CN1202125C - 肽免疫原、用其制成的治疗变态反应的疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含人IgE受体结合部位结构的肽免疫原、用其制成的治疗变态反应的疫苗及其制备方法。本发明的肽免疫原是选自IgE的Cε3区和Cε4区的五个肽段组中的一种或一种以上肽，将其与载体蛋白交联形成免疫复合物或用基因技术制成融合蛋白，加以佐剂制成疫苗。此疫苗接种人体或哺乳动物后，诱导机体产生能与IgE起交叉反应的抗体，阻止IgE与受体结合，用于预防和治疗IgE介导的变态反应性疾病。

Description

肽免疫原、用其制成的治疗变态反应的 疫苗及其制备方法

                        技术领域

本发明属于分子免疫学范围，涉及治疗变态反应的疫苗及其制备，更具体地涉及含人IgE受体结合部位结构的肽免疫原、用其制成的治疗变态反应的疫苗及其制备方法。

                        背景技术

变态反应中的I型速发型变态反应(Type I immediate hypersensitivity)是由IgE分子介导的。特异质个体(atopic individual)接触过敏原(Allergen)后会产生较多的针对过敏原的IgE，此IgE经循环体液与组织中的肥大细胞、嗜碱性粒细胞(以下简称靶细胞：target cells)表面的高亲和力受体FcεRI结合，使这些细胞“致敏”(sensitised)。当过敏原再次进入机体时，就会与结合在靶细胞受体上的IgE(cell-bound IgE)的Fab′端发生特异性的抗原抗体反应并引起交联，触发细胞内信息传递导致细胞脱颗粒，释放组织胺、白细胞三烯等活性物质，引起急性炎症和疾病症状。

(一)I型速发型变态反应性疾病现有治疗方法

目前对此类疾病的治疗有两种方法，一是使用阻抑靶细胞脱颗粒和对抗所释放活性物质的药物，如抗组胺药、β₂拮抗剂、可的松类激素等，虽然有效，但只能对症，长期用药副作用较大。另一种方法是使用过敏原做“脱过敏”(desensitize)治疗，属免疫治疗方法，但治疗很费时间，也有风险，必须先弄清病人对那种过敏原过敏。目前，因过敏原种类有数百种，不同国家地区过敏原成分又有所不同，用于诊断和治疗的过敏原还没有标准化、产品化，许多医院不能开展“脱过敏”治疗。因此，若能从此病其他的发病环节入手，开辟新的治疗方法和药物是研究发展的方向。

(二)人IgE分子中受体结合部位结构的研究

IgE是机体产生的一种免疫球蛋白，它由二条轻链和二条ε重链组成。功能上可分为F(ab′)₂和Fc两部分，F(ab′)₂含两个Fab′端、负责与抗原特异性结合，Fc段由两个ε链恒定区的三个功能区Cε2、Cε3和Cε4区构成，负责与某些细胞上的Fc受体结合。机体嗜碱性粒细胞(basophils)和肥大细胞(mast cells)等表面有IgE Fc段的高亲和力受体(high affinity receptor，FcεRI)；而某些B淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和血小板表面有一种CD₂₃分子，它是IgE Fc段的低亲和力受体(Lowaffinity receptor，FcεRII)，其与IgE的结合反应有调节B细胞产生IgE和抑制炎症反应的作用。

因此，若能阻断IgE与FcεRI的结合，就阻止了靶细胞的致敏，阻断了I型变态反应的发病。

IgE的氨基酸残基排列顺序(一级结构)早已获得阐明(Bennich H.and Bahr-Lindastrom.H.Vou.Prog.Immnnol 11.pp49.1978)。根据这个顺序，国外80年代未90年代初研究了IgE分子中FcεRI结合部位的结构。通过采用人工合成肽和基因重组突变技术等，制备了一些人或动物IgE分子中的或长或短的肽段、或某些位点缺失或被置换的肽段、或嵌合性肽段，通过动物试验或带有FcεRI受体的细胞试验，初步表明与FcεRI结合的主要是IgE的Cε3功能区中的一些结构、可能还有Cε4功能区的一些结构，称之为“结合部位(binding sites)”和相关部位，这些部位在肽链上是不连续的。如Cε3功能区的肽链依次形成了A、B、C、D、E、F、G七个β片层骨架，相邻二片层间连接的残基序列形成一些露于表面活动度较大的半环或环状结构。IgE Cε3功能区的AB、CD、EF和FG环(Loop)结构和Cε4的1～2个相关结构参与了与FcεRI的结合(Nio，N.et al：FEBS Letters 1992314(3)：229；Nio，N.et al：FEBS Letters 1993.319(3)：225和Presta，L.et al：J Biochem.1994，269(42)：26368)。故含这些结构的肽段，可竞争占据靶细胞上的FcεRI受体，阻挡IgE与FcεRI的结合，使靶细胞不能致敏，而防止发病。

Nio，N等(EP 0263655 A2 880413和WO9204373 A1920319)用含有上述AB环，或FG环结构的或相似结构的合成肽(均少于50个氨基酸残基)作药物治疗剂。Presta L等(WO 9304173 AI 930304)用含AB、CD、EF、FG环结构或经改造的相似结构的基因重组多肽，称为受体特异性结合多肽(多为100个以上氨基酸残基的多肽)作治疗剂，以及用针对其中某一些结合多肽的小鼠或人源化单克隆抗体输送给机体作被动免疫(Passive immunity)治疗。Nio和Presta等设计制备的这些受体特异性结合多肽，对FcεRI的亲和力不如天然IgE，需高浓度才能起竞争性结合靶细胞受体的作用，尚未见实际使用效果的报导。而Presta等的相应单克隆抗体治疗剂则需人源化才可能应用。他们都没有提到用含结合部位结构的多肽作为免疫原制成疫苗，诱导主动免疫(active immunity)来治疗I型变态反应，因为这里有不少关键问题尚待解决，下面将阐述。

(三)用IgE分子的一部分结构作为免疫原进行主动免疫来防治I型变态反应的研究

基本原理：疫苗接种机体后，诱导机体产生抗IgE抗体，或与IgE起交叉反应的抗体(IgG类)。这些抗体能与游离(或称可溶性)IgE结合，阻挡了IgE与靶细胞表面受体结合，从而阻断发病，并且抗体与IgE结合产生的免疫复合物能被机体免疫清除机制所清除，使机体IgE水平下降。这里有几个关键问题要解决：(1)疫苗诱导的抗体必须只与游离的IgE分子反应，而不能与已结合在受体上的IgE(cell-bound IgE)反应。因为后者反而激发细胞脱颗粒引起过敏症状。因此必须精心选择作为免疫原的IgE分子结构。显然，选择其受体结合部位结构或相关结构为好。因为当IgE与受体结合后，即在cell-bound IgE中，这些结构已被掩盖，或发生构型变化，不能接触相应抗体而反应。(2)IgE及其分子结构都是机体正常成分，属于“自我”，一般不能被机体免疫系统识别，不会产生相应抗体。要使机体识别，需对这些结构进行改造，可能有效的办法之一是将其与异种载体蛋白偶联或制成融合蛋白。(3)若采用的IgE结构是小分子肽段(如Cε3区的AB、CD、EF、FG环都是不到20个氨基酸残基的小肽段)，因其免疫原性差，通常必须与大分子载体蛋白交联或融合才能成为有效的免疫原。载体蛋白主要功能之一是提供辅助性T细胞抗原决定簇。故选择好的载体蛋白，特别是可用于人体的载体蛋白很重要。(4)作为疫苗特别是免疫原性不强的疫苗，必须选好佐剂。目前能用于人体的佐剂不多，选择好的人用佐剂仍有困难。

