CN106543287B - 构象表位疫苗和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了构象表位疫苗和应用。具体地，本发明提供了一种携带构象表位的重组蛋白，所述的重组蛋白具有源自载体蛋白的结构骨架以及整合入所述结构骨架的外源构象表位肽段W，所述的载体蛋白为霍乱毒素(CT)B亚基(CTB)，并且所述构象表位肽段W替换和/或插入霍乱毒素(CT)B亚基(CTB)中的特定肽段T1。本发明还提供了含有所述重组蛋白的药物组合物和疫苗组合物。本发明的重组蛋白可有效激发机体针对所携带构象表位的特异性的杀伤性T细胞(CTL)，在动物移植肿瘤模型的预防和治疗中表现出较好的抑制移植肿瘤的效果。

Description

构象表位疫苗和应用

技术领域

本发明属于生物和医药领域，具体地涉及针对肿瘤抗原MUC1的疫苗及其制法和用途。

背景技术

表位(Epitope)是抗原分子上的一个免疫活性区，具有与T细胞受体结合、B细胞受体和抗体分子结合，传递免疫激活信号的功能。

以抗原表位肽段的氨基酸序列为基础设计、发展的合成肽疫苗(syntheticpeptide vaccine)、重组表位疫苗及表位核酸疫苗，具有以下特点：

首先，表位疫苗能够有效激发自然免疫场合弱势的中和表位的免疫反应。如HIV和流感病毒，自然感染可有效掩没弱势的中和表位，导致自然感染激发的免疫反应不能抵御病原体的进攻。

其次，可以组合多个天然抗原分子上的中和表位，T、B细胞抗原表位，易于设计针对多种病原体和疾病靶点的多功能疫苗；而且结构明确、性质稳定、不含能够引起未知免疫反应的多余结构，因此安全好。

最后，选用病原体和疾病靶点中序列保守的表位，可突破病原体和疾病靶点通过高频因突变导致的免疫原性漂移，逃避宿主免疫系统的攻击。

对于无特殊构象要求的疫苗表位，直接合成疫苗表位和含T辅助细胞表位的生产合成肽疫苗，或用化学合成肽段再通过化学偶联至多种载体蛋白，或在载体蛋白的N-端或C-端连接表达为融合蛋白就可以免疫机体实现有效刺激的免疫反应。

然而，对于有特殊空间构象要求的表位，上述策略就难以奏效。如Mucin1(MUC1)是一种大分子量、高度糖基化的Mucin黏蛋白家族的I型跨膜糖蛋白，主要在上皮细胞表达、分泌到细胞表面起润滑作用，形成的一层物理屏障使其与外界环境隔离，保护细胞抵御有毒化学物质及微生物带来的直接威胁。成熟MUC1蛋白由跨膜的C亚基和胞外N亚基组成，其中N亚基包括多个重复序列可变区(VNTRs)，每个VNTR含20个氨基酸残基的重复序列，(PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA SEQ ID NO.:1)。乳腺癌细胞中有90％过表达MUC1，糖基化结构异常，参与了肿瘤形成、生长、侵袭和细胞信号转导，促进血管生成，组织低氧应答和肿瘤抗药性的产生，与乳腺癌细胞的高转移特性及不良预后有关。因此糖基化结构异常的MUC1是癌症治疗的一个重要靶点[Pillai et al.，Am J Clin Oncol.2015；38:108-18]。肿瘤细胞表面的MUC1糖基化不完全，能够暴露出正常情况下被多糖链掩蔽的肽段，使肿瘤MUC1成为免疫细胞攻击的靶点。目前靶向MUC1的疫苗抗原设计策略是将MUC1 VNTR区的肽段化学偶联至不同的载体蛋白，包括KLH、ABS、DT等[Hoffmann-Roder et al.，Chem Commun(Camb)，2011；47:9903-9905；Xing et al.，Int J Oncol，1995；6:1283-1289；Zhang et al.，Cancer Res，1996；56:3315-3319]，用于治疗MUC1阳性的肿瘤。在MUC1转基因小鼠中能够抑制肿瘤生长、减少转移、延长生存期。但这种化学随机偶联MUC1 VNTR区的肽段形成的抗原作为疫苗的免疫原性仍然不够强，未能激发有效的MUC1抗原特异性的杀伤性T细胞(CTL)免疫应答，抗肿瘤效果有待进一步提高。

因此，本领域迫切需要开发能够有效激发机体针对具有特殊构象要求的并且能增强杀伤性T细胞(CTL)的表位疫苗抗原。

发明内容

本发明的目的就是提供一种能够有效激发机体针对具有特殊构象要求的表位的增强杀伤性免疫T细胞的疫苗抗原及其制法和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种携带构象表位的重组蛋白，所述的重组蛋白具有源自载体蛋白的结构骨架以及整合入所述结构骨架的外源构象表位肽段W，所述的载体蛋白为霍乱毒素(CT)B亚基(CTB)，并且所述构象表位肽段W替换和/或插入霍乱毒素(CT)B亚基(CTB)中P1位至P2位的肽段T1，其中，P1为54、55、56、或57位，而P2为58、59、60或61。

在另一优选例中，P1和P2的氨基酸位置基于SEQ ID NO.:3。

在另一优选例中，所述的外源构象表位的长度Lw大于所述肽段T1的长度Lt，较佳地Lw-Lt之差ΔL≥3，更佳地≥5，如5-15个氨基酸。

在另一优选例中，所述的外源构象表位的长度为8-30个氨基酸，较佳地为10-25个氨基酸，更佳地为12-20个氨基酸。

在另一优选例中，所述的外源构象表位选自下组：MUC1的VNTR片段。

在另一优选例中，所述的外源构象表位包括序列如SEQ ID NO.:1、2和4所示的VNTR片段。

在另一优选例中，所述的重组蛋白还包括与所述结构骨架融合在一起的外源免疫调节结构域。

在另一优选例中，所述的外源免疫调节结构域包括针对免疫抑制性受体的结构域，如PD1、PD-1结构域、CTLA-4，从而阻断肿瘤免疫抑制。

在另一优选例中，所述的外源免疫调节结构域包括针对免疫刺激性受体的结构域，如41-BB。

在另一优选例中，所述重组蛋白包括单体、或多聚体。

在另一优选例中，所述的多聚体为五聚体。

在另一优选例中，所述的重组蛋白具有至少一个T细胞辅助(Th)表位。

在另一优选例中，所述的Th表位来自所述的蛋白骨架和/或所述的外源构象表位。

在另一优选例中，所述的重组蛋白具有下式I的结构：

X₀-A-L-B-X₁

(I)

