KR20230165063A - 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 이용한 엔로플록사신 검출용 키트 - Google Patents

엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 이용한 엔로플록사신 검출용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 이용한 엔로플록사신 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 단일클론항체를 이용하면 농축수산물에 잔류하는 엔로플록사신을 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.

Description

엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 이용한 엔로플록사신 검출용 키트{Monoclonal Antibody Specifically Binding to Enrofloxacin and Kit for Detecting Enrofloxacin}
본 발명은 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 이용한 엔로플록사신 검출용 키트에 관한 것이다.
플루오르퀴놀론 계열의 엔로플로사신(Enrofloxacin) 항균제는, 수산물, 닭 등 축수산업에서 세균성질병 치료 및 예방을 위해 많이 사용되는 항균·항생제 중 하나이다. 항생ㆍ항균제의 오ㆍ남용은 우유, 식육, 계란, 수산물에 잔류될 위험성을 내재하고 있으며 이를 섭취하는 사람에게 흡수되어 약물에 대한 과민반응과 항생제에 대한 내성균을 유발시키는 여러가지 문제를 야기할 수 있다.
국내에서는 식품공전에 사용 가능한 동물용 의약품의 종류 및 최대잔류허용한계 등을 법으로 정하여 국민건강을 보호하는 정책을 수행하고 있으며 가축 및 수산물의 출하 시 검사 또는 도축 후 검사를 통해 잔류허용기준을 초과할 경우 출하 및 판매를 금지시키고 있다. 엔로플로사신도 다른 동물용의약품과 마찬가지로 대사산물인 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 포함하여 잔류허용기준을 0.1 mg/kg(100 ppb)로 규정하고 있다.
안심 먹거리에 대한 소비자의 불신을 최소화하기 위하여 식육, 우유, 계란 등의 농축수산물에서의　항균ㆍ항생물질　잔류　여부를 일차적으로 쉽고 간편하게 확인할 수 있는 간이검사 방법의 개발이 시급한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1484294호 (2015.01.13. 등록)
본 발명자들은 농축수산물에 잔류 가능한 항균물질인 플루오르퀴놀론(Fluroroquinolone) 계열 중 특히 엔로플록사신(Enrofloxacin)의 신속한 검출을 위하여 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 이용한 엔로플록사신 검출용 조성물 및 키트를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확립하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 엔로플록사신(Enrofloxacin)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체로부터 유래한 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 엔로플록사신 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엔로플록사신 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 엔로플록사신(Enrofloxacin)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단일클론항체는 엔로플록사신 및 엔로플록사신의 대사산물인 시프로플록사신(ciprofloxacin)에 교차반응성이 있다. 즉, 본 발명의 단일클론항체는 엔로플록사신 및 시프로플록사신에 특이적으로 결합한다.
구체적으로, 본 발명의 단일클론항체는 플루오르퀴놀론 계열의 물질 중 엔로플록사신 및 시프로플록사신에만 특이적으로 결합한다.
보다 구체적으로는 에녹사신(enoxacin), 다노플록사신(danofloxacin), 노르플록사신(norfloxacin), 옥소리닉산(oxolinic acid), 페플록사신(pefloxaicin), 오플록사신(ofloxacin), 로메플록사신(lomefloxacin), 스파플록사신(sparfloxacin), 플루메퀸(flumequine), 오르비플록사신(orbifloxacin), 마르보플록사신(marbofloxaine), 및 날리딕신 산(nalidixic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항생물질에는 특이적으로 결합하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 단일클론항체를 제조하기위하여는 엔로플록사신을 마우스 등에 면역화하고 비장을 적출한 후, 비장 세포와 마이엘로마 세포를 융합한 하이브리도마 세포를 제조하고, 이를 배양함으로써 세포외로 분비되는 단일클론항체를 대량생산하여야 한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역화에 사용된 엔로플록사신은 BSA(소 혈청 알부민, Bovine Serum Albumin), BTG(bovine thyroid globulin) 또는 KLH(구멍삿갓조개 헤모시아닌, Keyhole Limpets Hemocyanin)에 결합된 것이다. 엔로플록사신은 분자량이 359.40 g/mol로, 자체적으로는 항원성이 없는 합텐으로, BSA(소 혈청 알부민, Bovine Serum Albumin), BTG(bovine thyroid globulin) 또는 KLH(구멍삿갓조개 헤모시아닌, Keyhole Limpets Hemocyanin) 등과 같이 분자량이 큰 캐리어 단백질(carrier protein)과 결합시킨 컨쥬게이트를 항원으로 사용하여 항체를 개발하게 된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 단일클론항체는 본 발명의 실시예의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단일클론항체이다. 보다 구체적으로, 상기 단일클론항체는 하이브리도마 세포주 2C4-10에 의해 생산된 것이다.
