CN1173204A - 刺激粘膜免疫的免疫原 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于刺激针对能通过接触哺乳动物粘膜感染其宿主的病原体的粘膜免疫的免疫原,本发明公开了一些多肽和遗传构建物,包括与病原体的肽可操作连接的膜结合多肽。将这些免疫原引入哺乳动物以刺激粘膜免疫应答的方法在权利要求书和说明书中进行了详细描述。

Description

刺激粘膜免疫的免疫原
发明领域
本申请涉及针对某些生物体产生粘膜抗体的方法，这些生物体通过与哺乳动物粘膜接触而感染其宿主。本申请特别涉及适于产生免疫原而诱导粘膜抗体的蛋白复合物及基因构建物，还涉及将免疫原引入哺乳动物产生粘膜免疫应答的方法。
发明背景
各种引起疾病的感染诱发因素一般均能接触身体的粘膜表面。这些表面包括胃肠道、泌尿生殖道和呼吸道。身体的外表面受连续的角质化鳞样上皮层保护，而身体的粘膜表面缺乏这种角质化的保护层，因此更易受偶然侵入的生物体感染。毫不奇怪，这些表面(粘膜表面)成为外源微生物进入体内的主要入口。
身体粘膜表面有广泛的免疫系统。无包被的淋巴样组织以分散的细胞团或有组织的淋巴结形式散布于胃肠道和泌尿生殖道的粘膜。分散的淋巴样细胞团散布于本体纤层，而淋巴结或者称派伊尔氏淋巴结，包括增殖的B细胞的生发中心和T细胞活性的周边区域，更多集中于粘膜的某些部位。
粘膜表面的淋巴样细胞能对外源抗原作出应答。覆盖派伊尔氏淋巴结的肠道表皮允许抗原转运入淋巴样组织，有抗原呈递细胞的功能(Bromander，et al.《斯堪的那维亚免疫学杂志》37：452-458，1993)。分泌的IgA(sIgA)能穿越粘膜，常是偶然侵入的诱发因素接触哺乳动物粘膜表面所遇到的第一道防御。
能有效阻止因粘膜感染而引起的疾病的疫苗优选′刺激IgG和分泌的IgA。限制粘膜感染的有效疫苗可能引起并显示分泌的IgA活性。
许多性传播疾病，如衣原体病、淋病、梅毒、软下疳、滴虫病均由通过粘膜进入体内的生物体引起。尽管这些疾病由不同生物引起并以不同方式复制，但这些性传播微生物及其他微生物均主要通过粘膜屏障进入机体。这些及大多数其他引起疾病的生物均携带独特的抗原决定簇，刺激免疫系统。此外，粘膜表面也是大多数病毒的主要入口。因此，对病毒，包括但不限于流感病毒、乳头状瘤病毒，HIV、疱疹病毒家族成员及其他类似病毒的粘膜表面免疫也在感染、繁殖阶段及病毒释放的部分时期与粘膜表面整体相关。开发针对这些生物体的疫苗的尝试并不成功，因为非胃肠道的疫苗一般不产生明显水平的分泌免疫。
非病毒的性传播疾病如诊断早可以得到治愈，但许多这种疾病早期症状轻微，因此直到症状加重才去治疗。
衣原体病是主要感染宿主泌尿生殖道系统粘膜的性传播疾病的例子。沙眼衣原体是美国首要的性传播生物体，每年约感染4百万人(STD/HIV预防部门，1992年年报，CDC，亚特兰大，1993)。衣原体病主要通过阴道性交或肛门性交染上，也能通过口交传染。生殖道感染沙眼衣原体能引起妇女输卵管炎，引起输卵管阻塞和不育。据估计在美国每年有200,000妇女由于衣原体病输卵管炎而不育，而且，感染此病的人得HIV的危险性增大(Wasserhiet.“流行病学的增效作用：人类免疫缺陷病毒感染和其他性传播疾病的相互关系”性传播疾病，19：61-77，1992)。极其需要改进控制该疾病病理学表现的方法。
沙眼衣原体分离物有15个不同的血清型，分属3个亚组，主要外膜蛋白(MOMP)决定血清型和血清组特性。对衣原体的保护免疫就是针对主要外膜蛋白的免疫应答。
衣原体主要外膜蛋白的比较分析表明MOMP基因保守，有4个可变区对每种血清型均是独特的。这些可变区决定血清型，亚种，血清组或种特异性的抗体，可变区IV(VDIV)是最大的MOMP可变区，位于蛋白的C-末端。VDIV含亚种、血清组抗原决定簇和一个保守的种特异性的抗原决定簇。MOMP所有的可变区均是外部表位，这由其对胰蛋白酶的敏感性及其对抗体结合的可及性所证实。本发明涉及将来自MOMP或其他病原体蛋白的抗原决定簇与粘膜结合多肽结合在一起，这些病原体包括但不限于HIV，肝炎病毒和肠道毒性大肠杆菌，它们均通过接触粘膜而感染哺乳动物宿主。
几种介质已证明为刺激粘膜免疫的有效载体和佐剂(参看Bienenstock，J.“粘膜表面免疫的实质-简明综述”，《呼吸道和胃肠粘膜的细菌感染)》，编辑Doncachie，W等，IRL出版社，1988年，9-18页)。来自不同感染介质的可及表位已用基因工程方式连于减毒的活载体表面，如牛痘或鼠伤寒沙门氏菌(见Flexner等，“携带克隆的外源基因的作为活载体的牛痘”，《新一代疫苗》，编辑Woodrow，G.C.，等，Marcel Dekker出版社，纽约1990，189-206页和Curtiss，R.“用于表达外源抗原的作为活载体的减毒沙门氏菌株”，书目同上，161-188页)。非活性的载体系统允许免疫学可及表位作为遗传构建物的产物或作为化学偶连到携带介质上的多肽呈递到免疫系统。这种非活性载体系统包括微粒，脂质体，固体基质抗体-抗原复合物，免疫刺激复合物(ISCOMs)和蛋白载体，包括B型肝炎病毒的核心抗原，脊髓灰质炎病毒粒子，霍乱毒素和来自大肠杆菌的不耐热肠毒素。
载体本身可以有内源佐剂活性或者外源佐剂可与载体一起使用。牛的胆汁已用作口服痢疾灭活疫苗等口服免疫原的佐剂。其他用于诱导粘膜免疫并得到检测的佐剂包括DEAE-4葡聚糖，溶菌酶，多聚鸟苷酸，十二烷基苯磺酸钠，脂类缀合的物质，链霉素和维生素A(见Holmgren等，《疫苗》11：1170-1184，1993)。此外，如胞壁酰二肽，吖啶和西咪替丁也有一些正效用(见Bienenstock等，同上)。
霍乱毒素能产生粘膜免疫，也是有效的增加口服疫苗免疫效果的佐剂。霍乱毒素由霍乱弧菌产生。该毒素分子已弄清，其天然形式由5个装配成环状的结合B亚基和一个单独的A亚基构成。B亚基结合细胞表面的GM1受体，B亚基结合后，A亚基转位到细胞内部。霍乱毒素已作为口腔粘膜免疫原使用，也是诱导针对霍乱毒素及其他抗原的分泌IgA的有效佐剂(Lycke，N和Holmgren，《免疫学杂志》59：301-308，1986)。大肠杆菌的不耐热肠毒素也有免疫调节和佐剂性质。
与外源抗原偶连的霍乱毒素已用于刺激胃肠道的免疫应答。如将霍乱毒素B亚基化学偶连于链球菌抗原已引起肠道粘膜表面和唾液腺的抗体反应(Czerkinsky等，《感染免疫学》57：1072-1077，1989)。霍乱毒素/仙台病毒缀合物免疫接种已在呼吸道产生仙台病毒特异性的免疫球蛋白。
尽管霍乱毒素已用于刺激对细菌的免疫应答并选择胃肠道病毒抗原，但还没有成功的方法用于产生总体粘膜免疫或泌尿生殖道粘膜的有效免疫。而且即使在用霍乱毒素或其亚基刺激针对外源抗原的免疫应答时，该免疫应答与针对霍乱毒素载体产生的免疫应答相比水平仍较低。如将氨基酸残基加到CTB的N或C末端有时会干扰最终产物的折叠和组装(Sandkvist等，《细菌学杂志》169：4570，1987和Clements J.D.《感染免疫学》58：1159-1166，1990)。当这些构建物在霍乱弧菌中生产时，外源表位可能被细菌蛋白酶切除掉(Schodel，等《基因》99：255-259，1991)。因此，仍有必要改进霍乱毒素来源的免疫原。
与现有技术不同，本发明揭示的蛋白复合体和基因构建物可刺激针对导致性传播疾病病原体的粘膜免疫。此外，还揭示了增加与粘膜结合多肽相连的外源表位的稳定性的基因构建物。还揭示了全部或部分由大肠杆菌或霍乱弧菌表达的蛋白复合体。
这样，本发明不仅揭示了产生针对非病毒的性传播病原体及各种病毒病原体的粘膜免疫应答的策略，而且还揭示了使用不同基因构建物增加对外源抗原免疫应答的方法。
附图简述
图1示出产生本发明的pMLλ大肠杆菌表达载体的策略。
图2提供了优选的使用tac启动子的表达载体实例；图2(a)示出从tac启动子表达CTB的质粒；图2(b)示出与图2(a)中同样的载体，额外携带了ctxAB基因片段，用于构建CTA2融合蛋白。图2(c)示出图2(b)中揭示的质粒，额外含有lacIq基因以帮助ctxAB的可诱导x-gal表达。图2(d)示出携带修饰的ctxB基因的质粒，该基因用于在单一的KpnI和MscI位点间框内插入内部表位。
图3示出从λ噬菌体左向启动子表达CTB的质粒以产生CTB融合体(pML-LCTBλ7)或CTA融合体(pPJλ)。
图4示出寡核苷酸序列SEQ ID NO：5，用于再产生ctxA信号肽和用于克隆外源表位到构建物中的单一酶切位点。
图5提供了合成寡核苷酸序列SEQ ID NO：24和SEQ IDNO：25，用于将衣原体T细胞和B细胞表位插入ctxA基因。方盒内的序列代表衣原体多肽。
图6提供了寡核苷酸序列SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，用于形成连接衣原体表位A8(SEQ ID NO：6)和VDIV(SEQ ID NO：1)的接头。pML-LCTBtac 或pML-LCTBλ和pPJVDIV的邻近的SacI和NheI序列也在图中标出。
图7示出编码CTB：杂合蛋白的质粒pCB55-64gp309的构建。本图示出母本质粒pML-LCTBtac接受了外源抗原序列。质粒pCB55-64gp309含来自gp120的氨基酸309-318的HIV抗原序列。方框内示出位于KpnI和BssHII间的gp120核酸序列，插入的gp120序列以斜体表示。
发明概述
本发明涉及对刺激粘膜免疫及一些蛋白复合物有用的免疫原，这些免疫原可用于检测针对粘膜结合蛋白的抗体或针对来自能通过粘膜感染哺乳动物的病原体的外源抗原的抗体的存在。此外，本发明还涉及诱导针对能通过粘膜感染哺乳动物的病原体的粘膜表面免疫的方法。
本发明的一个实施方案中，涉及的粘膜结合组合物包括一个粘膜结合多肽，其连接到至少一个引起性传播疾病的非病毒病原体的抗原。在一个优选实施方案中，粘膜结合多肽是霍乱毒素的一个结合亚基，而在另一个实施方案中，粘膜结合多肽额外包括至少霍乱毒素A亚基的一部分。在一个优选实施方案中，来自非病毒病原体的抗原来自衣原体。
衣原体抗原可定位于霍乱毒素结合亚基的氨基端，定位于霍乱毒素A亚基一部分的氨基端或者定位于霍乱毒素结合亚基的内部。抗原可通过重组或化学手段连接到粘膜结合蛋白。
在一个优选的实施方案中，抗原来自衣原体的主要外膜蛋白的B细胞刺激抗原。在一个特别优选的实施方案中，B细胞刺激抗原来自衣原体主要外膜蛋白的VDIV区域。而在另一优选的实施方案中，抗原进一步包括一个T辅助细胞刺激抗原并且优选地该抗原也来自衣原体的主要外膜蛋白。在一个实施方案中，T辅助细胞刺激抗原来自衣原体的主要外膜蛋白，而在一个优选的实施方案中，是来自衣原体的主要外膜蛋白的A8区域。
本发明另一个实施方案中，公开了一种针对非病毒性传播疾病产生粘膜免疫反应的方法，包括以粘膜结合组合物接触哺乳动物宿主的粘膜。
而在本发明另一个实施方案中，公开了一些重组多肽，它们包含一个编码粘膜结合多肽的第一区域和一个编码引起性传播疾病的非病毒病原体抗原的第二区域。在一个优选实施方案中，粘膜结合多肽是霍乱毒素结合亚基，病原体是衣原体。在此实施方案中，优选的抗原包括一个T辅助细胞刺激抗原和一个B细胞刺激抗原，均来自衣原体的外膜蛋白。在一个特别优选的实施方案中，B细胞刺激抗原来自衣原体主要外膜蛋白的VDIV区域。
本发明还涉及给哺乳动物接种以预防衣原体感染的方法，所述方法包括将有效剂量的已连接有衣原体主要外膜蛋白的B细胞表位和T细胞表位的霍乱毒素结合亚基给予哺乳动物粘膜。在一个优选实施方案中，给药部位为阴道，而在其它实施方案中，则通过直肠或口腔给予疫苗。
本发明另外还涉及一些粘膜结合组合物，它们包括结合了至少一个引起性传播疾病的病毒病原体抗原的粘膜结合多肽。在一个优选的实施方案中，粘膜结合多肽包含霍乱毒素结合亚基而抗原是HIVgp120抗原。而在另一个实施方案中，抗原是B型肝炎病毒pre-s(2)抗原，在此基础上的另一实施方案中，粘膜结合多肽连接到至少一个来自肠毒性大肠杆菌的STa蛋白的抗原。
