TR201802091T4 - Bitkilerde rotavirüs - benzeri partikül üretimi. - Google Patents

Bitkilerde rotavirüs - benzeri partikül üretimi. Download PDF

Info

Publication number
TR201802091T4
TR201802091T4 TR2018/02091T TR201802091T TR201802091T4 TR 201802091 T4 TR201802091 T4 TR 201802091T4 TR 2018/02091 T TR2018/02091 T TR 2018/02091T TR 201802091 T TR201802091 T TR 201802091T TR 201802091 T4 TR201802091 T4 TR 201802091T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
plant
rotavirus
protein
nucleic acid
seq
Prior art date
Application number
TR2018/02091T
Other languages
English (en)
Inventor
Daoust Marc-Andre
Landry Nathalie
Lavoie Pierre-Olivier
Arai Masaaki
Asahara Naomi
Levi Rutendo Mutepfa David
Isabel Hitzeroth Inga
Peter Rybicki Edward
Original Assignee
Medicago Inc
Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medicago Inc, Mitsubishi Tanabe Pharma Corp filed Critical Medicago Inc
Publication of TR201802091T4 publication Critical patent/TR201802091T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203—Virus mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8214—Plastid transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8221—Transit peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12351—Methods of production or purification of viral material

Abstract

Bu buluş, bitkilerde rotavirüs yapısal proteinlerinin üretilmesiyle ilgilidir. Daha spesifik olarak, bu buluş, bitkilerde rotavirüs yapısal proteinini içeren virüs benzeri partiküllerin üretilmesiyle ilgilidir.

Description

TARIFNAME BITKILERDE ROTAVIRUS - BENZERI PARTIKUL URETIMI Bulusun Alani Bu bulus, bitkilerde rotavirüs yapisal proteinlerinin üretilmesiyle ilgilidir. Daha spesifik olarak, bu bulus, bitkilerde rotavirüs yapisal proteinini içeren virüs benzeri partiküllerin üretilmesiyle ilgilidir.
Bulusun Arka Plani Rotavirüs enfeksiyonu bes yasin altindaki çocuklari etkileyen küresel bir problemdir.
Ciddi gastroenterit ve en kötü ihtimalle ölümle sonuçlanir.
Rotavirüsler, gastrointestinal sistemi ve solunum yollarini etkileyen virüslerin Reoviridae ailesinin (rotavirüs cinsi) üyeleridirler. Negatif kontrast elektron mikroskobu ile incelendiginde, adini virionlarin tekerler benzeri görünümden alir (Sekil 1a; önceki teknik). Rotavirüs genelde küre biçimindedir ve adini bunun dis ve iç kabuklardan veya bunlarin çift kabuklu kapsid yapisindan alir. Dis kapsid yaklasik 70 nm'dir ve iç kapsidlerin çapi yaklasik 55 nm'dir. Rotavirüsün çift kabuklu kapsidi iç protein kabugu ve genom da dahil çekirdegin etrafini sarar. Rotavirüs genomu, en az 11 rotavirüs proteinini kodlayan çift sarmalli RNA bölümlerinden olusur. dsRNA, alti yapisal proteini (VP) ve alti yapisal olmayan proteini (NSP) kodlamaktadir (Sekil 10; önceki teknik). Yapisal proteinler VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 ve VP7'yi içerir (Sekil 1b; onceki teknik). Sirasiyla VP2, VP6 ve VP7'nin VP4 ile bir araya getirilmesiyle virüs yapisi yüzeyinde 'pikler' olusturacak sekilde üç es merkezli katman olusturulur. NSP'ler, enfekte olmus hücrelerde sentezlenir ve çogalma döngüsünün çesitli bölümlerinde islev g'orür veya patogenezi veya enfeksiyona karsi bagisiklik cevabini etkilemek için bazi ana proteinlerle etkilesirler (Greenberg ve VP2, 102 kDa'lik bir proteindir ve viral çekirdegin en bol proteinidir. En içteki yapisal protein tabakasini olusturur ve viral çekirdegin bilesenlerini ve transkripsiyon enzimlerini dogru bir sekilde birlestirmek için bir iskele saglar (Lawton, 2000). 