杨平常等报道了用IgE的Fc段大分子加弗氏佐剂(FCA)免疫动物，能抑制动物血清IgE水平(中华微生物学免疫学杂志1994.14：407)。Hellmam等(Eur.J.Immun 1994.24：415)用含IgE Cε2和Cε3功能区的76个氨基酸残基的重组多肽融合蛋白作免疫原接种动物，证明也有效，并获得了专利(WO 9305810 A1930401)。Stanworth等用称为“组胺释放肽”的IgE Cε4区的一个10肽(Cys 497-Phe 506)与纯化结核菌素衍生蛋白(PPD)或钥孔血兰素(KLH)等载体蛋白交联，并加佐剂免疫动物。所诱导的抗体，可抑制大鼠被动皮肤过敏反应(PCA)，接种动物在以过敏原攻击时释放入血的组胺水平降低(Lancet 1990.336：1279；EP 0403 312 AI1990)。

用IgE Fc段或含Cε2和Cε3区的76个氨基酸残基重组多肽融合蛋白，虽然因其分子量较大而免疫原性较好，但是，这些大分子中除含结合部位结构外，还有许多其它结构，具有多个抗原决定簇、接种后产生的是多克隆抗体。其中有的抗体可与cell-bound IgE反应，激发过敏反应。此问题杨平常与Hellman等未作解释；而Presta在其专利说明书中提到了这种可能性，可见他没有提出用他的“受体特异性结合多肽”作免疫原作主动免疫，即出于此种考虑。Stanworth等的10肽分子很小，取自Cε4区，不属于上述受体结合部位结构。在cell-bound IgE中，此10肽被掩盖，而当Cell-bound IgE与过敏原反应时，此10肽凸现，与靶细胞表面另一受体结合导致释放组织胺，故称为“组胺释放肽”。疫苗诱导产生的抗体主要是阻止组胺释放肽与其受体的结合，而不是阻止IgE与FcεRI的结合。

这些专利中采用PPD、KLH作载体蛋白，并提出还可用动物血红蛋白、血兰蛋白、白蛋白、以及破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)等作载体蛋白。显然，这些载体蛋白只有PPD、TT、DT可用于人用疫苗，其它只能用作动物实验疫苗。

王长怡(Wang Chang Yi)认为载体疫苗所诱导的针对载体蛋白的抗体应答强于针对IgE免疫原结构的应答是一个缺点，故对Stanworth的10肽进行了改造。采用分枝状赖氨酸作骨架的合成肽多聚体技术，扩大分子量和抗原决定簇重复数目，融合入辅助性T细胞决定簇肽段代替载体蛋白，使Stanworth的10肽成为可能用于人体的实用疫苗。这是合成肽疫苗技术的一大进步，因而获得了专利(WO9526365和WO9612740等)并在中国申请了相应专利(CN95192778和CN95196496)。然而，这些专利涉及的只是IgE分子中Cε4区非受体结合部位的一个10肽。此外，由于人类个体之间白细胞抗原(HLA)类型互不相同，有万千种之多，不同个体所需的辅助性T细胞决定簇肽段也有很多种，王长怡设计的近百种辅助性T细胞决定族肽段可能是不够用的，人群接种的效果有待观察。

                        发明内容

本发明的目的在于提供一种合成肽免疫原，这种肽免疫原与大分子载体蛋白形成复合物后，可以诱导机体产生针对人IgE分子中受体结合部位结构的抗体。

本发明的目的还在于提供一种治疗变态反应的疫苗，这种疫苗接种机体后产生的与游离IgE起反应的抗体，可阻止IgE对肥大细胞、嗜碱性粒细胞等的致敏，从而抑制IgE介导的I型变态反应。

本发明的另一个目的在于提供治疗变态反应疫苗的制备方法。

本发明所用的合成肽免疫原，包含一种或几种免疫原性肽，所述免疫原性肽分别选自以下肽段组，所述肽段组各包含若干个含有如下氨基酸残基顺序结构的肽：

肽的编号    氨基酸残基顺序       所属受体结合部位      Bennich序号

A组A-1    PFDLFIRK                  Cε3区AB环           345-352

   A-2    PFDLFIRKSPTI

   A-3    SRPSPFDLFIRKSPTI

   A-4    YLSRPSPFDLFIRKSPTI

   A-5    CAPFDLFIRKAC

   A-6    ADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIR                        329-356

          KSPTI

B组B-1    TWSRASGKPVNHS             Cε3区CD环           373-385

   B-2    CTWSRASGKPVNHSAC

   B-3    GTVNLTWSRASGKPVNHSTR                           368-387

C组C-1    GTRDWIEGETY               Cε3区EF环           406-416

   C-2    CAGTRDWIEGETYAC

   C-3    PVGTRDWIEGETYQSR

   C-4    TSTLPVGTRDWIEGETYQSRVT                         400-421

D组D-1    PRALMRST                  Cε3区FG环           426-433

   D-2    HLPRALMRST

   D-3    HLPRALMRSTTK

   D-4    CAHLPRALMRSTAC                                 421-440

   D-5    THPHLPRALMRSTTKTSGPR

E组E-1    LHNEVQLPDAR               Cε4区               479-489

   E-2    LHNEVQLPDARHSTTQPR

   E-3    SVQWLHNEVQLPDARHSTTQPR                         475-496

其中，氨基酸残基的符号表示如下意义：

A Ala丙氨酸	R Arg精氨酸	D Asp天冬氨酸	N Asn天冬酰胺	C Cys半胱氨酸
					E Glu谷氨酸	G Gly甘氨酸	Q Gln谷氨酰胺	L Leu亮氨酸	K Lys赖氨酸
I Ile异亮氨酸	H His组氨酸	M Met甲硫氨酸	F Phe苯丙氨酸	T Thr苏氨酸
					W Trp色氨酸	Y Tyr酪氨酸	P Pro脯氨酸	V Val缬氨酸	S Ser丝氨酸

本发明所提供的治疗变态反应的疫苗，包含由上述肽免疫原与载体蛋白形成的免疫原性肽载体复合物及佐剂，或免疫原性肽载体融合蛋白及佐剂。

本发明所提供的治疗变态反应的疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)合成并纯化含有上述肽段组所列肽段氨基酸残基顺序结构的若干个肽；

