JP2003277292A - マラリア原虫伝搬阻止粘膜ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、粘膜投与によるマラリア原虫伝搬
阻止ワクチンを提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明は、粘膜アジュバントおよびマラ
リア原虫伝搬阻止抗原の混合物を含むことを特徴とする
ワクチンを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、粘膜アジュバント
およびマラリア原虫伝搬阻止抗原を含有することを特徴
とするマラリア原虫伝搬阻止粘膜ワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで過去数十年にわたり莫大な尽力
がマラリア感染の征圧のために投入され、効果的な抗マ
ラリア薬の開発およびＤＤＴのような殺虫剤が開発され
たことなどからマラリア発生率は顕著に減少した。しか
し、そのような薬剤の使用は薬剤耐性原虫および殺虫剤
耐性媒介蚊を出現させ、現在では抗マラリア薬による直
接的な感染治療、および媒介生物の駆除を介しての間接
的な原虫駆除などの方法のみでマラリアを制御すること
は著しく困難なものとなってきている。このようなマラ
リア征圧における現状から、宿主側の免疫機能を有効に
利用するワクチン接種がマラリア制御戦略のもう一方の
有効手段として、以前にも増して重要となってきてお
り、ＷＨＯおよびその他の国際機関が有効なワクチンの
開発を待ち望んでいる。しかしながら、マラリアに限ら
ず、デング熱、日本脳炎など、多くの感染症の蔓延に実
際に悩まされているアジア、アフリカ、中南米諸国の経
済途上国では、費用がかかりすぎるという理由から、従
来型ワクチンの接種を普及させることはきわめて困難で
あり、世界規模での感染症対策が円滑に行えないという
のが現状である。

【０００３】また、マラリア原虫感染に対する有効なワ
クチンは未だ開発されていない。その理由は、ヒトの獲
得防御免疫に関する主要な原虫由来の抗原や免疫誘導機
構など、不明な点が多くあるためであるが、とりわけ重
大な理由は、マラリア原虫は高度に発達した免疫回避機
構によりヒト宿主の免疫監視から逃れるシステムを発達
させており、防御免疫の獲得が困難なことである。この
ような宿主免疫監視からの回避機構はマラリア原虫の遺
伝子多型や抗原性の多様性などに起因しており、ヒト体
内で各発生段階に応じて表面の抗原が変化するためであ
ると考えられている。このようなことから感染患者内の
無性生殖期の原虫を標的としたワクチンは、未感染者の
感染防御および感染患者の症状緩和において若干の効果
はあるものの、実用化に至る有効なワクチンは開発され
ていない。また、宿主免疫監視から回避したマラリア原
虫に対しては効果がなく、伝搬阻止の目的にはあまり有
効ではない。

【０００４】このような理由からマラリア原虫の伝搬を
阻止するためには、伝搬阻止ワクチン（図１〜４）が有
効と考えられる。伝搬阻止ワクチンは、媒介蚊内で有性
生殖期にあるマラリア原虫の表面抗原の変異性が、宿主
内マラリア原虫のそれと比べ低いことに依拠するもので
ある。有性生殖期のマラリア原虫の表面抗原を含有する
伝搬阻止ワクチンは、前記表面抗原を標的とする抗体を
ヒト体内で産生させ、ワクチンを投与されたヒトがその
後感染した場合でも、すでに感染している場合でも、効
果的に媒介蚊からヒトへのマラリア伝搬を阻止するもの
である（図１）。即ち、吸血した蚊は中和抗体を中腸内
に取り込み、そこでの原虫発育を阻害する。その作用機
構上、伝搬阻止ワクチンはマラリア原虫の生活環を媒介
蚊の段階で遮断して感染の伝搬を阻止するため、ワクチ
ン接種を受ける本人に対しては感染防御効果や症状の緩
和などの直接的な効果がない。また、前記表面抗原は感
染患者に存在するマラリア原虫では発現していないこと
から、感染原虫がたとえ体内に存在していても前記表面
抗原に対するブースト効果が生じないため、感染患者で
さえも継続的なワクチン接種によって抗体価を維持する
必要がある。

【０００５】以上のように、マラリアの根絶には伝搬阻
止ワクチンが有効であるが、感染地域のできるだけ多く
の対象に継続して接種する必要があること、また接種す
る対象が感染・発症から守られないこと、さらに従来の
注射投与ではコストがかかることなどの理由から、マラ
リア浸淫地域での実用化が困難とされている。

【０００６】遺伝子組換え技術によって作り出された組
換え蛋白質ワクチンの経口および経鼻などの経粘膜免疫
法によるワクチンは、注射器を必要としない利便性のあ
る易接種型ワクチンであり、コスト的にも従来型ワクチ
ンより優れている。また、経粘膜免疫法は痛みを伴わな
いので生殖母体を多く有する感染した子供を対象とする
ことが比較的容易であり、継続的な集団ワクチン接種が
可能となる。更に、経粘膜ワクチンは、組換え植物を使
用した「食べるワクチン」としての可能性を秘めてい
る。このような「食べるワクチン」は究極的な接種法で
あり、コスト面できわめて優れていると考えられてい
る。

【０００７】このように粘膜投与型のワクチンは前記課
題の有効な解決策と思われるが、媒介蚊の吸血によって
伝搬するマラリアの侵入部位は、ポリオやインフルエン
ザのように腸管や呼吸器の粘膜ではない。そのため、従
来はマラリアのワクチンを粘膜から接種するという発想
がなかったことなどから、粘膜投与型のワクチンはいま
だ提案されてない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】前記課題を解決し、集
団的・継続的なワクチン実施体制を確立するために、本
発明は易接種型で痛みを伴わない粘膜投与型の伝搬阻止
ワクチンを提供することを目的とする。

【０００９】より具体的には、粘膜アジュバントおよび
マラリア原虫伝搬阻止抗原の混合物を含むことを特徴と
するマラリア原虫伝搬阻止粘膜ワクチンを提供すること
を目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、有性生殖
期（媒介蚊内での発育）のマラリア原虫の抗原（ヒトの
体内で増殖する原虫では発現していない）を伝搬阻止ワ
クチンとして使用し、有性生殖期のマラリア原虫に対す
る特異的血中抗体を経粘膜投与によって誘導することを
試みた。また、粘膜アジュバントを用いることで免疫増
強効果を獲得することを試みた。

【００１１】上記課題を解決するため鋭意研究を行った
結果、粘膜アジュバントおよびマラリア原虫伝搬阻止抗
原との混合物がマラリア原虫伝搬阻止粘膜ワクチンとし
て機能することを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１２】すなわち、本発明の一つの態様に従えば、
粘膜アジュバントおよびマラリア原虫伝搬阻止抗原を含
有することを特徴とする粘膜ワクチンが提供される。

【００１３】本発明の更に別の態様に従えば、前記粘膜
ワクチンを使用したマラリア伝搬を阻止する方法が提供
される。

【００１４】本発明において、前記粘膜アジュバント
は、好ましくはコレラトキシン蛋白質（ＣＴ）、より好
ましくはコレラトキシンＢ鎖蛋白質（ＣＴＢ）である。

【００１５】また、本発明において、前記マラリア原虫
伝搬阻止抗原は、好ましくはマラリア原虫虫様体の表面
抗原、より好ましくはＰｙｓ２５蛋白質またはＰｖｓ２
５蛋白質である。

【００１６】以下本発明を詳細に説明する。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明のマラリア原虫の伝搬を阻
止するワクチンは、粘膜アジュバントおよびマラリア原
虫伝搬阻止抗原を含有することを特徴とする。

【００１８】ここで、「粘膜アジュバント」とは、粘膜
組織や免疫担当細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マク
ロファージ等）に対する特異的親和性を有するなどの性
質をもつ蛋白質をいい免疫増強効果やワクチン運搬機能
をもつもののことである。前記粘膜アジュバントは、た
とえばコレラトキシン蛋白質（ＣＴ）、コレラトキシン
Ｂ鎖蛋白質、毒素原性大腸菌（ＬＴＢ）、弱毒サルモネ
ラ菌もしくは乳酸菌等の細菌、ウイルス、病原体、また
はその他に由来する、粘膜細胞表面や免疫担当細胞に対
する特異的親和性を有する蛋白質を使用することができ
る。本発明は、このような粘膜アジュバントをマラリア
原虫伝搬阻止抗原と組合わせることにより、経粘膜投与
によるワクチン接種によって、マラリア原虫伝搬阻止抗
原での有効な免疫賦与を可能にしたものである。

【００１９】本発明の一つの態様において、前記粘膜ア
ジュバントは、好ましくはコレラトキシン蛋白質（Ｃ
Ｔ）であり、より好ましくはコレラトキシンＢ鎖蛋白質
（ＣＴＢ）である。