式中，

A为整合有所述外源构象表位的结构骨架；

L为任选的连接肽元件；

B为外源免疫结构域；

X₀为无、信号肽序列、分泌信号肽序列或标签序列；和

X₁为无、或标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：6His。

在另一优选例中，所述的B为PD-1的结构域或PD-1配体结构域(PD-L1)或CTLA-4结构域或41-BB结构域。

在另一优选例中，所述的肽段T1序列为56-QHID-59。

在另一优选例中，所述的重组蛋白是如下制备的：将CTB的56-QHID-59位肽段用MUC1的VNTR片段的12个氨基酸残基的肽段(APDTRPAPGSTA SEQ ID NO.:2)进行替换。

在另一优选例中，在所述蛋白骨架的C端融合有PD-1结构域。

在另一优选例中，所述的重组蛋白的序列如SEQ ID NO.:5、6或7所示。

在本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的重组蛋白。

在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括真核细胞和原核细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种生产本发明第一方面所述的重组蛋白的方法，包括步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养第四方面所述的宿主细胞，从而表达第一方面所述的重组蛋白；和

(b)分离或纯化所述的重组蛋白。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物含有(a)本发明第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述的宿主细胞，以及(b)药学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的组合物为疫苗。

在本发明的第七方面，提供了一种疫苗组合物，所述的组合物含有(a)本发明第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述的宿主细胞，以及(b)免疫学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物为MUC1靶向癌症疫苗制剂。

在另一优选例中，所述疫苗组合物还含有(c)佐剂。

在另一优选例中，所述的佐剂选自下组：铝佐剂、CpG佐剂、或其组合。

在本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的重组蛋白、或第六方面所述的药物组合物、或第七面所述的疫苗组合物的用途，它们被用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

在本发明的第九方面，提供了一种预防或治疗肿瘤的方法，包括步骤：给需要的对象施用第一方面所述的重组蛋白、第六方面所述的药物组合物、或第七面所述的疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的对象包括人和非人哺乳动物(如啮齿动物，如大鼠、小鼠)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明CTB-MUC1疫苗抗原蛋白制备、免疫原性和抗肿瘤评价等实验结果。其中，图1A中，泳道如下：泳道1：CTB单体；泳道2:CTB五聚体；泳道3:CTB-MUC1单体；泳道4：CTB-MUC1五聚体。(为了检测五聚体形式的CTB和CTBMUC1，将纯化的蛋白与2×非还原缓冲液混合，然后不经加热直接上样)。

图2显示了CTB-MUC1疫苗抗原免疫增强CTL细胞比例。

图3显示了CTB-MUC1-PD1疫苗抗原蛋白制备和免疫原性评价等实验结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，将MUC1蛋白的重复序列可变区(VNTR)插入或替换来自特定载体蛋白(霍乱毒素(CT)B亚基)的蛋白骨架的特定位置(54-61位)，可以构成一种新颖的携带构象表位的重组蛋白。所述重组蛋白极好地保持了VNTR的构象，可以更有效地激发免疫应答。在此基础上完成了本发明。

实验表明，本发明的重组蛋白可有效激发机体产生针对具有特殊构象要求的表位的特异性杀伤性T细胞(CTL)，提高了针对MUC1抗原特异性的杀伤性T细胞(CTL)免疫应答。

术语

如本文所用，术语“载体蛋白”指在本发明的重组蛋白中作为蛋白结构骨架的蛋白。通常，所述的载体蛋白是免疫原性较强的蛋白，例如病原体蛋白，代表性的例子包括(但并不限于)：病毒蛋白如CTB。

如本文所用，术语“抗原表位(肽)”指拟诱导动物产生免疫反应的其它蛋白的一段肽，该表位相对于载体蛋白而言的不是指载体蛋白本身能够引起免疫反应的肽段。通常，抗原表位指免疫反应拟靶向的肽段，较佳地来源于哺乳动物(如人)蛋白的一段肽，而不是来自所述载体蛋白。

如本文所用，术语T细胞表位是指T细胞表位，又称为T细胞抗原表位，是抗原分子经过抗原呈递细胞中酶解加工产生的一段肽，能够由主要组织相容性复合体(MHC)分子结合，呈递在细胞表面被T细胞受体(TCR)结合，激活T细胞，包括T辅助细胞表位等。

如本文所用，术语“低免疫原性蛋白”是指单独免疫动物不能引起足够的免疫反应的蛋白。

如本文所用，术语“分子表面氨基酸残基区”或“表面氨基酸残基区”是指位于蛋白分子表面的氨基酸残基组成的区域，优选地，所述“分子表面氨基酸残基区”包括loop区、beta-tum区、N末端或C末端。

霍乱毒素B亚单位(CTB)

霍乱毒素(cholera toxin)是霍乱弧菌分泌的外毒素(84kDa)，由A、B亚基组成，为AB5型。霍乱毒素B亚单位(CTB)是霍乱毒素无毒的部分，具有良好的免疫原性，经人体试验证明是疫苗的有效成分。CTB能与大多数哺乳动物细胞表面存在的神经节苷脂GM1特异性结合，刺激机体产生粘膜IgA，加强抗原性诱导粘膜免疫反应。

