JP6999904B2 - マラリア伝播阻止型ワクチン - Google Patents
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Description
[1] マラリア原虫のオーシスト期に特異的に発現するマラリア原虫由来の免疫原性タンパク質を含むマラリア伝播阻止型ワクチンであって、
マラリア原虫由来の免疫原性タンパク質が、
(a1)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b1)配列番号1に記載のアミノ酸配列に90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、免疫原性を有するタンパク質、
(a2)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または、
(b2)配列番号2に記載のアミノ酸配列に90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、免疫原性を有するタンパク質
である、前記マラリア伝播阻止型ワクチン。
[2] マラリア原虫のオーシスト期に特異的に発現するマラリア原虫由来の免疫原性タンパク質のペプチド断片であるポリペプチドを含むマラリア伝播阻止型ワクチンであって、該ポリペプチドが、
(a1)配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b1)配列番号3に記載のアミノ酸配列に90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、免疫原性を有するポリペプチド、
(a2)配列番号4、5または6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、
(b2)配列番号4、5または6に記載のアミノ酸配列に90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、免疫原性を有するポリペプチド
である、前記マラリア伝播阻止型ワクチン。
[3] 経口用である、前記[1]または[2]に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
[5] マラリア原虫由来の免疫原性タンパク質またはそのペプチド断片を発現する形質転換体を含有する、前記[1]~[4]のいずれか一項に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
[6] マラリア原虫由来の免疫原性タンパク質またはそのペプチド断片を発現する形質転換体の可食性組織を含有する、前記[1]~[4]のいずれか一項に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
[7] 可食性組織が、生食可能である、前記[6]に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
[8] 形質転換体が、形質転換植物である、前記[5]~[7]のいずれか一項に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
[9] 形質転換植物がイチゴであり、可食性組織がイチゴ果実である、前記[8]に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
[11] 発現するDNAが、
(a1)配列番号7または8に記載の塩基配列からなるDNA、
(b1)(a1)に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、免疫原性を有するタンパク質をコードするDNA、
(a2)配列番号9、10、11または12に記載の塩基配列からなるDNA、または、
(b2)(a2)に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、免疫原性を有するペプチド断片をコードするDNA、
を発現する、前記[10]に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
[13] 導入したDNAが、
(a1)配列番号7または8に記載の塩基配列からなるDNA、
(b1)(a1)に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、免疫原性を有するタンパク質をコードするDNA、
(a2)配列番号9、10、11または12に記載の塩基配列からなるDNA、または、
(b2)(a2)に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、免疫原性を有するペプチド断片をコードするDNA、
を発現可能に導入してなる、前記[12]に記載の形質転換体。
[14] 前記[1]~[11]のいずれか一項に記載のマラリア伝播阻止型ワクチンを家畜または野生動物へ投与することを含む、マラリアの伝播を阻止する方法。
[15] 投与が、経口投与である、前記[14]に記載の方法。
(a1)-(a2)-(a1)-(a2)-・・・-(a1)-(a2)や、
(a1)-(b1)-(c1)-(d1)-・・・-(c1)-(d1)などのように規則的に反復しているものや、例えば、
(a1)-(b2)-(b1)-(b2)-・・・-(a2)-(a2)や、
(a2)-(b1)-(c1)-(b2)-・・・-(d2)-(b2)などのように不規則に反復しているものも包含する。
構成単位を反復して含む場合は、その反復数はとくに限定されない。
