CN112135630A - 猪瘟疫苗组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与猪Fc片段融合的猪瘟抗原，并且更具体地，涉及通过使Fc片段与猪瘟抗原结合而具有自身免疫增强作用的疫苗组合物及其制备方法。

Description

猪瘟疫苗组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及用于产生与猪Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白的表达载体、用该表达载体转化的转基因生物、从转基因生物分离的与猪Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白及其用途等。
背景技术
经典猪瘟是由病原体(即经典猪瘟病毒(CSFV))引起的疾病，并且是一种传染病，其可感染猪而不是人或其他动物，但一旦被猪或野猪感染，则具有很高的传染性，没有治疗方法，并且具有很高的致死率，大多数受感染的猪都死了。经典猪瘟被世界动物卫生组织(OIE)列为非常重要的疾病，甚至在韩国，该病也被《预防传染性动物疾病法》列为I类牲畜流行病之一，并且是一种这样的传染病，由于死亡率和发病率很高，因此预防该传染病被认为是在没有消灭经典的猪瘟的情况下，足以保证养猪业的未来的重要问题。在韩国，疫苗接种是使用由作为减毒活病毒的LOM株制备的减毒活疫苗进行的疾病对策，但是专家和养猪户不断提出有关LOM疫苗的致病性和安全性的问题(韩国专利No.10-1642727)。
作为引起人们关注LOM疫苗株安全性的代表性案例，2002年宣布消除了经典猪瘟，并实施了非疫苗接种政策，但2002年和2003年在全国范围内再次出现经典猪瘟，因此LOM疫苗接种于2004年对全国范围内的所有猪重新开始，并且在这种情况下，接种怀孕母猪后发生了许多流产和死产的案例，因此有些案例成为问题。此外，在济州岛上，该岛自1999年以来一直是经典的猪瘟非疫苗接种区，2004年分发了用作饲料添加剂的血粉制剂产品，同时又无意中被经典的猪瘟LOM疫苗株污染，并且在济州岛上300个养殖场中的150个养殖场，非常类似经典的猪瘟的症状在感染了该疫苗株的猪中发生了，甚至在对猪进行尸检期间，也出现了特定于实质器官的病变症状。最近，在2014年，证实猪瘟LOM疫苗株错误地分布在济州岛并接种到怀孕的母猪中，结果发生了流产和死产，并且LOM疫苗株垂直传播给胎儿，因此疫苗安全性的问题再次出现，并且需要一种有效的疫苗来代替LOM疫苗株。因此，对能够有效稳定地预防经典猪瘟的新型疫苗的需求不断增长。
发明内容
【技术问题】
为了解决如上所述的相关技术中的问题而设计了本发明，并且本发明的目的是提供与猪Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白，包含该经典猪瘟抗原E2蛋白的疫苗组合物、其制备方法等。
然而，本发明意图解决的技术问题不限于上述的技术问题，并且本发明相关的技术领域中的普通技术人员根据以下描述将清楚地理解未提及的其他技术问题。
【技术方案】
本发明提供了一种预防经典猪瘟的疫苗组合物，其包括作为活性成分的与由SEQID No.4表示的猪Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白。
在本发明的一个实施方案中，E2蛋白可以包括由SEQ ID No.18表示的氨基酸序列，但不限于此，只要E2蛋白是一种经典的猪瘟抗原即可。
在本发明的另一实施方案中，E2蛋白的特征在于与Fc片段融合以具有自身免疫增强(自佐剂)作用和增加的溶解度。融合可以是抗原通过肽键与Fc片段的N端或C端连接的形式，但不受限于此，只要融合是Fc片段与抗原结合的形式即可。
此外，本发明提供了用于预防经典猪瘟的饲料组合物，其包含作为活性成分的与由SEQ ID No.4表示的猪Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白。
另外，本发明提供了预防或治疗经典猪瘟的方法，该方法包括向个体施用包含作为活性成分的与由SEQ ID No.4表示的猪Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白的组合物。
此外，本发明提供了包含作为活性成分的与由SEQ ID No.4表示的猪Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白的组合物用于预防或治疗经典猪瘟的用途。
此外，本发明提供了包含与由SEQ ID No.4表示的猪Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白的组合物在制备用于预防经典猪瘟的药物中的用途。
另外，本发明提供了用于产生与Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白的重组表达载体，该重组表达载体包括编码由SEQ ID No.4表示的猪Fc片段的多核苷酸和编码经典猪瘟抗原E2蛋白的多核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，重组表达载体可以顺序连接以便在启动子基因、编码E2抗原的多核苷酸和编码Fc片段的多核苷酸的序列中可操作，或以便在启动子基因、编码Fc片段的多核苷酸和编码E2抗原的多核苷酸的序列中可操作。
在本发明的另一个实施方案中，所述启动子是花椰菜花叶病毒衍生的35S启动子、花椰菜花叶病毒衍生的19S RNA启动子、植物的肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、延伸因子-1α(EF-1α)启动子、pEMU启动子、MAS启动子、组蛋白启动子、Clp启动子等等，但不受限于此。
在本发明的另一实施方案中，重组表达载体可以进一步包括编码伴侣结合蛋白(BiP)的多核苷酸，编码His-Asp-Glu-Leu(HDEL)肽的基因，M17的5'非翻译区(5'UTR)位点基因等。
在本发明的另一实施方案中，重组表达载体提高了与Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白的表达水平，并且与Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白具有自身免疫增强(自佐剂)作用和增加的溶解度。
此外，本发明提供了用所述重组表达载体转化的转基因生物。
在本发明的一个实施方案中，转基因生物可以是微生物，例如大肠杆菌，芽孢杆菌，沙门氏菌和酵母，昆虫细胞，包括人细胞在内的动物细胞，动物，例如小鼠，大鼠，狗，猴子，猪，马和牛，根癌土壤杆菌，植物等，该植物可以是粮食作物，包括水稻，小麦，大麦，玉米，大豆，马铃薯，红豆，燕麦和高粱；蔬菜作物，包括芥菜，大白菜，白萝卜，辣椒，草莓，西红柿，西瓜，黄瓜，白菜，东方甜瓜，南瓜，葱，洋葱和胡萝卜；特种作物，包括人参，烟草，棉花，芝麻，甘蔗，甜菜，紫苏，花生和油菜籽；水果，包括苹果，梨，枣，桃子，葡萄，橘子，柿子，李子，杏子和香蕉；开花植物，包括玫瑰，康乃馨，菊花，百合和郁金香等，但不受限于此，只要它可以是可以用本发明的重组表达载体转化的生物即可。
另外，本发明提供了生产具有自身免疫增强作用的与Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白的方法，该方法包括：(a)培养转基因生物；(b)从转基因生物或培养液中分离与Fc片段融合的经典猪瘟E2蛋白，并纯化与Fc片段融合的经典猪瘟E2蛋白。转基因生物优选可以是细胞本身，也可以是包括该细胞的培养产物，并且培养液可以优选是在培养细胞后从中去除细胞的培养液，但不受限于此，只要其包括本发明的重组抗原即可。
【有益效果】
由于根据本发明的与Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白具有自身免疫增强作用，因此即使少量的疫苗组合物也可以显示出有效预防经典猪瘟的效果，而无需使用额外的免疫抗原佐剂，并且，通过增加抗原的溶解度和稳定性来促进抗原的分离和储存。此外，由于使用根据本发明的表达载体可以显著增加E2蛋白的生产量，因此期望能够高效地生产疫苗。
附图说明
图1是说明根据本发明的实施方案的pCAMBIA1300载体图的视图。
图2是说明根据本发明的示例性实施方案的用于表达pFc融合VP1重组蛋白的基因的排列的视图。
图3是说明通过蛋白印迹确认根据本发明的一实施方案的pFc融合VP1重组蛋白的表达水平的结果的视图。
图4是说明通过蛋白印迹确认根据本发明的实施方案的pFc融合VP1重组蛋白的稳定性的结果的视图。
图5是说明通过蛋白印迹确认根据本发明的实施方案的pFc融合VP1重组蛋白的溶解度的结果的视图。
图6是说明通过蛋白印迹确认根据本发明的实施方案的pFc融合GP5重组抗原的溶解度的结果的视图。
图7是说明通过蛋白印迹确认根据本发明的实施方案的pFc融合PCV2重组蛋白的溶解度和生产率的结果的视图。