CTB无毒，由2段α螺旋元件和6段beta-片构成核心骨架，结构元件之间由灵活性的环区连接。五个B亚以长α螺旋元件相对平行向内组装，形成五角星形状。每个亚基都可独立结合细胞膜上的神经结苷脂(GM1)受体。

CTB氨基酸序列如下所示：

CTB含2个T细胞表位，CTB-Th表位81-100为优势表位，CTB-Th表位31-50为弱势表位，分布在亚单位结构核心的4段Beta-片上。

重组蛋白

如本文所用，术语“本发明蛋白”、“本发明重组蛋白”、“携带构象表位的重组蛋白”可互换使用，指在来自特定载体蛋白(霍乱毒素(CT)B亚基)的蛋白骨架的特定位置(对应于霍乱毒素B亚基的54-61位)，插入或替换有外源构象表位所形成的重组蛋白。

通过本发明所提供将表位肽段锚定到骨架分子特定表面，可以更准确地呈现表位天然构象。

在本发明中，提供了一种构象表位疫苗抗原蛋白骨架，所述抗原骨架具有源自霍乱毒素(CT)B亚基(CTB)的氨基酸序列，并且在56-QHID-59位氨基酸残基可以用目标表位肽段(即外源构象表位)拼接、替换、和/或插入。

在本发明另一优选例中，提供了一种基于CTB骨架的PD1抑制解除构象表位靶向癌症疫苗，其中CTB的C端融合PD-1结构域，CTB的56-QHID-59位氨基酸残基用表位肽段置换或插入。

在本发明另一优选例中，提供了一种基于CTB骨架的MUC1靶向癌症疫苗，其中CTB的56-QHID-59位氨基酸残基用MUC1的VNTR的肽段(APDTRPAPGSTA，SEQ ID NO.:2)

在本发明另一优选例中，提供了一种基于CTB骨架的MUC1和PD1双靶向癌症疫苗，其中CTB的56-QHID-59位氨基酸残基用MUC1的VNTR的肽段置换，并且CTB的C端融合PD-1结构域。

在本发明中，所述的重组蛋白可以是单体或多聚体。当形成多聚体(如五聚体)时，本发明重组蛋白更有效地结合于哺乳动物上皮细胞和/或白细胞表面的神经节苷脂(GM1)，从而降低抗原引起免疫应答的阈值，进而降低毒性。

本发明的重组蛋白或相应的制剂是基于CTB骨架的MUC1靶向癌症疫苗制剂。可用于预防和/或治疗肿瘤。

在本发明的疫苗组合物中，优选含有佐剂。如Alum佐剂和CpG佐剂。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的重组蛋白或本发明的可编码重组蛋白的多核苷酸，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

本发明的组合物可以是单价的(仅含有一种重组蛋白或多核苷酸)，也可以是多价的(含有多种重组蛋白或多核苷酸)。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(i)药物组合物

本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明重组蛋白或多核苷酸。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的重组蛋白。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的重组蛋白)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。

这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组蛋白)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。

(iii)给药途径和剂量

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组蛋白直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予重组蛋白疫苗，即重组蛋白的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。

代表性的疾病包括(但并不限于)：自身免疫性疾病、肿瘤等。

在各疫苗剂份中所选用的重组蛋白的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg，较佳地为1μg-100mg，更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。

优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他治疗剂一起给予。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明可有效增强机体针对MUC1的特异性的杀伤性T细胞(CTL)，在动物移植肿瘤模型的预防和治疗中表现出较好的抑制移植肿瘤的效果。

(b)重组蛋白骨架具有源自霍乱毒素(CT)B亚基(CTB)的氨基酸序列，可有效地与哺乳动物上皮细胞和白细胞表面的神经节苷脂(GM1)结合，从而降低抗原引起免疫应答的阈值。

(c)本发明的重组蛋白可降低了针对载体蛋白的抗体应答。

(d)当本发明的重组蛋白含有额外的PD-1结构域时，可有效阻断PD-1介导的肿瘤免疫抑制。

(e)含MUC1-VNTR表位的CTB重组蛋白抗原与Alum疫苗制剂显著降低了针对载体蛋白的抗体应答。含MUC1-VNTR表位的CTB重组蛋白抗原与Alum及CpG ODN制剂免疫动物能显著增强MUC1特异性的IgG2a抗体应答。含MUC1-VNTR表位的CTB重组蛋白抗原与Alum及CpGODN制剂，在荷瘤小鼠模型中能有效增强MUC1特异性的CTL效应，抑制MUC1阳性的肿瘤细胞的生长。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法

1.重组表位疫苗抗原结构设计

单表位重组蛋白抗原结构设计：将靶蛋白的抗原表位肽氨基酸序列移植到CTB的表位展示位置并替换原位置氨基酸残基完成，形成新蛋白结构。

2.重组表位疫苗的表达载体构建

以pSJF2-CTB为模板制备PCR反应体系。反应体系50μL，条件为95℃预变性5min，95℃变性1min、55℃退火1min、68℃延伸5min，共进行35次循环，最后68℃延伸10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(120V、25min)，按照Axygen凝胶回收试剂盒标准操作回收。DPN I酶消化胶回收产物(反应体系50μL：1μL DPN I酶、5μL 10X NEB Buffer 4，总体积不足50μL以ddH2O补足；37℃孵育120min，80℃变性20min备用)。取消化液2μL，加入到50μLE.coli Top10感受态细胞中，冰浴30min、42℃热激90s、立即置于冰上5min、然后加入600μLLB无抗性培养基，37℃、180rpm振摇复苏1h，取300μL涂布LB固体平板(Amp 100μg/mL)，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取单克隆培养于3mL LB(Amp 100μg/mL)培养基中，37℃，180rpm振摇培养过夜。将过夜菌送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。各引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

3.重组蛋白的表达与制备

将含有重组表达质粒蛋白的大肠杆菌TG1单菌接种于25mL LB培养基(Amp100μg/mL)，37℃、180rpm振摇培养过夜。将过夜菌按1:500转接至1L M9培养基(Amp 100μg/mL)，28℃、200rpm振摇培养30h，然后加入100μL 1M IPTG和100mL 10X TB培养基，28℃、200rpm振摇培养65-70h。8000rpm室温离心5min收集菌体并称重。

