PT2847324T - Produção de partículas semelhantes a rotavírus em plantas - Google Patents

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Lavoie Pierre-Olivier
D'aoust Marc-Andre
Arai Masaaki
Asahara Naomi
Levi Rutendo Mutepfa David
Isabel Hitzeroth Inga
Peter Rybicki Edward
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Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
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Description

As duas proteínas externas VP7, uma glicoproteína de 37 kDa (G) e a VP4 (P) sensível à protéase de 87 kDa, definem os serotipos do vírus. Essas duas proteínas induzem respostas de anticorpos neutralizantes e, portanto, são usadas para classificar os serotipos de rotavirus em um sistema de nomenclatura dupla, dependendo da combinação de antígeno GP (por exemplo, G1 P [8] ou G2 P [4]) (Sanchez-Padilla et al., 2009) . A proteína VP4 dimeriza para formar 60 espigões na casca externa do vírus, que estão diretamente envolvidos nos estágios iniciais da entrada da célula hospedeira. A proteína de espiga contém um local de clivagem na posição de aminoácido (aa) 248. Após a infeção, é clivada pela protéase de tripsina para produzir VP5 (529 aa, 60 kDa) e VP8 (246 aa, 28 kDa) (Denisova et al·., 1999). Este processo melhora a infecciosidade do vírus (ligação celular e invasão da célula hospedeira) e estabiliza a estrutura do pico (Glass, 2006} . A glicoproteína VP7 forma a camada externa ou externa do vírus. Atualmente, são conhecidos 27 g e 35 P genótipos (Greenberg e Estes, 2009). VP4 e VP7 são os principais antígenos envolvidos na neutralização do vírus e são alvos importantes para desenvolvimento de vacinas (Dennehy, 2007).
Em células de mamíferos infetadas, os rotavirus sofrem um modo único de morfogénese para formar as partículas virais completas VP2/6/4/7 de camada tripla completas (Lopez et al., 2005). A cápside de camada tripla é um complexo muito estável que permite a transmissão fecal-oral e a entrega do vírus no intestino delgado, onde infecta enterócitos diferenciados não divididos perto das pontas das vilosidades (Greenberg e Estes, 2009). Em primeiro lugar, o vírus intacto atribui-se aos recetores independentes do ácido siálico através de 60 pontos de dímero VP4 na superfície do vírus (Lundgren e Svensson, 2001) . Os 60 picos de dímero VP4 na superfície do vírus permitem que o vírus se apegue a esses recetores celulares. VP4 é suscetível à clivagem proteolitica pela tripsina, o que resulta em uma troca consistente de pontos de vista para a fixação de glicoproteinas para a interação com uma série de coreceptores.
No entanto, o processo de entrada e entrada de várias etapas não é claramente compreendido, mas o virus é entregue através da membrana plasmática do hospedeiro. 0 invólucro de cápside externo VP7 que também está envolvido no processo de entrada, é removido no processo e as partículas de duas camadas (DLP) são entregues no citoplasma celular em vesículas (Figura 2, arte anterior). 0 DLP escapa da vesícula e entra em inclusões citoplasmáticas não ligadas à membrana. A transcrição precoce do genoma por VP1 começa em partículas de modo que o dsARN nunca é exposto ao citoplasma. A replicação de ARN e a formação de núcleo ocorrem nestas inclusões citoplasmáticas não ligadas à membrana. Os ARNs (+) nascentes são então transportados para o citoplasma e servem como modelos para síntese proteica viral. VP4 é produzido no citosol e transportado para o retículo endoplasmático áspero (RER), e VP7 é segregado no RER. VP2 e VP6 são produzidos e montados no citosol em virossomos e subsequentemente brotam nos compartimentos RER, recebendo um envelope de membrana transitória no processo (Lopez et al·., 2005; Tian et al., 1996). No RER, os envelopes transitórios das partículas virais são removidos e substituídos por monómeros de proteína VP4 e VP7, com envolvimento crítico da glicoproteína rotaviral NSP4 (Tian et al·., 1996; Lopez et al., 2005; Gonzalez et al., 2000). NSP4 funciona como um recetor intracelular na membrana ER e liga as partículas subvirais recém-fabricadas e provavelmente também a proteína VP4 de pico (Tian et al., 1996). NSP4 também é tóxico para os seres humanos e é o agente causador da diarreia. As partículas completas e maduras são transferidas para a secreção de membrana plasmática (Lopez et al., 2005).
Uma variedade de abordagens diferentes foi tomada para gerar uma vacina rotavirus adequada para proteger as populações humanas dos vários serotipos do rotavirus. Essas abordagens incluem várias abordagens de Jennerian, uso de vírus atenuados vivos, uso de partículas semelhantes a vírus, vacinas de ácido nucleico e subunidades virais como imunogénicos. Atualmente, existem duas vacinas orais disponíveis no mercado, no entanto, têm baixa eficácia em alguns países em desenvolvimento devido à variação da estirpe e à presença de outros agentes patogénicos.
As Patentes US 4.624.850, 4.636.385, 4.704.275, 4.751.080, 4.927.628, 5.474.773 e 5.695.767, cada uma descreve uma variedade de vacinas contra rotavirus e/ou métodos de preparação da mesma. Uma comunidade compartilhada pelos membros desse grupo é que cada uma dessas vacinas depende do uso de partículas virais inteiras para criar as melhores vacinas de rotavirus. Dada a longa necessidade de uma vacina eficaz e multivalente, é claro que esse corpo de trabalho tem sido apenas parcialmente bem sucedido no atendimento da necessidade de tal vacina.
Partindo dos métodos tradicionais de geração de vacinas, os avanços no campo da biologia molecular permitiram a expressão de proteínas individuais de rotavirus. Crawford et al. (J Virol. 1994, setembro; 68 (9): 5945-5952) clonou VP2, VP4, VP6 e codificação VP7 para a principal proteína de cápside no sistema de expressão de baculovírus e expressou cada proteína em células de insetos. A co-expressão de diferentes combinações das proteínas estruturais principais de rotavirus resultou na formação de partículas semelhantes a vírus estáveis (VLPs) . A co-expressão de VP2 e VP6 isoladamente ou com VP4 resultou na produção de VLPs VP2/6 ou VP2/4/6, que eram semelhantes às partículas de rotavirus de camada dupla. A co-expressão de VP2, VP6 e VP7, com ou sem VP4, produziu VLPs de três camadas VF2/6/7 ou VP2/ 4/6/7, qu© eram- gbrnelKantes :á:s partículas dê rotavirus- Infeciosas nativas. As VLPs mantiveram as caracteristicas estruturais e funcionais das partículas nativas, determinadas pelo exame microscópico eletrónico das partículas, a presença de epítopos não neutrali.zantes e neutralizantes em VP4 e VP7 e atividade de hemaglutinação das VLP VP2/4/6/7.
Os candidatos de vacinas gerados a partir de partículas similares a "vírus da diferentes:: don^dS:idd®S' de proteínas mostraram potencial como vacinas subunitárias. O’Neal et ai, ("Rotavirus Virus-like Particles Administered Mucosally Induce Protective Immunity," J. Virology, 71(11):8707-8717 (1997)) mostrou que VLPs contendo VPs 2 e 6 ou VPs 2, 6 e 7 quando administrados a ratinhos com e sem a adição de Imunldade protetora· .induzida por; toxina· da: Cólera em ratos imunizados, embora a proteção fosse mais eficaz quando as vliPs·: .fossem: s^lnlstragag -00111:: "toxina:: da çêlera *
Partículas semelhantes a núcleos (CLP) e VLPs: também foram usadas para imunizar vacas, Fernandez et al. ("Passive Immunity to Bovine Rotavirus in Newborn Calves Fed Colostrum lupglements Cows Immuhiraad "with; "R®Gda#iaaníf· :§A1Í. rotavirus core-like particle (CLP) or virus-like particle (VLP) vaccines," Vaccine, 16 (5):507--516 (1998)). Neste estudo, estudou-se a capacidade de CLFs e VLPs para criar
Imunidade passiva·.: Rate grupo. concluiu: qua. -as:: VLiS -sraim maig. eficazes do que os CLPs na indução de imunidade passiva.
As plantas são cada vez mais utilizadas para a produção em larga escala de proteínas recombinantes. Por exemplo, a OS 2003/0175303 descreve a expressão da proteína estrutural recomfcinante de rotavirus VP6, VP2, VP4 ou VP7 em plantas de tomate transformadas estáveis.
Saldana et al. expressou VP2 e VP6 no citoplasma de plantas de tomate usando um promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) e A. tumefaciens recombinante (Saldana et al., 2006). Estudos de microscopia eletrónica mostraram que uma pequena proporção das partículas se reuniu em 2/6 VLPs. Uma resposta imune protetora foi detetada em ratinhos e isso pode ter sido até certo ponto contado pelos VPs não montados. As proteínas individuais demonstraram obter respostas imunes em camundongos, como no caso de VP8 e VP6 (Zhou et al., 2010).
Matsumura et al., (2002) foram os primeiros a relatar a expressão e a montagem de rotavirus bovino A VP6 em plantas de batata transgénicas. Em seu estudo, usaram plantas de batata transgénicas reguladas por um promotor de vírus do mosaico de couve-flor (CaMV) 35S e Agrobacterium tumefaciens recombinante portador do gene VP6. A proteína foi expressa, purificada e estudos imunogénicos realizados. A resposta imune em ratinhos adultos mostrou presença de anticorpos VP6 nos soros. No entanto, não mostraram evidências de proteínas VP6 montadas. Pode ter sido simples monómeros ou trímeros que poderiam provocar uma resposta imune em ratinhos. O trabalho de outro grupo mostrou a montagem de VP6 em Nicotiana benthamiana usando um vetor de vírus de batata X (PVX) (O'Brien et al·., 2000). Quando a proteína VP6 foi expressa em plantas, descobriu-se que apenas se montou quando fundido com as barras da proteína PVX. Uma vez que a clivagem ocorreu, o VP6 foi montado em VLP icosaédricas como observado em um estudo similar de HIV-PVX por Marusic et al., (2001). Este resultado provavelmente sugere que as proteínas de rotavirus podem exigir um fator ou aprimoramento adicional para formar VLPs. A produção de VLP é uma tarefa desafiadora, pois são necessárias síntese e montagem de uma ou mais proteínas recombinantes. Este é o caso da VLP do rotavirus, que é um vírus de ARN com uma cápside formada por 1860 monómeros de quatro proteínas diferentes. Para a produção de VLP é necessária a expressão e montagem simultânea de duas a três proteínas recombinantes. Estes compreendem 120 moléculas de VP2 (camada interna), 780 moléculas de VP6 (camada intermediária) e 780 moléculas da glicoproteína VP7 (camada externa), formando finalmente uma partícula de camada dupla ou tripla. Além disso, a produção da maioria das VLP requer a expressão simultânea e a montagem de várias proteínas recombinantes, que - para o caso da partícula de rotavirus (RLP) - deve ocorrer em uma única célula hospedeira.
Um estudo mais recente mostrou a expressão bem-sucedida do rotavirus humano VP6 otimizado com codão em Chenopodium amaranticolor usando um sistema de expressão mediada pelo vírus da queimadura Black Beet (BBSV) . A proteína foi projetada como uma substituição ao quadro de leitura aberto de proteína de revestimento da BBSV. A imunização oral de ratinhos BALB/c fêmeas com a proteína VP6 baseada em plantas induziu altos títulos de mucosa IgA anti-VP6 e IgG sérica (Zhou et al., 2010). O grupo, no entanto, não mencionou se as proteínas VP6 se montaram em VLPs ou partículas.
Rotavirus VP7 também foi expresso com sucesso em plantas de tabaco e mostrou manter sua resposta imune neutralizante em ratinhos (Yu e Langridge, 2001) . Outro estudo usando plantas de batata transgénicas para expressar VP7 mostrou que o gene VP7 era estável em 50 gerações nas plantas transformadas. A proteína VP7 da 50a geração induziu anticorpos protetores e neutralizantes em ratinhos adultos (Li et al·., 2006).
Yang et al. (Yang YM, Li X, Yang H, et al., 2011) co-expressaram três proteínas de cápside de rotavirus VP2, VP6 e VP7 do grupo A RV (P [8] Gl) em plantas de tabaco e níveis de expressão dessas proteínas, bem como como a formação de partículas semelhantes a rotavirus e imunogenicidade foram estudados. As VLPs foram purificadas a partir de plantas de tabaco transgénicas e analisadas por mícroscopia eletrónica e Western blot. Yang et al. Os resultados indicam que a planta derivou a proteína VP2, VP6 e VP7 auto-montada em 2/6 ou 2/6/7 rotavirus como uma. partícula com um diâmetro de 60-iÉ nm,. A WO 01/59070 Al descreve um método para produzir proteínas estruturais de rotavirus recombinantes cultivando células de plantas transformadas e uma composição de vacina compreendendo o mesmo que no componente consecutivo. A pubiidiçid. de S:. .Saldana. .et al:. **;PS:dduçfeíoa oi rotavlpus-· .11¾ part leias. in tomato; lEYddpfôrdiddBi dsculépisM i.J. fruit. ;by· .aipréssipR: >®;£: eapsld proteins·. VP2 and. and, .isda^nduoigldai studies- dédOtève' ,â esipresS'Sd cie proteínas; dé; cápside de rotavirus V.P2 e VP6 em frutos de plantas de tomateiro transgénicas. A publicação de SD Trask et al.;,:. “Assembly, df Infectious. ^rotavirus partldles ireopatéd· uiih rfpombin.ant outer1 capsid proteins" déscréve. partículas de rotavirus de camada dupla recobertas com recomhinantes VP4 e VP7. A publicação de YM Yang et al., f8itrftunoqdn:i'Oa:tf'· and tipua-lite partidié: formation oif rotavirus capsid proteins produced in transgenic plants" descreve a expressão estável, extração e purificação ':etd ptOiSiMS: dd rotavirus': W$! e "W7 d® idaptimedto·: completo em plantas de tabaco do promoter 355.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à produção de proteínas estruturais de rotavirus em plantas. Mais espeeificamente, a presente invenção também se relaciona com a produção de particular ae^lbaateS: a virai edripisendendd .ptotéinã: estrutural. .de rotavirus ;#m plantai::.
De acordo com a presente invenção, é proporcionado um método para produzir uma partícula de tipo rotavirus (RLP) numa planta de acordo com a reivindicação 1 compreendendo: a) Introduzir um primeiro ácido nucleico compreendendo uma primeira região reguladora ativa na planta ligada operacionalmente a uma primeira sequência de nucleótidos que codifica uma primeira proteína estrutural de rotavirus selecionada de uma de VP2, VP6 e VP7, um segundo ácido nucleico compreendendo uma segunda região reguladora ativa em a planta ligada operativamente a uma segunda sequência de nucleótidos que codifica uma segunda proteína estrutural de rotavirus selecionada de uma VP2, VP6 e VP7 e um terceiro ácido nucleico compreendendo uma terceira região reguladora ativa na planta ligada operacionalmente a uma terceira sequência de nucleótidos que codifica uma terceira estrutura de rotavirus proteína selecionada de uma VP2, VP6 e VP7 na planta, porção de uma célula de planta ou planta, em que a primeira, segunda ou terceira sequência de nucleótidos que codifica a VP7 compreende um péptido de sinal nativo truncado ou um péptido de sinal não nativo a partir de uma planta polipéptido, e em que o RLP compreende VP2, VP6 e VP7; ou a) Fornecer uma planta, uma porção de uma célula vegetal ou vegetal compreendendo um primeiro ácido nucleico que compreende uma primeira região reguladora ativa na planta ligada operativamente a uma primeira sequência nucleotídica que codifica uma primeira proteína estrutural de rotavirus, um segundo ácido nucleico compreendendo uma segunda região reguladora ativa na planta ligada operativamente a uma segunda sequência de nucleótidos que codifica uma segunda proteína estrutural de rotavirus e um terceiro ácido nucleico compreendendo uma terceira região reguladora ativa na planta ligada operativamente a uma terceira sequência de nucleótidos que codifica uma terceira proteína estrutural de rotavirus na planta, a porção de uma planta ou célula vegetal; em que a primeira proteína estrutural de rotavirus é VP2, a segunda proteina estrutural de rotavirus é VP6 e a terceira proteína estrutural de rotavirus é VP7, em que VP7 compreende um péptido de sinal nativo truncado ou um péptido de sinal não nativo a partir de um polipéptido de planta; b) Incubar a planta, porção de uma planta ou célula vegetal em condições que permitem a expressão transitória do primeiro, segundo e terceiro ácido nucleico, produzindo desse modo o RLP, c) Colher a planta, porção da planta ou célula vegetal, e d) Extrair e purificar as RLP da planta, parte da planta ou célula vegetal, na presença de cálcio, em que a concentração de cálcio está entre 1 mM e 1000 mM.
Além disso, um quarto ácido nucleico que compreende uma quarta região reguladora ativa na planta e operativamente ligado a uma quarta sequência de nucleótidos que codifica uma quarta proteína estrutural de rotavirus pode ser introduzida na planta, porção de uma planta ou célula vegetal no passo a) e é expresso ao incubar a planta, porção de uma planta ou célula vegetal no passo b).
No método como descrito acima, a primeira proteína estrutural de rotavirus pode ser VP2, a segunda proteína estrutural de rotavirus pode ser VP6 e a terceira proteína estrutural de rotavirus pode ser VP7. Além disso, a quarta proteína estrutural de rotavirus pode ser VP4. 0 VP4 pode ser processado ou clivado para produzir VP5 e VP8. A clivagem de VP4 pode ser realizada usando uma protéase, por exemplo, tripsina, uma protéase do tipo tripsina, uma serina protéase, uma protéase do tipo quimotripsina ou uma subtilisina. A protéase pode ser co-expressa dentro da planta.
Além disso, no método, um ácido nucleico adicional pode ser expresso na planta, porção de uma planta ou célula vegetal, e em que o ácido nucleico adicional compreende uma região reguladora ativa na planta ligada operativamente a uma sequência de nucleótidos que codifica um supressor de silenciamento. 0 uso de codão da sequência de nucleótidos pode ser ajustado para o uso de codão humano preferido, aumento do conteúdo de GC ou uma combinação destes. A proteína estrutural de rotavirus compreende um péptido de sinal truncado nativo ou não-nativo. 0 péptido de sinal não nativo pode ser um péptido de sinal de proteína dissulfureto isomerase (PDI). A primeira, a segunda, a terceira ou a quarta sequência de nucleótidos ou a sua combinação podem ser operativamente ligadas a uma região reguladora do vírus do mosaico do Cowpea (CPMV) . 0 método como descrito acima compreende os passos de: c) colheita da planta, porção de uma planta ou célula vegetal, e d) purificação das RLP da planta, porção de uma planta ou célula vegetal.
Durante o passo de colheita ou purificação no método, VP4 pode ser processado ou clivado para produzir VP5 e VP8 usando tripsina, uma protéase do tipo tripsina, uma serina protéase, uma protéase do tipo quimotripsina, subtilisina.
Os RLPs podem variar de tamanho de 7 0-100 nm e são purificados na presença de cálcio.
A presente invenção proporciona um RLP produzido pelo método como descrito acima. O RLP produzido pode compreender, pelo menos, uma proteína estrutural de rotavirus a VP4. O VF4 pode ser clivado em VP5 e VP8 usando uma protéase, por exemplo, tripsina, uma protéase do tipo tripsina, uma serina protéase, uma protéase do tipo quimotripsina, subtilisina. A protéase pode ser co-expressa dentro da planta ou adicionada durante a colheita, a purificação ou ambas. Além disso, o RLP produzido pelo método pode ser um RLP de duas camadas e/ ou um RLP de camada tripla.
Além disso, são fornecidas sequências de nucleótidos. A sequência de nucleótidos que codifica VP2 pode compreender de 80% a 100% de identidade com uma sequência de nucleótidos como definida por SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 45. A sequência de nucleótidos que codifica VP6 pode compreender de 80% a 100% de identidade com uma sequência de nucleótidos como definida pela SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 46. A sequência de nucleótidos que codifica VP7 pode compreender de 80% a 100% de identidade com uma sequência de nucleótidos como definida por SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 ou 57. E a sequência de nucleótidos que codifica VP4 pode compreender de Identidade de 80% a 100% com uma sequência de nucleótidos como definida por SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 ou 51. Além disso, VP2 pode ser codificada por uma sequência de aminoácidos compreendendo de 80% a 100% de identidade com o amino sequência de ácido definida por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 25. O VP6 pode ser codificado por uma sequência de aminoácidos compreendendo de 80% a 100% de identidade com a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 31. VP7 pode ser codificada por uma sequência de aminoácidos compreendendo de 80% a 100% de identidade com a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 4, 39, 43 ou 59. VP4 pode ser codificado por uma sequência de aminoácidos compreendendo de 80% a 100% de identidade com a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 36. 33. A uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus podem ser VP2, VP4, VP6 e/ou VP7. O VP4 pode ser processado para VP5 e VP8. A uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus podem ser selecionadas da estirpe de rotavirus G9 P [6], estirpes de rotavirus A WA, vacina de rotavirus A vacina USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] e estirpe de rotavirus SA11.
No método como descrito acima, a primeira, segunda ou terceira sequência de ácido nucleico ou uma sua combinação podem compreender uma região reguladora ativa na planta ligada operacionalmente a um ou mais que um potenciador de comovirus, a um ou mais de um elemento de amplificação e a uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína estrutural de rotavirus, e em que um quarto ácido nucleico que codifica uma replicase pode ser introduzido na planta, porção de uma planta ou célula vegetal. A presente invenção proporciona um RLP produzido pelo método como descrito acima. 0 RLP pode compreender três ou mais proteínas estruturais de rotavirus que podem compreender N-glicanos específicos de planta ou N-glicanos modificados. A presente invenção inclui uma composição compreendendo uma dose eficaz do RLP produzido pelo método, como acabou de descrever, para induzir uma resposta imune e um veículo farmaceuticamente aceitável. A divulgação adicional, mas não dentro do âmbito das reivindicações, é um método de induzir imunidade a uma infeção por rotavirus em um indivíduo, compreendendo a administração do RLP como acabou de ser descrito, ao sujeito. 0 RLP pode ser administrado a um indivíduo por via oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea. A presente descrição também proporciona matéria vegetal compreendendo um RLP produzido pelo método (A) , como descrito acima. A matéria da planta pode ser utilizada para induzir imunidade a uma infeção pelo vírus do rotavirus em um assunto. A matéria da planta também pode ser adicionada como suplemento alimentar.
No método como descrito acima, a planta ou porção da planta pode ainda ser administrada com ou ainda compreender outra sequência de ácido nucleico que codifica um supressor de silenciamento.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Estas e outras características da invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir da descrição a seguir em que se faz referência aos desenhos anexos em que: A FIGURA 1 mostra a estrutura de rotavirus e a atribuição de proteínas genéticas. (A) Microscopia eletrónica de transmissão de partículas de rotavirus (a barra representa lOOnm). (B) Organização das proteínas da cápside do vírus compreendendo interior, intermediário e externo. (C) segmentos de dsARN de rotavirus dispostos de acordo com o tamanho e a função. 0 dsARN pode ser separado por eletroforese em gel de poliacrilamida (D). As proteínas em (C) são indicadas por segmentos dsARN em (D) . Imagens de Crawford et al., 1997 (A), Instituto Suíço de Bioinformática, 2008 (B) e Greenberg e Estes, 2009 (D). A Figura 2 mostra entrada e replicação de células de rotavirus. Quando o rotavirus entra em uma célula, VP4 e VP7 são perdidos, formando uma partícula dupla (DLP). A transcrição do dsARN começa resultando na tradução de VP2, VP4, VP6 e VP7. Os núcleos de progénies com atividade de replicase são produzidos em fábricas de vírus (também chamadas de viroplasmas). A transcrição tardia ocorre nesses núcleos de progenitura. Na periferia das fábricas de vírus, esses núcleos são revestidos com VP6, formando DLPs imaturos que brotam através da membrana do retículo endoplasmático, adquirindo uma membrana lipídica transitória que é modificada com as glicoproteínas virais residenciais ER residentes NSP4 e VP7; essas partículas envolvidas também contêm VP4. À medida que as partículas se movem para o interior das cisternas ER, a membrana lipídica transitória e a proteína não estrutural NSP4 são perdidas, enquanto as proteínas de superfície de vírus VP4 e VP7 reorganizam para formar a camada de proteína de vírus mais externa, produzindo partículas infeciosas de camada tripla infeciosas (ver Instituto Suíço de Bioinformática (ViralZone):viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/l 07.html). A FIGURA 3 mostra vetores de Agrobacterium pTRAc, pTRAkc-rbcsl-cTP e pTRAkc-ERH. P35SS, promotor CaMV 35S com amplificador de transcrição duplicado; CHS, chalcone sintase 5'região não traduzida; pA35S, sinal de poliadenilação CaMV 35S; SAR, região de fixação do andaime do gene Rb7 do tabaco; LB e RB, as margens esquerda e direita para integração T-ADN; ColElori, origem de replicação para E. coli; RK2ori, origem de replicação para Agrobacterium; bla, gene bla da resistência à ampicilina/carbenicilina; LPH, sequência sinal-péptido da cadeia pesada mAb24 murina; his6, 6 x His tag sequence; SEKDEL, sequência do sinal de retenção de ER; rbcsl-cTP, sequência peptídica de tritão de cloroplasto de um gene de subunidade pequena Rubisco (rbcSl) de Solanum tuberosum; npt II, resina de kanamicina npt II gene; Pnos e pAnos, sinal de promotor e poliadenilação do gene da nopalina sintase (Maclean et al., 2007). A Figura 4 mostra uma visão geral do procedimento de clonagem e infiltração de rotavirus. A Figura 5 mostra um procedimento de extração de proteína apoplástica. (A) Ilustração da célula da planta e localização do apoplasto. As proteínas VP são expressas no citosol e direcionadas para o apoplasto (seta vermelha). (B) - Após o teste de tempo, a folha da planta é infiltrada a vácuo com PBS (1) e colocada em uma coluna de rotação perfurada (2) e centrifugada em um tubo Eppendorf de 2 ml para coletar a seiva (3). A Figura 6 mostra um western blots de expressão da proteína VP6 de rotavirus em compartimentos das células da folha da planta ao longo de 7 dias. 0 anticorpo VP6 anti-rotavírus do mouse (1: 5000) foi usado para sondar as membranas. (+) e (-) indicam expressão com ou sem supressor de silenciamento, respetivamente. As linhas vermelhas indicam a posição das proteínas VP6 nas várias amostras analisadas (~ 40 kDa). A expressão e eficiência de extração de VP6 foi melhor no citoplasma. A Figura 7 mostra uma mancha de Western que mostra a expressão individual de proteínas de rotavirus identificadas no dia 3 no citoplasma das folhas da planta de N. benthamiana. + ve - rotavirus bacteriano expresso VP2; M -marcador de peso molecular; VP - proteína de cápside de rotavirus. A infiltração de VP7 resultou em amarelecimento das folhas (b). A Figura 8 mostra a expressão do rotavirus VP2 (a) e VP4 (b) direcionado para vários compartimentos de células de folha de planta de N. benthamiana no dia 3. O respetivo soro anti-rotavírus de frango (1: 2000) para VP2 e VP4 foram utilizados para sondar a proteínas. cTp - cloroplastos; ER - retículo endoplasmático; pTRAc - citoplasma; A - apoplast; Controlo negativo (-ve) - plantas infiltradas apenas com o supressor silenciador; Controle positivo (+ ve) em (a) - VP2 bacteriana expressa, (b) - VP4 bacteriana expressa; {- e +) com ou sem supressor silenciador; M - marcador de peso molecular. As setas indicam a posição das bandas de proteína em questão.