【００２０】本発明の「マラリア原虫伝搬阻止抗原」と
は、有性生殖期（媒介蚊内での発育）のマラリア原虫で
発現する変異しないか、または、変異の少ない抗原であ
る。既述したように、該抗原に対して誘導された抗体
は、媒介蚊内でマラリアの発生を阻害する効果を呈す
る。したがって、この抗原に対する免疫を誘導すること
によって、結果的に媒介蚊からヒトへのマラリア伝搬を
阻止することができる。この抗原は前記マラリア原虫伝
搬阻止抗原の性質を有するものであればよいが、好まし
くは有性生殖期のマラリア原虫の表面に発現する抗原で
あり、より好ましくはマラリア原虫の虫様体の表面に発
現する蛋白質であり、最も好ましくはＰｙｓ２５蛋白質
またはＰｖｓ２５蛋白質に由来する抗原である。

【００２１】また、前記マラリア原虫伝搬阻止ワクチン
は、前記粘膜アジュバントと前記マラリア原虫伝搬阻止
抗原の融合蛋白質を含むものであってもよい。この融合
蛋白質は、前記粘膜アジュバントの遺伝子および前記マ
ラリア原虫伝搬阻止抗原の遺伝子が得られれば、これら
の遺伝子を適切な発現ベクターに組込み、該発現ベクタ
ーを適切な宿主に形質転換することにより、当該技術分
野において周知の方法を用いて製造することができる。

【００２２】本発明のワクチンは、前記蛋白質（粘膜ア
ジュバントおよびマラリア原虫伝搬阻止抗原）を含有す
ることを特徴とするが、前記ワクチンは、たとえばひと
つ以上の薬学的に、又は獣医学的に許容される担体を含
んでいてもよく、必要に応じて他の治療成分と組み合わ
せることが好ましい。前記担体は、ワクチン中の他の成
分と適合し、その投与対象に対して害がないという意味
で「許容される」ものでなければならない。当然のこと
ながら、その成分は意図する投与経路に応じて変動し、
薬学分野での周知の方法によって調製され得る。また、
本発明のワクチンの用量は、様々な要因に基づいて、適
切な投与量レベルで投与すればよい。このような用量
は、医師または獣医師であれば、容易に適切な投与量レ
ベルを決定できるであろう。

【００２３】本発明のワクチンは、経粘膜接種されるこ
とが特徴であり、鼻腔粘膜に接種するのが特に好まし
い。

【００２４】以下、本発明に使用する蛋白質の一例につ
いて、その取得方法を説明する。

【００２５】本発明において使用する蛋白質の幾つか
は、商業的に入手可能である。例えば、コレラトキシン
蛋白質（ＣＴ）およびコレラトキシンＢ鎖蛋白質（ＣＴ
Ｂ）はシグマケミカル社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， Ｍ
Ｏ．）から商業的に入手可能である。

【００２６】また、商業的に入手できないときでも、コ
レラトキシン蛋白質（ＣＴ）またはコレラトキシンＢ鎖
蛋白質（ＣＴＢ）、並びにＰｙｓ２５遺伝子およびＰｖ
ｓ２５遺伝子などのマラリア原虫伝搬阻止抗原をコード
するｃＤＮＡ配列は公知であるので、それらの配列を基
にして、当業者に周知の技術により、これら蛋白質をコ
ードする遺伝子を得ることができる。即ち、プライマー
を設計して通常のＰＣＲ法により、又は化学合成によ
り、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブ
としてハイブリダイズさせることにより、これら蛋白質
の遺伝子を得ることができる。

【００２７】具体的には、例えば、本発明に使用する蛋
白質のうち、コレラトキシンＢ鎖蛋白質（ＣＴＢ）をコ
ードするＤＮＡの取得法としては、以下の反応条件、テ
ンプレート、およびプライマーを使用してＰＣＲを行う
ことによって、ＣＴＢ遺伝子を増幅できる； テンプレート：コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒ
ａｅ）のゲノムＤＮＡ、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉ
ｍｅｒ： ５’−ＧＣＧＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴ
ＴＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号１） Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣ
ＴＴＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＧＴＡＧＧＧＧ
ＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＣＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴ
ＡＣＴＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣ−３’（配列番
号２） ＰＣＲ条件：９４℃において３分の後、９４℃において
４５秒、５５℃において１分、７２℃において１分を３
０サイクル、次に７２℃において１０分。

【００２８】また、本発明に使用する蛋白質のうち、マ
ラリア原虫伝搬阻止抗原であるＰｖｓ２５蛋白質をコー
ド遺伝子は、例えば、以下の反応条件、テンプレート、
およびプライマーを使用してＰＣＲを行うことによっ
て、Ｐｖｓ２５遺伝子を増幅できる； テンプレート：Ｓａｌｖａｄｏｒ Ｉ株の三日熱マラリ
ア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）のゲノム
ＤＮＡ、 Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＴＡＴＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＴＣＡＣＧＧ
ＴＡＴＡＣＡＣＣ−３’（配列番号３） Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＴＡＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴＡＣＡ
ＴＴＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番号４） ＰＣＲ条件：９４℃において２分変性した後、変性条件
を９４℃、アニーリング条件を４２℃、伸長条件を７２
℃にして、それぞれ１分の反応を３サイクル、その後は
アニーリング温度を６２℃にして更に２５サイクルの反
応をおこなう。

【００２９】次に、上記のようにして得られた遺伝子
を、適切な発現ベクターに組込み、これを適切な宿主細
胞に導入して得られた形質転換体を培養し、前記組込ま
れた遺伝子を発現させることにより、コレラトキシンＢ
鎖蛋白質およびマラリア原虫伝搬阻止抗原蛋白質を得る
ことができる。このような遺伝子組換え技術は、当業者
に周知である。なお、上記二つの遺伝子を適切に連結
し、これを一つの発現ベクターに組込んで、適切な宿主
細胞内で発現させることにより、上記二つの蛋白質の融
合蛋白質を得ることができる。このような融合蛋白質を
得る方法も、当業者に周知である。

【００３０】こうして得られた目的の蛋白質は、必要に
応じて適宜精製して使用する。そのような精製方法とし
ては、次のような方法が挙げられる。即ち、例えば硫安
塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、ハイドロフォービッククロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィー等の方法を組み合わせるこ
とにより精製する方法；前記蛋白質または前記融合蛋白
質を発現させる際に、種々の精製用タグ（例えばＨｉ
ｓ、ＧＳＴ、Ｔ７、チオレドキシン等）を付加して発現
させ、それぞれのアフィニティーカラムを利用したアフ
ィニティークロマトグラフィーにより精製する方法；前
記蛋白質または前記融合蛋白質に特異的なモノクローナ
ル抗体又はポリクローナル抗体を用いて作製したイムノ
アフィニティーカラムを用い、イムノアフィニティーク
ロマトグラフィーにより精製する方法；およびＧＭ１ガ
ングリオシドをカップリングさせたカラムを用いたアフ
ィニティークロマトグラフィー（ＣＴＢは、ＧＭ１ガン
グリオシドに対する特異的親和性を有していることが明
らかである）により精製する方法などである。

【００３１】粘膜アジュバントは粘膜細胞表面や免疫担
当細胞に親和性を有する限り、及び、マラリア原虫伝搬
阻止抗原は、免疫誘導活性を有する限り、当該アミノ酸
配列において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置換、
付加等の変異が生じてもよい。例えば、前記蛋白質（粘
膜アジュバントまたはマラリア原虫伝搬阻止抗原）また
は前記融合蛋白質のアミノ酸配列の少なくとも１個、好
ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜２０個
のアミノ酸が欠失してもよく、又は、アミノ酸配列に少
なくとも１個、好ましくは１〜５０個程度、さらに好ま
しくは１〜２０個のアミノ酸が付加してもよく、或い
は、アミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜５
０個程度、さらに好ましくは１〜２０個のアミノ酸が他
のアミノ酸に置換してもよい。前記蛋白質または前記融
合蛋白質は、粘膜細胞および／または免疫担当細胞に対
する特異的親和性または免疫誘導活性を有している限
り、より短い、またはより長いペプチド配列をコードし
てもよい。ここで、免疫誘導活性とは、前記蛋白質また
は前記融合蛋白質を投与された動物が、それらを体内に
取り込み、異物として認識し、それらに対する抗体を体
内に生産し、かつ該抗体が前記蛋白質または前記融合蛋
白質の活性部分に作用してマラリア原虫の伝搬を阻害す
る活性を意味する。例えば、前記蛋白質または前記融合
蛋白質の粘膜アジュバントにおいては、粘膜細胞表面に
親和性あるいは免疫増強効果を有することを意味し、マ
ラリア原虫伝搬阻止抗原においては、マラリア原虫抗原
に対する抗体産生を体内に誘導することを意味する。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。なお、以下の説明では各
系列の実験ごとに種々の公知文献が参照される。これら
文献の書誌的事項は、発明の詳細な説明の項の末尾にあ
る配列表の直前に各系列ごとに列記する。