本发明还涉及纯化的重组多核苷酸，包括编码与B细胞刺激抗原可操作连接的粘膜结合蛋白的核酸，其中的抗原是得自能通过粘膜感染哺乳动物的病原体的肽。在一个优选的实施方案中，粘膜结合蛋白编码霍乱毒素结合亚基，而在另一实施方案中，核酸进一步编码霍乱毒素CTA(2)亚基。在一个优选实施方案中，B细胞刺激抗原编码包括LNPTIAG氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，B细胞刺激抗原来自HIVgp120。
而在另一个优选实施方案中，编码B细胞刺激抗原的核酸位于编码粘膜结合蛋白的核酸的编码区框架内。B细胞刺激抗原可以分别包括氨基酸序列LNPTIAG，来自HIVgp120蛋白的抗原，B型肝炎病毒的pre-s(2)蛋白或肠毒性大肠杆菌STa蛋白。在这些实施方案中，编码B细胞刺激抗原的核酸长度为21-150碱基之间，更优选为21-60碱基之间。
发明详述
本发明涉及用于产生针对不同的病毒和非病毒病原体的粘膜免疫应答的免疫原；还涉及制备免疫原的方法，并涉及对能通过接触宿主粘膜而感染哺乳动物的病原体产生粘膜免疫应答的方法。
术语“免疫可及”用于描述那些当与粘膜结合多肽相连引入时可到达免疫系统的抗原序列。
术语“T细胞刺激抗原”或“T细胞抗原”用来指明那些在公知的标准T辅助细胞分析中单独或与其它蛋白结合能刺激T辅助细胞活性的肽、多肽、蛋白或糖类、脂类、核酸等非蛋白类分子。
术语“B细胞刺激抗原”或“B细胞抗原”用来指那些能刺激B细胞产生抗体的肽、多肽、蛋白质或糖类、脂类、核酸等非蛋白类分子。
术语“ctxA”和“ctxB”指编码霍乱毒素A和B亚基的基因序列。
术语“粘膜结合组合物”用来指包括粘膜结合多肽和能通过粘膜感染哺乳动物的病原体的抗原的组合物。术语“粘膜结合多肽”用来指能结合哺乳动物粘膜表面的多肽。
本领域已公开了许多不同的粘膜结合多肽，粘膜结合组合物至少包括一种粘膜结合多肽。其它与粘膜结合多肽相连的多肽也在本发明范围内。本发明的粘膜结合多肽包括但不限于细菌毒素膜结合亚基，其中至少有霍乱毒素B亚基，大肠杆菌不耐热肠毒素的B亚基，百日咳杆菌毒素亚基S2，S3，S4和/或S5，白喉毒素的B片段和志贺毒素或志贺样毒素的膜结合亚基。
本发明范围内的其他粘膜结合亚基包括细菌纤毛蛋白，其中有大肠杆菌纤毛K88，K99，987P，F41，CFA/I，CFA/II(CS1，CS2和/或CS3)，CFA/IV(CS4，CS5和/或CS6)，P型纤毛或类似物。本发明范围内的其他纤毛包括百日咳杆菌丝状血细胞凝集素，霍乱弧菌毒素共调节菌毛(TCP)，甘露糖敏感性血细胞凝集素(MSHA)，岩藻糖敏感性血细胞凝集素(PSHA)等。
本发明范围内的其它粘膜结合分子包括病毒附着蛋白，其中有流感和仙台病毒血细胞凝集素，动物凝集素或类凝集素分子，如免疫球蛋白分子或其片段，依赖钙(C型)的凝集素，选择蛋白，收集蛋白(collectin)或Helix pomatia血细胞凝集素。具有粘膜结合亚基的植物凝集素包括伴刀豆球蛋白A，麦胚凝集蛋白，植物血细胞凝集，相思豆毒蛋白和蓖麻蛋白。
本发明公开了粘膜结合组合物在刺激针对能通过宿主粘膜感染哺乳动物宿主的病原体的粘膜免疫中的应用。在一个优选的实施方案中，公开了使用细菌毒素粘膜结合亚基产生针对病原体的粘膜免疫的方法，在本实施方案的一方面中将霍乱毒素或大肠杆菌不耐热肠毒素嵌合构建物与得自病原体的抗原进行偶连，在本实施方案的另一方面公开了将粘膜结合多肽如霍乱毒素B亚基或大肠杆菌不耐热肠毒素的粘膜结合部分与得自病原体的抗原相偶连的方法。
本发明的膜结合组合物可以用于刺激分泌免疫球蛋白，分泌免疫球蛋白可用于ELISA，免疫印迹等诊断分析。另外，结合组合物本身能用于分析测定样品中针对膜结合多肽或外源表位的抗体的存在。而且从实验动物收集的分泌抗体能用于针对特定病原体的局部用药制备物中，或作为局部用药制备物的一个基本组分，或者用于评估分泌免疫球蛋白的特性研究中。
现有技术中已有不同的获取粘膜结合多肽的方法，多肽或其片段可以从自然界分离或者化学合成，或者从原核、真核表达系统中作为重组产物生产，本领域熟练技术人员能够选择并检测一种粘膜结合多肽用作载体的功能及辅助外源抗原呈递到免疫系统的能力。
为了选择并确定是否一特定的粘膜结合多肽能辅助外源抗原呈递到免疫系统，本领域熟练人员可从文献或其它研究来源着手选择粘膜结合多肽。粘膜结合蛋白可从自然界纯化也可从重组表达系统得来，作为范例的粘膜结合多肽上面已提供。为了表达重组蛋白，分子生物学领域熟练人员首先使用本领域公知的标准技术分离编码这一基因的核酸片段，并将这些片段插入表达系统。本领域有范围极广的真核、原核表达系统，熟练人员完全能准确将编码粘膜结合多肽的核酸片段插入不同的基因表达载体中。本文作为例子提供的基因表达构建物适于在大肠杆菌、霍乱弧菌中表达。或者，粘膜结合多肽可使用已知纯化技术从自然界分离。
接下来检测重组或纯化的粘膜结合多肽结合测试抗体的能力，该测试抗体已知能识别天然存在的粘膜结合多肽。合适的测试抗体识别的方法包括ELISA，免疫印迹或其它已知的免疫学检测法。举例性ELISA和免疫印迹已在实施例中说明(见实施例4和6)。这些检测法已广为人知，熟练人员很容易将其稍作改动以鉴定其它粘膜结合蛋白。随后，候选的粘膜结合蛋白要进一步检测其结合粘膜的能力。粘膜结合分析在本领域中已知。这些分析使用固定的粘膜组织，组织培养的初生粘膜细胞、商品化的粘膜细胞系，或者分析用粘膜细胞膜裂解物或纯化的粘膜细胞膜蛋白。粘膜组织可取自活体解剖，加工成组织细胞培养物，或作为固定组织切片(来自尸体解剖标本或穿孔活体解剖)。粘膜细胞系商业来源广泛，下列细胞系来自美国典型培养物保藏中心(Rockville，马里兰)。包括结肠组织(ATCC#′s CRL1459，CRL1539，CRL1541和CRL1790)，鼻隔膜(CCL30)，腭(CRL1486)，直肠细胞系(CCL235，CCL234)，来自阴门的细胞系(HTB88，HTB117，HTB118)，支气管细胞系(CCL208)，口腔癌细胞系(CCL17)。可以在受试动物中进行另外一些结合分析，这些分析可能涉及如放射性同位素、连接抗体的酶，连接粘膜结合组合物的酶等报导分子，以检测对粘膜表面的结合。另外，结合分析也可用特异识别粘膜结合组合物的抗体通过ELISA，修饰的ELISA，Western印迹法等方法进行。
在本发明优选的系列实施方案中，霍乱弧菌毒素的亚基或片段用于指导免疫原到粘膜。在下述实施例中公开了实施方案，其详细说明了粘膜结合多肽霍乱毒素B亚基与源自引起性传播疾病的非病毒病原体的免疫原的连接。
尽管蛋白的一级结构不同，在大肠杆菌不耐热肠毒素的非毒性亚基(LTB)和霍乱毒素B亚基(CTB)间仍有许多惊人相似处。LTB基因序列由Leong，J.等提供(《感染免疫学》48：73-77，1985和Tsuji等《微生物致病机理》2：381-390，1987)。象CTB一样，当霍乱弧菌培养物用表达重组LTB的表达载体转化时，LTB可分泌到培养基中。另外，CTB和LTB结合粘膜上的神经节苷酯(Hirst等，《美国国家科学进展》，83：9174-9178，1984和Schodel等，《基因》99：255-259，1991)。Hirst等的文献表明CTB序列能用LTB序列代替，用于重组表达。因此，应理解的是CTB序列可以用LTB序列代替并用于以下详述的方法和实施例中。
有许多构建物可供本领域熟练人员制备并检测其增进产生针对引起性传播疾病的非病毒病原体的抗体反应的能力，其中粘膜结合多肽源自霍乱毒素或大肠杆菌不耐热肠毒素。以下非限制性实施例包括采用粘膜结合多肽的各种组合物和来自4种不同病原体的抗原；这些病原体的主要感染途径均是通过粘膜感染。
本发明的粘膜结合组合物含有至少一个来自通过粘膜进入宿主的病原体的抗原。本发明认为，来自这种病原体的免疫原能选自已知的能刺激对于这种病原体引起的疾病有易感性的哺乳动物免疫应答的各种免疫原。抗原应包括至少一个抗体刺激决定簇，以来自引起疾病的病原体的表面蛋白为佳。抗原是多肽时，其应含有至少一个氨基酸连续区域，优选来自病原体表面多肽的免疫可及区域。另外，抗体刺激多肽可任选地包括一个或多个来自病原体相同或不同蛋白的功能区。这些功能区可以包括其它刺激抗体的氨基酸序列，这些序列的重复拷贝或刺激T细胞的氨基酸序列，或通过激活T辅助细胞或其它T细胞群以辅助产生抗体反应的氨基酸序列。另外，抗体刺激决定簇可以串联重复或由合适的连接序列分开以进一步刺激抗体应答。
因此，选择本发明的抗原的第一步是鉴定能通过粘膜进入而感染哺乳动物的非病毒病原体。其次可任选地确定感染病原体的哺乳动物是否产生了对病原体的抗体应答。这一点可通过实验或基于特定病原体的相关文献判定。
确定感染了病原体的个体是否产生抗体应答的方法的一个例子是从哺乳动物抽取血清样品与含病原体的细胞裂解物接触，或与完整病原体接触，检测血清抗体结合样品的情况从而判断抗体的存在。可用于检测血清抗体结合的方法包括酶连免疫吸附分析(ELISA)，Western印迹分析等免疫印迹反应等。这些方法在本领域中已为人熟知，并在各种方法学教材中有详述，其中包括Harlow等的教材(《抗体：实验室手册》，冷泉港出版社，1988)。任选地，本领域熟练人员可选择直接测试哺乳动物中针对病原体的IgG或分泌抗体的存在。这些测试方法中，分泌液体从病人或受试动物粘膜表面洗下，任选地将体积用合适的浓缩法减到最小。然后用本领域熟知的标准免疫测试法测定病原血清体特异的免疫球蛋白，一般为分泌IgA或IgG的存在。
或者，本领域熟练技术人员可以判定哪一种或哪些蛋白刺激对病原体的体外中和免疫应答。使用熟知的Western印迹技术等可将刺激免疫应答的决定簇定位到特定蛋白。刺激免疫系统的决定簇可用本领域熟知的任一种策略定位到蛋白上。将刺激抗体的决定簇定位到蛋白上的方法实例见Geysun等和Miles等的文献(“使用肽合成的表位分析策略”，《免疫学方法杂志》102：259-274，1987和“用于B细胞和T细胞表位系统分析的多重肽合成”，《今日寄生虫学》5：397-400，1989)。
这些快速检测方法可鉴定能刺激免疫系统的决定簇，在文献中已知对不同病原体包括衣原体均适用。文献中已知有许多选择刺激B细胞抗体产生的线型抗原决定簇的方法，或者选择刺激T辅助细胞活性的决定簇。刺激对沙眼衣原体的T辅助细胞应答的表位的鉴定策略可阅读Su等的文献(《实验医药学杂志》172：203-212，1990)。鉴定刺激对沙眼衣原体抗体生产的表位，可参阅Zhong等(《感染和免疫》59：1141-1147，1991)。
本领域已熟知的肽定位策略可用于鉴定能刺激针对病原体的中和免疫应答的多肽。测试B细胞激活的决定簇刺激体外中和抗体能力的方法可查阅Zhang等的文献(《免疫学杂志》，438：575-581，1987)。
本领域熟练人员可通过所有这些步骤鉴定可与粘膜结合多肽相连的候选多肽序列。这些步骤提供了一种用于鉴定可与粘膜结合多肽相连的候选多肽序列的策略，但本领域熟练技术人员应理解每一个步骤对于鉴定能产生免疫应答的多肽并不是绝对必需的。
为使本领域熟练人员能鉴定源自一种通过粘膜进入宿主的病原体的多肽的联合是否能在与粘膜结合多肽相连时在哺乳动物中刺激抗体产生，本文提供了举例性的检测策略，在下面实施例中有详述(见实施例4和6)。
生产本发明组合物的第一步是将粘膜结合蛋白与选自病原体的抗原相连接。本申请范围内可包括不同的连接策略。如抗原可通过化学偶联或通过脂类、糖类、蛋白等连接成分连接到粘膜结合蛋白。或者，抗原可通过基因构建物手段与粘膜结合蛋白分开或一起合成。
作为使用本发明刺激针对能通过粘膜感染宿主的病原体的粘膜免疫应答的具体实施例，实施例1详细说明了膜结合多肽与来自病原体的决定簇化学偶连的优选策略。该实施例中，使用Lebens等的方法表达了霍乱毒素B亚基的一个片段(《生物技术》11：1574-1578，1993)，并且该片段化学偶联到沙眼衣原体主要外膜蛋白来源的免疫原上。