125 kDa'da en büyük viral protein olan VP1, rotavirüs için bir RNA'ya bagli polimeraz görevi görür ve bir çekirdek replikasyon ara ürünü olusturur ve VP2'ye ikozahedral protein olan VP3, ayrica viral genom ile dogrudan iliskilidir ve viral mRNA'lara 5' baslik (cap) yapisini ekleyen bir mRNA baslik takma (capping) enzimi olarak islev görür. VP1 ve VP3 birlikte VP2 kapsid katmaninin dis 5 - katli köselerine bagli bir kompleks olustururlar (Angel, 2007). VP6, viral çekirdegin orta kabugunu olusturan, büyük kapsid proteini olan ve virionun toplam protein kütlesinin % 50'sinden fazlasini transkripsiyonu için gereklidir ve reoviridae ailesinin bir baska üyesi olan bluetongue virüsünde görüldügü gibi çekirdekte VP1'i VP1'e tutturarak rotavirüs RNA'sinin kapsüllenmesinde rol oynayabilir. Ayni zamanda, rotavirüslerin bes grup halinde (A'dan E'ye) siniflandirilmasini belirler, burada A grubu insanlari en fazla etkileyen gruptur (Palombo, 1999). Rotavirüs A grubundaki VP6, SG'ye özgü epitoplarin varligina veya yokluguna bagli olarak en az dört alt gruba (SG) sahiptir: SG I, SG II, SG (I + ll) ve SG non - (I + ll). B ve C gruplari ortak bir A grubu antijen içermezler, ancak D gruplari yalnizca tavuk ve inek gibi hayvanlari etkilerken, B ve C gruplarinin insanlari enfekte ettigi bilinmektedir (Thongprachum, 2010). lki dis kapsid protein VP7, bir 37 kDa'lik glikoprotein (G) ve 87 kDa'lik proteaz duyarli VP4 (P), virüsün serotiplerini tanimlar. Bu iki protein, nötralize edici antikor tepkilerini indükler ve GP antijen kombinasyonuna bagli olarak rotavirüs serotiplerini çifte isimlendirme sisteminde siniflandirmak için kullanilir (örn. G1 P [8] veya G2 P [4]) (Sanchez - Padilla ve digerleri, 2009). VP4 proteini, virüsün dis kabugu üzerinde, konak hücre girisinin baslangiç asamalarinda dogrudan yer alan 60 piki olusturmak için dimerlesir. Spike proteini, 248 amino asit (aa) konumunda bir bölünme bölgesi üretmek için proteaz tripsin ile bölünür (Denisova ve dig. , 1999). Bu islem, virüs enfektivitesini (hücre baglanmasi ve konak hücrenin istilasi) arttirir ve pik (spike) yapisini stabilize eder (Glass, 2006). VP? glikoproteini virüsün üçüncü veya dis tabakasini olusturur. Günümüzde, 27 G ve 35 P genotipleri bilinmektedir (Greenberg ve Estes, 2009). VP4 ve VP7i virüs nötralizasyonunda yer alan baslica antijenlerdir ve asi gelistirme için önemli hedeflerdir (Dennehy, 2007).
Enfekte memeli hücrelerinde, rotavirüsler, tam üç katmanli VP2 / 6/4/7 viral partiküllerini olusturmak için essiz bir morfogenez moduna girerler (Lopez ve digerleri, 2005). Üç katmanli kapsid, fekal - oral iletimi ve virüsün ince bagirsaga iletilmesini saglayan, çok stabil bir kompleks olup, villusun uçlarina yakin bölünmeyen farklilasmis enterositleri enfekte eder (Greenberg ve Estes, 2009).
Birincisi, bozulmamis virüs, virüs yüzeyinde 60 VP4 dimer pikleri (spike) yoluyla sialik asitten bagimsiz reseptörlere baglanir (Lundgren ve Svensson, 2001). Virüs yüzeyinde bulunan 60 VP4 dimer pikleri (spike) virüsün bu hücre reseptörlerine yapismasina izin verir. VP4, bir dizi yardimci reseptör ile etkilesim için glikoproteinin yüzeyinde ilave baglanma bölgeleri ortaya çikaran bir konformasyonel degisiklige neden olan tripsin ile proteolitik bölünmeye duyarlidir.
Bununla birlikte, çok adimli baglanma ve giris süreci açikça anlasilamamistir, ancak virüs konagin plazma zarin boyunca iletilir. Giris sürecinde yer alan VP7 dis kapsid kabugu islem sirasinda çikarilir ve çift tabakali partiküller (DLP) veziküllerdeki hücre sitoplazmasi içine gönderilir (Sekil 2, önceki teknik). DLP, vezikülden kaçar ve membrana bagli olmayan sitoplazmik inklüzyonlara gider. Genomun VP1 tarafindan erken kopyalanmasi partiküllerden baslar, böylece dsRNA sitoplazmaya asla maruz kalmaz. RNA replikasyonu ve çekirdek olusumu, membrana bagli olmayan sitoplazmik inklüzyonlarda gerçeklesir. Daha sonra, gelismekte olan (+) RNA'lar sitoplazma içine tasinir ve viral protein sentezi için sablonlar olarak görev yapar.