A Figura 9 mostra a análise Western Blot dos extratos do dia 3 de VP2/6/4 co-expressos no citoplasma de folhas de N. benthamiana. As proteínas foram sondadas com uma mistura de soro anti-rotavírus de frango (anti-VP2 (1/5000) e anti-VP4 (1/5000)) e anticorpo anti-VP6 de mouse (1: 5000). A infiltração de Agrobacterium recombinante foi feita com o supressor silenciador. Controle negativo (-ve) - plantas inteiras infiltradas apenas com o supressor silenciador; M - marcador de peso molecular. A Figura 10 mostra micrografias de eletrões das proteínas de rotavirus extraídas pelo citoplasma do dia 3 coradas com acetato de uranilo, (a) Extrato de amostra de proteína negativa com supressor de silenciamento; (b) extrato de proteína VP6; (c) extrato de proteína VP2/6 e (d) extrato de proteína VP2/6/4. Barras = 200 nm. Todas as RLP detetadas estavam entre 70 e 100 nm de diâmetro. A flecha dentro (b) indica uma bainha / esfregaço VP6. A seta em (c) indica um exemplo de um RLP. Todas as proteínas foram expressas na presença de um supressor silenciador. Todos foram capturados com anticorpo anti-VP6 de mouse (1:2000). A Figura 11 mostra a purificação do gradiente de sacarose de VP2/6 co-expressas e VP2/6/4 (a). As manchas de gradiente de sacarose VP2/6 purificado (b) e VP2/6/4 (c) . Os extratos de proteínas foram carregados em um gradiente de sacarose (10 - 60%) e ultracentrifugados. As frações foram analisadas por sondagem com (b) anticorpo anti-VP6 de mouse (1:5000) e (c) soro anti-VP2 e VP4 de frango (1:5000). A Figura 12 mostra a análise de Western Blot das frações de VP2/6 (a) , a fotografia de gel manchada de coomassie SDS-PAGE das frações das frações VP2/6 16 e 17 (b) e a análise de Western Blot das frações 16 e 17 (c) . O anti-VP6 de ratinho (1: 5000) e o soro anti-VP2 de frango (1:5000) foram utilizados no western blot (a) e apenas o rato anti-VP6 (1: 5000) em (c). Controlo negativo (- ve) em (a) e (c) - VP4 bacteriana expressa, e em (b) - plantas infiltradas com supressor silenciador e gradiente de sacarose purificado; extrato bruto VP2/6 não purificado; Controlo positivo (+ ve) em (a) - VP2 bacteriana expressada, (b) e (c) - planta VP6 expressada; Proteína VP6-SF9-VP6 de concentração conhecida expressa em células de insetos SF9. As setas indicam bandas de proteína de interesse. A Figura 13 mostra o ensaio de proteína solúvel total em frações de VP2/6 purificado por gradiente de densidade de sacarose, (a) - curva padrão de IgG, (b) - leituras de absorvência das frações tomadas a 750 nm. Pontos de interesse: frações 16 a 19. A Figura 14 mostra a análise do gradiente de densidade de sacarose das frações VP2/6/4 co-expressas de citoplasma. As leituras de absorvência bruta a 750nm foram realizadas para verificar os picos de proteínas previamente detetados na mancha de ponto de VP2/6/4. A Figura 15 mostra micrografias eletrónicas de transmissão de partículas VP2/6 purificadas por gradiente de densidade de sacarose. Ambos (a) e (b) mostram duas seções diferentes vistas na grade de cobre. Todas as RLP detetadas estavam entre 70 e 100 nm de diâmetro. As amostras foram capturadas com anticorpo anti-VP6 de rato (1:2000). As barras representam 200 nm. A Figura 16a mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) e as sequências nucleotídicas do Rotavirus VP2 (SEQ ID NO: 13 e 14). A Figura 16b mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) e as sequências de nucleótidos do Rotavirus VP4 (SEQ ID NO: 15 e 16). A Figura 16c mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) e as sequências de nucleótidos do Rotavirus VP6 (SEQ ID NO: 17 e 18) . A Figura 16d mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) e as sequências de nucleótidos do Rotavirus VP7 (SEQ ID NO: 19 e 20). A Figura 17A mostra a sequência de nucleótidos do iniciador IF-WA_VP2 (opt). si + 3c (SEQ ID NO: 21) , A Figura 17B mostra a sequência de nucleótidos do iniciador IF-WA_VP2 (opt).sl-4r (SEQ ID NO: 22) . A Figura 17C mostra uma representação esquemática da construção 1191. Os locais das enzimas de restrição SacII e StuI utilizados para a linearização do plasmideo são anotados na representação. A Figura 18 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 23) da construção 1191 das bordas de ADN-T da esquerda para a direita (sublinhadas). 2X35S/CPMV-HT/NOS com cassete de expressão de inibidor de silenciamento de Plastocianina-Pl9-Plastocianina. A Figura 19 mostra a sequência de nucleótidos que codifica VP2 (opt) da estirpe Rotavirus A WA (SEQ ID NO: 45). A Figura 20 mostra a sequência de aminoácidos de VP2 da estirpe Rotavirus A WA (SEQ ID NO: 25). A Figura 21 mostra uma representação esquemática da construção número 1710. A Figura 22A mostra uma representação esquemática da construção 193. Os locais das enzimas de restrição SacII e StuI utilizados para a linearização do plasmideo são anotados na representação. A Figura 22B mostra a sequência de nucleótidos da construção 193 (SEQ ID NO: 26). A construção 193 é mostrada das margens do ADN-t da esquerda para a direita (sublinhadas). 2X35S/CPMV-HT/NOS no sistema de amplificação BeYDV (m) + Replicase com cassete de expressão de inibidor de silenciamento de Plastocianina-Pl9-Plastocianina. A Figura 23 mostra a sequência de nucleótidos da cassete de expressão 1710 (SEQ ID NO: 27) . O número de cassete de expressão 1710 é mostrado a partir do promotor 2X35S para o terminador NOS. VP2 (opt) da estirpe de Rotavirus A WA está sublinhada. A Figura 24 mostra uma representação esquemática da construção número 1711. A Figura 25A mostra a sequência de nucleótidos do iniciador IF-WA_VP6 (opt) . si + 3c (SEQ ID NO: 28) . A Figura 25B mostra a sequência de nucleótidos do iniciador IF-WA_VP6 (opt).sl-4r (SEQ ID NO: 29). A Figura 25c mostra o número da cassete de expressão 1713 do promotor 2X35S ao terminador NOS (SEQ ID NO: 30) . VP6 (opt) da estirpe de Rotavirus A WA está sublinhada. A Figura 25d mostra a sequência de nucleótidos que codifica VP6 (opt) da estirpe Rotavirus A WA (SEQ ID NO: 46) A Figura 26 mostra a sequência de aminoácidos de VP6 da estirpe Rotavirus A WA (SEQ ID NO: 31). A Figura 27 mostra a representação esquemática do número de construção 1713. A Figura 28 mostra a sequência de nucleótidos do número de cassete de expressão 1714 do promotor 2X35S ao terminador NOS (SEQ ID NO: 32). VP6 (opt) da estirpe de Rotavirus A WA está sublinhada. A Figura 29 mostra uma representação esquemática do número de construção 1714. A Figura 30A mostra a sequência de nucleótidos do iniciador IF-Rtx_VP4 (opt) . si + 3c (SEQ ID NO: 33) . A Figura 30B mostra a sequência de nucleótidos do iniciador IF-Rtx_VP4 (opt).sl-4r (SEQ ID NO: 34). A Figura 31A mostra a sequência de nucleótidos da cassete de expressão número 1731 do promotor 2X35S ao terminador NOS (SEQ ID NO: 35). VP4 (opt) da estirpe de Rotavirus A Rotarix está sublinhada. A Figura 31B mostra a sequência de codificação otimizada da estirpe de Rotavirus A VP4 da estirpe RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] (SEQ ID NO: 47). A Figura 31C mostra a sequência de nucleótidos da cassete de expressão número 1730 do promotor 2X35S ao terminador NOS (SEQ ID NO: 44) . VP4 (opt) da estirpe de Rotavirus A Rotarix está sublinhada. A Figura 32 mostra a sequência de aminoácidos de VP4 da estirpe Rotavirus A Rotarix (SEQ ID NO: 36). A Figura 33A mostra uma representação esquemática do número de construção 1730. A Figura 33B mostra uma representação esquemática do número de construção 1731. A Figura 34A mostra a sequência de nucleótidos do iniciador IF-Rtx_VP7 (opt) .si + 3c (SEQ ID NO: 37) . A Figura 34B mostra a sequência de nucleótidos do iniciador IF-Rtx_VP7 (opt).sl-4r (SEQ ID NO: 38) . A Figura 34C mostra a sequência de nucleótidos da cassete de expressão número 1733 do promotor 2X35S ao terminador NOS. VP7 da vacina de Rotavirus A USA/ Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] é sublinhada (SEQ ID NO: 24) . A Figura 34D mostra a sequência de nucleótidos que codifica a VP7 da vacina da estirpe de Rotavirus A USA/ Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] (SEQ ID NO: 48) . A Figura 34E mostra a sequência de codificação otimizada da estirpe de Rotavirus A VP7 RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/ G1P1A [8] (SEQ ID NO 54) . A Figura 35 mostra a sequência de aminoácidos de VP7 da vacina USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] de Rotavirus A (SEQ ID NO: 39). A Figura 36 mostra uma representação esquemática da construção número 1733. A Figura 37 mostra a sequência de nucleótidos do iniciador IF-Rtx_VP7 (opt).s2 + 4c (SEQ ID NO: 40). A Figura 38 mostra uma representação esquemática da construção 1192. Os locais da enzima de restrição SacII e StuI utilizados para a linearização do plasmideo são anotados na representação. A Figura 39 mostra a sequência de nucleótidos da construção 1192 das bordas do ADN-T da esquerda para a direita (sublinhadas) (SEQ ID NO: 41) . 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS com cassete de expressão de inibidor de silenciamento de
Plastocianina-Pl9-Plastocianina são mostrados. A Figura 40A mostra a sequência de nucleótidos da cassete de expressão número 1735 do promotor 2X35S ao terminador NOS (SEQ ID NO: 42). PDISP / VP7 (opt) de estirpe Rotavirus A vacina EUA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] é sublinhada. Figura 40B Sequência de nucleótido que codifica PDISP/VP7 (opt) da vacina da estirpe de Rotavirus A USA/ Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] (SEQ ID NO: 49). A Figura 41 mostra a sequência de aminoácidos de PDISP/VF7 da vacina da estirpe de Rotavirus A USA/Rotarix-A41CB052A/ 1988/GlPlA [8] (SEQ ID NO: 43). A Figura 42 mostra uma representação esquemática da construção número 1735. A Figura 43A mostra a sequência de codificação do Rotavirus A VP4 da estirpe RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B [2] (SEQ ID NO: 50). A Figura 43B mostra a sequência de codificação otimizada da estirpe do Rotavirus A VP4 RVA/ Simian-tc/ZAF/SA11-H96/1958/G3PSB [2] (SEQ ID NO: 51) . A Figura 43C mostra a sequência de codificação da estirpe do Rotavirus A VP7 RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B [2] (SEQ ID NO: 52) . A Figura 43D mostra uma sequência de codificação otimizada da estirpe do Rotavirus A VP7 RVA/ Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B [2] (SEQ ID NO: 53). A Figura 44A mostra a sequência de nucleótidos do iniciador IF-TrSP + Rtx_VP7 (opt).sl + 3c (SEQ ID NP: 55). A Figura 44B mostra a sequência de nucleótidos do iniciador IF-Rtx_VP7 (opt) .sl-4r (SEQ ID NO: 56) . A Figura 44C mostra a sequência de nucleótidos da sequência de codificação otimizada da estirpe do Rotavirus A VP7 RVA/Vaccine/USA/ Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] (SEQ ID NO: 57) . A Figura 44D mostra a sequência de nucleótidos do número de cassete de expressão 1734 do promotor 2X35S ao terminador NOS (SEQ ID NO 58) . VP7 da estirpe de Rotavirus A Vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/ 1988/G1P1A [8] é sublinhada. A Figura 44E mostra a sequência de aminoácidos de TrSp-VP7 da vacina de Rotavirus A USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] (SEQ ID NO: 59). Figura 44F mostra a representação esquemática do número de construção 1734. A Figura 45 mostra a purificação de partículas semelhantes a rotavirus compreendendo VP2 e VP6 por centrifugação com gradiente de densidade de iodixanol. Figura 45A Análise SDS-PAGE manchada com Coomassie da carga antes da centrifugação e das frações 1 a 10 (a fração 1 está na parte inferior do tubo). A posição dos antígenos do rotavirus é mostrada por setas. Figura 45B Análise de transferência de Western das mesmas frações que em (A) usando um anticorpo anti-rotavírus policlonal de coelho. Figura 45C Análise de transferência de Western das mesmas frações que em (A) usando um anticorpo policlonal anti-VP2 de coelho. A Figura 46 mostra a purificação de partículas semelhantes a rotavirus compreendendo VP2, VP6 e VP7 por centrifugação com gradiente de densidade de iodixanol. Figura 46A Análise SDS-PAGE corada com Coomassie da carga antes da centrifugação e as frações 1 a 10 (a fração 1 está na parte inferior do tubo). A posição dos antígenos do rotavirus é mostrada por setas. Figura 46B Análise de transferência de Western das mesmas frações que em (A) usando um anticorpo anti-rotavírus policlonal de coelho. Figura 46C Análise de transferência de Western das mesmas frações que em {A) utilizando um anticorpo policlonal anti-VP7 de coelho. A Figura 47 mostra a purificação de partículas semelhantes a rotavirus compreendendo VP2, VP4, VP6 e VP7 por centrifugação com gradiente de densidade de iodixanol. Figura 47A Análise SDS-PAGE manchada com Coomassie da carga antes da centrifugação e das frações 1 a 10 (a fração 1 está na parte inferior do tubo) . A posição dos antígenos do rotavirus é mostrada por setas. Figura 47B Análise de transferência de Western das mesmas frações que em (A) usando um anticorpo anti-rotavírus policlonal de coelho. Figura 47C Análise de transferência de Western das mesmas frações que em (A) usando um anticorpo policlonal anti-VP7 de coelho. A Figura 48 mostra a avaliação do conteúdo de VP4 em partículas de tipo rotavirus purificadas compreendendo VP2, VP4, VP6 e VP7 por ELISA específico anti-VP4. A Figura 49 mostra a imagem de microscopia de crio-eletrão de partículas de rotavirus purificadas que compreendem VP2 e VP6 (painel esquerdo) e VP2, VP4, VP6 e VP7 (painel direito).
DESCRIÇÃO DETALHADA A descrição a seguir é de uma forma de realização preferida. A presente invenção refere-se a partículas semelhantes a vírus (VLPs) compreendendo uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus (isto é, uma partícula de rotavirus, VLP de rotavirus ou RLP) e métodos de produção de partículas de rotavirus (RLPs) em plantas. A partícula de rotavirus (RLP) pode, portanto, compreender uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus. 0 RLP pode ser de duas camadas ou três camadas. A presente invenção proporciona, em parte, um método de produção de uma partícula semelhante a rotavirus (RLP) numa planta de acordo com a reivindicação 1. 0 método compreende a introdução de um primeiro ácido nucleico que compreende uma primeira região reguladora ativa na planta ligada operativamente a uma primeira sequência de nucleótidos codificando uma primeira proteína estrutural de rotavirus selecionada de uma de VP2, VP6 e VP7, um segundo ácido nucleico compreendendo uma segunda região reguladora ativa na planta operativamente ligada a uma segunda sequência de nucleótidos que codifica uma segunda proteína estrutural de rotavirus selecionada a partir de VP2, VP6 e VP7 e um terceiro ácido nucleico compreendendo uma terceira região reguladora ativa na planta ligada operativamente a uma terceira sequência de nucleótidos que codifica uma terceira proteína estrutural de rotavirus selecionada de uma de VP2, VP6 e VP7 na planta, porção de uma célula de planta ou planta, em que a primeira, segunda ou terceira sequência de nucleótidos que codificam a VP7 compreende um péptido de sinal nativo truncado ou um péptido de sinal não nativo a partir de um polipéptido de planta, e em que o RLP compreende VP2, VP6 e VP7; ou fornecendo uma planta, uma porção de uma planta ou célula vegetal compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo uma primeira região reguladora ativa na planta operativamente ligada a uma primeira sequência de nucleótidos que codifica uma primeira proteína estrutural de rotavirus, um segundo ácido nucleico compreendendo uma segunda região reguladora ativa em a planta ligada operativamente a uma segunda sequência de nucleótidos que codifica uma segunda proteína estrutural de rotavirus e um terceiro ácido nucleico compreendendo uma terceira região reguladora ativa na planta ligada operativamente a uma terceira sequência de nucleótidos que codifica uma terceira proteína estrutural de rotavirus na planta, porção de uma planta ou célula vegetal; em que a primeira proteína estrutural de rotavirus é VP2, a segunda proteína estrutural de rotavirus é VP6 e a terceira proteína estrutural de rotavirus é VP7, em que VP7 compreende um péptido de sinal nativo truncado ou um péptido de sinal não nativo a partir de um polipéptido de planta; incubando a planta, porção de uma planta ou célula vegetal em condições que permitem a expressão transitória do primeiro, segundo e terceiro ácido nucleico, produzindo desse modo o RLP, colhendo a planta, parte da planta ou célula vegetal, e extraindo e purificando os RLPs da planta, parte da planta ou célula vegetal, na presença de cálcio, em que a concentração de cálcio está entre 1 mM e 1000 mM. A "proteína estrutural de rotavirus" pode referir-se a toda ou uma porção de uma sequência de proteína estrutural de rotavirus isolada a partir de rotavirus, presente em qualquer cepa ou isolante de rotavirus natural ou variante. Assim, o termo proteína estrutural de rotavirus e semelhantes incluem variantes de sequências de proteínas estruturais de rotavirus que ocorrem naturalmente produzidas por mutação durante o ciclo de vida do vírus ou produzidas em resposta a pressão seletiva {por exemplo, terapia medicamentosa, expansão de tropismo celular hospedeiro ou infecciosidade, etc.). Como um especialista na técnica se aprecia, tais sequências de proteínas estruturais de rotavirus e suas variantes podem também ser produzidas usando técnicas recombinantes.
Além disso, as proteínas estruturais podem incluir proteínas de cápside tais como, por exemplo, VP2 e VP6 e / ou proteínas de superfície como, por exemplo, VP4. A proteína estrutural pode ainda incluir, por exemplo, VP7.
Exemplos não limitantes de proteína estrutural de rotavirus são a proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6 e VP7 e um fragmento de VP2, VP4, VP6 e VP7. Os exemplos não limitativos de VP2, VP4, VP6 e VP7, ou fragmentos de proteínas VP2, VP4, VP6 e VP7 que podem ser utilizados de acordo com o presente invento incluem as VP2, VP4 VP6 e a proteína VP7 da estirpe de rotavirus G9 P [6], estirpe de rotavirus A WA, vacina de rotavirus A EUA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] e estirpe de rotavirus SA11.
Um exemplo de uma proteína estrutural de VP2, que não deve ser considerada limitante, é apresentado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 25. Além disso, a proteína estrutural VP2 pode compreender a sequência apresentada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25, ou uma sequência possuindo pelo menos cerca de 90-100% de similaridade de sequência com a mesma, incluindo qualquer percentagem de semelhança dentro destas gamas, tais como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similaridade de sequência com o mesmo. Além disso, uma proteína estrutural VP2 pode ser codificada por uma sequência de nucleótidos conforme estabelecido nas SEQ ID NO: 13, 14, 25 ou 45 ou uma sequência possuindo pelo menos cerca de 80-100% de similaridade de sequência com ela, incluindo qualquer percentagem de similaridade dentro estas gamas, tais como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similaridade de sequência com a mesma.
Um exemplo de uma proteína estrutural VP4, que não deve ser considerada como limitante, está estabelecida na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 36. Além disso, a proteína estrutural VP4 pode compreender a sequência apresentada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 36 ou uma sequência com pelo menos cerca de 90-100% de similaridade de sequência com a mesma, incluindo qualquer percentagem de similaridade dentro destas gamas, como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similaridade de sequência com o mesmo. Além disso, uma proteína estrutural VP4 pode ser codificada por uma sequência de nucleótidos conforme estabelecido nas SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 ou 51 ou uma sequência com pelo menos cerca de 80-100% de similaridade de sequência com ela, incluindo qualquer percentagem de similaridade dentro destas gamas, tais como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similaridade de sequência com a mesma.
Um exemplo de uma proteína estrutural VP6, que não deve ser considerada como limitante, é apresentado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 31. Além disso, a proteína estrutural VP6 pode compreender a sequência apresentada em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 31 ou uma sequência possuindo pelo menos cerca de 90-100% de similaridade de sequência com a mesma, incluindo qualquer percentagem de similaridade dentro destas gamas, como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similaridade de sequência com o mesmo. Além disso, uma proteína estrutural VP6 pode ser codificada por uma sequência de nucleótidos conforme estabelecido nas SEQ ID NO: 17, 18 ou 46 ou uma sequência possuindo, pelo menos, cerca de 80 a 100% de similaridade de sequência, incluindo qualquer percentagem de similaridade nestes intervalos, tais como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similaridade de sequência com o mesmo.
Um exemplo de uma proteína estrutural VP7, que não deve ser considerada como limitante, é apresentado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 47. Além disso, a proteína estrutural VP7 pode compreender a sequência apresentada em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 43, ou uma sequência possuindo, pelo menos, cerca de 90-100% de similaridade, incluindo qualquer percentagem de similaridade dentro estas gamas, tais como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similaridade de sequência com elas. Além disso, uma proteína estrutural de VP7 pode ser codificada por uma sequência de nucleótidos conforme estabelecido nas SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53 ou 54 ou uma sequência com pelo menos cerca de 80 a 100% de similaridade de sequência com ela, incluindo qualquer percentagem de similaridade dentro desses intervalos, como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de sequências da mesma. A similaridade ou identidade da sequência de aminoácidos pode ser calculada usando os programas BLASTP e TBLASTN que empregam o algoritmo BLAST (algoritmo básico de alinhamento local) 2.0. As técnicas para calcular a semelhança ou identidade da sequência de aminoácidos são bem conhecidas dos especialistas na técnica, e o uso do algoritmo BLAST é descrito emALTSCHUL et al. {1990, J Mol. Biol. 215: 403-410) e ALTSCHUL et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). O termo "partícula semelhante a vírus" (VLP) ou "partículas semelhantes a vírus" ou "VLPs" refere-se a estruturas que se auto-montam e compreendem uma ou mais proteínas estruturais, como por exemplo a proteína estrutural de rotavirus, por exemplo, mas não limitada para VP2, VP4, VP6 e/ou proteína estrutural VP7. As VLP que compreendem a proteína estrutural de rotavirus podem também ser referidas a "VLP de rotavirus", "partícula pareada a rotavirus (RVLP)", "partícula semelhante a rotavirus (RLP)", "partícula semelhante a rotavirus", "RVLP" ou "RLP". VLPs ou RLPs geralmente são morfologicamente e antigenicamente semelhantes aos viriões produzidos em uma infeção, mas carecem de informação genética suficiente para replicar e, portanto, não são infeciosas. As VLP podem ser produzidas em células hospedeiras adequadas incluindo células hospedeiras de plantas. Após a extração da célula hospedeira e após o isolamento e purificação adicional em condições adequadas, as VLPs podem ser purificadas como estruturas intactas. O RLP pode ser um RLP de uma única camada, dupla ou tripla. RLP de camada única pode ser obtido pela expressão de uma proteína estrutural de rotavirus, como VP2 ou VP6. As RLP de camada dupla podem ser obtidas expressando duas proteínas estruturais de rotavirus, como, por exemplo, por co-expressar VP2 e VP6, com ou sem VP4. As RLP de camada tripla podem ser obtidas pela expressão simultânea de pelo menos três proteínas estruturais de rotavirus, por exemplo, a co-expressão de VP2, VP6 e VP7, com ou sem VP4. A co-expressão de VP4 resulta em uma partícula com espigas que se assemelha ao rotavirus nativo. VP4 pode ser processado ou clivado para produzir VP5 e VP8. Este processamento pode ocorrer dentro do hospedeiro utilizando protéases endógenas, ou por co-expressão de uma protéase adequada, por exemplo, tripsina, uma protéase do tipo tripsina, uma serina protéase, uma protéase do tipo quimotripsina, subtilisina. Em alternativa, VP4 pode ser processado para produzir VP5 e VP8 adicionando uma protéase adequada, por exemplo, tripsina, uma protéase do tipo tripsina, uma serina protéase, uma protéase do tipo quimotripsina, subtilisina durante qualquer etapa do procedimento de extração de RLP ou após purificação de RLP.
Cada uma das proteínas estruturais de rotavirus tem caracteristicas e tamanho diferentes e é necessária em diferentes quantidades para montagem em RLP, 0 termo "VLP de rotavirus", "partícula semelhante a vírus de rotavirus (RVLP)", "partícula semelhante a vírus de rotavirus (RLP)", "partícula semelhante a vírus de rotavirus", "RVLP" ou "RLP" refere-se a um vírus partícula (VLP) compreendendo uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus. 0 exemplo de proteínas estruturais de rotavirus pode incluir, mas não está limitado a proteína estrutural VP2, VP4 (ou VP5 e VP8) VP6 e VP7.
No método de produção de RLPs numa planta de acordo com a invenção, um primeiro ácido nucleico (um primeiro ácido nucleico) que codifica uma primeira proteína estrutural de rotavirus, por exemplo uma proteína VP2 ou VP6, é co-expresso com um segundo ácido nucleico que codifica um segundo proteína estrutural de rotavirus, por exemplo, uma proteína VP6 ou VP2. Além disso, um terceiro ácido nucleico que codifica uma terceira proteína estrutural de rotavirus, por exemplo VP7 é co-expresso com o primeiro e segundo ácido nucleico de modo que o primeiro, o segundo ácido nucleico e os terceiros ácidos nucleicos são co-expressos na planta. 0 primeiro ácido nucleico, o segundo ácido nucleico e o terceiro ácido nucleico podem ser introduzidos na planta no mesmo passo, ou podem ser introduzidos na planta sequencialmente.
Além disso, uma planta que expressa um primeiro ácido nucleico que codifica uma primeira proteína estrutural de rotavirus, um segundo ácido nucleico que codifica uma segunda proteína estrutural de rotavirus e um terceiro ácido nucleico que codifica uma terceira proteína estrutural de rotavirus pode ser adicionalmente transformado com um quarto ácido nucleico que codifica um quarto proteína estrutural de rotavirus, por exemplo uma proteína VP7 ou VP4, de modo que o primeiro, o segundo ácido nucleico, o terceiro e o quarto ácidos nucleicos são co-expressos na planta. 0 VP4 pode ser processado ou clivado para produzir VP5 e VP8 dentro do hospedeiro co-expressando um ácido nucleico que codifica uma protéase adequada, por exemplo, tripsina, uma protéase do tipo tripsina, uma serina protéase, uma protéase do tipo quimotripsina, subtilisina. Em alternativa, VP4 pode ser processado durante qualquer passo de extração de RLP, ou após purificação de RLP por adição de uma protéase adequada, por exemplo, tripsina, uma protéase do tipo tripsina, uma serina protéase, uma protéase do tipo quimotripsina, subtilisina.
Conforme descrito em mais detalhes abaixo, as RLP podem ser produzidas em uma planta, expressando um ácido nucleico (um primeiro ácido nucleico) que codifica uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus selecionadas de VP2, VP6 ou VP7. Um segundo ácido nucleico que codifica uma segunda proteína estrutural de rotavirus selecionada de VP7, VP6 ou VP2 é co-expresso na planta. Além disso, um terceiro ácido nucleico que codifica uma terceira proteína estrutural de rotavirus selecionada de VP6, VP7 ou VP2 é co-expresso na planta. 0 primeiro ácido nucleico, o segundo ácido nucleico e o terceiro ácido nucleico podem ser introduzidos na planta no mesmo passo, ou podem ser introduzidos na planta sequencialmente. 0 ácido nucleico, o segundo ácido nucleico e o terceiro ácido nucleico podem ser introduzidos na planta de forma transitória ou de forma estável.
Além disso, uma planta que expressa um primeiro ácido nucleico que codifica uma primeira proteína estrutural de rotavirus, por exemplo uma proteína VP2, é transformada com um segundo ácido nucleico que codifica uma segunda proteína estrutural de rotavirus, por exemplo, mas não limitado a VP6 ou VP7, de modo que tanto a Primeiro e os segundos ácidos nucleicos são co-expressos na planta. A planta é ainda transformada com um terceiro ácido nucleico que codifica uma terceira proteína estrutural de rotavirus, por exemplo, mas não limitado a VP7 ou VP6.
Em alternativa, uma planta que expressa uma proteína VP6 ou VP7 (segundo ácido nucleico) é transformada com o primeiro ácido nucleico que codifica a proteína VP2, de modo que tanto o primeiro quanto o segundo ácidos nucleicos são co-expressos na planta. A planta é ainda transformada com um terceiro ácido nucleico que codifica uma terceira proteína estrutural de rotavirus, por exemplo, mas não limitado a VP7 ou VP6.
Além disso, uma planta que expressa um primeiro e segundo ácido nucleico que codifica uma primeira e segunda proteína estrutural de rotavirus, por exemplo uma proteína VP2 e VP6, é transformada com um terceiro ácido nucleico que codifica uma terceira proteína estrutural de rotavirus, por exemplo VP7. 0 método de produção de RLPs numa planta envolve a introdução de três ou mais ácidos nucleicos que codificam as referidas três ou mais proteínas estruturais de rotavirus ligadas operativamente a uma região reguladora ativa na planta e uma ou mais de uma sequência de segmentação de compartimento e/ ou elementos de amplificação, na planta, porção da planta ou célula vegetal. A planta, porção da planta ou célula vegetal é então incubada sob condições que permitem a expressão de um ou mais ácidos nucleicos, produzindo deste modo os RLPs. A uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus podem ser VP2, VP4 (ou VP5 e VP8), VP6, VP7 um fragmento do VP2, VP4 (ou VP5 e VP8), VP6, VP7 ou uma combinação destes. A presente descrição proporciona ainda uma RLP que compreende três ou mais proteínas estruturais de rotavirus, por exemplo, mas não se limitando a VP2, VP4 (ou VP5 e VP8), VP6, VP7 ou uma sua combinação. 0 RLP pode ser produzido por um ou mais dos métodos fornecidos pela presente invenção. A ocorrência de RLPs pode ser detetada utilizando qualquer método adequado, por exemplo, a centrifugação com gradiente de densidade ou cromatografia de exclusão por tamanho. As RLPs podem ser avaliadas quanto à estrutura e tamanho, por exemplo, microscopia eletrónica ou por cromatografia de exclusão de tamanho.
Para a cromatografia de exclusão de tamanho, as proteínas solúveis totais podem ser extraídas do tecido da planta por meio da amostra de homogeneização (Polytron) de material vegetal esmagado congelado em tampão de extração e material insolúvel removido por centrifugação. A precipitação com acetona gelada ou PEG também pode ser benéfica. A proteína solúvel é quantificada e o extrato passa através de uma coluna Sephacryl™, por exemplo, uma coluna Sephacryl™ S500. 0 Blue Dextran 2000 pode ser usado como um padrão de calibração. Após a cromatografia, as frações podem ser analisadas adicionalmente por imunotransferência para determinar o complemento proteico da fração. A fração separada pode ser, por exemplo, um sobrenadante (se centrifugado, sedimentado ou precipitado), ou um filtrado (se for filtrado) e é enriquecido em proteínas, ou proteínas de supraestrutura, como, por exemplo, nanotubos, nano esferas ou de ordem superior, maior peso molecular, partículas como RLPs de camada única (sl), de duas camadas (dl) ou de camada tripla (tl). A fração separada pode ser processada adicionalmente para isolar, purificar, concentrar ou uma combinação destes, proteínas, proteínas de supraestrutura ou partículas de ordem superior, por exemplo, etapas de centrifugação adicionais, precipitação, passos cromatográficos (por exemplo, exclusão de tamanho, permuta iónica, afinidade cromatografia) , filtração de fluxo tangencial ou uma combinação destes. A presença de proteínas purificadas, proteínas de supraestrutura ou partículas de ordem superior, tais como RLPs, pode ser confirmada, por exemplo, nativa ou SDS-PAGE, análise ocidental usando um anticorpo de detecção apropriado, eletroforese capilar, microscopia eletrónica ou qualquer outro método como seria evidente para um especialista na arte.
