本发明的目的在于提供一种合成肽免疫原,这种肽免疫原与大分子载体蛋白形成复合物后,可以诱导机体产生针对人IgE分子中受体结合部位结构的抗体。
本发明的目的还在于提供一种治疗变态反应的疫苗,这种疫苗接种机体后产生的与游离IgE起反应的抗体,可阻止IgE对肥大细胞、嗜碱性粒细胞等的致敏,从而抑制IgE介导的I型变态反应。
本发明的另一个目的在于提供治疗变态反应疫苗的制备方法。
本发明所用的合成肽免疫原,包含一种或几种免疫原性肽,所述免疫原性肽分别选自以下肽段组,所述肽段组各包含若干个含有如下氨基酸残基顺序结构的肽:肽的编号 氨基酸残基顺序 所属受体结合部位 Bennich序号A组 A-1 PFDLFIRK Cε3区AB环 345-352
A-2 PFDLFIRKSPTI
A-3 SRPSPFDLFIRKSPTI
A-4 YLSRPSPFDLFIRKSPTI
A-5 CAPFDLFIRKAC
A-6 ADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIR 329-356
KSPTIB组 B-1 TWSRASGKPVNHS Cε3区CD环 373-385
B-2 CTWSRASGKPVNHSAC
B-3 GTVNLTWSRASGKPVNHSTR 368-387C组 C-1 GTRDWIEGETY Cε3区EF环 406-416
C-2 CAGTRDWIEGETYAC
C-3 PVGTRDWIEGETYQSR
C-4 TSTLPVGTRDWIEGETYQSRVT 400-421D组 D-1 PRALMRST Cε3区FG环 426-433
D-2 HLPRALMRST
D-3 HLPRALMRSTTK
D-4 CAHLPRALMRSTAC 421-440
D-5 THPHLPRALMRSTTKTSGPRE组 E-1 LHNEVQLPDAR Cε4区 479-489
E-2 LHNEVQLPDARHSTTQPR
E-3 SVQWLHNEVQLPDARHSTTQPR 475-496其中,氨基酸残基的符号表示如下意义:
A Ala丙氨酸 |
R Arg精氨酸 |
D Asp天冬氨酸 |
N Asn天冬酰胺 |
C Cys半胱氨酸 |
E Glu谷氨酸 |
G Gly甘氨酸 |
Q Gln谷氨酰胺 |
L Leu亮氨酸 |
K Lys赖氨酸 |
I Ile异亮氨酸 |
H His组氨酸 |
M Met甲硫氨酸 |
F Phe苯丙氨酸 |
T Thr苏氨酸 |
W Trp色氨酸 |
Y Tyr酪氨酸 |
P Pro脯氨酸 |
V Val缬氨酸 |
S Ser丝氨酸 |
本发明所提供的治疗变态反应的疫苗,包含由上述肽免疫原与载体蛋白形成的免疫原性肽载体复合物及佐剂,或免疫原性肽载体融合蛋白及佐剂。
本发明所提供的治疗变态反应的疫苗的制备方法,包括以下步骤:
(1)合成并纯化含有上述肽段组所列肽段氨基酸残基顺序结构的若干个肽;
(2)将合成并纯化的一种或几种肽用化学交联剂与载体蛋白交联形成免疫复合物;
(3)将所述免疫复合物与佐剂混合,制成疫苗。
本发明所提供的治疗变态反应的疫苗的另一种制备方法,包括以下步骤:
(1)将一种或几种上述肽段组所列结构的肽所对应的编码寡核苷酸序列,中间加以编码接头,在DNA合成仪上进行合成,
(2)连接经PCR法扩增的编码载体蛋白的基因,转入细菌质粒或噬菌体,在宿主细胞中增殖表达,分泌出免疫原性肽载体融合蛋白,
(3)将所述免疫原性肽载体融合蛋白与佐剂混合,制成疫苗。
下面对本发明作详细描述。
本发明通过给机体接种一种特殊的免疫原成分,使机体主动产生针对游离IgE的内源性抗体,此抗体与IgE反应就阻止了IgE与其FcεRI受体的结合,抑制了肥大细胞、嗜碱性粒细胞的致敏状态,阻断了IgE介导的变态反应发病环节,来治疗I型速发型变态反应。
本发明的肽免疫原含有以下肽段组所列肽段氨基酸残基顺序结构的若干个免疫原性肽:肽的编号 氨基酸残基顺序 所属受体结合部位 Bennich序号A组A-1 PFDLFIRK Cε3区AB环 345-352
A-2 PFDLFIRKSPTI
A-3 SRPSPFDLFIRKSPTI
A-4 YLSRPSPFDLFIRKSPTI
A-5 CAPFDLFIRKAC
A-6 ADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIR 329-356