VP4, sitozolde üretilir ve kaba endoplazmik retikuluma (RER) tasinir ve VP7, RER içine salinir. VP2 ve VP6 üretilir ve virozomlardaki sitozolda bir araya getirilir ve daha sonra süreçte geçici bir membran zarfi alan RER bölmelerine asilanir (Lopez ve digerleri, 2005; Tian ve digerleri, 1996). RER'de, viral partiküllerin geçici zarflari rotaviral glikoprotein NSP4'ün kritik katilimi ile birlikte çikarilir ve yerine VP4 ve VP? protein monomerleri yerlestirilir (Tian ve digerleri, 1996; Lopez ve digerleri, 2005; Gonzalez ve digerleri, 2000). NSP4, ER zarinda bir hücre içi reseptör görevi görür ve yeni yapilmis alt - viral partikülleri ve muhtemelen VP4 spike proteinini baglar (Tian ve digerleri, 1996). NSP4 ayrica insanlar için toksiktir ve ishale neden olan bir ajandir. Tam, olgun partiküller daha sonra RER'den Golgi aparati yoluyla salgilama için plazma zarina aktarilir (Lopez ve digerleri, 2005). rotavirüs asisi üretmek için çesitli ve farkli yaklasimlara basvurulmustur. Bu yaklasimlar, çesitli Jennerian yaklasimlari, canli zayiflatilmis virüslerin kullanimi, virüs benzeri partiküllerin kullanilmasi, nükleik asit asilari ve viral alt ünitelerin immünojenler olarak kullanilmasini içerir. Günümüzde piyasada mevcut olan iki oral asi bulunmaktadir, ancak, bazi gelismekte olan ülkelerde sus çesitleri ve diger patojenlerin varligi nedeniyle bu etkiler düsüktür. hazirlanma yöntemlerini tarif etmektedir. Bu grubun üyeleri tarafindan ortak olarak paylasilan nokta, bu asilarin her birinin nihai rotavirüs asilarini olusturmak için viral partiküllerin kullanilmasina dayaniyor olmasidir. Etkili, çok degerlikli bir asi için uzun zamandir devam eden ihtiyaca bakarsak, bu çalisma grubunun böyle bir asi ihtiyacina yönelik olarak yalnizca kismen basarili oldugu açiktir.
Geleneksel asi üretim yöntemlerinden ayrilan moleküler biyoloji alanindaki ilerlemeler, bireysel rotavirüs proteinlerinin sentezlenmesine izin vermistir. Crawford kodlama yapan VP2, VP4, VP6 ve VP7'yi bakulovirüs ifade sistemine klonlamis ve böcek hücrelerinde her proteini ifade etmistir. Rotavirüsün ana yapisal proteinlerinin farkli kombinasyonlarinin birlikte ifadesi stabil virüs benzeri partiküllerin (VLP'Ierin) olusumuyla sonuçlanmistir. VP2 ve VP6'nin tek basina veya VP4 ile birlikte ifadesi, çift katmanli rotavirüs partiküllerine benzer olan VP2 / 6 veya VP2 / 4/6 VLP'lerin üretilmesiyle sonuçlanmistir. VP4, VP4, VP4 ve VP7'nin birlikte ifadesi, dogal bulasici rotavirüs partiküllerine benzer üç katmanli VP2 / 6/7 veya VP2 / 4/6/7 VLP'ler üretmistir. VLP'ler partiküllerin elektron mikroskopik incelemesi, VP4 ve VP7 üzerindeki nötrlestirici olmayan ve nötralize edici epitoplarin varligi ve VP2 / 4/VLP'lerin hemagglütinasyon aktivitesi ile belirlendigi üzere, dogal partiküllerin yapisal ve islevsel özelliklerini korumustur.
Farkli protein bilesimlerinin virüs benzeri partiküllerinden üretilen asi adaylarinin potansiyel alt birim asilari oldugu gösterilmistir. O'Neal ve digerleri ("Rotavirüs Virus - like Particles Administered Mucosally Induce Protective lmmunity, " J. Virology, 71 veya eklenmeden farelere verildiginde VP2 ve 6 veya VP2, 6 ve 7'yi içeren VLP'lerin bagisiklik kazandirilmis farelerde koruyucu bagisiklik olusturdugunu göstermistir, ancak VLP'lere kolera toksini (CT) uygulandiginda koruma daha etkili olmustur. kullanilmistir, Fernandez ve digerleri, ("Passive lmmunity to Bovine Rotavirüs in Newborn Calves Fed Colostrum Supplements From Cows Immunized with Recombinant SA11 rotavirus core - like particle (CLP) or virus - like particle (VLP)" yaratma yetenegi arastirilmistir. Bu grup, VLP'Ierin pasif bagisikligi uyarmada CLP'Ierden daha etkili oldugu sonucuna varmistir.
Bitkiler, rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretimi için giderek daha fazla bitkilerinde VP6, VP2, VP4 veya VP7 rekombinant rotavirüs yapisal proteininin ifadesini açiklar.
Saldana ve digerleri bir karnabahar mozaik virüsü (CaMV) 358 promotörü ve rekombinant A. tumefaciens kullanarak domates bitkilerinin sitoplazmasinda VP2 ve VP6'yi ifade etmistir (Saldana ve dig. , ABD)2006). Elektron mikroskopisi çalismalari, partiküllerin küçük bir bölümünün 2/6 VLP'Ierde toplandigini göstermistir. Farelerde koruyucu bir bagisiklik tepkisi tespit edilmis ve bu, bir araya getirilmemis VP tarafindan bir dereceye kadar desteklenmis olabilir. Bireysel proteinlerin, VP8 ve VP6 durumunda oldugu gibi, farelerde bagisiklik tepkileri ortaya çikardigi gösterilmistir (Zhou ve digerleri, 2010).