본 발명의 실시예에 나타낸 바와 같이, 상기 하이브리도마 세포주 2C4-10는 마우스에 엔로플록사신-BTG 컨쥬게이트를 주사하여 면역화시키고, 비장세포를 마우스의 마이엘로마 세포와 융합시킴으로써 제조된 거이다.
상기 하이브리도마 세포주 2C4-10은 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC 14972BP로 2022.05.10.자로 수탁되었다.
본 명세서에서, “엔로플록사신(Enrofloxacin)”은 플루오르퀴놀론계열의 항균제로서, 소, 돼지, 개, 고양이, 가금류, 양식어류 등의 소화기, 호흡기, 요도 감염증 등 세균성 질병 치료제로 사용되고 있다. 엔로플록사신은 경구를 통해 잘 흡수되고, 모든 조직에 광범위하게 분포되며, 특히 간과 신장에 고농도로 분포하는 특징이 있다. 엔로플록사신의 체내 주요 대사산물은 시프로플록사신으로, 엔로플록사신과 함께 체내에서 독성을 유발할 수 있다. 축수산물 내 잔류 엔로플록사신의 분석법으로는, 시료에 트리클로로초산(Trichloroacetic acid) 용액을 가한 후 아세토니트릴로 잔류하고 있는 엔로플록사신과 시트로플로사신을 추출하여 LC/MS/MS로 분석한다. 액체크로마토그래피는 자외부검출기(UV) 278nm를 사용하고, 질량분석기의 조건은 전자 분무 이온화 (Electrospray ionization: ESI)를 조건으로 한다. 정량한계는 축수산물에서는 0.5 ppb, 벌꿀에서는 5 ppb이다.
본 명세서에서, 용어 "항체(antibody)"는 면역글로불린(immunoglobulin) 으로도 알려져 있는 항원(antigen)에 특이적으로 결합하는 넓은 범위의 단백질 또는 이의 단편을 의미하며, 보다 구체적으로는 완전한 형태의 항체뿐만 아니라, 항체의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)를 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 명세서에서, 용어 “항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 scFv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab(fragment antigen binding)는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chin variable fragment, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)).
본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3) 및 경쇄(L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH에서 다음의 순서로 나타난다:
FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-HCDR1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-HCDR2-FRH3-HCDR3-FRH4;
또한, HVR 및 FR서열은 일반적으로 VL(또는 Vk)에서 다음의 순서로 나타난다:
FRL1(Framework region 1 of Light chain)-LCDR1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-LCDR2-FRL3-LCDR3-FRL4.
또한 본 명세서에서 용어, “인간 항체(human antibody)” 또는 “인간화 항체(humanized antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다.