KSPTIB组 B-1 TWSRASGKPVNHS Cε3区CD环 373-385
B-2 CTWSRASGKPVNHSAC
B-3 GTVNLTWSRASGKPVNHSTR 368-387C组 C-1 GTRDWIEGETY Cε3区EF环 406-416
C-2 CAGTRDWIEGETYAC
C-3 PVGTRDWIEGETYQSR
C-4 TSTLPVGTRDWIEGETYQSRVT 400-421D组 D-1 PRALMRST Cε3区FG环 426-433
D-2 HLPRALMRST
D-3 HLPRALMRSTTK
D-4 CAHLPRALMRSTAC 421-440
D-5 THPHLPRALMRSTTKTSGPRE组 E-1 LHNEVQLPDAR Cε4区 479-489
E-2 LHNEVQLPDARHSTTQPR
E-3 SVQWLHNEVQLPDARHSTTQPR 475-496
其中,氨基酸残基的符号意义同上。
本发明的免疫原是从含有以上五组基本结构肽段的肽中选出的来自不同组的一种或几种(如A-1和B-2,或A-2、C-2和E-1,或A-1、C-1和E-2等等)组合而成。
上述五个肽段组,每组都有一个最短的肽,该组其余的肽都包含了这个最短肽的结构。因此最短肽是该组的基本结构。设计用作本发明疫苗的免疫原性肽进行人工合成或以基因工程技术制备时,先选一个组。该组中各个肽虽然都可选择,但较好的选择是选最短的肽,或比最短肽长但不超过该组最长肽的结构,这要看所选择肽段的水溶性如何。水溶性高的好。在较佳选择方案中,选择的肽长度在8-18个氨基酸残基为好,并可在两头添加丙氨酸和半胱氨酸,以使产生二硫键形成环状。进一步实施时,设计选择来自不同组的二个肽,如A-1肽和C1肽,或A-1肽和B-2肽,或A-1肽和E-2肽等。将这二种肽联合作为免疫原,进而制成疫苗。在更佳的实施方案中,设计选择来自不同组的三个肽,如A-1、C-1和E2肽,或A-2、C-2和E1肽,联合组成免疫原,进而制成疫苗。
本发明列出的以上五组肽段,都取自人IgE分子中FcεRI受体结合部位的结构,都具有免疫原性。同组的各个肽均含有该组最短肽的基本结构而具有相似的免疫原性、即可诱导出针对此基本结构的特异性抗体。也可诱导出能与人IgE受体结合部位结构起反应的特异性抗体。但由于同组各个肽的长度不一样,水溶性不一样。这种免疫原性强弱会有所差别,使用前要经过实验选择免疫源性较强的肽来应用。本发明的免疫原性肽覆盖了以上系列各组肽外,还覆盖未列出的含有以上五组各组最短肽基本结构的任何其它更长的肽,以及这些肽的任何联合。
这些肽段可用F-moc或T-boc系列氨基酸在自动多肽合成仪上用固相方法分别化学合成,经Sephadex G-25色谱法初步纯化或进一步用高效液相色谱法(HPLC)高度纯化加以制备。也可用基因重组方法表达于丝状噬菌体上,即将选出的一种或一种以上肽段相对应的编码寡核苷酸序列,中间加以编码接头(如[Gly4-Ser]3)的寡核苷酸,在DNA合成仪上人工自动合成,连接用PCR法扩增的编码载体蛋白的基因,克隆插入到丝状噬菌体M13株质粒的小包膜蛋白P3或菌体包膜蛋白P8的基因中,在噬菌体表面表达,筛选出表达阳性的噬菌体株,在大肠杆菌中大量增殖,分泌所要的肽载体融合蛋白,收集纯化。
本发明所用的载体蛋白主要是乙肝病毒表面抗原(HBsAg)或核心抗原(HBcAg)或狂犬病毒的核蛋白。它们都是基因工程的重组蛋白,HBsAg也可用血源性产品。其中以HBsAg为最好。因为不论血源性或重组性HBsAg都已正式用作人类疫苗,不需再做什么测定。若用于动物接种,可用牛血清白蛋白,KLH作载体蛋白。
当采用人工合成的上述肽段时,需要交联剂将其与载体蛋白共价交联。交联剂有双重氮联苯胺,马来酰亚胺苯甲酰基N-羟基丁二酰胺酯,或戊二醛(Glutaraldehyde)。交联时一种或一种以上肽段等量混合,混合物与载体蛋白如HBsAg的质量比为1∶1~2∶1。最好是1.5∶1。由于肽段分子量小得多。这样的质量比,可获得含有大量重复抗原决定簇结合在HBsAg上的复合分子。交联后用透析法或色谱法除去没交联上去的小分子合成肽段,就获得了大分子免疫原载体蛋白复合物。
不论是合成肽-载体蛋白复合物,还是基因重组的肽-载体融合蛋白(二者统称免疫原性肽载体复合物)都需加以佐剂才能组成疫苗。本发明所用佐剂主要是脂质体、氢氧化铝凝胶、γ菊粉、或Tucaresol,最好是脂质体。用作动物注射的实验疫苗则可用弗氏完全佐剂(FCA)和不完全佐剂(IFA),或Ribi佐剂。