图8是说明确认根据本发明实施方案的pFc融合E2重组抗原的生产量的结果的视图。
图9是说明一次施用根据本发明实施方案的pFc融合E2重组抗原并确认免疫原性的结果的视图。
图10是说明两次施用根据本发明实施方案的pFc融合E2重组抗原并确认免疫原性的结果的视图。
具体实施方式
在本发明中，当将猪Fc片段结合到经典猪抗原E2上时，证实了通过该片段提高了抗原的表达水平和生产率，并且提高了溶解度和稳定性，并且其目的是提供包括与猪Fc片段融合的抗原E2，编码猪Fc片段的多核苷酸和编码E2的多核苷酸的表达载体，以及使用该表达载体生产重组抗原的方法。
如本文所使用的，“Fc片段”是指当通过木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白时，仅通过S-S键与重链(H链)部分连接并且不具有任何抗原结合位点的部分，并且本发明的Fc片段优选为猪Fc片段，更优选为由SEQ ID No.4表示的猪Fc片段，但不受限于此，只要其是在与靶抗原结合时增加靶抗原的表达水平和溶解度的Fc片段即可。此外，本发明的Fc片段在本发明的范围内包括SEQ ID No.4的变体。具体而言，该基因可以包括与SEQ ID No.4的碱基序列具有90％或更高，更优选为95％或更高，最优选98％或更高的序列同源性的碱基序列。与多核苷酸的“％序列同源性”通过将比较区域与最佳比对序列进行比较来确定，并且比较区域中的多核苷酸序列中的一部分可进一步包括与参考序列(无添加或缺失)相比的添加或缺失(即缺口)，以实现序列的最佳比对。
如本文所使用的，“抗原”通常是指在体内引起免疫应答的所有物质，并且优选是病毒、化学物质、细菌、花粉、癌细胞、虾等，或其部分肽或蛋白，但不受限于此，只要其是可以在体内引起免疫反应的物质即可。
在本说明书中，属于瘟病毒的“经典猪瘟病毒”在E2糖蛋白中具有抗原结合位点，E2糖蛋白是大约12.3至12.5kb大小的包膜相关糖蛋白(E蛋白)的一种，因此经典猪瘟病毒的E2蛋白已知诱导病毒中和抗体应答，并且在经典猪瘟的防御机制中发挥重要的免疫学作用。经典猪瘟病毒的E2蛋白也被称为gp55，并且优选由SEQ ID No.18的氨基酸序列表示。此外，本发明的E2蛋白在本发明的范围内包括SEQ ID No.17的变体，具体而言，该基因可以包括与SEQ ID No.17的碱基序列具有70％或更高，更优选80％或更高，最优选90％或更高的序列同源性的碱基序列。
如本文所使用的，“疫苗”是包含抗原的生物制剂，该抗原在生物体中引起免疫应答，并且是指通过注射或口服给药于人或动物而诱导在生物体中的免疫力以预防感染性疾病的免疫原。动物是人类或非人类动物，并且非人类动物是指猪、牛、马、狗、山羊、绵羊等，但不受限于此。
在本说明书中，“靶蛋白”是指根据本发明通过基因工程方法生产的蛋白，并且优选是商业上使用且需要大量生产的抗原，并且更优选地是，抗原、抗体、抗体片段、结构蛋白、调节蛋白、转录因子、毒素蛋白、激素、激素类似物、细胞因子、酵母、酵母片段、酶抑制剂、转运蛋白、受体、受体片段、生物防御诱导剂、贮藏蛋白、运动蛋白、开发蛋白、报道蛋白等，但不受限于此，只要靶蛋白是可以由本发明的重组表达载体产生的蛋白即可。
如本文所使用的，“重组载体”是指能够表达由插入其中的外源核酸编码的肽或蛋白的载体，优选地是经制备以表达与猪Fc片段融合的靶抗原的载体。“载体”是指用于在体外、离体或体内将碱基引入和/或转移到宿主细胞中的任何介体，并且可以是复制子，另一DNA片段可以与该复制子结合以产生复制的结合片段，并且“复制子”是指在体内起着DNA复制的自主单位的作用的任何基因单位(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒等)，即能够在自己的控制下进行复制的基因单位。本发明的重组表达载体可以优选包括作为RNA聚合酶结合的转录起始因子的启动子、任何调节转录的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、调节转录和翻译的终止的序列、终止子等，更优选地可以进一步包括用于增加蛋白的合成量的M17的5'UTR位点基因、用于将靶蛋白转移至内质网的BiP基因、用于使蛋白的降解最小化以使该蛋白可以稳定地保持在内质网中的HDEL基因等等，甚至更优选地，可以进一步包括用于容易分离重组蛋白的标签基因和用于选择转基因生物的选择标记基因(例如抗生素抗性基因)等。
除了作为本发明的标签蛋白的Fc片段之外，还包括标签基因以易于分离，其代表性示例可以包括Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、IgG-Fc标签、CTB标签、Softag 1标签、Softag 3标签、链霉菌标签、TC标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签等，选择标记基因的代表性示例包括除草剂抗性基因，例如草甘膦或膦丝菌素；抗生素抗性基因，例如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素和氯霉素，aadA基因等，启动子的代表性示例包括pEMU启动子、MAS启动子、组蛋白启动子、Clp启动子、花椰菜花叶病毒衍生的35S启动子、花椰菜花叶病毒衍生的19S RNA启动子、植物的肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、延伸因子-1α(EF-1α)启动子等，终止子的代表性示例包括胭脂碱合酶(NOS)、水稻淀粉酶RAmy1 A终止子、菜豆蛋白的终止子、根癌土壤杆菌的章鱼碱基因的终止子，大肠杆菌的rrnB1/B2的终止子等，但是这些示例仅是示例性的，并且不受限于此。
如本文所使用的，“融合抗原”是指通过将猪Fc片段与靶抗原融合而获得的重组抗原，并且优选地是指优选地通过与Fc片段融合而同时具有提高的溶解度和免疫原性的重组抗原，但是不受限于此，只要它是与本发明的猪Fc片段结合的重组抗原即可。
如本文所使用的，“转化”统指通过注入的DNA改变活生物体的遗传特性的那些过程，“转基因生物体”是通过分子遗传方法经由注入外部基因而制备的生物体，优选为用本发明的重组表达载体转化的生物体，并且生物体不受限于此，只要其是活生物体即可，例如微生物、真核细胞、昆虫、动物和植物等，并且优选是大肠杆菌，沙门氏菌，芽孢杆菌，酵母，动物细胞，小鼠，大鼠，狗，猴子，猪，马，牛，根癌农杆菌，植物等，但不受限于此。可以通过诸如转化、转染、农杆菌介导的转化、粒子枪轰击、超声处理、电穿孔和聚乙二醇(PEG)介导的转化之类的方法来制备转基因生物，但不受限于此，只要其是能够注射本发明的载体的方法即可。
如本文所使用的，“溶解度”是指靶蛋白或肽可以溶解在适合施用于人体的溶剂中的程度。具体地，溶解度可以表示溶质在特定温度下在给定溶剂中的饱和程度。可以通过确定溶质的饱和浓度来测量溶解度，例如，将过量的溶质添加到溶剂中，搅拌并过滤所得混合物，然后可以使用UV分光光度计、HPLC等测量浓度。溶解度的测量方法没有限制，高溶解度在重组蛋白的分离和纯化中是有利的，并且具有优点，因为重组蛋白的聚集被抑制，并且因此重组蛋白的生理活性或药理活性得以维持。
如本文所使用的，“预防”是指通过施用根据本发明的疫苗组合物来抑制经典猪瘟或延迟经典猪瘟发作的所有作用。
如本文所使用的，“治疗”是指通过施用重组蛋白来抑制经典猪瘟，减轻该疾病的严重性，或治愈或治疗疾病的所有作用，在该重组蛋白中，根据本发明的猪Fc片段与靶抗原融合。
如本文所使用的，“个体”是指可以对其施用本发明的疫苗组合物的受试者，并且该受试者不受限制。
本发明的“疫苗组合物”可以根据典型方法通过以诸如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服制剂和无菌注射溶液的形式进行配制而使用。当制备组合物时，可以使用常用的稀释剂或赋形剂(例如填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂)制备该组合物。用于口服制剂的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且固体制剂可以通过将至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等)与卵磷脂类乳化剂混合来制备。另外，除了简单的赋形剂以外，还可以使用硬脂酸镁和滑石粉之类的润滑剂。作为口服的液体制剂，可以使用混悬剂、内用液剂、乳液、糖浆等，并且除了作为简单常用的稀释剂的水和液体石蜡之外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。肠胃外给药的制剂的实例包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳剂和冻干制剂。作为非水溶剂和悬浮液，可以使用丙二醇，聚乙二醇，植物油，诸如橄榄油，可注射酯诸如油酸乙酯等。此外，可以进一步包括常规已知的“免疫抗原佐剂”。佐剂可以不受限制地使用，只要它是本领域已知的即可，但是例如，可以通过进一步包括弗氏完全佐剂或不完全佐剂来增强免疫原性。