Os RLP produzidos de acordo com a presente invenção são purificados, parcialmente purificados a partir de uma planta, porção de uma planta ou matéria vegetal, ou podem ser administrados como uma vacina oral, utilizando métodos como são conhecidos para um especialista na técnica. A purificação de RLP pode envolver a centrifugação em gradiente, por exemplo, gradientes de densidade de sacarose, iodixanol, OptiPrep™ ou cloreto de césio (CsCl) podem ser utilizados para purificar ou purificar parcialmente os RLPs da biomassa da planta transformada. Conforme mostrado, por exemplo, na Figura 45, um gradiente de gradiente de iodixanol ou gradiente contínuo de iodixanol pode ser usado para purificar o RLP e/ou proteínas estruturais de rotavirus expressas. A concentração de cálcio (Ca2+) mostrou-se importante para a transformação de partículas de camada tripla (TLP) para partículas de dupla camada (DLP) e depende da deformação (ver, por exemplo, Martin et al. Journal of Virology, janeiro de 2002). A perda completa das proteínas de cápside externa de TLPs (decapsidação de TLP) ocorre na faixa nanomolar de [Ca2+]. Portanto, a purificação e/ou extração de RLP é realizada na presença de cálcio, e o passo de centrifugação em gradiente é realizado na presença de cálcio, por exemplo, no presente de CaC12. A concentração de CaC12 está entre 1 mM e 1000 mM, ou qualquer quantidade entre eles, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 50, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 mM ou qualquer quantidade entre eles.
As plantas, ou fragmentos de plantas podem ser minimamente processados. Pelo termo "processamento mínimo" entende-se matéria vegetal, por exemplo, uma planta ou sua porção compreendendo uma proteína de interesse e/ou a RLP que é parcialmente purificada para produzir um extrato de planta, homogeneizado, fração de homogeneizado de planta ou similar (isto é, processado minimamente). A purificação parcial pode compreender, mas não está limitada, a interrupção das estruturas celulares da planta, criando assim uma composição compreendendo componentes de plantas solúveis e componentes de plantas insolúveis que podem ser separados por exemplo, mas não se limitando a, por centrifugação, filtração ou uma combinação destes. A este respeito, as proteínas segregadas dentro do espaço extracelular da folha ou outros tecidos podem ser facilmente obtidas usando extração a vácuo ou centrífuga, ou os tecidos podem ser extraídos sob pressão por passagem através de rolos ou moagem ou semelhantes para espremer ou libertar a proteína livre do espaço extracelular. O processamento mínimo também pode envolver a preparação de extratos brutos de proteínas solúveis, uma vez que estas preparações teriam contaminação negligenciável de produtos vegetais secundários. Além disso, o processamento mínimo pode envolver a extração aquosa de proteína solúvel a partir de folhas, seguido de precipitação com qualquer sal adequado. Outros métodos podem incluir maceração em grande escala e extração de suco para permitir o uso direto do extrato. As RLP podem ser purificadas ou extraídas utilizando qualquer método adequado, por exemplo, extração mecânica ou bioquímica. 0 processamento mínimo também pode envolver a preparação de extratos brutos de proteínas solúveis, uma vez que estas preparações teriam contaminação negligenciável de produtos vegetais secundários. Além disso, o processamento mínimo pode envolver a extração aquosa de proteína solúvel a partir de folhas, seguido de precipitação com qualquer sal adequado. Outros métodos podem incluir maceração em grande escala e extração de suco para permitir o uso direto do extrato. As RLP podem ser purificadas ou extraídas utilizando qualquer método adequado, por exemplo, extração mecânica ou bioquímica. 0 processamento mínimo também pode envolver a preparação de extratos brutos de proteínas solúveis, uma vez que estas preparações teriam contaminação negligenciável de produtos vegetais secundários. Além disso, o processamento mínimo pode envolver a extração aquosa de proteína solúvel a partir de folhas, seguido de precipitação com qualquer sal adequado. Outros métodos podem incluir maceração em grande escala e extração de suco para permitir o uso direto do extrato. As RLP podem ser purificadas ou extraídas utilizando qualquer método adequado, por exemplo, extração mecânica ou bioquímica, seguido de precipitação com qualquer sal adequado. Outros métodos podem incluir maceração em grande escala e extração de suco para permitir o uso direto do extrato. As RLP podem ser purificadas ou extraídas utilizando qualquer método adequado, por exemplo, extração mecânica ou bioquímica, seguido de precipitação com qualquer sal adequado. Outros métodos podem incluir maceração em grande escala e extração de suco para permitir o uso direto do extrato. As RLP podem ser purificadas ou extraídas utilizando qualquer método adequado, por exemplo, extração mecânica ou bioquímica. A uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus podem ser sintetizadas numa quantidade até 2 g por quilograma de peso fresco da planta. Por exemplo, a quantidade de proteína estrutural sintetizada talvez entre 1 e 2 g por quilograma de peso fresco, ou qualquer quantidade entre eles, como 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 g por quilograma de peso fresco ou qualquer quantidade entre eles. Por exemplo, a proteína estrutural pode ser sintetizada em uma quantidade até 1,54 g por quilograma de peso fresco da planta.
Além disso, o RLP pode ser sintetizado numa quantidade até 1,5 g por quilograma de peso fresco da planta. Por exemplo, a quantidade de RLP sintetizada pode entre 0,5 e 1,5 g por quilograma de peso fresco, ou qualquer quantidade entre eles, como 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 g por quilograma de peso fresco. Por exemplo, o RLP pode ser sintetizado em uma quantidade de até 1,1 g por quilograma de peso fresco da planta. O tamanho (ou seja, o diâmetro) dos RLPs acima definidos, talvez mede, por exemplo, por técnicas dinâmicas de dispersão de luz (DLS) ou microscópio eletrónico (EM), geralmente está entre 50 a 110 nm ou qualquer tamanho entre eles. Por exemplo, o tamanho da estrutura de RLP intacta pode variar de cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, ou qualquer tamanho entre eles, tal como 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm ou qualquer tamanho entre eles. A presente invenção proporciona ainda um método de produção de um RLP numa planta, uma porção de uma planta ou célula vegetal, que compreende a introdução de um ácido nucleico, em que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleótidos que codifica uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus ligadas operativamente a uma região reguladora ativa em uma planta. A sequência de nucleótidos pode ser otimizada, por exemplo, para o uso de codões humanos ou o uso de codões de plantas. Além disso, uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus podem ser operativamente ligadas a um ou mais de um elemento de amplificação. Além disso, uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus podem ser operativamente ligadas a uma ou mais de uma sequência de segmentação do compartimento. A uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus codificadas pela sequência de nucleótidos podem ser, por exemplo, VP2, VP4, VP6 ou VP7. Além disso, a uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus codificadas pela sequência de nucleótidos podem ser, por exemplo, de qualquer grupo de rotavirus A a G, mas mais preferencialmente do grupo de rotavirus A. Além disso, a uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus codificadas pela sequência de nucleótidos talvez de qualquer cepa de rotavirus com um genótipo de quaisquer combinações de tipos G e P de G1 a G27 e de PI a P34, e mais preferencialmente de G1 a G19 e de PI a P27, incluindo, mas não limitado a GlP [8], G2P [4], G2P [8], G3P [8], G4P [8], G9P [6], G9P [8], estirpe de Rotavirus A WA, estirpe rotavirus A vacina EUA/Rotarix-A41CB052A/198/ GlPlA [8] ou estirpe rotavirus SAll.
Uma sequência de ácido nucleico referida na presente invenção pode ser "substancialmente homóloga", "substancialmente semelhante" ou "substancialmente idêntica" a uma sequência, ou um elogio da sequência se a sequência de ácido nucleico hibridar com um ou mais de um nucleótido sequência ou um elogio da sequência de ácido nucleico tal como aqui definido, sob condições de hibridação rigorosas. As sequências são "substancialmente homólogas", "substancialmente semelhantes", "substancialmente idênticas" quando pelo menos cerca de 70%, ou entre 70 a 100%, ou qualquer quantidade entre elas, por exemplo, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100%, ou qualquer quantidade entre eles, dos nucleótidos correspondem ao longo de um comprimento definido da sequência de nucleótidos, desde que tais sequências homólogas exibam uma ou mais de uma das propriedades da sequência, ou o produto codificado como aqui descrito.
Por exemplo, a presente invenção proporciona um método de produção de um RLP numa planta, porção de uma planta ou célula vegetal, compreendendo a introdução de um polinucleótido isolado, em que o polinucleótido isolado compreende um ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus que são pelo menos 60% 65% 70% 75% 80% 85% 86% 87% 88% 89% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 96%, 97%, 98%, 99% 100% ou qualquer quantidade entre idênticos a sequências como definido, por exemplo, nas SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 45, 46, 47, 49 , 50, 51, 52, 53, 54. O polinucleótido pode ser codão humano otimizado por qualquer dos métodos conhecidos na técnica.
Além disso, a presente invenção proporciona um método de produção de um RLP numa planta, porção de uma planta ou célula vegetal, compreendendo a introdução de ácidos nucleicos, em que os ácidos nucleicos são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85% 86% 87% 88% 89% 90% 91% 92% 93% 94% 95% 96% 97% 98% 99% 100% ou qualquer quantidade entre idênticos a sequências como definido, por exemplo, nas SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 53, 54.
Uma tal semelhança ou identidade de sequência pode ser determinada usando um programa de comparação de sequências de nucleótidos, como o fornecido dentro de ADNSIS (usando, por exemplo, mas não limitado a, os seguintes parâmetros: penalti GAP 5, # das diagonais superiores 5, penalidade GAP fixa 10 , k tupla 2, espaço flutuante 10 e tamanho da janela 5). No entanto, outros métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, por exemplo, os algoritmos de Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2: 482), Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat’l. Acad. Sei. USA 85: 2444), e por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e BLAST, disponíveis através do NIH), ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al·., Eds. Suplemento de 1995), ou utilizando hibridização Southern ou Northern em condições rigorosas (ver Maniatis et al., Em Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). De preferência, as sequências que são substancialmente homólogas exibem pelo menos cerca de 80% e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% de similaridade de sequência ao longo de um comprimento definido da molécula.
Um exemplo de uma dessas condições de hibridação rigorosas pode ser durante a noite (de cerca de 16-20 horas) hibridação em 4 X SSC a 65°C, seguido de lavagem em 0,1 X SSC a 65°C durante uma hora ou 2 lavagens em 0,1 X SSC a 65°C cada por 20 ou 30 minutos. Em alternativa, uma condição de hibridação rigorosa exemplificativa poderia ser durante a noite (16-20 horas) em formamida a 50%, SSC 4 X a 42°C, seguido de lavagem em SSC 0,1 X a 65°C durante uma hora ou 2 lavagens em 0,1 X SSC a 65°C cada por 20 ou 30 minutos, ou durante a noite (16-20 horas), ou hibridação no tampão de fosfato aquoso da Igreja (SDS a 7%, tampão NaP04 0,5 M, pH 7,2, EDTA 10 mM) a 65°C, com 2 lavagens a 50°C em 0,1 X SSC, 0,1% de SDS durante 20 ou 30 minutos cada, ou 2 lavagens a 65°C em SSC 2 X, SDS a 0,1% durante 20 ou 30 minutos cada para regiões de sequência únicas.
Um ácido nucleico que codifica um polipéptido estrutural de rotavirus pode ser descrito como um "ácido nucleico de rotavirus", uma "sequência de nucleótidos de rotavirus", um "ácido nucleico de rotavirus" ou uma "sequência de nucleótidos de rotavirus". Por exemplo, que não deve ser considerado limitante, uma partícula semelhante a vírus compreendendo uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus ou polipéptido estrutural de rotavirus, pode ser descrita como um "VLP rotavirus", "RVLP" ou "RLP".
Muitos organismos exibem um viés para uso de codões particulares para codificar para inserção de um aminoácido particular em uma cadeia peptídica em crescimento. A preferência de codão ou o viés de codão, diferenças no uso de codões entre organismos, é proporcionada pela degeneração do código genético e está bem documentada entre muitos organismos. O viés de codão muitas vezes se correlaciona com a eficiência da tradução de ARN mensageiro (mARN), que, por sua vez, acredita ser dependente, entre outras, das propriedades dos codões que estão sendo traduzidos e da disponibilidade de moléculas de ARN de transferência particular (tARN). A predominância de tARNs selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos codões utilizados com maior frequência na sintese de péptidos. Consequentemente, os genes podem ser adaptados para a expressão genética ideal em um determinado organismo com base na otimização de codões. O processo de otimização da sequência de nucleótidos que codifica uma proteína expressa heteróloga pode ser um passo importante para melhorar os rendimentos de expressão. Os requisitos de otimização podem incluir etapas para melhorar a capacidade do hospedeiro para produzir a proteína estranha. A "otimização de codão" é definida como a modificação de uma sequência de ácido nucleico para expressão melhorada em células de interesse, substituindo pelo menos um, mais de um ou um número significativo de codões da sequência nativa com codões que podem ser mais frequentes ou mais frequentemente usado nos genes de outro organismo ou espécie. Várias espécies exibem uma tendência particular para determinados codões de um aminoácido particular. A presente invenção inclui um método de produção de um RLP numa planta, uma porção de uma planta ou célula vegetal, que inclui a introdução de sequências polinucleotidicas sintéticas, em que as sequências polinucleotidicas sintéticas que foram codificadas otimizadas, por exemplo, as sequências foram otimizadas para o uso humano de codões ou uso de codões de plantas. As sequências polinucleotidicas otimizadas por codões podem então ser expressas em plantas. Mais especificamente, as sequências otimizadas para uso de codão humano ou utilização de codões de plantas podem ser expressas em plantas. Sem querer se unir pela teoria, acredita-se que as sequências otimizadas para o codão humano aumentam o teor de guanina-citosina (conteúdo GC) da sequência e melhora o rendimento de expressão nas plantas.
Existem diferentes técnicas de otimização de codões conhecidas na técnica para melhorar, a cinética de tradução de regiões de codificação de proteínas ineficientes de tradução. Essas técnicas baseiam-se principalmente na identificação do uso de codões para um determinado organismo hospedeiro. Se um certo gene ou sequência deve ser expresso neste organismo, a sequência de codificação de tais genes e sequências será então modificada de tal forma que uma substituirá os codões da sequência de interesse por codões mais frequentemente utilizados do organismo hospedeiro. A proteína ou o polipéptido estrutural de rotavirus pode ser expresso num sistema de expressão que compreende um sistema de expressão baseado em vírus, ADN ou ARN, por exemplo, mas não limitado a uma cassete de expressão baseada em comovírus e um elemento de amplificação baseado em geminivírus. 0 sistema de expressão como aqui descrito pode compreender uma cassete de expressão com base em um vírus bipartido ou um vírus com um genoma bipartido. Por exemplo, os vírus bipartidos podem ser da família Comoviridae Genera da família Comoviridae incluem Comovirus, Nepovirus, Fabavirus, Cheravirus e Sadwavirus. Os comovírus incluem o vírus do mosaico do Cowpea (CPMV), o vírus do mosaico grave do Cowpea (CPSMV), o virus do mosaico da abóbora (SqMV), o virus da moto vermelha do trevo (RCMV), o vírus da mancha do feijão do feijão (BPMVj , o vírus do nó de nabo (TuRSV) vírus do mosaico (BBtMV), vírus da mancha de feijão largo (BBSV), vírus do mosaico do rabanete (RaMVj. Exemplos de sequências de ARN-2 de comovirus que compreendem elementos potenciadores que podem ser úteis para vários aspectos da invenção incluem, mas não estão limitados a: RNA-2 de CPMV (número de acesso GenBank NC_003550), RNA-2 RCMV (número de acesso GenBank NC_003738), BPMV RNA-2 (número de acesso GenBank NC_003495), CPSMV RNA-2 (número de acesso GenBank NC_003544), SqMV RNA-2 (número de acesso GenBank NC_003800), TuRSV RNA-2 (número de acesso GenBank NC_013219. 1). BBtMV RNA-2 (número de acesso GenBank GU810904), BBSV RNA2 (número de acesso GenBank FJ028650), RaMV (número de acesso GenBank NC_003800).
Os segmentos do genoma de ARN comoviral bipartido são referidos como ARN-1 e ARN-2. 0 ARN-1 codifica as proteínas envolvidas na replicação enquanto o ARN-2 codifica as proteínas necessárias para o movimento célula-célula e as duas proteínas da cápside. Pode ser utilizada qualquer cassete com base em comovirus adequada, incluindo CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV ou BPMV, por exemplo, a cassete de expressão pode basear-se na CPMV. "Cassete de expressão" refere-se a uma sequência de nucleótidos compreendendo um ácido nucleico de interesse sob o controlo de, e operacionalmente (ou operativamente) ligado a um promotor apropriado ou outros elementos reguladores para a transcrição do ácido nucleico de interesse numa célula hospedeira.
Os sistemas de expressão também podem compreender elementos de amplificação a partir de um geminivírus, por exemplo, um elemento de amplificação do vírus da anã do feijão amarelo (BeYDV). BeYDV pertence ao género Mastreviruses adaptado às plantas dicotiledôneas. BeYDV é monopartite com um genoma de ADN circular de uma única cadeia e pode replicar para números de cópias muito elevados por um mecanismo de círculo circulante. Os sistemas de vector de replicão de ADN derivados de BeYDV foram utilizados para a produção rápida de proteína de alto rendimento em plantas.
Tal como aqui utilizado, a frase "elementos de amplificação" refere-se a um segmento de ácido nucleico que compreende pelo menos uma porção de uma ou mais regiões intergénicas longas ou repetição intergénica longa (LIR) de um genoma de geminivírus. Tal como aqui utilizado, "região intergénica longa" ou "repetição intergénica longa" refere-se a uma região de uma região intergénica longa que contém um local de ligação do representante capaz de mediar a excisão e a replicação por uma proteína Rep de geminivírus. Em alguns aspetos, o segmento de ácido nucleico que compreende uma ou mais LIRs pode compreender ainda uma região intergénica curta ou região intergénica pequena (SIR) de um genoma de geminivírus. Tal como aqui utilizado, "região intergénica curta" ou "pequena região intergénica" refere-se à cadeia complementar (o IR curto (SIR) de um Mastrevirus). Qualquer Olemehtd: de: ampllf^ídaçaò:· derivado; de qemihiyixns' ndcquádo pode ser aqui utilizado. Veja, por exemplo, a W02QQG/2Q557; W02010/025285; Zhang X, et al. (2005, Biotechnology and Bioehf:ihe©ri.Hf^· Vol^. SQy ;lll-i;7i:|:;, Huang &.*, et al;.. ;(1:0É;S:,: Biotechnology and Bioengineering, Vol. l|3y 7fS-7MJ:, Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, S—i7j: . ,Se. mais de: :¾¾ LIR for uáadd ηη dansttuçád, por exemplo dois LIRs, então o promotor, as regiões de CMPV-HT e a sequência de ácido nucleico de interesse e o terminador estão entre colchetes por cada um dos dois LIRs. Além disso, © elemento de amplificação pode, por exemplo, ser originário da sequência conforme divulgado em Halley-Stott et al. (2007} Archives of Virology 152: 1237-1240, depositado sob o número de acesso do GenBank DQ458791. C segmento de ácido nucleico. que compreende LIRs é unido nos nucleotideos 2401 a 2566 ela 128. O segmento de ácido nucleico compreendendo SIRs sâo os nucleotideos 1154 a 12:121,:
Conforme aqui descrito, a co-entrega do vírus derivado do vírus da anã do feijão amarelo (BeYDV) e um vetor de fornecimento de Rep/RepA, por meio da agroinf.iltração de Nicotiana bentha.rn.iana deixa resultados em amplificação de rêplidãb: êfxgiênbd:· e produção profedna robustá.
Uma cassete de expressão baseada em comovírus e um elemento de âmp;li:fí:Çá.çi:o derivado: de gemluLvirus podem, ser incluídas em vetores separados, ou as partes componentes podem ser incluídas em um vetor. Se forem utilizados dois vetores, o primeiro e o segundo vetores podem ser introduzidos em uma "Cálulâ: de planta οί'ΐήηίοοηοοκίοηρο: Os sepâradámente,
Uma replicase virai também pode ser incluída no sáetêmâ.: dé expressão como aqui descrito para aumentar a expressão do dcido hucleiO:© de infereseç. .um exemplo .nSo limirsriy© dd uma replicase é uma repetição BeYDV (pREPllO) codificando
BeYDV Rep e RepA (C2/C1; Huang et al., 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714). Outro exemplo não limitativo de uma replicase é divulgado em Halley-Stott et al. (2007) Archives of Virology 152: 1237-1240, depositado sob o número de acesso do GenBank DQ458791. 0 segmento de ácido nucleico que compreende o gene Cl: C2 são os nucleotídeos 1310 a 2400.
Por "co-expresso" entende-se que duas ou mais de duas sequências de nucleótidos são expressas aproximadamente ao mesmo tempo dentro da planta e dentro do mesmo tecido da planta. No entanto, as sequências de nucleótidos não precisam ser expressas exatamente ao mesmo tempo. Em vez disso, as duas ou mais sequências de nucleótidos são expressas de maneira tal que os produtos codificados tenham a chance de interagir. As duas ou mais de duas sequências de nucleótidos podem ser co-expressas usando um sistema de expressão transitória, onde as duas ou mais sequências são introduzidas dentro da planta aproximadamente ao mesmo tempo sob condições em que ambas as sequências são expressas. Em alternativa, uma planta de plataforma que compreende uma das sequências de nucleótidos pode ser transformada de forma estável, com uma sequência adicional que codifica a proteína de interesse, por exemplo, uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus, introduzidas na plataforma da plataforma de forma transitória. O dobrado correto da proteína pode ser importante para a estabilidade da proteína, a formação de multímeros, a formação de RLPs e a função. 0 dobramento de uma proteína pode ser influenciado por um ou mais fatores, incluindo, mas não se limitando a, a sequência da proteína, a abundância relativa da proteína, o grau de aglomeração intracelular, a disponibilidade de cofatadores que podem se unir ou ser associadas temporariamente com a proteína dobrada, parcialmente dobrada ou desdobrada. Além disso, o compartimento ou sub-compartimento dentro da planta onde a proteína é expressa pode influenciar os níveis de expressão e dobramento da proteína. A expressão de uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus pode ser direcionada para compartimentos e/ou sub-compartimentos de células vegetais específicos por meio de agroinfiltração em plantas transgénicas. 0 compartimento ou os sub-compartimentos podem ser, por exemplo, plastídios, reticula endoplasmática (ER), cloroplasto ou apoplasto. Sem querer ser vinculado pela teoria, o compartimento ou subpartilhos visando pode aumentar a acumulação de proteína no compartimento ou sub-compartimentos visados sobre a acumulação citoplasmática. A acumulação de compartimentos ou sub-compartimentos pode proteger a proteína da degradação por protéases presentes no citoplasma e/ou permitir que ele se acumule em maior concentração sem afetar a função da célula da planta.
Por conseguinte, a cassete ou o vetor de expressão pode ser adaptado para dirigir o vetor ou a proteína ou polipéptido estrutural de rotavirus expresso a partir do vetor para o compartimento ou subcompartilho desejado na planta.
Por exemplo, a cassete ou o vetor de expressão pode ser adaptado para direcionar plastídios fazendo com que uma proteína ou polipéptido estrutural de rotavirus expressado inclua uma porção capaz de interagir com as membranas de tilacoides dos plastídios, em particular o mecanismo de transferência das membranas de tilacoides. Esta interação pode fazer com que a proteína ou o polipéptido estrutural de rotavirus sejam importados para o plastídio do citoplasma onde é expresso. Sem querer estar vinculado pela teoria, o mecanismo de importação do citoplasma pode ser importante para a dobragem apropriada das proteínas. Será apreciado que a cassete de expressão ou o vetor podem ser adaptados para direcionar os próprios plastidios para serem transformados e a expressão da proteína ou polipéptido estrutural de rotavirus pode ocorrer inteiramente dentro do plastídio.
Pelo termo "sequência de segmentação" entende-se que as sequências de segmentação podem ser incluídas no vetor ou na cassete de expressão. Tais sequências de direcionamento podem ser traduzidas para um péptido que dirige o vetor ou produto do mesmo para o compartimento ou subcompartilho desejado na planta, tal como um plastídio. Por exemplo, os péptidos de sinal de plastídio (também referidos como "péptidos de trânsito de plastídio" na arte) para direcionar proteínas em plastidios são conhecidos na técnica. Um exemplo não limitativo de um péptido de trânsito de plastídio que pode ser usado é o de rbcsl-cTP. Como exemplo adequado de uma sequência peptídica de trânsito de cloroplasto é o gene de subunidade pequena Rubisco (rbcSl), por exemplo, de Solanum tuberosum.
Portanto, a proteína ou polipéptido estrutural de rotavirus inclui um péptido de sinal que é o mesmo ou heterólogo com o restante do polipéptido ou proteína. 0 termo "péptido de sinal" é bem conhecido na técnica e refere-se, em geral, a uma sequência curta de aminoácidos (aproximadamente 5-30 aminoácidos), encontrada geralmente no terminal N de um polipéptido que pode dirigir a translocação do recém-traduzido polipéptido para um organelo particular, ou ajuda no posicionamento de domínios específicos da cadeia polipeptídica em relação a outros. Como um exemplo não limitativo, o péptido sinal pode direcionar a translocação da proteína para o retículo endoplasmático e/ou auxiliar no posicionamento do domínio proximal do terminal N em relação a um domínio âncora da membrana do polipéptido nascente para auxiliar na clivagem e dobradura da proteína madura, por exemplo, que não deve ser considerado limitante, uma proteína estrutural de rotavirus.
Um péptido de sinal (SP) pode ser nativo da proteína ou proteína do vírus, ou um péptido sinal pode ser heterólogo em relação à sequência primária da proteína ou proteína do vírus que está sendo expressa. Por exemplo, o péptido de sinal nativo da proteína estrutural de rotavirus pode ser usado para expressar a proteína estrutural de rotavirus em um sistema de planta.
Um péptido de sinal também pode ser não nativo, por exemplo, a partir de uma proteína, proteína virai ou proteína estrutural nativa de um vírus que não a proteína de rotavirus, ou de um polipéptido vegetal, animal ou bacteriano. Um exemplo não limitativo de um péptido de sinal que pode ser utilizado é o da proteína de alfafa dissulfureto isomerase (PDISP) (nucleótidos 32-103 do número de acesso Z11499) . Além disso, o péptido de sinal pode ser completamente eliminado ou truncado. Por truncamento ou truncado, significa que 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou qualquer quantidade entre os resíduos de aminoácidos são excluídos do péptido sinal. De preferência, os resíduos de aminoácidos truncados são contínuos, e o truncamento ocorre a partir da segunda metionina em diante. A presente invenção proporciona, portanto, um método de produção de uma RLP numa planta, porção de uma planta ou célula vegetal, que inclui a introdução de um ácido nucleico, em que o ácido nucleico codifica a proteína estrutural VP7 de rotavirus e um péptido de sinal não nativo ou nativo truncado péptido de sinal. O método de produção de um RLP numa planta, uma porção de uma planta ou célula vegetal pode compreender expressar construções genéticas em qualquer hospedeiro vegetal adequado. Exemplos de hospedeiros adequados incluem, mas não estão limitados a culturas agrícolas, incluindo alfafa, canola, sementes de Brassica, milho, Nicotiana spp., batata, ginseng, ervilha, aveia, arroz, soja, trigo, cevada, girassol, algodão e similares.
As sequências de nucleótidos que codificam para as proteínas estruturais do rotavirus podem ser transferidas para o hospedeiro da planta utilizando vetores plasmídeos binários 1, 2, 3, 4 ou 5. Cada vetor de plasmídeo binário pode, portanto, conter 1, 2, 3, 4 ou 5 sequências de nucleótidos que codificam para uma proteína estrutural de rotavirus. 0 método de produção de um RLP numa planta, parte de uma planta ou célula vegetal pode compreender uma ou mais construções genéticas que podem compreender ainda uma região 3 'não traduzida. Uma região 3' não traduzida refere-se à porção de um gene que compreende um segmento de ADN que contém um sinal de poliadenilação e quaisquer outros sinais reguladores capazes de efetuar o processamento de mARN ou a expressão de genes. 0 sinal de poliadenilação é normalmente caracterizado por efetuar a adição de pistas de ácido poliadenílico à extremidade 3'do precursor de mARN. Os sinais de poliadenilação são comumente reconhecidos pela presença de homologia na forma canónica 5'AATAAA-3', embora as variações não sejam incomuns. Exemplos não limitativos de regiões 3'adequadas são as regiões 3' não transcritas contendo um sinal de poliadenilação de genes de plasmídeos indutores de tumores de Agrobacterium (Ti), tais como o gene da nopalina sintase (NOS), genes de plantas tais como os genes da proteína de armazenamento de soja, a subunidade pequena da ribulose-I, 5-gene bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO; US 4962028; que é aqui incorporado por referência), o promotor utilizado na regulação da expressão da plastocianina, descrito em US 7125978. 0 método de produção de um RLP numa planta, uma porção de uma planta ou célula vegetal pode compreender uma ou mais construções genéticas que também podem incluir potenciadores adicionais, quer potenciadores de tradução ou de transcrição/ que podem ser necessários. Os amplificadores podem estar localizados na sequência 5’ ou 3' que está a ser transcrita. As regiões de amplificador são bem conhecidas dos e .special is tas na técnica e podem incluir um. codão de iniciação de ATG, sequências adjacentes ou semelhantes. 0 codão de iniciação, se presente, pode estar em fase com o quadro de leitura ("em quadro”) da sequência de codificação para fornecer a tradução correta da sequência transcrita. 0 método de produção de um RLP em uma planta, uma porção de uma planta ou célula vegetal pode compreender o uso de plásmldeobí de :11:, plásmldebS: Bi, vetorês /ide - virus ida: planta., transformação direta de ADN, microinjeção, eletroporação, etc. Para revisões de tais técnicas, veja, por exemplo, Weissbach e Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); e Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in :Rláht:S:::... In. Plant: Metabolism* M Ed, if* ienait,: -if Turpin:* DD Lêfêbrvê, PB "Laytell :(:ddsj·, Addison Wealy*: )Lahgmana 'Ltd, London, pp. 561-579 (1997) . Gut res métodos incluem a absorção direta de ADN, o uso de liposs ornas, eletroporação, por exemplo, usando protoplastos, microinjeção, microprojécteis ou "bigodes·, e ânifiltraçio a :vâcu©:··.. Veja., per" exampi©-,: Bllang,: et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al, (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 1.11-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Kowell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al, (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 19:8.8:1., Methods; in. plant; Molecular íãiolóçfp |8d:hul:©.P add' Zielinski,. eds., Academic Press Inc,/ 1989} , Lin e Lomonossoff (J Virol Meth, 105:343-348, 2002,), Patente US 4945050; 5G36QQ6; e 5100192, Patentes US 6403865 apresentada em 10 de maio de 1995 e 5625136, apresentada em 25 de setembro de 19:92.