脂质体的脂质原料可为二氧乙烯十六烷基醚[C16H33(OCH2CH2)2OH]、胆固醇和油酸。将三者按比例(如33∶11∶7分子量比)混合,加热至75-100℃融化澄清保持在50-60℃呈液态脂质。将免疫原性肽载体复合物以生理盐水或磷酸缓冲液(PBS)溶解配成适当蛋白浓度的溶液,与液态脂质按3∶1到5∶1体积比,最好是4∶1体积比,以推注法制成脂质体,即为疫苗。
本发明的脂质体还可用二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG),二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)等制备。将其中二种或三种按比例(如DSPC∶DSPG按摩尔比1∶3,DSPC∶DSPG∶DSPE-PEG按摩尔比10∶3∶1.45)混合,同法制备。
制备脂质体的这些原料均无毒性,在体内可降解成小分子,被代谢消除。
本发明的上述疫苗,采用皮下或肌肉注射法接种,每次剂量20至400微克(肽-载体复合物蛋白量)视儿童,少年和成人而不同。在发病季节可能需接种2-4次,间隔1个半月或二个月。
本发明疫苗能够防治I型变态反应疾病的基本原理是:本发明的特殊免疫原,是含有人Ige分子中FcεRI受体结合部位(binding sites)结构或相关结构的肽段组合物,接种机体后诱生的抗体与这些结构有交叉反应,即能与这些结构结合,从而阻止IgE与受体的结合。但这些抗体不与已结合在受体上的IgE反应,因cell-bound IgE的结合部位已被掩盖或阻挡。虽然每个IgE分子有两组受体结合部位,但当IgE的一组结合部位与受体结合后,其Fc段和另一组结合部位都发生了构型变化,不能再与原识别抗体反应。
本发明特殊免疫原诱生的抗体与IgE形成的复合物也可被体内免疫消除机制所清除,使循环性IgE水平降低,而cell-bound IgE在与游离IgE维持动态平衡过程中,一旦从受体上脱落恢复原构型时,也能被抗体所清除,从而靶细胞致敏状态就会减低。因此,接种本发明的免疫原,既可预防也可治疗IgE介导的过敏反应性疾病。
本发明采用组合的免疫原性肽和适当的载体蛋白来解决人群辅助性T细胞决定簇需要的多样性,因为在抗原提呈细胞(APC)对抗原的加工过程中,载体蛋白被分解成许许多多小分子肽段,各个个体的APC可根据各自的HLA型从中选择所需肽段,来活化辅助性T细胞,促进免疫应答。
本发明的免疫原性肽交联人用载体蛋白,加上可人用的佐剂,制成的疫苗给人体或哺乳动物接种进行主动免疫,诱导机体产生能与游离IgE起交叉反应的抗体,阻止IgE与受体结合。此外,还诱生较高滴度针对HBsAg的抗体。此种抗体非但对机体无害,而且可保护人体防御乙肝病毒的感染,或可能有利于乙型肝炎的康复。
以下用实施例对本发明作进一步的详细说明。必须指出,这些实施例仅仅是为了说明而不是限制本发明。在此基础上所作的任何变动和修改都落在本发明的范围内。
实施例1人IgE多肽的化学合成和脂质体疫苗的制备
(一)多肽的化学合成
按本发明所设计的A、B、C、D、E五组各个多肽的氨基酸残基序列,分别在ABI431多肽自动合成仪(Applied Biosystemes公司)上,按操作说明,逐一进行固相法化学合成(Sheppard RC:Science Tools 1986,33:9-16)。采用的HMP树脂、F-moc系列活化氨基酸和主要化学试剂均为ABI公司产品,合成完毕,取出干燥的肽-树脂,在冰浴中加入预冷的解离混合液(结晶酚0.75g、二硫乙二醚0.25ml,苯甲硫醚0.5ml,去离子水0.5ml,三氯乙酸10ml),加入量按0.1~1.5g肽树脂加10ml计。室温搅拌反应1.5小时。抽滤分离肽溶液,再置40℃水浴旋转蒸发浓缩至1-2ml。加入5ml冷乙醚沉淀多肽,抽滤收集沉淀物,真空干燥获得粗肽,粗肽用Sephadex G-25柱层析纯化,洗脱液为10%乙酸,收集的肽溶液冻干备用。
纯化的各个多肽,以高效液相色谱法(HPLC)(如Beckman 110 B型仪器)进行纯度分析,用ULTRAPORETMRPS柱(4.6mm×75mm),流动相用乙睛,检测模式可用Model 163,250mm。要求HPLC纯度≥70%。若低于此,应用制备型HPLC进一步纯化,可使用DELTA PAK 15μC18 300柱(Waters公司)。流动相用乙腈。合成的各个多肽序列是否正确,用质谱仪进行质谱分析,也可用氨基酸自动分析仪进行氨基酸组分分析。