本发明的疫苗组合物或药物组合物可以根据典型方法通过以诸如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服制剂，以及外用制剂、栓剂或无菌注射液的形式配制来使用。
根据本发明的疫苗组合物的施用途径包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠管、局部、舌下或直肠途经。口服或肠胃外给药是优选的。如本文所使用的，术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病变内和颅内注射或输注技术。本发明的疫苗组合物也可以栓剂的形式用于直肠给药。
根据个体的年龄、体重、性别、身体状况等来选择根据本发明所述的疫苗组合物或药物组合物的剂量。在没有特殊副作用的情况下诱导个体免疫保护反应所需的量可能会有所不同，具体取决于用作免疫原的重组蛋白和任何赋形剂的存在。通常，每剂量包含0.1至1000μg、优选0.1至100μg的蛋白/毫升本发明的重组蛋白的无菌溶液。在疫苗组合物的情况下，如果需要，可以进行初始剂量，然后进行任选的重复抗原刺激。
如本文所使用的，“免疫抗原佐剂”通常是指增加针对抗原的体液和/或细胞免疫应答的任何材料，并且“自身免疫增强应答”(自我佐剂)是指一种应答，在这种应答中，与现有抗原相比，重组抗原本身增加了针对抗原的体液和/或细胞免疫应答，并且优选是指通过将猪Fc片段与抗原结合而提高了抗原的免疫原性。
本发明的“饲料组合物”是指包含本发明的与Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白的饲料，该饲料的实例包括诸如猪肉、牛肉和鸡肉之类的副产物，以及玉米、大米、通常的稻草、野草、草、青贮饲料、干草、山野草等，但不受限于此，并且可以不受限制地使用，只要其用于饲养牲畜即可。将本发明的E2蛋白添加到饲料中并混合所得混合物的方法的示例包括例如机械混合、吸附和封闭的方法，但不受限于此。
在下文中，将提出用于帮助理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。
[实施例]
实施例1：pFc融合VP1重组蛋白表达载体的制备
为了制备用于生产重组蛋白的表达载体，该重组蛋白通过提高靶蛋白的表达水平并同时提高溶解度而具有增强的分离和纯化效率，使用猪Fc片段(pFc)的pFc1(SEQ IDNo.1)、pFc2(SEQ ID No.3)或pFc3(SEQ ID No.5)构建表达载体。更具体地，如图1和2所示，通过在pCAMBIA1300载体的CaMV 35S启动子基因和NOS终止子之间按这种顺序克隆M17的5'非翻译区(UTR)位点基因(SEQ ID No.7)、编码伴侣结合蛋白(BiP)蛋白的多核苷酸(SEQ IDNo.8)、口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因(SEQ ID No.9)、编码pFc片段的多核苷酸和编码His-Asp-Glu-Leu(HDEL)蛋白的多核苷酸来构建表达载体。通过插入作为pFc片段的pFc1，pFc2或pFc3中的每一个构建不同的表达载体。
实施例2：pFc融合VP1重组蛋白表达实验
2.1.确定pFc融合VP1重组蛋白的表达水平的实验
为了确认以与实施例1中相同的方式构建的pFc融合VP1重组蛋白表达载体的蛋白表达水平，通过将载体引入通过PEG介导的转化方法从拟南芥叶中分离的原生质体中来制备转基因生物。然后通过使用抗猪二抗(1：5,000，Abcam)进行的蛋白印迹确认了BiP:FMDV-VP1:pFc的表达模式，其是通过收集和溶解培养的原生质体而得到的由其表达的重组蛋白。更具体地，将30μL的细胞裂解物与SDS样品缓冲液混合，然后加热。接下来，通过对10％SDS-PAGE凝胶进行电泳，按大小分离蛋白，将分离的蛋白转移至PVDF膜上，然后使用5％脱脂乳进行封闭步骤，接着将抗原与蛋白彼此结合，并通过制造商提供的方法用ECL溶液处理，从而证实了pFc融合重组蛋白。结果在图3中示出。
如图3所示，证实了在各种pFc片段中，与pFc2片段结合的重组蛋白具有最高的表达水平。通过该结果，可以确认相同的免疫球蛋白片段没有显示相同的效果。
2.2.确定pFc融合VP1重组蛋白稳定性的实验
为了证实以与实施例1相同的方式制备的pFc融合重组蛋白表达载体的蛋白稳定性，通过与实施例2.1相同的方式分别在提取重组蛋白时对样品(0)以及在将样品(0)在4℃下保存1小时后对样品(1)进行蛋白印迹来确认蛋白稳定性。结果在图4中示出。
如图4所示，与pFc2片段结合的重组蛋白的表达水平最高，稳定性也高。
2.3.确定pFc2融合VP1重组蛋白溶解度的实验
为了确认以与实施例1相同的方式制备的pFc2融合重组蛋白表达载体的蛋白溶解度，在通过用于将载体转化的根癌农杆菌接种到烟草植物(Nicotiana benthamiana)的叶片的瞬时表达方法来表达pFc2融合重组蛋白(BiP:FMDV-VP1:pFc2)后，从植物叶片中提取蛋白并离心，然后以与实施例2.1相同的方式，使用呈包含在溶液中的可溶性形式(S)的蛋白和在沉淀(P)部分中的蛋白进行蛋白印迹。作为对照，使用了与编码常规已知的纤维素结合模块(CBM3)的多核苷酸(SEQ ID No.13)融合的重组蛋白来代替与pFc片段融合的重组蛋白。结果在图5中示出。
如图5所示，确认在沉淀部分未观察到pFc2融合重组蛋白，而溶液中包含pFc2融合重组蛋白。但是，在重组蛋白与纤维素结合域融合的情况下，在沉淀部分观察到大量的重组蛋白。通过该结果可以确认，通过由靶蛋白与pFc片段的结合引起的结构变形，pFc2融合重组蛋白的溶解度提高，并且由此可以确认pFc2融合重组体蛋白在分离和纯化方面是有利的，并且由于抑制了重组蛋白的聚集，因此对于保持重组蛋白的生理活性或药理活性是有效的。
实施例3：确定pFc2融合GP5重组抗原的溶解度的实验
为了使pFc2片段和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的GP5抗原蛋白融合，表达GP5：pFc2重组抗原的重组载体通过以下方式构建：将编码猪GP5抗原蛋白的多核苷酸(SEQ IDNo.11)插入其中，而不是实施例1的重组载体中包含的口蹄疫病毒的VP1基因。接着，在通过用于将载体转化的根癌农杆菌接种到烟草植物(Nicotiana benthamiana)的叶片的瞬时表达方法来表达pFc2融合GP5重组抗原(GP5:pFc2)后，从植物叶片中提取蛋白并离心，然后以与实施例2.1相同的方式，使用呈包含在溶液中的可溶性形式(S)的蛋白和在沉淀(P)部分中的蛋白进行蛋白印迹。作为对照，使用与CBM3(SEQ ID No.14)融合的GP5重组抗原而不是与pFc片段融合的GP5重组抗原，并且在CBM3融合GP5重组抗原的情况下，使用HA抗体进行了用于蛋白印迹的实验。结果在图6中示出。
如图6所示，在pFc2融合GP5重组抗原中，在沉淀部分观察到少量蛋白，而溶液中主要包含pFc2融合GP5重组抗原。然而，在GP5重组抗原与CBM3融合的情况下，在沉淀部分观察到大量重组蛋白。通过该结果，可以证实pFc2融合重组蛋白具有提高的溶解度，而与蛋白的类型无关。
通过该结果可以确认，通过将猪免疫球蛋白Fc片段，特别是将包含由SEQ ID No.4表示的氨基酸序列的pFc2片段与靶蛋白融合，可以提高靶蛋白的表达水平，并且同时，增加了溶解度，从而可以稳定并且容易地分离和储存靶蛋白。
实施例4：确定pFc2融合PCV2重组蛋白的生产率和溶解度的实验
为了使pFc2片段和猪圆环病毒2型(PCV2)蛋白融合，表达PCV2：pFc2重组蛋白的重组载体通过以下方式构建：将编码猪圆环病毒2型蛋白的多核苷酸(SEQ ID No.15)插入其中，而不是实施例1的重组载体中包含的口蹄疫病毒的VP1基因。接着，在通过用于将载体转化的根癌农杆菌接种到烟草植物(Nicotiana benthamiana)的叶片的瞬时表达方法来表达pFc2融合PCV2重组蛋白后，从植物叶片中提取蛋白并离心，然后以与实施例2.1相同的方式，使用呈包含在溶液中的可溶性形式(S)的蛋白和在沉淀(P)部分中的蛋白进行蛋白印迹。作为对照，使用与His标签融合的PCV2重组蛋白而不是与pFc片段融合的PCV2重组蛋白，并且在His标签融合的PCV2重组蛋白的情况下，使用抗His抗体进行了用于蛋白印迹的实验。结果在图7中示出。
如图7所示，证实在pFc2融合PCV2重组蛋白的情况下，与His标签融合的PCV2重组蛋白相比，不仅大部分重组蛋白被包含在溶液中，而且产量也显著提高。
实施例5：pFc2融合E2重组蛋白表达实验
5.1.pFc2融合抗原蛋白的分离