Expressão transitória
Sem querer estar vinculado pela teoria, a concentração de proteína e a proporção das diferentes proteínas estruturais do rotavirus podem ser importantes para a eficiência de montagem de RLPs, Portanto, a multiplicidade e o tempo de infeção podem ser importantes para manipular a concentração de proteínas e a eficiência geral de montagem de RLPs nas plantas, Q método de produção de um RLP numa planta, uma porção de uma planta ou célula vegetal pode compreender a expressão transitória de uma ou ma is construções que codificam uma proteína estrutural de rotavirus. Um sistema de expressão transitória que depende da expressão epicromossómica de Agrobacterium tumefaciens recoiabinante em uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal pode ser usado para expressar a proteína estrutural de rotavirus, direcionada para vários ÇiqirpartimênÉos'' celulares qu s:tíb-cpmpá 'Um aid tema· de expressão transitória permite uma alta \?elocidade de produção. Além disso, grandes quantidades de proteína podem ser atingidas dentro de alguns dias após a infiltração de Agrobacterium recombinante em plantas {Rybickí, 2010; Fischer et al,, 1999). Também é possível expressar longas sequências genéticas e ter mais de um gene simultaneamente express©: s;a :mesma sé lula::, permitindo: uma: montagem: eficiente ::de proteínas, ^multimêricás ^Lombardi et al -,. 2UM1.
As sequências de nucleótidos que codificam as proteínas estruturais do rotavirus podem ser transferidas para o hospedeiro da planta para a estirpe de Agrobacterium tumefaciens transformada em 1, 2, 3, 4 ou 5.
No entanto, durante a expressão transitória, o silenciamento de genes pós-transcrição pode limitar a expressão das proteínas heterólogas nas plantas. A co-expressão de um supressor de silenciamento, por exemplo, mas não limitado a Nss de vírus de murcha manchada de tomate pode ser usada para contrariar a degradação específica de mARN de transgene (Brigneti et al., 1998). Os supressores alternativos de silenciamento são bem conhecidos na técnica e podem ser utilizados como aqui descrito (Chiba et al., 2006, Virology 346: 7-14), por exemplo, mas não se limitando a HcPro, TEV -pl / HC-Pro (vírus da etch do tabaco-pl/HC-Pro) , BYV-p21, pl9 do vírus de dublagem do tomate (TBSV pl9), proteína da cápside do vírus do crinkle do tomate (TCV-PC), 2b do vírus do mosaico do pepino; CMV-2b) , p25 do vírus da batata X (PVX-p25), pll do vírus da batata M (PVM-pll) , pll do vírus da batata S (PVS-pll), pl6 do vírus do Scorch Blueberry, (BScV-pl6), P23 do vírus da tristeza Citrus (CTV-p23) , p24 do vírus-2 associado ao rolo da Grapevine, (GLRaV-2 p24), plO do vírus A da videira (GVA-plO), pl4 do vírus B da videira (GVB-pl4), plO do vírus latente de Heracleum (HLV-plO), ou pl6 do vírus latente comum do alho (GCLV-pl6). Portanto, um supressor de silenciamento, por exemplo, HcPro, TEV -pl / HCPro, BYV-p21, TBSV pl9, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-pll, PVS-pll, BScV-pl6, CTV- p23, GLRaV-2 p24, GBV-pl4, HLV-plO, GCLV-pl6 ou GVA-plO, pode ser co-expresso junto com uma ou mais proteínas estruturais de rotavirus, por exemplo VP2, VP4, VP6, ou uma combinação destes, para garantir níveis elevados de produção de proteínas dentro de uma planta ou porção de uma planta. A presente invenção também proporciona um método como descrito acima, em que uma sequência de nucleótidos adicional (quarto ou quinto) é expressa dentro da planta, a sequência de nucleótidos adicional (quarto ou quinto) que codifica um supressor de silenciamento está operacionalmente ligada com um adicional (quarta ou quinta) região reguladora que é ativa na planta. A sequência de nucleótidos que codifica um supressor de silenciamento pode ser, por exemplo, Nss, HcPro, TEV -pl / HC-Pro, BYV-p21, TBSV pl9, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-pll, PVS- pll, BScV-pl6, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-pl4, HLV-plO, GCLV-pl6 ou GVA-plO.
Conforme descrito abaixo, os métodos de expressão transitória podem ser usados para expressar uma ou mais construções que codificam uma proteína estrutural de rotavirus (ver Liu e Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105: 343-348). Em alternativa pode ser utilizado um método de expressão transitória baseado no vácuo, como descrito por Kapila et al., 1997. Estes métodos podem incluir, por exemplo, mas não estão limitados a um método de agro-inoculação ou agro-infiltração, infiltração da seringa, no entanto, outros métodos transitórios também podem ser utilizados como observado acima. Com a injeção de agro-infiltração ou a infiltração de seringas, uma mistura de Agrobacteria compreendendo o ácido nucleico desejado entra nos espaços intercelulares de um tecido, por exemplo as folhas, porção aérea da planta (incluindo caule, folhas e flor), outros porção da planta (caule, raiz, flor) ou a planta inteira. Depois de atravessar a epiderme, as Agrobacteria infetam e transferem cópias de t-ADN para as células. O t-ADN é transcrita episomicamente e o mARN traduzido, levando à produção da proteína de interesse em células infetadas, no entanto, a passagem de t-ADN dentro do núcleo é transitória.
Para auxiliar na identificação de células de plantas transformadas, o método de produção de um RLP numa planta, uma porção de uma planta ou célula de planta pode compreender construções incluindo marcadores selecionáveis por planta. Os marcadores selecionáveis úteis incluem enzimas que proporcionam resistência a produtos químicos tais como um antibiótico, por exemplo, gentamicina, higromicina, canamicina ou herbicidas, tais como fosfinotriina, glifosato, clorossulfurão e semelhantes. Do mesmo modo, podem ser utilizadas enzimas que proporcionam a produção de um composto identificável por alteração de cor tal como GUS (beta-glucuronidase) ou luminescência, como luciferase ou GFP. 0 método de produção de um RLP numa planta, parte de uma planta ou célula vegetal pode também compreender métodos de produção de plantas transgénicas, células de plantas ou sementes que expressam RLPs. Os métodos de regeneração de plantas inteiras a partir de células de plantas também são conhecidos na técnica. Em geral, as células de plantas transformadas são cultivadas num meio apropriado, que pode conter agentes seletivos tais como antibióticos, onde os marcadores selecionáveis são utilizados para facilitar a identificação de células de plantas transformadas. Uma vez que o calo se forma, a formação do tiro pode ser incentivada empregando as hormonas das plantas apropriados de acordo com métodos conhecidos e os rebentos transferidos para o meio de enraizamento para regeneração de plantas. As plantas podem então ser usadas para estabelecer gerações repetitivas, seja a partir de sementes ou usando técnicas de propagação vegetativa. As plantas transgénicas também podem ser geradas sem o uso de culturas de tecidos. 0 uso dos termos "região reguladora", "elemento regulador" ou "promotor" no presente pedido deve refletir uma porção de ácido nucleico tipicamente, mas não sempre, a montante da região de codificação da proteína de um gene, que pode ser composto de ADN ou ARN, ou ADN e ARN. Quando uma região reguladora é ativa, e em associação operativa, ou operativamente ligada, com um gene de interesse, isso pode resultar na expressão do gene de interesse. Um elemento regulador pode ser capaz de mediar a especificidade do órgão ou controlar a ativação do gene de desenvolvimento ou temporal. Uma "região reguladora" pode incluir elementos promotores, elementos promotores de núcleo que exibem uma atividade de promotor basal, elementos que são induzíveis em resposta a um estímulo externo, elementos que medeiam a atividade do promotor, como elementos reguladores negativos ou potenciadores da transcrição. A "região reguladora", tal como aqui utilizada, também pode incluir elementos que são ativos após a transcrição, por exemplo, elementos reguladores que modulam a expressão de genes tais como potenciadores de tradução e transcrição, repressores de tradução e transcrição, sequências de ativação a montante e determinantes de instabilidade de ARNm. Vários desses últimos elementos podem estar localizados próximos da região de codificação.
No contexto desta divulgação, o termo "elemento regulador" ou "região reguladora" refere-se normalmente a uma sequência de ADN, geralmente, mas não sempre, a montante (5'} da sequência de codificação de um gene estrutural que controla a expressão da região de codificação, fornecendo o reconhecimento da ARN polimerase e/ou outros fatores necessários para que a transcrição comece em um determinado site. No entanto, deve ser entendido que outras sequências de nucleótidos, localizadas nos intrões, ou 3’ da sequência podem também contribuir para a regulação da expressão de uma região de interação de codificação. Um exemplo de um elemento regulador que prevê o reconhecimento de ARN polimerase ou outros fatores transcricionais para garantir que a iniciação em um site particular seja um elemento promotor. A maioria, mas não todos, Os elementos do promotor eucariótico contêm uma caixa TATA, uma sequência de ácido nucleico conservada composta por pares de bases de nucleótidos de adenosina e timidina geralmente situados a aproximadamente 25 pares de bases a montante de um local de inicio da transcrição. Um elemento promotor compreende um elemento promotor basal, responsável pelo início da transcrição, bem como outros elementos reguladores (como mencionado acima) que modificam a expressão génica.
Existem vários tipos de regiões reguladoras, incluindo as que são reguladas pelo desenvolvimento, induzíveis ou constitutivas. Uma região reguladora que é regulada pelo desenvolvimento ou controla a expressão diferencial de um gene sob seu controle é ativada em certos órgãos ou tecidos de um órgão em momentos específicos durante o desenvolvimento desse órgão ou tecido. No entanto, algumas regiões reguladoras que são reguladas pelo desenvolvimento podem preferencialmente ser ativas em certos órgãos ou tecidos em estádios de desenvolvimento específicos, eles também podem ser ativos de maneira regulada pelo desenvolvimento, ou em um nível basal em outros órgãos ou tecidos dentro da planta também. Exemplos de regiões reguladoras específicas de tecido, por exemplo, uma região reguladora específica de ver, incluem o promotor de napina e o promotor de cruciferina (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130) . Um exemplo de um promotor específico da folha inclui o promotor da plastocianina (ver a Patente US 7125978).
Uma região reguladora induzível é uma que é capaz de ativar direta ou indiretamente a transcrição de uma ou mais sequências de ADN ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor, as sequências ou genes de ADN não serão transcritos. Tipicamente, o fator de proteína que se liga especificamente a uma região reguladora induzível para ativar a transcrição pode estar presente numa forma inativa, que é convertida direta ou indiretamente na forma ativa pelo indutor. No entanto, o facto de proteína também pode estar ausente. 0 indutor pode ser um agente químico, como uma proteína, um metabolito, um regulador de crescimento, um herbicida ou um composto fenólico ou um estresse fisiológico impostas diretamente pelo calor, frio, sal ou elementos tóxicos ou indiretamente através da ação de um agente patogênico ou agente de doenças como um vírus. Uma célula vegetal que contém uma região reguladora induzível pode ser exposta a um indutor aplicando externamente o indutor à célula ou planta tal como por pulverização, rega, aquecimento ou métodos semelhantes. Elementos reguladores induzíveis podem ser derivados de genes vegetais ou não-plantas (por exemplo, Gatz, C. e Lenk, LRP, 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358) . Exemplos, de potenciais promotores induzíveis incluem, mas não se limitando a, promotor induzível com tetraciclina (Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108), promotor induzível por esteroides (Aoyama. T. e Chua, NH, 1997, Planta 1. 2, 397-404) e promotor induzível com etanol (Salter, MG, et al, 1998, Plant lOurnal 16, 127-132; Caddick, MX, et al, 1998, Nature Biotech. 16, 177-180) genes IB6 e CKI 1 induzíveis por citoquinina (Brandstatter, I. e Kieber, 1.1, 1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274,982-985) e o elemento indutivel com auxina, DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971).
Uma região reguladora constitutiva direciona a expressão de um gene ao longo das várias partes de uma planta e continuamente ao longo do desenvolvimento da planta. Exemplos de elementos reguladores constitutivos conhecidos incluem promotores associados ao transcrito CaMV 35S (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812), a actina de arroz 1 (Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), actina 2 (An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121), ou tms 2 (US 5428147) e triosefosfato isomerase 1 (Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), o gene da ubiquitina 1 do milho (Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), os genes Arabidopsis ubiquitina 1 e 6 (Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), e o gene do factor 4A de iniciação da tradução do tabaco (Mandei et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 995-1004). O termo "constitutivo" tal como aqui utilizado não indica necessariamente que um gene sob o controlo da região reguladora constitutiva seja expresso no mesmo nível em todos os tipos de células, mas que o gene é expresso numa vasta gama de tipos de células, embora a variação em A abundância é frequentemente observada. Os elementos reguladores constitutivos podem ser acoplados com outras sequências para melhorar adicionalmente a transcrição e/ou a tradução da sequência de nucleótidos à qual estão ligados operativamente. Por exemplo, o sistema CPMV-HT é derivado das regiões não traduzidas do vírus do mosaico de Cowpea (CPMV) e demonstra tradução aprimorada da sequência de codificação associada. Por "nativo" entende-se que a sequência de ácido nucleico ou aminoácido está ocorrendo naturalmente, ou "tipo selvagem". Por "operacionalmente vinculado" significa que as sequências particulares, por exemplo um elemento regulador e uma região de interação de codificação, interagem direta ou indiretamente para realizar uma função pretendida, como a mediação ou a modulação da expressão gênica. A interação de sequências ligadas operativamente pode, por exemplo, ser mediada por proteínas que interagem com as sequências operativamente ligadas. 0 RLP produzido dentro de uma planta pode induzir uma proteína estrutural de rotavirus VP7 compreendendo N-glicanos específicos da planta. Por conseguinte, esta invenção também proporciona um RLP que compreende VP7 com N-glicanos específicos de planta.
Além disso, a modificação do N-glicano nas plantas é conhecida (ver, por exemplo, US 2011/0008837) e VP7 com N-glicanos modificados podem ser produzidos. Podem ser obtidos VP7 compreendendo um padrão de glicosilação modificado, por exemplo com N-glicanos fucosilados reduzidos, xilosilados, ou ambos, N-glicanos fucosilados e xilosilados, ou podem ser obtidos VP7 com um padrão de glicosilação modificado, em que a proteína não possui fucosilação, xilosilação ou ambos, e compreende galactosilação aumentada. Além disso, a modulação de modificações pós-tradução, por exemplo, a adição de galactose terminal pode resultar em redução de fucosilação e xilosilação da VP7 expressada quando comparada a uma planta de tipo selvagem que expressa VP7.
Por exemplo, a síntese de VP7 com um padrão de glicosilação modificado pode ser conseguida por co-expressão de VP7 juntamente com uma sequência de nucleótidos que codifica beta-1,4 galactosiltransferase (GalT), por exemplo, mas não limitado a GalT de mamífero, ou GalT humano, no entanto GalT de outras fontes também podem ser usadas. O domínio catalítico de GalT também pode ser fundido em um domínio CTS (isto é, a cauda citoplasmática, domínio transmembranar, região de haste) da N-acetilglucosaminil transferase (GNT1), para produzir uma enzima híbrida GNTl-GalT e a enzima híbrida pode ser co -expressado com VP7. O VP7 também pode ser co-expresso juntamente com uma sequência de nucleótidos que codifica N-acetilglucosaminil transferase III (GnT-III), por exemplo, mas não limitado a GnT-III de mamífero ou GnT-III humano, GnT-III de outras fontes também podem ser usadas. Além disso, uma enzima híbrida GNTl-GnT-III, que compreende o CTS de GNT1 fundido com GnT-III também pode ser usada.
Portanto, a presente descrição também proporciona RLPs compreendendo VP7 com N-glicanos modificados.
Sem querer ser ligado pela teoria, a presença de N-glicanos de plantas em VP7 pode estimular a resposta imune promovendo a ligação de VP7 pelas células apresentadoras de antigeno. A estimulação da resposta imune usando a planta N glicano foi proposta por Saint-Jore-Dupas et al. (2007). O presente invento será ainda ilustrado nos seguintes exemplos.
Exemplos Exemplo 1
Expressão de protéase de rotavirus e a produção de VLP em folhas da planta N. benthamiana A seguinte análise utilizou proteínas de cápside de rotavirus da estirpe de rotavirus G9 P [6] e avaliou se as partículas semelhantes a rotavirus foram formadas nos vários compartimentos de células de folha de N. Benthamiana de tabaco. A co-expressão de VP2 e VP6, bem como várias combinações de VP2, VP6, VP7 e VP4 em folhas de plantas de tabaco foram investigadas.
Materiais e métodos Construção de plasmídeos
Os cADN de rotavirus otimizados com codões de plantas para VP2, VP4, VP6 e VP7 foram fornecidos pela Geneart, na Alemanha. O ADN plasmídeo foi transformado em células E. coli quimicamente competentes de DH5-oí {E. cloni™, Lucigen) de acordo com as instruções do fabricante. Novos vetores binários de Agrobacterium pTRAc (citoplasma), pTRAkc-rbcsl-cTP (alvejamento de cloroplasto) e pTRAkc-ERH (alvo de retículo endoplasmático) fornecidos por Rainer Fischer (Instituto Fraunhofer para Biologia Molecular e Ecologia Aplicada, IME, Alemanha) foram utilizados neste estudo. Um vetor adicional, pTRAkc-A (apoplast), foi derivado da modificação de pTRAkc-ERH por digestão de enzima de restrição (RE) nos locais Ncol e Xhol no site de clonagem múltipla (Figura 3) . Isso remove a etiqueta de histidina e a sequência de KDEL que retém proteínas no ER. As proteínas são, em vez disso, direcionadas ao apoplasto. 0 cADN de VP2, VP4 e VP6 foi enzima de restrição (RE) digerido com Ncol/Xhol enquanto que VP7 foi cortado com AflIII/ Xhol. As enzimas de restrição Afllll, Ncol e MluI possuem extremidades adesivas compatíveis. Para a clonagem direta do ADN em pTRAc, pTRAkc-rbcs-cTP e pTRAkc-A, os vetores foram RE digeridos nos locais AflIII/Xhol, Mlul/Xhol e Ncol/Xhol, respetivamente. A clonagem de ADN nos vetores foi realizada de acordo com o protocolo padrão seguido por transformação em células DH5-a de E. coli quimicamente competentes (E. cloni™, Lucigen). As colónias recombinantes selecionadas foram verificadas por PCR de colónia. Para a clonagem em pTRAkc-ERH, foi adicionado um local de enzima de restrição Notl para substituir o codão de parada de cada quatro cADN de rotavirus por amplificação por PCR. 0 cADN foi amplificado com iniciadores como detalhado na Tabela 1. As condições de reação de PCR incluíram a desnaturação a 95°C durante 5 min, seguido de cinco ciclos de desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, recozimento a 52eC durante 1 min e alongamento a 72°C durante 1,5 min. Outros 20 ciclos foram feitos da seguinte maneira; 95°C durante 30 segundos, 57°C durante 1 min, 72°C durante 1,5 min e 72°C durante 5 min. Os fragmentos amplificados foram então clonados em pGEM-T-Easy (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. A transformação foi realizada em E. coli DH5-a quimicamente competente (E. cloni™, Lucigen). A PCR de colónia foi então realizada em colónias selecionadas como feito para as outras três construções.
Tabela 1: iniciadores de cADN de rotavirus para clonagem de
vetores ER
Os ADN de pGEM-VP de colónias positivas foram sequenciados para verificar a fidelidade da PCR. 0 ADN foi digerido com Ncol/Notl e o fragmento de ADN apropriado clonado em pTRAkc-ERH nos locais Ncol e Notl para formar pTRAkc-ERH-VP. A transformação foi então realizada em células E. coli DH5-oí como previamente feito. A PCR de colónia também foi realizada para verificar o ADN de rotavirus em colónias selecionadas.
Transformação de Agrobacterium A estirpe Agrobacterium tumefaciens GV3101 foi fornecida pelo Professor Rainer Fischer (Instituto Fraunhofer para Biologia Molecular e Ecologia Aplicada IME, Aachen, Alemanha) e fabricado eletrocompetente como descrito anteriormente (Shen e Forde, 1989). Três centenas de nano gramas de construções de pTRA-VP de rotavirus isoladas foram misturados com 100 μΐ de células GV3101 de eletrocompetente em uma cuvete electrogap de 0,1 cm (BioRadTM), então eletroporados em urn GenePulser (BioRad) sob as seguintes configurações: 1.8 kV, 25 pF e 200. A incubação foi permitida durante 1 h a 27“C em 900 μΐ de LB antes do revestimento em placas LA contendo 50 pg/ml de carbenicilina (carb), 30 pg/ ml de canamicina (kan) e 50 pg/ml de rifampicina (rif) . As placas foram incubadas a 27°C durante 3 dias. Para verificar os transformantes positivos, o ADN plasmideo foi isolado a partir das colónias de Agrobacterium recombinantes e transformado de volta para as células DH5-a competentes de E. coli. Estes foram então selecionados em 100 pg/ml de ampicilina (amp) LA. A colónia de PCR e enzimas de restrição digeridas em cADN foram feitas para verificar os transformantes bem sucedidos. As reservas de glicerol de Agrobacterium recombinante relevante foram feitas e armazenadas a -70°C.
Infiltração de Agrobacterium recombinante A. tumefeciens LBA 4404 (pBIN-NSs) utilizado neste estudo foi obtido de Mareei Prins (Laboratório de Virologia, Wageningen University, Binnenhaven, Países Baixos). Contém o supressor de silenciamento NSs encontrado no vírus de Wilt manchado de tomate (TSWV). O Agrobacterium recombinante (pTRA-VPs) a partir de estoques de glicerol foi cultivado a 27°C durante a noite em LB com 50 pg/ml de carboidratos, 30 pg/ml de kan e 50 pg/ml de rif. Os Agrobacterium recombinantes e LBA4404 (pBIN-NSs) foram então inoculados em meio de indução (LB, MES de ácido 2- (N-morf olino) etanosulfónico 10 mM, MgS04 2 mM, acetoseringa 20 pM, 50 pg/ ml de carboidratos, 30 pg/ml kan e 50 pg/ml de rif e pH 5,6) .
As culturas foram incubadas a 27°C durante a noite. As células de Agrobacterium foram recolhidas por centrifugação a 4000 rpm durante 5 minutos a 4°C e depois ressuspensas em meio de infiltração de 2 ml (MES 10 mM, MgC12 10 mM, sacarose a 3%, pH 5,6, acetoseringa 200 uM e água estéril). A densidade ótica (OD600) das células foi verificada e diluída com meio de infiltração para obter uma OD600 de 0,25. Para cada construção de pTRA-VP, LBA4404 foi misturado com Agrobacterium recombinante até a OD600 final de 0,5. Para estudos de co-expressão, cada construção foi adicionada ao total de uma OD600 de 0,5, por exemplo; VP2 - 0,25 e VP6 -0,25, até o OD600 para a mistura igual a 0,5. A aceetosiringona utilizada no meio de indução e infiltração ajuda na ativação de genes vir em Agrobacterium.
As células da planta feridas liberam compostos fenólicos que são detetados pelos genes Vir A e Vir G em Agrobacterium, levando subsequentemente à indução da expressão da proteína nas células hospedeiras (Zupan, J. et al., 2000). As células foram então incubadas à temperatura ambiente durante 1 h para permitir que a acetossiringona induz genes vir. As plantas de N. benthamiana de tipo selvagem de três semanas de idade foram infiltradas com Agrobacterium recombinante que expressava as proteínas VP. Isso envolveu infiltração a vácuo de plantas inteiras ou injeção de Agrobacterium recombinante (pTRA-VP) nos espaços de ar abaxial no lado ventral das folhas da planta. O agrobacterium recombinante foi infiltrado com ou sem o supressor silenciador LBA 4404 (pBIN-NSs).
Inicialmente, injetou-se 2 ml de suspensão de meio de infiltração de Agrobacterium em cada planta usando uma seringa por construção. Uma planta foi usada por construção durante uma prova de sete dias. Também foi realizada co-expressão de proteínas de rotavirus em que VP2, VP6 e VP4 foram simultaneamente expressas no citoplasma de folhas de plantas de N. Benthamiana. As combinações investigadas foram VP2/6 e VP2/6/4. A proteína VP4 "pico" pode se ligar a VP6, e, portanto, existe a possibilidade de que elas possam adicionar estruturas RLP. A clonagem de VP7 foi tentada, mas problemas de toxicidade para células hospedeiras provaram ser um problema. 0 recombinante VP7 Agrobacterium matou células foliares no prazo de um dia após a infiltração. Vários métodos foram tentados a evadir isso, como infiltrar plantas a uma temperatura baixa de 17 ° Ce infiltrar-se após o dia 3 e/ou o dia 5 dos ensaios de tempo. Assim sendo, o VP7 foi omitido nos estudos de co-expressão devido à sua natureza tóxica nas plantas de tabaco.
Extração de proteínas
As folhas inteiras ou os discos de duas folhas por construção foram colhidos e moídos em nitrogénio líquido. A matéria da folha do solo foi ressuspensa em PBS estéril contendo o Inibidor Completo de Protéase (livre de EDTA, Roche). Isto foi então centrifugado durante 5 min a 13000 rpm e as pastilhas (matéria foliar da planta) foram descartadas. 100 μΐ de cada construção foram então misturados com tampão de carga SDS-PAGE 5X e cozidos durante 2 min a 95°C, prontos para análises adicionais sobre géis de SDS-PAGE e transferências de Western. O resto das amostras foi armazenado a -20°C para uso futuro. A Figura 4 mostra uma visão geral do procedimento de clonagem e infiltração para o cADN de rotavirus.
Extração de proteína apoplástlca
Um procedimento de extração adicional foi realizado nas construções pTRAkc-A, apoplasto. O apoplasto é o espaço difusional livre entre a membrana plasmática e as paredes celulares das células da planta (Figura 5a) . As proteínas expressas no citoplasma têm uma sequência de exportação que os direciona para o apoplasto, portanto, eles se acumulam aqui. No procedimento de extração que se seguiu, as folhas inteiras de cada dia de extração foram vazias ou injeção infiltradas com PBS estéril contendo o Inibidor de Protéase Completo. Para a infiltração a vácuo, as folhas de plantas individuais foram suspensas em PBS e colocadas sob vácuo a 100 mbar durante 10 minutos em um tanque de vácuo. As folhas foram então enroladas e colocadas suavemente em colunas de rotação (semelhantes às colunas de rotação de Qiagen) com um orifício na parte inferior (Figura 5b2). Os orifícios permitem fácil passagem do fluido das folhas sem permitir que a matéria sólida da folha passe. As colunas de rotação foram colocadas em tubos Eppendorf de 2 ml e a centrifugação foi realizada a 4000 rpm durante 15 min (Figura 5 b3) . 0 filtrado foi recolhido e o corante de carga de proteínas para gel de SDS-PAGE e a análise de transferência de Western foi adicionada a 100 μΐ de cada amostra de filtrado.
Manchas de Western Blots e Coomassie
As transferências de Western e os géis SDS-PAGE corados com azul de Coomassie foram utilizados como descrito anteriormente. O anticorpo VP6 anti-rotavírus de rato (US Biologicals) (1: 5000), anticorpo anti-rótulo de histidina de rato (Sigma®) (1:2000), soro anti-VP2 de frango e soro anti-VP4 de frango (1:2000) foram utilizados para sonda cada uma das proteínas respetivas em Western Blots. Os géis SDS-PAGE corados com azul de Coomassie foram utilizados para quantificar proteínas por análise de densidade de bandas usando um Sistema de Documentação de Gel Syngene.
Microscópio eletrónico
Para determinar se as proteínas expressas foram montadas em RLPs, a microscopia eletrónica de transmissão (TEM) de partículas imuno-aprisionadas foi realizada no dia 3 da expressão do citoplasma expresso VP6, VP2/6 e VP2/6/4, tudo na presença de um supressor silenciador Nss. As grelhas de carbono/cobre descarregadas por fulgor foram colocadas em 20 μΐ de anticorpo VP6 anti-rotavirus de rato (1: 5000) durante 5 min e depois lavadas 3 vezes com água destilada estéril. As grelhas foram então colocadas em 10 μΐ dos extratos de proteína e deixadas durante 2 min antes de serem lavadas 3 vezes novamente com água destilada estéril. Finalmente, as grelhas flutuaram em 20 μΐ de acetato de uranil a 2% durante 1 min antes de serem visualizadas sob um TEM (Zeiss 912 OMEGA Energy Filter Transmission Electron Microscope, Universidade de Cape Town).
Para amostras isoladas de gradientes de sacarose, a sacarose primeiro teve que ser removida por diálise antes da imobilização nas redes de cobre. Se não for removido, os cristais de sacarose inibem a visualização definitiva de amostras sob o TEM, pois forma cristais nas grades, interrompendo a estrutura do carbono e do material unidos. As frações de sacarose foram colocadas em cassetes de diálise de 10 000 MW e dialisadas em PBS estéril contendo NaCl 0,4 M durante 4 horas antes de trocar o tampão e deixá-lo durante a noite a 4°C com agitação. Como o volume aumenta com a diálise, as amostras de proteínas precisam se concentrar. As amostras foram congeladas por vácuo durante 3 horas e ressuspensas em 2 ml de PBS estéril, pronto para análise posterior.
Purificação de gradiente de sacarose de RLPs
Os extratos de proteínas vegetais foram inicialmente filtrados através de miracloth para remover a matéria sólida da planta. Os gradientes de sacarose de 10 a 60% de sacarose foram configurados em tubos de 40 ml cada, criando seis camadas de 5 ml de sacarose dissolvidas em PBS estéril (pH 7,4). As amostras de proteínas clarificadas em volumes de 5 a 10 ml foram então carregadas em cima de cada coluna de gradiente. A ultracentrifugação a 150 000 g (rotor de balde balanço SWTÍ28, Beckman Coulter) foi realizada a 4eC durante 1 h 30 min. No final da centrifugação, foram recolhidas frações de 2 ml do fundo de cada coluna por punção do tubo. As transferências de pontos foram então realizadas para determinar frações com proteínas de interesse. Para cada fração, 1 μΐ de amostra foi carregado em uma grade em uma membrana de nitrocelulose, que foi então bloqueada com tampão de bloqueio de BSA. A análise de transferência de Western foi então realizada como de costume. As proteínas foram sondadas com anticorpo anti-VP6 de rato (1: 5000) para VP6 ou frango anti-VP2 e soro VP4 (1: 5000) para as outras duas proteínas.
