JP5043077B2 - 落花生アレルゲンの検出方法 - Google Patents
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Description
、未変性オボムコイドと反応するが熱変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、熱変性オボムコイドと反応するが未変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、及び未変性オボムコイドと熱変性オボムコイドに反応するモノクローナル抗体を用いて、加熱変性状態をも識別してオボムコイドを定量し、卵アレルゲンの同定と正確な定量を可能とする免疫学的定量方法が報告されている(例えば、特開2002−253230号公報参照)。
1−1 材料及び方法
1)Ara h1タンパク質の調製
市販生落花生に5倍量の20mM bis-tris-propanebuffer(pH7.2)を加え、室温で2時間攪拌後3000×gで遠心分離を行い沈殿および油分を除去した。得られた水溶性画分を再度10000×gで遠心分離を行い上清を得た。上清をさらにSourceQ(アマシャム ファルマシア)を用いて、20mMのbis-tris-propane buffer(pH7.2)、NaClのリニアグラジエント(0〜1M)により精製を行った。精製したAra h1画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行い、未変性Ara h1(以下NAh1と記す)とした。また、変性Ara h1(以下DAh1と記す)はNAh1を10mg量り、尿素6g、2−メルカプトエタノール(以下2−MEと記す)0.2ml、50mMのTris−HCl緩衝液(pH 8.6)1ml、蒸留水1.5mlを加え、アルミフォイルで蓋をした後、100℃で1時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。その後透析し、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥を用い、生理食塩水で0.1%のDAh1溶液及び0.1%のDAh1溶液それぞれを作製し、1ml容エッペンドルフチューブに500μlずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−20℃で凍結保管した。
供試動物として、5週齢のBALB/cマウス(日本クレア株式会社製)5尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のNAh1溶液及び0.1%のDAh1溶液がそれぞれ500μl入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。また、追加免疫は、2週間の間隔で3回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%のNAh1溶液及び0.1%のDAh1溶液がそれぞれ500μl入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。
初回あるいは追加免疫でNAh1溶液又はDAh1溶液を注射した1週間後に、各BALB/cマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に2時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の10倍希釈段を作製し、非競合法ELISAによりマウス血中の抗NAh1抗体価及び抗DAh1抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製)を用いた。
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法(1975)に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、0.1%のNAh1溶液又は0.1%のDAh1溶液それぞれ100μlを尾部静脈より注射した。静脈注射から4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ(Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。1,000rpm×10分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞(P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が10:1になるように混合し、再度1,000rpm×10分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量3,350の45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にRPMI1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地(10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地)に100μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミノプテリン、16μMのチミジンを含むHAT選択培地を加え、5×106cells/wellとなるように24ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に分注し、5%CO2下37℃で培養した。
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ELISAの一次抗体として供試し、抗NAh1抗体又はDAh1抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ELISAによりNAh1又はDAh1に対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、0.9cell/wellとなるように96ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson)に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、4週齢BALB/cマウス胸腺細胞を5×106cells/wellとなるように96ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100g/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を用いた。
モノクローナル抗体のスクリーニングは、NAh1、DAh1、あるいは落花生粗タンパク質の未変性物(以下NP−eと記す)、尿素処理(以下DP−eと記す)の4種類に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。なお、NP−eは落花生に5倍量の20mMbis-tris-propanebuffer(pH7.2)を加え、室温で2時間攪拌後遠心分離を2回行い得られた上清を透析した後、凍結乾燥したものとした。また、DP−eはNP−eを10mg量り、尿素6g、2−ME0.2ml、50mMのTris−HCl緩衝液(pH8.6)1ml、蒸留水1.5mlを加え、アルミフォイルで蓋をした後、100℃で1時間オイルバスで加熱、変性処理を行ったものとした。培養上清のNAh1、NP−e、DAh1あるいはDP−eに対する反応性を非競合法ELISAにて調べた。
Jonesら(1990)に従い、まず、BALB/cマウスに不完全フロイントアジュバントを0.2ml腹腔内に注射した。1週間後、一尾当たり5×106cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム(アマシャム ファルマシア)により精製した。