(2)将合成并纯化的一种或几种肽用化学交联剂与载体蛋白交联形成免疫复合物；

(3)将所述免疫复合物与佐剂混合，制成疫苗。

本发明所提供的治疗变态反应的疫苗的另一种制备方法，包括以下步骤：

(1)将一种或几种上述肽段组所列结构的肽所对应的编码寡核苷酸序列，中间加以编码接头，在DNA合成仪上进行合成，

(2)连接经PCR法扩增的编码载体蛋白的基因，转入细菌质粒或噬菌体，在宿主细胞中增殖表达，分泌出免疫原性肽载体融合蛋白，

(3)将所述免疫原性肽载体融合蛋白与佐剂混合，制成疫苗。

下面对本发明作详细描述。

本发明通过给机体接种一种特殊的免疫原成分，使机体主动产生针对游离IgE的内源性抗体，此抗体与IgE反应就阻止了IgE与其FcεRI受体的结合，抑制了肥大细胞、嗜碱性粒细胞的致敏状态，阻断了IgE介导的变态反应发病环节，来治疗I型速发型变态反应。

本发明的肽免疫原含有以下肽段组所列肽段氨基酸残基顺序结构的若干个免疫原性肽：

肽的编号    氨基酸残基顺序      所属受体结合部位    Bennich序号

A组A-1    PFDLFIRK                  Cε3区AB环         345-352

   A-2    PFDLFIRKSPTI

   A-3    SRPSPFDLFIRKSPTI

   A-4    YLSRPSPFDLFIRKSPTI

   A-5    CAPFDLFIRKAC

   A-6    ADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIR                      329-356

          KSPTI

B组B-1    TWSRASGKPVNHS             Cε3区CD环         373-385

   B-2    CTWSRASGKPVNHSAC

   B-3    GTVNLTWSRASGKPVNHSTR                         368-387

C组C-1    GTRDWIEGETY               Cε3区EF环         406-416

   C-2    CAGTRDWIEGETYAC

   C-3    PVGTRDWIEGETYQSR

   C-4    TSTLPVGTRDWIEGETYQSRVT                       400-421

D组D-1    PRALMRST                  Cε3区FG环         426-433

   D-2    HLPRALMRST

   D-3    HLPRALMRSTTK

   D-4    CAHLPRALMRSTAC                               421-440

   D-5    THPHLPRALMRSTTKTSGPR

E组E-1    LHNEVQLPDAR               Cε4区             479-489

   E-2    LHNEVQLPDARHSTTQPR

   E-3    SVQWLHNEVQLPDARHSTTQPR                       475-496

其中，氨基酸残基的符号意义同上。

本发明的免疫原是从含有以上五组基本结构肽段的肽中选出的来自不同组的一种或几种(如A-1和B-2，或A-2、C-2和E-1，或A-1、C-1和E-2等等)组合而成。

上述五个肽段组，每组都有一个最短的肽，该组其余的肽都包含了这个最短肽的结构。因此最短肽是该组的基本结构。设计用作本发明疫苗的免疫原性肽进行人工合成或以基因工程技术制备时，先选一个组。该组中各个肽虽然都可选择，但较好的选择是选最短的肽，或比最短肽长但不超过该组最长肽的结构，这要看所选择肽段的水溶性如何。水溶性高的好。在较佳选择方案中，选择的肽长度在8-18个氨基酸残基为好，并可在两头添加丙氨酸和半胱氨酸，以使产生二硫键形成环状。进一步实施时，设计选择来自不同组的二个肽，如A-1肽和C1肽，或A-1肽和B-2肽，或A-1肽和E-2肽等。将这二种肽联合作为免疫原，进而制成疫苗。在更佳的实施方案中，设计选择来自不同组的三个肽，如A-1、C-1和E2肽，或A-2、C-2和E1肽，联合组成免疫原，进而制成疫苗。

本发明列出的以上五组肽段，都取自人IgE分子中FcεRI受体结合部位的结构，都具有免疫原性。同组的各个肽均含有该组最短肽的基本结构而具有相似的免疫原性、即可诱导出针对此基本结构的特异性抗体。也可诱导出能与人IgE受体结合部位结构起反应的特异性抗体。但由于同组各个肽的长度不一样，水溶性不一样。这种免疫原性强弱会有所差别，使用前要经过实验选择免疫源性较强的肽来应用。本发明的免疫原性肽覆盖了以上系列各组肽外，还覆盖未列出的含有以上五组各组最短肽基本结构的任何其它更长的肽，以及这些肽的任何联合。

这些肽段可用F-moc或T-boc系列氨基酸在自动多肽合成仪上用固相方法分别化学合成，经Sephadex G-25色谱法初步纯化或进一步用高效液相色谱法(HPLC)高度纯化加以制备。也可用基因重组方法表达于丝状噬菌体上，即将选出的一种或一种以上肽段相对应的编码寡核苷酸序列，中间加以编码接头(如[Gly4-Ser]₃)的寡核苷酸，在DNA合成仪上人工自动合成，连接用PCR法扩增的编码载体蛋白的基因，克隆插入到丝状噬菌体M₁₃株质粒的小包膜蛋白P₃或菌体包膜蛋白P₈的基因中，在噬菌体表面表达，筛选出表达阳性的噬菌体株，在大肠杆菌中大量增殖，分泌所要的肽载体融合蛋白，收集纯化。

本发明所用的载体蛋白主要是乙肝病毒表面抗原(HBsAg)或核心抗原(HBcAg)或狂犬病毒的核蛋白。它们都是基因工程的重组蛋白，HBsAg也可用血源性产品。其中以HBsAg为最好。因为不论血源性或重组性HBsAg都已正式用作人类疫苗，不需再做什么测定。若用于动物接种，可用牛血清白蛋白，KLH作载体蛋白。

当采用人工合成的上述肽段时，需要交联剂将其与载体蛋白共价交联。交联剂有双重氮联苯胺，马来酰亚胺苯甲酰基N-羟基丁二酰胺酯，或戊二醛(Glutaraldehyde)。交联时一种或一种以上肽段等量混合，混合物与载体蛋白如HBsAg的质量比为1∶1～2∶1。最好是1.5∶1。由于肽段分子量小得多。这样的质量比，可获得含有大量重复抗原决定簇结合在HBsAg上的复合分子。交联后用透析法或色谱法除去没交联上去的小分子合成肽段，就获得了大分子免疫原载体蛋白复合物。

不论是合成肽-载体蛋白复合物，还是基因重组的肽-载体融合蛋白(二者统称免疫原性肽载体复合物)都需加以佐剂才能组成疫苗。本发明所用佐剂主要是脂质体、氢氧化铝凝胶、γ菊粉、或Tucaresol，最好是脂质体。用作动物注射的实验疫苗则可用弗氏完全佐剂(FCA)和不完全佐剂(IFA)，或Ribi佐剂。

脂质体的脂质原料可为二氧乙烯十六烷基醚[C₁₆H₃₃(OCH₂CH₂)₂OH]、胆固醇和油酸。将三者按比例(如33∶11∶7分子量比)混合，加热至75～100℃融化澄清保持在50～60℃呈液态脂质。将免疫原性肽载体复合物以生理盐水或磷酸缓冲液(PBS)溶解配成适当蛋白浓度的溶液，与液态脂质按3∶1到5∶1体积比，最好是4∶1体积比，以推注法制成脂质体，即为疫苗。

本发明的脂质体还可用二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)等制备。将其中二种或三种按比例(如DSPC∶DSPG按摩尔比1∶3，DSPC∶DSPG∶DSPE-PEG按摩尔比10∶3∶1.45)混合，同法制备。