在一个优选的应用化学偶连的实施方案中，源自主要外膜蛋白的多肽是相应于沙眼衣原体主要外膜蛋白第四可变区的一部分的VDIV肽(SEQ IDNO：1)。在另一个优选的实施方案中，多肽是包含来自沙眼衣原体的主要外膜蛋白的A8区域和VDIV区域的线型嵌合多肽(SEQ ID NO：2)。Su等的文献说明了A8和VDIV区域及嵌合肽(《疫苗》11：1159-1166，1993)。
本发明另一个实施方案中，作为不同的连接策略的一个例子，来自引起性传播疾病的非病毒病原体蛋白的多肽作为重组蛋白与粘膜结合蛋白的一个亚基或片段一起表达。作为这种复合体重组表达的一个例子，粘膜结合蛋白是霍乱毒素的一部分，抗原决定簇来自沙眼衣原体。
应理解的是有不同的构建物设计能被用于表达具有霍乱毒素的一部分和来自能通过粘膜感染宿主的病原体蛋白的多肽的蛋白质。例如来自病原体的一个或多个抗原决定簇可置于B亚基的氨基端或羧基端，A亚基的氨基端或羧基端，或A亚基一部分的氨基端。在一个优选的实施例中，A亚基可操作连到B亚基。在另一个下面有详述的实施例中，抗原决定簇框内掺入到A或B亚基或其一部分的内部。
下面实施例中提供的这些构建物也能不需繁杂的实验从大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基得到。质粒的改变也在本发明涉及的范围之内。例如，研究工作还证明高拷贝的衍生质粒pML-LCTBtac2与pML-LCTBtac有相同限制酶图谱，但含有pUC19的复制起始点(见Lebens等，《生物技术》，与上述文献同)。这样，这一质粒的应用也在本发明范围内。
在实施例2中详述的一个构建物中，产生一个嵌合蛋白，包括一个羧基端连接到霍乱毒素B亚基(CTB)氨基端的多肽。作为证实该构建物也可类似地用于产生针对其它抗原的刺激抗体的例子，将HIV表位IQRGPGRAFV连接到B亚基的氨基端。
在实施例3中详述的本实施方案中，来自病原体的抗原连接到一条多肽的氨基端；该多肽是霍乱毒素A亚基片段和CTB的融合蛋白，并在大肠杆菌或霍乱弧菌中表达。本实施方案中，抗原肽是来自沙眼衣原体主要外膜蛋白的VDIV序列，而在另一优选实施方案中，抗原肽是来自主要外膜蛋白的A8序列。在本实施方案的第三方面中，肽是含抗原肽序列A8和VDIV的嵌合蛋白，A8与VDIV中间为接头所分开(见图6)。应理解的是同样的接头引入例如质粒pML-LCTBλ7会辅助任一表位多重拷贝的构建。或者此接头或其它接头可用来将A8和VDIV序列插入其它构建物，或者接头能辅助插入序列在载体间转移。本实施方案范围内抗原序列的顺序可变，A8或VDIV的多重决定簇可串联连接或在重组构建物内连接。
文献说明了沙眼衣原体的不同抗原肽序列，它们是血清特异的、亚型特异的或血清广泛保守的。来自沙眼衣原体主要外膜蛋白或其它蛋白的其它抗原肽也能用于在粘膜表面刺激抗体产生。
Jobling等(《(感染与免疫》60：4915-4924，1992)已生产出融合蛋白，其中整个细菌蛋白通过氨基端连到A亚基片段CTA2。但是Jobling等证明嵌合毒素可从霍乱毒素构建物生产，但嵌合物两部分均为细菌蛋白，嵌合表达的信号序列来自插入的细菌蛋白。本发明证明，对于细菌是外源的抗原序列能插入CTA2。有外源抗原序列的CTA2融合蛋白与来自霍乱弧菌的CTB共表达，产生分泌到胞外的组装产物，并可在GM1-ELISA中检测到。Jobling等的基因产物不能分泌到胞外。
在应用基因构建物的第三个实施例中，如实施例4详述，多肽读框内掺入粘膜结合多肽的内部，优选免疫可及位点。本策略的一个实施例中，一个短的外源多肽被引入霍乱B亚基内部区域，代替CTB56-63位氨基酸。在一个实施方案中，这一肽包括VDIV表位LNPTIAG，而在另一个实施方案中，为证明本策略可使用其它肽序列，肽是HIV中和表位IQRGPGRAFV(HIV-1分离物HTLV-IIIB的309-318位氨基酸)。
构建了6个额外质粒，编码内部HIV∷CTB杂合蛋白，其带有从gp120的V3环开始的10至14个氨基酸，这些氨基酸在氨基酸52与65之间的不同位点遗传插入，杂合蛋白还带有不同的CTB(霍乱毒素亚基)氨基酸缺失(见表1)。编码带有插入CTB55和64，53和64，或56和57间的肽的蛋白的质粒合成与CTB特异性单抗(mAb)反应并结合到GM1神经节苷脂上的蛋白。这表明这些位点的插入并不改变天然CTB的功能构象或受体结合特性。
而在另一实施例中，肽为来自B型肝炎病毒pre-S(2)蛋白的一部分；另一实施例中，肽是来自肠毒性的大肠杆菌的STa蛋白的两条肽之一。构建了编码CTB杂合蛋白的质粒，该杂合蛋白含有肝炎病毒(HBV)pre-S(2)的11个氨基酸肽(SEQ ID NO：28)，或与肠毒性大肠杆菌热稳定毒素(STa)相关的两条肽之一(SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31，见表1)。本工作证明内部允许位点(permissive site)可用来插入具若干不同氨基酸组成的肽。
表位特异性抗体用于GM1-ELISA和免疫印迹分析以检测杂合蛋白的构象完整性，结合膜决定簇的能力或被外源表位特异性抗体识别的能力。实施例4提供了与本检测有关的数据。所有CTB：外源抗原产物均在小鼠中诱导低水平的针对全长外源蛋白的血清抗体。此外，产物还刺激强烈的针对CTB的血清抗体反应。
实施例4的数据表明，本发明的CTB∷外源抗原杂合体保留了天然CTB的所有重要特征，如折叠，五聚化，在霍乱弧菌中表达时的胞外分泌，以及结合GM-1。而且，许多这些插入肽构建物抗霍乱弧菌蛋白酶的酶切。该实施例数据表明无论蛋白处于变性形式或是非变性形式，CTB∷外源抗原杂合体均可与针对外源抗原的单抗反应，这表明用来自无关蛋白如gp120，VDIV，pre-S(2)和STa的氨基酸取代天然分子中一个8个氨基酸的区域产生的构建物带有外源抗体，它可为宿主免疫系统所及。
应理解的是在本发明范围内可以改变插入肽的环境以增强免疫原性。例如可在插入肽的两侧加入一些残基，或可在CTB序列的插入允许区内移动插入物的位置，这些改变不限制本发明的范围。
一旦结合蛋白和抗原的粘膜结合复合物已得到，分别用抗外源抗原的抗体和抗粘膜结合蛋白的抗体检测复合物的完整性将是有益的。检测杂合蛋白表达的方法提供于实施例4和实施例6中。体外检测粘膜结合的方法可用于证明复合物的完整性。这些分析法包括对完整粘膜表皮细胞培养物或粘膜切片的结合分析。如果粘膜受体是已知的，特异ELISA或受体/配体层析分析等方法可用于确定粘膜结合。
接着，将复合物配成粘膜结合组合物，组合物任选地包括生理缓冲液，额外的佐剂等，以辅助哺乳动物中免疫应答的产生。该组合物通过阴道、口腔、直肠、鼻腔、肌肉内、腹膜内、静脉内引入哺乳动物。血清或粘膜免疫应答在实验哺乳动物中监控或通过ELISA、免疫印迹、Western印迹临床测试，以检测粘膜结合多肽的抗体或外源多肽抗体。可用本领域熟知的检测法检测血清或粘膜分泌物中的抗体是否存在对特定肽、多肽、病原体制备物的IgA，IgG或总抗体活性。粘膜分泌物通过灌洗、抽吸或冲洗法收集。粘膜分泌物也可通过灯芯效应使用吸收填充物如填塞物、吸收塞等收集。同样，本发明测试阶段的粘膜组织活体解剖样本可用来通过组织病理学或细胞活性分析针对粘膜结合多肽特定的免疫应答。制备活体解剖组织的方法见Eriksson等或Quiding等的文献(“Perfext：用于解剖学部位抗体和细胞因子定量分析的简单灌注-抽提程序”，摘要已提交第12次欧洲免疫学大会，1994年6月14-17日，以及《临床研究杂志》88(1)：143-148，1991)。在哺乳动物中检测IgG和IgA的策略是本领域熟知的，包括用ELISA法、免疫印迹法等测量血清或粘膜分泌物中的抗体。
本发明详述了将本发明的组合物引入哺乳动物以刺激抗体产生的方法，提供了刺激阴道、口腔和直肠免疫应答的方法(见实施例7-9)。
实施例7中详述的结果表明，用CTB∷HIV杂合蛋白免疫小鼠会产生对CTB部分的强烈的血清抗体应答，也观察到对外源表位的抗体。实施例10表明粘膜结合多肽与来自病原体的外源抗原的结合产生了病原体特异性粘膜抗体。
本文中所有提及的文献均以全文作为参考。本发明特定的实施方案在下面作了详细讨论，本发明范围内可能的改动也作了描述。本领域熟练人员可选用不同技术和程序成功实施本发明。
实施例1    多肽与膜结合蛋白的化学偶联
本例中，霍乱毒素B亚基(CTB)在霍乱毒素基因缺失并用编码CTB质粒(Lebens等，上述文献)转染的霍乱弧菌突变株中生产。在此表达系统中，CTB作为分泌蛋白回收产率达或超过1g/L。细菌培养物在8000转/分离心220分钟，上清用稀HCl调至PH4.5。在用六偏磷酸酯(终浓度2.5g/L)于23℃沉淀2小时后，用8000转/分离心，沉淀用0.1M磷酸钠盐(PH8.0)溶解，对0.01M磷酸缓冲盐水(PBS)PH7.2透析。透析液然后在15000转/分离心以去除不溶组合物，上清通过0.22um滤膜(Millipore，Bedford，MA)进一步澄清。CTB用标准的凝胶过滤层析法通过Sephadex G-100柱(Pharmacia，Upsala，瑞典)纯化。
根据厂商的指导，使用N-琥珀酰亚胺基(3-[2-吡啶基]-二硫代)丙酸酯(SPDP，Pharmacia)作为双功能偶连剂将多肽共价偶连到CTB。CTB在0.1M磷酸缓冲液/0.1M NaCl，PH7.5中由SPDP按摩尔比1∶5加以衍生化。在23℃温育30分钟后，过量的SPDP用凝胶过滤通过Sephadex G-25柱(Pharmacia)去除，并用PBS洗脱。这种被修饰蛋白的吸收值在280nm测定。为了估算用2-吡啶基二硫化物残基取代的程度，将400微升中的100微升蛋白溶液与50微升二硫苏糖醇(0.1M)温育15分钟后在343nm测定吸光值(343nm摩尔消光系数为8.08×103M-1cm-1)。这个浓度相当于蛋白中2-吡啶基二硫化物残基的浓度。因为2-吡啶基二硫化物基团在280nm有吸光值，所以蛋白浓度的计算需要修正：蛋白A280＝A280×(B×5.1×10-3)，其中B为释放的吡啶-2-硫酮的摩尔浓度。从这些结果，可计算每摩尔蛋白中取代的2-pyridyldisulphide摩尔数。这些条件下取得的取代率为每摩尔CTB五聚体2-3摩尔的SSPY。
肽与SPDP衍生化的CTB按5mol肽/1mol SSPY的比率混合，在23℃温育24小时。产生的CTB-肽缀合物用凝胶过滤通过Sephadex G-25柱来纯化。缀合物在Sephadex G-25的GM1柱纯化。纯化的缀合物保留了GM1结合能力，并保留了CTB和肽的特异血清学反应活性，缀合物的这些性质是通过固相ELISA法证明，其中以GM1为捕捉系统，并使用抗CTB或与CTB偶联的外源多肽序列的酶标抗体。使用GM1的举例性ELISA法在下述实施例4和6中说明。
本实施方案中，三个不同的肽与CTB缀合。首先，肽166(SEQ ID NO：13，A8-VDIV)是共线性肽，由Su等描述(《疫苗》，11：1159-1166，1993)，它含有单一的半胱氨酸残基，肽172(SEQ ID NO：14)有一个自由的额外半胱氨酸偶连到A8-VDIV序列的氨基端，肽173(SEQ ID NO：15)有一个自由的额外半胱氨酸偶连到A8-VDIV序列的羧基端。
CTB/A8-VDIV复合物引入C57 BL/6J雌性小鼠(得自Goteborg大学医药微生物学和免疫学系动物饲养中心)，年龄6-8周，实施例8中说明了产生粘膜抗体的免疫程序。
实施例2    外源多肽与CTB氨基端的遗传融合
在此实施方案中，起始质粒pPL-λ取自Pharmacia AB，瑞典。图1说明了pMLλ质粒的产生。pPL-λ用SmaI和BamHI消化，琼脂糖凝胶分离消化的DNA，通过带抽提回收1217bp的片段，它携带λ启动子区域。用BamHI和PvuII消化更多的同样质粒并再次用琼脂糖分离，通过带抽提回收携带pBR322复制起始点和氨苄青霉素抗性基因的2305bp的BarnHI/PvuII片段。将抽提的两条带连接，并转化大肠杆菌N4830-1，它是N4830的Gal-P2转导体(Pharmacia，瑞典)。在产生的质粒pMLλ1中，噬菌体λDNA的方向已改变，并去除了pBR322 DNA的1689bp片段。