Matsumura ve digerleri, (2002), sigir rotavirüsü A VP6 ifadesini ve transgenik patates bitkilerindeki birlesmeyi ilk kez rapor etmistir. Çalismalarinda, karnabahar mozaik virüsü (CaMV) 358 promotörü ve VP6 genini tasiyan rekombinant Agrobacterium tumefaciens tarafindan regüle edilen transgenik patates bitkilerini kullanmislardir.
Protein ifade edilmis, saflastirilmis ve immünojenik çalismalar yapilmistir. Yetiskin farelerde bagisik yaniti, serumda VP6 antikorlarinin varligini göstermistir. Bununla birlikte, bir araya getirilmis VP6 proteinlerine kanit sunmamislardir. Farelerde bir bagisiklik tepkisi ortaya çikarabilecek olan, basit monomerler veya trimerler olabilir.
Bir baska grubun çalismasi, Nicotiana benthamiana'da patates virüsü X (PVX) vektörü kullanilarak VP6 birlesmesini göstermistir (O'Brien ve digerleri, 2000). VP6 proteini bitkilerde ifade edildiginde, sadece PVX protein çubuklarina kaynastiginda bir araya geldigi kesfedilmistir. Bölünme meydana geldiginde, VP6, Marousica ve digerleri (2001) tarafindan yapilan HIV - PVX ile benzer bir çalismada görüldügü gibi, ikozahedral VLP'Ier halinde toplanmistir. 2001 Bu sonuç büyük olasilikla rotavirüs proteinlerinin VLP'Ieri olusturmak için ilave bir faktöre veya promotöre ihtiyaç duyabilecegini düsündürmektedir.
Bir veya daha fazla rekombinant proteinin sentezi ve birlestirilmesi gerektigi için VLP üretimi zor bir görevdir. Bu, dört farkli proteinin 1860 monomeri tarafindan olusturulan bir kapsid ile bir RNA virüsü olan rotavirüsün VLP'si için geçerlidir. VLP üretimi için, iki ila üç rekombinant proteinin ayni anda ifadesi ve birlestirilmesi gereklidir. Bunlar, bir araya gelerek sonuçta bir çift veya üç katmanli partikül olusturan 120 molekül VP2 (iç katman), 780 molekül VP6 (orta katman) ve 780 moleküllü glikoprotein VP7'yi (dis tabaka) içerir. Buna ek olarak, çogu VLP'nin üretimi, rotavirüs benzeri partikül (RLP) durumunda tek bir konak hücrede meydana gelmesi gereken birkaç rekombinant proteinin ayni anda ifadesini ve toplanmasini gerektirir.
Daha yeni bir arastirma, Beet black scorch virüsü (BBSV) aracili ifade sistemi kullanan kodon - optimize insan rotavirüsü VP6'nin Chenop - odium amarantikolorda basarili bir sekilde ifade edildigini göstermistir. Protein, BBSV'nin kilif proteini açik okuma çerçevesinin yerine konmak üzere tasarlanmistir. Disi BALB/c farelerinin bitki esasli VP6 proteini ile oral olarak asilanmasi yüksek titreleri anti - VP6 mukozal Iga ve serum IgG'yi indüklemistir (Zhou ve digerleri, 2010). Ancak, grup, VP6 proteinlerinin VLP'Iere mi yoksa partiküllere mi eklendiginden bahsetmemistir.
Rotavirüs VP7 ayrica tütün bitkilerinde de basariyla ifade edilmistir ve farelerde nötralize edici bagisiklik tepkisini sürdürdügü gösterilmistir (Yu ve Langridge, 2001).
VP7'yi ifade etmek için transgenik patates bitkileri kullanan bir baska arastirmada, VP7 geninin, dönüstürülmüs bitkilerde 50'den fazla nesilde stabil oldugu gösterilmistir. 50. nesilden gelen VP7 proteini yetiskin farelerde koruyucu ve nötrlestirici antikorlari indüklemistir (Li ve digerleri, 2006).
Yang ve digerleri, (Yang YM, Li X, Yang H, ve digerleri 2011), tütün bitkilerinde A RV grubunun (P [8] G1) üç kapsid proteini VPR, VP6 ve VP7'yi birlikte ifade etmis ve bu proteinlerin ifade seviyelerinin yani sira rotavirüs benzeri partiküllerin olusumu ve immünojenisitesi üzerinde çalisilmistir. VLP'Ier, transgenik tütün bitkilerinden saflastirilmis ve elektron mikroskopisi ve Western blot ile analiz edilmistir. Yang ve digerlerinin sonuçlari, bitkiden türetilen VP2, VP6 ve VP7 proteininin 60 - 80 nm çapinda 2/6 veya 2/6/7 rotavirüs benzeri partikül içine kendini monte ettigini göstermektedir.