Ensaio de Proteína Total Solúvel A proteína solúvel total (TSP) foi determinada por ensaios de Bradford. Isto foi realizado para comparar os níveis de proteínas acumuladas no citoplasma co-expresso VP2/6. A proteína IgG (1,43 mg/ml de reserva) foi utilizada em uma série de diluição como padrão. 5 μΐ de padrão e amostras foram adicionados a uma placa de microtitulação seca limpa. Os reagentes A e B de Proteínas Solúveis Totais foram adicionados de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad Dc Protein Assay). Todas as experiências foram realizadas em triplicado. As leituras de absorvência foram registradas a 750 nm usando um leitor de microplacas (Bio-tek PowerWave XS).
Resultados
Expressão de VP6 nos compartimentos de células vegetais O VP6 foi expresso e direcionado para todos os compartimentos celulares (Figura 6; (as marcas de linha VP6, a ~ 42 kDa)), com e sem o supressor silenciador. No citoplasma, a proteína foi expressa no primeiro dia da experimentação, com aumento da acumulação proteica no citoplasma durante o teste de uma semana (Figura 6a) . No ER, a acumulação de proteína foi claramente vista apenas no dia 3 {Figura 6b) . A proteína correu em um tamanho de banda maior (aproximadamente 11 kDa mais) do que as outras proteínas. Isto pode ser um resultado da etiqueta de histidina 6 adicionada à extremidade C-terminal da proteína, bem como o local de clivagem (consulte a sequência do vetor pProEx) A acumulação de proteínas nos cloroplastos ocorreu entre os dias 1 e 3 (Figura 6 "cloroplastos"). 0 supressor silenciador teve efeito sobre as proteínas, uma vez que nenhuma proteína foi detetada na ausência. Não houve expressão de proteína nos dias 5 e 7. 0 apoplasto, assim como no ER, teve a melhor acumulação de proteína entre os dias 3 e 5 da contraprova (Figura 6 "apoplasto") e nenhum no dia 1 e dia 7. 0 supressor silenciador teve um efeito positivo especialmente no dia 3, resultando em maiores níveis de deteção de proteínas em comparação com quando foi deixado de fora. Também pode ser visto que duas bandas são visíveis na marca de ~ 40 kDa provavelmente como resultado da clivagem da marca de sinalização na proteína VP6. O ER, os cloroplastos e o apoplasto exibiram a maior expressão proteica no dia 3, com a maior parte da proteína acumulada na presença do supressor silenciador. O citoplasma foi o melhor em termos de acumulação de proteínas, pois apresentava alta e crescente expressão proteica ao longo do tempo de experimentação.
Expressão de proteínas de rotavirus marcadas com histidina no citoplasma
Os quatro VPs de rotavirus foram clonados em um vetor adicional, pTRAc-HT. Este vetor inclui uma marca de 6-histidina para proteínas direcionadas ao citoplasma e facilita a deteção pelo uso de um anticorpo anti-histidina se os anticorpos para as proteínas de interesse não estiverem disponíveis. No nosso caso, apenas o VP6 possui um anticorpo comercialmente disponível e, portanto, tentamos esse procedimento para a deteção precoce de todas as proteínas enquanto aguardamos soro. 0 citoplasma também funcionou bem para a expressão de VP6 e nos motivou a experimentar as outras proteínas.
Os resultados de Western blot dos extratos do dia 3 de um teste de tempo de 7 dias mostraram expressão bem sucedida de VP2, VP4 e VP6 (Figura 7a). Para obter a expressão de VP7 em plantas, várias técnicas foram testadas. No entanto, as plantas infiltradas com VP7 exibiram folhas amareladas a partir do dia 1 e passaram a conduzir durante o decurso da contraprova (Figura 7b). Nenhuma expressão de proteína foi detetada nestas condições, mesmo após o dia 1 da infiltração quando a planta ainda parecia razoavelmente boa.
Expressão de VP2 e VP4 em plantas VP2 e VP4 foram infiltrados nas folhas da planta de N. benthamiana e direcionados para ER, cloroplasto, citoplasma e apoplasto. Não conseguimos expressar o VP2 direcionado ao vetor apoplasto, pois não conseguimos obter nenhum clone positivo em E. coli. No entanto, a proteína foi expressada com sucesso e destinada a todos os outros 3 compartimentos (Figura 8a). 0 soro de frango anti-VP2 e anti-VP4 (1: 2000) foi utilizado na análise Western Blot de extratos. As bandas VP2 e VP4 foram visíveis logo abaixo da marca de 100 kDa (banda de proteína indicada pela seta) como visto na Figura 8a e 8b, respetivamente. A expressão parecia ser melhor no citoplasma e ER para VP2 enquanto que para VP4, no citoplasma e apoplasto. O supressor silencioso não teve um efeito significativo na expressão das proteínas. Somente aumentou ligeiramente a expressão na construção VP2 ER e não tanto no resto, como pode ser visto a partir do western blot. As construções VP4 foram todas expressas na presença do supressor silenciador.
Co-expressão de VP2/6 e VP2/6/4 no citoplasma 0 citoplasma pareceu ser o melhor para a expressão da proteína da cápside de rotavirus e exibiu as maiores eficiências de extração. Todo o trabalho de expressão adicional foi feito com proteínas direcionadas ao citoplasma. VP2 e VP6 demonstraram formar RLPs com respostas imunogénicas protetoras em ratinhos e, portanto, a co-expressão de VP2/ 6 e VP2/6/4 no citoplasma foi investigada. Os extratos do dia 3 de VP2/6/4 co-expressos foram detetados por western blot com soro anti-VP2 e VP4 (1/5000) e anticorpo anti-VP6 de mouse (1: 5000) (Figura 9). A expressão de VP6 foi muito alta conforme determinado anteriormente, mas a expressão de VP2 e VP4 era muito baixa, como pode ser visto na faixa muito fraca na marca de 100 kDa. Isso pode ter sido atribuído pela co-expressão, o que resultou em mais recursos de células hospedeiras sendo utilizados na sobre-expressão de VP6, deixando menos para VP2 e/ou VP4. Também não foi fácil determinar se a banda detetada era VP2 e VP4 ou qualquer uma das duas proteínas. A banda muito visível que ultrapassa 130 kDa pode ser proteínas VP6 dimerizadas. A análise microscópica eletrónica de transmissão no VP6 expressado pelo citoplasma, bem como em VP2/6 e VP2/6/4 co-expressas, foram realizadas para verificar partículas de proteína e RLPs montadas (Figura 10) . Isso também determinou se VP2 e/ou VP4 foram realmente co-expressados com sucesso. VP6 quando expresso sozinho montado para formar bainhas de proteína como indicado pela seta na Figura 10b. Na adição de VP2, as partículas foram montadas para formar RLPs (Figura 10c). VP2 atua como proteína de andaime que permite que outras proteínas se juntem e, em última instância, formem uma estrutura completa de rotavirus. VP6 como tal ligado a VP2, mas ainda não era fácil determinar as estruturas VP4 na VP2/6/4 co-expressa. A micrografia eletrónica na Figura lOd pode ser partículas VP2/6 puramente montadas. Verificou-se, no entanto, que VP4 se liga a VP6 durante a montagem da proteína, e isso ocorre antes que o VP7 se liga. É provável que essas estruturas VP4 não sejam estáveis e possam cair da estrutura RLP durante os procedimentos de preparação para microscopia eletrónica.
Purificação de gradiente de sacarose de VP2/6 e VP2/6/4 VP2/6 e VP2/6/4 foram purificados num gradiente de sacarose variando de 10 a 60% de sacarose (Figura 11a). As frações de 2 ml foram recolhidas a partir do fundo de cada um dos tubos e sondadas com anticorpo anti-VP6 de rato e/ou soro de frango anti-VP2 e VP4 para determinar quais as frações contidas as proteínas. Para VP2/6, as proteínas foram encontradas nas frações 16 e 17, uma vez que estas foram positivas para a proteína VP6 na mancha (Figura 11b). A análise de mancha VP2/6/4 com soro anti-VP2 e VP4 de frango mostrou resultados positivos em todas as frações. Isso pode ter sido como resultado dos altos níveis de deteção de proteína de fundo pelo soro de frango. No entanto, a intensidade dos pontos foi maior nas frações 17 e 18, como se observa na Figura 11c, possivelmente devido à maior concentração das proteínas de interesse nessas frações.
Juntando estes resultados juntos (Figura 11b e 11c), as proteínas do rotavirus estavam em frações variando de 16 a 20.
Manchas de frações Western Blot e Coomassie
Uma mancha de Western e SDS-PAGE de VP2/6 co-expressas foram feitas para verificar a presença de proteínas VP2 e VP6 nas frações 13 a 20. A análise de Western Blot para a proteína VP6 sondada com o anticorpo anti-VP6 de rato foi positiva nas frações 16 através da para 20 (Figura 12a, seta inferior e Figura 12c). A proteína VP2 sondada com soro anti-VP2 de frango foi detetada nas frações 17 a 20 (Figura 12a, seta superior). A VP2 mostrou expressar menos de VP6 em estudos anteriores de co-expressão e isso também foi mostrado aqui na Figura 12a na qual as bandas de proteína VP2 têm menor intensidade em comparação com VP6.
As frações 16 e 17 de VP2/6 co-expressas previamente determinadas para conter a proteína VP6 por transferência de ponto (Figura 11b) foram submetidas a electroforese num gel SDS-PAGE. Uma proteína de concentração conhecida, a célula de inseto SF9 expressa VP6 (0,91 pg/μΐ) foi incluída de modo a determinar a concentração de proteínas brutas VP2/6 (Figura 11b e c). Isto foi feito por varredura de densidade da banda de proteína bruta (ruído marcado com pista) utilizando um sistema de documentação de gel Syngene e, consequentemente, permitiu-nos determinar a quantidade de VP2/6 por quilograma de matéria foliar. Verificou-se que o rendimento de proteína era aproximadamente 1,54 g/kg de peso fresco (FW) . Foram obtidos 1,1 mg de RLP purificados a partir de 1 grama de material vegetal (1,1 g/kg).
Ensaio de Proteína Total Solúvel de VP2/6 A proteína solúvel total (TSP) foi determinada em frações VP2/6 co-expressas para determinar as quantidades relativas de proteína VP2/6 (Figura 13). As concentrações de proteína foram calculadas como 0,538 mg/ml e 1,012 mg/ml para as frações 17 e 18, respetivamente, com o uso de um padrão de IgG (Figura 13a). As bandas de proteína correspondentes a VP2/6 nessas frações foi calculada por varredura de densidade em um Sistema de Documentação de Gel de Syngene e encontrou-se aproximadamente 0,108 mg/ml e 0,202 mg/ml, respetivamente.
Assim, o TSP para VP2/6 nas frações 17 e 18 foram ambos aproximadamente 20% TSP A maioria das RLPs na coluna de sacarose encontrou-se entre 15 e 25% de sacarose, correspondendo às frações 15 a aproximadamente 20, onde o gráfico é notou que de repente pico e depois diminuir. As diferenças de densidade dos vários materiais no extrato me permitiram separar e assim purificar as proteínas de interesse. Os géis de SDS-PAGE corados com azul de Coomassie mostraram apenas uma banda proeminente indicando que as proteínas são relativamente puras {Figura 12b). TEM de VP2/6 purificado
As frações de VP2/6 purificadas foram reunidas e dialisadas em PBS de alto teor de sal para remover a sacarose antes de ver em um microscópio eletrónico de transmissão. O TEM foi feito para determinar a pureza e verificar se RLPs permaneceram intactos após o procedimento de purificação. Como pode ser visto na Figura 15, a maior parte do material de fundo que consistiu principalmente nos produtos da célula hospedeira (Figura 10b, c e d) foi removido, deixando para trás RLPs. A maioria das RLPs permaneceu intacta, mas algumas pareciam ter perdido forma provavelmente como resultado da deformação devido às condições na grade EM.
Análise preliminar da expressão de proteínas estruturais de rotavirus em folhas de N. benthamiana
Esta análise preliminar centrou-se na expressão de proteínas estruturais de rotavirus VP2 (SEQ ID NO: 1), VP4 (SEQ ID NO: 2), VP6 (SEQ ID NO: 3) e VP7 (SEQ ID NO: 4) em N. benthamiana parte como um exemplo de sistema de expressão do hospedeiro. A estirpe do rotavirus selecionado aqui era uma cepa G9 P [6] que circula predominantemente na África do Sul e outras regiões subsaarianas. Uma vacina RLP visando essa cepa ajudaria a aliviar o ónus da doença na África subsaariana.
Um sistema de expressão transitório mediado por
Agrobacterium foi utilizado nesta análise. A expressão transitória, em oposição à expressão transgênica, permite a rápida expressão das proteínas em um tempo relativamente curto, sem integração dos genes da proteína da cápside de rotavirus no cromossoma do hospedeiro. A maioria das proteínas foi expressa e acumulada em quantidades detetáveis no dia 3 da infiltração recombinante de Agrobacterium em folhas de N. benthamiana. Como mostrado abaixo, observou-se a expressão bem sucedida de várias proteínas estruturais de rotavirus, incluindo VP2, VP4 e VP6 nos compartimentos das células da planta, conforme detalhado na tabela 2:
Tabela 2: Expressão das proteínas VP de rotavirus em vários contartimentos de células foliares
A expressão da glicoproteína VP7 não foi observada possivelmente devido aos seus efeitos tóxicos nas células vegetais. Vale ressaltar que, para este estudo preliminar, foi utilizado um VP7 contendo seu péptido sinal nativo. A infiltração no dia 3 durante os ensaios de co-expressão também foi testada. Isto foi tentado para ver se a proteína foi expressa e logo depois montada com VP2 e VP6 para formar RLPs. A natureza tóxica da VP7 recombinante como observada neste estudo foi descrita anteriormente (Williams et al., 1995; McCorquodale, 1987; Arias et al., 1986).
Estudos anteriores de expressão de VP7 em batatas transgénicas foram relatados (Li et al., 2006; Choi et al., 2005; Wu et al., 2003). Choi et al. (2005) usou um rotavirus simiano VP7, e Li et al. e Wu et al. (Li et al., 2006; Wu et al., 2003) usaram grupo humano Gl VP7. O resultado aqui descrito usa o rotavirus humano G9 VP7. O VP2 foi expresso e direcionado para todos os compartimentos, exceto o apoplasto, pois não conseguimos clonar o cADN apropriado, e as restrições de tempo só nos permitiram algumas tentativas antes de prosseguir com as outras construções. Os níveis de expressão de VP2 foram notadamente significativamente baixos em todos os compartimentos. Em um estudo anterior citado por Saldana et al. 2006, concluiu-se que um VP2 com sua sequência otimizada para expressão na planta era impossível de expressar, apesar de o mRNA ser detetado nas células da planta. No entanto, eles conseguiram expressá-lo em células de plantas de tomate usando ADN sintético. O motivo da dificuldade na expressão de VP2 é mais provável como resultado de uma tradução incorreta de mARN ou que o mARN contém alguns motivos de sequência que desestabilizam as células da planta (Kawaguchi e Bailey-Serres, 2002). A evidência dos baixos níveis de expressão de VP2 em comparação com VP6 tem sido observada em estudos de expressão de células de plantas e insetos por Mena et al. (2006), Saldana et al. (2006), Vieira et al. (2005) e Labbé et al. (1991). A proteína externa da cápside, VP4, que forma picos na superfície da estrutura do virião, foi expressa e direcionada para acumulação no citoplasma, ER e apoplasto. Não foi detetada acumulação de proteína nos cloroplastos. Conforme observado para VP2, os níveis de expressão proteica para VP4 foram menores do que os observados para VP6 em Western Blots. A proteína possui um local de clivagem da tripsina que resulta em duas proteínas, VP5 e VP8. Pode ser possível que a tripsina local em folhas de N. benthamiana cliva algumas das proteínas à medida que elas são produzidas, resultando em níveis de concentração mais baixos de VP4 intacta acumulada nos compartimentos designados. A proteína mostrou ser um grande antígeno neutralizante, mas houve algumas tentativas para clonar toda a proteína para o desenvolvimento da vacina (Khodabandehloo et al., 2009; Mahajan et al., 1995; Nishikawa et al., 1989). Houve, no entanto, vários estudos no sistema de expressão de células de insetos e leveduras que mostram a expressão das subunidades VP5 ou VP8 de VP4 (Andrés et al., 2006; Favacho et al., 2006; Kovacs-Nolan et al., 2001). Até à data, o presente estudo representa o primeiro estudo que mostra a expressão de toda a proteína em um sistema de expressão vegetal. O VP6 foi expresso em todos os compartimentos com sobre-expressão observada no citoplasma com acumulação de proteína observada entre o dia 1 e o dia 7 neste compartimento. Isso é contrário a alguma literatura que sugere que a atividade da protéase e o silenciamento gênico reduzem ou dificultam o acúmulo de proteína estranha no citoplasma (Fischer et al., 2004). Além disso, dado as condições de pH corretas, VP6 é conhecido por automontagem em partículas tubulares ou helicoidais, bem como as partículas observadas em nosso estudo (Figura 9b) (Estes et al., 1987) . O VP6 representa cerca de 50% do núcleo virai e, portanto, é um importante antígeno no desenvolvimento de uma vacina contra rotavirus. 0 resultado alcançado acima permitiu-nos investigar ainda mais a co-expressão de VP2, VP6 e VP4 no citoplasma.
Quando co-expressa no citoplasma, VP2 e VP6 montados para formar RLPs. Foram observados rendimentos de proteína muito elevados a partir do sistema de expressão transitória de entre 1,27 - 1,54 g/kg de FW. Quando purificado numa coluna de sacarose, a quantidade de VPs retida foi de 1,1 g/kg de FW. Este rendimento é comparável ao obtido para a produção de um anticorpo, IgG, utilizando um sistema de expressão transitória em N. benthamiana, com um rendimento de até 1,5 g/kg de FW (Vézina et al·., 2009) . Saldana et al. (2006) foram até agora o único grupo conhecido por co-expressar com sucesso rotavirus VP2 e VP6 em plantas de tomate transgénico e níveis de aproximadamente 1% de proteína solúvel total. A montagem de VP2/6 no sistema de expressão de células de insetos foi bem documentada (Vieira et al., 2005; O'Brien et al., 2000). Estas VPLs VP2/6 também demonstraram proporcionar imunidade protetora contra a infeção por rotavirus (Zhou et al·., 2011, Saldana et al., 2006). Assim, as RLP VP2/6 que produzimos no sistema de expressão da planta são candidatos adequados para o desenvolvimento de uma vacina de rotavirus de subunidades. VP2/6/4 também foram co-expressos e detetados. O primeiro pico visível (Figura 14, fração 16) na leitura total de absorvência de proteína das proteínas co-expressas pode ser montado VP2/6/4, mas ao examinar essa fração sob TEM, não foram detetadas RLPs. O pico de proteína observado pode resultar de uma acumulação de monómeros VP4 ou suas respetivas subunidades VP5 e VP8. O segundo pico (fração 18), quando examinado sob TEM, mostrou estruturas RLP muito parecidas com as observadas na amostra VP2 / 6. No entanto,
Crawford et al já relataram que o VP4 não podia ser visto sob TEM, e que as partículas VP2/6/4 e VP2/6/4/7 tinham estrutura e diâmetro similares em TEM (Crawford, 1994). Nós fizemos a mesma observação para RLPs VP2/6/7, VP 2/6/4/7 e RLPs VP2/6, que parecem semelhantes sob TEM normal.
Exemplo 2 Construções A-2X35S/CPMV-HT/RVA (WA) VP2 (opt)/NOS (Construção número 1710)
Uma sequencia otimizada que codifica VP2 da estirpe Rotavirus A WA foi clonada no sistema de expressão 2X35S-CPMV-HT-NOS num plasmídeo contendo a cassete de expressão Plasto_pro/ P19/Plasto_ter usando o seguinte método baseado em PCR. Um fragmento contendo a sequência de codificação VP2 foi amplificado usando iniciadores IF-WA_VP2 (opt).sl + 3c (Figura 17A, SEQ ID NO: 21) e IF-WA_VP2 (opt).sl-4r (Figura 17B, SEQ ID NO: 22), usando a sequência do gene VP2 otimizada (Figura 19, SEQ ID NO: 45) como modelo. Para a otimização de sequência, a sequência da proteína VP2 (número de acesso do Genbank CAA33074) foi traduzida de forma reversa e otimizada para o uso de codões humanos, conteúdo de GC e estrutura de mARN. O produto de PCR foi clonado no sistema de expressão 2X35S/CPMV-HT/NOS usando o sistema de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). O número de construção 1191 (Figura 17C) foi digerido com enzima de restrição SacII e StuI e o plasmídeo linearizado foi utilizado para a reação de montagem In-Fusion. 0 número de construção 1191 é um plasmídeo aceitador destinado à clonagem "In Fusion" de genes de interesse em uma cassete de expressão baseada em CPMV-HT. Também incorpora uma construção genética para a co-expressão do supressor TBSV P19 do silenciamento sob o promotor e terminador do gene de Plastocianina de alfafa. A estrutura é um plasmídeo binário de pCAMBIA e a sequência das bordas de ADN-t de esquerda para direita é apresentada na Figura 18 (SEQ ID NO: 23) . A construção resultante recebeu o número 1710 (Figura 23, SEQ ID NO: 27) . A sequência de aminoácidos da estirpe de VP2 de Rotavirus A WA é apresentada na Figura 20 (SEQ ID NO: 25) . Uma representação do plasmídeo 1710 é apresentada na Figura 21. B-2X35S/CPMV-HT/RVA (WA) VP2 (opt) / NOS no sistema de amplificação BeYDV (m) + Replicase (Construção número 1711)
Uma sequencia otimizada que codifica VP2 da estirpe Rotavirus A WA foi clonada em 2X35S / CPMV-HT / NOS compreendendo o sistema de amplificação BeyDV (m) + replicase em um plasmídeo contendo cassete de expressão Plasto_pro / P19 / Plasto_ter usando o seguinte método baseado em PCR. Um fragmento contendo a sequência de codificação VP2 foi amplificado usando iniciadores IF-WA_VP2 (opt) .sl + 3c (Figura 17A, SEQ ID NO: 21) e IF-WA_VP2 (opt) .sl-4r (Figura 17B, SEQ ID NO: 22) , utilizando a sequência do gene VP2 otimizada (SEQ ID NO: 45) como modelo. Para a otimização de sequência, a sequência da proteína VP2 (número de acesso do Genbank CAA33074) foi traduzida de forma reversa e otimizada para o uso de codões humanos, conteúdo de GC e estrutura de mARN. 0 produto de PCR foi clonado na cassete de expressão 2X35S / CPMV-HT / NOS no sistema de amplificação BeYDV (m) usando o sistema de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . A construção 193 (Figura 22A) foi digerida com enzima de restrição SacII e StuI e o plasmídeo linearizado foi utilizado para a reação da montagem In-Fusion. O número de construção 193 é um plasmídeo aceitante destinado à clonagem "In Fusion" de genes de interesse em uma cassete de expressão baseada em CPMV-HT no sistema de amplificação BeYDV (m). Também incorpora uma construção genética para a co-expressão do supressor TBSV P19 do silenciamento sob o promotor e terminador do gene de Plastocianina de alfafa. A estrutura é um plasmídeo binário de pCAMBIA e a sequência das bordas de ADN-t da esquerda para a direita é apresentada na Figura 22B (SEQ ID NO: 26) . A construção resultante recebeu o número 1711 (Figura 23, SEQ ID NO: 27) . A sequência de aminoácidos da estirpe de VP2 de Rotavirus A WA é apresentada na Figura 20 (SEQ ID NO: 25).