【００３３】

【第１系列の実験】ネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）の虫様体表面蛋白質（ＯＳＰ：ｏ
ｏｋｉｎｅｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）
Ｐｙｓ２５とコレラ毒素の共経鼻投与によるマウスにお
ける完全伝搬阻止免疫の誘導。

【００３４】＜材料および方法＞Ｐｙｓ２５蛋白質の発現および精製 Ｐｙｓ２５遺伝子をコードする遺伝子は、公知のＰｙｓ
２５遺伝子の塩基配列をもとに設計したプライマーセッ
ト、および、ネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｙｏｅｌｉｉ）のＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲ法
により増幅した。

【００３５】Ｐｙｓ２５遺伝子をコードするＰＣＲ産物
をＹＥｐＲＰＥＵ−３プラスミッドに導入した。ＹＥｐ
ＲＰＥＵ−３プラスミッドは酵母のエピゾームプラスミ
ッドであって、マルチクローニングサイトの５’側に酵
母の蛋白質分解酵素であるＫＥＸ２の切断部位配列を終
端部に有する分泌性α―因子配列をコードしている。

【００３６】前記プラスミッドのマルチクローニングサ
イトの下流には６つのヒスチジン、そして終止コドンを
コードする領域が設けられている。組換え型蛋白質はα
―因子配列の５’側に配置したエタノール誘導性のＡＤ
Ｈ２プロモーターの支配下で産生される。形質転換体の
プラスミッド保持はトリプトファン選択により維持し
た。全てのプラスミッド構築物ＤＮＡの塩基配列は自動
塩基配列決定装置（ＡＢＩ３７７型； ＰＥアプライド
バイオシステムズ社、Ｎｏｒｗａｌｋ、 Ｃｏｎｎ．）
を用いて確認した。

【００３７】次に、酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＶＫ１）を前記のプラスミッド構築物で形質転換し
た。形質転換体のヒスチジン標識蛋白質の分泌を検査し
て、分泌が認められた形質転換体を増殖後に発酵させ
た。

【００３８】発酵上清を微量濾過器に回収し、１０００
分子量排除限界を有するＹＤ１０ラセン中空繊維濾過器
（アミコン社、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）による限
外濾過により３００ｍｌにまで濃縮した。そして２ｘＰ
ＢＳ（ｐＨ７．４）１．５リッターを用いた透析濾過
（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により透析した。

【００３９】透析物をニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ
−ＮＴＡ： ｎｉｃｋｅｌ−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃ
ｅｔｉｃ ａｃｉｄ）アガロースビーズと４℃で攪拌し
ながらインキュベーションした。１晩インキュベーショ
ンを行った後、クロマトグラフ用のカラムに移して、ア
ガロースビーズを２ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）、２ｘＰＢ
Ｓ（ｐＨ６．８）、１ｘＰＢＳ（ｐＨ６．４）で洗浄し
た。蛋白質をアガロースビーズから０．２５Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ４．５）で溶出して、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で目的蛋白質
の分子量および目的蛋白質が含まれる画分を確認した。

【００４０】目的蛋白質を含有する画分を、１６／６０
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム（ファルマシア社、ウ
プサラ、スウェーデン）を用いた分子排除クロマトグラ
フ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ）により精製した。目的蛋白質を含有する
画分を保存し、ＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａ
ｃｉｄ）アッセイ（ピアス社、ロックフォード、Ｉｌ
ｌ．）により蛋白質濃度を決定した。

【００４１】組換え型蛋白質の同一性をＮ端のアミノ酸
配列分析、およびエレクトロスプレーマススペクトル分
析により確認した。

【００４２】マウスおよび免疫 ７週齢のＤＢＡ／２ＮＣｒｊ（ＤＢＡ／２）および異系
交配ｄｄｙ雌マウスは日本ＳＬＣ（東京、日本）から購
入した。伝搬阻止ワクチン抗原Ｐｙｓ２５の粘膜での免
疫原性を評価するために、異系交配ｄｄｙマウスを抗体
導入実験で使用した。蚊の中腸でのオーシスト形成水準
の顕著な上昇が伝搬阻止ワクチン有効性評価に有用であ
ると報告されているので（Ｔｓｕｂｏｉ等、１９９
５）、Ｃ−５欠損ＤＢＡ／２マウスを免疫および蚊生体
食餌実験（ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｌｉｖｅ ｆｅｅｄｓ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）の両実験で使用した。５〜１
０μｇコレラ毒素（シグマケミカル，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ， ＭＯ．）と混合した２５μｇの酵母で合成した組
換え型Ｐｙｓ２５（Ｐｙｓ２５／ＣＴ）により、マウス
を週１回、４週間にわたり経鼻的に免疫した。コントロ
ール群はコレラ毒素（ＣＴ）単独で経鼻的に免疫した。
同様に１群のマウスを同じ投与スケジュールで１０μｇ
コレラ毒素を混合した５０μｇＰｙｓ２５、またはコン
トロール実験としてコレラ毒素単独により経口的に免疫
した。受動免疫の実験では、ＤＢＡ／２雌マウスをＰｙ
ｓ２５／ＣＴまたはＣＴ単独（コントロール）で経鼻的
に免疫したマウス由来のプール免疫血清０．５ｍｌで経
静脈的に受動免疫した。

【００４３】酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ） 平底９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ４；ダイネッ
クステクノロジー，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ， ＶＡ．）を
酵母で合成した組換え型Ｐｙｓ２５蛋白質（重炭酸緩衝
液ｐＨ９．６中で０．５μｇ／ウェル）で４℃、１晩コ
ートした。プレートを１％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ，
Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ．）を含有するＴＢＳ−Ｔ
（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のトリス緩衝塩類溶
液）中で１時間室温にてブロッキングした。マウス血清
のブロッキング緩衝液による連続希釈系列（１００μ
ｌ）を２組の抗原コートしたウェルに添加し、３７℃、
２時間インキュベーションした。これらのプレートを各
マウス抗体アイソタイプおよびサブクラスを認識するア
ルカリフォスファターゼ標識２次抗体（１００μｌ／ウ
ェル）とインキュベーションした。結合した２次抗体を
アルカリフォスファターゼ基質（ｐ−ニトロフェニルフ
ォスフェート， シグマケミカル， Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ， ＭＯ．）１００μｌ／ウェルを添加して染色し
た。バイオラッドマイクロプレートリーダー（バイオラ
ッド， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ．）により４１５ｎ
ｍの波長の吸光度を測定した。抗Ｐｙｓ２５血清抗体の
濃度を、抗原およびアルカリフォスファターゼ標識した
抗マウス免疫グロブリン抗体をコートしたプレートでの
間接的ＥＬＩＳＡで種々のマウス免疫グロブリン濃度を
測定し作成した標準曲線に基づき決定した。抗体濃度ま
たは吸光度値の統計学的な有意差をシェッフェのＦ検定
（Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ Ｆ−ｔｅｓｔ）により検定し
た。

【００４４】原虫の実験感染、蚊の食餌法、および伝搬
阻止アッセイ 最終免疫の約１週間後、致死系統Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｙｏｅｌｉｉ １７Ｘに感染した末梢赤血球１０^６細
胞でマウスを腹腔内感染させた。感染３日後に原虫血症
および血中生殖母体の水準を、ギムザ染色した血液塗抹
標本の顕微鏡検査により検定した。約１００個体の雌の
蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）を１晩
飢餓状態にして、免疫マウス各群からのマウス血液餌
（ｂｌｏｏｄ ｍｅａｌ）を摂食させた。摂食しなかっ
た蚊を除き、充血蚊を１．５％フルクトースおよび１．
５％スクロース含有水を与え２４℃で１週間飼育した。
各々の実験群で蚊を解剖し、中腸をオーシスト形成数の
計数のため光学顕微鏡下で調べた。オーシスト数の統計
学的な有意差をシェッフェのＦ検定により検定した。

【００４５】受動免疫実験での血清の調製 血液（Ｐｙｓ２５／ＣＴまたはＣＴ単独で経鼻的に免疫
したマウスからエーテル麻酔下で心臓穿刺によって採血
した）を１時間室温にて凝固させ、４℃で１晩インキュ
ベーションした。血餅を遠心分離で除き、血清を受動免
疫実験のためにプールした。