抗NAh1MAb又は抗DAh1MAbの特性を決定するために、固相法を用いた。固相法として、NAh1、DAh1、NP−e又はDP−eをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原に抗NAh1MAb又はDAh1MAbを作用させる方法を用いた。また、MAbのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotypingkit(Pharmingen)により、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)及びIgL(γ)を決定した。
精製したMAbについて、サンドイッチELISAに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。50mMの炭酸緩衝液(pH8.5)を用いて20mg/mlとなるよう調製し、DMSOに3mg/100μlで溶解したNHS−ビオチン溶液を10μl加え、撹拌後、氷冷しながら2時間静置した。その後、20mg/mlとなるようにPBSで置換した。
1)抗NAh1MAbとDAh1MAbの特性とクラス、サブクラス
NAh1に対する特異性を持つMAb7種類、及び、DAh1に対する特異性を持つMAb3種類を得た。それぞれ固相の抗原に対する特異性を表1及び表2に示した。
固相の抗原に対し陽性反応を示した各MAbをそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、NP−eおよびDP−eを検出するためのMAbの組合せを、サンドイッチELISAにおける検出感度の点から選出した。その結果、NP−eを検出できる組合せとして、プレート抗体にPAh1−2(FERM BP−10270)とビオチン抗体にPAh1−1(FERM BP−10269)、また、DP−eを検出できる組合せとしてプレート抗体にPAh1−2とビオチン抗体にPAh1−3(FERM BP−10271)の組合せを選択した(図1と図2)。
固相にPAh1−2、ビオチン化にPAh1−1およびPAh1−3を混合し、NP−e、DP−eの検出感度を確認した。それぞれのMAb濃度は50μg/mlに設定した。その結果、MAb混合系でNP−e、DP−eともに検出することが可能であった(図3と図4)。
上記1.で選択されたPAh1−1、PAh1−2およびPAh1−3の組合せにより、実際の食品中の落花生粗タンパク質を検出できるかを試みた。
1)モデル食肉製品の作製
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表3に示す配合にて各濃度の落花生粗タンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、5mmで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、75℃で30分の加熱を行った。
(モデル塩漬肉)
各モデル塩漬肉を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル1gを量り取り、PBST19gを加えホモジナイザーにて30秒攪拌した。3000rpm×20分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを0.5ml測り取り、PBSTを9.5ml加え、ELISA用サンプルとした。検量線には同様にPBSTに溶解した落花生粗タンパク質の段階希釈を用いた。
(モデル加熱製品)
各モデル加熱製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル1gを量り取り、1M尿素および0.1%2−MEを含むPBS19gを加えホモジナイザーにて30秒攪拌した。その後、100℃で1時間加熱処理を行った。冷却後3000rpm×20分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを0.5ml測り取りPBSTを9.5ml加え、ELISA用サンプルとした。検量線には同様に1M尿素および0.1% 2−ME処理を行った落花生粗タンパク質の段階希釈を用いた。また、分析用サンプルからPBSTを用いて抽出し、PBSTに溶解した落花生粗タンパク質を検量線とした尿素および2−MEを用いない場合との比較を行った。
サンドイッチELISAによるモデル食肉製品中の落花生粗タンパク質の分析について、モデル塩漬肉の結果を表4に、モデル加熱製品の結果を表5に、また、PBSTのみで抽出した結果を表6に示す。
3−1 材料及び方法
1)金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPAh1−1とPAh1−3のMAb溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500ml加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液625μlを加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1% BSA溶液でOD525=2.0になるよう調製し、1:1の割合で混合した。ガラスウール製コンジュゲートパッドに68μl/cm2となるよう塗布し、乾燥させた。
PBSで4mg/mlとなるようPAh1−2のMAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1%スキムミルクを含む10mMリン酸バッファー(pH7.5)で37℃、1時間ブロッキング後、10mMリン酸バッファー(pH7.5)で洗浄し乾燥させた。
上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドをそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。非検液としては、上記2.で調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。
メンブレン塗布MAb PAh1−2、および金コロイド標識MAb PAh1−1とPAh1−3 の組合せにより、落花生粗タンパク質は加熱、非加熱に係わらず50ppb(食品中2ppm)まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入した落花生タンパク質が対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
Claims (15)
- 未変性落花生Ara h1タンパク質及び加熱変性落花生Ara h1タンパク質を共に認識する抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体と、
未変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体、又は、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、未変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体との、
2種類の抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体を用い、食品中のAra h1を指標として分析することを特徴とする加熱又は未加熱の落花生アレルゲンの検出方法。 - 未変性落花生Ara h1タンパク質及び加熱変性落花生Ara h1タンパク質を共に認識する抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体が、未変性Ara h1タンパク質、未変性落花生粗タンパク質、尿素処理Ara h1タンパク質及び尿素処理落花生粗タンパク質を認識し;
