CN104267189B - 牛奶中人α-乳清蛋白筛查试纸条及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于可食动物产品转基因成分检测领域，具体涉及一种牛奶中α-乳清蛋白筛查试纸条及制备方法与应用，本发明与免疫胶体金技术有关。公开了一种用于快速检测转人α-乳清蛋白基因牛奶的免疫胶体金试纸条，在试纸条的PVC背衬上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；结合垫上包被有抗hLALBA抗体-胶体金标记物，通过hLALBA免疫小鼠制备得到杂交瘤细胞株LB-001(保藏号为CCTCC？NO：C2014157)，利用腹水法大量制得单抗；在硝酸纤维素膜上分别包被有hLALBA蛋白构成的检测线和山羊抗兔IgG的质控线。本发明的试纸条特异性强，操作简便，检测快速。

Description

牛奶中人α-乳清蛋白筛查试纸条及制备方法与应用

技术领域

本发明属于牛奶转基因成分的检测技术领域，具体涉及一种转人α-乳清蛋白筛查试纸条及其制备方法。本发明与免疫胶体金检测技术有关。

背景技术

转基因动物及转基因动物产品以其诱人的经济前景，显示出强大的生命力，其市场化将是不可扭转的时代趋势。然而，鉴于生物安全问题，转基因动物生产的各个环节都需受到严格的控制。因此，一套健全、科学、规范的安全评价体系是必不可少的。其中，可靠、准确的转基因检测方法是安全评价体系中的重环节。

在本发明申请以前，有资料报道中国农业大学已经成功研制出了一批转人α-乳清蛋白转基因奶牛及其他一些转基因奶牛。这标志着我国转基因奶牛新品种培育和动物乳腺生物反应器技术达到了国际先进水平，鉴于转人α-乳清蛋白基因奶牛生产技术的成熟以及其产品市场化的趋势，建立一种快速、简便的检测人α-乳清蛋白的方法，有很重要的必要性和紧迫性。

目前对于转基因成分的检测可从外源基因的核酸和蛋白质两个水平进行，从蛋白质水平进行转基因成分检测，具有必要性和可行性，这是因为：只有对目的蛋白质进行检测，才能反映外源基因的最终表达情况；对于生物反应器制得的蛋白产品，必须对蛋白质进行定性、定量以及生物活性分析；对蛋白质进行检测，蛋白质样品制样较核酸简单。诸多的蛋白质检测方法，大致可以分为4类：(1)基于蛋白质的物理化学特性的检测，如双向电泳、质谱、色谱等；(2)基于核酸与蛋白质之间的互作的检测，如邻位连接技术，是一种依赖于适配子(aptamer，能够特异地识别并结合蛋白质的DNA或RNA的总称)的检测技术(MatsG.,SimonF.,MichaelT.,etal.Asenseofcloseness:proteindetectionbyproximityligation[J].CurrentOpinioninBiotechnology,2003,14:82-86；SimonF.,MatsG.,JonasJ.,etal.Proteindetectionusingproximity-dependentDNAligationassays[J].Nature,2002,20:473-477)；(3)基于蛋白质与蛋白质之间的互作的检测，如常用的免疫检测方法，包括westernblot，dotblot(不需专门的仪器，但是操作繁琐，不适合做批量检测)，ELISA(灵敏度高、特异性强、简单快速、稳定性好、便于自动化检测等特点，应用性强)，以及免疫组织化学染色法(具有特异性强、灵敏度高、定位准确的特点，便于进行功能研究，但是操作复杂、假阳性率高)等；(4)将对蛋白质的检测转化为核酸的检测，如Bio-barcodeassay，灵敏度高(KhanS,KleinW,MirkinCA,etal.Fluorescentandscanometricultrasensitivedetectiontechnologieswiththebio-barcodeassayforalzheimer’sdisease[J].Nanoscape,2005,2(1):7-15)。上述提到的这些方法都比较费时费力，而且需要专业技术人员和专门的仪器设备，基本上只能在实验室完成，不便于基层推广。

胶体金免疫层析(gold-immunochromatographyassayGICA)是20世纪80年代发展起来的一项新的免疫分析方式，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。依据胶体金免疫层析技术，在转基因植物检测中，已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测试纸条。