【００４６】原虫実験感染、蚊の食餌法、および受動的
伝搬阻止アッセイ マウスを上記のようにＰ． ｙｏｅｌｉｉで感染させ、
原虫血症の水準が９〜１０％に達するまで３日間飼育し
た。約１００個体の蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓｓｔｅｐｈ
ｅｎｓｉ）に血液餌を免疫血清の受動的移植の前または
５分後に摂食させた。充血蚊を分離し、上記のようにオ
ーシスト形成を調べるために適切な時間飼育した。オー
シスト数の統計学的な有意差をシェッフェのＦ検定によ
り検定した。

【００４７】＜結果＞組換え型Ｐｙｓ２５の粘膜免疫原性 週１回の２５μｇＰｙｓ２５蛋白質（酵母で合成）およ
び５−１０μｇコレラ毒素の投与で４週間にわたり経鼻
免疫したＤＢＡ／２マウスでの血清抗体応答を調べた。
Ｐｙｓ２５特異的血清抗体（全血清ＩｇＧ抗体レベルお
よびＩｇＭ抗体レベル）を最終免疫の１週間後に間接Ｅ
ＬＩＳＡ法により測定した（図５および図６ａ）。図６
ａにおいて、抗Ｐｙｓ２５特異的抗体のレベルは、各群
３〜４個体のマウスから採取したプール免疫血清におけ
る全ＩｇＧおよびＩｇＭ（主にＩｇＧ）の平均濃度±標
準偏差（μｇ／ｍｌ）で表した。統計学的な有意差はＰ
ｙｓ２５／ＣＴおよびＣＴ免疫群の間で認められた（Ｐ
＜０．０００１）。

【００４８】我々は顕著なレベルの特異的な血清ＩｇＧ
抗体およびＩｇＭ抗体（主にＩｇＧ）をＣＴ存在下、Ｐ
ｙｓ２５で経鼻免疫されたマウスで見出した（１４１４
６．７μｇ／ｍｌ 平均±４２４１．０５標準偏差）。
血清の抗体反応は初回免疫刺激の約４週間後に検出され
た（データ示さず）。ＣＴ非存在下での経鼻免疫はＰｙ
ｓ２５に対する特異的抗体を検出し得る水準にまで誘導
できなかった。５０μｇＰｙｓ２５での経口投与による
免疫（経鼻免疫に使用される量の２倍量）は、ＣＴの存
在下でさえ、抗Ｐｙｓ２５抗体を検出し得る水準にまで
誘導できなかった。経鼻Ｐｙｓ２５／ＣＴ免疫により誘
導された血清ＩｇＧのサブクラスの構成は主にＩｇＧ１
で構成され、低水準ではあるが顕著量のＩｇＧ２ａ抗体
を伴っていた（図６ｂ）。この図においては、血清Ｉｇ
Ｇ１およびＩｇＧ２ａサブクラスを測定した結果を、希
釈率１２８，０００でのＯ．Ｄ．４１５±標準偏差とし
て表した。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａの比は約２０（１．４
５５±０．１７８／０．０７５±０．０１９）であっ
た。

【００４９】低水準ではあるが、検出し得る水準の抗Ｐ
ｙｓ２５血清ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体がＰｙｓ２５／Ｃ
Ｔ経鼻免疫したマウス群でのみ誘導された。しかしなが
ら、ＩｇＡおよびＩｇＥアイソタイプの抗体の水準は、
ＣＴ免疫のコントロール群と比較して顕著な水準に達さ
なかった（ＩｇＡ：Ｐ＝０．０９；ＩｇＥ：Ｐ＝０．２
０）（図６ｃ）。この図においては、血清ＩｇＡおよび
ＩｇＥのレベルを測定し、希釈率１２８，０００での平
均Ｏ．Ｄ．４１５±標準偏差として表した。両方のアイ
ソタイプで抗体レベルは、ＣＴ免疫したコンロトール群
と対比して有意なレベルに達さなかった（ＩｇＡ：Ｐ＝
０．０９^＊；ＩｇＥ：Ｐ＝０．２０^＊＊）。

【００５０】高いＩｇＧ力価のマウスは高いＩｇＡおよ
び低いＩｇＥ力価を有し、そして低いＩｇＧ力価のマウ
スは低いＩｇＡおよび高いＩｇＥ力価を示す傾向にあっ
た（データ示さず）。同様な血清の抗体応答は異系交配
マウス系統（ｄｄｙ）が粘膜免疫実験に使用された際に
も観察された（データ示さず）。

【００５１】経鼻免疫の伝搬阻止の有効性 経鼻Ｐｙｓ２５／ＣＴ免疫の伝搬阻止効果を評価するた
めに、蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）
にＰ． ｙｏｅｌｉｉ １７Ｘの致死性系統を感染させ
た免疫ＤＢＡ／２マウスの血液餌を摂食させた。ＣＴ免
疫コントロールマウスの血液餌を摂食した蚊の中腸にお
いて顕著に多数のオーシストを観察したが（３０８．９
平均±１３０．２標準偏差）、Ｐｙｓ２５／ＣＴ免疫マ
ウスの血液餌を摂食した充血蚊の中腸では全く観察され
なかった（Ｐ＜０．０００１）(図５および図７)。図７
において、オーシスト感染度は中腸毎の平均オーシスト
数±標準偏差で表され、オーシスト感染度での統計学的
な有意差がＰｙｓ２５／ＣＴ免疫（０）およびＣＴ免疫
群（３０８．９±１３０．２）の間で観察された（Ｐ＜
０．０００１）。

【００５２】Ｐｙｓ２５／ＣＴで免疫したマウス由来の
免疫血清の伝搬阻止効果を評価するために、免疫血清の
受動的移植処理前後のＰ． ｙｏｅｌｉｉ １７Ｘに感
染したマウスの血液餌を蚊（Ａｎ． ｓｔｅｐｈｅｎｓ
ｉ）に摂食させた。免疫血清の受動的移植前の血液餌を
蚊に摂食させた際に、Ｐｙｓ２５／ＣＴ免疫マウスおよ
びＣＴ免疫マウスの両方で、顕著に多数のオーシストが
蚊の中腸で観察された（Ｐｙｓ２５／ＣＴ：３３７．５
平均±７５．１４標準偏差；ＣＴ：３３５．７平均±７
４．９標準偏差）（図８）。この図においては、オーシ
スト感染度は中腸毎の平均オーシスト数±標準偏差で表
され、統計学的な有意差がＰｙｓ２５／ＣＴおよびＣＴ
免疫群のマウスの両方において受動的移植を行った前
（ＢＦ）後（ＡＦ）で観察された（Ｐｙｓ２５／ＣＴ：
３３７．５±７５．１４に対して０、Ｐ＜０．０００１
^＊１；ＣＴ：３３５．７±７４．９に対して１０３．８
５±５４．９９、Ｐ＜０．０００１^＊２）。移植後処理
のＰｙｓ２５／ＣＴおよびＣＴ免疫群の間においても統
計学的な有意差が認められた（Ｐ＜０．０００
１^＊＊）。

【００５３】この結果と対比して、受動的移植後に血液
餌を与えた場合にはＰｙｓ２５／ＣＴ免疫群においてオ
ーシスト感染は観察されなかった（Ｐ＜０．０００
１）。我々はまた、免疫血清の受動的移植の前後でＣＴ
免疫群におけるオーシスト感染度の顕著な減少化を認め
た（３３５．７平均±７４．９標準偏差に対して１０
３．８５平均±５４．９９標準偏差、Ｐ＜０．０００
１）。

【００５４】＜考察＞伝搬阻止免疫の誘発に対するマラ
リア原虫ＯＳＰに準拠した粘膜ワクチンの可能性を調査
するために、我々は伝搬阻止実験に酵母で合成したＰｙ
ｓ２５を使用した。我々は初めて伝搬阻止ワクチン抗原
の粘膜投与が、ほぼ１５ｍｇ／ｍｌの濃度に達する抗原
特異的血清ＩｇＧおよびＩｇＭ産生により特徴づけられ
る強い免疫反応性を誘発することを示した。経鼻的免疫
によって達成されるこの強い免疫反応はワクチン接種マ
ウスに完全な伝搬阻止免疫能を与えた。この事実は全て
の充血蚊でオーシスト感染の完全阻止を呈したことから
明白である。

【００５５】さらに、我々は粘膜ワクチン接種に基づく
完全な伝搬阻止効果を能動免疫実験のみならず受動免疫
実験においても観察した（図７、８）。オーシスト感染
の罹患率はコントロール血清（ＣＴ単独による受動免
疫）に対して１００％のままであったが（表１）、我々
は受動免疫の前（３３５．７平均±７４．９標準偏差）
後（１０３．８５平均±５４．９９標準偏差）でオーシ
スト感染度の顕著な減少を見出した（Ｐ＜０．０００
１）（図８）。コントロール血清によるオーシスト感染
度の減少は、以前Ｃａｏ等（Ｃａｏ等、１９９８ａ、１
９９８ｂ）によって報告された自然伝搬阻止効果により
説明することができる。受動的伝搬阻止実験に使用した
免疫血清は、原虫感染の約３．５日後のマウスから得ら
れたものであり、自然伝搬阻止効果は感染３日後（感染
５日後にピークがある）に観察されると報告されてい
る。従って、受動ワクチン接種実験に使用した免疫血清
はマラリア原虫感染によって誘導された自然伝搬阻止免
疫を有するものであると考えられた。