制备脂质体的这些原料均无毒性，在体内可降解成小分子，被代谢消除。

本发明的上述疫苗，采用皮下或肌肉注射法接种，每次剂量20至400微克(肽-载体复合物蛋白量)视儿童，少年和成人而不同。在发病季节可能需接种2～4次，间隔1个半月或二个月。

本发明疫苗能够防治I型变态反应疾病的基本原理是：本发明的特殊免疫原，是含有人IgE分子中FcεRI受体结合部位(binding sites)结构或相关结构的肽段组合物，接种机体后诱生的抗体与这些结构有交叉反应，即能与这些结构结合，从而阻止IgE与受体的结合。但这些抗体不与已结合在受体上的IgE反应，因cell-bound IgE的结合部位已被掩盖或阻挡。虽然每个IgE分子有两组受体结合部位，但当IgE的一组结合部位与受体结合后，其Fc段和另一组结合部位都发生了构型变化，不能再与原识别抗体反应。

本发明特殊免疫原诱生的抗体与IgE形成的复合物也可被体内免疫消除机制所清除，使循环性IgE水平降低，而cell-bound IgE在与游离IgE维持动态平衡过程中，一旦从受体上脱落恢复原构型时，也能被抗体所清除，从而靶细胞致敏状态就会减低。因此，接种本发明的免疫原，既可预防也可治疗IgE介导的过敏反应性疾病。

本发明采用组合的免疫原性肽和适当的载体蛋白来解决人群辅助性T细胞决定簇需要的多样性，因为在抗原提呈细胞(APC)对抗原的加工过程中，载体蛋白被分解成许许多多小分子肽段，各个个体的APC可根据各自的HLA型从中选择所需肽段，来活化辅助性T细胞，促进免疫应答。

本发明的免疫原性肽交联人用载体蛋白，加上可人用的佐剂，制成的疫苗给人体或哺乳动物接种进行主动免疫，诱导机体产生能与游离IgE起交叉反应的抗体，阻止IgE与受体结合。此外，还诱生较高滴度针对HBsAg的抗体。此种抗体非但对机体无害，而且可保护人体防御乙肝病毒的感染，或可能有利于乙型肝炎的康复。

                        附图说明

图1表示人IgE分子ε链Cε2、Cε3和Cε4区氨基酸残基顺序与结构。其中氨基酸残基为Bennich序数，缩写字母的意义同前。。

图2表示过敏原与结合在肥大细胞受体上的IgE(Cell-bound IgE)的Fab′端发生特异性抗原抗体反应并引起交联，导致脱颗粒。

图3表示针对Cε2区的抗体可与Cell-bound IgE结合、交联，导致脱颗粒。

图4表示本发明的肽免疫原诱导的针对IgE受体结合部位的抗体IgG与游离的IgE结合，从而阻止IgE与FcεRI受体结合。

图2-图4中，M为肥大细胞，FcεRI为肥大细胞表面对IgE Fc段具有高亲和力的受体。

                      具体实施方式

以下用实施例对本发明作进一步的详细说明。必须指出，这些实施例仅仅是为了说明而不是限制本发明。在此基础上所作的任何变动和修改都落在本发明的范围内。

实施例1人IgE多肽的化学合成和脂质体疫苗的制备

(一)多肽的化学合成

按本发明所设计的A、B、C、D、E五组各个多肽的氨基酸残基序列，分别在ABI 431多肽自动合成仪(Applied Biosystemes公司)上，按操作说明，逐一进行固相法化学合成(Sheppard RC：Science Tools 1986，33：9-16)。采用的HMP树脂、F-moc系列活化氨基酸和主要化学试剂均为ABI公司产品，合成完毕，取出干燥的肽-树脂，在冰浴中加入预冷的解离混合液(结晶酚0.75g、二硫乙二醚0.25ml，苯甲硫醚0.5ml，去离子水0.5ml，三氯乙酸10ml)，加入量按0.1～1.5g肽树脂加10ml计。室温搅拌反应1.5小时。抽滤分离肽溶液，再置40℃水浴旋转蒸发浓缩至1～2ml。加入5ml冷乙醚沉淀多肽，抽滤收集沉淀物，真空干燥获得粗肽。粗肽用Sephadex G-25柱层析纯化，洗脱液为10％乙酸，收集的肽溶液冻干备用。

纯化的各个多肽，以高效液相色谱法(HPLC)(如Beckman 110B型仪器)进行纯度分析，用ULTRAPORE^TM RPS柱(4.6mm×75mm)，流动相用乙睛，检测模式可用Model 163，250mm。要求HPLC纯度≥70％。若低于此，应用制备型HPLC进一步纯化，可使用DELTA PAK 15μC18 300柱(Waters公司)。流动相用乙腈。合成的各个多肽序列是否正确，用质谱仪进行质谱分析，也可用氨基酸自动分析仪进行氨基酸组分分析。

(二)多肽-载体蛋白的制备(戊二醛交联法)

用纯化的牛血清白蛋白(BSA)作载体蛋白。取此种载体蛋白4mg，A-1多肽(或B-1，或E-1多肽)1mg，分别溶于0.015M PBS(pH7.1～7.3)液中，体积视多肽溶解程度而定，以尽量少为好，一般1ml左右。载体蛋白液与多肽液混合后，加入等体积0.2％戊二醛液(也用同一PBS液配制)，37℃搅拌反应30分钟，然后加入NaBH₄使其最终浓度为10mg/ml，继续搅拌1小时。反应液装透析袋，以4～10℃PBS液充分透析，即为单一多肽-载体蛋白复合物，用Bradford法测定蛋白浓度。过滤除菌，无菌保存。

(三)脂质体疫苗的制备

取二氧乙烯十六烷基醚(商品名Brij 52 Aldrich产品)1.92g，胆固醇0.75g，油酸0.33g，混合，加热至75～100℃融化澄清。取此液态混合脂质0.5ml，置一无菌针筒中，50～60℃保温。另取2ml含0.25mg/ml～1.0mg/ml上述肽-载体蛋白复合物的溶液置另一无菌针筒内，50～60℃预热3～5分钟。二针筒以双通针头(直径0.47mm)连接，来回推注45～50次，操作温度从50～60℃移至37℃再移至室温，即获乳白色可流动之脂质体疫苗。

实施例2

除了用KLH(美国Piere公司产品)作载体蛋白外，按实施例1(二)、(三)的方法制备多肽-载体蛋白和进一步制成脂质体疫苗。

实施例3

用不含保护剂的纯化TT(系相应疫苗的半成品)作为载体蛋白。取此种载体蛋白2mg配成溶液：另取A-4多肽及C-1多肽(或A-1多肽及E-1多肽等)各2mg溶于PBS中。载体蛋白液与混合多肽液混合后，加入戊二醛液使其最终浓度为0.2％，用与实施例1(二)同样的方法，获得二肽-载体蛋白复合物，并用与实施例1(三)同样的方法制得疫苗。