본 명세서에서, 용어 "단일클론항체(monoclonal antibody)"란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 단일클론항체는 단세포군 항체, 모노클로날 항체 또는 단클론 항체라고 불리기도 한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 배양에 의해 생산되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
상기한 하이브리도마가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 단일클론항체가 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M이하의 평형 해리 상수 (예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 “친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체 또는 단일클론항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 X와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 엔로플록사신 또는 시프로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체로부터 유래한 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항원 결합 단편의 의미는 상술한 정의에 나타낸 의미와 같으며, 구체적으로는 이의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 항원 결합 단편으로서 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 scFv 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 엔로플록사신 또는 시프로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 2C4-10를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 하이브리도마 세포는 마우스 유래의 골수종세포 및 마우스 유래의 비장세포의 융합에 의하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 일 양태에 따른 단일클론항체, 또는 이로부터유래한 항원 결합 단편을 포함하는 엔로플록사신 또는 시프로플록사신 검출용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 상기 하이브리도마 세포주 2C4-10에 의하여 생산되는, 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 엔로플록사신 및/또는 시프로플록사신에 대해 형성된 항원-항체 복합체를 검출함으로써 엔로플록사신 및/또는 시프로플록사신을 면역학적으로 검출할 수 있다.
상기 설명한 바와 같이 본 발명의 단일클론항체는 엔로플록사신 및/또는 시프로플록사신에 특이적으로 면역반응성을 나타내어 엔로플록사신 및/또는 시프로플록사신을 용이하게 검출할 수 있으므로, 이를 적용하면 농축수산물에 잔류하는 엔로플록사신 및/또는 시프로플록사신을 검출할 수 있는 키트가 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 엔로플록사신 또는 시프로플롯사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 엔로플록사신 또는 시프로플록사신 검출용 키트를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 엔로플록사신 및/또는 시프로플록사신과 이를 인지하는 본 발명의 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 엔로플록사신 또는 시프로플록사신 검출용 조성물에는 항체의 활성 유지 및 항원-항체 결합을 확인하기 위한 보조물질 등 통상의 잔류 약물 검출용 조성물에 포함될 수 있는 첨가물이 더 포함될 수 있다.
본 발명의 엔로플록사신 또는 시프로플록사신 검출용 조성물에는 검사대상의 시료를 채취 또는 진단 시약을 적용하기 위한 도구, 항원-항체 결합을 확인하기 위한 시약 또는 장치 등 항체를 사용하여 생물학적 시료로부터 엔로플록사신 또는 시프로플록사신의 존재유무를 확인하는 통상의 진단용 조성물에 포함될 수 있는 도구, 장치 또는 시약이 더 포함될 수 있다.
상기 진단용 조성물에 포함될 수 있는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 엔로플록사신-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 엔로플록사신의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단일클론항체는 본 발명의 실시예의 하이브리도마 세포주 2C4-10에 의해 생산된 단일클론항체이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단일클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 엔로플록사신 및/또는 시프로플록사신을 검출할 수 있다.
상기 엔로플록사신은 그 농도가 식품의 기준 및 규격(식품의약품안전처고시 제2022-16호)에 따른 식품 중 동물용의약품의 잔류허용기준 이상인 경우에 본 발명의 단일클론항체로 검출이 가능하며, 엔로플록사신의 잔류허용기준은 소, 돼지, 가금류의 근육에서 엔로플록사신 및 그 대사산물인 시프로플록사신을 합하여 0.1 mg/kg (100 ppb)이하이며, 식용란에서는 엔로플록사신이 검출되지 않아야 한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엔로플록사신과 항체의 복합체를 검출하기 위하여는 여러가지 표지 물질을 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검출 표지 물질로서 사용되는 바람직한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 β-락타마제가 있으며, 바람직한 형광물로는 양자점, 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트가 있으며, 바람직한 리간드로는 바이오틴 유도체가 있고, 바람직한 발광물로는 아크리디늄 에스테르 또는 이소루미놀 유도체가 있으며, 바람직한 미소입자로는 콜로이드 금 또는 착색된 라텍스가 있고, 바람직한 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 또는 125I-볼톤(Bolton) 헌터(Hunter) 시약이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 바람직하게는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 효소면역흡착법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단일클론항체는 검출 표지물질과 컨쥬게이션될 수 있으며, 검출 표지물질과 컨쥬게이션되지 않은 경우는 이들 단일클론항체 또는 이의 절편을 포획할 수 있고, 검출 표지물질을 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “시료 샘플”은 엔로플록사신을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 대상물을 의미하며, 액체, 토양, 공기, 식육, 원유, 계란 등의 식품, 폐기물, 동물 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 분변 또는 뇨로부터 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에서 채취될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 동물은 말, 돼지, 소, 개 등의 가축과, 닭, 오리, 칠면조 등의 가금류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 동물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 엔로플록사신 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엔로플록사신 검출용 키트는 ELISA법을 위한 것일 수 있다. 구체적으로, 표면에 항원이 고정 또는 접합되어 있는 고체상 지지체를 포함하는 기질; 및 전술한 단일클론항체를 포함하는 부분을 포함하는 것일 수 있다.