为了确认pFc2片段是否可以通过与抗原蛋白融合来使用，通过以下方式构建表达BiP：E2：pFc2重组蛋白的重组载体：将编码属于经典猪瘟抗原的E2蛋白的多核苷酸(SEQ IDNo.17)插入其中，而不是实施例1的重组载体中所包括的口蹄疫病毒的VP1基因。接下来，通过以下方式制备转化的植物体：通过农杆菌属介导的转化用制备的重组载体来转化拟南芥，选择对卡那霉素具有抗性的拟南芥，并最终确保同质种子(a homo seed)，其中通过产生促进来使与pFc2融合的E2重组蛋白的表达稳定。然后，从8g的最后使用通常用于蛋白提取的蛋白提取缓冲液固定的转化植物体中分离出蛋白，并使用配备有蛋白A-琼脂糖柱的AKTA prime(GE Healthcare)分离出pFc融合E2重组蛋白。接下来，作为对照，使用与纤维素结合域(SEQ ID No.19)融合的BiP：E2：CBD重组蛋白代替pFc片段。使用无定形纤维素(AMC)从5g转化的植物体内分离出与CBD融合的E2重组蛋白。接下来，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析分离的重组蛋白，然后使用离心滤管浓缩。接下来，为了定量分离的重组蛋白的量，进行SDS-PAGE，然后将分离的重组蛋白用考马斯亮兰染色。在这种情况下，使用牛血清白蛋白(BSA)并使用标准曲线对重组蛋白进行定量。结果在图8中示出。
如图8所示，证实每1g植物体产生约30μg与纤维素结合结构域融合的E2重组抗原，而每1g植物体产生302μg与pFc2片段融合的E2重组抗原。通过该结果，证实了使用pFc2片段可以将靶抗原的表达水平提高10倍或以上。
5.2.确认pFc2融合E2重组抗原的免疫原性和病毒中和能力的实验
为了通过在生物体中诱导抗体来确认pFc融合E2重组抗原是否具有免疫原性和病毒中和能力，使用6周龄的雄性C57BL/6J小鼠进行了实验。更具体地，将1μg的pFc融合E2重组抗原一次(6周龄)或两次(6周龄和8周龄)施用给实验组小鼠，并将磷酸盐缓冲液施用给阴性对照小鼠。另外，作为阳性对照，以与实验组相同的量和时间施用与纤维素结合域融合的E2重组抗原。在每次抗原施用期间，将相同量的弗氏佐剂混合并施用。对于一次性施用组，施用完全佐剂。对于两次性施用组，第一次施用时，施用完全佐剂，然后在第二次施用时，施用不完全的佐剂。同样，在实验开始的时间点，并且从施用抗原后的一周起，通过每周采血，使用用于临床诊断经典猪瘟病毒的抗体试剂盒(CSFV-ab ELISA Kit,MEDIANDIAGNOSTICS)确认了针对所施用抗原的特异性抗体的产生和抗体的持久性。对于两次性施用组，在所有二次施用完成后一周开始采血。每组使用5只小鼠进行实验，结果示于表1和图9和10。当表1中的S/P值为0.14或更大时，该值被确定为正，而当该值小于0.14时，该值被确定为负。
[表格1]
Figure BDA0002657679550000141
如图9所示，确认了施用抗原一次时，从施用后经过一周的时间点起，pFc2融合E2重组抗原表现出高反应性，并且反应性维持了8周以上。相反，证实了与纤维素结合结构域融合的E2重组抗原表现出正值，但是其反应性低于pFc2融合E2重组抗原。
如图10和表1所示，证实了，当施用抗原两次时，即使在与纤维素结合结构域融合的E2重组抗原的情况下，与当施用抗原一次时相比，反应性提高，但反应性仍然比pFc2融合E2重组抗原的低。
此外，要求动植物检疫局确认来自相同小鼠的血清样品的病毒中和能力。结果示于表2。
[表2]
Figure BDA0002657679550000151
如表2所示，已证实与纤维素结合结构域融合的E2重组抗原在施用该抗原一次时在一些小鼠中呈现负值，但是pFc2融合E2重组抗原显示出高滴度的病毒中和能力，而与一次性施用或两次性施用无关。
5.3.确认pFc2融合E2重组抗原的病毒中和能力的实验
为了确认pFc2融合E2重组抗原是否即使在仔猪中也同样显示出高滴度的病毒中和能力，选择了4只经典猪瘟抗体阴性的猪，并且施用pFc2融合E2重组抗原两次，请求动植物检疫机构确认每两周一次获得的血清中的病毒中和能力。结果示于表3。
[表3]
Figure BDA0002657679550000152
Figure BDA0002657679550000161
如表3所示，证实了所有小猪都显示出正值，如使用实施例3.2的小鼠进行的实验中一样。
通过该结果，可以确认，与现有的纤维素融合E2重组抗原相比，在通过融合pFc2片段而制备的重组抗原的情况下，抗原的生产率提高，重组抗原的免疫应答迅速，并且反应性显著提高。通过该结果，可以证实pFc2片段表现出自身免疫增强(自佐剂)作用，因此通过将pFc2片段与现有抗原融合而显示出自佐剂作用，从而显著提高了靶抗原的免疫原性，并提高了生产率和稳定性。此外，可以证实pFc2融合E2重组抗原可以用作新型经典猪瘟疫苗组合物。
在下文中，将描述本发明的药物组合物和饲料组合物的制备实施例，但是该描述并非旨在限制本发明，而仅旨在详细描述本发明。
制备实施例1.药物组合物的制备
1.1.散剂的制备
pFc2融合E2重组抗原 20mg
牛奶糖 100mg
滑石粉 10mg
通过混合这些成分并用这些成分填充气密包装来制备散剂。
1.2.片剂的制备
pFc2融合E2重组抗原 10mg
玉米淀粉 100mg
牛奶糖 100mg
硬脂酸镁 2mg
将成分混合后，根据典型的片剂制备方法通过将混合物压片来制备片剂。
1.3.胶囊的制备
pFc2融合E2重组抗原 10mg
结晶纤维素 3mg
乳糖 14.8mg
硬脂酸镁 0.2mg
通过根据典型的胶囊制备方法混合各成分并用该混合物填充明胶胶囊来制备胶囊。
1.4.注射剂的制备
pFc2融合E2重组抗原 10mg
甘露醇 180mg
注射用无菌蒸馏水 2974mg
Na2HPO42H2O 26mg
根据制备注射剂的典型方法，以每1安瓿瓶(2ml)中这些成分的含量制备注射剂。
1.5.液剂的制备
pFc2融合E2重组抗原 20mg
异构糖 10g
甘露醇 5g
纯净水 适量
根据制备液剂的典型方法，将每种成分加入纯净水中并溶解，加入适量的柠檬香精，然后将这些成分混合，然后向其中加入纯净水并调节总混合物至100mL，然后通过用混合物填充棕色瓶并对该棕色瓶灭菌来制备液剂。
制备实施例2.饲料组合物的制备
pFc2融合E2重组抗原 100mg
维生素E 0.7mg
左旋肉碱 0.7mg
根据制备饲料的典型方法，通过混合这些成分来制备饲料。
出于说明性目的提供了本发明的上述描述，并且本发明所属领域的技术人员应理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应该理解，上述实施例在所有方面仅是示例性的，而不是限制性的。
【工业适用性】
由于与本发明的猪Fc片段融合的经典猪瘟E2蛋白可表现出自身免疫增强作用，抗原的溶解度和稳定性得以增强，从而提高了疫苗的稳定性，并且使用根据本发明的表达载体可显著提高经典猪瘟E2蛋白的产量，因此经典猪瘟E2蛋白有望有效地用于生产经典猪瘟疫苗。
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caaaagtcca taagtaagac gcaaggaaag 690
<210> 2
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pFc1的氨基酸序列(Amino acid sequence of pFc1)
<400> 2
Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys Glu Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys
85 90 95
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val
130 135 140
Thr Val Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile His Val
145 150 155 160
Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Glu Thr Phe Glu Cys
195 200 205
Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
210 215 220
Ser Lys Thr Gln Gly Lys
225 230
<210> 3
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pFc2的DNA序列(DNA sequence of pFc2)
<400> 3
gttggaagac catgccctat atgtcctgct tgtgaaggtc caggtccctc tgcttttata 60
ttcccaccaa agccgaagga taccttgatg atttcacgta caccacaagt tacttgtgtt 120
gttgtggatg tttcacaaga aaatcctgag gtacaattca gctggtatgt tgatggggta 180
