10265)が産生する抗オボアルブミンモノクロナー

差替え用紙 （規則 26) 104 ル抗体 ΡΝΟΑ1。

[54] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10266)が産生する抗オボアルブミンモノクロナー ル抗体 PNOA2。

[55] ハイブリドーマ（FERM ABP— 10275)が産生する抗オボアルブミンモノクロナー ル抗体 PD〇A1。 ■

[56] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10276)が産生する抗オボアルブミンモノクロナー ル抗体 PDOA2。

[57] ハイブリド一マ（FERM ABP— 10279)が産生する抗オボムコイドモノクロナ一ル抗 体 PNOMlo

[58] ハイプリドーマ（FE M ABP— 10280)が産生する抗オボムコイドモノクロナール抗 体 PNOM2。

[59] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10277)が産生する抗オボムコイドモノクロナ一ル抗 体 PDOMl_D

[60] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10278)が産生する抗オボムコイドモノクロナール抗 体 PDOM2₀

[61] 未変性小麦グリアジン及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識する抗小麦グ リアジンモノクロナール抗体を用いることを特^ [とする小麦アレルゲンの検出方法。

[62] 未変性小麦グリアジン及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識し、かつ異なる ェピトープを認識する 2種類の抗小麦グリアジンモノクロナール抗体を併用することを 特徴とする小麦アレルゲンの検出方法。

[63] 抗小麦グリアジンモノクロナール抗体が、未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチ ル化小麦グリアジン、 0. 1M酢酸可溶化小麦グリアジン、 70%エタノール可溶化小 麦グリアジン、及び変性剤で可溶ィヒした小麦グリアジンを認識する抗小麦グリアジン モノクロナール抗体であることを特徴とする請求項 61又は 62記載の小麦アレルゲン の検出方法。

[64] 抗小麦グリアジンモノクロナール抗体力 ハイプリドーマ（FERM ABP— 10267)が 産生する抗小麦グリアジンモノクロナール抗体 PGL1及びノ又はハイプリドーマ（FE RM ABP- 10268)が産生する抗小麦グリアジンモノクロナール抗体 PGL2である

差替え用紙 （規則 26) 105

ことを特徴とする請求項 61〜63のいずれか記載の小麦アレルゲンの検出方法。

[65] サンドイッチ ELISAにより、食品中の未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチル 化小麦グリアジン、 0. 1M酢酸可溶化小麦グリアジン、 70%エタノール可溶ィ匕小麦 グリアジン、及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを、 10〜100ppbの濃度範囲に ぉ ヽても定性的かつ定量的に分析しうることを特徴とする請求項 61〜 64の！/ヽずれか 記載の小麦アレルゲンの検出方法。

[66] 未変性小麦グリアジン及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識する抗小麦グ リアジンモノクロナール抗体を備えたことを特徴とする小麦アレルゲン検出用キット。

[67] 未変性小麦グリアジン及び変性剤で可溶ィ匕した小麦グリアジンを認識し、かつ異なる ェピトープを認識する 2種類の抗小麦グリアジンモノクロナール抗体を備えたことを特 徴とする小麦アレルゲン検出用キット。

[68] 抗小麦グリアジンモノクロナール抗体力 未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチ ル化小麦グリアジン、 0. 1M酢酸可溶化小麦グリアジン、 70%エタノール可溶化小 麦グリアジン、及び変性剤で可溶ィヒした小麦グリアジンを認識する抗小麦グリアジン モノクロナール抗体であることを特徴とする請求項 66又は 67記載の小麦アレルゲン 検出用キット。

[69] 抗小麦グリアジンモノクロナール抗体力 S、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10267)が 産生する抗小麦グリアジンモノクロナール抗体 PGL1及び Z又はハイブリド一マ（FE RM ABP- 10268)が産生する抗小麦グリアジンモノクロナール抗体 PGL2である ことを特徴とする請求項 66〜68のいずれか記載の小麦アレルゲン検出用キット。

[70] 異なるェピトープを認識する 2種類のモノクロナール抗体の少なくとも一つ力 ィムノ クロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクロナール抗体であることを特徴と する請求項 66〜69のいずれか記載の小麦アレルゲン検出用キット。