WC 01 / 59070A1, dönüstürülmüs bitki hücresinin kültürlenmesiyle rekombinant rotavirüs yapisal proteinlerin üretilmesi için bir yöntemi ve ardisik bilesende oldugu gibi aynisini içeren bir asi bilesimini açiklamaktadir. S. Saldana ve digerlerinin by expression of capsid proteins VP2 and VP6 and immunological studies" baslikli yayini transgenik domates bitkilerinin meyvelerinde VP2 ve VP6 rotavirüs kapsid proteinlerinin ifadesini açiklamaktadir. 8. D. Trask ve digerlerinin "Assembly of highly infectious rotavirüs particles recoated with recombinant outer capsid proteins" baslikli yayini VP4 ve VP7 rekombinantlara sahip, yeniden kaplanmis çift katmanli rotavirüs partiküllerini açiklar. Y. M. Yang ve digerlerinin "lmmunogenicity and virus - like particle formation of rotavirüs capsid proteins produced in transgenic plants" baslikli yayini tütün bitkilerinde bir karnabahar mozaik 358 promotörü kullanan birimlerden gelen tam uzunlukta rotavirüs VP2, VP6 ve VP? proteinlerinin stabil sekilde ifade edilmesi, ekstraksiyonu ve saflastirilmasini açiklamaktadir.
Bulusun Kisa Açiklamasi Bu bulus, bitkilerde rotavirüs yapisal proteinlerinin üretilmesiyle ilgilidir. Daha spesifik olarak, bu bulus, bitkilerde rotavirüs yapisal proteinini içeren virüs benzeri partiküllerin üretilmesiyle ilgilidir.
Mevcut bulusa göre bir bitkide bir rotavirüs - benzeri partikül (RIP) üretmeye yönelik lstem 1'e göre yöntem saglanir, yöntem asagidakileri içerir: a) VP2, VP6 ve VP7`den seçilen birinci bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan birinci bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli bitki içinde aktif bir birinci düzenleyici bölgeyi içeren birinci bir nükleik asit, VP2, VP6 ve VP7'den seçilen ikinci bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan ikinci bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli bitki içinde aktif bir ikinci düzenleyici bölgeyi içeren ikinci bir nükleik asit ve VP2, VP6 ve VP7'den seçilen üçüncü bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan üçüncü bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli bitki içinde aktif bir üçüncü düzenleyici bölgeyi içeren üçüncü bir nükleik asidin bitkiye, bitkinin bir bölümüne veya bir bitki hücresine sokulmasi, burada VP7'yi kodlayan birinci, ikinci ve üçüncü nükleotit dizisi kesik bir dogal sinyal peptidini veya bir bitki polipeptidinden gelen dogal olmayan bir sinyal peptidini içerir ve burada RLP VP2, VP6 ve VP7'yi içerir, veya bir bitkiye, bir bitki bölümüne veya bitki hücresine birinci bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan birinci bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli bitki içinde aktif bir birinci düzenleyici bölgeyi içeren birinci bir nükleik asit, ikinci bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan ikinci bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli bitki içinde aktif bir ikinci düzenleyici bölgeyi içeren ikinci bir nükleik asit ve üçüncü bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan üçüncü bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli bitki içinde aktif bir üçüncü düzenleyici bölgeyi içeren üçüncü bir nükleik asidi içeren bir bitki, bir bitki bölümü veya bitki hücresinin saglanmasi, burada birinci rotavirüs yapisal proteini VP2, ikinci rotavirüs yapisal proteini VP6 ve üçüncü rotavirüs yapisal proteini VP7'dir, burada VP7 bir bitki polipeptidinden gelen kesik bir dogal bir sinyal peptidini veya dogal olmayan bir sinyal peptidini içerir; b) bitki, bir bitki bölümü veya bitki hücresinin birinci, ikinci ve üçüncü nükleik asidin geçici ifadesine izi veren kosullar altinda inkübe edilmesi, böylece RLP'nin üretilmesi, c) bitkinin, bitki bölümünün veya bitki hücresinin hasat edilmesi ve d) kalsiyumun varliginda, burada kalsiyum konsantrasyonu 1 mM ila 1000 mM arasindadir, bitki, bitki bölümü veya bitki hücresinden gelen RLP'Ierin ekstrakte edilmesi ve saflastirilmasi.
Ayrica, bitki içinde aktif bir dördüncü düzenleyici bölgeyi içeren ve dördüncü bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan dördüncü bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli dördüncü bir nükleik asit de a) adimindaki bitkiye, bitkinin bir bölümüne veya bir bitki hücresine sokulabilir ve b) adimindaki bitki, bitkinin bir bölümü veya bitki hücresi inkübe edilirken, ifade edilir.
Yukarida açiklanan yöntemde ilk rotavirüs yapisal proteini VP2, ikinci rotavirüs yapisal proteini VP6, üçüncü rotavirüs yapisal proteini VP7 olabilir. Dahasi, dördüncü rotavirüs yapisal proteini VP4 olabilir. VP4; VP5 ve VP8 üretmek üzere islenebilir veya bölünebilir. VP4'ün bölünmesi bir proteaz, örnegin tripsin, tripsin benzeri proteaz, serin proteaz, kimotripsin benzeri proteaz veya bir subtilisin kullanilarak gerçeklestirilebilir. Proteaz, bitki içinde birlikte ifade edilebilir.
Ayrica, yöntemde ilave bir nükleik asit bitkide, bir bitkinin bir bölümünde veya bitki hücresinde ifade edilebilir, burada ilave nükleik asit bitki içinde aktif olan susturmanin bir baskilayicisini kodlayan bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli, düzenleyici bir bölgeyi içerir.