gaagtgcaca ctgcacagac tcgaccaaag gaggcccagt ttaactcgac ttatagagtt 240
gtttctgttc tcccaatcca acacgaagat tggctgaagg gcaaggaatt tgaatgcaag 300
gttaacaata aagatctacc agcaccaatt accaggatta tttctaaggc aaaaggaccc 360
tccagagagc cccaagttta cacattgtct ccttctgctg aggagcttag tagaagtaaa 420
gtgagcatta cctgcttagt gacgggattc taccctccag acatcgacgt cgaatggaaa 480
tctaatggtc aacctgagcc agaaggtaac tataggacta ctccaccaca acaggacgtc 540
gatggcacat actttcttta ttcaaaactt gctgtcgata aggcaagttg gcaaagagga 600
gatccatttc agtgtgctgt aatgcatgag gctttgcata atcattatac acagaaatca 660
gtttctaaaa cacaagggaa a 681
<210> 4
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pFc2的氨基酸序列(Amino acid sequence of pFc2)
<400> 4
Val Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Gly Pro Gly Pro
1 5 10 15
Ser Ala Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn
35 40 45
Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr
50 55 60
Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Glu Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu
85 90 95
Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg
100 105 110
Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Pro Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Ser Pro Ser Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr
130 135 140
Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Lys
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val
180 185 190
Asp Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Pro Phe Gln Cys Ala Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Val Ser Lys Thr
210 215 220
Gln Gly Lys
225
<210> 5
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pFc3的DNA序列(DNA sequence of pFc3)
<400> 5
attgagccac cgacacctat ttgtcctgaa atatgctctt gccctgcggc cgaagtttta 60
ggagcaccgt cggtctttct gtttccacct aaacctaagg acattttaat gatctctagg 120
acgcccaagg taacttgtgt tgttgttgat gtttctcaag aagaagctga ggttcaattc 180
tcctggtatg tagacggcgt tcaattgtac accgcacaga ctaggcctat ggaagaacag 240
tttaactcaa catacagagt agtgtccgtg ttgccgatcc aacatcaaga ttggttgaaa 300
ggtaaagagt ttaagtgtaa agtgaacaat aaggatctcc tttctcctat taccagaact 360
ataagtaaag ctaccggacc atctcgggtt ccacaggtct acactcttcc accagcttgg 420
gaggagctta gcaagtcaaa ggtaagcatc acttgtctcg taacgggatt ctatccacca 480
gatattgatg tggaatggca gagtaatggt caacaggaac ccgagggtaa ttaccgaaca 540
actcctcctc agcaggatgt tgacggtact tattttcttt attcaaagct agctgttgat 600
aaagtgagat ggcaacgtgg cgatttgttc cagtgcgcag tcatgcatga ggctcttcat 660
aatcactata cacaaaaatc aatttctaag acacaaggga ag 702
<210> 6
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pFc3的氨基酸序列(Amino acid sequence of pFc3)
<400> 6
Ile Glu Pro Pro Thr Pro Ile Cys Pro Glu Ile Cys Ser Cys Pro Ala
1 5 10 15
Ala Glu Val Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Ile Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser Gln Glu Glu Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Gln Leu Tyr Thr Ala Gln Thr Arg Pro Met Glu Glu Gln
65 70 75 80
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp
100 105 110
Leu Leu Ser Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Thr Gly Pro Ser
115 120 125
Arg Val Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ala Trp Glu Glu Leu Ser
130 135 140
Lys Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro
145 150 155 160
Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Gly
165 170 175
Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe
180 185 190
Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Val Arg Trp Gln Arg Gly Asp
195 200 205
Leu Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
210 215 220
Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys
225 230
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M17的5'UTR基因(5'UTR of M17 gene)
<400> 7
ggcgtgtgtg tgtgttaaag a 21
<210> 8
<211> 272
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 伴侣结合蛋白（BiP）的DNA序列(DNA sequence of chapherone bindingprotein(BiP))
