CN113039275A - 用于在植物中表达病毒样颗粒的重组载体和用于使用该病毒样颗粒制备包含病毒样颗粒的疫苗组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从用叶绿素靶向重组载体转化的植物中分离的PCV2制备疫苗组合物以在植物中表达的技术，并提供了携带编码重组蛋白的多核苷酸的重组载体，其中叶绿素靶向蛋白与PCV2衣壳蛋白彼此融合。另外，提供了用重组载体转化的转基因植物，从该转基因植物中分离和纯化靶蛋白的方法，通过使用该靶蛋白制备包含病毒样颗粒的疫苗组合物的方法，以及通过该制备方法制备的疫苗组合物。

Description

用于在植物中表达病毒样颗粒的重组载体和用于使用该病毒 样颗粒制备包含病毒样颗粒的疫苗组合物的方法
技术领域
本发明涉及一种包含使用植物生产的病毒样颗粒(VLP)的疫苗组合物，并且更具体地，涉及用于通过在植物中使用高效表达载体来提高可用作疫苗组合物的2型猪圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白的生产率，并同时将生产的PCV2衣壳蛋白制成病毒样颗粒来制备病毒样颗粒作为疫苗组合物的方法。
本申请要求分别于2018年11月15日和2019年10月15日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2018-0141184和10-2019-0127987的优先权和权益，在这些申请的说明书和附图中公开的所有内容被并入本申请中。
背景技术
通常，使用转基因植物生产有用的生物活性物质可以从根本上消除各种污染物，例如病毒、癌基因和肠毒素，这些污染物可能是通过从动物细胞和微生物中合成和生产蛋白质的方法生成的，并且当对相应的有用物质的需求迅速增加时，就大规模生产所需的设备技术或成本而言，与现有的动物细胞系统相比，使用转化植物生产有用的生物活性物质的系统绝对具有优势，从而该系统由于具有可在最短时间内以低成本实现大规模生产的优势而广泛用于诸如基础科学研究、疫苗开发和治疗剂开发等各种研究领域。
然而，尽管具有上述优势，与包括动物细胞和微生物的其他宿主相比，相对较低的蛋白质表达水平以及非优化的分离和纯化方法仍是从植物细胞生产蛋白质的主要障碍。因此，已经进行了许多研究，并且尝试通过各种方法来增加来自植物细胞的蛋白质的相对较低的表达和生产率。其示例包括用于有效地将外源基因转移到植物中或提高靶蛋白的表达水平的载体构建技术、用于允许植物合成靶蛋白的转化技术、能够从转化体生产靶蛋白的蛋白分离和纯化技术等。
在此，如上所述，作为有效地将外源基因转移到植物中或提高靶蛋白的表达的载体生产技术的一个示例，韩国登记专利号10-1449155提出了通过在待生产的靶蛋白的上游添加DNA片段作为重组载体，用该重组载体转化的植物可以改善靶蛋白的翻译，通过诱导向植物中特定位置的迁移而允许靶蛋白稳定地积累，并且由于这些原因，具有能够从植物中大量生产靶蛋白的效果。
此外，作为用于增加蛋白质的表达水平的载体生产技术的相关技术的另一个示例，韩国公开专利号10-2018-0084680提出了一种在导致N糖基化的小结构域与靶蛋白融合时允许蛋白质的表达水平增加，由此显著提高转基因植物中靶蛋白生产效率的方法，作为一种在从植物细胞生产靶蛋白时在翻译阶段提高靶蛋白表达水平的方法。
此外，作为能够从转化体生产靶蛋白的蛋白分离和纯化技术的一个示例，韩国登记专利号10-1848082提出了通过使用包含纤维素结合结构域3的重组载体将从转基因植物合成的蛋白结合到纤维素可以分离出包含靶蛋白的融合蛋白，并且通过用肠激酶处理融合蛋白可以有效地分离重组载体，以及靶蛋白和纤维素结合结构域。
此外，作为能够生产靶蛋白的蛋白分离和纯化技术的另一个示例，韩国公开专利号10-2015-0113934提出了，当生物活性蛋白或肽与免疫球蛋白Fc片段结合时，与未结合免疫球蛋白Fc片段的生物活性蛋白或肽相比，具有改善生物活性蛋白或肽的溶解性的效果。
因此，当基于上述常规技术从植物生产有用的生物活性物质时，具有可以替代使用动物细胞和微生物的生产方法(所述方法为现有方法)的效果。首先，可以缩短有用的生物活性物质的生产所需的时间，并且可以显著降低生产成本。其次，有可能从根本上消除引起细胞毒性的污染物，这种污染物可能会在分离和纯化由动物细胞和微生物合成的蛋白质的过程中发生；第三，当商业化时，可以将从植物生产的有用的生物活性物质以种子的形式长时间储存，并且可以减少储存和保存成本。第四，有用的生物活性物质能够以安全种子的形式运输，并且可以迅速提供给在紧急情况下需要它的地区或国家。第五，当对生物活性物质的需求迅速增加时，由于大量生产所需的生产设备和系统构造所需的技术无需许多，因此可以容易地大量生产该物质，并且具有可显著降低安装成本和产品生产成本、能够在最短的时间内进行大量生产以根据需求实现充足的供应的优势。
另外，植物系统具有引起翻译后修饰过程的合成途径(这在哺乳动物中是必不可少的)，从而具有可生产与使用动物细胞生产的蛋白质相似的形式的优势。因此，如上所述使用这种转基因植物来生产作为有用的生物活性物质的蛋白质的方法具有替代使用动物细胞或微生物来生产蛋白质的方法的潜力，因此近来引起了极大的关注。
如上所述，尽管提供了各种有效地合成、分离和纯化有用的生物活性物质(包括医学上适用的蛋白质和疫苗，以及来自植物的工业上有用的酶)的技术，但是每种蛋白质具有不同的固有特性，由于不优选统一应用特定的方法，从而需要进行个别研究。
发明内容
[技术问题]
做出本发明以解决如上所述的相关技术中的问题，并证实了在生产2型猪圆环病毒(PCV2，其在转化的植物中形成作为靶蛋白的病毒样颗粒)时，当RuBisCO转运肽与靶蛋白融合并且多组氨酸附着以进行分离和纯化，以靶向叶绿体，以便在翻译阶段提高蛋白的表达水平时，蛋白的表达水平以及分离和纯化效率得到了提高，并证实了借此可以显著提高转基因植物中靶蛋白的生产效率。
此外，通过各种实验方法证实，当适当地调节如上所述分离和纯化的包括PCV2的溶液的pH时，形成了病毒样颗粒，并且通过证明这种病毒样颗粒可增强中和病毒的中和抗体的形成来完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种用于植物表达的重组载体，其包括编码RuBisCO转运肽的多核苷酸，该多核苷酸包括由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列；以及编码2型猪圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白的多核苷酸，该多核苷酸包括由SEQ ID NO：3或5表示的氨基酸序列。
本发明的另一个目的是提供用本发明的重组载体转化的转基因植物。
此外，本发明的又一个目的是提供一种用于分离和纯化重组PCV2衣壳蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
(S1)使用本发明的重组载体转化植物；
(S2)通过将步骤(S1)中获得的转基因植物与蛋白提取缓冲溶液混合来制备植物混合物溶液；
(S3)通过将步骤(S2)中获得的混合物溶液注入装有琼脂糖的柱中来吸附其中多组氨酸标签与PCV2衣壳蛋白连接的重组蛋白；
(S4)通过向柱内注入洗涤液来洗涤柱；以及
(S5)通过将洗脱溶液注入柱中来洗脱吸附到琼脂糖上的重组蛋白。