Uma sequencia otimizada que codifica VP6 da estirpe Rotavirus A WA foi clonada no sistema de expressão 2X35S-CPMV-HT-NOS num plasmideo contendo uma cassete de expressão Plasto_pro / P19 / Plasto_ter utilizando o seguinte método baseado em PCR. Um fragmento contendo a sequência de codificação de VP6 foi amplificado usando iniciadores IF-WA_VP6 (opt) .sl + 3c (Figura 25a, SEQ ID NO: 28) e IF-WA_VP6 (opt) .sl-4r (Figura 25b, SEQ ID NO: 29), utilizando uma sequência de genes VP6 otimizada (SEQ ID NO: 46) como modelo. Para a otimização de sequência, a sequência de proteína VP6 (número de acesso Genbank AAA47311) foi traduzida de forma reversa e otimizada para uso de codão humano, conteúdo de GC e estrutura de mRNA. O produto de PCR foi clonado no sistema de expressão 2X35S / CPMV-HT / NOS usando o sistema de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). O número de construção 1191 (Figura 17c) foi digerido com enzima de restrição SacII e StuI e o plasmideo linearizado foi utilizado para a reação de montagem In-Fusion. O número de construção 1191 é um plasmideo aceitador destinado à clonagem "In Fusion" de genes de interesse em uma cassete de expressão baseada em CPMV-HT. Também incorpora uma construção genética para a co-expressão do supressor TBSV P19 do silenciamento sob o promotor e terminador do gene de Plastocianina de alfafa. A espinha dorsal é um plasmideo binário de pCAMBIA e a sequência das bordas de ADN-t de esquerda para direita é apresentada na Figura 18 (SEQ ID NO: 23) . A construção resultante recebeu o número 1713 (Figura 25c, SEQ ID NO: 30). A sequência de aminoácidos de VP6 da estirpe de Rotavirus A WA é apresentada na Figura 26 (SEQ ID NO: 31) . Uma representação do plasmídeo 1713 é apresentada na Figura 27. D-2X35S / CPMV-HT / RVA (WA) VP6 (opt) / NOS no sistema de amplificação BeYDV fm) + Replicase (número de construção 1714)
Uma sequencia otimizada que codifica VP6 da estirpe Rotavirus A WA foi clonada em 2Χ35Ξ / CPMV-HT / NOS compreendendo o sistema de amplificação BeyDV (m) + replicase num plasmídeo contendo cassete de expressão Plasto_pro / P19 / Plasto_ter usando o seguinte método baseado em PCR. Um fragmento contendo a sequência de codificação de VP6 foi amplificado usando iniciadores IF-WA_VP6 (opt) .sl + 3c (Figura 25a, SEQ ID NO: 28) e IF-WA_VP6 (opt) .sl-4r (Figura 25b, SEQ ID NO: 29), utilizando uma sequência de genes VP6 otimizada (SEQ ID NO: 46) como modelo. Para a otimização de sequência, a sequência de proteína VP6 (número de acesso Genbank AAA47311) foi traduzida de forma reversa e otimizada para uso de codão humano, conteúdo de GC e estrutura de mRNA. 0 produto de PCR foi clonado na cassete de expressão 2X35S / CPMV-HT / NOS no sistema de amplificação BeYDV (m) usando o sistema de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . A construção 193 (Figura 22A) foi digerida com enzima de restrição SacII e StuI e o plasmídeo linearizado foi utilizado para a reação da montagem In-Fusion. 0 número de construção 193 é um plasmídeo aceitante destinado à clonagem "In Fusion" de genes de interesse em uma cassete de expressão baseada em CPMV-HT no sistema de amplificação BeYDV (m) . Também incorpora uma construção genética para a co-expressão do supressor TBSV P19 do silenciamento sob o promotor e terminador do gene de Plastocianina de alfafa. A espinha dorsal é um plasmídeo binário de pCAMBIA e a sequência das bordas de ADN-t da esquerda para a direita é apresentada na Figura 22B (SEQ ID NO: 26) . A construção resultante recebeu o número 1714 (Figura 28, SEQ ID NO: 32). A sequência de aminoácidos de VP6 da estirpe de Rotavirus A WA é apresentada na Figura 26 {SEQ ID NO: 31). C-2X35S / CPMV-HT / RVA (Rtx) VP4 (opt) / NOS (Construtor número 1730)
Uma sequência otimizada que codifica VP4 da vacina de Rotavirus A EUA / Rotarix-A41CB052A / 1988 / GlPlA [8] foi clonada em 2Χ35Ξ / CPMV-HT / NOS num plasmideo contendo uma cassete de expressão Plasto_pro / PI9 / Plasto_ter usando o seguinte método baseado em PCR . Um fragmento contendo a sequência de codificação VP4 foi amplificado usando primers IF-Rtx_VP4 (opt) .sl + 3c (Figura 30A, SEQ ID NO: 33) e IF-Rtx_VP4 (opt) .sl-4r (Figura 30B, SEQ ID NO: 34), usando a sequência de genes VP4 otimizada (Figura 31B, (SEQ ID NO: 47) como modelo. Para otimização de sequência, a sequência de proteína VP4 (número de acesso Genbank AEX30660) foi traduzida de forma reversa e otimizada para o uso de codões humanos, conteúdo de GC e estrutura de maRN. 0 produto de PCR foi clonado na cassete de expressão 2X35S / CPMV-HT / NOS usando o sistema de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Construindo o número 1191 (Figura 18, SEQ ID NO: 23) foi digerido com enzima de restrição SacII e StuI e o plasmideo linearizado foi utilizado para a reação de montagem In-Fusion. O número de construção 1191 é um plasmideo aceitador destinado à clonagem "In Fusion" de genes de interesse em uma cassete de expressão baseada em CPMV-HT. Também incorpora uma construção genética para a co-expressão do supressor TBSV P19 do silenciamento sob o promotor e terminador do gene de Plastocianina de alfafa. A espinha dorsal é um plasmideo binário pCAMBIA e a sequência das margens de t-ADN da esquerda para a direita é apresentada (Figura 18, SEQ ID NO: 23). A construção resultante recebeu o número 1730 (Figura 31C, SEQ ID NO: 50) . A sequência de aminoácidos de VP4 da vacina de Rotavirus A USA / Rotarix-A41CB052A / 1988 / G1P1A [8] está apresentada na Figura 32 (SEQ ID NO: 36) . Uma representação do plasmideo 1730 é apresentada na Figura 33A. E-2X35S / CFMV-HT / RVA (Rtx) VP4 (opt) / NOS no sistema de amplificação BeYDV fm) + Replicase (número de construção 1731)
Uma sequencia otimizada que codifica VP4 da vacina de Rotavirus A USA / Rotarix-A41CB052A / 1988 / G1P1A [8] foi clonada em 2X35S / CPMV-HT / NOS compreendendo o sistema de amplificação BeyDV (m) + replicase num plasmídeo contendo Plasto_pro / P19 / Cassete de expressão Plasto_ter usando o seguinte método baseado em PCR. Um fragmento contendo a sequência de codificação VP4 foi amplificado usando primers IF-Rtx_VP4 (opt) .sl + 3c (Figura 30A, SEQ ID NO: 33) e IF-Rtx_VP4 (opt) . sl-4r (Figura 30B, SEQ ID NO: 34), utilizando uma sequência de genes VP4 otimizada (SEQ ID NO: 47) como modelo. Para a otimização de sequência, a sequência de proteína VP4 (número de acesso do Genbank AEX30660) foi traduzida de forma reversa e otimizada para o uso de codões humanos, conteúdo de GC e estrutura de mRNA. 0 produto de PCR foi clonado na cassete de expressão 2X35S / CPMV-HT / NOS no sistema de amplificação BeYDV (m) usando o sistema de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . A construção 193 (Figura 22A) foi digerida com enzima de restrição SacII e StuI e o plasmideo linearizado foi utilizado para a reação da montagem In-Fusion. O número de construção 193 é um plasmídeo aceitante destinado à clonagem "In Fusion" de genes de interesse em uma cassete de expressão baseada em CPMV-HT no sistema de amplificação BeYDV (m) . Também incorpora uma construção genética para a co-expressão do supressor TBSV P19 do silenciamento sob o promotor e terminador do gene de Plastocianina de alfafa. A estrutura é um plasmídeo binário de pCAMBIA e a sequência das bordas de ADN-t da esquerda para a direita é apresentada na Figura 22B (SEQ ID NO: 26) . A construção resultante recebeu o número 1731 (Figura 31, SEQ ID NO: 35) . A sequência de aminoácidos de VP4 da vacina de Rotavirus A USA / Rotarix-A41CB052A / 1988 / GlPlA [8] está apresentada na Figura 32 (SEQ ID NO: 36) . Uma representação do plasmídeo 1731 é apresentada na Figura 33B. F-2X35S / CPMV-HT / RVA (Rtx) VP7 (opt) / NOS (Construção número 1733)
Uma sequência otimizada que codifica VP7 com péptido de sinal nativo da vacina de Rotavirus A USA / Rotarix-A41CB052A / 1988 / G1P1A [8] foi clonada no sistema de expressão 2X35S-CPMV-HT-NOS num plasmídeo contendo uma cassete de expressão Plasto_pro / P19 / Plasto_ter usando o seguinte método baseado em PCR. Um fragmento contendo a sequência codificadora de VP7 foi amplificado usando iniciadores IF-Rtx_VP7 (opt) . sl + 3c (Figura 34A, SEQ ID NO: 37) e IF-Rtx_VP7 (opt) .sl-4r (Figura 34B, SEQ ID NO: 38), utilizando a sequência de genes VP7 otimizada (SEQ ID NO: 54) como modelo. Para a otimização de sequência, a sequência da proteína VP7 (número de acesso do Genbank AEX30682) foi traduzida e otimizada para o uso de codões humanos, conteúdo de GC e estrutura de mARN. 0 produto de PCR foi clonado no sistema de expressão 2X35S / CPMV-HT / NOS usando o sistema de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . 0 número de construção 1191 (Figura 17C) foi digerido com enzima de restrição SacII e StuI e o plasmídeo linearizado foi utilizado para a reação de montagem In-Fusion. 0 número de construção 1191 é um plasmídeo aceitador destinado à clonagem "In Fusion" de genes de interesse em uma cassete de expressão baseada em CPMV-HT. Também incorpora uma construção genética para a co-expressão do supressor TBSV P19 do silenciamento sob o promotor e terminador do gene de Plastocianina de alfafa. A estrutura dorsal é um plasmídeo binário de pCAMBIA e a sequência das bordas de ADN-t de esquerda para direita é apresentada na Figura 18 (SEQ ID NO: 23). A construção resultante recebeu o número 1733 (Figura 34C, SEQ ID NO: 24). A sequência de aminoácidos de VP7 com péptido de sinal nativo da vacina de Rotavirus A USA / Rotarix-A41CB052A / 1988 / G1P1A [8] é apresentada na Figura 35 (SEQ ID NO: 39). D-2X35S / CPMV-HT / TrSp-RVA (Rtx) VP7 (opt) / NOS (Construtor número 1734)
Uma sequência otimizada que codifica a VP7 com uma versão truncada do péptido sinal nativo da vacina do Rotavirus A EUA / Rotarix-A41CB052A / 1988 / G1P1A [8] foi clonada no sistema de expressão 2X35S-CPMV-HT-NOS num plasmideo contendo Plasto_pro / P19 / Plasto_ter cassete de expressão usando o seguinte método baseado em PCR. Um fragmento contendo a sequência de codificação VP7 foi amplificado usando primers IF-TrSP + Rtx_VP7 (opt) .sl + 3c (Figura 44A, SEQ ID NO: 55) e IF-Rtx_VP7 (opt) .sl-4r (Figura 44B, SEQ ID NO: 56) , utilizando uma sequência de genes VP7 otimizada (correspondente a nt 88-981 da Figura 44C, SEQ ID NO: 57) como modelo. Para a otimização de sequência, a sequência da proteina VP7 (número de acesso do Genbank AEX30682) foi traduzida e otimizada para o uso de codões humanos, conteúdo de GC e estrutura de mARN. 0 produto de PCR foi clonado no sistema de expressão 2X35S / CPMV-HT / NOS usando o sistema de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . 0 número de construção 1191 (Figura 17C) foi digerido com enzima de restrição SacII e StuI e o plasmideo linearizado foi utilizado para a reação de montagem In-Fusion. 0 número de construção 1191 é um plasmideo aceitador destinado à clonagem "In Fusion" de genes de interesse em uma cassete de expressão baseada em CPMV-HT. Também incorpora uma construção genética para a co-expressão do supressor TBSV P19 do silenciamento sob o promotor e terminador do gene de Plastocianina de alfafa. A estrutura é um plasmideo binário de pCAMBIA e a sequência das bordas de ADN-t de esquerda para direita é apresentada na Figura 18 (SEQ ID NO: 23). A construção resultante recebeu o número 1734 {Figura 44D, SEQ ID NO: 58). A sequência de aminoácidos de VP7 com péptido de sinal truncado da vacina de Rotavirus A USA / Rotarix-A41CB052A / 1988 / G1P1A [8] é apresentada na Figura 44E (SEQ ID NO: 59) . Uma representação do plasmideo 1734 é apresentada na Figura 44F. G-2X35S / CPMV-HT / PDISP / RVA (WA) VP7 (opt) / NOS no sistema de amplificação BeYDV (m) + Replicase (número de construção 1735)
Uma sequência que codifica a VP7 da vacina de Rotavirus A EUA / Rotarix-A41CB052A / 1988 / GlPlA [8] foi clonada no sistema de expressão 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS num plasmideo contendo cassete de expressão Plasto_pro / P19 / Plasto_ter usando a seguinte PCR com base no método. Um fragmento contendo a sequência de codificação de VP7 sem o seu péptido de sinal de tipo selvagem foi amplificado usando iniciadores IF-Rtx_VP7 (opt) .s2 + 4c (Figura 37A, SEQ ID NO: 40) e IF-Rtx_VP7 (opt) .sl-4r (Figura 34B, SEQ ID NO: 38), utilizando uma sequência de genes VP7 otimizada (SEQ ID NO: 54) . Para a otimização de sequência, a sequência da proteína VP7 (número de acesso do Genbank AEX30682) foi traduzida e otimizada para o uso de codões humanos, conteúdo de GC e estrutura de mARN. O produto de PCR foi clonado no quadro com péptido de sinal PDI de alfafa no sistema de expressão 2X35S / CPMV-HT / NOS usando o sistema de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). A construção 1192 (Figura 38) foi digerida com a enzima de restrição SacII e StuI e o plasmideo linearizado foi utilizado para a reação da montagem In-Fusion. O número de construção 1192 é um plasmideo aceitante destinado à clonagem "In Fusion" de genes de interesse na moldura com um péptido de sinal PDI de alfafa numa cassete de expressão baseado em CPMV-HT. Também incorpora uma construção genética para a coexpressão do supressor TBSV Pi 9 do silenciamento sob o promotor e terminador do gene de Plastocianina de alfafa. A estrutura é um plasmídeo binário pCAMBIA e a sequência das bordas de ADN-T da esquerda para a direita é apresentada na Figura 39 (SEQ ID NO: 41) . A construção resultante recebeu o número 1735 (Figura 40, SEQ ID NO: 42). A sequência de aminoácidos de PDISP / VP7 da vacina de Rotavirus A USA / Rotarix-A41CB052A / 1988 / G1P1A [8] é apresentada na Figura 41 (SEQ ID NO: 43) . Uma representação do plasmídeo 1735 é apresentada na Figura 42.
Tabela 3. Descrição dos genes sintetizados para a produção de RLPs.
Ta&ala 4, Descrição da coaatração moafcada a tastada para a produção da RLPa,
Exemplo 3
Montagem de construções de genes e transformação de Agrobacfcerium
Todos os plasmídeos, incluindo os plasmídeos 1710, 1713, 1730 e 1734, foram utilizados para transformar Agrobacterium túmeféclens ;AtSÊ.?. "ManAssas:;* :2lf 10#*· ESAf "por" eletroporação (Mattanovich et al., 1989, Nucleic Acid Res. 17; 6747) alternativamente, pode ser utilizado o choque térmico utilizando células competentes preparadas com CaC12 (XU et al., 2008, Methods of Plant 4). A integridade dos plasmídeos nas cepas de A. tumefaciens criadas foi confirmada pelo mapeamento de restrição, A estirpe de A. tumefaciens transformada com um plasmídeo binário dado é denominada AGL1/ ':db Ror- exemplo., a ©ρύΐΐρ®: de; A*, tumefaciens transformada com o número de construção 1710 é ^dénóffiináda:· '"Apli /13· IO®*:
Preparação de biomassa vegetal, inoculo, agroinfiltração e colheita
As plantas de Nicotiana benthamiana foram cultivadas a partir de sementes em apartamentos preenchidos com um substrato comercial de musgo de turfa. As plantas foram autorizadas a crescer na estufa sob um fotoperiodo 16/8 e um regime de temperatura de 25°C dia/20eC de noite. Três semanas após a semeadura, plantadas individuais foram colhidas, transplantadas em potes e deixadas para crescer na estufa por três semanas adicionais nas mesmas condições ambientais.
As agrobacterias transfectadas com cada construção foram cultivadas em um meio LB de origem vegetal e suplementadas com 10 mM de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES) e 50 pg/ml de canamicina pH 5,6 até atingir uma OD600 entre 0,6 e 2,5. As suspensões de Agrobacterium foram misturadas para atingir a proporção apropriada para cada construção e trazidas para 2,5X OD600 com meio de infiltração (MgC12 10 mM e MES 10 mM pH 5,6) . As suspensões de A. tumefaciens foram armazenadas durante a noite a 4 ° C. No dia da infiltração, os lotes de cultura foram diluídos com meio de infiltração em 2,5 volumes de suspensão e deixaram-se aquecer antes do uso. Plantas inteiras de N. benthamiana foram colocadas de cabeça para baixo na suspensão bacteriana em um tanque de aço inoxidável estanque ao ar sob um vácuo de 20-40 Torr por 2 minutos. Após a infiltração, as plantas foram devolvidas à estufa por um período de incubação de 3 a 12 dias até a colheita. A biomassa colhida manteve-se congelada {-80 ° C) até o uso para purificação de partículas.
Extração e purificação de partículas semelhantes a rotavirus
As proteínas foram extraídas de biomassa congelada por extração mecânica em um liquidificador com 3 volumes de tampão de extração (TNC: Tris 10 mM pH 7,4, NaCl 140 mM, CaC12 10 mM). A pasta foi filtrada através de um filtro de nylon de poro grande para remover grandes detritos e centrifugou 5000 g durante 5 min a 4 ° C. O sobrenadante foi recolhido e centrifugado novamente a 5000 g durante 30 min (4°C) para remover detritos adicionais. O sobrenadante foi filtrado em profundidade e ultrafiltrado e o filtrado foi centrifugado a 75 000 g durante 20 min (4 ° C) para concentrar as partículas do tipo rotavirus. O sedimento contendo as partículas foi ressuspenso em 1/12 de volume de TNC e os insolúveis foram removidos com uma centrifugação a 5000 g durante 5 minutos. O sobrenadante foi filtrado em Miracloth antes de ser carregado em gradientes de densidade de iodixanol. A centrifugação com gradiente de densidade foi realizada da seguinte forma. Tubos contendo gradientes de passo de 5% a 45% de iodixanol foram preparados e sobrepostos com os extratos filtrados contendo as partículas semelhantes a rotavirus. Os gradientes foram centrifugados a 120 000 g durante 4 horas (4°C). Após centrifugação, recolheram-se fracções de 1 ml do fundo para o topo e analisaram-se por SDS-PAGE e Western Blot colorados com Coomassie. Para remover o iodixanol para as frações selecionadas para posterior análise, as frações selecionadas foram centrifugadas 75 000 g durante 20 minutos (4°C) e as partículas sedimentadas foram ressuspensas em tampão TNC fresco. SDS-PAGE e imunotransferência
As concentrações de proteína foram determinadas pelo ensaio da proteína BCA (Pierce Biochemicals, Rockport IL) . As proteínas foram separadas por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras e coradas com azul de Coomassie. Os géis manchados foram digitalizados e a análise de densitometria realizada usando imageJ Software (NIH).
Para a imunotransferência, as proteínas submetidas a eletroforese foram electrotransferidas em membranas de difluoreto de polivinileno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) . Antes da imunotransferência, as membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado e 0,1% de Tween-20 em solução salina tamponada com Tris (TBS-T) durante 16-18h a 4°C. A imunotransferência foi realizada por incubação com um anticorpo adequado (Tabela 5), em 2 pg/ml em 2% de leite desnatado em TBS-Tween 20 0,1%. Os anticorpos secundários utilizados para a deteção de quimiluminescência foram indicados na Tabela 5, diluídos como indicado em 2% de leite desnatado em TBS-Tween 20 0,1%. Os complexos imunorreativos foram detetados por quimiluminescência utilizando o luminol como substrato (Roche Diagnostics Corporation). A conjugação de peroxidase-enzima de Horseradish do anticorpo IgG humano foi realizada utilizando o kit de conjugação de peroxidase ativada EZ-Link Plus® (Pierce, Rockford, IL).
Tabela 5: Condições de eletroforese, anticorpos e diluições para imunotransferência de antigenos de rotavirus.
Ensaio de anti-VP4 imuno-sorvente ligado a enzimas (ELISA)
As placas de microtitulação de 96 poços de fundo em U foram revestidas com um anti-VP4 monoclonal de rato (fornecido gentilmente pelo Professor Koki Taniguchi) diluído 1:100000 em PBS 10 mM pH 7,4 (solução salina tamponada com fosfato), NaCl 150 mM para 16-18 horas a 4°C. Após a incubação, as placas foram lavadas três vezes com 10 mM de PBS pH 7,4, 1 M de NaCl contendo 0,1% de Tween-20 e bloqueadas com 5% de BSA em 10 mM de PBS pH 7,4, 150 mM de NaCl contendo 0,1% de Tween-20 para 1 hora a 37°C. Após o passo de bloqueio, as placas foram lavadas três vezes com PBS 10 mM pH 7,4, NaCl 1 M contendo 0,1% de Tween-20. As amostras foram adicionadas e as placas foram incubadas durante 1 hora a 37°C. A placa foi então lavada 3 vezes com PBS 10 mM pH 7,4, NaCl 1 M, CaC12 1 mM, MgC12 0,5 mM contendo Tween-20 a 0,1%. Para todos os passos de lavagem restantes, o tampão de lavagem permanece o mesmo e durante a terceira lavagem, as placas foram incubadas 10 minutos à temperatura ambiente antes de remover completamente a solução de lavagem. O anticorpo policlonal de coelho criado contra o Rotavirus (fornecido gentilmente pelo Professor Koki Taniguchi) foi diluído 1: 10000 com BSA a 3% em PBS 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, CaC12 1 mM, MgC12 0,5 mM contendo Tween-20 a 0,1% e as placas foram incubadas durante 1 hora a 37°C. As placas foram então lavadas 3 vezes e anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com peroxidase de rábano (111-035-144, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) diluído 1: 5000 com BSA a 3% em PBS 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, CaC12 1 mM, MgC12 0,5 mM contendo Tween-20 a 0,1% e as placas foram incubadas durante 1 hora a 37°C. As placas foram lavadas 3 vezes. Após lavagens finais, as placas foram incubadas com o substrato SureBlue TMB peroxidase (KPL, Gaithersburg, MD) durante 20 minutos à temperatura ambiente. A reacção foi interrompida pela adição de IN HC1 e os valores de A450 foram medidos utilizando um leitor de placas Multiskan Ascent (Thermo Scientific, Waltham, MA) .
Produção de partículas semelhantes a rotavirus compreendendo VP2 e VP6.
As partículas semelhantes a rotavirus compreendendo VP2 e VP6 foram produzidas por expressão transitória em Nicotiana benthamiana. As plantas foram infiltradas com um inoculo de Agrobacteria contendo uma mistura de AGLl/1710 e AGLl/1713 numa proporção de 1: 1 e incubadas durante 7 dias antes da colheita. As partículas de tipo Rotavirus foram purificadas a partir da biomassa utilizando a metodologia descrita na seção de materiais e métodos. Após a centrifugação dos extratos clarificados no gradiente de densidade de iodixanol, as dez primeiras frações do fundo do tubo foram analisadas por SDS-PAGE corada com Coomassie. Conforme mostrado na Figura 45A, os antígenos de rotavirus (VP2 e VP6) foram encontrados principalmente nas frações 2 e 3 do gradiente de densidade onde a concentração de iodixanol é de aproximadamente 35%, uma concentração onde as partículas semelhantes a rotavirus devem ser encontradas. Foi encontrada pouca contaminação por proteínas vegetais nessas frações. A análise de Western blot das frações com soro de coelho hiperimune e anti-rotavírus anti-rotavírus e anticorpos policlonais de coelho anti-VP2 confirmaram a identidade de VP2 e VP6 nas frações de gradiente de densidade (Figuras 45B e 45C) . As frações 2 e 3 foram reunidas e o iodixanol foi removido por centrifugação e ressuspensão de alta velocidade, e as partículas purificadas foram enviadas para análise de microscopia de cryo-elétron (Nanolmaging Services Inc., La Jolla, CA) para confirmar a montagem do VP2 e VP6 em partículas parecidas com a partícula de rotavirus. Conforme mostrado na Figura 49 (painel esquerdo), as imagens cryoEM de partículas VP2 / VP6 confirmaram a montagem correta dos antígenos em partículas semelhantes a rotavirus.
Produção de partículas semelhantes a rotavirus compreendendo VP2, VP6 e VP7.
As partículas semelhantes a rotavirus compreendendo VP2, VP6 e VP7 foram produzidas por expressão transitória em Nicotiana benthamiana. As plantas foram aglomeradas com um inoculo de Agrobacteria contendo uma mistura de AGLl / 1710, AGLl / 1713, AGLl / 1734 numa proporção 1:1:1 e incubadas durante 7 dias antes da colheita. As partículas de tipo Rotavirus foram purificadas a partir da biomassa utilizando a metodologia descrita na seção de materiais e métodos. Após a centrifugação dos extratos clarificados no gradiente de densidade de iodixanol, as dez primeiras frações do fundo do tubo foram analisadas por SDS-PAGE corada com Coomassie. Conforme mostrado na Figura 46A, os antígenos de rotavirus (VP2, VP6 e VP7) foram encontrados principalmente nas frações 2 e 3 do gradiente de densidade onde a concentração de iodixanol é de aproximadamente 35%, uma concentração onde as partículas semelhantes a rotavirus devem ser encontradas. Foi encontrada pouca contaminação por proteínas vegetais nessas frações. A análise de transferência de Western das frações com soro de coelho hiperimune e anti-rotavírus e anticorpos policlonais de coelho anti-VP7 confirmaram a identidade de VP6 e VP7 nas frações de gradiente de densidade {Figuras 4 6B e 46C).
Produção de partículas semelhantes a rotavirus compreendendo VP2, VP4, VP6 e VP7.
As partículas de tipo Rotavirus compreendendo VP2, VP4, VP6 e VP7 foram produzidas por expressão transitória em Nicotiana benthamiana. As plantas foram infiltradas com um inoculo de Agrobacteria contendo uma mistura de AGLl / 1710, AGLl / 1730, AGLl / 1713, AGLl / 1734 numa proporção 1:1:1:1 e incubadas durante 7 dias antes da colheita. As partículas de tipo Rotavirus foram purificadas a partir da biomassa utilizando a metodologia descrita na seção de materiais e métodos. Após a centrifugação dos extratos clarificados no gradiente de densidade de iodixanol, as dez primeiras frações do fundo do tubo foram analisadas por SDS-PAGE corada com Coomassie. Conforme mostrado na figura 47A, 3 dos 4 antigenos de rotavirus (VP2, VP6 e VP7) foram visíveis e encontrados principalmente nas frações 3 do gradiente de densidade onde a concentração de iodixanol é de aproximadamente 35% uma concentração onde as partículas semelhantes a rotavirus devem ser encontradas. Foi encontrada pouca contaminação por proteínas vegetais nessas frações. A ausência de nível detectable de VP4 no gel corado com Coomassie foi esperada uma vez que VP4 não pode ser observado quando a mesma análise é realizada no virião de rotavirus humano purificado. A análise de transferência de Western das fracções com soro de coelho hiper-imune anti-rotavírus e anticorpos policlonais de coelho anti-VP7 confirmou a identidade de VP6 e VP7 nas fracções de gradiente de densidade (Figuras 47B e 47C) . 0 iodixanol foi removido da fração 3 por centrifugação de alta velocidade e ressuspensão e as partículas purificadas foram analisadas por ELISA para confirmar a presença de VP4. Os resultados apresentados na Figura 48 mostram claramente que o ELISA reconhece especificamente o VP4, uma vez que as partículas de controle negativo compreendendo VP2 / VP6 e VP7 apenas resultaram em um nível de sinal de fundo. Em contraste, a análise de 3 lotes diferentes de partículas purificadas compreendendo antigenos VP2, VP4, VP6 e VP7 apresentaram sinais fortes e uniformes quando testados nas mesmas condições. Os RLP purificados de VP2 / VP4 / VP6 / VP7 foram enviados para análise de microscopia de crono-elétron (Nanolmaging Services Inc., La Jolla, CA) para confirmar a montagem dos quatro antigenos em partículas que se assemelham à partícula de rotavirus. Conforme mostrado na Figura 4 9 {painel direito) , as imagens cryoEM de partículas VP2 / VP4 / VP6 / VP7 confirmaram a montagem correta dos antígenos em partículas semelhantes a rotavirus. a análise de 3 lotes diferentes de partículas purificadas compreendendo antígenos VP2, VP4, VP6 e VP7 mostrou sinais fortes e uniformes quando ensaiados nas mesmas condições. Os RLP purificados de VP2 / VP4 / VP6 / VP7 foram enviados para análise de microscopia de crono-elétron (Nanolmaging Services Inc., La Jolla, CA) para confirmar a montagem dos quatro antígenos em partículas que se assemelham à partícula de rotavirus. Conforme mostrado na Figura 49 (painel direito), as imagens cryoEM de partículas VP2 / VP4 / VP6 / VP7 confirmaram a montagem correta dos antígenos em partículas semelhantes a rotavirus, a análise de 3 lotes diferentes de partículas purificadas compreendendo antígenos VP2, VP4, VP6 e VP7 mostrou sinais fortes e uniformes quando ensaiados nas mesmas condições. Os RLP purificados de VP2 / VP4 / VP6 / VP7 foram enviados para análise de microscopia de crono-elétron (Nanolmaging Services Inc., La Jolla, CA) para confirmar a montagem dos quatro antígenos em partículas que se assemelham à partícula de rotavirus. Conforme mostrado na Figura 49 (painel direito), as imagens cryoEM de partículas VP2 / VP4 / VP6 / VP7 confirmaram a montagem correta dos antígenos em partículas semelhantes a rotavirus. CA) para confirmar a montagem dos quatro antígenos em partículas que se assemelham à partícula de rotavirus. Conforme mostrado na Figura 49 (painel direito), as imagens cryoEM de partículas VP2 / VP4 / VP6 / VP7 confirmaram a montagem correta dos antígenos em partículas semelhantes a rotavirus. CA) para confirmar a montagem dos quatro antígenos em partículas que se assemelham à partícula de rotavirus. Conforme mostrado na Figura 49 (painel direito), as imagens cryoEM de partículas VP2 / VF4 / VP6 / VP7 confirmaram a montagem correta dos antígenos em partículas semelhantes a rotavirus. A Tabela 6 lista sequências proporcionadas em várias formas de realização da invenção.
Tabela 6: Descrição da sequência para identificadores de sequência.
Referências #: lang i M* 1:.i M? 2ah|r 'ii? ah at:,: :¾ yinae-- .14¾ partiste .fermathen df .rotavirus capsid produced in:· transgenic plants, Sci China Life Sci, 2011(, f% It-®© * Shget? J. ? Miâ.* and dreehdexgv. H.3. .