<400> 8
atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60
tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120
ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180
ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240
tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272
<210> 9
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMDV-VP1的DNA序列(DNA sequence of FMDV-VP1)
<400> 9
actacaagta ccggcgaatc tgctgatcca gttactgcta cagttgaaaa ttatggtgga 60
gaaacacaag tgcaaagaag acatcataca gatgtttctt ttatcctaga taggtttgtt 120
aaggtcactc ctaaggattc aattaatgtt ttggacctga tgcagactcc cccacataca 180
ttggttggcg ctctacttcg tactgcaact tattatttcg ctgatttaga ggtagccgtt 240
aaacacgaag gtgatttaac atgggttcct aatggagcac ctgaggctgc actcgataat 300
actactaatc caactgctta ccacaaagca ccactcacta gactcgcgct tccttacact 360
gccccgcata gggttcttgc tactgtttat aacgggaact gcaaatacgc aggtggttca 420
ttgcctaatg tacgaggaga tttgcaagta ttggctcaaa aagcagcatg gccattacct 480
acttctttta actatggagc tataaaggct acacgtgtga cggaacttct ttataggatg 540
aagagagctg agacatactg tcctagacca ttactggctg ttcatccatc cgccgcaaga 600
cacaaacaga aaattgtggc tcccgttaag cagagcctt 639
<210> 10
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMDV-VP1的氨基酸序列(Amino acid sequence of FMDV-VP1)
<400> 10
Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val
20 25 30
Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Ser Ile
35 40 45
Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Pro His Thr Leu Val Gly Ala
50 55 60
Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val
65 70 75 80
Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala
85 90 95
Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu
100 105 110
Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr
115 120 125
Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val
130 135 140
Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Trp Pro Leu Pro
145 150 155 160
Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu
165 170 175
Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu
180 185 190
Ala Val His Pro Ser Ala Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro
195 200 205
Val Lys Gln Ser Leu
210
<210> 11
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GP5的DNA序列(DNA sequence for GP5)
<400> 11
aacggcaaca gctcgacata ccaatacata tataacttga cggtatgcga gctgaatggg 60
accgcctggt tgtctaccca cttttcttgg gcagtcgaga ccggaggcgg gggtagcaaa 120
aattgtatgg cttgccgcta cgcccgcacc cggttcacca acttcattgt agacgaccgg 180
gggaggattc atcggtggaa gtccccggtg gtggtggaga aatttggcaa agccgaaatt 240
ggcggcggtc ttgtcaccat caaacatgtc gtcctcgaag gggttaaagc tcaacccttg 300
acgaggactt cggctgagca atgggaagcc 330
<210> 12
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GP5的氨基酸序列(Amino acid sequence for GP5)
<400> 12
Asn Gly Asn Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr Val Cys
1 5 10 15
Glu Leu Asn Gly Thr Ala Trp Leu Ser Thr His Phe Ser Trp Ala Val
20 25 30
Glu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asn Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala
35 40 45
Arg Thr Arg Phe Thr Asn Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Ile His
50 55 60
Arg Trp Lys Ser Pro Val Val Val Glu Lys Phe Gly Lys Ala Glu Ile
65 70 75 80
Gly Gly Gly Leu Val Thr Ile Lys His Val Val Leu Glu Gly Val Lys
85 90 95
Ala Gln Pro Leu Thr Arg Thr Ser Ala Glu Gln Trp Glu Ala
100 105 110
<210> 13
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBM3的DNA序列(DNA sequence for CBM3)
<400> 13
gtatcaggta accttaaggt ggagttttac aactcgaacc cttctgatac aactaactca 60
ataaacccac agttcaaagt tacaaacaca ggcagctctg cgatcgattt gtctaaatta 120
accctcagat actattatac ggttgatgga cagaaggacc agactttctg gtgtgatcat 180
gcagctatca ttggttctaa cggtagctac aacggaatta catcaaacgt gaagggcact 240
ttcgttaaga tgtcctctag cactaacaac gcagacacat atttggagat cagttttacg 300
gggggaaccc ttgaaccagg tgctcacgtc cagattcaag gaagattcgc taaaaacgac 360