상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 전술한 단일클론항체를 포함하는 부분은 항체-콜로이드 골드를 전처리하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엔로플록사신 검출용 키트는 면역 반응 완료 후 시료 내 반응하지 않은 물질들을 흡수하는 부분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엔로플록사신 검출용 키트는 시료를 흡수하는 부분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엔로플록사신 검출용 키트는 측방향 유동 분석(lateral flow assy) 키트일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 엔로플록사신 검출용 키트는 상술한 본 발명의 엔로플록사신 검출용 조성물 및 엔로플록사신 검출방법을 이용하는 발명인 바, 이들과 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 생략된다.
본 발명은 엔로플록사신에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용한 엔로플록사신 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 단일클론항체를 이용하면 농축수산물에 잔류하는 엔로플록사신을 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.
도 1은 엔로플록사신과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 개발하기 위하여 제조한 엔로플록사신-BTG 컨쥬게이트와 엔로플록사신-BSA 컨쥬게이트를 나타낸 것이다.
도 2는 엔로플록사신-BTG 컨쥬게이트로 면역화된 마우스의 혈청 역가를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 단일클론항체의 다른 항균ㆍ항생물질과의 교차반응 시험에 이용되는 경쟁적 효소결합면역측정법(Competitive ELISA)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 단일클론항체의 다른 플루오르퀴놀론계열, 또는 타계열의 항균ㆍ항생물질과의 교차반응 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 단일클론항체 및 면역크로마토그래피 방법을 이용하여 엔로플록사신을 검출하는 과정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 엔로플록사신 검출용 측방향 유동 분석(lateral flow assy) 키트의 구성을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 단일클론항체의 엔로플록사신의 검출한계를 결정한 결과를 나타낸 것이다(검출한계 3 ppb).
도 8은 본 발명의 단일클론항체의 시프로플록사신의 검출한계를 결정한 결과를 나타낸 것이다(검출한계 15 ppb).
도 9는 본 발명의 엔로플록사신 검출용 키트의 플루오로퀴놀론계열의 항균ㆍ항생물질과의 교차반응 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 엔로플록사신 검출용 키트의 다른 계열의 항균ㆍ항생물질과의 교차반응 시험 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 엔로플록사신 항원의 제조
엔로플록사신과 같이 분자량이 작은 물질들은 자체적으로 항원성이 없기 때문에 KLH(구멍삿갓조개 헤모시아닌, Keyhole Limpets Hemocyanin), BTG(Bovine Thyroid globulin), BSA(소 혈청 알부민, Bovine Serum Albumin)와 같은 분자량이 큰 캐리어 단백질(carrier protein)과 결합시킨 컨쥬게이트(conjugate)로 면역하여 항체를 개발하게 된다. 본 발명자들은 엔로플로사신과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 개발하기 위하여 엔로플록사신-BTG 컨쥬게이트를 제조하였다(도 1 참조).