实施例4

除用HBsAg(血源性或重组产品，系相应疫苗的半成品)作为载体蛋白外，用与实施例3同样的方法，制得二肽-载体蛋白复合物和疫苗。

实施例5

取纯化TT 2mg，A-1多肽、B-多肽及C-1多肽(或A-1多肽、C-1多肽和E-1多肽等)各1mg，以PBS配成溶液后混合，加戊二醛至终浓度0.2％，25℃反应40分钟。反应液以Sephadex G-25柱层析分离。其余步骤与实施例1相同，获得三肽-载体蛋白复合物，并进一步制成疫苗。

实施例6

除了用HBsAg作为载体蛋白外，与实施例5相同，获得三肽-载体蛋白复合物和疫苗。

实施例7

将不溶性的多形性γ菊粉与氢氧化铝凝胶按Cooper的“标准方法”(Cooper PDand Steele EJ：Vaccine 1991.9(5)：351)制成Algammulin，其中γ菊粉与氢氧化铝的比例为10∶1。再用旋涡混合器(Vortex)将实施例1-6中得到的免疫原性肽载体复合物生理盐水溶液与Algammulin迅速混合并均匀分散，20℃放置15分钟。使免疫源性肽载体复合物(简称抗源)完全吸附在Algammulin上，制成疫苗。一般1mg Algammulin颗粒可吸附1～25μg抗源，每只小鼠免疫可用此种疫苗0.4-2.0mg作皮下或腹腔注射。

实施例8重组人IgE肽-载体融合蛋白的制备、检定和纯化

在DNA合成仪上，人工合成上述人IgE的二个或三个肽段的编码基因，中间以接头DNA[如(Gly4-Ser)₃]联接。然后，按常规方法克隆到PBluescript KS质粒中，构成PBE1质粒。另用PCR法扩增乙肝病毒HBsAg的编码基因，纯化后将其“a”决定簇基因的3′端，与PBE1质粒中IgE肽基因的5′端相连。再将此融合基因插入到丝状噬菌体M₁₃小包膜蛋白P₃基因的N端。然后感染敏感大肠杆菌，培养增殖。具体操作按“分子克隆实验指南”(Sambrook J等著。金冬雁、黎孟枫译，科学出版社1993)一书201-233页进行。从固体培养基上挑选出抗药性噬菌体菌落分别培养，取各培养的上清液作ELISA检测。

ELISA检测采用常规双抗体夹心法，即用抗HBsAg抗体包板→加待测的培养上清反应→加酶标抗HBsAg抗体。

选择ELISA呈强阳性反应对应的噬菌体培养管，在大肠杆菌中放大培养，收集培养上清液。此液中含有克隆成功能表达重组人IgE肽-HBsAg融合蛋白的噬菌体所分泌的产物。将其超滤浓缩后，用50％饱和度硫酸铵沉淀。沉淀物重溶解后经Saphadex G-25柱脱盐，然后上HBsAg抗体亲和层析柱纯化。

纯化的重组人IgE肽-HBsAg载体融合蛋白经纯度分析后，用于制备疫苗。

实施例9

制备多肽抗血清并检测其对多肽和IgE的活性

将实施例1～6制备的肽-载体蛋白复合物，首次加弗氏完全佐剂(FCA)，后二次加强注射加弗氏不完全佐剂(IFA)，给Balb/c小鼠(雄、14克左右)注射，每组10～20只小鼠，每只皮下多点注射肽-载体蛋白复合物5～10μg，各次间隔3～4周。第三次注射后7～14天，眼眶放血，同组小鼠血合并，分离血清，即为多肽抗血清。

测定多肽抗血清活性的间接ELISA法。将A-1(或B-1等)合成肽以pH9.6、0.1M碳酸缓冲液配成1μg～5μg/ml浓度，包被96孔ELISA板孔，每孔50μl，4～16℃过夜。以洗涤液(含0.05％Tween 20的PBS)洗板孔后，各孔分别加入五倍系列稀释的多肽抗血清，以正常小鼠或载体蛋白免疫小鼠血清作对照，37℃反应1.5小时。洗涤4～5次，加入1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(酶标抗体)，每孔50μl，37℃反应1小时。洗涤板孔五次，各孔加底物(邻苯二胺1mg/ml)液100μl、室温反应15分钟，加4N硫酸液100μl终止反应。在酶标分光光度仪上读取各孔A_490nm吸光值。多肽抗血清对各合成肽的ELISA测定举例见表1。

                             表1

              多肽抗血清对各自合成肽的反应活性

多肽抗血清                       ELISA A_490nm值

稀释度       对照鼠血清      抗A-1血清   抗B-1血清    抗E-1血清

1∶100          0.12            1.95        2.10         0.80

1∶500          0.05            1.58        1.80         0.30

1∶2500         0.03            0.95        1.30         0.18

1∶12500        0.01            0.45        0.65         0.05

从表1可见，各多肽抗血清对自身多肽均有强的或较强的反应，表明此多肽交联载体蛋白加上佐剂后，具有免疫原性，选择设计的该多肽有效，可考虑作为疫苗候选。

另一种ELISA法是以天花粉蛋白包板，先加入小鼠抗天花粉蛋白IgE单抗(培养上清)使小鼠IgE结合在板上，洗涤后，加待测多肽抗血清反应后，有的抗肽抗体可与小鼠IgE结合。洗涤，再加酶标羊抗鼠IgG抗体反应。显色程序同上。测定结果举例见表2。

                           表2

              多肽抗血清对各自合成肽的反应活性

多肽抗血清                      ELISA A_490nm值

稀释度       对照鼠血清    抗A-1血清     抗A-2血清    抗E-1血清

1∶50           0.09         0.69          0.15         0.46

1∶200          0.07         0.55          0.10         0.33

1∶800          0.04         0.39          0.06         0.20

1∶3200         0.02         0.010         0.02         0.09

小鼠抗天花粉蛋白IgE单抗培养上清为中科院上海细胞生物所提供。

从表2可见，抗A-1血清和抗E-1血清，与小鼠IgE有交叉反应性，而抗A-2血清则无。

实施例10评价多肽抗血清抗过敏活性的“大鼠被动皮肤过敏反应(PCA)抑制试验”(体内试验)

(一)大鼠被动皮肤过敏反应(PCA)。

1.含IgE致敏血清制备

取C57小鼠或Balb/c小鼠，10周龄，雌，20～30只，每只腹腔注射天花粉蛋白(上海金山制药厂生产)10μg，第一次加4mg Al(OH)₃，第二次加2mg Al(OH)₃，间隔三周。用Wistar大鼠，雄，150克，每只腹腔注射天花粉蛋白400μg，第一次加10mg Al(OH)₃，第二次加5mg Al(OH)₃、间隔3周。第二次注射后7-10天。小鼠眼眶采血，血液合并；大鼠心脏取血。分离血清，即为含有针对天花粉蛋白IgE的致敏血清。

2.大鼠PCA试验

将致敏血清以生理盐水作1∶25，1∶50，1∶75稀释，分别给剪去背毛的正常Wistar大鼠(雄200～250克)作皮内注射，在背脊两侧皮内每点0.1ml。以正常小鼠或大鼠血清作对照。4小时后，给大鼠经尾静脉注入天花粉蛋白2mg 0.5％伊文氏兰液0.5ml(均以生理盐水配制)。15～30分钟内注射点呈现兰斑。处死大鼠剪下各注射点皮片，分别剪碎后浸入3ml丙酮生理盐水(丙酮与盐水体积比7∶3)中，试管密封过夜，使皮片兰色浸出。次日比色测定各皮片浸液的A_610nm值，举例见表3。