(二)多肽-载体蛋白的制备(戊二醛交联法)
用纯化的牛血清白蛋白(BSA)作载体蛋白。取此种载体蛋白4mg,A-1多肽(或B-1,或E-1多肽)1mg,分别溶于0.015M PBS(pH7.1~7.3)液中,体积视多肽溶解程度而定,以尽量少为好,一般1ml左右。载体蛋白液与多肽液混合后,加入等体积0.2%戊二醛液(也用同一PBS液配制),37℃搅拌反应30分钟,然后加入NaBH4使其最终浓度为10mg/ml,继续搅拌1小时。反应液装透析袋,以4~10℃PBS液充分透析,即为单一多肽-载体蛋白复合物,用Bradford法测定蛋白浓度。过滤除菌,无菌保存。
(三)脂质体疫苗的制备
取二氧乙烯十六烷基醚(商品名Brij 52 Aldrich产品)1.92g,胆固醇0.75g,油酸0.33g,混合,加热至75~100℃融化澄清。取此液态混合脂质0.5ml,置一无菌针筒中,50~60℃保温。另取2ml含0.25mg/ml~1.0mg/ml上述肽-载体蛋白复合物的溶液置另一无菌针筒内,50~60℃预热3~5分钟。二针筒以双通针头(直径0.47mm)连接,来回推注45~50次,操作温度从50~60℃移至37℃再移至室温,即获乳白色可流动之脂质体疫苗。
实施例2
除了用KLH(美国Piere公司产品)作载体蛋白外,按实施例1(二)、(三)的方法制备多肽-载体蛋白和进一步制成脂质体疫苗。
实施例3
用不含保护剂的纯化TT(系相应疫苗的半成品)作为载体蛋白。取此种载体蛋白2mg配成溶液;另取A-4多肽及C-1多肽(或A-1多肽及E-1多肽等)各2mg溶于PBS中。载体蛋白液与混合多肽液混合后,加入戊二醛液使其最终浓度为0.2%,用与实施例1(二)同样的方法,获得二肽-载体蛋白复合物,并用与实施例1(三)同样的方法制得疫苗。
实施例4
除用HBsAg(血源性或重组产品,系相应疫苗的半成品)作为载体蛋白外,用与实施例3同样的方法,制得二肽-载体蛋白复合物和疫苗。
实施例5
取纯化TT2mg,A-1多肽、B-多肽及C-1多肽(或A-1多肽、C-1多肽和E-1多肽等)各1mg,以PBS配成溶液后混合,加戊二醛至终浓度0.2%,25℃反应40分钟。反应液以Sephadex G-25柱层析分离。其余步骤与实施例1相同,获得三肽-载体蛋白复合物,并进一步制成疫苗。
实施例6
除了用HBsAg作为载体蛋白外,与实施例5相同,获得三肽-载体蛋白复合物和疫苗。
实施例7
将不溶性的多形性γ菊粉与氢氧化铝凝胶按Cooper的“标准方法”(Cooper PDand Steele EJ:Vaccine 1991.9(5):351)制成Algammulin,其中γ菊粉与氢氧化铝的比例为10∶1。再用旋涡混合器(Vortex)将实施例1-6中得到的免疫原性肽载体复合物生理盐水溶液与Algammulin迅速混合并均匀分散,20℃放置15分钟。使免疫源性肽载体复合物(简称抗源)完全吸附在Algammulin上,制成疫苗。一般1mg Algammulin颗粒可吸附1~25μg抗源,每只小鼠免疫可用此种疫苗0.4-2.0mg作皮下或腹腔注射。
实施例8重组人IgE肽-载体融合蛋白的制备、检定和纯化
在DNA合成仪上,人工合成上述人IgE的二个或三个肽段的编码基因,中间以接头DNA[如(Gly4-Ser)3]联接。然后,按常规方法克隆到PBluescript KS质粒中,构成PBE1质粒。另用PCR法扩增乙肝病毒HBsAg的编码基因,纯化后将其“a”决定簇基因的3′端,与PBE1质粒中IgE肽基因的5′端相连。再将此融合基因插入到丝状噬菌体M13小包膜蛋白P3基因的N端。然后感染敏感大肠杆菌,培养增殖。具体操作按“分子克隆实验指南”(Sambrook J等著。金冬雁、黎孟枫译,科学出版社1993)一书201-233页进行。从固体培养基上挑选出抗药性噬菌体菌落分别培养,取各培养的上清液作ELISA检测。
ELISA检测采用常规双抗体夹心法,即用抗HBsAg抗体包板→加待测的培养上清反应→加酶标抗HBsAg抗体。
选择ELISA呈强阳性反应对应的噬菌体培养管,在大肠杆菌中放大培养,收集培养上清液。此液中含有克隆成功能表达重组人IgE肽-HBsAg融合蛋白的噬菌体所分泌的产物。将其超滤浓缩后,用50%饱和度硫酸铵沉淀。沉淀物重溶解后经Saphadex G-25柱脱盐,然后上HBsAg抗体亲和层析柱纯化。