【００５６】

【表１】

【００５７】このモデルマウスの実験系では、蚊の中腸
のオーシスト形成数を最大にするために補体系の構成因
子を欠損したＤＢＡ／２系統を使用した（Ｔｓｕｂｏｉ
等、１９９５）。しかしながら、自然界でハマダラカ属
の媒介蚊はマラリア原虫にそう頻繁には感染していない
ことが予想される。従って、もし同水準の免疫反応がワ
クチン接種によってヒトで誘導し得るならば、完全な伝
搬阻止効果が達成されるであろうと期待される。

【００５８】一般的に、肝臓および赤血球の原虫に対す
るマラリアワクチン開発は、主に哺乳類の宿主免疫系に
よる選択圧に起因するマラリアの抗原変異性により困難
とされる。循環型原虫での遺伝子発現とは異なり、ＯＳ
Ｐのような伝搬阻止ワクチンの標的抗原は、分子の抗原
変異性を回避するであろう宿主免疫機構から免疫的に隠
れている。この現象が効果的マラリアワクチンの開発に
要求される決定的な要素である。実際、Ｐ． ｆａｌｃ
ｉｐａｒｕｍおよびＰ． ｖｉｖａｘのＯＳＰが世界の
遠隔地の隔離された地域間においてさえ最小限の抗原変
異性を呈することが示された（Ｔｓｕｂｏｉ、未発表デ
ータ）。

【００５９】また、ワクチン製剤に蚊の体内の発生段階
でのみ発現する抗原を使用しても安全性に関する問題を
提議することにはならないだろう（蚊の中腸で発現する
蛋白質に基づく伝搬阻止ワクチンである場合には）、な
ぜならヒト宿主は蚊の吸血時にそれらの抗原に暴露され
ないからであり、このことは潜在的にアレルギー反応の
ような望まない免疫反応の誘導を回避する。しかしなが
ら、伝搬阻止ワクチン抗原の潜在的な利点は、理想的ワ
クチンにおいて期待される重要な因子の犠牲のもとに成
立する、すなわち（１）感染によるブースター効果、結
果として生じる長期免疫、および（２）ワクチン接種を
うけた個体における直接的な防御効果がないことであ
る。

【００６０】もし注射によるワクチン接種法に匹敵する
伝搬阻止免疫が誘導し得るのであれば、ワクチン抗原の
粘膜投与はもうひとつの戦略と成り得るであろう。病原
性微生物の効果的な排除のために、ＣＤ８^＋の細胞障害
性Ｔ細胞の刺激によって特徴付けられる細胞性免疫反応
の誘導を必要とする感染症とは異なり（Ｓｅｄｅｒおよ
びＨｉｌｌ、２０００；Ｉｎｆａｎｔｅ−Ｄｕａｒｔｅ
およびＫａｍｒａｄｔ、１９９９）、効果的なマラリア
伝搬阻止ワクチンには血清抗体（免疫グロブリンアイソ
タイプの種類にかかわらず）のみが必要とされる。外来
抗原の粘膜投与は液性免疫反応のＴｈ−２サブタイプの
Ｔ細胞を動員する傾向にあり、これは血清ＩｇＧ１およ
び粘膜Ｓ−ＩｇＡの優勢的な発現誘導によって特徴付け
られるものである（ＭｃＮｅｅｌａ等、２０００；Ｙａ
ｍａｍｏｔｏ等、１９９７）。従って、我々が本発明に
おいて示したように、粘膜ワクチンとして製剤化された
伝搬阻止抗原は上記の伝搬阻止ワクチンの短所を克服す
る別の有利な特徴を提供するものであり、ワクチンの有
効性を犠牲としないものである。

【００６１】肝臓および赤血球ワクチン、並びに蚊の中
腸で発現する蛋白質に基づく伝搬阻止ワクチンを含む他
のマラリアワクチン候補抗原と組み合わせた場合に、Ｏ
ＳＰ準拠の伝搬阻止ワクチンがマラリア原虫の異なる発
生段階を標的とした非常に効果的な多価ワクチンを提供
し得る、これは結果的にワクチン接種したヒトの感染防
御に対して寄与し、そしてハマダラカ属の媒介蚊集団に
おけるマラリア感染罹患率の減少に寄与する。

【００６２】経鼻経路による免疫は経口経路に比べて全
身系および粘膜系の免疫反応の誘導に効果的である（Ｒ
ａｓｋ等、２０００）と以前から指摘されていた。これ
は抗原が鼻粘膜に関連するリンパ組織に達するまでに消
化酵素に直接に暴露されないことに主に起因しており、
消化管で部分的または広範囲の抗原分解を生じる経口投
与の場合とは異なるものである。この見解はＣＴの存在
下でさえ検出し得る水準の抗体応答を誘導できなかった
我々の経口免疫試験の結果を説明し得るものである。今
後、血清抗体誘導における伝搬阻止抗原の経口免疫原性
を改善できるかどうかの調査がなされるべきである。

【００６３】本発明において我々はＣＴ（今日知られる
最も強力な粘膜アジュバントのひとつ）をマラリア伝搬
阻止抗原に対する全身系血清免疫反応を誘導する目的で
使用した。しかしながら、ヒトのワクチン製剤でＣＴを
使用することは潜在的な毒性効果のため禁止されてい
る。他の方法として、毒性のない変異ＣＴが共投与する
抗原として粘膜アジュバントに使用できる、或いはＣＴ
のＢサブユニット（ＣＴＢ）が外来抗原に対して様々な
様式で化学的または遺伝学的に結合した粘膜アジュバン
トとして使用できる（Ｙａｍａｍｏｔｏ等、２００１；
Ｉｓａｋａ等、２００１；Ｇｅｏｒｇｅ−Ｃｈａｎｄｙ
等、２００１）。最近、組換え型５量体ＣＴＢ分子の生
物学的活性型が細菌の遺伝子発現系（Ｇｏｔｏ等、２０
００）のみならず、トランスジェニック植物（Ａｒａｋ
ａｗａ等、１９９７）および酵母（Ａｒａｋａｗａ、未
発表データ）の系においても合成されることが報告され
ており、これらの系で発現させた蛋白質を用いたワクチ
ンも使用できる。

【００６４】

【第２系列の実験】三日熱マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍ ｖｉｖａｘ）のＰｖｓ２５とコレラ毒素のマウス
への共経鼻投与は感染ヒト血液から蚊への原虫伝搬を完
全に阻止する血清抗体を誘導する。

【００６５】＜材料および方法＞Ｐｖｓ２５蛋白質の発現および精製 Ｐｖｓ２５遺伝子をコードするＤＮＡはＳａｌｖａｄｏ
ｒ Ｉ株の三日熱マラリア原虫のゲノムＤＮＡを鋳型と
して、以下のプライマーセットを用いて増幅した。

【００６６】Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＴＡＴＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＴＣＡＣＧＧ
ＴＡＴＡＣＡＣＣ−３’（配列番号３） Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＴＡＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴＡＣＡ
ＴＴＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番号４） ＰＣＲの条件は９４℃において２分変性した後、変性条
件を９４℃、アニーリング条件を４２℃、伸長条件を７
２℃にして、それぞれ１分の反応を３サイクル、その後
はアニーリング温度を６２℃にして更に２５サイクルの
反応を行った。

【００６７】前記反応条件によって増幅したＰＣＲ産物
を用いて、既述の「第１系列の実験」の「材料および方
法」に記載した方法と同様にＰｖｓ２５蛋白質の発現お
よび精製を行った。

【００６８】動物および免疫 ７週齢の雌のＣＡＦ１（Ｈ−２^ｄ/ａ）およびＡ／Ｊ
（Ｈ−２^ａ）マウスは日本ＳＬＣ(東京、日本)から購入
し、琉球大学の遺伝子実験センターの動物施設で飼育し
た。マウスを５μｇのコレラ毒素（ＣＴ）(シグマケミ
カル、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．)と混合した２５μｇ
組換え型Ｐｖｓ２５蛋白質（酵母で合成）で経鼻的に免
疫した。ＰＢＳ溶液に溶解した２０μｌワクチン混合液
を軽度の麻酔下で鼻の開口部に投与した。マウスを０、
３、および５週目に合計３回免疫した。ネガティブコン
トロールとして、５μｇＣＴ単独またはＰＢＳ溶液を同
様なスケジュールで３回経鼻経路でマウスに投与した。
３回目の免疫処理の１週後にマウス殺生し、血液を麻酔
下で心臓穿刺して採取した。採取した血液を室温で１時
間凝固させ、４℃で一晩インキュベーションした。免疫
血清を遠心分離で集め、そして伝搬阻止アッセイをタイ
国の村で実施するまで−８０℃で保存した。本発明で実
施した動物試験は、琉球大学の動物の保護及び使用に関
する委員会で承認されたガイドライン及びプロトコルに
従って実施した。