실시예 2: 마우스 면역화, 클론 2C4-10 선별, 및 단일클론항체의 제작
2-1. 마우스 면역화
엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 개발하였다. 구체적으로 하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화된 마우스를 얻기 위해 실시예 1에서 제조한 엔로플록사신-BTG 컨쥬게이트를 면역원으로 이용하여 6 주령 마우스 2 마리에 1차 접종(20μg Enrofloxacin-BTG+Freund's complete adjuvant)하였다. 2 주 후 2차 접종(20μg Enrofloxacin-BTG+Freund's complete adjuvant) 후 채혈하여 ELISA 혈청 역가를 테스트하였고, 또다시 2 주 후 3차 접종(20 μg Enrofloxacin-BTG+Freund's complete adjuvant) 후 채혈하여 ELISA 혈청 역가를 테스트하였다. 마지막으로 10 μg Enrofloxacin-BTG 포함 PBS 용액으로 부스팅을 하고 채혈하여 ELISA 혈청 역가를 테스트하였다. 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이 Mouse 1이 Mouse 2보다 더 혈청 역가가 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 마이엘로마(골수종) 세포의 배양
먼저 마이엘로마(골수종, myeloma) 세포 스탁을 세포융합 72 시간 전에 배양하여 준비하였다. 마이엘로마 세포를 수거하고 RPMI 배지에서 재현탁하여 2 x 107 cells로 준비하였다.
또한, 상기 실시예 2-1에서 1번 마우스(Mouse 1)의 비장을 적출하여 20 mL RPMI가 들어있는 100ф petri dish에 넣고 세척하였다. 비장을 100 메쉬 체(100-mesh sieve)에 옮겨 분쇄하였다. 2,500 rpm x 5 min.간 원심분리를 하고, 30 mL RBC lysis buffer로 부유시킨 후 얼음에서 3분 동안 배양하였다. 마지막으로 2,500 x 5 min.간 원심분리 후 생성된 펠렛(pellet)을 40 mL RPMI에 부유시켰다.
2-3. 하이브리도마 세포 제작(비장 세포와 마이엘로마 세포의 융합)
상기에서 준비한 마이엘로마 세포와 1번 마우스의 비장세포를 50 mL conical tube에 넣고 잘 섞어준 후, 1,800 rpm x 5min.간 원심분리하였다. 펠렛을 RPMI 배지로 부유시켜 다시 원심분리하였다. 가능한 한 모든 상층액을 완전히 제거하고 펠렛을 부드럽게 태핑(tapping) 하였다. 1 mL 50% PEG4000을 천천히 1분동안 첨가하였다. 1,800 rpm x 3min.간 원심분리한 후, 30 mL RPMI을 천천히 첨가한 후 실온에서 5분동안 반응시켰다. 1,800rpm x 7min.간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 37℃에서 3분 동안 펠렛을 방치하였다. 30mL의 RPMI를 천천히 첨가하면서 펠렛을 부유시켰다. 1,800 rpm x 7min. 원심분리한 후, 상층을 제거하고 37℃에서 3분동안 펠렛을 방치하였다. 여기에 33 mL의 HAT media를 부드럽게 흔들면서 첨가하였다. 37℃에서 60 min.간 배양한 후 96-well plate에 well 당 100 μl씩을 넣고 배양하였다. 5일 후, HAT를 100 μl씩 첨가하여 4일간 추가 배양하였다. 2-3일마다 HAT media의 절반을 교체해주었으며, 충분한 세포주의 집락(colony)이 보이면 ELISA 방법으로 항체가를 측정하였다. 그 결과, 가장 항체가가 높았던 본 발명의 클론 2C4-10 을 선별하였다.
2-4. 선별 클론 2C4-10의 복수 생산 및 단일클론항체의 정제
2C4-10 하이브리도마 세포로부터 복수(ascite)를 생산하기 위해, 8주령 수컷 Balb/c 마우스에 먼저 면역보조제(Pristane, sigma, P2870) 500 μl씩을 복강에 주입하였다. 7일 후, 준비한 하이브리도마 세포를 20 mM PBS 200 μl에 현탁하여 복강 주입하고, 마우스의 복강이 부풀어질 때까지 유지한 후 주사기로 마우스의 복강에서 복수를 회수하였다. 회수한 복수는 1,500g x 10min.간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 복수로부터 Protein G affinity bead를 이용하여 IgG를 정제하였다. 280 nm에서 흡광도 측정하여 생산된 단일클론항체의 양을 정량한 후 -20℃에 보관하며 사용하였다.