另外，本发明的又一个目的是提供一种用于制备包含病毒样颗粒的疫苗组合物的方法，该方法包括以下步骤：
(S1)使用本发明的重组载体转化植物；
(S2)从步骤(S1)中获得的转基因植物中分离并纯化PCV2衣壳蛋白；
(S3)将步骤(S2)中得到的PCV2衣壳蛋白制成病毒样颗粒；以及
(S4)制备包含在步骤(S3)中获得的病毒样颗粒的疫苗组合物。
此外，本发明的又一个目的是提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物通过根据本发明的制备方法制备。
此外，本发明的又一个目的是提供PCV2病毒样颗粒，其包含在通过本发明的制备方法制备的疫苗组合物中。
另外，本发明的又一个目的是提供一种用于通过将根据本发明的制备方法制备的疫苗组合物施用于个体来预防猪圆环病毒感染的方法。
本发明的又一个目的是提供通过根据本发明的制备方法制备的疫苗组合物在预防猪圆环病毒感染中的用途。
本发明的又一个目的是提供通过根据本发明的制备方法制备的组合物在生产用于预防猪圆环病毒感染的疫苗中的用途。
然而，本发明意图解决的技术问题不限于上文提及的技术问题，并且本发明所属的本领域的普通技术人员根据以下描述将清楚地理解未提及的其他技术问题。
[技术方案]
为了实现如上所述的本发明的目的，本发明提供了一种用于植物表达的重组载体，该重组载体包括编码RuBisCO转运肽的多核苷酸，该多核苷酸包括由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列；以及编码2型猪圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白的多核苷酸，该多核苷酸包括由SEQ ID NO：3或5表示的氨基酸序列。
作为本发明的示例性实施方案，编码RuBisCO转运肽的多核苷酸可包括由SEQ IDNO：2表示的碱基序列。此外，编码PCV2衣壳蛋白的多核苷酸可包括由SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6表示的碱基序列。
作为本发明的另一个示例性实施方案，重组载体还可包括编码多组氨酸标签的多核苷酸，该多核苷酸包括由SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列。
作为本发明的又一个示例性实施方案，在重组载体中，编码RuBisCO转运肽的多核苷酸、编码多组氨酸标签的多核苷酸和编码PCV2衣壳蛋白的多核苷酸顺序地连接在启动子和终止子之间，但是连接顺序不限于此。
本发明还提供了用本发明的重组载体转化的转基因植物。
此外，本发明提供了一种用于分离和纯化重组PCV2衣壳蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
(S1)使用本发明的重组载体转化植物；
(S2)通过将步骤(S1)中获得的转基因植物与蛋白提取缓冲溶液混合来制备植物混合物溶液；
(S3)通过将步骤(S2)中获得的混合物溶液注入装有琼脂糖的柱中来吸附其中多组氨酸标签与PCV2衣壳蛋白连接的重组蛋白；
(S4)通过向柱内注入洗涤液来洗涤柱；以及
(S5)通过将洗脱溶液注入柱中来洗脱吸附到琼脂糖上的重组蛋白。
作为本发明的示例性实施方案，蛋白提取缓冲溶液可包含10至100mM Tris、100至300mM氯化钠(NaCl)、0.01至0.5％Triton X-100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚和5至300mM咪唑。
作为本发明的另一个示例性实施方案，琼脂糖可以是镍-三硝基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖。
本发明的又一个示例性实施方案，步骤(S1)可以使用导入了重组载体的细菌来转化植物，并且该细菌可以优选为根癌农杆菌。
另外，本发明提供了一种用于制备包含病毒样颗粒的疫苗组合物的方法，该方法包括以下步骤：
(S1)使用本发明的重组载体转化植物；
(S2)从步骤(S1)中获得的转基因植物中分离并纯化PCV2衣壳蛋白；
(S3)将步骤(S2)中得到的PCV2衣壳蛋白制成病毒样颗粒；以及
(S4)制备包含在步骤(S3)中获得的病毒样颗粒的疫苗组合物。
作为本发明的示例性实施方案，用于制备疫苗组合物的方法还可包括添加佐剂。明矾可以用作佐剂，但是佐剂不限于此。
作为本发明的另一个示例性实施方案，植物可以是选自拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、马铃薯、番茄、大白菜、卷心菜和生菜的双子叶植物；或选自水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱的单子叶植物。
作为本发明的又一个示例性实施方案，步骤(S1)可以使用导入了重组载体的细菌来转化植物，并且该细菌可以优选为根癌农杆菌，但不限于此。
作为本发明的又一个示例性实施方案，步骤(S3)可以通过改变包含PCV2衣壳蛋白的缓冲溶液的pH来制备病毒样颗粒。
作为本发明的又一个示例性实施方案，缓冲溶液可包含50至100mM Tris、300至1000mM氯化钠(NaCl)和10至100mM精氨酸，并且可具有6.9至7.5的pH。
作为本发明的又一个示例性实施方案，缓冲溶液的pH可以优选为7.2。
此外，本发明提供了通过根据本发明的制备方法制备的疫苗组合物。
作为本发明的示例性实施方案，疫苗组合物可以进一步为佐剂。佐剂可以是明矾，但不限于此。
此外，本发明提供了包含在通过本发明的制备方法制备的疫苗组合物中的PCV2病毒样颗粒。
作为本发明的示例性实施方案，PCV2病毒样颗粒通过尺寸排阻色谱法显示具有约2,000kDa的分子量，并且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)显示具有669kDa或更高的分子量，并且当通过负染色法染色时，可以是具有10nm或更大且40nm或更小，优选20nm或更大且30nm或更小的直径的球形或环形，然后通过透射电子显微镜观察。
另外，本发明提供了一种用于通过将根据本发明的制备方法制备的疫苗组合物施用于个体来预防猪圆环病毒感染的方法。
此外，本发明提供了通过根据本发明的制备方法制备的疫苗组合物在预防猪圆环病毒感染中的用途。
此外，本发明提供了通过根据本发明的制备方法制备的组合物在生产用于预防猪圆环病毒感染的疫苗中的用途。
[有益效果]
本发明涉及一种PCV2疫苗组合物，其包含使用靶向叶绿体的植物表达载体制备的病毒样颗粒，并且可以显著降低生产成本并可以从根本上阻断可能由相关领域中公知的方法(从动物细胞或微生物生产蛋白质，然后分离和纯化蛋白质的方法)生成的各种污染物(病毒、癌基因、肠毒素等)。另外，由于本发明包括真核蛋白的合成途径(其中发生了动物细胞基本上包括的翻译后转化过程)，因此本发明的优势在于可生产维持生理活性的蛋白，甚至在商业化阶段，该产品也可以作为种子库存进行管理，这与动物细胞或细菌不同。此外，当对相应物质的需求迅速增加时，就大规模生产所需的设备技术和成本而言，本发明比使用动物细胞或细菌的现有生产系统更为有效和经济，从而还具有可随需求的增加在短时间内大量生产和供应相应物质的优势。
附图说明
图1是示出根据本发明示例性实施方案的用于在植物中表达重组PCV2衣壳蛋白的两种重组PCV2衣壳蛋白的表达盒的视图。(Rbc-TP，RuBisCO转运肽；6XHis，多组氨酸标签；BiP-SP，伴侣结合蛋白信号肽)。