每1g菌体充分重悬于10mL上样缓冲液(500mMNacl，20mMTris，20mM Imidazole，pH8.0)，超声破碎仪破碎重悬液(功率8～10％，30min)。4℃，12000rpm离心30min后取上清液备用。Ni柱平衡(500mMNacl，20mMTris，20mM Imidazole，pH 8.0)后以2mL/min流速上样，洗杂液冲洗20个柱体积(500mMNacl，20mMTris，50mM Imidazole，pH 8.0)，洗脱液(500mMNacl，20mMTris，500mM Imidazole，pH 8.0)洗脱，收集洗脱峰。G25分子筛采用10mMPBS(pH7.4)平衡后，将洗脱峰过G25分子筛，收集流穿峰。流穿峰采用10kDa超滤管超滤后，加入还原/非还原上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳(分离胶浓度12％、电压120V、电泳时间约80min、蛋白胶的制备及Running buffer配制参考Bio-Rad标准配方)，BCA定量检测蛋白纯度及浓度。

4.融合蛋白的动物免疫与抗血清数据检测

雌性的C57BL/6SPF级老鼠购自中国科学院上海实验动物中心，并按照AAALAC指南要求进行饲养。融合蛋白抗原50μg，Al佐剂0.3mg或融合蛋白抗原50μg，Al佐剂0.3mg，CpG30μg混匀后，在小鼠背部脊柱两侧分别选取两个点进行皮下注射，第14天加强免疫，第21天小鼠眼眶取血，37℃静置2h，4000rpm离心10min后，取上清血清备用。

用包被缓冲液(50mmol/L碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)将靶蛋白或靶细胞的稀释至浓度为100ng/100μl，然后转移到聚苯乙烯96孔板上(每孔加100μl)，4℃孵育过夜，用PBST(0.02M磷酸盐，0.15M NaCl，0.15％Tween-20，pH 7.4)洗6次，每次洗5分钟。再加入300μl脱脂奶粉(溶于PBST，蛋白浓度为5％)，37℃孵育2小时进行封闭。用PBST(0.02M磷酸盐，0.15MNaCl，0.15％Tween-20，pH 7.4)洗6次，每次洗5分钟。然后用脱脂奶粉(溶于PBST，蛋白浓度为5％)将免疫血清稀释100倍后每孔加100μl，37℃孵育1小时，用PBST(0.02M磷酸盐，0.15MNaCl，0.15％Tween-20，pH 7.4)洗6次，每次洗5分钟。加入100μl兔抗鼠-IgG-辣根过氧化物酶交联物(1:5，000稀释)，室温孵育2小时，用PBST(0.02M磷酸盐，0.15M NaCl，0.15％Tween-20，pH 7.4)洗6次，每次洗5分钟。最后加入100μl底物溶液(10ml底物溶液含1mg四甲基联苯胺(TMB)，0.0969g柠檬酸钠，0.3496g Na₂HPO₄·12H₂O，32μl 0.75％H₂O₂，37℃孵育15分钟。加入50μl 2mol/L H₂SO₄终止反应。在酶标仪上对每个孔测450nm及630nm处的值，计算OD₄₅₀-OD₆₃₀。

5.小鼠肿瘤模型的构建

肿瘤细胞培养与移植：MUC1⁺B16采用RPMI-1640培养基，并于5％CO₂培养箱，37℃培养。当细胞融合度达到90％时，经0.25％胰酶消化，收集细胞于无血清的培养液中，轻轻摇动，500g，离心5min，洗涤一次，PBS重悬，调整浓度为10⁶，经台盼蓝染色，并用血球计数板计数，检测活细胞比例在95％以上。

小鼠免疫2次并在第21天采血，第24天在小鼠腋下接种2×10⁵个MUC1⁺B16肿瘤细胞，并于第28天加强免疫一次，剂量如方法4。出瘤后每3天用游标卡尺测量肿瘤长度与宽度，并计算肿瘤体积，计算公式为：体积＝[长×宽²]/2。第49天，处死小鼠并采取肿瘤和血液样本。

当肿瘤体积大于mm³理论上判断小鼠死亡，统计存活情况，制定生存曲线。根据公式：抑制率＝(对照组平均肿瘤重量-实验平均组肿瘤重量)/对照组平均肿瘤重量*100％计算抑制率。小鼠在分组前和剖杀前，电子天平称量小鼠体重并记录，计算瘤重体重比。

6.T淋巴细胞增殖检测

第21天小鼠脱颈处死后，放入75％乙醇中浸泡15分钟，将浸泡好的小鼠仰卧尾朝外平放在平皿中，从右侧腹股沟上方一厘米剪开腹腔，用小镊子拨开肝脏后小心拉出脾脏，放在6孔板的孔中，孔中预先加入2ml PBS；用注射器的活塞柄头小心的压碎脾脏，并进行旋转研磨至完全散开。将得到的细胞悬液小心的吸到离心管上的滤器中，至细胞悬液全部滤过，加1ml PBS冲洗下板孔并吸出冲洗滤网一次；准备好15ml离心管，预先加入3ml淋巴细胞分离液，按照说明书进行操作分离淋巴细胞；细胞沉淀用PBS再清洗一次，用含有10％FCS1640将细胞调整至1×10⁶/孔，每孔100μL，每孔加终浓度为10μg/ml的人MUC1肽刺激，5％CO₂37度培养72小时；加入10μL MTT继续培养4小时，吸弃培养上清及悬浮的细胞；加入100μL二甲亚砜，室温震荡5分钟溶解蓝色沉淀；在分光光度计测定在570nm、630nm处的吸光值，以OD₅₇₀-OD₆₃₀作为最终数值，判断每孔的活细胞数目。用抗原刺激组-空白对照组数值作为细胞增殖活性。