tggtcgaact atacccaaag taatgattac agttttaaat ccgcctcaca atttgttgag 420
tgggatcagg tcactgctta cctgaacggg gttctagtgt ggggaaagga acctggt 477
<210> 14
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBM3的氨基酸序列(Amino acid sequence for CBM3)
<400> 14
Val Ser Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser
20 25 30
Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val
35 40 45
Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile
50 55 60
Gly Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr
65 70 75 80
Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu
85 90 95
Ile Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln Ile
100 105 110
Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn
115 120 125
Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln Val
130 135 140
Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro Gly
145 150 155
<210> 15
<211> 579
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCV2的DNA序列(DNA sequence for PCV2)
<400> 15
aaaaatggca ttttcaatac acgcctcagt cgaacttttg gatatactgt caagcgtact 60
acagtcacca cgccatcttg ggctgtggat atgatgagat ttaagttgga tgactttgtt 120
cctcctggag ggggaaccaa caaaatttct ataccgtttg agtactatag aatcagaaaa 180
gttaaggttg agttctggcc gtgttccccc ataactcagg gtgatagggg tgtgggttca 240
actgctgtta ttctagatga taacttcgta cctaaggcca acgcattgac ttatgacccc 300
tatgtaaact actcatctag acatacaatc ccacaacctt tctcctacca ctcgcgttat 360
tttacaccaa agcctgtttt agattctacc attgattatt tccaaccaaa taacaagagg 420
aatcagcttt ggttgagatt acaaacctca cggaacgtgg atcatgtcgg attgggtact 480
gcatttgaaa atagtaagta tgatcaggac tacaatatcc gtgtgacaat gtacgttcaa 540
tttagggaat ttaatcttaa agacccacca cttaatcca 579
<210> 16
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCV2的氨基酸序列(Amino acid sequence for PCV2)
<400> 16
Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met
20 25 30
Arg Phe Lys Leu Asp Asp Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys
35 40 45
Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu
50 55 60
Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser
65 70 75 80
Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Pro Lys Ala Asn Ala Leu
85 90 95
Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln
100 105 110
Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp
115 120 125
Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp
130 135 140
Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr
145 150 155 160
Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr
165 170 175
Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn
180 185 190
Pro
<210> 17
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> E2的DNA序列(DNA sequence of E2)
<400> 17
aacggctagc ctgcaaggaa gattacaggt acgcaatatc atcaaccaat gagatagggc 60
tactcggggc cggaggtctc accaccacct ggaaagaata caaccacgat ttgcaactga 120
atgacgggac cgttaaggcc atttgcgtgg caggttcctt taaagtcaca gcacttaatg 180
tggtcagtag gaggtatttg gcatcattgc ataaggaggc tttacccact tccgtgacat 240
tcgagctcct gttcgacggg accaacccat caactgagga aatgggagat gacttcgggt 300
tcgggctgtg cccgtttgat acgagtcctg ttgtcaaagg aaagtacaat acaaccttgt 360
tgaacggtag tgctttctat cttgtctgtc caatagggtg gacgggtgtt atagagtgca 420
cagcagtgag cccaacaact ctgagaacag aagtggtaaa gaccttcagg agggacaagc 480
cctttccgca cagaatggat tgtgtgacca caacagtgga aaatgaagat ttattctact 540
gtaagttggg gggcaactgg acatgtgtga aaggtgaacc agtggtctac acgggggggc 600
tagtaaaaca atgcagatgg tgtggctttg acttcaatga gcctgacgga ctcccacact 660
accccatagg taagtgcatt ttggcaaatg agacaggtta cagaatagtg gattcaacag 720
actgtaacag agatggtgtt gtaatcagca cagaggggag tcatgagtgc ttgatcggta 780
acacgactgt caaggtgcat gcatcagatg aaagactggg ccccatgcca tgcagaccta 840
aagagatcgt ctctagtgca ggacctgtaa ggaaaacttc ctgtacattc aactacgcaa 900
aaactttgaa gaacaagtac tatgagccca gggacagcta cttccagcaa tatatgctta 960
agggcgagta tcagtactgg tttgacctgg acgtgactga ccgccactca gattacttcg 1020
cagaag 1026