【００６９】酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ） 平底９６−ウェルマイクロタイタープレート(Ｉｍｍｕ
ｌｏｎ ４；ダイネックステクノロジー、Ｃｈａｎｔｉ
ｌｌｙ、ＶＡ．)を組換え型Ｐｖｓ２５蛋白質（酵母で
合成したもの、重炭酸緩衝液ｐＨ９．６中で０．５μg
／ウェル）で４℃、１晩コーティングした。プレートを
ＰＢＳに溶解した１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）(シ
グマケミカル、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．)で３７℃、
２時間ブロッキングした。０．５％ＢＳＡ（ＰＢＳに溶
解）により作成したマウス血清の段階希釈系列（１００
μｌ）を２組の抗原コートしたウェルに添加し、３７
℃、２時間インキュベーションした。プレートをアルカ
リホスファターゼ標識した抗マウスＩｇＧ（シグマ）
（１００μｌ／ウェル）でインキュベーションした。結
合した二次抗体をアルカリホスファターゼ基質（ｐ−ニ
トロフェニルフォスフェート、シグマケミカル、Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．）を１００μｌ／ウェルを添加して
染色した。４１５ｎｍの波長の吸光度をマイクロプレー
トリーダー（バイオラッド， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ
Ａ．）で測定した。抗Ｐｖｓ２５血清抗体力価を４１５
ｎｍで０．１吸光度を与える最大血清希釈率として決定
した。吸光度値の統計学的な有意差をシェッフェのＦ検
定（Ｓｃｈｅｆｆｅ'ｓ Ｆ−ｔｅｓｔ）により検定し
た。

【００７０】伝搬阻止アッセイ 末梢血液サンプルをタイ国の１１〜１３人の三日熱マラ
リア感染患者から採取した。感染をギムザ染色した血液
塗抹標本により確認した。凝固防止の目的でヘパリンコ
ーティングした注射器で血液を採取し、そしてマウス免
疫血清の等量と混合した。混合液を直ちに３７℃に保た
れた膜状給餌装置（ｍｅｍｂｒａｎｅｆｅｅｄｉｎｇ
ａｐｐａｒａｔｕｓ）にセットして、ケージ内の蚊（Ａ
ｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）に約１０分
間、随意に吸血させる。吸血しなかった蚊を取り除き、
充血蚊を１．５％フルクトースおよび１．５％サッカロ
ース含有水を与えて１週間、２５℃で飼育した。各々の
実験群で蚊を解剖し、オーシスト形成数を計数するため
中腸を光学顕微鏡下で検査した。オーシスト数の統計学
的な有意差をシェッフェのＦ検定により検定した。

【００７１】＜結果＞血清免疫反応の誘導に対する組換え型Ｐｖｓ２５の経鼻
投与。 マウスを麻酔下で５μｇのコレラ毒素と混合した２５μ
ｇ組換え型Ｐｖｓ２５（酵母で合成）で免疫した。コー
ティング抗原として５００ｎｇ／ウェルの組換え型Ｐｖ
ｓ２５蛋白質を使用した間接的ＥＬＩＳＡを実施するた
め、免疫血清を段階希釈した。２５μｇ組換え型Ｐｖｓ
２５（酵母で合成したもの、５μｇのＣＴを共投与す
る）によるマウスの経鼻免疫は、ＰＢＳ（ｐ＜０．００
０１）または５μｇＣＴ（ｐ＜０．０００１）を経鼻投
与したコントロール・マウスと比較して、ＣＡＦ１およ
びＡ／Ｊマウス両系統において、血清ＩｇＧの顕著量を
誘導した（図９ａ）。この図において、全血清ＩｇＧ抗
体力価は４１５ｎｍで０．１の吸光度を与える最大血清
希釈率の逆数として算出した。エラーバーは各々の免疫
群に対して６〜７匹のマウスから得られた平均値の標準
誤差（ＳＥＭ）を示す。免疫前マウスの血清はＰｖｓ２
５蛋白質を認識しなかった（データ示さず）。

【００７２】ＣＡＦ１血清と比べＩｇＧ力価の軽微な上
昇がＡ／Ｊマウス血清で観察されたが、この差は統計的
有意差レベル以下であった（６８，６６６．７±７，５
７５．９ ＳＥＭに対して５７，９１６．７±１１，５
５１．６ ＳＥＭ、ｐ＝０．８６９５）。誘導された血
清ＩｇＧは主にＩｇＧ１サブクラスであり、低いＩｇＧ
２ａ及びＩｇＧ２ｂ抗体も誘導された（図９ｂ）。この
図において、血清ＩｇＧの各々のサブタイプはＩｇＧサ
ブタイプの２種のマウス免疫グロブリンγＦｃ領域を認
識するアルカリホスファターゼ標識抗体を使用して決定
した。

【００７３】Ｐｖｓ２５（ＣＴ共投与での）による経鼻
免疫は、マウス両系統（ＣＡＦ１：２１．５、Ａ／Ｊ：
２２．５）で低いが、検出可能なレベルのＰｖｓ２５特
異的血清ＩｇＡ抗体を誘導する、しかしながらＰｖｓ２
５特異的ＩｇＥ抗体力価の増加は、免疫前マウスの血清
と比較してＰｖｓ２５／ＣＴ免疫したマウスで観察され
なかった（図９ｃ）。この図において、血清ＩｇＡおよ
びＩｇＥ抗体はマウス免疫グロブリンのαＦｃおよびε
Ｆｃ領域を認識するアルカリホスファターゼ標識抗体を
使用して決定した。ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体の力価は、
４１５ｎｍで０．１の吸光度を与えるプール免疫血清の
最大希釈率の逆数として算出した。結果は２回の独立し
た測定の平均値として表される。伝搬阻止抗原を経鼻投
与で粘膜アジュバントＣＴと共投与した場合のみ、これ
らの血清抗体の顕著な上昇が検出された（データ示さ
ず）。

【００７４】患者血液から蚊へのＰ． ｖｉｖａｘ伝搬
に対するマウス免疫血清の効果。 生殖母体陽性患者の血液から媒体蚊への三日熱マラリア
原虫の伝搬を阻止する抗Ｐｖｓ２５免疫血清の効力評価
のために、４倍希薄したマウス免疫血清プールと患者血
液を混合し、膜状給餌装置で蚊（Ａｎ． ｓｔｅｐｈｅ
ｎｓｉ）に混合液を吸血させた。血液餌吸血の約１週間
後に実験群毎に約２００〜２５０匹の充血蚊を解剖し、
中腸で形成されたオーシスト数を計数した。我々はオー
シスト感染強度水準の顕著な減少を見出しており、それ
はＰＢＳ（ＣＡＦ１: ６．８２８±１．１６４ ＳＥ
Ｍ，ｐ＜０．０００１；Ａ／Ｊ：６．３２６±０．９０
４ＳＥＭ，ｐ＜０．０００１）またはＣＴ（ＣＡＦ１：
１０．０５１±１．３４１ ＳＥＭ，ｐ＜０．０００
１；Ａ／Ｊ：４．９７１±０．６４５ ＳＥＭ，ｐ＝
０．００４）で免疫されたマウス群と比較して、Ｐｖｓ
２５／ＣＴ（ＣＡＦ１：０．０３４±０．０１５ ＳＥ
Ｍ；Ａ／Ｊ：０）で免疫したマウスの免疫血清が与えら
れた蚊で形成されるオーシスト数として定義する、ここ
でオーシスト感染強度水準は、蚊中腸で形成された平均
オーシスト数±標準誤差として表した（図１０ａ）。こ
の図においてはＰＢＳ、ＣＴまたはＰｖｓ２５／ＣＴで
免疫したマウスから得られた免疫血清を４倍希薄したも
のを使用した。ＰＢＳおよびＣＴ免疫群と対比して、オ
ーシスト感染強度水準の顕著な減少がＰｖｓ２５／ＣＴ
群で観察された。