실시예 3: 단일클론항체의 교차반응 시험
경쟁적 효소결합면역 측정법(Competitive ELISA)를 이용하여 퀴놀론 계열과 다른 항균ㆍ항생물질에 대한 본 발명의 2C4-10 클론으로부터 생산한 단일클론항체의 교차반응성을 확인하였다.
엔로플록사신의 잔류허용기준인 100 ppb를 기준으로 교차반응을 확인하였다. 교차반응 시험에 사용된 항생제는 엔로플록사신(enrofloxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 에녹사신(enoxacin), 다노플록사신(danofloxacin), 노르플록사신(norfloxacin), 옥소리닉산(oxolinic acid), 페플록사신(pefloxaicin), 오플록사신(ofloxacin), 로메플록사신(lomefloxacin), 스파플록사신(sparfloxacin), 플루메퀸(flumequine), 오르비플록사신(orbifloxacin), 마르보플록사신(marbofloxaine), 날리딕신 산(nalidixic acid), 암피실린(ampicillin), 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline), 및 설파디메톡신(Sulfadimethoxine) 이었다.
교차반응의 정도는 음성 대조군(Negative)과 비교하여 흡광도가 억제되는 정도를 Inhibition %로 표시하였다.
Inhibition %의 계산식은 다음과 같았다.
식
Inhibition % = (1-sample OD/Negative OD) x 100%
교차반응 시험 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 개발된 단일클론항체는 엔로플록사신 및 시프로플록사신에 특이적으로 결합하고 다른 종류의 항균ㆍ항생물질과는 반응하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용한 측방향 유동 분석(lateral flow assy) 키트의 제작 및 성능 평가
4-1. 엔로플록사신 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용한 측방향 유동 분석(lateral flow assy) 키트의 제작
상기 실시예 2에서 제작된 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용하여 현장에서 바로 검사가 가능한 측방향 유동 분석(lateral flow assy) 키트를 제작하였다. 키트는 면역크로마토그래피 방법을 이용한 것으로, 그 검출 과정의 모식도는 도 5에 나타내었다.
키트는 i) 샘플 패드(Sample pad), ii) 항체-골드 패드(Gold conjugate pad), iii) 검사선(test line)과 대조선(control line)을 포함하고 있는 나이트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane) 및 iv) 흡습 패드(Absorbent pad)로 이루어지는 4 개의 부분을 포함하였으며, 각 부분에 해당하는 구성의 전처리 및 조립을 통하여 제작하였다(도 6).
i) 샘플 패드는 측정하고자 하는 시료를 흡수하는 부분으로서, 셀룰로스 소재로 된 패드를 사용하였다.
ii) 나이트로셀룰로스 멤브레인의 검사선(Test line)에는 엔로플록사신-BTG 컨쥬게이트(enrofloxacin-BTG conjugate), 대조선(control line)에는 염소 항-마우스 IgG(goat anti-mouse IgG)를 분주하고, 25℃에서 24 시간 동안 건조하여 준비하였다.
iii) 항체-골드 패드는 원유(原乳), 식육(食肉), 혈액, 계란 등에 잔류하는 엔로플록사신과 본원발명의 단일클론항체 간의 항원-항체 면역반응이 일어나는 부분으로, 폴리에스테르 패드에 다음과 같이 항체-콜로이드 골드를 전처리하여 제조하였다.