用BamHI彻底消化pMLλ1，然后用HaeIII部分消化，消化的DNA重新连接起来，转化大肠杆菌N4830-1，由质粒的酶切分析筛选转化子，其中λ的N基因和tL1终止子已除去。产生的质粒是pMLλ2并携带了启动子λP1，其有下游的单一限制位点BamHI，SmaI和EcoRI，可用于重组基因的克隆。强trpA转录终止子(来自trpA盒，Pharmacia)已引入pMLλ2内单一EcoRI和AatII位点之间。同时，还将可用于克隆的额外的单一XhoI位点及HindIII位点引入了质粒(见图1)。
质粒内单一NdeI位点由NdeI消化、DNA聚合酶Klenow片段修平并连接而除去。载体内的SspI位点通过插入EcoRI接头而除去，接头在引入的EcoRI位点两边均产生了BspE1位点。用BspEI消化产生的质粒并连接，这个质粒用于大肠杆菌的重组表达。
将合成的寡核苷酸插入表达载体pML-LCTBλ7的SacI与SspI单一位点间，产生多肽与CTB氨基端的融合蛋白(见图3)。例如，在pML-LCTBλ7的SacI和SspI位点间使用了两个寡核苷酸SEQ ID No：9和SEQ IDNo：10，那么HIV的RP335肽即与CTB的氨基端相连。在第二个构建物中，插入物置于结构基因内CTB序列的+3位置，产生一个HpaI位点，同时破坏了SspI位点。相应于SEQ ID No：11和SEQ ID No：12的寡核苷酸用于这个载体的构建。这个载体中ctxB基因在可诱导的λP1启动子控制之下，构建方法同以前所述(Lebens，M，等，《生物技术》11：1574-1578，1993)。选择可构建融合基因的载体，因为诱导系统仅允许在诱导条件下表达，因此融合基因产物可能对宿主细胞有害。这样在使用构建物时培养物应在其表达不被诱导的条件下培养，重组蛋白就不会积累到有害水平。高水平表达可在细胞收获前短期诱导，这时，培养物的存活不需再考虑。
在另一实施方案中，使用pMLtac衍生质粒得到第二个构建物，它允许所产生的融合蛋白在霍乱弧菌中表达。这里的起始质粒是得自Pharmacia AB(瑞典)的表达载体pKK223-3。为了得到CTB及其衍生物大量表达的质粒，去除了1689bp的PvuII/BamHI片段。这一点通过用PvuII和BamHZ酶切其中插有ctxB基因的质粒，然后用Klenow酶补平并再连接而实现。本程序重新产生了BamHI位点，如图2所示。
不同ctxB衍生物在两个表达系统间交换过程中，rrnB T1T2转录终止子用上述trpA终止子所取代。
载体的进一步发展是在tac启动子上游引入1acI基因使载体以可诱导方式生产克隆基因产物，使用PCR进行这一步。本发明的Ptac为基础的表达质粒用SEQ ID No：16和SEQ ID No：17作了扩增。lacIq基因通过使用SEQ ID No：19和SEQ ID NO：19经PCR片段扩增表达质粒pMMB66(Furste等，《基因》48：119-131，1986)得到，lacIq基因引入BamHI和BglII之间，以便较易除去从而产生从tac启动子组成型表达的质粒(见图2)。
在第三个实施方案中，在表达质粒pJS752-3(APR)，一种pJS162衍生物(Sanchez，等，《美国国家科学进展》，86：481-485，1989)的前导肽与成熟CTB之间连接处的SacI和XmaI限制酶切位点之间插入编码gp120肽的互补合成寡核苷酸，gp120肽即与CTBN末端相融合。这个质粒与pML-LCTBtac基本相同，所不同的是携带重组ctxB基因的EcoRI/HindII片段来自pJS162。亲本质粒是表达载体pKK223-3(Pharmacia)。质粒JS752-3携带在tac启动子控制下的编码CTB的基因。在质粒pJS54(见实施例4)中，一个寡聚体(由寡聚核苷酸SEQ ID No：20和SEQ ID No：21杂交并连接形成)插入pJS752-3的单一SacI和SmaI位点之间。
重组的生产N末端CTB∷HIV杂合蛋白的霍乱弧菌将嵌合蛋白分泌到培养基中，使用GM-1 ELISA法可检测，如下述实施例4所述。用GM1-ELISA分析可证明培养细胞分泌与抗gp120的mAbF58/H3有反应活性的蛋白。GM1-ELISA法是定量分析表达蛋白的有用工具，并可检测加入肽的蛋白降解程度。实施例5中说明了生产构建物的培养条件。
在另一实施方案中，构建了N-末端有取代的另一构建物，其中gp120表位带有两个额外氨基酸并置于CTB蛋白的N末端，两个额外氨基酸相应于CTB的两个起始氨基酸，其N末端与gp120肽相连，这一延伸表位直接与完整的成熟CTB相连。产生的pCB2gp309-318质粒在霍乱弧菌JS1569(菌株644)中表达。37℃培养时，结合到GM1的蛋白与CTB特异性的mAbLT39反应，它产生于周质空间内。与天然CTB不同，该蛋白并不大量分泌到培养基中。然而，菌株644生产的蛋白与mAbP4/D10随时间增加反应活性。这一蛋白中的融合gp120肽(SEQ ID No：29)比缺CTBN端氨基酸的构建物更抗蛋白酶降解。质粒pCB29p309-318也在大肠杆菌HB101(菌株504)中表达，可从周质空间通过渗透休克裂解细胞后用80％硫酸铵沉淀并用PBS透析而获得纯化。该蛋白在SDS-PAGE中以比CTB高的分子量迁移，表明已形成聚集物，但该蛋白能与抗gp120的mAb p4/D10反应，也能与抗CTB五聚体及单体的mAb LT39和CT6反应。
实施例3    外源多肽与CTA-2氨基端的遗传融合
构建了用以表达CTA-2的质粒，以便CTA-2融合物与CTB在体内共表达，取得全蛋白的装配。ctxA 2基因和ctxB基因得自pCVD30(见Kaper，J等，《生物技术》，2，345-349，1984)基因作为XbaI/HindIII片段已克隆到pUC19(Yanisch，Perron，C等，《基因》，33，103-109，1985)。通过在载体中ctxA基因上游XbaI位点和单一EcoRI位点间插入合成寡核苷酸而重新引入ctx核糖体结合位点和信号肽序列(见图4)。产生的携带ctx基因的EcoRI/HindIII片段含单一SacI和XbaI位点，其间可插入合成寡核苷酸，以在ctxA2和所加入的表位间产生氨基端融合，然后将这个片段转移到图2和图3中各种表达质粒上，在每种情况下都可证明CTB的质粒衍生表达。携带tac启动子控制下的ctx基因的质粒保持在霍乱弧菌中，因为在本实施例中产生的CTB水平太高大肠杆菌不能忍受。此构建物缺少CTA成熟中蛋白裂解的识别位点。
本工作使用的抗原来自已由Su和Caldwell鉴定的沙眼衣原体株(Su等，《疫苗》，11，1159-1166，1993)。包括T细胞表位A8 SEQ ID No：6，其位于来自血清型A MOMP的一个25氨基酸的肽内，和B细胞表位VDIV SEQ ID No：1，其来自血清型B MOMP所含的17个氨基酸。在VDIV序列内，一个七肽(septapeptide)序列作为与单抗DIII-A3反应的表位已被定位。两条肽的氨基酸序列，连同与CTB形成融合基因的合成核苷酸序列均在图5中标明。相应于VDIV的寡核苷酸和相应于A8的寡核苷酸均已鉴定。
通过与CTA2的氨基端连接形成第一个融合蛋白。相应于外源抗原的合成寡核苷酸被克隆到载体。可以表达VDIV肽与CTB相连的装配蛋白，并可用Mab DIII-A3作为一级抗体经GM1 ELISA法检测，这里装配蛋白是在λP1启动子控制下于大肠杆菌中产生。在V.cholerae中，构建物在tac启动子控制下表达时可在周质空间检测到。A8肽独立克隆到相似载体。
为了产生结合到CTA2的A8和VDIV肽间的融合蛋白，已将图6中的接头用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8插入到质粒pPJ-VDIVλ的SacI位点。从而使A8序列加到VDIV序列的氨基末端成为可能，做法是将pPJA8λ的BglI/Xbal片段克隆到BglI/NheI消化的pPJVDIVλ1中。pPJA8λ是一个已插入编码A8T细胞表位的寡聚物的CTA2融合载体。
实施例4    中和抗原在霍乱毒素B亚基表面暴露的内部区域的插入
本例中，通过将外源肽插入CTB内部区域制备新的链内CTB融合蛋白，产生的嵌合蛋白保留了天然CTB的许多重要功能特征，包括1)五聚化；2)结合GM1神经节苷脂受体；3)在霍乱弧菌中生产该蛋白时对蛋白酶降解的抗性。插入的表位用已知结合该表位的抗体以ELISA法和免疫印迹法检测，证明表位不仅存在而且是位于蛋白表面。用杂合蛋白免疫鼠引发了对粘膜结合多肽和插入抗原的抗体应答。
在一个例子中，外源多肽插入到CTB β4和α2之间内环结构的位置，有若干残基伸展到α-螺旋内部，正如与LTB的晶体结构对比作的预测(Sixma等，《自然》，351：371-377，1991)。此处是使用限制性内切酶识别位点KpnI和MscI将VDIV片段TTLNPTIAGAG掺入CTB内部位点。将相应于SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的寡核苷酸杂交，用限制酶KpnI和MscI消化，纯化后与质粒pCB56-64相连。
在第二例中，构建了一个具有读框内置于CTB内部的HIV-1表位的表达载体。CTB表达质粒pML-LCTBtac(ApR)用聚合酶链反应(PCR)诱变，方法参照Schodel等文献，稍作修改(“减毒沙门氏菌表达的用于口腔免疫的杂合B型肝炎病毒核/pre-S颗粒”，Brown，F.，等编，《疫苗》′91，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1991，319-325页)。PCR反应使用的寡核苷酸为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。这些引物在CTB的55与64残基之间掺入一个编码HIVgp120的V3环中心部分的10个氨基酸的序列，同时用寡核苷酸引物把两个单一限制酶位点BssHII和KpnI引入最终质粒pCB55-64gp309中(见图7)。
在1.5mM MgCl2和1.25mM脱氧核苷酸存在时在下述条件下进行PCR反应：94℃变性1分钟，65℃引物退火2分钟，72℃用Tag DNA聚合酶(Boehringer Mahnbeim，Indianapolis，Indiana)D延伸DNA4分钟。反应进行30个循环，每个循环增加延伸步骤2秒。为了完成所有的合成DNA链，在72℃进行最终温育步骤10分钟。酚/氯仿抽提后，PCR产物用BssH II遵循厂商指导消化(Boehringer Mannbeim)，再次用酚/氯仿抽提，并用T4 DNA连接酶(Pharmacia，Upsala，瑞典)在16℃连接3小时连接的质粒用Lebens等的方法(上述文献)电转化到霍乱弧菌(菌柱JS1569，CTXA-，ctxB+)。用Sanger等的双脱氧链终止法确证DNA序列(《美国国家科学进展)，74：5463-5467，1977)。
选择取代的CTB区域是因为据报导该区域与识别一级蛋白结构而非CTB构象表位的抗体反应(Jacob等，《欧洲分子生物学杂志》，4：3339-3343，1985和Kazemi等，《分子免疫学》，29：865-876，1991)。另外，基于LTB的晶体结构，该区域的取代被认为不会影响对分子正确折叠必需的β折叠和α螺旋结构，并且基于LTB的晶体结构，该区域的取代不会影响五聚体的装配(见Sixman等，1991，上述文献)。另外，该区域的取代不会影响负责GM1受体结合的粘膜表面位点。