[71] ハイブリド一マ（FERM ABP— 10267)が産生する抗小麦グリアジンモノクロナー ル抗体 PGL1₀

[72] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10268)が産生する抗小麦グリアジンモノクロナー ル抗体 PGL2。

[73] 未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパ

差替え用紙 （規則 26) 106 ク質モノクロナール抗体を用いることを特徴とするそばアレルゲンの検出方法。

[74] 未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識し、かつ異なるェピト ープを認識する 2種類の抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体を併用することを特 徴とするそばアレルゲンの検出方法。

[75] 抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体力 24Daタンパク質及び加熱変性そば粗タ ンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体、又は 76kDaタンパク質 及ぴ未変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体で あることを特徴とする請求項 73又は 74記載のそばアレルゲンの検出方法。

[76] 抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体力 ハイブリドーマ（FERM ABP- 10272 )が産生する抗 24kDaタンパク質モノクロナール抗体 PBW1及び/又はハイプリドー マ（FERM ABP- 10273)が産生する抗 76kDaタンパク質モノクロナール抗体 PB W2及び Z又はハイプリドーマ（FERM ABP- 10274)が産生する抗 76kDaタン パク質モノクロナール抗体 PBW3であることを特徴とする請求項 73〜75のいずれか 記載のそばアレルゲンの検出方法。

[77] サンドイッチ ELISAにより、未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質 を、 10〜1000ppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうることを特徴 とする請求項 73〜76のいずれか記載のそばアレルゲンの検出方法。

[78] 検体から、尿素と 2_メルカプトエタノールを用いて加熱変性そば粗タンパク質を抽 出することを特徴とする請求項 73〜77のいずれか記載のそばアレルゲンの検出方 法。

[79] 未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパ ク質モノクロナール抗体を備えたことを特徴とするそばアレルゲン検出用キット。

[80] 未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識し、カゝっ異なるェピト ープを認識する 2種類の抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体を備えたことを特徴 とするそばアレルゲン検出用キット。

[81] 抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体力 24Daタンパク質及び加熱変性そば粗タ ンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体、又は 76kDaタンパク質 及び未変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクロナ一ル抗体で .

差替え用紙 （規則 26) 107

あることを特徴とする請求項 79又は 80記載のそばアレルゲン検出用キット。

[82] 抗そば粗タンパク質モノクロナール抗体力 ハイプリドーマ (FERM ABP- 10272 )が産生する抗 24kDaタンパク質モノクロナール抗体 PBW1及び/又はハイプリドー マ（FERM ABP- 10273)が産生する抗 76kDaタンパク質モノクロナール抗体 PB W2及び/又はハイブリド一マ（FERM ABP- 10274)が産生する抗 76kDaタン パク質モノクロナール抗体 PBW3であることを特徴とする請求項 79〜81のいずれか 記載のそばアレルゲン検出用キット。

[83] 異なるェピトープを認識する 2種類のモノクロナール抗体の少なくとも一つ力 ィムノ クロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクロナール抗体であることを特徴と する請求項 79〜82のいずれか記載のそばァレノレゲン検出用キット。

[84] 検体からのそば粗タンパク質抽出剤としての、尿素と 2—メルカプトエタノール力 S備え られていることを特徴とする請求項 79〜83のいずれか記載のそばアレルゲン検出用 キット。

[85] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10272)が産生する抗 24kDaタンパク質モノクロナ ール抗体 PBW1。

[86] ハイブリドーマ（FERM ABP— 10273)が産生する抗 76kDaタンパク質モノクロナ ール抗体 PBW2_D

[87] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10274)が産生する抗 76kDaタンパク質モノクロナ ール抗体 PBW3。

[88] 未変性落花生 Ara hiタンパク質及び加熱変性落花生 Ara hiタンパク質を認識す る抗 Ara hiタンパク質モノクロナール抗体を用いることを特徴とする落花生アレルゲ ンの検出方法。

[89] 未変性落花生 Ara hiタンパク質及び加熱変性落花生 Ara hiタンパク質を認識し、 かつ異なるェピトープを認識する 2種類の抗 Ara hiタンパク質モノクロナール抗体を 併用することを特徴とする落花生アレルゲンの検出方法。