图2是示出通过蛋白质印迹法确认根据本发明的示例性实施方案的植物中的两种重组PCV2衣壳蛋白表达的结果的视图。
图3是示出使用亲和色谱法分离和纯化根据本发明示例性实施方案的重组PCV2衣壳蛋白的结果的视图。
图4是示出在本发明中分离和纯化的重组PCV2衣壳蛋白的尺寸排阻色谱法和Native-PAGE和SDS-PAGE结果的视图。
图5是示出通过透射电子显微镜拍摄的由本发明中分离和纯化的重组PCV2衣壳蛋白形成的病毒样颗粒的图像的视图。
图6是用图表和示意图示出用于确认本发明中分离和纯化的重组PCV2衣壳蛋白的抗体是否形成的豚鼠实验方法的视图(上)，以及用条形图示出通过ELISA试剂盒确认的结果的视图(下)。
具体实施方式
本发明人证实了，在生产在转化的植物中形成病毒样颗粒作为靶蛋白的2型猪圆环病毒(PCV2)时，当RuBisCO转运肽与靶蛋白融合并且多组氨酸附着以进行分离和纯化以靶向叶绿体，以便在翻译阶段增加蛋白的表达水平时，蛋白的表达水平以及分离和纯化效率得到提高，并证实了借此可以显著提高转基因植物中靶蛋白的生产效率，由此完成了本发明。
因此，在本发明的一个示例性实施方案中，构建了一种表达其中多组氨酸标签和叶绿体靶向的RuBisCO转运肽与PCV2衣壳蛋白融合的重组蛋白的植物表达载体以及一种表达其中多组氨酸标签和内质网靶向伴侣结合蛋白(BiP)信号肽与PCV2衣壳蛋白融合的重组蛋白的植物表达载体(参见实施例1)。
在本发明的又一个示例性实施方案中，用植物表达载体转化农杆菌后，通过将转化的农杆菌注入本氏烟草叶片的背面，在植物中表达重组PCV2衣壳蛋白(参见实施例2)。
在本发明的又一个示例性实施方案中，使用装有Ni-NTA琼脂糖树脂的柱从表达重组PCV2衣壳蛋白的本氏烟草叶中分离和纯化重组蛋白，并且使用缓冲溶液从重组蛋白中诱导PCV2衣壳蛋白的自组装，以制备病毒样颗粒(参见实施例3至5)。
在本发明的又一个示例性实施方案中，证实了通过将包含以上获得的PCV2病毒样颗粒的组合物注射到豚鼠中来形成针对PCV2的抗体(参见实施例6)。
在本发明的又一个示例性实施方案中，证实了通过向豚鼠施用包含两种基因型的PCV2病毒样颗粒的组合物，PCV2a和PCV2b基因型均具有形成病毒中和抗体的能力(参见实施例7)。
因此，本发明可以提供用于植物表达的重组载体，该重组载体包括编码RuBisCO转运肽的多核苷酸，该多核苷酸包括由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列；以及编码2型猪圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白的多核苷酸，该多核苷酸包括由SEQ ID NO：3或5表示的氨基酸序列。
如本文所用，术语“RuBisCo转运肽”是指核糖-1,5-双磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基的N末端转运肽，并且优选地由包含SEQ ID NO：2的碱基序列的多核苷酸编码，最优选通过由SEQ ID NO：2表示的多核苷酸编码，但可以由与SEQ ID NO：2的碱基序列具有80％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高的序列同一性的碱基序列编码。例如，RuBisCo转运肽包括具有70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的序列同一性的多肽。通过将比较区域和最佳比对序列进行比较来确定与多核苷酸的序列同一性％，并且比较区域中的一部分多核苷酸序列可包括相对于参考序列(无添加或缺失)的添加或缺失(即缺口)以进行这两个序列的最佳比对。RuBisCo转运肽用于将在转基因植物中表达的重组蛋白转移到叶绿体中，并且当表达RuBisCo转运肽时，序列的一部分被切除，并且只有一部分氨基酸可以保留。更具体地，当与根据本发明的RuBisCo转运肽融合的重组PCV2衣壳蛋白在植物中表达时，RuBisCo转运肽的前侧上的54个氨基酸被切除，并且只有由SEQ ID NO：1表示的氨基酸可以保留。此外，在这种情况下，可以在RuBisCo转运肽序列和多组氨酸序列之间插入额外的氨基酸以结合DNA框架，并且优选地，可以进一步插入甘氨酸或异亮氨酸。
如本文所用，术语“伴侣结合蛋白(BiP)”用于将表达的重组蛋白转移到内质网中，优选是包含SEQ ID NO：10的碱基序列的基因，最优选是由SEQ ID NO：10表示的基因，但可以包括与SEQ ID NO：10的碱基序列具有80％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高的序列同一性的碱基序列。当BiP基因被表达，序列的一部分被切除，并且只有一部分氨基酸可以保留。
如本文所用，术语“转运肽”或“信号肽”是指可以诱导蛋白质向特定细胞器、细胞室和细胞外转运位点的转运或定位的氨基酸序列。该术语包括转运肽和编码转运肽的所有核苷酸序列。
如本文所用，术语“PCV2”是指2型猪圆环病毒，是小的(直径17至22nm)二十面体非包膜DNA病毒，并且包含单链环状基因组。PCV2与1型猪圆环病毒(PCV1)共享大约80％的序列同一性。然而，通常与无毒的PCV1相反，感染PCV2的猪通常表现出称为断奶后多系统消耗综合症(PMWS)的症状。PCV2具有两个主要的开放阅读框架(ORF)。ORF1产生病毒复制蛋白(Rep)，而ORF2产生“衣壳蛋白”。对于通过转录PCV2的ORF2产生的衣壳蛋白，三个衣壳蛋白聚集以形成一个面，并且20个面组装以形成二十面体结构，从而完成病毒样颗粒(VLP)的结构。根据编码衣壳蛋白的ORF2的基因型，可以将PCV2分为诸如PCV2a、PCV2b和PCV2c之类的基因型。然而，这类基因型之间的致病性尚不明确，并且通过人工感染获得的结果尚未得出关于致病性差异的结论。
在本说明书中，PCV2a和PCV2b统称为“PCV2”，但是优选地是指PCV2a。此外，如有必要，当需要基因型之间的比较时，可将PCV2分为并分别称为PCV2a和PCV2b。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指包含通常经由磷酸二酯键彼此结合的两个或更多个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的低聚物或聚合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。多核苷酸还包括DNA和RNA衍生物，包括例如核苷酸类似物或磷酸二酯键以外的主链键，例如磷酸三酯键、磷酸氨基酯键、硫代磷酸酯键、硫酯键或肽键(肽核酸)。多核苷酸包括单链和/或双链多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)以及RNA或DNA的类似物。
如本文所用，术语“载体”是指DNA制剂，其包含可操作地连接至能够在合适的宿主中表达DNA的合适的调节序列的DNA序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒，或者仅仅是潜在的基因组插入物。一旦转化成合适的宿主，载体就可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。由于质粒是目前最常用的载体类型，因此术语质粒和载体有时可以互换使用。然而，本发明包括具有与本领域中已知或逐渐已知的功能等同的功能的已知载体的其他形式。