염화 금 용액(Gold chloride solution)에 Na-citrate를 첨가하여 염화 금을 환원시켜 입자 크기가 약 40 nm인 금 콜로이드(Colloidal gold)를 제조하였다. 제조된 금 콜로이드에 정제한 엔로플록사신-특이적 단일클론항체를 5 μg/ml 첨가한 후 실온에서 1 시간 동안 진탕 반응시켰다. 반응이 완료되면 금 입자를 세척하고 흡광도계를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하여 정량한 후, 보존제를 첨가하고 폴리에스테르섬유에 균질하게 흡수시키고 상대습도 20% 이하에서 4 시간 이상 건조하였다.
iv) 흡습 패드는 면역 반응 완료 후 시료 내 반응하지 않은 물질들을 흡수하고, 이에 따라 시험 물질을 포함한 시료 용액이 모세관 현상에 의해 이동할 수 있도록 하는 부분으로, 나이트로셀룰로스 멤브레인 상단에 부착하였다.
i) 내지 iv)의 제조된 구성물을 플라스틱 카드 위에 중첩하여 부착하는 라미네이션을 수행하였다. 멤브레인 코팅이 완료된 플라스틱 카드의 이중테이프 부분을 떼어내어 항체 코팅이 완료된 나이트로셀룰로스 멤브레인 아래쪽에 2 mm 겹치도록 항체-골드 패드를, 항체-골드 패드 아래쪽에 2 mm 겹치도록 샘플패드를, 나이트로셀룰로스 멤브레인 위쪽에 2 mm 겹치도록 흡습 패드를 차례대로 놓고, 검사용 키트의 내부 스트립 구조에 맞도록 각 구성물을 중첩하여 부착하는 어셈블리 과정을 진행하였다. 어셈블리 된 카드를 다시 손으로 살짝 눌러주어 빈틈이 없게 하였다.
4-2. 제조된 엔로플록사신 검출용 키트의 성능 평가
1) 시험 방법, 결과 판독 및 검출한계의 결정
제조된 엔로플록사신 검출용 키트의 성능을 평가하기 위한 시험을 실시하였다. 소, 돼지, 닭 등의 근육 1g에서 육즙을 채취한 후, 12000 rpm x 15min.간 원심분리를 하였다. 상층액을 희석용액과 1:1로 희석한 후, 120 μl을 키트에 점적하였다. 시료를 점적한 키트는 40℃에서 10 분간 반응시킨 후, 육안 또는 리더기를 이용하여 판독하였다.
본 실시예의 키트는 육안으로 보았을 때 엔로플록사신 양성인 경우 대조선이 검사선보다 진하게 표시되며, 엔로플록사신 음성인 경우 검사선이 대조선보다 진하게 표시된다. 육안으로 판독이 어려운 경우 리더기를 이용하여 판독하며, Ratio가 1 이상이면 양성(positive), 1 미만이면 음성(negative)으로 판독하였다.
엔로플록사신을 농도 별로 다음과 같이 스파이킹(spiking)하고 반복적으로 시험하여 100% 양성으로 판독되는 최소 농도를 검출한계로 결정하였다. 육류 샘플에서 엔로플록사신의 검출한계(Limit of Detection, LOD)는 3 ppb, 시프로플록사신은 15 ppb로 결정되었다(표 1 및 표 2, 및 도 7 및 도 8).
엔로플록사신의 검출한계 결정, 리더기 판독 결과
농도(ppb) 시그널 Ratio 판정
100 1.23 1.68 positive
1.32 1.67 positive
1.74 1.66 positive
1.78 1.66 positive
10 1.17 1.68 positive
1.47 1.67 positive
3.1 1.62 positive
3.43 1.61 positive
5 5.35 1.54 positive
6.26 1.51 positive
5.4 1.54 positive
7.25 1.48 positive
3 19.18 1.09 positive
13.16 1.29 positive
13.5 1.28 positive
15.64 1.21 positive
2 20.41 1.05 positive
22.76 0.98 negative
24.2 0.93 negative
25.59 0.88 negative
1 41.05 0.38 negative
36.61 0.52 negative
34.62 0.59 negative
39.16 0.44 negative
0 65.31 0 negative
69.65 0 negative
61.18 0 negative
70.56 0 negative
시프로플록사신의 검출한계 결정, 리더기 판독 결과
농도(ppb) 시그널 Ratio 판정
100 0.77 1.69 positive
0.64 1.7 positive
2.18 1.65 positive
2.35 1.64 positive
20 8.25 1.45 positive
9.06 1.42 positive
8.4 1.44 positive
9.11 1.42 positive
15 19.69 1.08 positive
10.17 1.39 positive
14.89 1.23 positive
18.2 1.12 positive
10 27.12 0.83 negative
29.1 0.7 negative
29.09 0.77 negative
27.79 0.81 negative
0 62.98 0 negative
66.76 0 negative
60.61 0 negative
64.48 0 negative
2) 플루오르퀴놀론계열의 타 항생제와의 교차반응 확인
본 발명자들은 제조된 엔로플록사신/시프로플록사신 검출용 키트가 플루오르퀴놀론계열의 타 항균ㆍ항생물질과 교차반응하는지 여부를 시험하였다.