[90] 抗 Ara hiタンパク質モノクロナール抗体力 未変性 Ara hiタンパク質と未変性落花 生粗タンパク質、及び/又は、尿素処理 Ara hiタンパク質と尿素処理落花生粗タン パク質を認識する抗 Ara hiタンパク質モノクロナール抗体であることを特徴とする請

差替え用紙 （規則 26) 108

求項 88又は 89記載の落花生アレルゲンの検出方法。

[91] 抗落花生 Ara hiタンパク質モノクロナ一ル抗体力 S、ハイプリドーマ（FERM ABP— 10269)が産生する抗未変性 Ara hiタンパク質モノクロナール抗体 PAhl _ l及び /又はハイプリドーマ（FERM ABP— 10270)が産生する抗未変性 Ara hiタンパ ク質モノクロナール抗体 PAhl— 2及び/又はハイプリドーマ（FERM ABP— 102 71)が産生する抗加熱変性 Ara hiタンパク質モノクロナール抗体 PAhl—3である ことを特徴とする請求項 88~90のいずれか記載の落花生アレルゲンの検出方法。

[92] サンドイッチ ELISAにより、未変性落花生 Ara hiタンパク質及び加熱変性落花生 A ra hiタンパク質を、 10〜： LOOOppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分 析しうることを特徴とする請求項 88〜91のいずれか記載の落花生アレルゲンの検出 方法。

[93] 検体から、尿素と 2—メルカプトエタノールを用いて加熱変性落花生 Ara hiタンパク 質を抽出することを特徴とする請求項 88〜92のいずれか記載の落花生アレルゲン の検出方法。

[94] 未変性落花生 Ara hiタンパク質及び加熱変性落花生 Ara hiタンパク質を認識す る抗落花生 Ara hiタンパク質モノクロナール抗体を備えたことを特徴とする落花生ァ レルゲン検出用キット。

[95] 未変性落花生 Ara hiタンパク質及び加熱変性落花生 Ara hiタンパク質を認識し、 かつ異なるェピトープを認識する 2種類の抗落花生 Ara hiタンパク質モノクロナール 抗体を備えたことを特徴とする落花生アレルゲン検出用キット。

[96] 抗 Ara hiタンパク質モノクロナール抗体力 未変性 Ara hiタンパク質と未変性落花 生粗タンパク質、及び/又は、尿素処理 Ara hiタンパク質と尿素処理落花生粗タン パク質を認識する抗 Ara hiタンパク質モノクロナ一ル抗体であることを特徴とする請 求項 94又は 95記載の落花生アレルゲン検出用キット。

[97] 抗落花生 Ara hiタンパク質モノクロナール抗体力 ハイプリドーマ (FERM ABP- 10269)が産生する抗未変性 Ara hiタンパク質モノクロナール抗体 PAhl― 1及び /又はハイプリドーマ（FERM ABP- 10270)が産生する抗未変性 Ara hiタンパ ク質モノクロナール抗体 PAhl— 2及び 又はハイプリドーマ（FERM ABP— 102

差替え用紙 （規則 26) 109

71)が産生する抗加熱変性 Ara hiタンパク質モノクロナール抗体 PAhl— 3である ことを特徴とする請求項 94〜96のいずれか記載の落花生アレルゲン検出用キット。

[98] 異なるェピトープを認識する 2種類のモノクロナール抗体の少なくとも一つ力 S、ィムノ クロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクロナール抗体であることを特徴と する請求項 94〜97のいずれか記載の落花生アレルゲン検出用キット。

[99] 検体からのホエータンパク質抽出剤としての、尿素と 2—メルカプトエタノールが備え られて!/、ることを特徴とする請求項 94〜98のレ、ずれか記載の落花生アレルゲン検 出用キット。

[100] ハイプリド一マ（FERM ABP— 10269)が産生する抗未変性 Ara hiタンパク質モ ノクロナール抗体 PAhl - 1。

[101] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10270)が産生する抗未変性 Ara hiタンパク質モ ノクロナール抗体 PAhl— 2。

[102] ハイプリドーマ（FERM ABP— 10271)が産生する抗加熱変性 Ara hiタンパク質 モノクロナール抗体 PAhl— 3。

差替え用紙 （規則 26)