编码本发明的RuBisCo肽的多核苷酸可以包括由SEQ ID NO：2表示的碱基序列，并且此外，编码PCV2衣壳蛋白的多核苷酸可以包括由SEQ ID NO：4或6表示的碱基序列。另外，编码本发明的RuBisCo肽的多核苷酸包括在本发明范围内的SEQ ID NO：2的变体。具体地，多核苷酸可包括与SEQ ID NO：2的碱基序列具有90％或更高，更优选95％或更高，最优选98％或更高的序列同一性的碱基序列。此外，编码本发明的PCV2蛋白的多核苷酸包括在本发明范围内的SEQ ID NO：4或6的变体。具体地，多核苷酸可包括与SEQ ID NO：4或6的碱基序列具有90％或更高，更优选95％或更高，最优选98％或更高的序列同一性的碱基序列。
此外，本发明的重组载体还可包括编码多组氨酸标签的多核苷酸，该多核苷酸包括由SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列。
除了作为本发明的靶蛋白的PCV2以外，还包括多组氨酸标签以易于分离，代表性地，可以包括Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、FLAG标签、HA标签、Myc标签、S标签、SBP标签、IgG Fc标签、CTB标签、Softag 1标签、Softag 3标签、Strep标签、TC标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签等。
另外，在重组载体中，编码RuBisCO转运肽的多核苷酸、编码多组氨酸标签的多核苷酸和编码PCV2衣壳蛋白的多核苷酸在启动子和终止子之间顺序地连接，但是连接的顺序不限于此。
启动子的示例包括pEMU启动子、MAS启动子、组蛋白启动子、Clp启动子、花椰菜花叶病毒衍生的35S启动子、花椰菜花叶病毒衍生的19S RNA启动子、植物的肌动蛋白蛋白启动子、泛素蛋白蛋白质启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、延伸因子-1α(EF-1α)启动子等，终止子的示例包括胭脂碱合酶(NOS)终止子、水稻淀粉酶RAmy1A终止子、菜豆碱终止子、根癌农杆菌的章鱼碱基因的终止子、大肠杆菌的rrnB1/B2终止子等，但这些示例仅是示例性的，并且是不限于此。
作为本发明的另一方面，可以提供用根据本发明的重组载体转化的转基因植物。
如本文所用，“转化”统指其中通过注入的DNA改变活的有机体的遗传特性的那些过程，“转基因植物”是通过分子遗传方法通过注入外源基因而制备的植物，并且优选地是通过本发明的重组表达载体转化的植物，并且该植物没有限制，只要该植物达到本发明的目的即可。
此外，可以通过诸如转化、转染、农杆菌介导的转化、粒子枪轰击、超声处理、电穿孔和聚乙二醇(PEG)介导的转化之类的方法来制备根据本发明的转基因植物，但是没有限制，只要它是能够注入本发明载体的方法即可。
作为本发明的另一方面，本发明提供了一种用于分离和纯化重组PCV2衣壳蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
(S1)使用本发明的重组载体转化植物；
(S2)通过将步骤(S1)中获得的转基因植物与蛋白提取缓冲溶液混合来制备植物混合物溶液；
(S3)通过将步骤(S2)中获得的混合物溶液注入装有琼脂糖的柱中来吸附其中多组氨酸标签与PCV2衣壳蛋白连接的重组蛋白；
(S4)通过向柱内注入洗涤液来洗涤柱；以及
(S5)通过将洗脱溶液注入柱中来洗脱吸附到琼脂糖上的重组蛋白。
根据本发明的蛋白提取缓冲溶液可包含10至100mM Tris、100至300mM氯化钠(NaCl)、0.01至0.5％Triton X-100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚和5-300mM咪唑。
根据本发明的琼脂糖可以是镍-三硝基三乙酸镍(Ni-NTA)琼脂糖。
此外，在本发明中，步骤(S1)可以使用导入了重组载体的细菌来转化植物，并且该细菌优选为根癌农杆菌。
作为本发明的又一方面，提供了一种用于制备包含病毒样颗粒的疫苗组合物的方法，该方法包括以下步骤：
(S1)使用本发明的重组载体转化植物；
(S2)从步骤(S1)中获得的转基因植物中分离并纯化PCV2衣壳蛋白；
(S3)将步骤(S2)中得到的PCV2衣壳蛋白制成病毒样颗粒；以及
(S4)制备包含在步骤(S3)中获得的病毒样颗粒的疫苗组合物。
如本文所用，术语“疫苗”是包含在生物体中引起免疫应答的抗原的生物制剂，并且是指免疫原，该免疫原通过注射或口服施用给人或动物而在生物体中诱导免疫以预防传染病。动物是人类或非人类动物，并且非人类动物是指猪、牛、马、狗、山羊、绵羊等，但不限于此。
本发明的“疫苗组合物”可以根据典型方法以口服制剂(例如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂)以及无菌注射溶液的形式配制使用。当制备该组合物时，可以使用常用的稀释剂或赋形剂(例如填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂)制备该组合物。用于口服制剂的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂等，并且该固体制剂可以通过混合至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等)与类卵磷脂的乳化剂来制备。此外，除了简单的赋形剂外，还可以使用诸如硬脂酸镁和滑石粉等润滑剂。作为用于口服施用的液体制剂，可以使用悬浮液、内部使用的液体、乳剂、糖浆等，并且除了水和液体石蜡作为简单常用的稀释剂之外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外施用的制剂的示例包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳剂和冻干制剂。作为非水溶剂和悬浮液，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射酯(如油酸乙酯)等。
根据本发明的疫苗组合物的施用途径包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠管、局部、舌下或直肠途径。口服或肠胃外施用是优选的。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。本发明的疫苗组合物也可以以用于直肠施用的栓剂的形式施用。
考虑到个体的年龄、体重、性别、身体状况等来选择根据本发明的疫苗组合物或药物组合物的剂量。在没有特殊副作用的情况下诱导个体免疫保护反应所需的量可能会有所不同，具体取决于用作免疫原的重组蛋白和随机赋形剂的存在。
在本发明中，用于制备疫苗组合物的方法还可包括添加佐剂。
如本文所用，术语“佐剂”是指可以添加到疫苗或药物活性组分中以增加或影响免疫应答的物质或组合物。代表性地，佐剂通常是指用于免疫原和/或另一种药物活性物质或组合物的载体或辅助物质。通常，术语“佐剂”应被解释为广义的概念，并且是指可以增强整合到佐剂中或与佐剂一起施用的抗原的免疫原性的各种物质或策略(stratagem)。此外，佐剂不限于此，并且可以分为免疫增强剂、抗原递送系统或其组合。