하기 표 3 및 도 9에 나타난 바와 같이, 제조된 키트는 엔로플록사신과 시프로플록사신 외에는 교차반응이 거의 없거나 약한 것으로 확인되어, 다양한 축/수산물에서 엔로플록사신과 그 대사산물인 시프로플록사신의 검출에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
3) 타 계열의 항생제와의 교차반응 확인
본 발명자들은 또한 제조된 엔로플록사신/시프로플록사신 검출용 키트가 플루오르퀴놀론계열이 아닌 타 계열의 항균ㆍ항생물질과 교차반응하는지 여부를 시험하였다. 결과는 표 4 및 도 10에 나타내었다.
상기 표 4 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 키트는 동물용 의약품으로 사용되는 대표적인 항균ㆍ항생물질인 암피실린(Ampicillin), 설파티아졸(Sulfathiazole), 및 테트라사이클린(Tetracycline)과는 교차반응이 없어 엔로플록사신과 시프로플록사신만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
종합하면, 본 발명자들이 개발한 클론 2C4-10 하이브리도마 세포에서 생산하는 단일클론 항체는 플루오르퀴놀론계열의 항생제 중에서도, 엔로플록사신(enrofloxacin)과 그 대사산물인 시프로플록사신(ciprofloxacin)에만 특이적으로 결합하는 항체임을 확인하였고, 면역크로마토그래피(Immunochromatography) 등 면역분석법(immunoassay)에 적용하여 축수산물 등에서 우수한 민감도와 특이도를 가지는 검출키트에 활용이 가능한 항체를 생산하는 세포주임을 확인하였다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC14972BP 20220510

Claims (7)

  1. 수탁번호 KCTC 14972BP로 기탁된 하이브리도마 세포주 2C4-10에 의하여 생산된, 엔로플록사신(enrofloxacin)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 플루오르퀴놀론 계열의 물질 중 엔로플록사신 및 시프로플록사신(ciprofloxacin)에만 특이적으로 결합하는 것인, 단일클론항체.
  3. 제1항의 단일클론항체로부터 유래한 엔로플록사신 또는 시프로플록사신에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 또는 제2항의 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 14972BP로 기탁된 하이브리도마 세포주 2C4-10.
  5. 제1항 또는 제2항의 단일클론항체, 또는 제3항의 항원 결합 단편을 포함하는 엔로플록사신 또는 시프로플록사신 검출용 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항의 단일클론항체, 또는 제3항의 항원 결합 단편을 포함하는 엔로플록사신 또는 시프로플록사신 검출용 키트.
  7. 제1항 또는 제2항의 단일클론항체, 또는 제3항의 항원 결합 단편을 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 엔로플록사신-항체 복합체, 엔로플록사신-항원 결합 단편 복합체, 시프로플록사신-항체 복합체, 또는 시프로플록사신-항원 결합 단편 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 엔로플록사신 또는 시프로플록사신의 검출방법.
KR1020220064988A 2022-05-26 2022-05-26 엔로플록사신에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 이용한 엔로플록사신 검출용 키트 KR20230165063A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101484294B1 (ko) 2012-11-30 2015-01-21 대한민국 퀴놀론계 항균제 특이적 단일클론항체

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KR101484294B1 (ko) 2012-11-30 2015-01-21 대한민국 퀴놀론계 항균제 특이적 단일클론항체

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