また本発明は一態様において、マラリア原虫のオーシスト期に特異的に発現するマラリア原虫由来の免疫原性ポリペプチドを含む、経口用のマラリア伝播阻止型ワクチンであってもよい。
なお、本発明において、「マラリア伝播阻止型ワクチン」は、マラリアが伝播するのを阻止するワクチンであればよい。例えば、マラリア原虫の媒介蚊の体内の発育段階においてマラリア原虫において発現する抗原を含むワクチンであってもよい。
(a1)配列番号7に記載の塩基配列からなるDNA(タンパク質PbCap93をコードするDNA)、または、配列番号8に記載の塩基配列からなるDNA(タンパク質PbCap494をコードするDNA)
(b1)(a1)に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、免疫原性を有するタンパク質をコードするDNA、
(a2)配列番号9に記載の塩基配列からなるDNA(ポリペプチドPbCap93-1をコードするDNA)、配列番号10に記載の塩基配列からなるDNA(ポリペプチドPbCap494-1をコードするDNA)、配列番号11に記載の塩基配列からなるDNA(ポリペプチドPbCap494-2をコードするDNA)、もしくは、配列番号12に記載の塩基配列からなるDNA(ポリペプチドPbCap494-3をコードするDNA)、または、
(b2)(a2)に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、免疫原性を有するペプチド断片をコードするDNA
である。
本発明の形質転換体は、上記の本発明のワクチンに用いることができる形質転換体であり、例えば、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質PbCap93もしくはそのペプチド断片、または、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質PbCap494もしくはそのペプチド断片をコードするDNAを発現可能に導入してなる。
(a1)配列番号7または8に記載の塩基配列からなるDNA、
(b1)(a1)に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、免疫原性を有するタンパク質をコードするDNA、
(a2)配列番号9、10、11または12に記載の塩基配列からなるDNA、または、
(b2)(a2)に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、免疫原性を有するペプチド断片をコードするDNA、
を発現可能に導入してなる。
Plasmo DB(http://plasmodb.org/plasmo/)のIdentify Genes based on P.b. life cycle MassSpec.Evidence(http://plasmodb.org/a/showQuestion.do?questionFullName=GeneQuestions.GenesByProteomicsProfile)を利用してオーシスト期にのみ発現する65遺伝子のうちトランスメンブレン領域を持つ14遺伝子を選択し、そのなかから新規タンパク質であるPBCAP93およびPBCAP494を含む5遺伝子を候補遺伝子とした。表1に記載のペプチドを、マレイミド法を用いてKLHにコンジュゲートし、それぞれ、日本白色種の家兎に免疫した。なお、抗体作製は、eurofins operon社の抗体作製サービスを用いて実施した。
表1に記載の各アミノ酸領域をコードするDNAを12回反復させたコンストラクトをそれぞれ作製し、pCold IIIベクター系(TAKARA)で発現させた。
下記に記載のプライマーを用いて獲得したPCR増幅断片を、それぞれプラスミドベクターを制限酵素(Nde I/Pst I)処理後、プラスミドに導入し、これを用いて発現用大腸菌BL21(Agilent Technoligies Cat.230245)形質転換株を得た。
FW Primer: 5'-GAATTCCATATGATGATTTCCCATAACCACAACGACCAT-3'(配列番号13)
RV Primer: 5'-GAACTGCAGTCAAAGTTCATCCTTATGATGATGGTGGTG-3'(配列番号14)
IPTG発現誘導後の大腸菌(400ml)を集菌し、B/W Bufferを加え、超音破砕にて破砕する。その後、遠心分離(9800×g、10分)をして上清をNi-NTA Agarose (QIAGEN Cat.1018240) 4ml(Bed Volume)に混合し、シェーカーを用いて4℃で一晩吸着させた。一晩吸着をさせた後、遠心分離(2000×g、2分)をして上清は捨て、Ni-NTA AgaroseをB/W Bufferにて遠心洗浄(2000×g、2分×2回)をした。Poly-Prep(登録商標) Cromatography Columns (BIO RAD Cat.731-1550) にNi-NTA Agaroseを充填し、B/W Bufferにて洗浄した(10ml×4回)。付属のElution Buffer1~5を5mlずつ順にPoly-Prep(登録商標) Cromatography Columnsに通し、各フラクションを回収した。
PBSに溶解した精製した発現タンパクを96ウェルプレートに添加し、一晩4℃で固相化した。ブロッキング後、抗PbCap93-1抗体を100μl添加し、4℃で2時間反応させた。PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギIgGを添加し、4℃で2時間反応させ、洗浄、発色後、吸光度を測定することで(a)において作製した抗体の抗体価を確認した。