                                  表3

                        PCA试验皮片浸液A_610nm值

 测试用   生理盐    1∶4正常          小鼠致敏血清             大鼠致敏血清

大鼠编号  水对照    鼠血清    1∶25      1∶50     1∶75      1∶8      1∶16

  No1     0.002     0.005     0.188      0.102     0.049      0.148     0.072

  No2     0.005     0.010     0.246      0.124     0.056      0.174     0.096

  No3     0.007     0.015     0.330      0.160     0.088      0.186     0.102

  No4     0.007     0.010     0.210      0.110     0.058      0.138     0.066

(二)多肽抗血清的PCA抑制试验

将多肽抗血清以生理盐水作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释，分别与小鼠致敏血清(1∶25)等量混合，以单纯载体蛋白免疫小鼠血清作阴性对照进行同样处理。各混合液于25℃反应40分钟后，分别注射正常大鼠(Wistar，雄，200～250克)背部皮内，每点0.1ml。注射点安排一般是脊背一侧为阴性对照混合液3～4个点，另一侧为多肽抗血清混合液3～4个点，以脊柱为中心对称。另设生理盐水一个点，阳性对照(1∶50致敏血清)一个点，每只大鼠可注射8-10个点。4小时后尾静脉注射天花粉蛋白2mg、0.5％伊文氏兰液0.5ml，以后操作同PCA试验。多肽抗血清的PCA抑制率按下面公式计算：

一些多肽抗血清的PCA抑制率举例见表4。

                                   表4

                     多肽抗血清对大鼠PCA的抑制率％

多肽抗血清                               多肽抗血清稀释度

   代号               1∶4              1∶8              1∶16            1∶32

A₁-BSA-FCA        65.0±26.1^*     58.6±4.9^*       41.7±12.4^*       34.1±9

A₃-KLH-FCA        66.3±20.9^*     54.8±18.4^*      29.6±12.9         9.6±8

B₂-BSA-FCA        32.9±20.2^*     25.9±12.2^*      17.3±10.6^*       11.2±1

C₁-BSA-FCA        40.5±15.6^*     31.3±18.5^*      29.3±10.9^*       29.4±2

E₂-BSA-FCA        37.0±21.5^*     34.7±8.4^*       43.3±9.4^*        25.9±2

*统计学有显著差异P＜0.05

表4显示，所例举的5个多肽抗血清都有程度不同的PCA抑制活性。

实施例11评价多肽抗血清抗过敏活性的“大鼠肥大细胞被动致敏抑制试验”(体外试验)

(一)准备大鼠肥大细胞悬液。Wistar大鼠，雄，200～250克。乙醚麻醉后，处死。立即腹腔注入15～20ml无Ca⁺⁺HBT液(配方见后)。搓柔腹部2分钟，剪开腹膜，吸出注入的HBT液，避免出血。吸出液离心(1200rpm×5分钟)，并以HBT液再洗涤一次。细胞重悬在2ml HBT液中。离心后，弃上清，加入4ml0.05M、pH3.5乳酸缓冲液，20℃处理5分钟，使结合在肥大细胞表面的IgE脱落。随即加入4ml HBT，洗涤一次，重悬至1.5ml。取样阿利新兰染色作肥大细胞计数。即为非纯化的富含肥大细胞悬液。

(二)被动致敏及多肽抗血清对被动致敏的抑制。将多肽抗血清，及作为对照用的单纯载体免疫血清，分别以HBT液作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释，然后各与1∶4稀释度的小鼠致敏血清(见实施例10(一))等量混合37℃反应30分钟。取各混合液0.1ml与上述肥大细胞悬液0.1ml共置一个试管内，37℃反应1小时。此步骤，致敏血清中的小鼠IgE可使肥大的细胞致敏，而多肽抗血清若能与IgE交叉反应，就部分阻止其的致敏作用，使致敏肥大细胞数减少。反应毕，洗涤细胞一次，各管重悬于0.1ml HBT液中，再均分为二小管，各50μl细胞悬液，一管为非激发管，另一管为激发管。

(三)激发肥大细胞脱颗粒。非激发管加入50μl HBT液，激发管加入50μl含6μg/ml浓度的天花粉蛋白液(用HBT液配)。37℃反应15分钟。随后各管加入0.15ml阿利新兰染色15分钟。显微镜下计数各管肥大细胞数，并计算出各稀释度抗血清的脱颗粒系数DI。

DI＝(非激发管肥大细胞数-激发管肥大细胞数)÷非激发管肥大细胞数

多肽抗血清对肥大细胞被动致敏的抑制率按下式计算。

HBT液配方：

NacI            13.7mM            CaCl₂          0.1mM

KCI             0.27mM            Hepes           1mM

NaH₂PO₄      0.04mM            葡萄糖          0.56mM

MgCl₂          0.05mM            明胶            0.1mg/ml

配制时按10倍浓度配，使用时作1∶10稀释，以0.2M NaOH调节至pH7.0多肽抗血清对大鼠肥大细胞被动致敏的抑制作用测试举例见表5。

                            表5

          多肽抗血清对肥大细胞被动致敏的抑制作用(％)

多肽抗血清                   多肽抗血清稀释度

   代号           1∶4        1∶8        1∶16       1∶32

A₁-BSA-FCA       62.5        64.9        57.2        -14.5

A3-BSA-FCA        61.7        65.6        45.0        -0.8

本实施例可从体外细胞试验角度，进一步验证PCA抑制试验的结果，也可作为疫苗效果的辅助性鉴定试验。

实施例12检测多肽抗血清有无激发过敏反应作用的“大鼠PCA激发试验”

作为免疫原的肽段如果选择不当，在Cell-bound IgE中仍暴露在外，那么它所诱导的抗体就有可能象过敏原一样，引起Cell-bound IgE交联(图1、图2)激发肥大细胞脱颗粒，反而导致过敏反应。本试验即为了检测此可能性。

将多肽抗血清，正常小鼠血清分别作1∶2稀释后，与1∶25小鼠致敏血清等量混合，25℃反应40分钟。取混合液分别注射正常Wistar大鼠背部皮下，每点0.1ml。同时设生理盐水，阳性对照(过敏原加1∶25致敏血清混合液)注射点。随即尾静脉注射0.5％伊文氏兰液0.5ml，再过2小时后处死动物剪下注射点皮片，以下步骤同PCA试验。PCA激发试验结果举例见表6。

                                 表6

           多肽抗血清的大鼠PCA激发试验(皮片浸液A_610mm值)

多肽抗                              测试大鼠编号

血清代号            1             2             3             4

生理盐水           0.007         0.015         0.002         0.007

阳性对照           0.090         0.086         0.098         0.085

A₁-BSA-FCA        0.044         0.054         0.056         0.055

A₂-KLH-FCA        0.026         0.024         0.027         0.043

A₃-BSA-FCA        0.020         0.027         0.017         0.050

E₂-BSA-FCA        0.036         0.032         0.053         0.063

G₁-BSA-FCA        0.081^*       0.102^*       0.123^*      0.082^*

G₁为取自IgE C_ε2区的肽段，作对照用。^*与阳性对照相比P＜0.02(t检验)