鉴于转基因动物及其产品的应用前景，研发快速、灵敏、准确、安全、便捷的转基因动物及其产品的检测方法，为转基因动物安全评价及转基因动物的监测和监控提供技术支撑，对于转基因动物及其产品的安全管理具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种转人α-乳清蛋白筛查试纸条及其制备方法，本发明能准确快速检测出转基因牛奶中转人α-乳清蛋白(hLALBA)，不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的筛查牛奶中转人α-乳清蛋白基因的方法，本发明的方法同时也为转基因动物及其产品安全评价和管理提供借鉴。

本发明的总体技术路线图见图1所示。

本发明的技术方案如下：

一种检测牛奶中人α-乳清蛋白(hLALBA)的免疫胶体金筛查试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬。在所述的塑料衬板上依次搭接粘帖的样品垫、金标垫、层析膜及吸水纸；所述的金标垫上包被有抗人α-乳清蛋白单克隆抗体，分泌该抗人α-乳清蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株LB-001，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCCNO：C2014157)；所述的层析膜上分别包被有人α-乳清蛋白的检测线(T线)和山羊抗兔IgG的质控线(C线)；

上述人α-乳清蛋白(hLALBA)购自Sigma公司，货号：L7269；山羊抗兔IgG购自Sigma公司，货号：91618；

申请人提供了一种人α-乳清蛋白筛查试纸条的制备方法，其包括如下步骤：

(1)抗hLALBA单克隆抗体的制备；

(2)用柠檬酸钠与氯金酸反应制备胶体金；

(3)将将保藏号为CCTCCNO：C2014157的杂交瘤细胞株LB-001分泌的抗人α-乳清蛋白单克隆抗体加入到步骤(1)制备的胶体金中，得到抗人α-乳清蛋白抗体-胶体金标记物；

(4)将抗人α-乳清蛋白抗体-胶体金标记物包被到金标垫上；

(5)将人α-乳清蛋白标准品包被到层析膜上构成检测线；并将山羊抗兔IgG包被到层析膜上构成质控线；

(6)在所述的塑料衬板上依次搭接粘帖的样品垫、金标垫、层析膜及吸水纸，得到所述的检测牛奶中人α-乳清蛋白的免疫胶体金试纸条。

本发明的试纸条是由样品垫、金标垫、层析膜、吸水纸按图示的顺序依次粘附在塑料衬板上组装而成的。金标上包被有本发明制备的抗hLALBA抗体－胶体金标记物，层析膜上包被有检测线和质控线，其中检测线(T线)为购买的hLALBA蛋白标准品，质控线(C线)为自制的山羊抗兔IgG。所述样品垫、金标垫、层析膜、吸水纸、塑料衬板均购自Millipore公司。

本发明试纸条检测原理是：检测牛奶时，将牛奶滴加到样品垫上，通过毛细作用牛奶就会向吸水垫一端渗透，当奶液经过金标垫时其中的人α-乳清蛋白就会与有色颗粒标记的抗体起反应，形成抗原-抗体复合物，使得样品中的人α-乳清蛋白间接地被有色颗粒标记；此后，该抗原-抗体复合物会继续向吸水纸一端流动，经过检测线(T线)时，由于有色颗粒标记的抗体已经与样品中的hLALBA结合，便失去了与检测线处包被的人α-乳清蛋白结合的能力，因此就不会出现红色的检测线；当溶液继续向前流动，到达质控线(C线)时，有色颗粒标记的抗体被包被的相应的抗体捕获，因此就会形成一条红色的质控线，检测结果判定为阳性，即表示牛奶样品中含有人α-乳清蛋白成分；如果样品中没有人α-乳清蛋白蛋白成分，则金标垫上的有色颗粒标记的抗体在层析膜上迁移的过程中，会顺利地先后与检测线处的人α-乳清蛋白和质控线处相应的抗体结合，分别出现红色的检测线(T线)和质控线(C线)，则判定检测结果为阴性，即表示受检的牛奶样品中不存在人α-乳清蛋白蛋白；如果在检测的过程中质控线没有出现，则表示该试纸条失效(见图2)。