【００７５】我々はまた、ＣＴ免疫したＣＡＦ１および
Ａ／Ｊマウス間（１０．０５１±１．３４１ ＳＥＭに
対して４．９７１±０．６４５ ＳＥＭ，ｐ＝０．００
３２）でオーシスト感染強度水準の顕著な差を観察し
た。抗Ｐｖｓ２５免疫血清で観察された伝搬阻止効果は
ＣＡＦ１およびＡ／Ｊマウス両血清に対する血清希釈率
の増加につれ、形成されるオーシスト数の増加が認めら
れる用量依存的なものであった［ＣＡＦ１（１／４：
０．０３４±０．０１５ ＳＥＭ；１／１６：１．１９
６±０．１９５ ＳＥＭ；１／６４：２．１８２±０．
３６５ ＳＥＭ）；Ａ／Ｊ（１／４：０；１／１６：
０．６３７±０．１０３ ＳＥＭ；１／６４：０．９８
１±０．１５２ ＳＥＭ）］（図１０ｂ）。

【００７６】また、抗Ｐｖｓ２５免疫血清は充血蚊（Ａ
ｎ． ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）の感染罹患率の減少に効果
的であった（図１１ａ）。この図において、ＣＴまたは
ＰＢＳ群と比較して感染罹患率の顕著な減少がＣＡＦ１
およびＡ／Ｊマウス両血清のＰｖｓ２５／ＣＴ処理群で
観察された。

【００７７】オーシスト感染罹患率は、全充血蚊中のオ
ーシスト陽性蚊のパーセンテージとして表される。オー
シスト感染罹患率の顕著な減少は、ＣＴ（ＣＡＦ１：５
５．０９％；Ａ／Ｊ：４８．５４％）およびＰＢＳ（Ｃ
ＡＦ１：５１．５２％；Ａ／Ｊ：４０．７７％）の血清
の場合と比較して、Ｐｖｓ２５／ＣＴ免疫血清（ＣＡＦ
１：２．５５％；Ａ／Ｊ：０％）において、観察され
た。オーシスト感染強度水準（図１０ｂ）の場合のよう
に、血清希釈率の増加につれてＣＡＦ１およびＡ／Ｊ免
疫血清の双方で感染罹患率が増加した［ＣＡＦ１（１／
４：２．５５％；１／１６：２６．９４％；１／６４：
３５．４１％）；Ａ／Ｊ（１／４：０％；１／１６：２
３．７２％；１／６４：２８．０２％）］（図１１
ｂ）。この図において、ＣＡＦ１およびＡ／Ｊ免疫血清
の双方で免疫血清の希釈が感染罹患率の増加を生じるこ
とから、感染強度水準（図１０ｂ）の場合のように、抗
Ｐｖｓ２５免疫血清の伝搬阻止効果は用量依存的なもの
であることが示された。図１１ａおよび図１１ｂにおい
て、オーシスト感染罹患率は充血蚊全体中の感染蚊のパ
ーセンテージとして表し、蚊中腸で形成されたオーシス
トが１つであっても感染陽性として計数した。また、各
々の図のデータ部に示される数値は充血蚊の総数に対す
る感染蚊の数を示している。

【００７８】オーシスト形成抑制に対する免疫血清の効
果は完全伝搬阻止率に基づき評価する、これは全ての充
血蚊でオーシスト形成を生じない血液（実験時に免疫血
清と混合する）を提供した感染患者のパーセンテージと
して定義されるものである。顕著に高率な完全阻止率が
Ｐｖｓ２５／ＣＴ免疫マウス（ＣＡＦ１：７６．９２
％；Ａ／Ｊ：１００％）に由来する免疫血清で観察さ
れ、ＣＴ（ＣＡＦ１：３３．３３％；Ａ／Ｊ：３０．７
７％）またはＰＢＳ（ＣＡＦ１：２５％；Ａ／Ｊ：２
３．０８％）の免疫血清より高率であった（図１２
ａ）。

【００７９】オーシスト感染強度水準および罹患率（図
１０ｂ、１１ｂ）と同様に、免疫血清の希釈は伝搬阻止
能力の低下を生じる（１／１６ Ａ／Ｊ血清より高い阻
止率を示した１／６４ Ａ／Ｊ血清の場合を除く）
［（ＣＡＦ１：１／４：７６．９２％；１／１６：３
８．４６％；１／６４：２７．２７％）；（Ａ／Ｊ：１
／４：１００％；１／１６：３８．４６％；１／６４：
４５．４５％）］（図１２ｂ）。図１２ａおよび図１２
ｂにおいて、完全伝搬阻止率は患者総数において、すべ
ての充血蚊でオーシスト形成を生じなかった血液（免疫
血清と混合される）を提供した三日熱マラリア患者のパ
ーセンテージとして表される。また、各々の図のデータ
部に示される数値は検査した患者総数に対して蚊に与え
た血液がオーシスト形成を生じなかった三日熱マラリア
患者の数である。

【００８０】＜考察＞本発明で我々は、Ｐｖｓ２５蛋白
質（ヒトマラリア原虫Ｐ． ｖｉｖａｘに対する伝搬阻
止ワクチンの候補分子）および強力な粘膜アジュバント
であるコレラ毒素の鼻腔内への共投与が伝搬阻止（Ｔ
Ｂ：ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）免
疫の誘導に非常に効果的なことを初めて証明した。適切
な高次構造をもつ酵母合成Ｐｖｓ２５蛋白質による経鼻
免疫は、生物学的に活性な抗体（Ｐ． ｖｉｖａｘの虫
様体が発現するＰｖｓ２５に相当する分子を特異的に認
識する）を誘導し、感染患者から媒介蚊への原虫伝搬を
完全に阻止した。組換え型Ｐｖｓ２５は、Ｔ−およびＢ
−細胞双方の応答を誘導する数種マウス系統において、
高免疫原性であった（Ｈｉｓａｅｄａ等、２０００）。
本発明で我々は、マウス２系統（ＣＡＦ１およびＡ／
Ｊ）において、組換え型Ｐｖｓ２５の粘膜免疫原性を試
験し、双方で適用し得る水準の強い抗体応答を誘導し
た。加えて、Ｐｖｓ２５（ＣＴとの共投与による）の経
鼻免疫はＴＢ免疫の適用し得る水準を誘導することがで
き、それは非経口免疫法（Ｈｉｓａｅｄａ等、２００
０）よりも低い用量および投与頻度でさえ認められた。

【００８１】ＴＢワクチンに使用される候補分子の主な
利点は（赤血球および肝臓の原虫で発現する他のマラリ
ア抗原に対しての利点）、フィールドで採取された分離
体の分子において認められるような抗原変異性の低さで
ある（Ｈａｆａｌｌａ等、１９９７、Ｋａｓｌｏｗ等、
１９８９）。これらの分子は媒介蚊内の原虫のみで非常
に限定して発現しているので（もしそれほど限定されて
いなくとも）、それらの分子は宿主免疫系から隠れてい
ると思われ、このようにして宿主の免疫的な選択圧から
逃れている。多形レベルは低いとされているものの、マ
ラリア感染症が認められる地域で分離した原虫のＰｖｓ
２５およびＰｖｓ２８分子で多少の多形性が観察されて
いる（Ｔｓｕｂｏｉ等、１９９８）。従って、ＴＢワク
チン抗原に対する抗血清が、フィールドで採取・単離し
た原虫の媒介蚊への伝搬を阻止するかとの疑問に答える
必要がある。タイ国の感染患者でのＴＢ試験によって、
Ｐｖｓ２５に対する抗血清が三日熱マラリア患者から分
離した原虫で発現しているＰｖｓ２５に相当する分子を
認識し得ることが明確に示され、そしてこの研究結果は
ＴＢワクチンが抗原性バリエーションという課題を克服
するだろうとの考えを支持するものである。

【００８２】ＴＢワクチンが低度の抗原性バリエーショ
ンを標的とすることの利点は、このワクチンにおける重
大な欠点と共存する性質のものである。すなわち、それ
らの分子は媒介蚊中の原虫では発現しないので、ＴＢ分
子に対しての感染誘導免疫ブースト効果が期待できない
ことである。加えて、弱毒化ワクチンまたは死細胞ワク
チン（ｋｉｌｌｅｄ ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｖａｃｃ
ｉｎｅ）とは異なり、長期の免疫を組換え型蛋白質ベー
スのワクチンによって、達成するのは困難なことであ
る。この課題を解決するひとつの方法は、簡単に使用で
き、容易に投与可能な形態のワクチン種を開発すること
である。エアロゾル形態のＴＢワクチンが解決策のひと
つであり、この形態により経鼻的に供給できる。一般的
に鼻の内面にある鼻粘膜関連リンパ組織は消化管関連の
リンパ組織よりも免疫反応を効果的に誘導するので有効
な投与経路である。