纯化的重组人IgE肽-HBsAg载体融合蛋白经纯度分析后,用于制备疫苗。
实施例9
制备多肽抗血清并检测其对多肽和IgE的活性
将实施例1~6制备的肽-载体蛋白复合物,首次加弗氏完全佐剂(FCA),后二次加强注射加弗氏不完全佐剂(IFA),给Balb/c小鼠(雄、14克左右)注射,每组10~20只小鼠,每只皮下多点注射肽-载体蛋白复合物5~10μg,各次间隔3~4周。第三次注射后7~14天,眼眶放血,同组小鼠血合并,分离血清,即为多肽抗血清。
测定多肽抗血清活性的间接ELISA法。将A-1(或B-1等)合成肽以pH9.6、0.1M碳酸缓冲液配成1μg~5μg/ml浓度,包被96孔ELISA板孔,每孔50μl,4~16℃过夜。以洗涤液(含0.05%Tween20的PBS)洗板孔后,各孔分别加入五倍系列稀释的多肽抗血清,以正常小鼠或载体蛋白免疫小鼠血清作对照,37℃反应1.5小时。洗涤4~5次,加入1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(酶标抗体),每孔50μl,37℃反应1小时。洗涤板孔五次,各孔加底物(邻苯二胺1mg/ml)液100μl、室温反应15分钟,加4N硫酸液100μl终止反应。在酶标分光光度仪上读取各孔A490nm吸光值。多肽抗血清对各合成肽的ELISA测定举例见表1。
表1
多肽抗血清对各自合成肽的反应活性多肽抗血清 ELISA A490nm值稀释度 对照鼠血清 抗A-1血清 抗B-1血清 抗E-1血清1∶100 0.12 1.95 2.10 0.801∶500 0.05 1.58 1.80 0.301∶2500 0.03 0.95 1.30 0.181∶12500 0.01 0.45 0.65 0.05
从表1可见,各多肽抗血清对自身多肽均有强的或较强的反应,表明此多肽交联载体蛋白加上佐剂后,具有免疫原性,选择设计的该多肽有效,可考虑作为疫苗候选。
另一种ELISA法是以天花粉蛋白包板,先加入小鼠抗天花粉蛋白IgE单抗(培养上清)使小鼠IgE结合在板上,洗涤后,加待测多肽抗血清反应后,有的抗肽抗体可与小鼠IgE结合。洗涤,再加酶标羊抗鼠IgG抗体反应。显色程序同上。测定结果举例见表2。
表2
多肽抗血清对各自合成肽的反应活性多肽抗血清 ELISA A490nm值稀释度 对照鼠血清 抗A-1血清 抗A-2血清 抗E-1血清1∶50 0.09 0.69 0.15 0.461∶200 0.07 0.55 0.10 0.331∶800 0.04 0.39 0.06 0.201∶3200 0.02 0.010 0.02 0.09
小鼠抗天花粉蛋白IgE单抗培养上清为中科院上海细胞生物所提供。
从表2可见,抗A-1血清和抗E-1血清,与小鼠IgE有交叉反应性,而抗A-2血清则无。
实施例10评价多肽抗血清抗过敏活性的“大鼠被动皮肤过敏反应(PCA)抑制试验”(体内试验)
(一)大鼠被动皮肤过敏反应(PCA)。
1.含IgE致敏血清制备
取C57小鼠或Balb/c小鼠,10周龄,雌,20~30只,每只腹腔注射天花粉蛋白(上海金山制药厂生产)10μg,第一次加4mg Al(OH)3,第二次加2mgAl(OH)3,间隔三周。用Wistar大鼠,雄,150克,每只腹腔注射天花粉蛋白400μg,第一次加10mg Al(OH)3,第二次加5mg Al(OH)3、间隔3周。第二次注射后7-10天。小鼠眼眶采血,血液合并;大鼠心脏取血。分离血清,即为含有针对天花粉蛋白IgE的致敏血清。
2.大鼠PCA试验
将致敏血清以生理盐水作1∶25,1∶50,1∶75稀释,分别给剪去背毛的正常Wistar大鼠(雄200~250克)作皮内注射,在背脊两侧皮内每点0.1ml。以正常小鼠或大鼠血清作对照。4小时后,给大鼠经尾静脉注入天花粉蛋白2mg0.5%伊文氏兰液0.5ml(均以生理盐水配制)。15~30分钟内注射点呈现兰斑。处死大鼠剪下各注射点皮片,分别剪碎后浸入3ml丙酮生理盐水(丙酮与盐水体积比7∶3)中,试管密封过夜,使皮片兰色浸出。次日比色测定各皮片浸液的A610nm值,举例见表3。
表3