未変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体が、未変性Ara h1タンパク質と未変性落花生粗タンパク質とを認識し、尿素処理Ara h1タンパク質と尿素処理落花生粗タンパク質とを認識しない;
加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、未変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体が、尿素処理Ara h1タンパク質と尿素処理落花生粗タンパク質とを認識し、未変性Ara h1タンパク質と未変性落花生粗タンパク質とを認識しない;
ことを特徴とする請求項1記載の落花生アレルゲンの検出方法。 - 未変性落花生Ara h1タンパク質及び加熱変性落花生Ara h1タンパク質を共に認識する抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体をプレート抗体として、
未変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体、又は、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、未変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体をビオチン抗体として用いることを特徴とする請求項1又は2記載の落花生アレルゲンの検出方法。 - 未変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ(FERM BP−10269)が産生する抗未変性Ara h1タンパク質モノクローナル抗体PAh1−1であり、未変性落花生Ara h1タンパク質及び加熱変性落花生Ara h1タンパク質を共に認識する抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ(FERM BP−10270)が産生する抗未変性Ara h1タンパク質モノクローナル抗体PAh1−2であり、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、未変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ(FERM BP−10271)が産生する抗加熱変性Ara h1タンパク質モノクローナル抗体PAh1−3であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の落花生アレルゲンの検出方法。
- サンドイッチELISAにより、未変性落花生Ara h1タンパク質又は加熱変性落花生Ara h1タンパク質を、10〜1000ppbの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の落花生アレルゲンの検出方法。
- 検体から、尿素と2−メルカプトエタノールを用いて加熱変性落花生Ara h1タンパク質を抽出することを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の落花生アレルゲンの検出方法。
- 未変性落花生Ara h1タンパク質及び加熱変性落花生Ara h1タンパク質を共に認識する抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体と、
未変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体、又は、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、未変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体との、
2種類の抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体を備え、食品中のAra h1を指標として分析することを特徴とする加熱又は未加熱の落花生アレルゲン検出用キット。 - 未変性落花生Ara h1タンパク質及び加熱変性落花生Ara h1タンパク質を共に認識する抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体が、未変性Ara h1タンパク質、未変性落花生粗タンパク質、尿素処理Ara h1タンパク質及び尿素処理落花生粗タンパク質を認識し;
未変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体が、未変性Ara h1タンパク質と未変性落花生粗タンパク質とを認識し、尿素処理Ara h1タンパク質と尿素処理落花生粗タンパク質とを認識しない;
加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、未変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体が、尿素処理Ara h1タンパク質と尿素処理落花生粗タンパク質とを認識し、未変性Ara h1タンパク質と未変性落花生粗タンパク質とを認識しない;
ことを特徴とする請求項7記載の落花生アレルゲン検出用キット。 - 未変性落花生Ara h1タンパク質及び加熱変性落花生Ara h1タンパク質を共に認識する抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体をプレート抗体として、
未変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体、又は、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、未変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体をビオチン抗体として備えることを特徴とする請求項7又は8記載の落花生アレルゲン検出用キット。 - 未変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ(FERM BP−10269)が産生する抗未変性Ara h1タンパク質モノクローナル抗体PAh1−1であり、未変性落花生Ara h1タンパク質及び加熱変性落花生Ara h1タンパク質を共に認識する抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ(FERM BP−10270)が産生する抗未変性Ara h1タンパク質モノクローナル抗体PAh1−2であり、加熱変性落花生Ara h1タンパク質を認識し、未変性落花生Ara h1タンパク質を認識しない抗Ara h1タンパク質モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ(FERM BP−10271)が産生する抗加熱変性Ara h1タンパク質モノクローナル抗体PAh1−3であることを特徴とする請求項7〜9のいずれか記載の落花生アレルゲン検出用キット。
- 異なるエピトープを認識する2種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項7〜10のいずれか記載の落花生アレルゲン検出用キット。
- 検体からのタンパク質抽出剤としての、尿素と2−メルカプトエタノールが備えられていることを特徴とする請求項7〜11のいずれか記載の落花生アレルゲン検出用キット。
- ハイブリドーマ(FERM BP−10269)が産生する抗未変性Ara h1タンパク質モノクローナル抗体PAh1−1。
- ハイブリドーマ(FERM BP−10270)が産生する抗未変性Ara h1タンパク質モノクローナル抗体PAh1−2。
- ハイブリドーマ(FERM BP−10271)が産生する抗加熱変性Ara h1タンパク質モノクローナル抗体PAh1−3。
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