Bdtavirus: vaecihis i naeert .deveiapsana-y and :fahare dpngiigg:r;iii:.gn:S:4 dáhnbe .ray tegs*.; Midr0i5ipl...cgg: 5 > dt®vSH: »' ILpaagO:?. l* it* 'f-efrei-ra^ M:,;:i:,.iL. .and· Failho:? ë:S;. |'2@011 „ .Rot a vi ru s genot ype s [4]<39, P[6]G9, and. "&amp; LliSi in hbspihalttdd: bhitardh: ví th abate 'ga;aLrpeh:t®i:i.t:i.'á in Éib de dandibb* Sraaii, b ttis· :MibrobiaÍ W$- * AriaS:?· € ,'F1 r Bailado., %* and. BlêhaflsBi,, :ÍÇ,
Synthesis· of lhe outer-: capai# glyebprotdiu ·ρ# the .simian XOtayirna. 31.1:1 in ISicheriehia'· coll * Sens it. ? ..211:-111 * An JC..Í,? ·Μΐ111οη setae M*M-±r· titldl,:: .« #ηΒννχηΐ
Farhible :B±hdihg .Bemain eh the iSotaytrus iKanettpefeahal GiyboprOtdin '.ESSE:,. 'Virology 184 ? sid-hl $ Bainh Mfí 'Xishih-Raeoi' My fthdll;..,, S-gi;yeh;s:yiahi:p:n of reconbiriant therapeutic glycoproteins in plant systems* Fold: léehnolggy and Sidtaahnoldgy It I-i©> * Bardor? M.f Faveeuw, C„, Fitehefcte? &amp;.C., Gilbert? D., Galasy L, ? trdhieln:?. ft ? Faye? in arad LOtQngO :Bt Ç2;QhSl * iítonnb^aehiàity' In: manatalá: of two 'taipal plant dlypbbS'i:t.gpg':s;:s: ogre alpha 11:,2¾ -Idggse aad bong bflops. difbpbidibgf' 12: 4:21-424- » Berois? M.? Sapin? C.? Erk? I»? Poneefc? D. and Cohen? J, {2003} , Setavirns: Ionsbtnatural BhOfeiu: MSfi Inter aets gift Meggr Bore Bhohein VF2;, Journal gl virology' 2Τ?: il|l * Battiibtbi-Glatiet:? &amp;,.:? oiarlet* if, ? eragfard?: s, s. ,
Scorer? M,. E,. and ΒηΟΟΟ:? |3t$h.: itdQtl.,. Itiduhagbaacity' 'SOd protective efficacy of rotavirus 2/6-virus-like partloloa: produoed; ,by a :doal .Oggniovirns enpraBaipU; yaictdx and, .ndniniataidd iatramsadtianly?. .inttanaadily:^: at· ofall.y1 to "Hhdihe ,21:?: is.fíh^'2'lh:© ® Cherp J,Z,? Settembre? E.C., Aoki? A. 1., Shang? X,, Bdliditl^y |.J,,, 'Bdrmitdát:í Bihu,, ilianrispn,: and-
Briddridft % n, 'Mbi:dbáia.t' interaphipaa .l.n rifayitud as:sasi3:i.f:' and. nnsdating sean. df: hidh-xahdintidn cryo-SM. PHÃS 100? 10644-10648 *· Crâwfdeá,: :E.s::ten:?:: WtM:.,# 'd:i:3:rlef.;?. M, ? ®dxohe?: B-'Sdhl..?· :idhen:f^ 1, .sad· Ιήηηρχ? llffSi -,. deta:rQ.typi:e. prataatlpn and ladaotidn d;f: a btead. hstftdhipib xidhttalinatids .rdapdasd: by' .rdtayi.rds-lila: particles. Journal, of Virology 73? 4813- 4822 * pirã^fCS^gi:^. 'ii.afeKsé:;': Μ . f BOt©©* J ». , BtfrOUgn©*: :È:«.:H ,: ?' th:QU* luiA: SUd.: BafàS* IBRi: |1:§:H| ,, ®a.Êa:C:Èe:^:Í'aâfeÍ'©a Cf virus-litea particles produced toy tie expression of rat avlruj gaiMid:: 'prdtodlna:: Is insegi: ©©ΐΐ©;* bourns,! ,g.£ virology 68, 5945-5952 « BtoSisoy©* RiBi* Booling:* W»,. 1¾¾¾¾¾. 'A,,. ,SS©g* S, , BdarJata* iRuggeri* W\ and Maufoç* 113:391 feflidsi: Gapsid. Brcttls :VBi$f:' .inrmsaBilir©# Me^ifansi* Journal of virology lâ 3141—:3.1:53 *: Bennetoy^ ifid?)« Ktayixda:: yadçindi - Mm. updat-to,
Vaccine:· IE* JIBJ—iiil « Sates M,K * Rotavirne and :fcteir: replication··... fields 'yiroicgy %$ l#B;f-:i.iS:5' FntodreiC'i,* B*,* Affitanwa:* I, , Vascotto* F. and Burrone, G.R, (1999), Two aon^stxnifutoai: :rdtavirn:s·; pngfein-s* bsp®; -and; ford uiuoplapín-lli-fes sirssi^ef: lu. ^viyçt, J Gen. Virol SB 3:3:3—1.,. &amp; Bavaddo* Aid*: Enrieutoicd·* 'M, * Ssrdi* fd:$·*· Irt V,S> (2005). Cloning, expression, and purification or rocdirtolnani. toevind rotavirus lieiaaggiutiiii'nfj,, VRSn* in, Eisiefictfa: ©oil, srtoteito Bxpfessldn ©nd,: .But if igatitos: 46, 196-203 * denisdis:* JIB,·,* faltd* &amp;*.R':,.::, Bleifeif* By*. GriffiS:,: B*By*. Bijysi,* E** EámacdanÉtas,* ÉitU* Jain.* ¥** Cu.niif fe, Katagoti:* E*,* Eittvdad* G;:*Si.,:.,· fisdBef *, 1 *11 * '.Becasiaty B,*s;,,* Bi ess©;* :j:,.B>.,* Jiang:* B. and .Glass:* .11., 1, fSBiBij , Sdyetoyp© 'Mcersify· .and, Beassoftmeni Between:. Hudas:: and Animai '.Bdtotyirus' Jtrains; Implications for '’Bdtayirjs Vaccine Programs J Infect Dis, 192 * 814.6-59 *: Glass, it, f,* .farasMt* 0'.D., :Bf©s©:%: GiS,* iurdids., R,, jiSPkef* J ,Xl * Widddddon* 8Á. * giand* s* amd:: BentadA* J, R, (2006), Rotavirus, vaccines; current prospects and fatafe CtoaXleugesy: iiíàúcet: :33®y· 323-3¾ &amp; Gonzales* A.M.# Nguyen, T,V,f Azevedo, M,S. P„, Jeong*
K, , agar 1 to*· F,, idsafy €,* Grani* R*·,* l©vg:ren.'-~BeugftS:©n:*. x,, 'Mdrein*. 131 .and, .Saif* f. J, |f idii ., Aufitendy .responses to '.rnmiiU ro:faVirua .fSíff·} .·!η g;ngt:e)to:iO'ti:G: pigs iptlaging -a new prime/'coost vaccine strategy using oral attenuated Bl# priming and Intfanasal. VKf/l rot:eyi:rUa-ii,toe:: pa:r::tiol:e: (¾¾ toddsting witto ISBQii:,: Bi-iaical: &amp; Bxpiritental Iteunologif 1B;5: iSl-UB * donnalet::;* * S:spiKOísa:* R:*:.* :Romero:* B*:.* tipen*. S, and
Arias: Seifs:. .'iJOBBl ;y '.Beiative:. :1οηό.ΐ.1οοΡ1οϊΐ of viropias-tile': and.: endoplasmic reticulum-resident rotavirus proteins in inf©ctdd .cells, Afedivss ©Ε Virology1 14 5, 133:3-13:13:: * Cisdhdeed,: B . B, .and Estas,; M/ÍK,, IddS-ij',. Rbi:avi.:rnsdSu Firam. Pathogenesis: -to '¥de:einaii:©n * Sasa:ííQ®ait:ê;aô.Í.©:Íg^· .1.3 6, ii3-f--1.:111 » asss&amp;iaair· Ψ** donee,- mM* a,z, lillBi-,
Serotypic characterization of outer capsid spike protein VP4 of vervef. monkey rotavirus 3M.1 strain, Archives of Virol-bii'· i'43^ ifiJ--1244- s isicdt:©,- ft..,-. -11¾¾¾¾ Mm dhafpi-iiaud:©.,: &amp;*<* Ροηοοί,,: ft*,?: CdiMBr- Mir -ivadseid-,·.· .-ft and dadansdn,,: ft: lillll ·* Parenteral administration of RF 8-2/6/7 rotavirus-like parhieidS: ia a dús-“-dd&amp;e:' .rsfimsu: indues .ptSidetivs? insanity in mine, Vaccine S-ft 4-3^4-4:8:01, « Rhd'd3tendèMi.©0.#. -M:.-,-, -Sdamsft Sift** Shak-râbadft Eèyftni.,--1,,:- and. .Bambai,*- b, (2009) , -Gldding- and EdgressLon: -df:: Simian Rotavirus Spike Protein (VBi) in Insect Cells by Ra-eUtoviras- l:xp-re®sion Systema Iranian Biopedidai:. dbu-rnai i 3 -Ι-ΐΙ * Kim, Y,, Kiel sen, P,R.r Hodgins, D,, Chang, K.O. and Sni.ft ftft, 42.8:-321.,: L-adtsdenid- antibody .reap-dnaas In. 'çça-s-vatilnated, f$fcl ibooiftinani- lb vine .rotaviria-like:: particles (¥LPs) of two serotypes or inactivated bovine rotavirus vaccines Vaccine 20, 1248-1258 » RdvaoftNOiad J., .Irik a . Sasaki,,·: Songwan Yoo,, Yoaiiaori idine* Cidmiud end .Edpyeaston -df Human |ftt a virus' dp-ike:: Bibhein.:,. 'YPRft bn Eocne-tichia: soli. Biodhpmibab: and Rioplysip-ai Re,sear cl. .Cem«iu:ni:ea.tion'®:,: 2R%- 1:1:83-1181-. « Xabibd* -¾¾^ .Eetes-:.,: and ¥enietat:ádí: ft,®>?':?i. f2idl:>*,
Mechanism ob genome:. 'transc-ript-isn- in iagmented. "dsUi, Viruses:,: :Àdvá:Hbds; in 'Vidad- -leelarcix: IS,,- 1,8:5--:2.14-. ® Lopez, T., Camacho M,,. Zayas M», Najera R., Sanchez R,, Arias C, F. and Lopez S, (2005), Silencing the Mb:3xdhòden:e:S:ié: cf -fttayir:ub-, ftaroai.: db Virbibiy 11,, .1-84:- m .* LuB:dò;reh;#: o, -and. -Svenssoa;,:. b, (;Μ©1) , pa.t:hdie:de.s:i.s of Rsidvirud. .diar-rhoea,,- ft-btobes- add Th feet Lon, 3 114:5:-1:15:8 <* lladore:,, .ft-ft*·*. Estes-,: WM·* r. Zarley,; -C ft,,: "MMr 3,,,
Rarsdda^:: .1,-,: Eigrayid::,:- D, , -drainer:,: Bmbhda: R.,
Jiang, B., Ccrsa.ro, B., Barrdak, V., Crawford, S, and Conner;,: Must: /ΙΜί!.,. Mk^úMémmáX -add.; imíftnsLbíiic comparison of virus-like particles for a rotavirus subunit, -vudoidd::*. 'Vaccine 17, ,24-:61:-2:471 * yeruaifi:^- Cft R.i.ZZa, Mr* Idtfdddi:.:,: ft::,: Muddiut, 'ftr Spada, M., Belaxdelli, F,, Benvenuto, E, and Capone, I, |2: jOil,- Chiddric -plant -virus -partibies -®δΐ idmudogedB· fir inducing -murine and human immune responses against huraan vifUi iypa 1:.:,; .ΒΟΡίη®!. .ÔÍ ν1χ©1θ§:Ρ: 7Βφ m&amp;m-mm., * ||iiii%:^m%J29v· ¥** Itchoda, N. and Tsunesiaitsv, H. (2002) ,
Production of immunogenic VP6 protein of bovine group A rdhsyifnS: 'in kfahsg@ni© pataka plant®..,. Archives: of
Virology 14 7, lÈm-ΜΦ * SSsna, dr&amp;y*. Ramlrer,·. #/1, and Balgmafes:,: Ά·*Ά* Pfdfiu Intcacdiidiar: di^atritotipn of· ratuydra®: stfuttgral ptaieihs an:dndinua:--'l:i ke:· particles: eaprdsaacl ip. the iaspdt ©allbaauiQyiru® system:,.; daufitai .of Biditddnnòi:0|:^: « fey©®;, J, C.,- Bergm®®®:,: € M» and Bellamy:, (Iddfl <
Xdtetâdfion pi' ratayira® dares' "pitít the: 'nos^atraptaidi:. glycoprotein M528. Virology 171, 98-107 »: Mallnaf i* 'ρ..Λ:, ’Baralta·:,, a.» land ishagâ;,: g:«;. f Pits):.«. Production of rotavirus™like particles i.n Spodoptera frugàpérdã "larvae* ..acnthal of Viralagl©a:l· MathaãS'; 14 7y 364-367 *- ails:®©®.,' S:,,- yan fanaaprff::,. d.,#,,* dcclpaiPf^ d** 'Gohcή* A,. and. Svenas:®®* L , llfdif', Asssi#ly Pf yitapiaid and. •virus-like 'participa of rstavirn®: hy a Semliti .Forest: Virus: rapliaan». Virplgeiir .M2* dSd-lAS: » MiadikáPâ:,: '&amp;.<,* dukiharty N.,. digrandir du*· drees.*: fd* lapikian:,; d,,> ΒΚρηρρΚ*. .It, and G:ot®idll4:,r: M? |ld8:|:)', Wi protein, cf per cine fata virus strain:: Odd efprassaa by a feAeuiouirns: recombinant induces: neutralising' .a®niB'odi®a>, Vlraipgy lid, fli-lll » O'Brien, G.J., Bryant, C.J., Voogd, C., Greenberg, H.B,, Gardner, A.C. and Bellamy, APR. (2000) . Rotavirus V'P6 dkpfssedd: :¾ :¾¾ f©©feats in dipotiana denttamiana. dp&amp;kd :PVX. fad® and" also· assemble®: into yirue-lite 'gaftieles::. Virology 270, 444-453 &amp; BalcmBb:, fuA* lldld)., Geasfeid and antigenio;. diverslay df human :rpr.avlrdass:í: petankiai impact: an·, the sacdAss m£ Pandidatê" .vaegihsa» FldS diaredi.ei©yy' letter®. :1.81..., 1 - 8 * Palomares, L„A, and Ramirez, 0,11 (2009), Challenges for the production of virus-like particles in. insect cells; The gape .af: rdtaviraa-iike garaihie®,
BioPdadichlEnif ineaf inf" AeuthAl i S:p|:, 1 St:-! f ? * Feral-ta::,. #d:l,£naf i,r p , and lafapgs:,: d,. ilOAS'),. dhimari® racpidsingnt rdtaVirus-lika· parti dips" as .a.: yçniaiá iof the: display: cf .f©tsr©laf.©u®: aplafepera vifgldgy" Aanthai i* liil » Baffiadhandran, M^, Rifkwdda, d:,.D;,..:f Onidort-,. f,, "Ganli:fife:r NvA,, Ward, .R:.:h»",, ehan, %M*-+ diark:* H,F,, Glasa:., R< I, and deni sell,.. > j . r , litldio daiscaiar dhafadfeáriaàfian d£ dirdtypd '·£9' ::rdtdvi:rpi: Plfá-lUi Χΐόίή a --glibâl PdX.ie:it:ÍÍP;:« ^ΧΡθ.Χ®§[|ί' 278, 4#S~?4 14: « RíbeSsr J.M., Qrtego, J„, Ceríani, Ji, Montava,- R«, EPXuiuiS-:, L. .and: .Buida,- dl- -(:2-14,1.1 ,-pms:tvsoii:tat:i:£.i:s: md:ps: (TiWf rpaspi. 'PiPtops -wXfla dUgi.in:@:@fdd, murla-p pr©p:XSP: sipteSp: Pi® rdfpvi-idgi VBT protein: and ixiluo-iise :ΜΧ-ο@: against rotavirus::,:. ¥i.rgXog:y' 4X2. x.f?-xif ®-: EddPl:||u:e:i-XiM^ :W,Á«, Tyo , Μ,-ίϊΧ:,., tMplpan, J, ,
Samitea:, :(3-,2, :&amp;pà BaXgpafpS::, .:i:..&amp;, ÍXOXX) , Mdl:idal.&amp;P and groedsa· ippign- for -votôvirLite pa.pt Xpld .ptdâuotXdn: la :S:a-:e afeareipis eerevialae, ΜΧθβοΡ taXl- Faot, 1E;, -31: « -SgX:da:Uâ::,- ,S,.f- Esgai-vel. E,,, G1 ívera Flores
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Lehacq, E,, Forster, J,t Zepp, F*, Delem, A, and De Vos? &amp;·,: lá-OdilSafety and 2¾¾¾¾of Κΐγ44:14 live attenuated human rotavirus vaccine in adults, toddlers and previoosiif' "tthiihfedhed. iniahtd:*, :¥aheine 2:2,, i#âi€m2#42 Viriina, Ρ.:,“Ρ, ,. 'Pãy%:: A,,: !.Iierduge::f 0^ ©ι&amp;ούηΐ, M,-~A,,,:f: Marquet-Biouin, E,, Burel, C,, Lavoie, P,--0., Harder, M. and iGometd:* Ψ»· iidiOfif , 'transient ee-enpee salon, for" fast: and' nigh"yield, prddudt'ion: el' anLihpdiee: Μϊ&amp;, 'huMan'-likai M~q:lyoan:s:, in plants:·::·.: plant pigteodndidgy' donrnai 7, :442:“ :4:SSu: *ii SPOU:^; S;,:,; Y. ,, :I®|,! 'Pi r iD©^, 'Gi , 0 * f, R .».0, , C., YU*. $**. Li, '$* 0§ 10:0·, prai: ^^1®ie-trdtiGn, df; plant-Oddest hdtdidrdsi dPd ihdusée d'n,tlqen“dpe0l,®id lg&amp;@* lid©·® and passive px'oteotioxi in mice. Vaccine 28, 6021-6027 » Zhou, H., Guo, ,h,,. ::lanf;, M., "Qa;,. GV,: 2hso>. Z,:,.''Wiahq^ >J, isudi Sung:,· :1,. ^pdlLi > 'prime ιΐ^ιρύηΐ,^ηίΐοηί with. rotavirus vlp 'Mf0 .fdliowed; hy hopeiing 'mth ah sdenp'virnsi expte;ssing" :Vpf Induees prethotivei; iaMuhiidahien· against 'retdviruB, in eide:, Vitdieqy hdurnil. #, 3
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <1 '!·> Msdieagolos, MidubíshliTáRafeei Pferrea Corporation <120> fhííâdfueiiké: P^rtiidepfOdaetioin in P'tefits· <:ÍSO> V«S3iie: <Í50> US6U6Í6.0S8 <iv!> 2012-05-'! i < t:.n> 59 <170> PdSntl ft version 3.5
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Gin Asn Ser Asn Lys Ile Gin Leu Ser Asp Lvs Vai Leu Ser Lys Lys 35 40 45
Glu Glu Xle Vai Thr ASp Ser Hás Glu Glu Vai Lys V&amp;l Thr ASp Glu 50 55 «0
Leu Lys Lys Ser Thr Lys Glu Glu Ser Lys Gin Leu Lea Glu Vai Lass 65 70 75 80
Lys Thr Lys Glu Glu His Gin Lys Glu Ile Gin Tyr Glu Ile Leu Gin 85 90 ' 95
Lys Thr lie Pro Thr Phe Glu Pro Lys Glu Thr Ile Leu Arg Lys Leu 100 1.0:5: 110
Glu Asp lie Gin Pro Glu Leu Ala Lys Lys Gin Thr Lys Leu Phe Arg 115 120 125
Ile Phe Glu Pro Lys Gin Leu Pro Tie lyr Arg Ala Asn Gly Glu Arg 1:3:0 135 ’ 1.4.0
Glu Leu Arg Asn Arg Trp Tyr Trp Lys Leu Lys Lys Asp Thr Leu Pro 14:5 150 155: 260
Asp Gly &amp;sp Tyr Asp Val Arg Sly Tyr Phe Leu Asp Let Tyr Asp Gin 155 170 175
Val Leu Thr Glu Met Pro Asp Tyr Leu Leu Leu Lys Asp Met Ala Val 18:0. 185 190
Glu Asn Lys Asn Ser Arg Asp Ala Gly Lys Val Val Asp Ser Glu Thr 195 200 205
Ala Ser He Cys Asp Ala He Phe Sin Asp Glu Glu Thr Glu Gly Ala 218 215 220
Val. Arg Arg Phe He Ala Glu Met Arg Gin Arg Val Gin Ala Asp Arg 225 230 ” 235 ' 240
Asn Vai Vál Asn Tyr Pro Ser lie Leu His Pro He Asp Tyr Ala Phe 245 250 * 255
Asn Glu Tyr Phe Leu Gin His Gin Leu Val Glu Pro Leu Asn Asn Asp MO 285 270 lie He Phe Asn Tyr He Pro Glu Arg He Arg Asn Asp val Asn Tyr 275 280 285 lie Leu Asn Met Asp Arg Asn Leu Pro Ser Thr Ala Arg Tyr He Arg 290 295 300
Pro Asn Leu Leu Gin Asp Arg Leu Asn Leu His Asp Asn Phe Glu Ser 305 310 " 315 320
Leu Trp Asp Thr He Thr <rhr Ser Asn Tyr He Leu Ala Arg Ser Val 325 330 335
Val Pro Asp Leu Lys Glu Leu Val Ser Thr Glu Ala Gin He Gin Lys 340 34:5 350:
Met Ser Gin .Asp Leu Gin Leu Glu Ala Leu Thr lie Gin Ser Glu Thr 355 360 365
Gin Phe Leu Thr Gly lie Asn Ser Gin Ala Ala Asn Asp Cys Phe: Lys 370 375 380
Thr Leu lie Ala Ala Men Leu Ser Gin Arg Thr Met Ser Leu Asp Phe 385 390 395 400
Val Thr Thr Asn Tyr Met Sax' Leu He Ser Gly Met Trp Leu Leu Thr 405 410 415
Vai Vai Pro Asn Asp Met She lie Arg Glu Ser Lea Val Ala Cys Gin 420 425 439
Leu Ala lie Val Asn Thr lie lie Tyr Pro Ala Phe Gly Met Gin Arg 43S 440 445
Met Mis Tyr Arg Asn Gly Asp Pro Gin Thr Pro Phe Gin He Ala Gin 450 455 460
Gin Gin lie Gin Asn Phe Gin Val Ala Asn Trp Lett His Phe Val Asn 465 470 475 480
Asn Asn Gin Phe Arg Gin Ala Val lie Asp Gly Val Leu Asr; Gin Val 485 430 435
Leu Asn Asp Asn He Arg Asn Gly His Val 11a Asn Gin Leu Met Glu " ' 509........ ' :505.:........519
Ala Leu Met Gin Leu Ser Arg Gin Gin Phe Pro Thr Met Pro He Asp 515 520 525
Tyr Lys Arg Ser He Gin Arg Gly He Leu Leu Leu Ser Asn Arg Leu 530 ’ 535 * 540
Gly Gin Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Leu Ala Tyr Asn Tyr Glu Thr 545 550 ‘ 555 560
Leu Met Ala Cys II® Thr Met Asn Met Gin His Val Gin Thr Leu Thr 565 570 :575
Thr Glu Lys Leu Gin Leu Thr Ser Val Thr Ser Leu Cys Met Leu He 580 585 530
Gly Asn Ala Thr val He Pro Ser Pro Gin Thr Leu Phe His Tyr Tyr 585 600 605
Asn Val Asn Val Asn Phe His Ser Asn Tyr Asn Glu Arg lie Asn Asp 610 615 * 620
Ala v?.l Ala He He Thr Ala Ala Asn Arg Leu Asn Leu Tyr Gin Lys 625 630 635 640
Lys Met Lys Ala II® Val Glu Asp Phe Leu Lys Arg Leu Tyr He Phe 64:5 ~ :659 ~ 655
Asp Val Ser Arg val Pro Asp Asp Gin Met Tyr Arg Leu Arg Asp Arg 660 :665: 670
Lew Arg Lew Leu Pro Val Glu lie Arg Arg Leu Asp Ira Phe Asn Leu ms,'· 680: 635 lie Leu Met Asn Met Asp Gin lie Glu Arg Ala Ser Asp Lys lie Ala 690 «35 900
Girs Giy Val He He Ala Tyr Arg Asp Met His Leu Giu Arg Asp Glu 905 ' 710 715 720
Met Tyr Giy Tyr Vai Asti He Ala Arg As» Leu Glu Giy: Ph® Gin Gin 725 730 735
He As» Leu Glu Glu Leu Met Arg Ser Giy Asp Tyr Ala Glu He Thr 740 745 750
Asrs Met Leu Leu Asn Asa Gin Pro Val Ala Leu Val Giy Ala Leu Pro 755 7 60: 765
Phe lie Thr Asp Ser Ser Val He Ser Leu lie Ala Lys Leu Asp Ala 7« 775: 780
Thr Vai Phe Ala Gin He Val Lys Leu Arg Lys Val Asp Thr Leu Lys 785 790: 7 m 888
Pro He Leu Tyr Lys He Asn Ser Asp Ser As» Asp Phe Tyr Leu Val
805 810 tlS
Ala Asn Tyr Asp Trp Val Pro Thr Ser Thr Thr Lys Val Tyr Lys Gin 820 825 830
Val Pro Gin Gin Phe Asp Phe Arg Asn Ser Met His Met. Leu Thr Ser 833 840 843
Asn Leu Thr Phe Thr Val Tyr Ser Asp Leu Leu Ala Phe Val .Ser Ala 850 855 860
Asp Thr Val Glu Pro He Asn Ala Val Ala Phe Asp Asn Met Arg He :365: :830: 873 ” S8fi
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Glu Lys Ser Gin Asn Val Thr lie Asn Fro Gly Pro Phe Ala Gin Thr 35 40 45
Asn. Tyr Ala Pro Val Thr Trp Ser His Gly Glu Val Asn Asp Ser Thr 50 55 60
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Pro Pro Asa Asp Tyr Trp He Leu Leu Asn Pro Thr Asn Gin. Gin Val 85 50 .95
Val Leu Glu Gly Thr Asn Lys Thr Asp He Trp Val Ala Leu Leu Leu 16:0 105 110
Val Glu Pro Asn Val Thr Asn Gin Ser Arg Gin Tyr Thr: Leu Phe Gly 115: 120 125
Gin Thr Lys Gin lie Thr Val Glu Leu Pro Thr Asp Phe Ser Va.I Ser 130 135 140
Arg Tyr Glu Val Tie Lys Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Val Asp Tyr Trp 145 150 155 160
Asp Asp Ser Gin Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr Val Arg Ser Leu Ala .1.65 170 ~ ' 175
Ala Asn Leu Asn Ser Val Lys Cys Ser Gly Gly Asn Tyr Asn Phe Gin ISO " ’ 185 * ’ :1:90 lie Pro Val Gly Ala Trp Pro Val Met Ser Gly Gly Ala Val Ser Leu 195: 200: 205
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Leu Asn Ser Leu Arg Phe Arg Phe Ser Leu Thr Val Glu Glu Pro Pro 225 230 235 240
Phe Ser Ha Leu Arg Thr Arg Val Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Pro Ala 245: 25.0: 255
Phe Asn Pro Asn Asn Gly Mis Glu Tyr Tyr Glu lie Ala Gly Arg Phe 260 265 270
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Met Asn Sar Val Thr Val Arg Gin Asp Leu Glu Arg Gin Leu Gly Asp 290 295 300
Leu Arg Glu Glu Phe Asn Ser Leu Ser Gin Glu lie Ala Met Thr Gin 305: 310 315 320
Leu He Asp Leu Ala Leu Leu Pro Leu Asp Met Phe Ser Met Phe Ser 325 330 335
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Pro Arg Val Leu Arg Asp Phe He Asn Gin Asn Asn Pro He He Lys 355 360 365
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<210> 13 <211> 2700 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 13 ggtaccgaat teggacgcgt tcgttccatg gcttaecgta aaaggggtgc taggcgtgaa 60 gctaacotca acaaeaaega tagçatgcaâ gagaagatcg afcgagaagea ggattccaac 120 a a g ate caço tc.tcogataa ggtgotcacc aagaaagaag agategttac tgafcfcccoac 180 gaagaggfcga aggtgacaga tgagettaag aagtccacaa aagasgagkc caagcagctc 2>30 atfcgaggtgc teaagaeaaa agaggaaeac cagaaagaga. fceeagfcaega: gatcotecaa 30.0 aagactatec caactttcga gccaaaagag actatcctca ggaagettga ggatatecag 360 ecagagcfctg efcaagaagea gaetaagctc fctcaggatcfc tcgagccaaa geagctccca 420 at-ctacogtg ctaacggtga aagggaactt aggaacaggt ggtactggaa gctcaagaag 480 gatactctcc eagacggtga ttacgatgfcg agagagtact tcctcaacet ctacgatcag 540 gtgctcacfcg agatgccaga tfcacctcctc ctcaaggata tggctgtgga gaacaagaaci 600 tccagggatg cfcggaaaggt ggtggattcc gagastgett ccatctgtga tgc.t.atctto 660 caggafcgaag agac.fcgaggg tgctgtgagg cgtttcat-t.g ctgagatgag gcagagggtfc 720 caggct'.gata ggaacgtggt. gaactacccs. t-Cc.atccfccc acccaafccga ttacgcfcttc 780 aaagagtact tccttcagca coagctfcgtg gagccactca acaacgatat. oafccfctoaac 840 tacatcoeag agaggattag gaaagacgtt aactacatco tcaacatgga taggaacctc 900 ccatccactg cfccgt.tacat eaggccaaac ctcctccagg ataggctcaa cctccacgat 960 aacttcgagt ccctctggga fcacaatcaot aottccaacfc acattctcgc tcgfcfcoogtg 1020 gfcgccagatc fccaaagaact cgtgtccact gaggctcaga tccagaagat gtoccaggat 1080 ctccagettg aggcfegteaci tateoagfces gagactcagt tcctoacfcgg tatcaacfcoc 1140 caggotgcfca aegattgott caagactctc attgetgeta tgctctccca gaggactatg 1200 tccctcgatt tcgtgactac taactatatg tccctcatct coggaatgt-g gcfccttgaet 1260 gt-ggtgccaa acgafcatgfct catccgfcgag tcccfctgtgg cfctgccagct cgcfcatcgfcg 1320 aacactatca tctacccagc tttcggaatg caaaggatgc actaccgtaa cggtga.tcca 5.380 cagaetccat tccagatcgc aqagcagcag atccagaact tccaggtggc aaactggctc 1440 cacttcgtga acaacaacca gttoaggcag gc.fcgtgatog atggfcgtgtt gaaccaggtg 1300 ctcaacgata acatcogtaa cggtcaegtg atc&amp;accagc tcatggaaqc tctcatgcaa 1560 gt.efcccagge agosgfefeae©· aaetatgcct atcg&amp;tt&amp;cra agcgttccat ceagagggga 1:620: afccctcctcc tttc.caac.ag gottggacag ctegtggatc tc.actaggct cctc.gctt.ac 1680 aactacgaga ctctcatggc tfcgcafccaet atgaacatgc agcaegttea gactcteact 1740 actgagaagc tccagofccac tfcccgtgact tccctctgca tgctcatcgg aaacgctact 1800 gtgafccSàâfc gcecàcagac ’agtÉttéOáe tactscaacg tgaacgtgáa· çbfcegacfeoc i860 aactaaaacg agaggatcaa cgatgctgfcg gctatcatea ctgctgctaa caggcttaac 1020 ctetaceaaa agaagatgaa ggctatcgtt gaggatttee tcaagaggct ctacatcttc 1980 gatgtgtcca gggt.gccaga tgatcagatg taccgtctta gggataggct fcaggctcctc 2040 ggagfeggaga fcéagaággct .égafcapèfcte ::á&amp;ééfcâat..gé ttabgaâg&amp;fe ggatsagate 2100 gagagggafcfe çògatâagàfc giggfcçagggií ^fetàfcfcãtcg tettaçcgfegá tatgfeadctt 2160 gsgagggatg agatgfcacgg atacgtgaac attgctagga acettgaggg attcoagcag 2220 atcaaccttg aagaçctfcat gcgttccggt gattacgctc agatcactaa catgctcctc 2280 aacaaccagc cagtggctct tgttggfcgct etcccattca tcactgafctc cfcccçtgatc 2340 icceteáttg çtaagttgga tgctáeSgtg ttggfctcaga·: tégtgaágefc. :caggaaagCg 24:00 gataetctsa agccaafccct cfcacaagatc aaatcagatt ocaacgattt cfcaectegfcg 2460 gctaactacg attgggtgcc aaattccact acaaaggtgt acaageaggt gccacagcag 2520 ttogattfccc gtaacbccat gcacatgctc acttccaacc tcactttcac tgtgtactcc 2580 gatefeec-tcg cttfeegtgfcc ggetgafcaet. gfeggagcct-a tcaacgetgt ggctttcgat· 2640 aacatgagga ttáfcgsaegã ggfetfcgatga ctegagggafc gefecfeagãga: afetggaggfes 2700
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Leu Ser Gin Lys Glu Glu lie lie Thr Asp Ala Gin Asp Asp lie Lys 50 55 60 lie Ala Gly Glu lie Lys Lys Ser Ser Lys Glu Glu Ser Lys Gin Leu
65 ' 70 75 SO
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Glu lie Leu Gin Lys Thr lie Pro Thr Phe Glu Ser Lys Glu Ser lie 100 105 110
Leu Lys Lys Leu Glu Asp He Arg Pro Glu Gin Ala Lys Lys Gin Met 315 120 125
Lys Leu Phe Arg tie Phe Glu Pro .Lys Gin Leu Pro Tie Tyr Arg Ala 130 135 140
Asn Gly Glu Lys Glu Leu Arg Asm Arg Trp Tyr Trp Lys Leu Lys Lys 145 150 155 160
Asp Thr Leu Pro Asp Gly Asp Tyr Asp Val Arg Glu Tyr Phe Leu Asn 165 170 .175
Leu Tyr Asp Gin He Leu He Glu Met Pro Asp Tyr Leu Leu Leu Lys ISO 185 ISO
Asp Met Ala Val Glu Asn Lys Asn Ser Arg Asp Ala Gly Lye Val Val 195 200 205
Asp Ser Glu Thr Ala Asn He Cys Asp Ala lie Phe Gin Asp Glu Glu 210 215 220
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Gin Ala Asp Arg Asn He Val Asn Tyr Pro Ser He Levs His Pro lie 245 ' 250 255
Asp His Ala Phe Asn Glu Tyr Phe Leu Asn His Gin Leu Val Glu Pro 260 ' 265 270 &amp;β». Λβ«· :&amp;sa Glu He lie Phe &amp;s« Tyr He Pro G1 u Arg Ele Arg Asn 275 230 285
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Arg Tyr lie Arg Pro Αβη Leu Leu, Gin Asp Arg Leu Asn Leu His Asp 305 310 315 320
Asn Phe Glu Ser Leu Trp Asp Thr lie Thr Thr Ser Asn Tyr lie Leu 325 3 m 335
Ala Arg Ser Vai Vai Pro Asp Leu Lys Glu Lys Glu Leu Vai Ser Thr 340 345 " 350
Glu Ala Gin lie Glrs Lys Met Ser Gin Asp Leu Gin Leu Glu Ala Leu 355 360 365
Thr lie Gin Ser Glu Thr Gin Fhe Leu Ala Gly 11« Asn Ser Gin Ala 370 375 388
Ala Asn Asp Cys Phe Lys Thr Leu lie Ala Ala Met Leu Ser Gin Arg 385 330 395 400
Thr Met Ser Leu Asp Phe Vai Thr Thr Asn Tyr Met Ser Leu Ile Ser 485 410 415
Gly Met Trp Leu Leu Thr Vai lie Pro Asn Asp Met. Phe Leu Arg Glu 428 425 430
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Pro Phe Gin Ile Ala Glu Gin Gin Ile Gin Asn Phe Gin Vai Ala Asn 465 470 475 480
