JP7266252B2 - 新規の免疫グロブリンeのエピトープ、それと結合する抗体および前記抗体を含む試料のうち免疫グロブリンeを分析するためのキット - Google Patents
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Description
実施例1.新規免疫グロブリンEエピトープの確認
(1)多クローン抗体の製造および力価の確認
抗原(IgE pep-40)100μlと同量のコンプリートアジュバント(Complete adjuvant)を混合して抗原乳化液を作った後、6週齢の雌マウス(BALB/C)の皮下に投与して免疫反応を誘導した。1次投与後、2週間隔で同じ抗原100μlと同量のインコンプリートアジュバント(Incomplete adjuvant)を用いて前記マウスの皮下に投与した(表1)。
抗体力価の確認実験を通じて確認されたマウスの血清中の力価を基準として高い力価を有する抗体が生成されたことを確認し、前記マウスのリンパ球を分離して細胞融合を実施した。免疫反応が誘導されたマウスの脾臓を損傷なしに摘出してDMEM(Dulbecco/Vogt modified Eagle’s minimal essential medium)培地で洗浄し、リンパ球を分離して、60mmディッシュ(dish)にDMEM培地を加えて単一細胞に分離させた。以後、RBC溶解バッファー(lysis buffer)を使用してリンパ球に混ざっている赤血球を除去した後、DMEM培地で洗浄し、準備された骨髄腫細胞(Myeloma cell、SP2/0 Ag 14-ATCC #CRL-1581)とリンパ球を細胞数対比1:5で混合した。その後、前記混合された細胞にPEG1500 1.7mlを添加して細胞融合を誘導し、96ウェルプレートにウェル当たり200μlずつ細胞を分注した後、CO2インキュベーター(incubator)で培養した。細胞融合2日後、各ウェル当たり50%をHAT培地(hypoxanthine-aminopterin thymidine medium)に交替し、12日後、コロニー(colony)を確認して、IgE pep-40タンパク質ペプチド(ELISA確認用抗原)との反応の有無を上記のELISA(Abs.450nm)方式で進めて決定した。前記ELISA結果のうち、O.D値を基準として1.0以上である場合、陽性(positive)と選定して単クローン細胞を選別した。
製造した融合細胞群のうちIgE pep-40にのみ特異的に反応する細胞を選別し、抗体の生成の有無を確認するために、酵素免疫方法を用いてスクリーニングした。細胞融合後12日目に培地を交換し、交換した培地を1次抗体としてELISA試験を行った。ELISA試験後、当該抗原に陽性を示すウェルを選択して24ウェルに移して培養した。24ウェルで培養したハイブリドーマ細胞株を同じ方法でさらにELISA試験を行って抗体力価を確認した。24ウェルで成長させた融合細胞の吸光度(O.D値)をELISAで確認し、吸光度が1を超える融合細胞のみを選択して6ウェル培養フラスコに移して培養し、遠心分離した後、上澄み液を集めて、ELISA確認して、3次スクリーニングを行った。3次スクリーニングに基づいて選択された融合細胞をさらに75T/C培養フラスコに移して培養し、ELISAで吸光度を確認して、吸光度が1を超える融合細胞のみを選択した。
抗体の生産に使用したペプチドを使用してエピトープマッピング(epitope mapping)を実施した。マッピングに使用されたペプチドは、従来抗原の生産に使用されたIgE pep-40タンパク質の一部である12、13、15個のアミノ酸配列を有するペプチドを使用した(表3)。
(1)アレルゲンの分離
下記表4に示した原材料をTSM Allergen Sourceが浸る程度にEtherを入れた後、よく撹拌しながら常温で5分間インキュベーション(incubation)させた。
1)抗体の力価の確認
前記Pep-6ペプチドと結合する抗体を発見し、これを用いた単クローン抗体細胞株の確立後、細胞培養液を用いて抗体の力価の確認試験を実施した。この際、Pep-6のキャリアとしてKLHタンパク質を使用した。
前記抗体の力価の確認においてPep-6-KLHに結合力が高かった8-7_100cell、140-13_500cell、302-2_100cellを既販売されている抗IgE抗体との性能比較試験を進めた(表6)。
キットの製造に使用された抗体の選別基準は、組換えIgEに対する結合力が販売製品と類似した3種の抗体(8-7_100cell、140-13_500cell、302-2_100cell)を選定した。また、3種の抗体が血液内存在するnative IgEに対する結合力の程度を確認するために、下記の方法でELISA試験を通じて確認した。
塩化金酸と還元剤を使用して直径40~60nmのコロイド性金粒子を製造した。コロイド性金粒子を520nmでOD値が1.0±1.0になるように3次蒸留水を添加する。ゴールド溶液1mlに実施例1-2で準備した単クローンanti-Human IgE抗体5μg~15μgを添加した後、室温で1時間の間振とう反応させた。反応が完了した金粒子を洗浄し、吸光度計を用いて520nmで測定して定量した後、濃度がOD値5.0±1.0になるように希釈し、保存剤を添加した。
ホウ酸塩緩衝液を使用して実施例1-(1)で準備したアレルゲン抗原は、5mg/mlでそれぞれ希釈し、anti-mouse IgGは、2mg/mlで希釈して、自動定量分注器を使用して検査線および対照線位置にそれぞれ分注してメンブレンをコーティングした。以後、前記コーティングされたメンブレンを確認検査台に載置し、各コーティング液が正常に分注されたか否かを全量肉眼で検査した。正常に分注されたメンブレンを1時間以上37±2℃で恒温乾燥した後、組立前まで密封して、除湿された状態で保管した。