另外，在本发明中，植物可以是选自拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、马铃薯、番茄、大白菜、卷心菜和生菜的双子叶植物；或选自水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱的单子叶植物。
如本文所用，术语“植物”可以不受限制地使用，只要它是能够大量生产本发明的重组蛋白的植物即可，但是更具体地，可以选自上文提及的植物组，并且可以优选烟草。本发明中的烟草在种类上没有特别限制，只要它是烟草属的植物并且能够过表达蛋白质即可，并且可以根据转化方法和大量生产蛋白质的目的通过选择适当的变种来实施本发明。例如，可以使用诸如本氏烟草L.(Nicotiana benthamiana L.)或烟草栽培变种Xanthi(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)之类的变种。
另外，在本发明中，步骤(S1)可以使用导入了重组载体的细菌来转化植物，并且该细菌可以优选为根癌农杆菌，但如上所述不限于此。
此外，在本发明中，步骤(S3)可以通过改变包含PCV2衣壳蛋白的缓冲溶液的pH来制备病毒样颗粒。
在制备病毒样颗粒时，可以进行使用过滤器交换和浓缩缓冲溶液的过程，使得重组PCV2衣壳蛋白可以通过自组装形成病毒样颗粒。
缓冲溶液可以包括50至100mM的Tris、300至1000mM的氯化钠(NaCl)和10至100mM的精氨酸，并且可以具有6.9至7.5，优选地7.2的pH。此外，可以进行尺寸排阻色谱法以纯化自组装的重组PCV2病毒样颗粒。
作为本发明的又一方面，本发明提供了通过根据本发明的制备方法制备的疫苗组合物。
疫苗组合物还可包含佐剂。另外，佐剂可以是明矾，但是在本发明中可以使用适合用作佐剂的任何类型的铝盐。铝盐包括氢氧化铝(Al(OH)3)、磷酸铝(AlPO4)、铝盐酸盐、硫酸铝、铵明矾、钾明矾、硅酸铝等。优选地，氢氧化铝或磷酸铝可以用作铝盐佐剂。
此外，作为本发明的又一方面，本发明提供了疫苗组合物中包含的PCV2病毒样颗粒。PCV2病毒样颗粒通过尺寸排阻色谱法显示具有约2,000kDa的分子量，并且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)显示具有669kDa或更高的分子量，并且当用负染色法染色然后通过透射电子显微镜观察时可以是具有10nm或更大且40nm或更小，优选20nm或更大且30nm或更小的直径的球形或环形。在此，术语“约”是指±10％。因此，约2,000kDa的分子量是指1,800kDa至2,200kDa。
作为本发明的又一方面，本发明提供了一种用于通过将根据本发明的制备方法制备的疫苗组合物施用于个体来预防猪圆环病毒感染的方法。
作为本发明的又一方面，本发明提供了通过根据本发明的制备方法制备的疫苗组合物在预防猪圆环病毒感染中的用途。
此外，作为本发明的又一方面，本发明提供了通过根据本发明的制备方法制备的组合物在生产用于预防猪圆环病毒感染的疫苗中的用途。
基于发明人可以适当地定义术语的概念，以便以最佳方式描述他/她自己的发明的原则，说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应被解释为局限于典型的或词典的含义，而应以与本发明的技术精神相符的含义和概念来解释。
在下文中，将提出有助于理解本发明的优选实施例。在下文中，提出以下实施例以帮助理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。
在下面的实施例和附图中，除非特别提及为PCV2b，否则PCV2指PCV2a。
[实施例]
实施例1：表达重组PCV2衣壳蛋白的植物表达载体的构建
如图1的切割图所示，构建用于植物表达的重组载体，以便在植物中表达重组PCV2衣壳蛋白。
更具体地，获得了关于PCV2衣壳蛋白的遗传信息，并合成了具有针对在本氏烟草中的表达而优化的序列的基因(SEQ ID NO：4或6)。通过依次连接编码RuBisCO转运肽的多核苷酸(SEQ ID NO：2)、编码6个连续组氨酸的多核苷酸(SEQ ID NO：8)和编码pCAMBIA1300载体的CaMV35S启动子与NOS终止子之间的PCV2衣壳蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：4或6)构建了叶绿体靶向的重组PCV2衣壳蛋白植物表达载体。通过依次连接编码伴侣结合蛋白(BiP)信号肽的多核苷酸(SEQ ID NO：10)、编码PCV2衣壳蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：4或6)、编码6个连续组氨酸的多核苷酸(SEQ ID NO：8)和编码在pCAMBIA1300载体的CaMV35S启动子和NOS终止子之间的His-Asp-Glu-Leu(HDEL)肽的多核苷酸(SEQ ID NO：12)构建了叶绿体靶向的重组PCV2衣壳蛋白植物表达载体。
实施例2：重组PCV2衣壳蛋白表达的确认
2.1.植物表达载体的瞬时表达
使用电击法(电穿孔)，用实施例1中制备的植物表达载体转化农杆菌LBA4404菌株。在转化后的农杆菌在28℃的条件下在5mL YEP液体培养基(10g酵母提取物、10g蛋白胨、5g NaCl、50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)中摇动培养16小时之后，将1ml的初级培养基接种到50ml的新鲜YEP培养基中，并在28℃的条件下摇动培养6小时。通过离心(7,000rpm，4℃，5分钟)收集如此培养的农杆菌，然后将其悬浮在渗透缓冲液[10mM MES(pH 5.7)，10mMMgCl2和200μM乙酰丁香酮中]。通过使用已从中移除注射针的注射器将农杆菌悬浮液注入到本氏烟草叶片的背面的方法来进行农业浸润。
2.2.重组PCV2衣壳蛋白在植物中表达的确认
从实施例2.1制备的植物叶片中提取蛋白并离心后，通过蛋白质印迹法，通过分别分离水溶性部分(上清液；S)中的蛋白质、沉淀(Pellet；P)中的蛋白质，以及包含水溶性部分和沉淀的部分(总量；T)确认重组PCV2衣壳蛋白的表达。更具体地，将每个部分的30μL与SDS样品缓冲液混合，然后加热。接下来，通过对10％SDS-PAGE凝胶进行电泳来确认按尺寸分离的蛋白条带，将分离出的蛋白转移到PVDF膜上，然后使用5％脱脂奶进行封闭步骤，然后将蛋白结合到与多组氨酸反应的抗体，并通过制造商提供的方法用ECL溶液处理，从而确认重组PCV2衣壳蛋白的表达。
结果，如图2所示，确认了与RuBisCO转运肽融合以便靶向叶绿体的重组PCV2衣壳蛋白被高效表达，在水溶性部分中确认到表达的重组PCV2衣壳蛋白的70％或更多，并且在沉淀部分中观察到约30％的PCV2衣壳蛋白(图2左侧的照片)。相比之下，与BiP信号肽融合以便靶向内质网的重组PCV2衣壳蛋白具有极低的表达效率(图2右侧的照片)。因此，仅使用与靶向叶绿体的RuBisCO转运肽融合的重组PCV2衣壳蛋白进行以下实施例。
实施例3：在植物中表达的重组PCV2衣壳蛋白的分离和纯化