P. berghei感染吸血後15日目のA. gambiae (Keele strain)の中腸をスライドグラスに塗抹・風乾後、メタノールで固定した。風乾後、Liquid Blocker (Daido Sangyo,Japan)で中腸塗抹部を囲み、Image-iT(商標) FX Signal Enhancer (Invitrogen USA)を1滴垂らし、37度で30分静置した。PBSで洗浄後、1次抗体として抗PbCap93-1および抗PbCap494-1抗体含ウサギ血清を4℃で2時間反応させ、2、3回PBSで洗浄し、2次抗体としてAlexa Fluor 488 抗ウサギIgG(Molecular Probes, USA)(1:800倍希釈)を4℃で1時間反応させ、2、3回PBSで洗浄した。さらに1次抗体として抗PbCap380ウサギ血清(1:1000倍希釈)を4度で1時間反応させ、2、3回PBSで洗浄し、2次抗体としてAlexa Fluor 568 抗ウサギIgG(Molecular Probes, USA)(1:800倍希釈)を4℃で1時間反応させ、2、3回PBSで洗浄した。核の染色にはHoechest 33258 (Polysciences,USA)を最終濃度5μg/mlとなるように2次抗体に添加して用いた。Fluoromount/Plus Sample(Diagnostic Bio System,USA)をスライドグラスに1滴垂らし、カバーガラスを被せて、蛍光顕微鏡下で観察した結果を図2に示す。これらの抗体がオーシストを認識すること、ならびに、PbCap93およびPbCap494がオーシスト壁の外側に局在することが明らかになった。
PbCap494-1~3
Plasmodium berghei(1×106)をBalb/cマウスに尾静脈投与した。使用した蚊(Anopheles stephensi)は血清投与前(Pre)と血清投与後(Post)の2つのBoxに分け、各Boxに蚊100匹(雌雄含む)ずつ準備した。赤血球寄生(パラシテミア)率(感染赤血球/全赤血球)10%前後になったら蚊に10分間吸血感染させた(Pre感染蚊)。その後、PbCap494-1のペプチドの免疫および、PbCap494-2およびp3の2領域を合わせたペプチドの免疫による(抗PbCap494-1抗体、および、抗PbCap494-2,3抗体)抗PbCap494ウサギ抗体をマラリア感染マウスに尾静脈投与した。尾静脈投与から5分後に蚊に10分間吸血感染させる(Post感染蚊)。吸血感染後15日後にPre感染蚊/Post感染蚊それぞれを解剖(30匹以上)し、蚊中腸内に形成されたオーシスト数をカウントし比較した。尾静脈にPbCap494-1抗体を10μg/匹(マウス)、および、200μg/匹(マウス)を投与したものの結果を図2に示す。10μg投与、および、200μg投与ともにオーシスト数が有意に減少し、抗体量が多いほうがよりオーシスト数の減少傾向がみられた。また、抗PbCap494-1抗体および抗PbCap494-2,3抗体を100μgずつ混合して200/匹(マウス)を投与したものの結果を図3に示す。投与群においてオーシスト数が有意に減少した。
Plasmodium berghei(1×107)をBalb/cマウスに腹腔内投与した。使用した蚊(Anopheles stephensi )は血清投与前(Pre)と血清投与後(Post)の2つのBoxに分け、各Boxに蚊100匹(雌雄含む)ずつ準備した。前記マウスの赤血球寄生(パラシテミア)率(感染赤血球/全赤血球)10%前後になったら蚊に10分間吸血感染させた(Pre感染蚊)。その後、抗PbCap93-1ウサギ血清をマラリア感染マウスに尾静脈投与(100μl)した。尾静脈投与から5分後に蚊に10分間吸血感染させる(Post感染蚊)。吸血感染後7日後にPre感染蚊/Post感染蚊それぞれを解剖(30匹以上)し、蚊中腸内に形成されたオーシスト数をカウントし比較した。結果を図4に示す。投与群においてオーシスト数が有意に減少した。
また、コントロール用ウサギ抗体を同じように投与したものの結果を図5に示す。投与によるオーシスト数の減少は見られなかった。
植物発現用のベクターの作製
PbCap93-1に関する植物発現用のコンストラクトを図6に示す。なお、図6中の各略号は、次のとおりであるCaMV P35S 836bp:転写促進因子、Ω:TMVオメガ配列、pRI 201 AN DNA(TAKARA)のAN配列をΩ配列で置換したもの、SP of Tobacco PR1:タバコPR1由来シグナルペプチド配列、Pb ANKA 090520/12rpt:Pbcap93エピトープ配列、T hsp 250bp:シロイヌナズナHSP遺伝子由来ターミネーター配列、His tag:ヒスチジン・タグ、KDEL:小胞体保留シグナル、FW Primer:順方向プライマー、RV Primer:逆方向プライマーである。なお、上記のpRI 201 AN DNAは、国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学より技術および試料の提供を受けて、TAKARAが製品化したものである。
In Fusion HD PCR Cloning Kit(TAKARA)を使用しNde IとSac Iで線状化したベクターに下記プライマーでPCR増幅した遺伝子を導入し、HB101を形質転換して回収した。
FW Primer: ttctacaactacacatATGGGATTCGTGCTTTTCTCTC(配列番号15)
RV Primer: cttcatcttcataagagctcTCAAAGTTCATCCTTATG(配列番号16)
なお、上記プライマーにおいて小文字部分は、ベクター由来の塩基配列である。