検出限界の確認
前記実施例2で製作したキットの検出限界を確認するために、immuno-CAP検査で陽性(3.5IU/ml以上)判定を受けた検体を原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍希釈した後、各アレルゲンに対する検体を3回繰り返して標準試験法によって試験を行い、判定基準によって判定し、その結果を下記表8に示した。
前記実施例2で製作したキットの(1)試験者間、(2)試験日間、(3)試験(Lot)間、(4)同一試験日、試験場所間のアレルゲンに対する正確度を判定するために、標準試験法によってテストした。アレルゲンに対する陰性標準物質および陽性標準物質をそれぞれ準備して、下記の試験方法でテストを進め、その結果を下記表9に示した。
前記実施例2で製作したキットに対して3人のそれぞれ異なる試験者がそれぞれ陰性標準物質および陽性標準物質を使用して試験を行い、その結果を分析した。
(2)試験日間
前記実施例2で製作したキットに対して1人の試験者がそれぞれ陰性標準物質および陽性標準物質を使用して1日間隔で合計5日間試験を行い、その結果を分析した。
(3)試験(Lot)間
前記実施例2で製作したキット3つに対して1人の試験者がそれぞれ陰性標準物質および陽性標準物質を使用して試験を行い、その結果を分析した。
(4)同一試験日(試験場所)間
前記実施例2で製作したキットに対し1人の試験者がそれぞれ異なる3か所の場所(実験室、QC室等)で陰性標準物質および陽性標準物質を使用して試験を行い、その結果を分析した。
偽陽性/偽陰性の有無の確認
検体内に存在する物質による干渉効果を測定するために、陰性標準物質および陽性標準物質に下記表10の物質を添加して偽陽性(false positive)および偽陰性(false negative)の有無を試験し、その結果を下記表11に示した。
また、検査過程で使用される抗体と検体内に存在可能な免疫グロブリン亜種の非特異的な結合による交差反応の有無を確認するために、陰性標準物質にIgA、IgM、IgG、およびIgDをそれぞれ3mg/ml添加して、標準試験法によって試験を行い、判定基準によって判定した。
実施例1-2によって製造および選別された抗体3種のうち8-7_100 cellを用いて実施例2によってアレルギーkitを製造して、既販売中のキット(LG、Alloscan)とアレルゲン39種のうち発生頻度数の高いアレルゲン13種(ヤケヒョウヒダニ(DP)、コナヒョウヒダニ(DF)、猫、イエダニ、犬、シラカンバ、alternaria、桃、りんご、ホソムギ、ハルガヤ、カモガヤ、オオアワガエリ、オーク、卵白、ジャガイモ)に対する一致率確認試験を進めた。試験は、13種に対して1つ以上のアレルゲンに対して陽性を示す160検体を使用し、不一致を示す検体は、第3の検査法であり且つアレルギー検査において標準試験法と見なされるユニキャップ検査を進めて結果を判定した。既販売製品キットを用いた試験とユニキャップ検査は、受託機関に依頼して実施し、自社開発したキットは、2人の検査員が検査する形態で自主的に実施した(表12)。
Claims (13)
- 検体が滴下される検体パッド、および、
前記アレルゲンがコーティングされたメンブレンを含み、
前記検体は、アレルゲンに対する特定免疫グロブリンE(Immunoglobulin E:IgE)抗体を含み、
前記検体と抗IgE抗体ゴールドコンジュゲートとは反応して抗IgE抗体ゴールド複合体を形成し、
前記抗IgE抗体ゴールド複合体は、該抗IgE抗体ゴールド複合体が前記メンブレン上に固定された前記アレルゲンに対する特定IgE抗体を含む場合にバンドを形成し、
前記抗IgE抗体は、IgEのエピトープ(epitope)である配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体である、
検体のうちIgE抗体を分析するためのキット。 - 希釈剤をさらに含むものである、請求項1に記載のキット。
- 前記検体は、個体をアレルゲンと接触させた後、個体から分離した生物学的検体である、請求項1に記載のキット。
- 前記検体は、接触後10分~40分に分離したものである、請求項3に記載のキット。
- 前記アレルゲンは、チリダニ、ホソムギ、オーク、ヨモギ、カナムグラ、ニンニク、豚肉、マグロ、かび、犬、ゴマ、ピーナッツ、牛肉、ハルガヤ、エビ、りんご、猫、ハンノキ、シラカンバ、大豆、クルミ、マダラ、カモガヤ、牛乳、桃、ジャガイモ、ブタクサ、卵白、小麦、カニ、麦、ヨシ、ゴキブリ、ソバおよびイエダニよりなる群から選ばれるいずれか1つ以上である、請求項1に記載のキット。
- 前記メンブレンは、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフルオリン化ビニリデン(PVDF)、ガラスおよびプラスチックよりなる群から選ばれるものである、請求項1に記載のキット。
- 前記キットは、免疫クロマトグラフィー分析用である、請求項1に記載のキット。
- 請求項1に記載のキットと、検体滴下部と、を含むアレルギーの診断または予後予測用デバイス。
- 個体の血液を採取して検体希釈液に混合する段階と、
前記希釈液を請求項8に記載のアレルギーの診断または予後予測用デバイスの検体滴下部に滴下(drop)して反応させる段階と、を含むアレルギー疾患の診断をするための指標を提供する方法。 - 前記反応は、10~40分間行われる、請求項9に記載の方法。
- 前記血液の体積は、0.5ml~2mlである、請求項9に記載の方法。
- 前記血液は、血しょうまたは血清である、請求項9に記載の方法。
- 前記血しょうまたは血清の体積は、0.1ml~1mlである、請求項12に記載の方法。
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