用于研究的gp120肽取自309-318位氨基酸，序列为IQRGPGRAFV(SEQID No：29)，代表了HIV-1分离物HTLV-IIIB的V3环的一部分。9p120的序列号以Los Alamos的gp120数据库序列为基础(Los Alamos国家实验室，Los Alamos，新墨西哥)。该序列含有HIV-1的主要中和B细胞的决定簇。肽内的GPGR序列在几种HIV-1分离物间保守，这种肽对开发HIV-1的肽基疫苗有重大意义(Javarherian等，《美国国家科学进展》，86：6768-6772，1989)。gp120肽代替了重组CTB的56-63位氨基酸，使蛋白净增两个氨基酸。
对携带质粒pCB55-64gp309的霍乱弧菌培养物上清的部分纯化蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析表明，内部杂合蛋白已合成，并象天然CTB一样主动地分泌到培养基中，累积到约5-15mg/升。在250mlErlenmeyer三角瓶中以50ml改进的Syncase培养基培养细菌，转速250转/分，37℃过夜。这些质粒也能在大肠杆菌中生长，无需调整载体结构。
另外，制备了许多质粒，这些质粒将外源抗原引入CTB序列54和64位之间。不同质粒的特点列于表1(见38页)。pCB55-64gp309(Ap)涉及本实施例前面段落所述的CTB：HIV杂合蛋白。表1的构建物用上述方法制得。质粒pCB55-64gp309-318用SEQ ID No：32和SEQ ID NO：33寡核苷酸将gp120表位引入CTB蛋白。质粒pCB56gp309-318使用SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35；pCB52-58gp309-318使用SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37；pCB53-64gp309-318使用SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39，pCB53-64gp307-318使用SEQ ID NO：40和SEQ IDNO：41，pCB55-64gp309-322使用SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43，pCB55-64STdeca使用SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45；pCB55-64sta使用SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，pCB55-64ps133-143使用SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49，pCB56ps133-143使用SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51。
质粒pCB53-64gp309-318和pCB53-64gp307-318通过将互补合成寡核苷酸克隆到pCB55-64gp309-318的KpnI和BssHII位点间制得，同时引入了BamHI位点。为了构建质粒pCB55-64gp308-322，将编码来自gp120的氨基酸314-322并携带BssHII位点的互补合成寡核苷酸克隆到质粒pCB5-64gp12的单一NsiI和MscI位点间，位于插入55和64间的肽的侧面。一个约1kb的BssHII/HindII片段，包括编码插入表位的315-322位氨基酸，以及编码CTB的基因(ctxB)的64至103位氨基酸和直到终止子的序列，得自中间质粒并亚克隆到质粒pCB55-64gp309-318的BssHII和HindIII之间。
其它HIV∷CTB融合基因通过对表达载体pML-LCTBtac进行寡核苷酸指导的PCR诱变，引入编码gp120氨基酸309-318并含有一个BssHII位点的核苷酸；或者是在56位直接插入，产生pCB56GP309-318，或者是CTB氨基酸56-64缺失(pCB55-65GP309-318)或氨基酸53-57位缺失(pCB52-58gp309-318)。
为了制备ST∷CTB质粒，合成了两对寡核苷酸，它们或者编码ST相关的含中和B细胞表位的十肽，或编码整个ST19个氨基酸，5’端为KpnI位点，3′端为MscI位点。一个SphI位点随寡核苷酸引入，该寡核苷酸克隆到质粒PCB55-64gp12分别获得质粒pCB55-64STdeca和pCB55-64STa。
编码HBY：CTB杂合蛋白的质粒也通过寡核苷酸指导的对pML-LCTBtac的PCR诱变构建，将编码来自pre-S(2)蛋白133-143位氨基酸连同XhoI位点的DNA引入CTB55和64位氨基酸之间，产生质粒pCB55-64ps133-143，或者直接插入56位氨基酸后，产生质粒pCB56ps133-143。
所有杂合基因均用Sanger(1977)等双脱氧链终止法测序。表1  不同质粒和相应的杂合蛋白的性质
                 重组         缺失的    插入表位       插入表位        与插入物共同质粒                 霍乱弧菌     CTB       中的氨基酸     的氨基酸        引入的单一
                 菌株a       氨基酸                   序列            限制酶位点pCB55-64gp309-318b        407     56-63  gp120 309-318c  IQRGPGRAFV      BssHII，KpnIpCB55-65gp309-318          408     56-64  gp120 309-318    IQRGPGRAFV      BssHII，KpnIpCB56gp309-318             439            gp120 309-318    IQRGPGRAFV      BssHIIpCB52-58gp309-318          440     53-57  gp120 309-318    IQRGPGRAFV      BssHIIpCB53-64gp309-318          460     54-63  gp120 309-318    IQRGPGRAFV      BssHII，KpnIpCB53-64gp307-318          586     54-63  gp120 307-318    IRIQRGPGRAFV    BssHII，KpnI，BamHIpCB55-64gp309-322          550     56-63  gp120 309-322    IQRGPGRAFVTIGK  BssHII，KpnIpCB2gp309-318            644(504d)        gp120 309-318    IQRGPGRAFV      BssHIIpJS54                      285            gp120 309-317  IQRGPGRAFPGYAHGE  XmaIpCB55-64STdeca             551     56-63  ST decapeptide   CAELCCNPAC      SphIpCB55-64st.                557     56-63  ST 1-19        NSSNYCCELCCNPACT  SphI
                                                            GCYpCB55-64ps133-143          395     56-63  pre-S(2)133-143  DPRVRGLYFPA     XhoIpCB56ps133-143             549            pre-S(2)133-143  DPRVRGLYFPA     XhoIa)母本菌株是V.Cholerae JS1569
b)质粒所用的名称如下：CB表示母本蛋白是CTB；第一个数字表明插入肽在CTB的位置(没有缺失的直接插入以氨基酸注明，插入物置于两个数字(如55-64)之后的表明两数字之间的氨基酸已缺失)；接下来的两个字母说明了插入氨基酸的起源，gp表示gp120，ps表示pre-S(2)，ST表示STa，最后的数字或字母标明插入的氨基酸。
c)根据Los Alamos数据库的gp120氨基酸编号。
d)菌株号504是一个携带质粒pCB2 gp309-318的大肠杆菌HB101。
e)黑体氨基酸组成间插接头序列。
实施例5    生产杂合多肽的细菌生长条件
生产杂合蛋白多肽的重组霍乱弧菌培养于改进的Syncase培养基(Lebens，等，《生物技术》11：1574-1578，1993)，加入氨苄青霉素100ug/ml，37℃摇瓶培养。接种后3、6、8、13和24小时收取样品，用GM1-ELISA法(见例4和例6)用抗CTB的mAb LT39和抗gp120的F58/H3分析细胞和培养物上清，发现所产生的杂合蛋白主要在上清中。使用纯化的重组CTB标准曲线计算产生的CTB的量。F58/H3结合滴度定义为A450超出背景值0.4的内插稀释度。
大肠杆菌在L-肉汤培养基中培养。
实施例6    检查杂合蛋白的表达
不同的内部杂合蛋白的定性
不同的内部杂合蛋白HIV∷CTB，HBV∷CTB和ST∷CTB在霍乱弧菌菌株JS1569(ctxA-，ctx+)中合成；该菌通过电穿孔技术用不同质粒转化。产生的重组菌株于37℃培养，加入氨苄青霉素使终浓度达到100μg/Mt。杂合蛋白在培养基中出现，在六偏磷酸盐条件下通过酸化法将蛋白沉淀下来(Lebens等，《生物技术》1993)。将沉淀物重新溶解，在PBS中透析，然后在SDS-PAGE中分析并作免疫印迹反应。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹
使用六偏磷酸钠从培养物上清沉淀并部分纯化1-3μg纯化的重组CTB和杂合蛋白，如Lebens等所述(《生物技术》，1993)。样品在带β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液溶解，经煮沸或未经煮沸，上样于15-17％的聚丙烯酰胺凝胶，其中含SDS0.1％。此分离过程可看到单体及五聚体形式的蛋白条带。电泳在200V常压下进行1小时，凝胶用考马氏亮蓝染色或者电泳转移到硝酸纤维素膜上进行免疫印迹分析。经在PBS中的1％BSA封闭后，用两种CTB特异性的mAbLT39和CT6(分别与CTB五聚体及单体反应)，抗gp120的mAbP4/D10，抗STa的mAb ST1：3，或抗pre-S(2)的mAb5520温育薄膜。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(Jackson)作第二抗体，用生色底物4-氯-1-萘酚(Bio-Rad)显色膜。
CTB：HIV融合蛋白在标准的考马氏蓝染色的PAGE上如同天然CTB分子一样以五聚体和单体形式迁移。杂合蛋白中插入的外源gp120表位在用针对gp120 V3环的mAb F58/H3的标准免疫印迹反应中检出，无论杂合蛋白以装配的五聚体形式还是单体形式存在gp120表位均被识别，这也表明在装配的五聚体中有明显的三维结构的保留。
内部杂合蛋白CTB∷HIV对mAbF581/H3的滴度显示与产生和分泌的蛋白量成比例的增加。当肽位于CTB内部时，对蛋白酶降解有抗性。