将100mL g蛋白提取溶液[50mM Tris-HCl(pH 8.2)、300mM NaCl、10mM咪唑和0.5％Triton X-100]添加到50g表达在实施例2.1中制备的重组PCV2衣壳蛋白的本氏烟草叶片中，通过搅拌器将组织压碎，然后通过在4℃下以13,000rpm离心30分钟来回收蛋白提取溶液。亲和色谱法用装满镍-三氟三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖树脂的柱进行，以从蛋白提取溶液中分离和纯化重组PCV2衣壳蛋白。用10mL树脂填充柱，然后用100mL洗涤溶液[50mMTris-HCl(pH 8.2)、300M NaCl和10mM咪唑]进行平衡。将回收的蛋白提取溶液施加到柱上并进行平衡，然后通过使100mL洗涤液流动来洗涤树脂，并用洗脱溶液[50mm Tris-HCl(pH8.2)、300mm NaCl和250mM咪唑]洗脱重组PCV2蛋白。对于包含重组PCV2衣壳蛋白的洗脱溶液，用缓冲溶液进行缓冲液交换和浓缩，以使用30kDa大小的过滤器制备病毒样颗粒[50mmTris-HCl(pH 7.4)、300mM NaCl、100mM精氨酸并且最终pH调整为7.2]。将分离和纯化的重组PCV2衣壳蛋白进行电泳(SDS-PAGE)，然后通过考马斯亮蓝染色确认(参见图3)。
实施例4：重组PCV2衣壳蛋白的纯化
重组PCV2衣壳蛋白通过自组装形成重组PCV2病毒样颗粒。因此，进行了尺寸排阻色谱法以分离重组PCV2病毒样颗粒。使用洗脱溶液[50mm Tris-Cl(pH 7.4)、300mm NaCl和0.5mM EDTA]平衡尺寸排阻色谱法(HiLoad 16/600SuperdexTM 200pg)。将5mg包含在实施例3中获得的分离和纯化的重组PCV2衣壳蛋白的缓冲溶液加载到尺寸排阻色谱柱上，并按尺寸分离以获得第一峰部分。对获得的部分进行Native-PAGE电泳，以确认是否形成病毒样颗粒。另外，进行SDS-PAGE电泳以确认分离和纯化的重组PCV2衣壳蛋白的纯化程度。通过尺寸排阻色谱分离的结果以及Native-PAGE和SDS-PAGE电泳的结果在图4中示出。
实施例5：重组PCV2病毒样颗粒的确认
通过用洗脱溶液[50mM Tris-Cl(pH 7.4)、300mM NaCl和0.5mM EDTA]稀释通过尺寸排阻色谱法分离的第一和第二部分中包含的重组PCV2a衣壳蛋白来进行负染色，使得最终浓度变为100nM。在使5μL蛋白质溶液在涂覆碳的铜网上反应1分钟后，使用滤纸除去蛋白质溶液，并用三重蒸馏水洗涤3次。在这种情况下，涂覆碳的铜网与等离子体反应1分钟，以将疏水性转变为亲水性，从而使蛋白质更易于附着在碳上。最后，使该网与1％乙酸铀酰反应1分钟以进行负染色，然后用滤纸除去染色溶液并在室温下干燥12小时。使用透射电子显微镜(日本飞利浦Tecnai T10)从制备的网中获得20,000倍的放大图像。
结果，如图5所示，在第一部分中可以观察到由重组PCV2衣壳蛋白组成的病毒样颗粒。
实施例6：重组PCV2衣壳蛋白抗体的形成的确认
进行实验以确认包含实施例5中确认的重组PCV2病毒样颗粒的组合物是否形成抗体，并根据韩国标准的兽用生物制品测定法[1-2-04-03 2型猪圆环病毒基因检测重组灭活疫苗(PCV2抗体滴度测试)]进行。准备9只体重为300至350g的豚鼠，将1/2剂量肌肉内接种至作为对照的三只动物和作为实验组的六只动物中，并在2周后进行第二次接种。在此，对照是指在没有抗原的情况下单独施用1ml PBS的组，而实验组是在50μg和100μg的PCV2抗原中分别添加了50％的氢氧化铝凝胶的组。第二次接种后两周，与三只动物的对照一起采集血液，并通过ELISA试剂盒测量抗体滴度。根据制造商的测试方法进行ELISA吸光度测量。抗体形成结果在图6中示出。
结果，如图6所示，随着施用包含PCV2病毒样颗粒的组合物，在豚鼠的体内形成了抗体。此外，随着组合物剂量的增加，形成的抗体的量也往往增加。
实施例7：重组PCV2a衣壳蛋白中和抗体的形成的确认
确认是否使用疫苗组合物形成了PCV2中和抗体，其中将氢氧化铝(Al(OH)3)佐剂添加到包含在实施例5中确认的PCV2病毒样颗粒的组合物中。根据韩国标准的兽用生物制品测定法(1-2-04-03 2型猪圆环病毒基因重组灭活疫苗)进行该实验。准备6只体重为300至350g的豚鼠，将1/2剂量肌肉内接种到作为对照的两只动物和作为实验组的四只动物中，并且在2周后进行第二次接种。第二次接种后两周，与两只动物的对照一起收集血液，并通过间接荧光抗体试验(免疫荧光测定法)确认是否形成了抗体。病毒中和实验的结果示于下表1中。
[表1]
Figure BDA0003065028750000221
结果，如表1所示，确认了PCV2基因型PCV2a和PCV2b两者均具有病毒中和能力。此外，PCV2a的病毒中和能力通常比PCV2b更好，并且当添加100μg明矾佐剂时，该中和抗体滴度显示为最高。
提供本发明的上述描述是出于说明性目的，并且本发明所属领域的技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或本质特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应理解，上述实施例仅在所有方面进行了说明，而不是进行限制。
[工业适用性]
当使用根据本发明的植物表达载体时，其优势在于可以显著降低生产成本，可以从根本上阻断诸如病毒、癌基因和肠毒素之类的污染物，并且具有真核蛋白的合成途径(其中发生翻译后的转化过程)，因此有可能产生一种维持生理活性的蛋白质，甚至在商业化阶段，该产品也可以作为种子库存进行管理。此外，当对相应物质的需求快速增加时，就大规模生产所需的设备技术和成本而言，本发明比使用动物细胞或细菌的现有生产系统更加有效和经济，从而预期其将具有很大的工业适用性价值，这是因为随着需求的增加可以在短时间内大量生产和供应相应的物质。
<110> 巴伊沃爱普有限公司
<120> 用于在植物中表达病毒样颗粒的重组载体和用于使用该病毒样颗粒制备包含病毒样颗粒的疫苗组合物的方法
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<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RuBisCO转运肽的氨基酸序列
<400> 1
Cys Met Gln Val Trp Pro Pro Ile Gly Lys Lys Lys Phe Glu Thr Leu
1 5 10 15
Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser
20 25
<210> 2
<211> 237
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RuBisCO转运肽的DNA序列
<400> 2
atggcttcct ctatgctctc ttccgctact atggttgcct ctccggctca ggccactatg 60
gtcgctcctt tcaacggact taagtcctcc gctgccttcc cagccacccg caaggctaac 120
aacgacacta cttccatcac aagcaacggc ggaagagtta actgcatgca ggtgtggcct 180