Nükleotit dizisinin kodon kullanimi, tercih edilen insan kodon kullanimi, arttirilmis GC içerigi veya bunlarin bir kombinasyonu olarak ayarlanabilir.
Rotavirüs yapisal proteini, kesilmis dogal veya dogal olmayan bir sinyal peptit içerir.
Dogal olmayan sinyal peptit bir protein disülfür izomeraz (PDI) sinyal peptidi olabilir.
Birinci, ikinci, üçüncü veya dördüncü nükleotit dizisi veya bunlarin bir kombinasyonu, Cowpea Mozaik Virüsü (CPMV) düzenleyici bölgesine islevsel olarak bagli olabilir.
Yukarida açiklanan yöntem su adimlari içermektedir: c) bitkinin, bitki bölümünün veya bitki hücresinin hasat edilmesi ve d) bitki, bitki bölümü veya bitki hücresinden gelen RLP'lerin saflastirilmasi.
Yöntemde hasat veya saflastirma adiminda, VP4; tripsin, tripsin benzeri bir proteaz, bir serin proteaz, bir kimotripsin benzeri proteaz, subtilisin kullanilarak VP5 ve VP8 üretmek üzere islenebilir veya bölünebilir.
RLP'lerin boyutu 70 - 100 nm arasinda degisebilir ve kalsiyum varliginda saflastirilirlar.
Mevcut bulus, yukarida açiklandigi gibi yöntem tarafindan üretilen bir RLP saglar. Üretilen RLP, en azindan bir VP4 rotavirüs yapisal proteini içerebilir. VP4; bir proteaz, örnegin tripsin, tripsin benzeri bir proteaz, bir serin proteaz, bir kimotripsin benzeri proteaz, subtilisin kullanarak VP5 ve VP8'e ayrilabilir. Proteaz, bitki içerisinde birlikte ifade edilebilir veya hasat, saflastirma veya her ikisi sirasinda eklenebilir.
Ayrica yöntemle üretilen RLP, çift katmanli bir RLP ve / veya üç katmanli bir RLP olabilir.
Ayrica, nükleotit dizileri saglanmaktadir. VP2'yi kodlayan nükleotid dizisi, SEK ID NO: 13, SEK ID NO: 14 veya SEK ID NO: 45 ile tanimlanan bir nükleotit dizisi ile % 80 ila tanimlanan bir nükleotit dizisi ile % 80 ila % 100 özdeslige sahip olmasidir. Ek olarak, VP2, SEK ID NO: 1 veya SEK ID NO: 25 ile tanimlanan bir amino asit dizisi ile % 80 ila % 100 özdeslik içeren bir amino asit dizisi tarafindan kodlanabilir. 25. VP6, SEK özdeslik içeren bir amino asit dizisi tarafindan kodlanabilir. 31. VP7, SEK ID NO: 4, bir amino asit dizisi tarafindan kodlanabilir. 4, 39, 43 veya 59'dur. VP4, SEK ID NO: 2 veya SEK lD NO: 36. 33 ile tanimlanan amino asit dizisi ile % 80 ila % 100 özdeslik içeren bir amino asit dizisi tarafindan kodlanabilir. 2 veya SEK ID NO: 36. 33. Bir veya daha fazla rotavir'us yapisal proteini VP2, VP4, VP6 ve /veya VP? olabilir. VP4; VP5 ve VP8 üretmek 'üzere islenebilir. Bir veya birden fazla rotavir'us yapisal proteini, rotavirüs G9 P [6], rotavirüs A WA susu, rotavir'us A asisi USA / Rotarix - Yukarida tarif edilen yöntemde, birinci, ikinci veya üçüncü nükleik asit dizisi veya bunlarin bir kombinasyonu, bitkide bir veya daha fazla komovir'us arttiriciya, bir veya birden fazla amplifikasyon elementine ve bir rotavir'üs yapisal proteinini kodlayan nükleotit dizisine islevsel olarak baglanmis bir düzenleyici bölge içerebilir ve burada bir replikazi kodlayan dörd'unc'ü bir nükleik asit, bir bitki, bitkinin bir bölümü veya bitki hücresine sokulabilir.
Mevcut bulus, yukarida açiklandigi gibi yöntem tarafindan üretilen bir RLP saglar.
RLP, bitkiye özgü N - glikanlar veya modifiye edilmis N - glikanlar içerebilen üç veya daha fazla rotavir'üs yapisal proteini içerebilir.
Mevcut bulus, tarif edildigi gibi, bir bagisiklik tepkisi indüklemek için yöntemle yapilmis etkili bir RLP dozunu ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici içeren bir bilesimi içerir.
Ayrica, istemlerde belirtilmemisse de, bir hastada bir rotavirüs enfeksiyonuna karsi bagisiklik kazandiracak bir yöntem, tarif edildigi gibi RLP'yi hastaya uygulamayi içerir. RLP, bir kisiye oral, intradermal, intranazal, intramüsküler, intraperitonal, intravenöz veya subkutan yoldan uygulanabilir.