上述脾脏淋巴细胞分离后，用合成的hMUC1肽刺激72小时，用PBS洗涤一次，然后用100μl EB流式细胞染色buffer重悬，加入FC封闭剂anti-Mouse CD16/CD32于4度封闭20分钟。然后再加入Anti-mouse CD3-allophycocyanin(APC)，CD8-phycoerythryin(PE)，和CD4fluoresce in isothicyanate(FITC)(EB)，避光，4度孵育30分钟，PBS洗涤两次后用200μl EB流式细胞染色buffer重悬，FACS检测。实验采用未接受抗原刺激的细胞作为阴性对照。

7.细胞内IFN-γ染色

第21天，处死小鼠并取出小鼠脾脏淋巴细胞进行培养，加入终浓度为10μg/ml合成的hMUC1肽刺激，5％CO₂，37度培养72小时后备用。在染色前六小时，加入BFA以封闭IFNγ的分泌。1000rpm 5min离心弃上清，然后用100μl EB流式细胞染色buffer重悬，加入FC封闭剂anti-Mouse CD16/CD32于4度封闭20分钟。然后再加入Anti-mouse CD8-PE，避光，4度孵育30分钟，预冷的PBS洗涤一次后用100μl PBS及100μl IC固定buffer重悬，避光，室温孵育30分钟。200μl的EB透化buffer洗涤两次，100μl anti-IFNγ-APC染色buffer重悬，避光，冰上孵育30分钟。200μl的EB透化buffer洗涤一次，用200μl EB流式细胞染色buffer重悬，FACS检测。

8.CTL杀伤实验

MUC1⁺B16肿瘤细胞用胰酶消化后，1000rpm 5min离心弃上清；加入3ml Cell-Based Assay Buffer重悬，计数后1000rpm 5min离心弃上清；按照10⁶cells/ml用CFSEstaining buffer重悬，对照细胞用同体积Cell-Based Assay Buffer重悬，室温避光孵育15min；1000rpm 5min离心弃上清，细胞按照10⁶cells/ml用含10％FBS+1640的培养基重悬；1000rpm 5min离心弃上清，细胞按照10⁶cells/ml用含10％FBS+1640的培养基重悬。放置细胞培养箱中培养30min-1小时备用。

按照T细胞增殖实验中的方法分离脾脏淋巴细胞，按照10⁷cells/ml铺6孔板，每孔2ml；加入终浓度为10μg/ml合成的hMUC1肽和10units/ml IL-2刺激，5％CO₂，37度培养72小时后备用。

检测：将标记好的靶细胞按照104cells/well铺96孔板中。刺激好的效应细胞按照不同的效靶比加入到靶细胞中，并补足培养基至每孔总体积为200μL，5％CO₂37度孵育4小时。400g/5min收集细胞沉淀，每管加入50ul 7-AAD Staining Solution，重悬细胞。4度避光孵育15min；400g/5min收集细胞；加入0.2ml Assay Buffer重悬，400g/5min收集细胞；加入0.2ml Assay Buffer重悬，上流式检测，记录数据。计算双阳性细(CFSE+7AAD+)占CFSE阳性细胞(CFSE+)的百分比作为最终的杀伤率。

9.qPCR检测

第49天处死小鼠后，用TRIzol提取其肿瘤组织的总RNA，取1μgRNA，利用MaximaFirst Strand cDNA Synthesis Kit将其反转录为cDNA。在ABI7500用2×Maxima SYBRGreen/ROX qPCR Master Mix kit进行qPCR检测。程度如下：95℃10分钟，95℃ 30秒，60℃60秒，循环40次。鼠源GAPDH(GenBank accession number:NM_008084.3)的表达作为内在对照，数据分析采用ΔΔCT relative quantification方法。

实施例1

以人MUC1为靶点的肿瘤疫苗开发

Mucin 1(MUC1)是一个巨大的单肽链跨膜糖蛋白，在细胞内被自动催化切割成两个亚基并在胞外形成异源二聚体。MUC1包含有一个巨大的，由20个氨基酸肽链重复组成的胞外结构域(VNTR)，并高度糖基化。正常情况下，MUC1表达于具有分泌功能的上皮细胞并形成保护层。但是在多种肿瘤，如乳腺癌，胰腺癌，肺癌中，MUC1均呈现出显著的高表达、糖基化残缺，并且伴随严重的预后不良。多个研究表明，MUC1通过促进表皮细胞极性缺失，激活酪氨酸激酶受体信号转导途径等多个与细胞生存生长相关的信号转导途径以及对细胞死亡途径的耐受来促进肿瘤细胞的生长与侵袭。因此，MUC1是一种良好的抗肿瘤靶点，目前已经有多种靶向MUC1的疫苗以及抗体处在临床研究阶段。

步骤1表位插入疫苗的设计

参考通用方法1，采用了基于蛋白氨基酸比例及3D结构的五种不同的表位预测方法预估CTB的B细胞表位，成功预测出5个表位。其中，最好的B表位位于V₅₀–A₇₀及A₇₀–N₁₀₃区域，V₅₂–A₅₉位于CTB五聚体外表面的环状区域，并且是五种预测方法结果的共同覆盖区。除此之外，E₅₁–S₅₅被认为和五聚体的形成有关，因此，Q₅₆–D₅₉可能是能呈递MUC1肽的最具有免疫原性的表位。

本实施例将CTB的56-QHID-59位氨基酸替换为12个氨基酸的人MUC1肽VNTR片段(NH₂-APDTRPAPGSTA-COOH SEQ ID NO.:2)，设计表位疫苗CTB-hMUC1。抗原氨基酸序列如下：

>CTB-hMUC1氨基酸序列(SEQ ID NO.:5)

TPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKDEMAIITFKNGATFQVEVPGSAPDTRPAPGSTASQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN

步骤2表位插入疫苗构建，蛋白表达及规模化制备

参考通用方法2，以含CTB基因的pCTB2质粒为模板，采用引物1和引物2进行PCR获得CTB-hMUC1重组质粒，测序表明重组基因序列正确。引物序列如下：

引物序列5’—3’