ccgattggaa agaagaagtt tgagactctc tcttaccttc ctgaccttac cgattcc 237
<210> 3
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PCV2的氨基酸序列
<400> 3
Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val
1 5 10 15
Lys Arg Thr Thr Val Thr Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg
20 25 30
Phe Lys Leu Asp Asp Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile
35 40 45
Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe
50 55 60
Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr
65 70 75 80
Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Pro Lys Ala Asn Ala Leu Thr
85 90 95
Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro
100 105 110
Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser
115 120 125
Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu
130 135 140
Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala
145 150 155 160
Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met
165 170 175
Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
180 185 190
<210> 4
<211> 579
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCV2的DNA序列
<400> 4
aatggcattt tcaatacacg cctcagtcga acttttggat atactgtcaa gcgtactaca 60
gtcaccacgc catcttgggc tgtggatatg atgagattta agttggatga ctttgttcct 120
cctggagggg gaaccaacaa aatttctata ccgtttgagt actatagaat cagaaaagtt 180
aaggttgagt tctggccgtg ttcccccata actcagggtg ataggggtgt gggttcaact 240
gctgttattc tagatgataa cttcgtacct aaggccaacg cattgactta tgacccctat 300
gtaaactact catctagaca tacaatccca caacctttct cctaccactc gcgttatttt 360
acaccaaagc ctgttttaga ttctaccatt gattatttcc aaccaaataa caagaggaat 420
cagctttggt tgagattaca aacctcacgg aacgtggatc atgtcggatt gggtactgca 480
tttgaaaata gtaagtatga tcaggactac aatatccgtg tgacaatgta cgttcaattt 540
agggaattta atcttaaaga cccaccactt aatccatag 579
<210> 5
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PCV2b的氨基酸序列
<400> 5
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Arg Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
225 230
<210> 6
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCV2b的DNA序列
<400> 6
atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60
cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120
aaaaatggca tcttcaacac ccgcctatcc cgcaccttcg gatatactat caagcgaacc 180
acagtcaaaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat tcaatattaa tgactttctt 240
cccccaggag ggggctcaaa cccccgctct gtgccctttg aatactacag aataagaaag 300
gttaaggtcg aattctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360
agtgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctcac ctatgacccc 420
tacgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccgctac 480
tttaccccca aacctgtcct agattccact attgattact tccaaccaaa caacaaaaga 540
aaccagctgt ggctgagact acaaactgct ggaaatgtag accacgtagg cctcggcact 600
gcgttcgaaa acagtatata cgaccaagaa tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660
ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaccctt aa 702
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多组氨酸标签的氨基酸序列
<400> 7
His His His His His His
1 5
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多组氨酸标签的DNA序列
<400> 8
caccaccatc accaccat 18
<210> 9
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BiP信号肽的氨基酸序列