PCA试验皮片浸液A610nm值测试用 生理盐 1∶4正常 小鼠致敏血清 大鼠致敏血清大鼠编号 水对照 鼠血清 1∶25 1∶50 1∶75 1∶8 1∶16No1 0.002 0.005 0.188 0.102 0.049 0.148 0.072No2 0.005 0.010 0.246 0.124 0.056 0.174 0.096No3 0.007 0.015 0.330 0.160 0.088 0.186 0.102No4 0.007 0.010 0.210 0.110 0.058 0.138 0.066
(二)多肽抗血清的PCA抑制试验
将多肽抗血清以生理盐水作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释,分别与小鼠致敏血清(1∶25)等量混合,以单纯载体蛋白免疫小鼠血清作阴性对照进行同样处理。各混合液于25℃反应40分钟后,分别注射正常大鼠(Wistar,雄,200~250克)背部皮内,每点0.1ml。注射点安排一般是脊背一侧为阴性对照混合液3~4个点,另一侧为多肽抗血清混合液3~4个点,以脊柱为中心对称。另设生理盐水一个点,阳性对照(1∶50致敏血清)一个点,每只大鼠可注射8-10个点。4小时后尾静脉注射天花粉蛋白2mg、0.5%伊文氏兰液0.5ml,以后操作同PCA试验。多肽抗血清的PCA抑制率按下面公式计算:
一些多肽抗血清的PCA抑制率举例见表4。
表4
多肽抗血清对大鼠PCA的抑制率%
多肽抗血清 多肽抗血清稀释度
代号 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32
A1-BSA-FCA 65.0±26.1* 58.6±4.9* 41.7±12.4* 34.1±9
A3-KLH-FCA 66.3±20.9* 54.8±18.4* 29.6±12.9 9.6±8
B2-BSA-FCA 32.9±20.2* 25.9±12.2* 17.3±10.6* 11.2±1
C1-BSA-FCA 40.5±15.6* 31.3±18.5* 29.3±10.9* 29.4±2
E2-BSA-FCA 37.0±21.5* 34.7±8.4* 43.3±9.4* 25.9±2*统计学有显著差异P<0.05
表4显示,所例举的5个多肽抗血清都有程度不同的PCA抑制活性。
实施例11评价多肽抗血清抗过敏活性的“大鼠肥大细胞被动致敏抑制试验”(体外试验)
(一)准备大鼠肥大细胞悬液。Wistar大鼠,雄,200~250克。乙醚麻醉后,处死。立即腹腔注入15~20ml无Ca++HBT液(配方见后)。搓柔腹部2分钟,剪开腹膜,吸出注入的HBT液,避免出血。吸出液离心(1200rpm×5分钟),并以HBT液再洗涤一次。细胞重悬在2ml HBT液中。离心后,弃上清,加入4ml0.05M、pH3.5乳酸缓冲液,20℃处理5分钟,使结合在肥大细胞表面的IgE脱落。随即加入4ml HBT,洗涤一次,重悬至1.5ml。取样阿利新兰染色作肥大细胞计数。即为非纯化的富含肥大细胞悬液。
(二)被动致敏及多肽抗血清对被动致敏的抑制。将多肽抗血清,及作为对照用的单纯载体免疫血清,分别以HBT液作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释,然后各与1∶4稀释度的小鼠致敏血清(见实施例10(一))等量混合37℃反应30分钟。取各混合液0.1ml与上述肥大细胞悬液0.1ml共置一个试管内,37℃反应1小时。此步骤,致敏血清中的小鼠IgE可使肥大的细胞致敏,而多肽抗血清若能与IgE交叉反应,就部分阻止其的致敏作用,使致敏肥大细胞数减少。反应毕,洗涤细胞一次,各管重悬于0.1ml HBT液中,再均分为二小管,各50μl细胞悬液,一管为非激发管,另一管为激发管。
(三)激发肥大细胞脱颗粒。非激发管加入50μl HBT液,激发管加入50μl含6μg/ml浓度的天花粉蛋白液(用HBT液配)。37℃反应15分钟。随后各管加入0.15ml阿利新兰染色15分钟。显微镜下计数各管肥大细胞数,并计算出各稀释度抗血清的脱颗粒系数DI。
DI=(非激发管肥大细胞数-激发管肥大细胞数)÷非激发管肥大细胞数
HBT液配方:
NacI 13.7mM CaCl2 0.1mM
KCI 0.27mM Hepes 1mM
NaH2PO4 0.04mM 葡萄糖 0.56mM
MgCl2 0.05mM 明胶 0.1mg/ml
配制时按10倍浓度配,使用时作1∶10稀释,以0.2M NaOH调节pH7.0多肽抗血清对大鼠肥大细胞被动致敏的抑制作用测试举例见表5。