Mevcut açiklama ayrica, yukarida tarif edildigi gibi (A) yöntemi ile üretilen bir RLP'yi içeren bitki maddesi saglar. Bitki maddesi, bir denekte bir rotavir'us virüsü enfeksiyonuna karsi bagisiklik kazandirmada kullanilabilir. Bitki maddesi ayrica gida takviyesi olarak eklenebilir.
Yukarida tarif edilen yöntemde, bitki veya bitkinin bir kismi, ayrica susturmanin bir baskilayicisini kodlayan baska bir nükleik asit dizisi ile birlikte uygulanabilir ya da ilaveten bunlari içerebilir. çizimlerin Kisa Açiklamasi Bulusun bu ve diger özellikleri, ekli çizimlere atifta bulunulan asagidaki açiklama ile daha açik hale gelecektir, burada: Sekil 1 Rotavirüs yapisi ve gen - protein atamasini gösterir. (A) Rotavirüs partiküllerinin transmisyon elektron mikroskopisi (çubuk 100 nm'yi temsil eder). (B) lç, orta ve dis yapiyi içeren virüs kapsid proteinlerinin organizasyonu. (C) Rotavirüs dsRNA parçalari, büyüklük ve fonksiyona göre düzenlenmistir. dsRNA, poliakrilamid jel elektroforez (D) ile ayrilabilir. (C) 'deki proteinler, (D)' deki dsRNA parçalari ile gösterilir. Crawford ve digerleri, and Greenberg and Estes, 'den gelen görüntüler.
Sekil 2 Rotavirüs hücre girisini ve replikasyonunu gösterir. Rotavirüs bir hücreye girdiginde, VP4 ve VP7 kaybolur ve çift katmanli bir partikül (DLP) olusur. VP2, VP4, VP6 ve VP7'nin translasyonu ile sonuçlanacak sekilde dsRNA'nin transkripsiyonu baslar. Replikaz aktivitesi olan döl çekirdekleri, virüs fabrikalarinda üretilir (viroplazmalar olarak da adlandirilir). Geç transkripsiyon, bu döl çekirdeklerinde olusur. Virüs fabrikalarinin çevrelerinde, bu çekirdekler, VP6 ile kaplanir ve endoplazmik retikulum membrani boyunca tomurcuklanan olgunlasmamis DLP'leri olustururlar ve ER'de bulunan viral glikoproteinler NSP4 ve VP7 ile modifiye edilen bir geçici Iipid membran elde ederler; bu zarflanmis partiküller ayni zamanda VP4'ü de içerir. Partiküller ER sisternanin iç kismina dogru ilerledikçe, geçici Iipid membran ve yapisal olmayan protein NSP4 kaybolur, diger taraftan VP4 ve VP7 virüs yüzey proteinleri en distaki virüs protein katmanini olusturmak üzere yeniden düzenlenir ve olgun enfeksiyöz üç katmanli partiküller üretirler (bkz. Isviçre Biyoenformatik Enstitüsü (ViralZone): viral - zone. expasy. org/viralzone/all_by_speciesl107. html).
Sekil 3 Agrobakteri vektörleri pTRAc, pTRAkc - rbcsl - CTP ve pTRAkc - ERH'yi gösterir. PSSSS, çogaltilmis transkripsiyonel arttiriciya sahip CaMV 358 promotör; CHS, kalkon sentaz 5 ' translate edilmemis bölge; pA358, CaMV 358 poliadenilasyon sinyali; SAR, tütün Rb7 geninin iskele tutturma bölgesi; LB ve R8, T - DNA entegrasyonu için sol ve sag sinirlar; ColElori, E. coli için kopyalama mensei; RK20ri, Agrobakteri için kopyalama mensei; bla, ampisilin / karbenisilin dirençli bla geni; LPH, murin mAb24 agir zincirinden sinyal - peptid dizisi; hisö, 6 x His etiketi dizisi; SEKDEL, ER - tutulum sinyal dizisi; rbcsl - cTP, Solanum tuberosum'dan bir Rubisco küçük altbirim geninin (rbcSI) kloroplast - transit peptit dizisi; npt II, kanamisin direnci npt ll geni; Pnos ve pAnos, nopalin sentaz geninin promotörü ve poliadenilasyon sinyali (Maclean ve digerleri, 2007).
Sekil 4 Rotavirüs klonlama ve infiltrasyon prosedürüne genel bir bakisi gösterir.
Sekil 5 Bir apoplast protein ekstraksiyon prosedürünü gösterir. (A) Bitki hücresinin illüstrasyonu ve apoplastin yeri. VP proteinleri sitozolde ifade edilir ve apoplasti hedef alir (kirmizi ok). (B) - Deneme sonrasinda, bitki yapragi, PBS (1) ile vakumla filtre edilir ve delikli bir spin kolonuna (2) yerlestirilir, daha sonra sap (3) toplamak için 2 ml'lik bir Eppendorf tüpünde santrifüje tabi tutulur.