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Leu Lao Ser Asn Arg Leu Gly Gin Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Val 54:5 * 5SQ .55.5 :560
Ser Tyr Asn Tyr Glu Thr Leu Met Ala Cys Val Thr Met Asn Met Gin .5:65 570 535
His Val Gin Thr Leu Thr thr Glu Lys Leu Gin Leu Thr Ser Val Thr 5:80 :585 5 98
Ser Leo Cys Met Leu Tie Gly Asn Thr Thr Val Tie Pro Ser Pro Gin 535 600:: 605
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Asri Glu Arg Tie Aan Asp Ala Val Ala lie lie Thr Ala Ala Asn Arg 625 630 635 640
Leu Asn Leo Tyr Gin Lys Lys Met Lys Ser lie val Glu Asp Phe Leu 645 " ‘ €50 * 655
Lys Arg Leo Gin lie Phe Asp Val Pro Arg Val Pro Asp Asp Gin Met 660 665 :670
Tyr Arg Leu Arg Asp Arg Leu Arg Leu Leu Pro Val Glu Arg Arg Arg 635 " 680 685·
Leu Asp Tie Phe Asn Leu lie Leu Met Asn Met: Glu Gin Tie Glu Arg 630 :635: 700
Ala Ser Asp Lys Tie Ala Gin Gly Val Tie Tie Ala Tyr Arg Asp Met 705 713 715 720
Gin Leu Glu Arg Asp Glu Met Tyr Gly Tyr Val Asn lie Ala Arg Asn 725 730 735
Leu Asp Gly Tyr Gin Gin Tie Asn Leo Glu Gin Leu .Met Arg Thr Sly 748: 74:5 750
Asp Tyr Gly Gin Tie Thr Aan Met Leu Leu Asn Asn Gin Pro Val Ala 755 760 765
Leu Val. Gly Ala Leu Pro Phe Val Thr Asp Ser Ser Val Tie Ser Leu 77C 775 788
He Ala Lys Lea Asp Ala Thr Val ?he Ala Gin He Val Lys Leu Arg 785 ΊΜ 755: 850:
Lys Sal Asp Thr Leu Lye Pro Lie Leu Tyr Lys lie As:n Ser Asp Ser 805: 810 815
Asn Asp Phe Tyr Leu Val. Ala Asm Tyr Asp Trp lie Fro Thr Ser Thr 823........ 855 830
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Asn Ala Leu Phe Pro Gin Ala Gin Pro Phe Gin Hrs His Ala Thr Val 30S 310 315 320
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Asn Trp Asp His Gly Glu He Asn Asp Ser Thr Thr Val Gin Pro lie 50" 55 60
Leu Asp Gly Pro Tyr Gin Pro Thr Thr Phe Thr Pro Pro ASR Asp Tyr: 65 70 75 ?0
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Asn Asn Ser Asp Phe Trp Thr Ala Val Val Ala He Glu Pro His Val 106 105 11:0
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Asn Val Ser Asn Asp Ser Asn Lvs Trp Lys Phe Leu Giu Met Phe Arc 1,30 135 140
Ser Ser Ser Gin Asn Glu Phe Tyr Asn Arg Arg Thr Leu Thr Ser Asp 145 150 155 160:
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Lys Thr Lys lie Asp Met. Ser Thr Gin Tie Gly Lys Asm Thr Leu Pro
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Arg Tie Leu Lys Asp Asp Glu Val Mist Glu lie Asti Thr Glu Gly Lys 6?5 630 685
Phe Phe Ala Tyr Lys He Asm Thr Phe Asp Glu Val Pro Phe Asp Val 690 695 700
Asm Lys Phe Ala Glu Leu Va.l Thr Asp Ser Pro Va.l He Ser Ala He 705 710 715 720:
He Asp Phe Lys Thr Leu Lys: Asn Leu Asm Asp Asm. Tyr Gly lie Thr 725 730 ’ ” 735
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<212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer IF-Rtx_VP7(opt).s2+4c <400> 40 tctcagatct tcgcccagaa ctatggcctg aacttaccaa tcaccggttc aatggatacc 60
<210> 41 <211 >4897 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 1192 <400> 41 tggcaggata tattgtggfcg taaa.caaa.tt. gacgctt.aga caact.taata ac.aaat.tgcg 60 gacgtttfcfca afcgtactgaa ttaaegccga ateccgggct. ggtafcatita tatgttgtca 120 aataacfecaa aaaceataaa agfctfcaagfct agcaagfegtg tscatfetfeta cfctgaaeaaa 1.80 aatattcaac tactactgfct atsaatcafct attaaacatt agagtaaaga aatatggafcg 240 at.aagaacaa gagfcagtgat attttgac.aa caat.t.ttgt.t gc.aacat.ttg a.gaaaat.t.tt. 300 gttgtsetsicfc çttfctsafctg gtèadaaáàa: átagdgsgâg :adááa.g^Sag agggigaafeS: 360 aaa.acata.2t: gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtacoaaa atagttgfcac 420 aaatatcatt. gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggfct&amp;attgc tgtaaataaa 430 taaggatgac gcafcfcagaga gatgtaceat tagagaattt fctggcaagte attaaaaaga 540 aagaataaat tatttfctaaa attaaaagtt gagtoatttg attaaacatg tgattafcfcta 600 atgaattgat gaaagagttg gatfcaaagtt gtafcfcagfcaa fctagaatttg gtgtcaaatt. 660 taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgcoceatag agtcagttaa ct.catt.ttt.a 720 tatcfccatag aicaastaag agaaataacg gtafcattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780 gtanatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg fcaggaggata 340 acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagafcaa cccactttaa gcccacgcat 900 ctgtggcaca tot.aeafct&amp;t ctaaatcaca cattcttcca c.acatct.gag ccacacaaaa .960 eccaatccac atctttat.ca occafctotat aaaaaatcac actttgtgag fcetacacfcfct 1020 gattcccfcfcc aaafiacatac aaagágaaga gactââttaa ttaattaatc atcttgagag 1030 aaaatggaae gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140 gatggaggat caggaggfcac cacttatcee ttcaaacttc atgacgaaag tccgagttgg 1200 actgagtggc ggctaçataá; cg;atgaga0g aattiigaafcc: aagafcaatec ccfctggfcfctee 1260 aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tfctaagagat atcfccagata cgacaggacg 1320 gaagcfctcac fcgcacagaçt cctiggafcct fcggacgggag afcfccggttaa etatgcaçca 1380 tafccgafcttfc tcggtttcga ccagatcgga. tgfcacetafca gtattcggct tcgaggagtt 1440 agt.atcaceg fcfctcLggagg gfcc.gcga&amp;ct cvtfccagcatc tcfcgtgagat ggcaafcfcagg 1500 tctaagcaag aacfcgetaca gcfcfcgeccca afccgaagtgg aaagtaafcgt atcaagagga 1560 tgaectgaag gtactcaaaa ct.fccgaaaaa gsaagsgagt aagttaaaat got.tcfctcgt 1620 . tgttafelsgtt· aáfcfctfcgfcfcé: ^igrófcti^^èiíiáíâL· 1680 tçgdtegiafcgfc. fcafcigaa&amp;fcáç tafetfcgfcafcg âgáfcgááefcgi gfcgfc&amp;àfcgt.a átfcéafcfcfcgçí: 1740' ataagtggag tcagaatcag aafcgtcfcccfc cc-stasctaa ctagacatga agacctgccg 1600
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Sffcfcaagccae ateaeattact: fcgtfcacsgafefc: efcgefcgaefcfc. tcggegggtg csaafcafcctocfe 32:40 aéEfcçtgçfct gacgag^at.. tgtfcgeEtegt açtfcelitfcct fcefctéfctEfcfc ggt^stfcggt: 3300 tctataagaa atotsgtatt ttc.tttgasa sagagttttc cagtggt.ttt cgaact.hgga 3360 gaaagattgt taagcitfcctg tatattotgc.’ ccaaaattgt cgggeecatg gegaaaaaag 3420 ttgegsttfefc eggcfctafefcg fcfcfctscfeetifce fctgtgttggfe feeetfegfceag afcefcfeegeeg 3480 cggefccíatea gccaa&amp;acga cagccecafec fcgfcGfcatcea ctggccactg gatcfcgetgc :3S40 ègãaàeÇàac ifeééafcggÉgá eaátgg-gátg getggfcisaag ggétatteiÊc 3:600 gacagtgacc tgga«ctei\g gakccct.gtc eagcggtgtg caceccttcc cagctgtcct 3660 ggagtefcgag etefeaeaet© tgagcagcte agtgãctgfce cectceágáa; gctiggetósag: 3720 egaSfàSSSitíS asgfcggaaeg ttgcccaccc ggiieaggag® asgâsggtegg açaa§aaa:át-: 3780 t:g6gs:cqagg gatfegtggfeÉ: gfcàagáç.t^g .çtóàfcgtaçâ. gfccísea®¥49 tatcatctgt 3840 é^fcç^fcòtfcC: 'etíééeaaàgtí' .éaáággafegt: gfctaàçjQafct actctgactc ctaaggtoac 3600 gtgfcgfcfcgfcg gteagacatea. gsaaggafcga teaacgaggtc oagfeteaget gçpfct&amp;gfeaga: 3960 tgatgtggag gtgsac&amp;c&amp;g cfceagaogca acccagggag gagcagttca ao.agcíicfctk 4020 ccgctcagtc agtgsactke ccatcatgca c;caggac.tgg cteaatggca aggagcgatc 4080 : gefeeaèeafcà: aggateaeoa 6eaegafcsa2í gaiifesaaggfe eisttfcfcgfct tagtfcfegáai 4140 tfeaètgitàfc feC’fSfcgt^Sa; fct2^;áfc:gfct :6g§6:gágesgâ' t6fcfe<ifcgigçk tçágKgtgtíg 4:200 6t6sÍ6fcta6 ;gÒaattt::aaé: ^«.Ét-tigifcgrè: gçtgGfcgttt agcsggfcegt gcçt^çaggá: '4260 aggaeaea&amp;a aagafefctfea» tfcttafefcaaa :aaaaaaaaaa aaaaagaccg ggaafctogat 4320 ateaagct.ta fiegseefegca gatcgfcfecaa :adafefcfcggéa afcáaagfctetç; tiaagafttga: 4380 afecetgtfege cggtgtfcgeg afcgafct ate-a. fcatasfcfctet gfetgaattae gtfcaageatg 4440 taataaktaa c.atgtaatge afcgaoçtkal·. ttafcgagatg ggtlvtfctatg attagagfcc.cj 4500 egoaaêtata: àafetfcaataç gçgáteagáaa acaaaatata gggggça#á®: taggátaáâfe: :4560 tafeegogcgc ggfcgfecatet: afegtfcaetag «totcfcagag tetcaagctt ggegcgcwea 4620 cgtgaçfcágfe ggçaetggçc: çtcgttttac aàiBgfetógfcgà: ^gggaaaáe, gcfcggffigttá 4080 èGdàáçfctá» tegeetfegea ^gacafeccág «tfctcgeáag efe^gggtaat:agagaagagg 4740 cccgcgcúgra. tcçcccttctí caacagttgc goagcctgaâ tggcgãatgc tagagdagct 4800 tgagcfct-gga tcagattgtc gtttcccgcc ctcagcttaa actatcagtg í.tt.ga«agga 4860 tatattggeg ggfcaaacGta agagaaaaga gegtfcta 4837 < 210> 42 =2:17:»::2643'
2212» SNA «213> Artificial sequence <22ΰ> <223> Expression cassette number 1735 <4D0> 42
gfccaacatgg tggagcacga oacacttgtc tactccaaaa at.accaaega tacagtctea SO gasgaecaâ» gggeaattg»: gãòttfctsaã: GaaagggKaa: t:&amp;B«cgg&amp;a« Gctoatoigga 1.20 fcfcccafctgec eagcfcatefcg fceaotfcfeafcfe igtgaagafcag tggaa&amp;sgga aggfeggcfcec 1:80 :fca:sà:ááfcgég at.saBfegoga: taáaggaaag gscàtcgfetg aágáBgeet.é1: tgqegaoagt; 240 :ggt;dçseaáág Stggacoccb: aqeGàfíg&amp;gg agéátègtgg aáàâ.aga:ãgá. Gg&amp;tcgaa&amp;e 300 asgBefctcaa agmagfcgga tfcgatgfegafe: jaasatggtgg agcacgacac aetfcgtcfcao: 3:60 tccaaaaata tcasagafcac: agtcfccagaa gaccaaaggg caafctgagac:ttfefccaacaa 420 ágggfcaátafc àcggaaácefe cctcggattc 'cafctgeqeag c.tat«fcgrfcoa· Gtfctattgtg 48:0: áagsBagfegg áâáagg&amp;ágg :tggét.ectáG aaafcgBcats attgegstsa aggs&amp;sggeaí 540
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ttgeáàgãás tfc-Kgçéqága.: agfe.afcggâcfc gaaeBtasea ãfccátícgátfe gáàfcggataé ISSO cgtitacgaL aatfccgacfcc: aagaggggat: atStefcgaca agtacgefcgfc gqçtgtafcta 1440 .t:çea:à:eága.S gcaiíSfcáseGí agateàât^gà tggggagBgg aâggatágfcs: fcétoáòagàt;. 150:0: gfefeGetaàGç aàgggefeggg·1 ccaçeggtte cgtct.act.to aággaatacfc. ctagtafeegfc 1560 •cgacttetcsa gttgaceeco agctfefcattg cgaetaeaae Gfcggt&amp;ct-ta: tgaaataega: 1S2&amp; oeaga&amp;cetg gagotggata tgt.Gogagot. ggofegacatg afccqfecaatg agtgggfcgtg 1680
Gaac.cccatg gasatcaoat: featatfeacta cjcagcagftgfc ggagaatega aeaagfcggat 1740 eagt&amp;bgggc tsaagttgca cggtgaaggfc gfcgtccsstfeg· aacaeecaaa bgefcgggcsfe 1806 bggtfcgteag asaactaatg fcggafcfecgfct fcgaaatggfca gcegaaaaqg agaagetggo 1860 batagtggae :gt;ágbççatg': gggbfeãadsa çaagatçaat çágactaçc» ccacttgtac 1920 .çáÈçagaâaç fcSbaaaáagé teggaeoccg iggagsaggfeç gatígigatee1 fâgg^gggggg 1980 gagcaatgtg ctcgacatta ctgccçaccc taccsccaat ccacagacgg sacggacgas:. 2040 gagagteaac: feggaagagafe. ggfcgsgça.ggfe cfeifcÈatagc afctgtgga<ífe açafcteaâésà 2100 g&amp;bfcgbgbaa gfccabgagfca aaeggbciaag· afcecebgaac: bcagesgcefc tcfeattiafceg .2166 sgfetfcagagg cetatbttéii tfeagfetigaa ífefcfeasfegtitá bisggtgfcgdi 2220 btggtgagBg gbtbtegegtg dbaegagt-gb gbbbatbfcbà tgbaaáfcáa» 1¾¾¾¾¾¾¾¾¾ 2S80 ágefedéfcgfct^ tágéaggbsg: tettefcbgâgC aaggacáeáS:: áaâgalttiá 'álfctiaOiÉas 234:6 a&amp;aaaaaaas aaaaaagae.C: ggga&amp;fctcga feafea&amp;agofet afeogacabge: agatcgbfcea 2400 àagatfctigg:© a^tÁaàgfctt; çbtaágàtifcg; .aàfeagtgttg· ceggfcdfcbgá gafcgaltábg 2-460 âbabaaíítfec :fcgbbgasfcfca dgOtaagiGSt ígfcaatáalfca agalgfcaatgr; igabgáísgfela 2520 b%bafcgagab gggttfetiat: gaÊlagaigbsi éggòááttàb áá&amp;et&amp;aáfca cgrigabiaga» 2580 aacaaaafcat agcgegcaaa c.taggataaa fctategcgcg cgwe-gtcato batgtt&amp;cta 2640 gat 2643 <2ÍÍ>:43:
«OilliSflÒ <'212> PRT <11'5> RoU;v:ri.:S «400> 4.;
Met Ala Lys Asn Val Ala He Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1. 5 10 15:
Leu Val Pro Ser Gin He Pile Ala Gin Asa Tyr Gly Leu Asn Leu Pro 20 25 30
He Thr Gly Ser Met Asp Thr Val Tyr Ala Asn Ser Thr Gin Glu Gly 35 40 * 45
He Phe Leu Thr Ser Thr Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Gin Ala Ser 50 55 60
Thr Gin He Asn Asp Gly Glu Trp Lys Asp Ser Leu Ser Gin Met Phe 65 30 75 80
Leu Thr Lys Gly Trp Pro Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Ser 85" 90 95
Ser tie Vai Asp Phe Ser Val Asp Pro <51n Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn IQÔ 105 110
Leu Val Leu Met Lys Tyr Asp Gift Asπ Leu Glu Leu Asp Met Ser Gin 115 120 125
Leu Ala Asp Leu lie Leu Asn Gin Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp lie 130 ' 135 *140
Thr Len Tyr Tyr Tyr Gin Gin Ser Gly Gin Ser Asn Lys Trp lie Ser 145 150 * 155 160
Met Gly Ser Ser Cys Thr Val Lys Val Cys Pro Len Asn Thr Gin Met 1:65 170 175
Leu Gly lie Gly Cys Gin Thr Thr Asn Val Asp Ser Phe Gin Met Val Ι8Ό 185 190
Ala Glu Asn Glu Lys Leu Ala lie Val Asp Val Val Asp Gly lie Asn 155 200 205
Kis Lys lie Asn Leu Thr Thr Thr Thr Cys Thr lie Arc Asn Cys Lys 210 :215 ’ 2-20
Lys Len Gly Pro Arg Glu Asn Val Ala Val lie Gin Val Gly Gly Ser 225 230 235 240
Asn Val Leu Asp Tie Thr Ala Asp Pro Thr Thr Asn Pro Gin Thr Glu 245 250 255
Arg Met Met Arg Val Asn Trp Lys Lys Trp Trp Gin Val Phe Tyr Thr 260 ' 265 27:0
He Val Asp Tyr He Asn Gin lie Val Gin Val Met Ser Lys Arg Ser 2:75 :280 285
Arg Ser Leu Asn Ser Ala Ala Phe Tyr Tyr Arg Val 290 235 ' 300 m <211> 4066
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Asp He Thx Ala Asp Pro Thx Thx Asn Pro Gin Thx Glu Axg Met, Met 245 25© 255
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Tyr He Asn Gin He Vai Gin Vai Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu 275 280 285
Asn Ser Ala. Ala Phe Tyr Tyr Axg Vai 290 295
REIVINDICAÇÕES 1. Método de produção de uma partícula semelhante a rotavirus (RLP) numa planta, porção de uma planta ou célula vegetal, compreendendo: a) Introduzir um primeiro ácido nucleico compreendendo uma primeira região reguladora activa na planta ligada operativamente a uma primeira sequência de nucleótidos codificando uma primeira proteína estrutural de rotavirus selecionada de uma de VP2, VP6 e VP7, um segundo ácido nucleico compreendendo uma segunda região reguladora ativa na planta operativamente ligada a uma segunda sequência de nucleótidos que codifica uma segunda proteína estrutural de rotavirus selecionada a partir de VP2, VP6 e VP7 e um terceiro ácido nucleico compreendendo uma terceira região reguladora activa na planta ligada operativamente a uma terceira sequência de nucleótidos que codifica uma terceira proteína estrutural de rotavirus seleccionada de uma de VP2, VP6 e VP7 na planta, porção de uma célula de planta ou planta, em que a primeira, segunda ou terceira sequência de nucleótidos que codifica a VP7 compreende um péptido de sinal nativo truncado ou um péptido de sinal não nativo a partir de um polipéptido de planta, um d em que o RLP compreende VP2, VP6 e VP7; ou a) Fornecer uma planta, uma porção de uma célula vegetal ou vegetal compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo uma primeira região reguladora activa na planta ligada operacionalmente a uma primeira sequência nucleotídica que codifica uma primeira proteína estrutural de rotavirus, um segundo ácido nucleico compreendendo uma segunda região reguladora activo na planta ligada operativamente a uma segunda sequência de nucleótidos que codifica uma segunda proteína estrutural de rotavirus e um terceiro ácido nucleico compreendendo uma terceira região reguladora activa na planta ligada operativamente a uma terceira sequência de nucleótidos que codifica uma terceira proteína estrutural de rotavirus na planta, parte de uma célula vegetal ou vegetal; em que a primeira proteína estrutural de rotavirus é VP2, a segunda proteína estrutural de rotavirus é VP6 e a terceira proteína estrutural de rotavirus é VP7, em que VP7 compreende um péptido de sinal nativo truncado ou um péptido de sinal não nativo a partir de um polipéptido de planta; b) incubar a planta, porção de uma planta ou célula vegetal em condições que permitem a expressão transitória do primeiro, segundo e terceiro ácido nucleico, produzindo assim o RLP; c) colher a planta, parte da planta ou célula vegetal e d) extrair e purificar as RLP da planta, parte da planta ou célula vegetal, na presença de cálcio, em que a concentração de cálcio está entre 1 mM e 1000 mM. 2. Método da reivindicação 1, em que um quarto ácido nucleico compreendendo uma quarta região reguladora ativa na planta e operativamente ligado a uma quarta sequência de nucleótidos que codifica uma quarta proteína estrutural de rotavirus é introduzida na planta, porção de uma planta ou célula vegetal em passo a), e é expresso quando incuba a planta, porção de uma planta ou célula vegetal no passo b) em que a quarta proteína estrutural de rotavirus é VP4. 3. Método da reivindicação 1, em que a primeira proteína estrutural de rotavirus é VP2, a segunda proteína estrutural de rotavirus é VP6 e a terceira proteína estrutural de rotavirus é VP7.

Claims (8)

  1. 4. Método da reivindicação 1, em que a planta, porção de uma planta ou célula vegetal é proporcionada com um quarto ácido nucleico compreendendo uma quarta região reguladora ativa na planta e operativamente ligada a uma quarta sequência de nucleótidos que codifica uma quarta proteína estrutural de rotavirus, em que a quarta proteína estrutural de rotavirus é VP4.
  2. 5. Método de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que a primeira, segunda, terceira ou quarta sequência de nucleótidos ou uma sua combinação está operacionalmente ligada a uma região reguladora do vírus do mosaico do Cowpea (CPMV).
  3. 6. Método de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que a sequência de nucleótidos que codifica VP2 compreende de 80% a 100% de identidade com uma sequência de nucleótidos como definida por SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 45, a sequência de nucleótidos que codifica VP6 compreende de 80% a 100% de identidade com uma sequência de nucleótidos como definida por SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 46, a sequência de nucleótidos que codifica VP7 compreende de 80% a 100% de identidade com uma sequência de nucleótidos como definida por SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 ou 57, a VP4 compreende de 80% a 100% de identidade com uma sequência de nucleótidos como definida pela SEQ ID NO : 15, 16, 47, 50 ou 51.
  4. 7. Método da reivindicação 1, em que o primeiro, o segundo e o terceiro ácido nucleico são introduzidos na planta, porção da planta ou célula vegetal por aglomeração com um inoculo de Agrobacteria compreendendo uma mistura do primeiro, segundo e terceiro nucleico ácido numa proporção de 1:1:1, em que o primeiro, o segundo e o terceiro ácido nucleico são expressos de forma transitória na planta e a planta é Nicotiana benthamiana.
  5. 8. Método da reivindicação 2, em que o primeiro, o segundo, o terceiro e o quarto ácido nucleico são introduzidos na planta, porção da planta ou célula vegetal por agro-infiltração com um inoculo de Agrohacteriacompreendendo uma mistura do primeiro, segundo, terceiro e quarto ácido nucleico numa proporção de 1:1:1:1, em que o primeiro, segundo, terceiro e quarto ácido nucleico são expressos de forma transitória na planta e a planta é Nicotiana benthamiana.
  6. 9. Método de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a utilização do codão da sequência de nucleótidos é ajustada para uso de codão humano preferido, aumento de conteúdo de GC ou uma combinação destes.
  7. 10. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 4, em que a primeira, segunda e terceira sequência nucleotidica está operacionalmente ligada a um elemento amplificador de tradução.
  8. 11. Método da reivindicação 1, em que o péptido de sinal não nativo é um péptido de sinal de isulfase de isulfase de proteina de alfafa (PDI).
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JP2015128397A (ja) * 2014-01-08 2015-07-16 国立大学法人広島大学 亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、および、当該遺伝子を用いた出芽酵母の選択的培養方法
ES2826402T3 (es) * 2015-01-23 2021-05-18 Medicago Inc Producción de partículas similares a rotavirus en plantas
CN106167518B (zh) * 2015-05-21 2021-01-15 厦门大学 截短的轮状病毒vp4蛋白及其用途
WO2017062246A1 (en) * 2015-10-05 2017-04-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Human rota virus g9p[6] strain and use as a vaccine
US11413346B2 (en) 2015-11-09 2022-08-16 Curevac Ag Rotavirus vaccines
MA44722A (fr) 2016-04-19 2019-02-27 Csir Vlp d'orbivirus chimériques produites par des plantes
GB201617480D0 (en) * 2016-10-14 2016-11-30 University Of Cape Town Production of soluble HIV envelope trimers in planta
US20210393765A1 (en) * 2019-02-19 2021-12-23 Medicago Inc. Rotavirus vp7 fusion proteins and rotavirus-like particles comprising them
CN112251461B (zh) * 2020-10-22 2022-08-23 植链(上海)生物科技有限公司 一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用
WO2022182224A1 (en) * 2021-02-23 2022-09-01 Universiti Malaya A process for producing pharmaceutical or other heterologous protein via agrobacterium-mediated transformation of mucuna bracteata
CN114875047A (zh) * 2022-05-27 2022-08-09 江苏三仪生物工程有限公司 一种优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白vp4的重组表达及应用
CN117866858B (zh) * 2023-11-30 2024-06-21 吉林农业大学 一种表达猪轮状病毒抗原的重组植物乳杆菌及其应用

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5428147A (en) 1983-04-15 1995-06-27 Mycogen Plant Science, Inc. Octopine T-DNA promoters
US4624850A (en) 1984-02-09 1986-11-25 Royal Children's Hospital Research Foundation Live attenuated human rotavirus vaccine
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4636385A (en) 1985-02-15 1987-01-13 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Vaccine, method for its preparation, and use thereof in vaccinating humans against rotavirus infection
US4751080A (en) 1985-08-26 1988-06-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against rotavirus diseases
US4704275A (en) 1985-08-26 1987-11-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against rotavirus diseases
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US4927628A (en) 1987-09-21 1990-05-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against rotavirus diseases and method of preparing same
KR0171434B1 (ko) 1990-11-16 1999-02-01 윌리엄 케이. 슈버트 인체 로타바이러스, 백신 및 방법
AU6512299A (en) 1998-10-07 2000-04-26 Boyce Institute For Plant Research At Cornell University Gemini virus vectors for gene expression in plants
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
KR100422158B1 (ko) * 2000-02-12 2004-03-10 (주)익스플로젠 재조합 로타바이러스의 구성체 단백질의 생산방법 및 이방법으로 생산된 백신 조성물
US6867353B2 (en) 2000-02-12 2005-03-15 Exploregen Inc. Production method of recombinant rotavirus structural proteins and vaccine composition
FR2806087B1 (fr) * 2000-03-07 2002-10-18 Agronomique Inst Nat Rech Particules pseudovirales de rotavirus et leur utilisation pour vectoriser des proteines ou des acides nucleiques
JP4698144B2 (ja) 2003-07-31 2011-06-08 富士通セミコンダクター株式会社 半導体装置の製造方法
CN1624141A (zh) * 2003-12-03 2005-06-08 中国农业科学院生物技术研究所 提高轮状病毒vp7或vp4植物表达含量的方法及产品
CN100569939C (zh) * 2004-02-26 2009-12-16 中国人民解放军免疫学研究所 表达人源轮状病毒外壳蛋白的转基因植物产品及其预防婴幼儿腹泻的用途
WO2007053183A2 (en) * 2005-05-27 2007-05-10 University Of Central Florida Chloroplasts engineered to express pharmaceutical proteins
BRPI0611336A2 (pt) * 2005-06-01 2010-08-31 Dow Global Technologies Inc método para produzir uma partìcula multivalente semelhante a vìrus, partìcula multivalente semelhante a vìrus, método de aumentar a solubilidade de uma partìcula multivalente semelhante a vìrus e vacina
CN1772902A (zh) * 2005-09-30 2006-05-17 中国农业大学 轮状病毒vp6蛋白的一种编码基因及其应用
CA2630220C (en) * 2005-11-22 2020-10-13 Doris Coit Norovirus and sapovirus antigens
CA2615372A1 (en) * 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
EP2610345B1 (en) * 2007-11-27 2015-08-19 Medicago Inc. Recombinant influenza virus-like particles (VLPS) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
EP2297186B1 (en) * 2008-05-29 2018-08-29 The Government of The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services, Expression and assembly of human group c rotavirus-like particles and uses thereof
CA2736796A1 (en) 2008-08-27 2010-03-04 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University A dna replicon system for high-level rapid production of vaccines and monoclonal antibody therapeutics in plants
CN103282501A (zh) * 2010-11-04 2013-09-04 麦迪卡格公司 植物表达系统

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