与现有的转基因动物外源蛋白检测技术相比，本发明具有如下的优点：

1.本发明的检测hLALBA的免疫胶体金试纸条，运用了层析技术，使免疫反应在层析膜上进行，整个过程迅速，耗时少。

2.本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低。

3.本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。

4.本发明的检测试纸条储存方便，对温度要求不高。

5.本发明采用胶体金标记特异的人α-乳清蛋白抗体，不受牛奶中其它蛋白的干扰，特异性好。

综上所述，用本发明对转基因牛奶中的人α-乳清蛋白进行检测，具有反应迅速、特异性好、无需其它的任何仪器设备和专业的技术人员，为基层检测机构对转基因牛奶进行监控提供了适用的方法和工具。

附图说明

图1：本发明的总体技术路线图。

图2：本发明检测试纸条结果判定示意图。

图3：本发明检测试纸条对牛奶样品的检测结果。图3标记说明，1：为PBS溶液，2：为非转基因牛奶，3-5：为转基因牛奶样品。

具体实施方式

实施例1(制备实施例)

检测hLALBA的免疫胶体金试纸条的制备方法

1.人α-乳清蛋白抗体的获得

(1)免疫小鼠：选用4周龄雌性Balb/c小鼠(购自湖北省预防医学科学院实验动物中心)，首次免疫将人α-乳清蛋白(购于Sigma公司，货号：L7269)与弗氏完全佐剂混合，采用颈背部皮下注射；3周后进行二免，蛋白与弗氏不完全佐剂融合后进行腹腔注射；3周后进行加强免疫。首免和二免后分别采用断尾采血进行血液抗体效价检测；

(2)细胞融合：无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液，将准备好的SP2/0瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇，接种到96孔板中；

(3)筛选：接种5天后，加入HAT培养基，7-10天后，加入HT培养基；

(4)杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化：选择有细胞生长的孔进行多次ELISA抗体效价检测，然后根据计算的细胞密度对其进行稀释，稀释至96孔板每个孔内只有一个细胞的程度，进行克隆，保证每个孔内的细胞为一个单细胞分裂而来；

(5)单克隆抗体的大量制备：采用小鼠腹水法制备抗体。选用4-6周龄雌性Balb/c小鼠，先注射液体石蜡，一周后，注射杂交瘤细胞，10天左右后，可见小鼠腹部明显胀大，可取腹水。然后进行纯化，即得到纯化后的单克隆抗体。

免疫小鼠，取免疫细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，进行筛选，得到阳性杂交瘤细胞株LB-001。将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，得到抗人α-乳清蛋白的单克隆抗体。

申请人将所得的杂交瘤细胞株LB-001于2014年8月13日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为：CCTCCNO：C2014157。

2.抗人α-乳清蛋白抗体-胶体金标记物的制备

⑴胶体金的制备

本发明采用柠檬酸三钠还原的方法，制得金颗粒直径为40nm的胶体金溶液。具体步骤为：将200mL0.01％的HCl4溶液煮沸后，快速向其中加入2.2mL1％的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸至溶液颜色变为稳定的绛红色，冷却至室温后4℃储存备用。

⑵金标抗体的制备

向每毫升的胶体金溶液中加入13μL0.01mol/L的K₂CO₃溶液调节pH，以及8μg的人α-乳清蛋白单克隆抗体，稳定后加入10％的牛血清白蛋白(BSA)溶液，使其终浓度为1％；缓慢搅拌30min后，在11000rpm离心40min去上清，加入等体积的硼酸缓冲液(硼酸0.1237g,中文名称PEG-200001g,用三馏水定容至1000ml，调pH至9.0)洗涤两次，最后加入1/20体积的硼酸缓冲液，将沉淀吹起，于4℃下储存备用。

3.结合垫的制备

将结合垫浸泡于0.01MpH7.4磷酸缓冲液(20gBSA，25g蔗糖，3g聚乙烯吡咯烷酮(PVPK-30)，0.2gNaN₃NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KH₂PO₄0.2g，用蒸馏水定容至1000ml)中30min后，于37℃烘干。然后用点膜仪(BioDot公司产品)将制备好的抗hLALBA抗体－胶体金标记物均匀包被在结合垫上，每厘米结合垫包被6μL人α-乳清蛋白抗体－胶体金标记物，于真空干燥，真空封装，置4℃备用。

4.样品垫的处理

将样品垫浸泡于0.01MpH7.4磷酸缓冲液(20gBSA，25g蔗糖，3gPVPK-30，0.2gNaN₃NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KH₂PO₄0.2g，用蒸馏水定容至1000ml)中30min后，于37℃烘干，真空封装，置4℃备用。