以上结果表明，用G₁肽段作免疫原所得抗血清有PCA激发作用，故G₁肽段不适合作疫苗免疫原。而本发明的几种肽段作免疫原所得抗血清无PCA激发作用。

实施例13以破伤风类毒素(TT)或HBsAg作载体蛋白，脂质体(Lp)作佐剂的人IgE肽疫苗诱导的抗血清活性测定

用本发明所述五组人IgE合成肽中的一种、或二种、或三种组合，与TT(上海生物制品研究所TT半成品)或HBsAg交联，分别获得肽-载体复合物，制成脂质体疫苗。按实施例9程序分别接种Balb/c小鼠，得到抗血清。再按实施例10(二)测抗血清的PCA抑制活性(体内试验)，并按实施例11，测抗血清的肥大细胞被动致敏抑制活性(体外试验)。结果举例见表7。

                                 表7

                 脂质体疫苗诱导的抗血清的PCA抑制率％

抗血清代号                           抗血清稀释度

                     1∶4               1∶8              1∶16              1∶32

A₁-TT-LP           9.0±17.0          5.0±21.2         7.1±8.5          -0.8±10.3

B₂-TT-LP           6.4±6.7           8.9±10.7         9.6±8.3          13.8±11.4

A₁C₁E₂-TT-LP    4.9±25.0          -8.9±21.9        -14.8±28.1       -17.0±27.4

A₁E₂-HBs-LP      23.9±16.1^*       52.5±35.7^*      57.8±47.5^*      30.3±20.3

A₁C₁E₂-HBs-LP   44.7±40.2^*       58.1±44.1^*      55.5±79.1^*      8.3±46.1

^*统计学处理差异有显著意义P＜0.05。

                               表8

       脂质体疫苗诱导的抗血清对大鼠肥大细胞被动致敏的抑制率％

抗血清代号                         抗血清稀释度

                          1∶4              1∶8              1∶16               1∶32

A₁E₂-HBs-LP          63.8±33.9^*      76.3±29.0^*      50.9±21.7^*       55.6±13.0^*

A₁C₁E₂-HBs-LP       74.3±31.9^*      79.6±21.1^*      49.7±2.7^*        28.6±9.1

^*统计学处理差异有显著意义P＜0.01。

以上二表表明，以TT作载体蛋白的疫苗无效，而以HBsAg作载体蛋白的疫苗效果良好，二种试验抑制率均较高，差异有统计学意义。

实施例14以HBsAg作载体蛋白，脂质体作佐剂的人IgE肽疫苗，接种实验性致敏大、小鼠后，对大、小鼠致敏状态的影响(体内实验)

(一)大、小鼠实验性致敏程序：前二次天花粉蛋白注射按实施例10(一)的第1点进行，但大、小鼠不处死。第三次天花粉蛋白腹腔注射，大鼠用天花粉蛋白100μg、Al(OH)₃ 2mg；小鼠用天花粉蛋白2μg、Al(OH)₃ 0.5mg.

(二)肽-载体-脂质体疫苗接种程序

实验组：大、小鼠背部皮下多点注射三次，间隔三周，每只鼠接种剂量：首次大鼠肽-载体复合物100μg、小鼠20μg。第二次大鼠50μg、小鼠10μg、第三次、大鼠30μg、小鼠5μg。

对照组：同法皮下注射同等剂量的载体蛋白加脂质体

疫苗接种程序可与实验性致敏程序交叉进行，以缩短时间，一般分成Post和Pre二大组，程序交叉如下：

先致敏后免疫组(post-immunized)：于第1、4、10周注射天花粉蛋白，于第5、8、11周注射疫苗、第12-13周采血测定。

先免疫后致敏组(Pre-immunized)：于第1、4、10周注射疫苗，第5、8、11周注射天花粉蛋白，第12～13周采血测定。

(三)疫苗接种大小鼠血清致敏活性受抑制的测定-PCA试验(体内试验)

将上述Post和Pre两种程序接种后，实验组与对照组大、小鼠的血清，按实施例10(一)的第2点作PCA试验，结果见表9-11。

                             表9

  疫苗接种实验性致敏小鼠之混合血清PCA试验的皮片浸液A_610nm值

   分组        PCA使用           实验性致敏小鼠血清稀释度

               大鼠数目         1∶16                1∶32

Post实验组        4         0.024±0.015^*       0.013±0.008^*

    对照组        4         0.116±0.087         0.090±0.032

Pre 实验组        4         0.048±0.022^*       0.025±0.015^*

    对照组        4         0.150±0.030         0.108±0.040

^*实验组与对照组相比P＜0.05

                                      表10

               疫苗接种实验性致敏大鼠混合血清PCA试验的皮片浸液A_610nm值

   分组         PCA使用                      实验性致敏小鼠血清稀释度

               大鼠数目          1∶4                   1∶8              1∶16

Post实验组        4         0.0060±0.007^*        0.0168±2.0099^*    0.0065±0.006

    对照组        4         0.2085±0.1009         0.2175±0.1178       0.0240±0.0083

Pre 实验组        4         0.0073±0.0031^*       0.0250±0.0062^*    0.0053±0.0036

    对照组        4         0.1830±0.0891         0.2056±0.0765       0.0373±0.0113

^*实验组与对照组相比P＜0.05

                                表11

           疫苗接种实验性致敏大鼠同组各只血清1∶8稀释度

                        PCA试验皮片浸液A_610mm值

同组致敏大鼠           Post免疫血清                   Pre免疫血清

   编号          实验组             对照组        实验组        对照组

    1             0.020             0.299         0.024         0.303

    2             0.020             0.279         0.028         0.175

    3             0.010             0.134         0.028         0.178

    4             0.021             0.159         0.022         0.261

均值±SD          0.0168±                      0.2175±              0.0250±            0.2056±

                  0.0099            0.1178        0.0062        0.0765

正常大鼠血清               0.019                          0.020

以上三表表明，注射不含人IgE肽段的载体-脂质体的对照组大、小鼠血清仍有较强的被动皮肤致敏作用，反映血清中含有较高水平的抗天花粉蛋白IgE。而注射含人IgE肽段-载体-脂质体疫苗的实验组大小鼠血清不能引起或只引起弱的PCA作用。表明疫苗接种抑制了大、小鼠的致敏状态。

(四)疫苗接种实验性致敏大鼠血清特异性IgE的测定(体外实验)

以50μg/ml浓度的天花粉蛋白液包被ELLSA板孔，洗涤后加入不同稀释度的实验组或对照组大鼠混合血清反应，洗涤后各孔再加酶标记的抗大鼠IgE单抗反应，其余步骤同实施例9的间接ELISA法。测定结果举例见表12。

                                   表12

       实验性致敏大鼠接种疫苗后血清特异性IgE的ELISA测定(A_490nm值)