【００８３】ワクチン抗原の注射接種が細胞性および体
液性双方の強い全身系免疫応答を誘導できるにもかかわ
らず、非経口による免疫刺激では、侵入時に粘膜組織と
接触する病原体に対して、粘膜組織の生体防御の第１障
壁としてのＳ−ＩｇＡによる防御が充分な効力を発揮す
ることができないことは多くの研究者により強調されて
いる。加えて、局所粘膜組織に対する外来抗原の粘膜投
与が距離的に遠位であっても相互に関連する粘膜部位の
免疫反応を誘導できるので、呼吸器上部を介して侵入す
るインフルエンザウイルスのような病原体は、ワクチン
抗原の経鼻投与または経口投与によって効果的に制御さ
れ得る。これらの知見に基づいて、粘膜の病原体に対す
る新規なワクチンの開発は粘膜投与による接種戦略を選
択するようになりつつある。粘膜ワクチンの他の注目す
べき特徴は、主に血清ＩｇＧの産生で特徴づけられる強
い全身の体液性免疫反応を誘導する能力である。粘膜を
介して侵入する病原体に対する粘膜ワクチンの開発には
多くの労力が注がれたにもかかわらず、粘膜組織を介し
て侵入しない伝染性病原体に対する粘膜ワクチンを記載
した報告は少ない。しかし、我々の実験の結果は粘膜ア
ジュバントを適切に使用すれば、粘膜ワクチンによって
粘膜感染しない病原体を制御できる可能性を明確に示唆
するものである。これらの発見は、マラリアのような節
足動物媒介性の病原微生物による多様な感染病に対する
粘膜ワクチンの開発に重要な知見を示し得る。

【００８４】我々はＴＢワクチンの粘膜アジュバントと
してＣＴを使用したが、その毒性のために実用上はヒト
には適用できない。最近、大腸菌から非毒性の変異コレ
ラ毒素および関連する非耐熱性毒素が開発された（Ｈａ
ｇｉｗａｒａ等、 １９９９； Ｏｈｍｕｒａ等、 ２
００１； Ｓａｉｔｏ等、 ２００１； Ｂｏｎｅｎｆ
ａｎｔ等、 ２００１）。また、これら毒素分子に由来
する非毒性のＢサブユニットが化学的または遺伝的に融
合したワクチン抗原のキャリヤとして粘膜免疫系に広く
使用された（Ｙａｍａｍｏｔｏ等、 ２００１； Ｉｓ
ａｋａ等、 ２００１； Ｇｅｏｒｇｅ−Ｃｈａｎｄｙ
等、 ２００１）。更に、最近の報告は組換え型ＣＴＢ
分子の生物学的活性型が細菌（Ｇｏｔｏ等、 ２００
０）、トランスジェニック植物（Ａｒａｋａｗａ等、
１９９７）および酵母（Ａｒａｋａｗａ未発表データ）
の遺伝子発現系で合成できることを示している。これら
の発現系は粘膜ＴＢワクチンの開発の目的で粘膜アジュ
バント分子およびＴＢワクチン抗原による融合蛋白質の
生産に使用できる。

【００８５】病原体に対する粘膜ワクチンの接種方法に
は従来の注射に基づく予防接種方法に勝るいくつかの利
点がある。粘膜ワクチンは、経鼻インフルエンザワクチ
ンで認められたように、粘膜組織を介して侵入する微生
物病原体に特に効果的である可能性がある（Ｈａｇｉｗ
ａｒａ等、 １９９９）。加えて、本発明で示されたよ
うに、粘膜ワクチンで誘導される血清ＩｇＧ誘導を特徴
とする全身系免疫応答は、非経口投与により誘導される
水準に匹敵する抗体の水準にまで達し得る。

【００８６】

【発明の効果】本発明では、粘膜アジュバントおよびマ
ラリア原虫伝搬阻止抗原を含有するワクチンの粘膜投与
により、粘膜を介した全身系の免疫応答を誘導して各種
のマラリア原虫伝搬阻止抗原に対する抗体産生を可能と
した。

【００８７】前記抗体が誘導された血清は、それを吸血
した媒介蚊の中腸内でのオーシスト形成を顕著に阻害す
るので、蚊からヒトへのマラリア伝搬を阻止することが
できる。

【００８８】結果として本発明は易接種型で、かつ安価
な接種法（注射器不要）によるマラリア伝搬を阻止する
ワクチン接種の実施を可能とした。

【００８９】

【参照文献１−１】

【００９０】

【参照文献１−２】

【００９１】

【参照文献１−３】

【００９２】

【参照文献２−１】

【００９３】

【参照文献２−２】

【００９４】

【参照文献２−３】

【００９５】

【参照文献２−４】

【００９６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> The president of Uneversity of Ryukyus <120> Malaria transmission-blocking mucosal vaccine <130> A000104375 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 1 gcgccatggt taaattaaaa tttggtgtt 29 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 2 cgcgagctct taaagttcat ccttttcgga tcctggacta gtaggggtac cgggcccggg 60 tccatttgcc atactaattg cggcaatcgc 90 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 3 tatagcgcta gcgccgtcac ggtatacacc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 4 tacagagggc ccaaggcata catttttctc 30

【図面の簡単な説明】

【図１】マラリア原虫の生活環を示す図。

【図２】マラリア原虫伝搬阻止ワクチンの効果を示す
図。

【図３】伝搬阻止ワクチンの利点および問題点を示す
図。

【図４】伝搬阻止ワクチンの粘膜免疫の効果を示す図。

【図５】マラリア原虫ワクチンの鼻腔内接種による免疫
実験の結果を示す図および顕微鏡写真。

【図６】ＤＢＡ／２マウスでの血清抗体応答を示すグラ
フである。

【図７】蚊（Ａｎ． ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）の中腸で
の、Ｐ． ｙｏｅｌｉｉオーシスト感染におけるＰｙｓ
２５／ＣＴの経鼻免疫の伝搬阻止効果を示すグラフであ
る。

【図８】蚊（Ａｎ． ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）の中腸の
Ｐ． ｙｏｅｌｉｉオーシスト感染における、抗Ｐｙｓ
２５免疫血清の受動的移植の伝搬阻止効果を示すグラフ
である。

【図９】雌のＣＡＦ１およびＡ／Ｊマウスにおける３回
目の経鼻免疫１週後の抗Ｐｖｓ２５蛋白質特異的血清抗
体応答を示すグラフである。

【図１０】蚊（Ａｎ． ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）の中腸の
Ｐ． ｖｉｖａｘオーシスト感染強度におけるＰｖｓ２
５／ＣＴによる経鼻免疫の伝搬阻止効果を示すグラフで
ある。

【図１１】蚊（Ａｎ． ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）のＰ．
ｖｉｖａｘオーシスト感染罹患率におけるＰｖｓ２５／
ＣＴの経鼻免疫の伝搬阻止効果を示すグラフである。

【図１２】蚊（Ａｎ． ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）中腸のオ
ーシスト形成の完全阻止における経鼻免疫の効果を示す
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐藤 良也 沖縄県中頭郡北中城村字安谷屋693−１ (72)発明者 只野 昌之 沖縄県沖縄市高原４−16−30 (72)発明者 松本 安喜 東京都北区王子６−２−７−304 (72)発明者 辻 尚利 茨城県つくば市松代４−415−１ (72)発明者 島袋 勲 沖縄県那覇市壺屋１−21−５ (72)発明者 佐藤 茂俊 沖縄県中頭郡西原町千原１ 琉球大学農学 部内 (72)発明者 長嶺 勝 沖縄県那覇市首里末吉町１−180−９ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 BA31 CA02 DA12 HA17 4C085 AA03 BA31 BB11 CC05 CC07 CC21 CC32 EE06 FF13 FF18 GG10

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 粘膜アジュバントおよびマラリア原虫伝
   搬阻止抗原を含有することを特徴とする粘膜ワクチン。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のワクチンであって、前
   記粘膜アジュバントがコレラトキシンＢ鎖蛋白質（ＣＴ
   Ｂ）またはコレラトキシン蛋白質（ＣＴ）である粘膜ワ
   クチン。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のワクチンであ
   って、前記マラリア原虫伝搬阻止抗原がマラリア原虫虫
   様体の表面抗原である粘膜ワクチン。
4. 【請求項４】 請求項１〜３の何れか１項に記載のワク
   チンであって、前記マラリア原虫伝搬阻止抗原が、Ｐｙ
   ｓ２５蛋白質またはＰｖｓ２５蛋白質である粘膜ワクチ
   ン。
5. 【請求項５】 鼻粘膜に投与するための、請求項１〜４
   の何れか１項に記載のワクチン。
6. 【請求項６】 請求項１〜４に記載のワクチンの粘膜投
   与による、マラリア原虫の伝搬を阻止する方法。
7. 【請求項７】 前記マラリア原虫がネズミマラリア（Ｐ
   ｌａｓｍｏｄｉｕｍｙｏｅｌｉｉ）または三日熱マラリ
   ア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）である、請求
   項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 請求項６または７に記載の方法であっ
   て、前記粘膜投与が鼻粘膜投与である方法。