表5
多肽抗血清对肥大细胞被动致敏的抑制作用(%)
多肽抗血清 多肽抗血清稀释度
代 号 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32
A1-BSA-FCA 62.5 64.9 57.2 -14.5
A3-BSA-FCA 61.7 65.6 45.0 -0.8
本实施例可从体外细胞试验角度,进一步验证PCA抑制试验的结果,也可作为疫苗效果的辅助性鉴定试验。
实施例12检测多肽抗血清有无激发过敏反应作用的“大鼠PCA激发试验”
作为免疫原的肽段如果选择不当,在Cell-bound IgE中仍暴露在外,那么它所诱导的抗体就有可能象过敏原一样,引起Cell-bound IgE交联(图1、图2)激发肥大细胞脱颗粒,反而导致过敏反应。本试验即为了检测此可能性。
将多肽抗血清,正常小鼠血清分别作1∶2稀释后,与1∶25小鼠致敏血清等量混合,25℃反应40分钟。取混合液分别注射正常Wistar大鼠背部皮下,每点0.1ml。同时设生理盐水,阳性对照(过敏原加1∶25致敏血清混合液)注射点。随即尾静脉注射0.5%伊文氏兰液0.5ml,再过2小时后处死动物剪下注射点皮片,以下步骤同PCA试验。PCA激发试验结果举例见表6。
表6
多肽抗血清的大鼠PCA激发试验(皮片浸液A610mm值)
多肽抗 测试大鼠编号
血清代号 1 2 3 4
生理盐水 0.007 0.015 0.002 0.007
阳性对照 0.090 0.086 0.098 0.085
A1-BSA-FCA 0.044 0.054 0.056 0.055
A2-KLH-FCA 0.026 0.024 0.027 0.043
A3-BSA-FCA 0.020 0.027 0.017 0.050
E2-BSA-FCA 0.036 0.032 0.053 0.063
G1-BSA-FCA 0.081* 0.102* 0.123* 0.082*
G1为取自IgE Cε2区的肽段,作对照用。*与阳性对照相比P<0.02(t检验)
以上结果表明,用G1肽段作免疫原所得抗血清有PCA激发作用,故G1肽段不适合作疫苗免疫原。而本发明的几种肽段作免疫原所得抗血清无PCA激发作用。
实施例13以破伤风类毒素(TT)或HBsAg作载体蛋白,脂质体(Lp)作佐剂的人IgE肽疫苗诱导的抗血清活性测定
用本发明所述五组人IgE合成肽中的一种、或二种、或三种组合,与TT(上海生物制品研究所TT半成品)或HBsAg交联,分别获得肽-载体复合物,制成脂质体疫苗。按实施例9程序分别接种Balb/c小鼠,得到抗血清。再按实施例10(二)测抗血清的PCA抑制活性(体内试验),并按实施例11,测抗血清的肥大细胞被动致敏抑制活性(体外试验)。结果举例见表7。
表7
脂质体疫苗诱导的抗血清的PCA抑制率%抗血清代号 抗血清稀释度
1∶4 1∶8 1∶16 1∶32A1-TT-LP 9.0±17.0 5.0±21.2 7.1±8.5 -0.8±10.3B2-TT-LP 6.4±6.7 8.9±10.7 9.6±8.3 13.8±11.4A1C1E2-TT-LP 4.9±25.0 -8.9±2 1.9 -14.8±28.1 -17.0±27.4A1E2-HBs-LP 23.9±16.1* 52.5±35.7* 57.8±47.5* 30.3±20.3A1C1E2-HBs-LP 44.7±40.2* 58.1±44.1* 55.5±79.1* 8.3±46.1*统计学处理差异有显著意义P<0.05。
表8
脂质体疫苗诱导的抗血清对大鼠肥大细胞被动致敏的抑制率%
抗血清代号 抗血清稀释度
1∶4 1∶8 1∶16 1∶32
A1E2-HBs-LP 63.8±33.9* 76.3±29.0* 50.9±21.7* 55.6±13.0*
A1C1E2-HBs-LP 74.3±31.9* 79.6±21.1* 49.7±2.7* 28.6±9.1
*统计学处理差异有显著意义P<0.01。
以上二表表明,以TT作载体蛋白的疫苗无效,而以HBsAg作载体蛋白的疫苗效果良好,二种试验抑制率均较高,差异有统计学意义。
实施例14以HBsAg作载体蛋白,脂质体作佐剂的人IgE肽疫苗,接种实验性致敏大、小鼠后,对大、小鼠致敏状态的影响(体内实验)