其它产HIV∷CTB的杂合蛋白的质粒，pCB55-65gp309-318，pCB52-58gp309-318和pCB55-64gp309-322，未产生可检水平的CTB杂合蛋白，其原因可能是由于产生的蛋白不稳定，多肽降解。以可检测水平产生的蛋白和以不可检水平产生的蛋白之间的结构差别极小。
质粒pCB55-64STdeca(菌株551)和pCB55-64STa(菌株557)所编码的ST∷CTB杂合蛋白，比HIV∷CTB和HBV∷CTB嵌合体产生水平略高，即使在ST2整个19氨基酸片段插入CTB氨基酸55和64之间的蛋白中也是如此。pCB55-64STdeca(菌株551)和PCB55-64STa(菌株557)表达水平为15-30μg/ml，而pCB55-64gp309-318，pCB5 3-64gp309-318和pCB53-64GP307-318编码的HBV∷CTB和HIV∷CTB嵌合体表达水平为5-15μg/ml，因此，外源插入物的氨基酸组成也很重要。ST序列包括几个半胱氨酸，其可形成分子内的二硫键，稳定插入肽及整个嵌合蛋白的结构。
质粒pCB56GP309-318(菌株439)编码的HIV∷CTB蛋白中，gp120表位直接插入，CTB无缺失，其产量比其它蛋白产量高(24小时后达到300μg/ml)。作SDS-PAGE和免疫印迹分析时，在样品未煮沸的情况下，该蛋白与CTB五聚体大小一样。然而在含SDS及β-硫基乙醇的样品缓冲液中煮沸时，蛋白的主要部分分开。来自菌株549的HBV∷CTB杂合蛋白，在同一位置有来自pre-S(2)的多肽插入，有与上相同的行为。对蛋白酶裂解的抗性可能依赖于各个杂合蛋白中肽的构象和可及性。
值得一提的是，蛋白可保持足以与CTB相似的构象，从而在聚丙烯酰胺凝胶上与CTB五聚体有相同的泳动率，可结合GM1神经节苷脂，并被抗CTB的mAb LT39所识别，即使它们在插入肽的位置受到酶切也是如此。因此，有必要进一步分析一些克隆以保证蛋白对酶切不会过于敏感。
GM1-ELISA法分析杂合蛋白
用现有技术中所述的GM1-ELISA法检测霍乱毒素蛋白(见Sanchez等，《FEBS通信》，241：110-114，1988和Svennerholm等，《临床微生物学杂志》，24：585-590，1986)。微滴定孔用0.3nmol GM1神经节苷酯(Sigma，圣路易斯，密苏里)/100μlPBS在室温包被过夜，然后用含0.1％BSA的PBS(PBS-BSA)37℃封闭30分钟。用PBS溶液洗涤3次后，样品在PBS-BSA中稀释，温育1小时。重组CTB起始浓度为0.5μg/ml，所有温育均在环境温度中进行。用含0.05％Tween-20的PBS(PBS-T)清洗后，将抗CTB的mAbLT39或外源表位特异抗体如抗gp120的V3环的mAbF57/H3，抗gp120的TB mAb P4/D10，抗STa的ST1：3，或抗pre-S(2)的5520通过含BSA0.1％，Tween20 0.05％的PBS(PBS-BSA-T)加入并温育1小时。用PBS-T清洗后，溶解于PBS-BSA-T中的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(Jackson Laboratories)作为第二抗体加入孔，1小时后，再次清洗平板，用生色底物溶于含0.012％H2O2的柠檬酸缓冲液中的邻苯二胺(OPD)显色。10-20分钟后在450nm测定吸光值。加入微定度板第一孔的各种杂合蛋白的量调整至10μg，一般以重组CTB作为标准从考马氏染色的聚丙烯酰胺凝胶估计，也由与抗CTB的mAbLT39反应所确证。滴度定义为在背景之上给出0.2的A450吸光值的内插血清稀释度。
在GM1-ELISA法中分析内部gp120表位杂合蛋白，表明GM1的结合以及对CTB五聚体特异的mAb，LT39的亲和性均保留。在同样条件下，CTB∷HIV蛋白也与抗gp120的mAbF58/H3反应，表明gp120表位暴露在分子表面。GM1表达的ELISA分析使用mAb LT39，包括起始浓度为0.5μg/ml的重组CTB与mAb P4/D10的反应性的的标准曲线，这定义为背景上吸光值A450给出0.4的内插血清稀释度。
HIV∷CTB蛋白中gp120表位的抗原性
来自gp120的10个氨基酸肽(氨基酸309-318)，当置于CTBN末端时(见例3)，或位于氨基酸55和64间时，会产生相当强的信号，表明表位在这两种蛋白(来自菌株504和407)中均暴露在表面。当增加插入的表位长度至12个氨基酸时(如在菌株586中)，表位与抗体的反应较弱。可能是表位在蛋白表面暴露较少，也可能形成一mAb不能识别的构象。
HIV∷CTB杂合蛋白也用相同的抗gp120的mAb作免疫印迹分析。当以未煮沸的五聚体形式电泳时，仅在氨基酸位点55-64内有取代的构建物中检测到插入的gp120表位。所有其它HIV∷CTB蛋白中，表位仅能以煮沸的单体形式检测到。这可能表明表位在单体形式中暴露，而在形成五聚体中时被包藏或扭曲。同时GM1-ELISA反应表明结合GM1之后，一些蛋白的五聚体形式暴露了插入的HIV表位，使之可被抗gp120的单抗识别。因此结合GM1可能会使得在插入的HIV表位易到达五聚体表面。
来自菌株439的蛋白在其合成后受到酶切，也用单抗P4/D10作免疫印迹分析。11KD附近弱的单体带认为是未受酶切的，其与mAb反应，但已降解的蛋白的大部分，未显示抗gp120的反应活性。
ST∷CTB和HBV∷CTB杂合蛋白中ST和pre-S(2)表位的抗原性质。
当用GM1-ELISA法分析时，菌株551和557中的在CTB氨基酸55和64之间插入的STa表位可用ST特异的中和抗体mAb ST1：3(见Syennerholm等，《临床微生物学杂志》，24：585-590，1986)检测到，其反应性比位于CTBN端或C端的ST肽强烈(见Sanchez等，《微生物学研究》，47：971-979，1990)。免疫印迹分析时，链内ST2肽仅能以单体蛋白形式检测到，这与在大多数HIV∷CTB蛋白中观察到的一致。HBV∷CTB蛋白也是一样，其中的pre-S(2)序列用抗pre-S(2)的mAb 5520(见Milich等，《免疫学杂志》，137：2703-2710，1986)不能检测到，无论在GM1-ELISA法中或以未煮沸的五聚体形式在免疫印迹分析中，但在煮沸的单体形式时则能观察到。
这些结果表明，外源抗原插入CTB内部56-64氨基酸区域时，64位Ala应位于插入物的C端以产生该种蛋白。这个观察与其它科学家报道的64位Ala对五聚体CTB稳定性重要相一致。同样，N端53位Pro对插入物也很重要，一旦缺失，如在PCB52-58gp309-318中，相应的杂合蛋白产量水平难以检测。
基于检测抗体与毒素或外源抗原结合的ELISA可确定，外源表位的反应性水平比CTB略低。因为融合蛋白在霍乱弧菌内产生时，链内融合蛋白抗蛋白裂解，因此外源表位的降解不是杂合蛋白中外源表位免疫原性比CTB反应性水平低的原因，更可能是插入的外源表位的表面密度比几种不同的强的主要是构象性的CTB表位的表面密度低。因此，本发明认为，多拷贝的外源抗原对提高免疫应答有用。
插入物的长度也影响稳定性。本领域熟练人员在稳定性有问题的取代中应考虑改变插入物长度。
ELISA检测法结合聚丙烯酰胺凝胶电泳染色及免疫印迹分析为本领域熟练人员提供了检测蛋白表达的合适方法。检测结果表明，CTB可被修饰，同时所希望的蛋白合成不受影响。
实施例7  优化血清抗体水平的免疫方法
用3剂部分纯化自JS1569上清的10μg CTB∷HIV杂合蛋白通过腹腔免疫C57B1/6雌鼠。第一剂免疫时加Freund完全佐剂(DIFCO实验室，底特律，密执根)，随后的免疫加Freund不完全佐剂。用CTB与不相关外源表位的杂合蛋白或用Freund佐剂以同样方法免疫鼠，作为阴性对照。第一次免疫前及第二次及第三次免疫7天后分别抽提血清样品。使用CTB(用实施例6方法结合GM1包被的微孔中的GM1)或重组gp120(Bolmstedt等，《普通病毒学杂志》，73：3099-3105，1992)作为抗原，用ELISA法分析血清。
两种杂合蛋白免疫的鼠中均检测到强烈的针对CTB部分的血清抗体反应。大多数受检鼠中也有明显的针对HIV部分的血清抗体反应。仅接受了Freund佐剂的鼠对CTB或gp120均无抗体反应。
实施例8  产生阴道免疫应答的免疫方法
在第一次免疫前10天或3天给雌鼠皮下注射10mg孕酮，然后再每周注射一次。鼠群或者通过4次阴道免疫(每次间隔1-2周)，或者通过三次腹腔免疫接着一次阴道免疫。每次阴道免疫剂量大约0.5mg CTB-肽缀合物(见例1)。每一剂量估计含CTB约0.4mg，A8-VDIV肽0.1mg，并额外包括5mcg霍乱毒素作为另外的佐剂，每次腹腔免疫剂量为以上量的1/3。
实施例9  产生粘膜抗体的免疫
CTB融合蛋白分离自细菌培养物上清：该细菌含Lebens等所描述的表达系统(《生物技术》，上述文献)。融合蛋白用Tayot等所述的GM1亲和纯化法分离(《欧洲生物化学杂志》，113：249-258)并用PBS透析。使用标准CTB通过ELISA法确定用于免疫的样品中特定蛋白浓度。
在一实验模型中，每次用相当于40-250μg的CTB蛋白免疫雄猴。每3-4周注射3-5次，前三次将抗原悬浮在完全的Freund佐剂中，随后的免疫在不完全佐剂中进行。在免疫开始前及第三和第四次接种后两周放血取得的血清通过ELISA分析特定的针对CTB和外源抗原的抗体。此外，在幼鼠中检测血清中和病原体的能力。取自免疫过的猴的血清稀释5倍后与相同体积的病原体混合，引入幼鼠口腔，监测鼠随时间推移出现疾病的情况。
对于人的免疫，嵌合蛋白通过口腔、直肠、阴道或鼻腔一次或重复给药，单次免疫使用0.1-2mg构建物，重复免疫使用0.01-0.2mg构建物。蛋白可以液体形式或分散在惰性凝胶中给药，接种体积估计为注射0.1-1ml，鼻腔免疫0.5-2ml，直肠或阴道免疫3-10ml。口腔免疫可用药学上可接受的含25-200ml液体的缓冲液一起进行，其中所述的液体约含29NaHCO3或同等酸性缓冲试剂。
实施例10  IgA和IgG粘膜抗体的实验检测
从处死(并用含肝素的缓冲液灌注)的鼠收集血清、肠系膜淋巴结、脾、子宫颈、阴道、小肠、结肠、直肠。处死鼠一般在用实施例1的制备物并使用实施例8的免疫方法作最后一次免疫的一周后进行。器宫冷冻，然后用PERFEXT方法以2％(W/V)皂苷抽提(Quiding等，《临床研究杂志》，88(1)：143-148，1991)。用ELISA法检测皂苷抽提物中抗CTB的IgA和IgG及抗VDIV的抗体。ELISA板分别用GM1(0.3nmol/ml)或A8-VDIV肽(1μg/ml)包被。
本例中，免疫小鼠株系为C57/B1，免疫时年龄8-10周。第一次免疫前10天和3天通过皮下注射1mg的6α-甲基-17α-乙酸基孕酮(Depoprovera；UpJohn公司，Kalamazoo，MI)，同时在免疫阶段每周注射一次。按所给的方法免疫，第一剂及第二剂免疫间隔两周，随后各剂免疫每周一次。表2  经不同途径以化学制备的霍乱毒素B亚基和来自沙眼衣原体的主要
 外膜蛋白A8-VDIV共线性肽的缀合物免疫的小鼠的雌性生殖
 道内免疫应答和血清
            针对A8-VDIV的ELISA抗体滴度免疫               阴道      子宫颈       输卵管       血清
             IgA   IgG   IgA   IgG   IgA   IgG   IgA   IgG无               ＜.5  ＜.5  ＜.5  ＜.5  ＜.5  ＜.5  ＜.5  ＜.5阴道内X4         290   .5    920   .5     50    .5     3    43口腔X4           ＜.5  ＜.5  ＜.5  ＜.5   22   ＜.5  ＜.5   3腹膜内X3++      14    99    40    130    38    nd    2     3500阴道内X1口腔X4+阴道内X1  2    ＜.5  2     ＜.5  ＜.5  ＜.5  ＜.5  ＜.5