血清          正常大鼠          Post免疫大鼠血清          Pre免疫大鼠血清

稀释度          血清         对照组       实验组      对照组       实验组

1∶100          0.32         1.76         0.45        1.92         0.68

1∶400          0.12         0.85         0.24        1.02         0.32

1∶1600         0.08         0.30         0.08        0.38         0.10

可见不论Post免疫或Pre免疫程序的对照组大鼠血清抗天花粉蛋白IgE含量显著高于实验组大鼠。此与PCA试验结果一致。

本实施例是模拟给过敏病人接种本发明疫苗，检测接种效果的动物体内实验模型。实验组小鼠或大鼠血清的PCA试验皮片染色程度或特异性IgE含量测定，均显著低于对照组，表明疫苗接种有效。

Claims (15)

1.合成肽免疫原，包含人IgE分子Cε3和/或Cε4结构域内参与FcεRI受体结合的局部结构的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含至少一种选自以下A至E组的免疫原性肽段，但不包括同组内不同肽段的组合：

肽的编号      氨基酸残基顺序              所属局部结构    Bennich序号

A组A-1        PFDLFIRK                    Cε3区AB环      345-352

A-2           PFDLFIRKSPTI

A-3           SRPSPFDLFIRKSPTI

A-4           YLSRPSPFDLFIRKSPTI

A-5           CAPFDLFIRKAC

A-6           ADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIR                     329-356

              KSPTI

B组B-1        TWSRASGKPVNHS               Cε3区CD环      373-385

B-2           CTWSRASGKPVNHSAC

B-3           GTVNLTWSRASGKPVNHSTR                        368-387

C组C-1        GTRDWIEGETY                 Cε3区EF环      406-416

C-2           CAGTRDWIEGETYAC

C-3           PVGTRDWIEGETYQSR

C-4           TSTLPVGTRDWIEGETYQSRVT                      400-421

D组D-1        PRALMRST                    Cε3区FG环      426-433

D-2           HLPRALMRST

D-3           HLPRALMRSTTK

D-4           CAHLPRALMRSTAC                              421-440

D-5           THPHLPRALMRSTTKTSGPR

E组E-1        LHNEVQLPDAR                 Cε4区          479-489

E-2           LHNEVQLPDARHSTTQPR

E-3           SVQWLHNEVQLPDARHSTTQPR                      475-496

2.治疗变态反应的疫苗，包含有权利要求1所述肽免疫原与载体蛋白形成的免疫原性肽载体复合物及佐剂。

3.如权利要求2所述的疫苗，其中所述免疫原性肽载体复合物是由免疫原性肽与载体蛋白用化学交联剂交联而成的复合物。

4.如权利要求2所述的疫苗，其中所述免疫原性肽载体复合物是用基因工程技术表达成的免疫原性肽与载体蛋白的融合蛋白。

5.如权利要求2-4中任一项所述的疫苗，其中所述载体蛋白选自乙肝病毒表面抗原或核心抗原或狂犬病毒的核蛋白。

6.如权利要求5所述的疫苗，其中所述载体蛋白为乙肝病毒表面抗原。

7.如权利要求2-4中任一项所述的疫苗，其中所述佐剂选自脂质体、氢氧化铝凝胶、γ菊粉或Tucaresol。

8.如权利要求7所述的疫苗，其中所述佐剂为脂质体。

9.如权利要求2所述的疫苗，所述疫苗系人用疫苗。

10.权利要求2所述治疗变态反应疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)合成并纯化含有以下各肽段组所列肽段氨基酸残基顺序结构的一个或若干个肽：

肽的编号      氨基酸残基顺序                 所属局部结构    Bennich序号

A组A-1        PFDLFIRK                       Cε3区AB环      345-352

A-2           PFDLFIRKSPTI

A-3           SRPSPFDLFIRKSPTI

A-4           YLSRPSPFDLFIRKSPTI

A-5           CAPFDLFIRKAC

A-6           ADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIR                        329-356

              KSPTI

B组B-1        TWSRASGKPVNHS                  Cε3区CD环      373-385

B-2           CTWSRASGKPVNHSAC

B-3           GTVNLTWSRASGKPVNHSTR                           368-387

C组C-1        GTRDWIEGETY                    Cε3区EF环      406-416

C-2           CAGTRDWIEGETYAC

C-3           PVGTRDWIEGETYQSR

C-4           TSTLPVGTRDWIEGETYQSRVT                         400-421

D组D-1        PRALMRST                       Cε3区FG环      426-433

D-2           HLPRALMRST

D-3           HLPRALMRSTTK

D-4           CAHLPRALMRSTAC                                 421-440

D-5           THPHLPRALMRSTTKTSGPR

E组E-1        LHNEVQLPDAR                    Cε4区          479-489

E-2           LHNEVQLPDARHSTTQPR

E-3           SVQWLHNEVQLPDARHSTTQPR                         475-496

(2)将含有一种或几种以上不同肽段组氨基酸序列的肽用化学交联剂与载体蛋白交联形成免疫复合物；

(3)将所述免疫复合物与佐剂混合，制成疫苗。

11.权利要求2所述的治疗变态反应疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将含有一种或几种以下不同肽段组氨基酸序列的肽所对应的编码寡核苷酸序列，中间加以编码接头，在DNA合成仪上进行合成，

肽的编号      氨基酸残基顺序                 所属局部结构    Bennich序号

A组A-1        PFDLFIRK                       Cε3区AB环      345-352

A-2           PFDLFIRKSPTI

A-3           SRPSPFDLFIRKSPTI

A-4           YLSRpSPFDLFIRKSPTI

A-5           CAPFDLFIRKAC

A-6           ADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIR                        329-356

              KSPTI

B组B-1        TWSRASGKPVNHS                  Cε3区CD环      373-385

B-2           CTWSRASGKPVNHSAC

B-3           GTVNLTWSRASGKPVNHSTR                           368-387

C组C-1        GTRDWIEGETY                    Cε3区EF环      406-416

C-2           CAGTRDWIEGETYAC

C-3           PVGTRDWIEGETYQSR

C-4           TSTLPVGTRDWIEGETYQSRVT                         400-421

D组D-1        PRALMRST                       Cε3区FG环      426-433

D-2           HLPRALMRST

D-3           HLPRALMRSTTK

D-4           CAHLPRALMRSTAC                                 421-440

D-5           THPHLPRALMRSTTKTSGPR

E组E-1        LHNEVQLPDAR                    Cε4区          479-489

E-2         LHNEVQLPDARHSTTQPR

E-3         SVQWLHNEVQLPDARHSTTQPR                           475-496

(2)连接经PCR法扩增的编码载体蛋白的基团，转入细菌质粒或噬菌体，在宿主细胞中增殖表达，分泌出免疫原性肽载体融合蛋白，

(3)将所述免疫原性肽载体融合蛋白与佐剂混合，制成疫苗。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述载体蛋白为乙肝病毒表面抗原。

13.如权利要求10或11所述的方法，其中所述佐剂为脂质体。

14.如权利要求10所述的方法，其中所述化学交联剂为戊二醛，或双重氮联苯胺，或马来酰亚胺苯甲酰基N-羟基丁二酰胺酯。

15.如权利要求11所述的方法，其中宿主细胞为大肠杆菌，或酵母菌。

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