引物1：hMUC1正向:AATTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTGCTCCGGACACCCGTCCGGCTCCGGGTTCTACCGCTTCACAAAAAAAAGCGATTGAAAGG(SEQ ID NO.:8)

引物2：hMUC1反向:CCTTTCAATCGCTTTTTTTTGTGAAGCGGTAGAACCCGGAGCCGGACGGGTGTCCGGAGCACTACCTGGTACTTCTACTTGAAAAATT(SEQ ID NO.:9)

参考通用方法3，将重组的CTB-hMUC1质粒，通过TG1菌株进行原核表达。经Ni-IDA金属螯合介质亲和纯化，SDS-PAGE电泳检测表明CTB-hMUC1抗原的大小为16kDa左右，并可形成大小为50kDa左右的五聚体结构，符合预期。蛋白纯度达到90％以上[图1A]。

步骤3抗血清数据的检测

参考通用方法4，进行Elisa检测，以合成的hMUC1肽(购自南京金斯瑞公司)作为包被抗原，将小鼠抗血清样品稀释100倍作为一抗，每组各10只。Elisa测定实验组CTB-hMUC1+Alum+CpG组的A_450-630值为1.8左右，而阴性对照hMUC1+Alum+CpG及CTB+Alum+CpG组的A_450-630值分别为0.8、0.1左右，实验组较阴性对照组有显著性差异，且CTB与hMUC1无交叉反应，表明CTB-hMUC1疫苗能激发小鼠针对人MUC1的抗体。对抗体亚型及抗体滴度的检测表明CTB-hMUC1+Alum+CpG组能够产生更高的anti-MUC1IgG应答及更强的IgG2a应答，预示着其能引起激发更强的Th1免疫途径应答[图1B]。

步骤4抗肿瘤效果研究

参考通用方法5，于第24天，对抗原组合中含有CpG的各组接种MUC1⁺B16肿瘤细胞，并于第28天加强免疫一次。肿瘤接种后每三天测量一次肿瘤大小。肿瘤接种后第14天，CTB-hMUC1+Alum+CpG组即显示出抗肿瘤效果。第49天处死小鼠，测量肿瘤体积，称量肿瘤重量，计算抗肿瘤效果。结果显示，CTB-hMUC1+Alum+CpG组小鼠肿瘤体积显著减少，与阴性对照组相比具有显著性差异。以上结果表明，CTB-hMUC1疫苗具有显著的抗肿瘤作用[图1C]。

步骤5CTB-hMUC1对T淋巴细胞应答的影响

参考通用方法6，检测CTB-hMUC1疫苗对T淋巴细胞应答的影响。人MUC1肽刺激小鼠脾脏细胞72小时后，生理盐水对照组，hMUC1+Alum+CpG组及CTB+Alum+CpG组均未表现出淋巴细胞增殖活性，而CTB-hMUC1+Alum+CpG组则表现出了显著的淋巴细胞增殖活性。通过流式细胞术检测CD8+的T淋巴细胞，结果显示，各组中CD8+的T淋巴细胞均增加，但在CTB-hMUC1+Alum+CpG组中增加更加显著。说明CTB-hMUC1疫苗可以有效刺激T细胞增殖，打破细胞免疫耐受[图1D]。

步骤6CTB-hMUC1对CD8+淋巴细胞产生IFN-γ的影响

参考通用方法7检测CTB-hMUC1疫苗对T淋巴细胞产生IFN-γ的影响。流式分析的结果显示，经人MUC1肽刺激后，生理盐水组，hMUC1+Alum+CpG组及CTB+Alum+CpG组均未产生hMUC1特异性的IFN-γ。而实验组CTB-hMUC1+Alum+CpG组的脾脏细胞则产生了对hMUC1特异性的T细胞免疫应答[图1E]。

步骤7CTL杀伤实验

用人MUC1肽及IL-2刺激荷瘤小鼠的T淋巴细胞作为效应细胞，用MUC1⁺B16细胞作为靶细胞进行CTL杀伤实验，具体方法参考通用方法8。

结果显示，当效应细胞与靶细胞的比例为1:50时，在实验组CTB-hMUC1+Alum+CpG组中，59.6％的MUC1⁺B16细胞能被杀死，而其他对照组中这一比例则只有30％。当效靶比降低至1:20时，实验组CTB-hMUC1+Alum+CpG组同样表现出有显著性差异的杀伤能力，当效靶比降低至1:10时，各组之间才无显著性差异。说明CTB-hMUC1疫苗能够对靶细胞产生很好的CTL杀伤作用[图1F]。

步骤8肿瘤内部MUC1+，Th1，TIL等表达水平的检测

参考通用方法9，采用qPCR检测肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)，Th1免疫途径及肿瘤组织内部hMUC1的表达水平。检测指标如下，肿瘤浸润T淋巴细胞(T细胞表面标志物CD3e链及CD8α链；Th1途径(IL-2Rα及CCR-2)。

结果

检测结果表明，经CTB-hMUC1+Alum+CpG免疫后的小鼠肿瘤内部，MUC1的表达显著减少，同时，其CD3e和CD8α的mRNA的表达水平也显著增加，Th1途径相关的标志物IL-IL-2Rα及CCR-2的mRNA水平相比于对照组增加了5倍。以上结果说明CTB-hMUC1抗原能够显著增加肿瘤T淋巴细胞浸润及促进Th1途径的产生。

实施例2

以鼠MUC1为靶点的肿瘤疫苗开发

步骤1表位插入疫苗的设计

参考通用方法1，采用了基于蛋白氨基酸比例及3D结构的五种不同的表位预测方法预估CTB的B细胞表位，成功预测出5个表位。其中，最好的B表位位于V₅₀–A₇₀及A₇₀–N₁₀₃区域，V₅₂–A₅₉位于CTB五聚体外表面的环状区域，并且是五种预测方法结果的共同覆盖区。除此之外，E₅₁–S₅₅被认为和五聚体的形成有关，因此，Q₅₆–D₅₉可能是能呈递MUC1肽的最具有免疫原性的表位。