此表说明，通过重复的阴道免疫或重复的腹腔起始免疫结合阴道增进免疫，使得CTB-A8-VDIV缀合物能诱导对沙眼衣原体A8-VDIV抗原特异的生殖道粘膜IgA抗体形成，从来自阴道、子宫颈、输卵管粘膜的样品中均可检测到抗体。多次腹腔免疫后，无论在生殖道组织还是血清中，IgA应答与基本的IgG应答也有联系。
CTB杂合蛋白中外源序列的免疫原性
为了测定内部插入的肽诱导免疫应答的能力，用来自菌株407，460或586的内杂合蛋白HIV∷CTB，用来自菌株504的N端杂合蛋白HIV：CTB，或两种ST∷CTB嵌合蛋白结合Freund佐剂免疫小鼠C57B1/6株系。所有小鼠均有高滴度的血清抗CTB IgG应答。如上所述，10个氨基酸的HIV表位当位于CTB55和64位氨基酸之间时可诱发针对gp120的血清IgG应答。用来自菌株460的内部杂合蛋白HIV∷CTB(10个gp120氨基酸位于53和64之间)和菌株586的内部杂合蛋白HIV∷CTB(12个gp120氨基酸位于53和64之间)，及用来自菌株504的gp120表位位于N端的蛋白免疫小鼠，都能由gp120部分诱导较弱的针对gp120的应答。事实上，所有这些蛋白均有与前述HIV∷CTB蛋白相似的免疫原性。
来自菌株551的ST∷CTB杂合蛋白中的ST十肽在某些动物中诱导相当高滴度的抗ST血清抗体，即使插入肽的体外免疫应答可能较弱。来自菌株557的ST∷CTB蛋白具有整个STa肽，ST部分也有免疫原性，但比来自菌株551蛋白的十肽诱发较低滴度的抗体。
来自菌株395的HBV∷CTB嵌合蛋白通过腹腔或口腔以霍乱毒素为佐剂引入小鼠BALB/C57B1/6。口腔及腹腔免疫的小鼠中均获得高的抗CTB血清滴度，而抗pre-S(2)的抗体通过腹腔免疫结合CT为佐剂得到最高水平。表3说明了不同的免疫方法及其结果。表3    用HBV∷CTB杂合蛋白免疫后的血清IgG滴度小鼠种系        CTa  途径b   抗-CTBc        抗pre-S(2)d
                          2剂    3剂       2剂    3剂C57BL/6(H-2b)   -     p.o.  53000a 23400      0      0BALB/c(H-2b)    -     p.o.     0     2400      0      0C57BL/6          +     p.o.  102400  256400     0      0BALB/c           +     p.o.    4000  38800      0      0C57BL/6          -     i.p.  170000  546000     0     1060BALB/c           -     i.p.  32000   153600     0      0C57BL/6          +     i.p.   106   682000    8500   3300BALB/c           +     i.p.   106   461000    6400   3600
a)用或不用5μg(p.o.)或1.5μg(i.p.)霍乱毒素(CT)作为佐剂免疫小鼠。
b)在0、14和24天分别给予动物剂量为30μg(p.o.)或7.5μg(i.p.)的来自菌株395的HBV∷CTB杂合蛋白。
c)结合GM1的重组LTB用作为确定抗CTB的IgG的抗原。
d)含来自pre-S(2)的133-153位残基的合成肽(Schodel等，1990)用作确定抗pre-S(2)的IgG的抗原。
e)第2剂和第3剂免疫7天后收集血清，来自同组小鼠(每组2或3只小鼠)的血清在分析前合并。产生A392＞3X免疫前血清A392的血清稀释度的平均倒数定义为滴度。
尽管本发明的具体实施方案已作了详细说明，但仅仅是一些范例。本发明的真正范围在以下权利要求中作了限定。
                                序列表(1)一般信息(i)申请人：Holmgren，Jan
       Lebens，Michael(ii)发明名称：刺激粘膜免疫的免疫原(iii)序列数目：51(iv)通讯地址：(A)通讯人：Knobbe，Martens，Olson and Bear(B)街道：620 Newport Center Drive 16th Floor(C)城市：Newport Beach(D)州：CA(E)国家：USA(F)邮编：92660(v)计算机阅读形式：(A)媒介类型：软盘(B)计算机：IBM兼容机(C)操作系统：DOS(D)软件：FastSEQ 1.5版(vi)本申请数据：(A)申请号：(B)申请日：(C)分类：(vii)在先申请数据：(A)申请号：(B)申请日：(viii)律师/代理人信息：(A)姓名：Kaiser，AnneMarie(B)注册号：37，649(C)参考/文档号：HOLMG.001VPC(ix)电讯信息：(A)电话：619-235-8550(B)传真：619-235-0176(C)电传：
(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：(A)长度：17个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iV)反义：否(v)片段类型：内部的(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Phe Asp Val Thr Thr Leu Asn Pro Thr Ile Ala Gly Ala Gly Asp Val1               5                  10                  15Lys(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：(A)长度：42个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部的(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Ala Leu Ash Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala1               5                  10                  15Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Ash Ser Phe Asp Val Thr Thr Leu Asn
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                                Met Val Lys Ile Ile Phe Val
                                 1               5TTT TTC TTA TCA TCA TTT TCA TAT GCA AAT GAT GAT AAG TTA GGA GCT   101Phe Phe Leu Ser Ser Phe Ser Tyr Ala Asn Asp Asp Lys Leu Gly Ala
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    35                  40(2)SEQ ID NO：16的信息：(i)序列特征：(A)长度：33个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：GGGGGGGATC CCCTCGCGCG TTTCGGTGAT GAC                33(2)SEQ ID NO：17的信息：(i)序列特征：(A)长度：36个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：GGGGGAGATC TCTGAAATGA GCTGTTGACA ATTATC              36(2)SEQ ID NO：18的信息：(i)序列特征：(A)长度：33个碱基对  (B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：GGGGGAGATC TGCCAGAACC GTTATGATGT CGG                 33(2)SEQ ID NO：19的信息：(i)序列特征：(A)长度：31个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：GGGGGGGATC CCGAACGCCA GCAAAGACGT A                  31(2)SEQ ID NO：20的信息：(i)序列特征：(A)长度：28个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：ATTCAGCGTG GTCCGGGTCG TGCTTTTG                      28(2)SEQ ID NO：21的信息：(i)序列特征：(A)长度：36个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链  (D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：CCGGGAAAAC GACGACCCGG ACCACGCTGA ATAGCT              36(2)SEQ ID NO：22的信息：(i)序列特征：(A)长度：57个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：GCGTAGCGGT ACCACCACTC TGAACCCAAC TATTGCTGGA GCTGGCTGGC CAGCACG  57(2)SEQ ID NO：23的信息：(i)序列特征：(A)长度：58个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：CCGTGCTGGC CAGCCAGCTC CAGCAATAGT TGGGTTCAGA GTGGTGGTAC CGCTACGC  58(2)SEQ ID NO：24的信息：(i)序列特征：(A)长度：61个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：CCATTTGATA TTACCACTTT AAATCCAACA ATTGCTGGTG CTGGTGATGT TAACCCGGG  60T                                                                 61(2)SEQ ID NO：25的信息：(i)序列特征：(A)长度：75个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：CTAGACCCGG GTTTAACATC ACCAGCACCA GCACCAGCAA TTGTTGGATT TAAAGTGGTA  60ATATCAAATG GAGCT                                                   75(2)SEQ ID