アグロバクテリウム法により前記プラスミドを導入した菌株を使用し形質転換を実施した。
下記の遺伝子両端部に設定した特異的FW Primer(順方向プライマー)とRV Primer(逆方向プライマー)を用い、ゲノミックPCRを行った。ゲノムDNAの抽出には核酸抽出キットMagExtractor-Plant Genome-(TOYOBO)を用い、核酸精製システムMagExtractor MFX-6100 (TOYOBO)を使用するプロトコールに準じて行った。PCR産物は、1.5%TBEアガロースゲルを用いた電気泳動により検出した(図7)。
FW Primer: CTCTCACTCTTGCAGGGCTATTTCCCATAACCAC(配列番号17)
RV Primer: cttcatcttcataagagctcTCAAAGTTCATCCTTATG(配列番号18)
なお、上記プライマーにおいて小文字部分は、ベクター由来の塩基配列である。
Balb/cマウスに、10μgのPbCap93をアジュバンド(Titer Max Gold(フナコシ))と混ぜ(抗原:アジュバンド=1:1)、筋肉注射で10μg/100μl/匹で免疫した。これらのマウスに、初回免疫から2、16、20、24日目に経口投与(凍結乾燥した形質転換イチゴの粉末を約0.1~0.15g/1回投与)により、追加免疫を行った。同様に、初回免疫から2日目、28日目に、筋肉注射により、追加免疫を行った。pre、11、15、25、41日目に、マウスの採血し、得られた血清のPbCap93-1に対する抗体価をELISAにより測定した。形質転換イチゴにて追加免疫したマウスにおいて、25日目以降に抗体価の上昇が観察された。結果を図9に示す。
Claims (13)
- マラリア原虫のオーシスト期に特異的に発現するマラリア原虫由来の免疫原性タンパク質のペプチド断片であるポリペプチドを含むマラリア伝播阻止型ワクチンであって、
該ポリペプチドが、
(a1)配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(a2)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および/または、
(a3)配列番号5および6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
である、前記マラリア伝播阻止型ワクチン。 - 経口用である、請求項1に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
- マラリア原虫由来の免疫原性タンパク質のペプチド断片であるポリペプチドを発現する形質転換体を含有する、請求項1または2に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
- マラリア原虫由来の免疫原性タンパク質のペプチド断片であるポリペプチドを発現する形質転換体の可食性組織を含有する、請求項1または2に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
- 可食性組織が、生食可能である、請求項4に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
- 形質転換体が、形質転換植物である、請求項3~5のいずれか一項に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
- 形質転換植物がイチゴであり、可食性組織がイチゴ果実である、請求項6に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。
- 形質転換体が、
配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および/または、
配列番号5および6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするDNAを発現する、請求項3~7のいずれか一項に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。 - 発現するDNAが、
(a1)配列番号9に記載の塩基配列からなるDNA、
(a2)配列番号10に記載の塩基配列からなるDNA、および/または、
(a3)配列番号11および12に記載の塩基配列からなるDNA
を発現する、請求項8に記載のマラリア伝播阻止型ワクチン。 - マラリア原虫由来の免疫原性タンパク質のペプチド断片であるポリペプチドを発現する形質転換体であって、
配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および/または、
配列番号5および6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするDNAを発現可能に導入してなる、前記形質転換体。 - 導入したDNAが、
(a1)配列番号9に記載の塩基配列からなるDNA、
(a2)配列番号10に記載の塩基配列からなるDNA、および/または、
(a3)配列番号11および12に記載の塩基配列からなるDNA
を発現可能に導入してなる、請求項10に記載の形質転換体。 - マラリアの伝播を阻止する方法における使用のための、請求項1~9のいずれか一項に記載のマラリア伝播阻止型ワクチンを含む組成物であって、
前記方法が、前記組成物を家畜または野生動物へ投与することを含む、前記組成物。 - 投与が、経口投与である、請求項12に記載の組成物。
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