本实施例将CTB的Q56-D59位氨基酸替换为20个氨基酸的鼠MUC1肽VNTR片段(NH₂-DSTSSPVAHSGTSSPATSAP-COOH,SEQ ID NO.:4)，设计表位疫苗CTB-mMUC1。抗原氨基酸序列如下：

>CTB-mMUC1氨基酸序列(SEQ ID NO.:6)

TPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKDEMAIITFKNGATFQVEVPGSDSTSSPVAHSGTSS PATSAPSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN

步骤2表位插入疫苗构建，蛋白表达及规模化制备

参考通用方法2，以含CTB基因的pCTB2质粒为模板，采用引物3和引物4进行PCR获得CTB-mMUC1重组质粒，测序表明重组基因序列正确。引物序列如下：

引物3：mMUC1正向(引物序列5’—3’)

AATTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTGACTCTACTTCTTCTCCAGTTGCTCACTCTGGTACTTCTTCTCCAGCTACTTCTGCTCCATCACAAAAAAAAGCGATTGAAAGG(SEQ ID NO.:10)

引物4：mMUC1反向(引物序列5’—3’)

CCTTTCAATCGCTTTTTTTTGTGATGGAGCAGAAGTAGCTGGAGAAGAAGTACCAGAGTGAGCAACTGGAGAAGAAGTAGAGTCACTACCTGGTACTTCTACTTGAAAAATT(SEQ ID NO.:11)

参考通用方法3，将重组的CTB-mMUC1质粒，通过TG1菌株进行原核表达。经Ni-IDA金属螯合介质亲和纯化，SDS-PAGE电泳检测表明CTB-mMUC1抗原的大小为22kDa左右，并可形成大小为66kDa左右的五聚体结构，符合预期。蛋白纯度达到90％以上。

步骤3抗血清数据的检测

参考通用方法4，进行Elisa检测，以合成的mMUC1肽(购自南京金斯瑞公司)作为包被抗原，将小鼠抗血清样品稀释100倍作为一抗，每组各5只。Elisa测定实验组CTB-mMUC1+Alum+CpG组的A_450-630值为0.3左右，而阴性对照mMUC1+Alum+CpG及CTB-Fc+Alum+CpG组的A_450-630值分别为0.1和0.1，实验组较阴性对照组无显著性差异。

结果

重组的CTB-MUC1具有和骨架蛋白CTB类似的构象并能形成五聚体。CTB-MUC1免疫后产生了高滴度的MUC1抗体。肿瘤保护实验结果显示CTB-hMUC1组小鼠肿瘤体积显著减少，与阴性对照组相比具有显著性差异。以上结果表明，CTB-hMUC1疫苗具有显著的抗肿瘤作用。CTB-MUC1免疫后小鼠体内的MUC1特异性杀伤性T细胞(CD8+IFNγ+)相比其他对照组显著增加(图2)。

实施例3

以鼠MUC1及鼠PD-1为靶点的肿瘤疫苗开发

程序性死亡受体1(PD-1)是B7-CD28家族成员，是一种免疫抑制性受体，表达于激活的CD4+\CD8+T细胞，单核细胞，NK细胞，B细胞上。PD-1与其表达于APC上的配体PDL-1/2结合抑制T细胞受体信号，并且下调抗凋亡因子(Bcl-xl)和促炎因子的表达。肿瘤浸润性淋巴细胞上高表达的PD-1与效应细胞的损伤(细胞因子产生和细胞因子抗肿瘤效果)以及多种肿瘤的预后差有关。因此阻断PD-1及其配体介导的肿瘤免疫免疫抑制将是一个十分有效的加强肿瘤免疫应答，增强抗肿瘤药物疗效的方法。最近的研究表明，利用单克隆抗体双阻断PD-1及CTLA-4介导的信号转导途径并联合肿瘤细胞疫苗能有效加强肿瘤淋巴细胞的浸润，恢复肿瘤特异性CD8+T细胞的功能，下调肿瘤浸润性调节性T细胞的比例，增强疫苗的抗肿瘤疗效。本实施例中利用基因工程技术设计制备了一种靶向PD1以及MUC1的双靶点蛋白疫苗，以期研究这种双靶点疫苗能否同时废除肿瘤诱导的免疫抑制并增强MUC1特异的抗肿瘤免疫应答。

步骤1表位插入疫苗的设计

参考通用方法1，采用了基于蛋白氨基酸比例及3D结构的五种不同的表位预测方法预估CTB的B细胞表位，成功预测出5个表位[Table 1]。其中，最好的B表位位于V₅₀–A₇₀及A₇₀–N₁₀₃区域，V₅₂–A₅₉位于CTB五聚体外表面的环状区域，并且是五种预测方法结果的共同覆盖区。除此之外，E₅₁–S₅₅被认为和五聚体的形成有关，因此，Q₅₆–D₅₉可能是能呈递MUC1肽的最具有免疫原性的表位。

本实施例将CTB的Q56-D59位氨基酸替换为20个氨基酸的鼠MUC1肽VNTR片段(NH₂-DSTSSPVAHSGTSSPATSAP-COOH)，同时，在CTB的C端插入鼠源的PD-1基因，设计表位疫苗CTB-mMUC1-mPD-1。抗原氨基酸序列如下：

>CTB-mMUC1-mPD-1氨基酸序列(SEQ ID NO.:7)

TPQNITDLCAEYHNTQIYTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGAIFQVEVPGS

SAPSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN

LTFYPAWLTVSEGANATFTCSLSNWSEDLMLNWNRLSPSNQTEKQAAFCNGLSQPVQDARFQIIQLPNRHDFHMNILDTRRNDSGIYLCGAISLHPKAKIEESPGAELVVTERIL

其中，粗体为鼠MUC1肽VNTR序列，下划线为连接肽，斜体为协助纯化的标签序列6His。连接肽之前CTB蛋白骨架，之后为免疫调节结构域。

步骤2表位插入疫苗构建，蛋白表达及规模化制备

参考通用方法2，以含CTB基因的pCTB2质粒为模板，采用引物3和引物4进行PCR获得CTB-mMUC1重组质粒，测序表明重组基因序列正确。引物序列如下：

引物3：mMUC1正向(引物序列5’—3’)

AATTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTGACTCTACTTCTTCTCCAGTTGCTCACTCTGGTACTTCTTCTCCAGCTACTTCTGCTCCATCACAAAAAAAAGCGATTGAAAGG(SEQ ID NO.:10)

引物4：mMUC1反向(引物序列5’—3’)

CCTTTCAATCGCTTTTTTTTGTGATGGAGCAGAAGTAGCTGGAGAAGAAGTACCAGAGTGAGCAACTGGAGAAGAAGTAGAGTCACTACCTGGTACTTCTACTTGAAAAATT(SEQ ID NO.:11)

引物5：mPD1正向(引物序列5’—3’)

TCCGGTGGAGGCGGGTCCTCCGGATCCCTCACCTTCTACCCAGCC(SEQ ID NO.:12)

引物6：mPD1反向(引物序列5’—3’)

CTGATCAGTTTTTGTTCGGATCCCTAGTGATGGTGGTGGTGGTGCAGGATTCTCTCTGTTACCAC(SEQID NO.:13)

参考通用方法3，构建CTB-mMUC1质粒。同时以PMD18T-mPD1为模板，引物5，6为引物扩增mPD1片段(469bp)，反应体系为50μL，条件为95℃预变性3min，95℃变性30s、58℃退火30s、68℃延伸35s，共进行35次循环，最后68℃延伸5min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(120V、25min)，按照Axygen凝胶回收试剂盒标准操作回收。将pCTB2及测序结果正确的CTB-Muc1重组质粒，用BaMH I及BspE I内切酶进行线性化。PCR获得的mPD1片段，通过同源重组法将其整合至线性化质粒pCTB2/CTB-Muc1的BaMH 1及BspE I酶切位点之间(反应体系20μL，含2μL ExnaseTmII、4μL 5X CE II buffer、线性化质粒50～200ng，插入片段扩增产物20～200ng，反应体系不足20μL以ddH2O补足；所有组分轻柔混匀，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用)。取2μL反应液加入到50μL E.coli Top10感受态细胞中，冰浴30min、42℃热激90s、立即置于冰上5min、然后加入600μL LB无抗性培养基，37℃、180rpm振摇复苏1h，取300μL涂布LB固体平板(Amp 100μg/mL)，37℃倒置培养过夜并挑取单克隆培养。PCR鉴定为阳性的单克隆通过TG1菌株进行原核表达。经Ni-IDA金属螯合介质亲和纯化，SDS-PAGE电泳检测表明CTB-mMUC1-mPD1重组蛋白的大小为28kDa左右，CTB-mPD1的大小为28kDa左右，符合预期。蛋白纯度达到90％以上[图3C]。

步骤3抗血清数据的检测

参考通用方法4，进行Elisa检测，分别以合成的mMUC1肽(购自南京金斯瑞公司)及本实验室制备的mPD1单结构域蛋白作为包被抗原，将小鼠抗血清样品稀释100倍作为一抗，每组各5只。Elisa测定实验组CTB-mMUC1-mPD1+Alum+CpG及CTB-mPD1+Alum+CpG两组针对于mMUC1的的A_450-630值分别为0.8和0.1左右，针对于mPD1的的A_450-630值分别为1.2和1.4，实验组较阴性对照组具有显著性差异。以上结果证明CTB-mMUC1-mPD1疫苗能有效突破自身免疫耐受，同时产生特异性的针对于mMUC1和mPD1的抗体，PD1的存在能够减轻机体的免疫抑制环境，增强针对于mMUC1的特异性免疫应答[图3B，3D]。

结果

重组的CTB-MUC1具有和骨架蛋白CTB类似的构象并能形成五聚体(图3A)/CTB-mMUC1免疫后只能产生极低滴度的mMUC1抗体，而融合PD-1后能显著帮助mMUC1打破自身免疫耐受产生高滴度抗体(图3B，3D)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种携带构象表位的重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有源自载体蛋白的结构骨架以及整合入所述结构骨架的外源构象表位肽段W，所述的载体蛋白为霍乱毒素B亚基(CTB)，并且所述构象表位肽段W替换和/或插入霍乱毒素B亚基(CTB)中P1位至P2位的肽段T1，其中，P1为第56位，而P2为第59位；

其中，所述P1和P2的氨基酸位置基于SEQ ID NO.:3；

并且，所述的外源构象表位肽段W包括序列如SEQ ID NO.:2和4所示的VNTR片段；

并且，所述的重组蛋白的序列如SEQ ID NO.:5、6或7所示。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的重组蛋白。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求3所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括真核细胞和原核细胞。

6.一种生产权利要求1所述的重组蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞，从而表达权利要求1所述的重组蛋白；和

(b)分离或纯化所述的重组蛋白。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有(a)权利要求1所述的重组蛋白、权利要求2所述的多核苷酸或者权利要求3所述的表达载体或者权利要求4所述的宿主细胞，以及(b)药学上可接受的载体和/或辅料。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的组合物为疫苗。

9.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物含有(a)权利要求1所述的重组蛋白、权利要求2所述的多核苷酸或者权利要求3所述的表达载体或者权利要求4所述的宿主细胞，以及(b)免疫学上可接受的载体和/或辅料。

10.如权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物为MUC1靶向癌症疫苗制剂。

11.一种如权利要求1所述的重组蛋白、或权利要求7所述的药物组合物、或权利要求9所述的疫苗组合物的用途，它们被用于制备预防或治疗肿瘤的药物；其中，所述的肿瘤是MUC1阳性的肿瘤。

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