5.硝酸纤维素膜的包被

用0.01MpH7.4PBS缓冲液(NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KH₂PO₄0.2g，用蒸馏水定容至1000ml，再加3％的甲醇)将人α-乳清蛋白标准品稀释至1mg/ml，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上作为检测线(即T线)，包被量为1μL/cm，检测线靠近结合垫端，距结合垫垫端约8mm；用0.01MpH7.4PBS缓冲液(含3％的甲醇)将山羊抗兔IgG抗体稀释2.5倍，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜作为质控线，包被量为1μL/cm，质控线靠近吸水垫，距吸收垫约8mm，两线距离5～8mm。37℃烘干，封装备用。

5.试纸条的组装

将层析膜、样品垫、金标垫以及吸水纸按照图2所示的位置关系，依次粘帖搭建到试纸条底衬上。

6.切条

用切条机将试纸条切成宽度为3.6mm～4.0mm的窄条。

7.试纸条的储存

将切好的试纸条至于干燥器中，干燥保存。

实施例2(应用实施例)

牛奶中PBS缓冲液筛查免疫胶体金试纸条的使用方法

1.牛奶样品的制备：

用PBS缓冲液(0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液，配方：NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KH₂PO₄0.2g，用蒸馏水定容至1000ml)将牛奶样品(采集于2010年4月，-80℃保存，保存期为14个月)10倍稀释，同时以配方：NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KH₂PO₄0.2g，用蒸馏水定容至1000ml配方：NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H2O2.9g，KH₂PO₄0.2g，用蒸馏水定容至1000ml人α-乳清蛋白溶液标准品(来源同前)和PBS溶液作为阳性和阴性对照。

2.检测

分别取阳性标准品、阴性标准品和各待检样品100μL加到微孔板中用于检测，将胶体金试纸条插入待检样品中，20min后观察结果。

3.结果判定

4.其结果如图2所示，若待检样品试纸条同时出现检测线和质控线，则判定为阴性样品，即为非转基因牛奶；若试纸条只出现质控线，则判为阳性样品，即为转基因(人α-乳清蛋白)牛奶；若质控线没有出现，则表明该试纸条失效。用本发明的试纸条对牛奶3份样品进行了检测，得到如图3所示的结果。

Claims (5)

1.一种转基因牛奶中人α-乳清蛋白免疫胶体金筛查试纸条，包括样品垫、金标垫、层析膜、吸水纸和塑料衬板，其特征在于，在所述的塑料衬板上依次搭接粘帖有样品垫、金标垫、层析膜和吸水纸；所述的金标垫上包被有抗人α-乳清蛋白单克隆抗体-胶体金标记物，分泌抗人α-乳清蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株LB-001，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO：C2014157；所述的层析膜上分别包被有人α-乳清蛋白的检测线即T线和山羊抗兔IgG的质控线，即C线。

2.一种牛奶中人α-乳清蛋白免疫胶体金筛查试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用柠檬酸钠与氯金酸反应制备得到胶体金；

(2)将保藏号为CCTCCNO：C2014157的杂交瘤细胞株LB-001分泌的抗人α-乳清蛋白单克隆抗体加入到步骤(1)制备的胶体金中，得到抗人α-乳清蛋白单克隆抗体-胶体金标记物；

(3)将抗人α-乳清蛋白单克隆抗体-胶体金标记物包被到金标垫上；

(4)将人α-乳清蛋白标准品包被到层析膜上构成检测线，即T线，并将山羊抗兔IgG包被到层析膜上构成质控线，即C线；

(5)在塑料衬板上依次搭接粘帖样品垫、金标垫、层析膜及吸水纸，得到转基因牛奶中人α-乳清蛋白的免疫胶体金筛查试纸条。

3.权利要求1所述的试纸条在筛查转人α-乳清蛋白基因牛奶检测中的应用。

4.一株分泌抗人α-乳清蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株LB-001，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO：C2014157。

5.权利要求4所述的杂交瘤细胞株LB-001分泌的抗人α-乳清蛋白单克隆抗体在制备转基因牛奶中人α-乳清蛋白免疫胶体金筛查试纸条中的应用。