<210> 18
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> E2的氨基酸序列(Amino acid sequence of E2)
<400> 18
Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn
1 5 10 15
Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu
20 25 30
Tyr Asn His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys
35 40 45
Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg
50 55 60
Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Glu Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe
65 70 75 80
Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp
85 90 95
Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys
100 105 110
Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val
115 120 125
Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro
130 135 140
Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Asp Lys Pro
145 150 155 160
Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp
165 170 175
Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu
180 185 190
Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Leu Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly
195 200 205
Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys
210 215 220
Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp
225 230 235 240
Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Ser His Glu Cys
245 250 255
Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu
260 265 270
Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro
275 280 285
Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Ala Lys Thr Leu Lys Asn
290 295 300
Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys
305 310 315 320
Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val Thr Asp Arg His Ser
325 330 335
Asp Tyr Phe Ala Glu
340
<210> 19
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纤维素结合域的DNA序列(DNA sequence of cellulose binding domain)
<400> 19
tttcgaagtt caccagtgcc tgcacctggt gataacacaa gagacgcata ttctatcatt 60
caggccgagg attatgacag cagttatggt cccaaccttc aaatctttag cttaccaggt 120
ggtggcagcg ccattggcta tattgaaaat ggttattcca ctacctataa aaatattgat 180
tttggtgacg gcgcaacgtc cgtaacagca agagtagcta cccagaatgc tactaccatt 240
caggtaagat tgggaagtcc atcgggtaca ttacttggaa caatttacgt ggggtccaca 300
ggaagctttg atacttatag ggatgtatcc gctaccatta gtaatactgc gggtgtaaaa 360
gatattgttc ttgtattctc aggtcctgtt aatgttgact ggtttgtatt ctcaaaatca 420
ggaacttct 429

Claims (16)

1.一种用于预防经典猪瘟的疫苗组合物，其包含作为活性成分的与由SEQ ID No.4表示的猪Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述E2蛋白包含由SEQ ID No.18表示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述E2蛋白与所述Fc片段融合以具有自身免疫增强(自佐剂)作用和增大的溶解度。
4.一种用于预防经典猪瘟的饲料组合物，其包含作为活性成分的与由SEQ ID No.4表示的猪Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白。
5.一种用于产生与Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白的重组载体，该重组载体包含编码由SEQ ID No.4表示的猪Fc片段的多核苷酸和编码经典猪瘟抗原E2蛋白的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其中，所述E2蛋白包含由SEQ ID No.18表示的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的重组载体，其中，所述重组载体包含启动子基因、编码经典猪瘟抗原E2蛋白的多核苷酸和编码猪Fc片段的多核苷酸按顺序连接的基因。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其中，所述启动子是选自花椰菜花叶病毒衍生的35S启动子、花椰菜花叶病毒衍生的19S RNA启动子、植物的肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、pEMU启动子、MAS启动子、组蛋白启动子、Clp启动子和延伸因子-1α(EF-1α)启动子中的任一种或多种。
9.根据权利要求5所述的重组载体，其中，所述重组载体还包含编码伴侣结合蛋白(BiP)的多核苷酸。
10.根据权利要求5所述的重组载体，其中，所述重组载体还包含编码His-Asp-Glu-Leu(HDEL)肽的基因。
11.根据权利要求5所述的重组载体，其中所述重组载体还包含M17的5'非翻译区(UTR)位点基因。
12.根据权利要求5所述的重组载体，其中，所述重组载体提高与所述Fc片段融合的所述经典猪瘟抗原E2蛋白的表达水平。
13.一种用根据权利要求5至12中任一项所述的重组载体转化的转基因生物。
14.一种与Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白的生产方法，该蛋白具有自身免疫增强作用，该方法包括：
(a)培养根据权利要求13所述的转基因生物；以及
(b)从所述转基因生物或培养液中分离与Fc片段融合的经典猪瘟E2蛋白，并纯化与所述Fc片段融合的所述经典猪瘟E2蛋白。
15.一种预防或治疗经典猪瘟的方法，该方法包括向个体施用包含作为活性成分的与由SEQ ID No.4表示的猪Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白的组合物。
16.包含作为活性成分的与由SEQ ID No.4表示的猪Fc片段融合的经典猪瘟抗原E2蛋白的组合物用于预防或治疗经典猪瘟的用途。
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