(一)大、小鼠实验性致敏程序:前二次天花粉蛋白注射按实施例10(一)的第1点进行,但大、小鼠不处死。第三次天花粉蛋白腹腔注射,大鼠用天花粉蛋白100μg、Al(OH)32mg;小鼠用天花粉蛋白2μg、Al(OH)30.5mg。
(二)肽-载体-脂质体疫苗接种程序
实验组:大、小鼠背部皮下多点注射三次,间隔三周,每只鼠接种剂量:首次大鼠肽-载体复合物100μg、小鼠20μg。第二次大鼠50μg、小鼠10μg、第三次、大鼠30μg、小鼠5μg。
对照组:同法皮下注射同等剂量的载体蛋白加脂质体
疫苗接种程序可与实验性致敏程序交叉进行,以缩短时间,一般分成Post和Pre二大组,程序交叉如下:
先致敏后免疫组(post-immunized):于第1、4、10周注射天花粉蛋白,于第5、8、11周注射疫苗、第12-13周采血测定。
先免疫后致敏组(Pre-immunized):于第1、4、10周注射疫苗,第5、8、11周注射天花粉蛋白,第12~13周采血测定。
(三)疫苗接种大小鼠血清致敏活性受抑制的测定-PCA试验(体内试验)
将上述Post和Pre两种程序接种后,实验组与对照组大、小鼠的血清,按实施例10(一)的第2点作PCA试验,结果见表9-11。
表9
疫苗接种实验性致敏小鼠之混合血清PCA试验的皮片浸液A610nm值
分组 PCA使用 实验性致敏小鼠血清稀释度
大鼠数目 1∶16 1∶32Post实验组 4 0.024±0.015* 0.013±0.008*
对照组 4 0.116±0.087 0.090±0.032Pre实验组 4 0.048±0.022* 0.025±0.015*
对照组 4 0.150±0.030 0.108±0.040*实验组与对照组相比P<0.05
表10
疫苗接种实验性致敏大鼠混合血清PCA试验的皮片浸液A610nm值分组 PCA使用 实验性致敏小鼠血清稀释度
大鼠数目 1∶4 1∶8 1∶16Post实验组 4 0.0060±0.007* 0.0168±2.0099* 0.0065±0.006
对照组 4 0.2085±0.1009 0.2175±0.1178 0.0240±0.0083Pre 实验组 4 0.0073±0.0031* 0.0250±0.0062* 0.0053±0.0036
对照组 4 0.1830±0.0891 0.2056±0.0765 0.0373±0.0113*实验组与对照组相比P<0.05
表11
疫苗接种实验性致敏大鼠同组各只血清1∶8稀释度
PCA试验皮片浸液A610mm值同组致敏大鼠 Post免疫血清 Pre免疫血清
编号 实验组 对照组 实验组 对照组
1 0.020 0.299 0.024 0.303
2 0.020 0.279 0.028 0.175
3 0.010 0.134 0.028 0.178
4 0.021 0.159 0.022 0.261
均值±SD 0.0168± 0.2175± 0.0250± 0.2056±
0.0099 0.1178 0.0062 0.0765
正常大鼠血清 0.019 0.020
以上三表表明,注射不含人IgE肽段的载体-脂质体的对照组大、小鼠血清仍有较强的被动皮肤致敏作用,反映血清中含有较高水平的抗天花粉蛋白IgE。而注射含人IgE肽段-载体-脂质体疫苗的实验组大小鼠血清不能引起或只引起弱的PCA作用。表明疫苗接种抑制了大、小鼠的致敏状态。
(四)疫苗接种实验性致敏大鼠血清特异性IgE的测定(体外实验)
50μg/ml浓度的天花粉蛋白液包被ELLSA板孔,洗涤后加入不同稀释度的实验组或对照组大鼠混合血清反应,洗涤后各孔再加酶标记的抗大鼠IgE单抗反应,其余步骤同实施例9的间接ELISA法。测定结果举例见表12。
表12
实验性致敏大鼠接种疫苗后血清特异性IgE的ELISA测定(A490nm值)血清 正常大鼠 Post免疫大鼠血清 Pre免疫大鼠血清稀释度 血清 对照组 实验组 对照组 实验组1∶100 0.32 1.76 0.45 1.92 0.681∶400 0.12 0.85 0.24 1.02 0.321∶1600 0.08 0.30 0.08 0.38 0.10
可见不论Post免疫或Pre免疫程序的对照组大鼠血清抗天花粉蛋白IgE含量显著高于实验组大鼠。此与PCA试验结果一致。
本实施例是模拟给过敏病人接种本发明疫苗,检测接种效果的动物体内实验模型。实验组小鼠或大鼠血清的PCA试验皮片染色程度或特异性IgE含量测定,均显著低于对照组,表明疫苗接种有效。