NO：26的信息：(i)序列特征：(A)长度：76个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：CCCGCTTTAA ATATTTGGGA TCGTTTTGAT GTTTTTTGTA CATTAGGTGC TACCACTGGT  60TATAAAGGTA ATAGTT                                                  76(2)SEQ ID NO：27的信息：(i)序列特征：(A)长度：84个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：CTAGAACTAT TACCAAAATA ACCAGTGGTA GCACCTAATG TACATTTAAC ATCAAAACGA  60TCCCAAATAT TTAAAGCGGG AGCT                                         84(2)SEQ ID NO：28的信息：(i)序列特征：(A)长度：11个氨基酸(B)类型：氨酸酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部的(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala1               5                  10(2)SEQ ID NO：29的信息：(i)序列特征：(A)长度：10个氨基酸(B)类型：氨酸酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部的(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val1               5                  10(2)SEQ ID NO：30的信息：(i)序列特征：(A)长度：10个氨基酸(B)类型：氨酸酸(C)链型：单链  (D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部的(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：Cys Ala Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys1               5                  10(2)SEQ ID NO：31的信息：(i)序列特征：(A)长度：19个氨基酸(B)类型：氨酸酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：内部的(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr1               5                  10                  15Gly Cys Tyr(2)SEQ ID NO：32的信息：(i)序列特征：(A)长度：51个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：GGGGCGCGCT TTCGTTGCGA TCGAAAGGAT GAAGGATACC CTGAGGATTG C           51(2)SEQ ID NO：33的信息：(i)序列特征：(A)长度：70个碱基对(B)类型：核酸  (C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：GGGGCGCGCC CCGGACCACG CTGGATACTA CCTGGTACCT CTACTTGAAA AGTTGCACCA  60TTCTTAAAAG                                                         70(2)SEQ ID NO：34的信息：(i)序列特征：(A)长度：42个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：GGGGCGCGCT TTCGTTCATA TAGATTCACA AAAAAAAGCG AT                     42(2)SEQ ID NO：35的信息：(i)序列特征：(A)长度：45个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：GGGGCGCGCC CCGGACCACG CTGGATTTGA CTACCTGGTA CTTCT                  45(2)SEQ ID NO：36的信息：(i)序列特征：(A)长度：39个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链  (D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：GGGGCGCGCT TTCGTTATAG ATTCACAAAA AAAAGCGAT                       39(2)SEQ ID NO：37的信息：(i)序列特征：(A)长度：48个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：GGGGCGCGCC CCGGACCACG CTGGATTACT TCTACTTGAA AAGTTGCA               48(2)SEQ ID NO：38的信息：(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：否(v)片段类型：(vi)最初来源：(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：CAATCCAGCG TGGTCCGGGG   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Claims (52)

1.一种粘膜结合组合物，包括与一种非病毒病原体的至少一个抗原连接的一条粘膜结合多肽，其中所述的病原体引起性传播疾病。
2.权利要求1的组合物，其中所述的粘膜结合多肽为霍乱毒素的结合亚基。
3.权利要求2的组合物，其中所述的组合物额外包括霍乱毒素A亚基或其一部分。
4.权利要求1的组合物，其中的抗原为衣原体抗原。
5.权利要求4的组合物，其中的衣原体抗原连接到霍乱毒素结合亚基的氨基端。
6.权利要求4的组合物，其中的衣原体抗原连接到霍乱毒素结合亚基的内部。
7.权利要求4的组合物，其中所述的粘膜结合多肽为霍乱毒素的结合亚基，所述抗原包括来自衣原体主要外膜蛋白的B细胞刺激抗原。
8.权利要求4的组合物，其中所述B细胞刺激抗原来自衣原体主要外膜蛋白的VDIV区域。
9.权利要求8的组合物，其中所述抗原还包括一个来自衣原体主要外膜蛋白的T辅助细胞刺激抗原。
10.权利要求9的组合物，其中所述的T辅助细胞刺激抗原来自A8区域。
11.权利要求1的组合物，其中所述抗原化学连接到所述结合多肽。
12.权利要求1的组合物，其中所述的抗原作为基因融合蛋白连接到所述的结合多肽。
13.一种产生针对非病毒性性传播疾病的粘膜免疫应答的方法，包括用权利要求1的组合物接触哺乳动物宿主的粘膜。
14.权利要求13的方法，其中的组合物为权利要求2的组合物。
15.权利要求13的方法，其中的组合物为权利要求6的组合物。
16.一种重组的多核苷酸，包括编码粘膜结合多肽的第一区域和编码非病毒病原体抗原的第二区域，其中所述的病原体引起性传播疾病。
17.权利要求16的多核苷酸，其中所述的粘膜结合多肽是霍乱毒素的结合亚基，所述病原体是衣原体。
18.权利要求17的多核苷酸，其中所述抗原是来自衣原体主要外膜蛋白的T辅助细胞刺激抗原。
19.权利要求18的多核苷酸，其中所述T辅助细胞刺激抗原来自A8区域。
20.权利要求19的多核苷酸，其中所述抗原还包括一个来自衣原体主要外膜蛋白的B细胞刺激抗原。
21.权利要求20的多核苷酸，其中所述B细胞抗原来自衣原体主要外膜蛋白的VDIV区域。
22.一种抗衣原体感染的免疫接种方法，包括将有效量的连接了衣原体主要外膜蛋白B细胞表位和T细胞表位的霍乱毒素结合亚基接种到哺乳动物宿主的粘膜。
23.权利要求22的方法，其中所述接种为通过阴道接种。
24.权利要求22的方法，其中所述接种为通过直肠接种。
25.权利要求22的方法，其中所述接种为通过口腔接种。
26.一种粘膜结合组合物，包括连接病毒病原体至少一个抗原的粘膜结合多肽，其中所述病原体引起性传播疾病。
27.权利要求26的组合物，其中所述粘膜结合多肽还包括霍乱毒素的结合亚单位。
28.权利要求27的组合物，其中所述抗原为HIVgp120抗原。
29.权利要求28的组合物，其中所述抗原为相应于SEQ ID NO：29的肽。
30.权利要求27的组合物，其中所述抗原为B型肝炎病毒抗原。
31.权利要求30的组合物，其中所述抗原来自B型肝炎病毒的pre-S(2)蛋白。
32.权利要求31的组合物，其中所述抗原为相应于SEQ ID NO：28的肽片段。
33.一种粘膜结合组合物，包括连接了至少一个来自肠毒性大肠杆菌的抗原的粘膜结合多肽。
34.权利要求33的组合物，其中所述抗原来自肠毒性大肠杆菌的STa蛋白。
35.权利要求34的组合物，其中所述抗原是相应于SEQ ID NO：30的肽片段。
36.权利要求34的组合物，其中所述抗原是相应于SEQ ID NO：31的肽片段。
37.一种纯化的重组多核苷酸，包括编码一种可操作连接到B细胞刺激抗原的粘膜结合蛋白的核酸，其中所述抗原为来自可通过粘膜感染哺乳动物的病原体的肽。
38.权利要求37的多核苷酸，其中所述的编码粘膜结合蛋白的核酸编码霍乱毒素的结合亚基。
39.权利要求38的多核苷酸，其中所述核酸还包括编码霍乱毒素亚单位CTA(2)的核酸。
40.权利要求39的多核苷酸，其中编码B细胞刺激抗原的核酸位于编码CTA(2)亚基的核酸的5’端。
41.权利要求40的多核苷酸，其中编码B细胞刺激抗原的核酸编码包括氨基酸序列LNPTIAG的肽。
42.权利要求40的多核苷酸，其中编码B细胞刺激抗原的核酸编码来自HIVgp120的肽。
43.权利要求38的多核苷酸，其中编码B细胞刺激抗原的核酸位于编码所述粘膜结合蛋白的核酸编码区读框之内。
44.权利要求43的多核苷酸，其中所述的编码B细胞刺激抗原的核酸编码包括氨基酸序列LNPTIAG的肽。
45.权利要求43的多核苷酸，其中所述的编码B细胞刺激抗原的核酸编码来自HIVgp120的肽。
46.权利要求45的多核苷酸，其中所述的编码来自HIVgp120肽的核酸编码肽IQRGPGRAFV。
47.权利要求43的多核苷酸，其中所述编码B细胞刺激抗原的核酸来自B型肝炎病毒pre-S(2)蛋白。
48.权利要求47的多核苷酸，其中所述的编码B细胞刺激抗原的核酸编码具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的肽。
49.权利要求43的多核苷酸，其中所述编码B细胞刺激抗原的核酸来自肠毒性大肠杆菌的STa蛋白。
50.权利要求49的多核苷酸，其中所述的编码B细胞刺激抗原的核酸编码具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的肽。
51.权利要求49的多核苷酸，其中所述的编码B细胞刺激抗原的核革酸编码具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的肽。
52.权利要求43的多核苷酸，其中编码B细胞刺激抗原的核酸长度为21至150个碱基。
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