<400> 9
Met Ala Arg Ser Phe Gly Ala Asn Ser Thr Val Val Leu Ala Ile Ile
1 5 10 15
Phe Phe Gly Cys Leu Phe Ala Leu Ser Ser Ala Ile Glu Glu Ala Thr
20 25 30
Lys Leu Gly Ser Val Ile Gly Ile Asp
35 40
<210> 10
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BiP信号肽的DNA序列
<400> 10
atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggatgt 60
ttatttgcgt tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt taggatcagt gatagggata 120
gat 123
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDEL的氨基酸序列
<400> 11
His Asp Glu Leu
1
<210> 12
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HDEL的DNA序列
<400> 12
catgatgagc tc 12

Claims (25)

1.一种用于植物表达的重组载体，所述重组载体包含编码RuBisCO转运肽的包含由SEQID NO：1表示的氨基酸序列的多核苷酸；以及编码2型猪圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白的包含由SEQ ID NO：3或5表示的氨基酸序列的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其中编码所述RuBisCO转运肽的多核苷酸包含由SEQ ID NO：2表示的碱基序列，并且编码所述PCV2衣壳蛋白的多核苷酸包含由SEQ ID NO：4或6表示的碱基序列。
3.根据权利要求1的重组载体，其还包含编码多组氨酸标签的包含由SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列的多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其中，在所述重组载体中，编码RuBisCO转运肽的多核苷酸、编码多组氨酸标签的多核苷酸和编码PCV2衣壳蛋白的多核苷酸在启动子和终止子之间依次连接。
5.一种转基因植物，其用根据权利要求1至4中任一项所述的重组载体转化。
6.一种用于分离和纯化重组PCV2衣壳蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(S1)使用根据权利要求1至4中任一项所述的重组载体转化植物；(S2)通过将步骤(S1)中获得的转基因植物与蛋白提取缓冲溶液混合来制备植物混合物溶液；(S3)通过将步骤(S2)中获得的所述混合物溶液注入装有琼脂糖的柱中来吸附其中多组氨酸标签与所述PCV2衣壳蛋白连接的重组蛋白；(S4)通过向所述柱内注入洗涤液来洗涤所述柱；以及(S5)通过将洗脱溶液注入所述柱中来洗脱吸附在琼脂糖上的所述重组蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述蛋白提取缓冲溶液包含10至100mM Tris、100至300mM氯化钠(NaCl)、0.01至0.5％的Triton X-100(聚乙二醇对-(1,1,3,3)-四甲基丁基)-苯基醚和5至300mM咪唑。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述琼脂糖是镍-三硝基三乙酸镍(Ni-NTA)琼脂糖。
9.根据权利要求6所述的方法，其中步骤(S1)使用引入了重组载体的细菌来转化植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述细菌是根癌农杆菌。
11.一种用于制备包含病毒样颗粒的疫苗组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(S1)使用根据权利要求1至4中任一项所述的重组载体转化植物；(S2)从步骤(S1)中获得的转基因植物中分离并纯化PCV2衣壳蛋白；(S3)将步骤(S2)中得到的所述PCV2衣壳蛋白制成病毒样颗粒；以及(S4)制备包含在步骤(S3)中得到的病毒样颗粒的疫苗组合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其还包括添加佐剂。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述植物是选自拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、马铃薯、番茄、大白菜、卷心菜和生菜的双子叶植物；或选自水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱的单子叶植物。
14.根据权利要求11所述的方法，其中，步骤(S1)使用引入了重组载体的细菌来转化植物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述细菌是根癌农杆菌。
16.根据权利要求11所述的方法，其中，步骤(S3)通过改变包括PCV2衣壳蛋白的缓冲溶液的pH来制备病毒样颗粒。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述缓冲溶液包含50至100mM的Tris、300至1000mM的氯化钠(NaCl)和10至100mM的精氨酸，并且具有6.9至7.5的pH。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述pH为7.2。
19.一种疫苗组合物，其通过权利要求11的制备方法制备。
20.根据权利要求19所述的疫苗组合物，其还包含佐剂。
21.根据权利要求20所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂是明矾。
22.PCV2病毒样颗粒，其包含在根据权利要求19所述的疫苗组合物中，其中，所述颗粒通过尺寸排阻色谱法显示具有1800kDa或更大且2,200kDa或更小的分子量，并且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)显示具有669kDa或更大的分子量，并且当通过负染色法染色然后用透射电子显微镜观察时，是具有20nm至30nm的直径的球形或环形。
23.一种用于通过将根据权利要求11所述的制备方法制备的疫苗组合物施用于个体来预防猪圆环病毒感染的方法。
24.通过根据权利要求11所述的制备方法制备的疫苗组合物在预防猪圆环病毒感染中的用途。
25.通过根据权利要求11所述的制备方法制备的组合物在生产用于预防猪圆环病毒感染的疫苗中的用途。
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