Sekil 6 7 gün boyunca bitki yapragi hücresi bölmelerinde rotavirüs VP6 proteini ifadesinin Western blotlarini gösterir. Zarlari problamak için fare anti - rotavirüs VP6 antikoru (1: 5000) kullanilmistir. (+) ve ( - ) sirasiyla susturucu baskilayici ile veya bu olmadan ifadeyi göstermektedir. Kirmizi çizgiler analiz edilen çesitli örneklerde (~ 40 kDa) VP6 proteinlerinin konumunu gösterir. VPö'nin ifadesi ve ekstraksiyon verimliligi sitoplazmada en iyidir.
Sekil 7 N. benthamiana bitki yapraklarinin sitoplazmasinda 3. günde histidin etiketli rotavirüs proteinlerinin bireysel ifadesini gösteren bir western bloti gösterir. + ve - bakteriyel ifadeli rotavirüs VP2; M - moleküler agirlik markörü; VP - rotavirüs kapsid proteini. VP7 infiltrasyonu yapraklarin sararmasina neden olmustur (b).
Sekil 8 3. günde çesitli N. benthamiana bitki yaprak hücresi bölmelerini hedef alan rotavirüs VP2 (a) ve VP4'ün (b) ifadesini gösterir. VP2 ve VP4 için ilgili tavuk anti - rotavirüs serumu (1: 2000) proteinlerin problanmasi için kullanilmistir. ch - kloroplastlar; ER - endoplazmik retikulum; pTRAc - sitoplazma; A - apoplast; Negatif kontrol ( - ve) - bitkiler sadece susturucu baskilayicilarla infiltre edilmistir; ( - ve +) susturucu baskilayici ile veya bu olmadan (a) - bakteriyel ifade edilmis VP2, (b) - bakteri ile ifade edilen VP4; M - moleküler agirlik markörü. Oklar, söz konusu protein Sekil 9 N. benthamiana yapraklarinin sitoplazmasinda birlikte ifade edilen VP2 / 6 / 4'ün 3. gün ekstraktlarinin western blot analizini gösterir. Proteinler, tavuk anti - antikoru (1: 5000) karisimi ile problanmistir. Rekombinant Agrobakteri infiltrasyonu susturucu baskilayici ile yapilmistir. Negatif kontrol ( - ve) - bütün bitkiler sadece susturucu baskilayici ile infiltre edilmistir; M - moleküler agirlik markörü.
Sekil 10 uranil asetat ile boyanan, 3. günde sitoplazmadan ekstrakte edilen rotavirüs proteinlerinin elektron mikrograflarini gösterir, (a) susturucu baskilayici ile negatif protein numunesi ekstrakti; (b) VP6 protein ekstrakti; (c) VP2 / 6 protein ekstrakti ve nm çapindadir. (b) kismindaki ok VP6 kilif / mati gösterir. (c)'deki ok bir RLP örnegini gösterir. Tüm proteinler bir susturucu baskilayici varliginda ifade edilmistir. Hepsi fare - anti VP6 antikoru (1: 2000) ile yakalanmistir.
Sekil 11 birlikte ifade edilen VP2 / 6 ve VP2 / 6/4 (a) 'nin sükroz gradyani saflastirmasini gösterir. Sükroz gradyanin nokta blotlari VP2/6 (b) ve VP2/6/4'ü (c) saflastirmistir. Protein ekstraktlari bir sükroz gradyanina (% 10 - 60) yüklenmis ve ultra - santrifüj edilmistir. Fraksiyonlar, (b) fare anti - VP6 antikoru (1: 5000) ve (c) tavuk anti - VP2 ve VP4 serumu (1: 5000) ile problama ile analiz edilmistir.
Sekil 12 VP2 / 6 fraksiyonlarinin (a) western blot analizini, VP2 / 6 fraksiyonlari 16 ve 17'nin (b) SDS - PAGE coomassie boyali jel fotografini ve fraksiyon 16 ve 17'nin (c) western blot analizini gösterir. Western blotta (a) ve sadece fare anti - VP6 (1: 5000) ve fare anti - VP2 serumu (1: 5000) ve (c)'de sadece tavuk anti - VP2 serumu (1: 5000) kullanilmistir. (a) ve (c)'de negatif kontrol ( - ve) - bakteride ifade edilen VP4 ve (b) - susturucu baskilayici ile infiltre edilen bitkiler ve saflastirilan sükroz gradyan; ham saflastirilmamis VP2 / 6 ekstrakti; (a)'da pozitif kontrol (+ ve) - bakteride ifade edilen VP2, (b) ve (c) - bitkide ifade edilen VP6; VP6 - SF9 - SF9 böcek hücrelerinde ifade edilen bilinen konsantrasyonda VP6 proteini. Oklar ilgi konusu protein gruplarini belirtir.
Sekil 13 sükroz yogunluk gradyaniyla saflastirilmis VP2 / 6 fraksiyonlari üzerinde toplam çözülebilir protein analizini gösterir. (a) - lgG standart egrisi, (b) - 750 nm'de alinan fraksiyonlarin absorbans Okumalari. Ilgili noktalar: fraksiyonlar 16 ila 19.
Sekil 14 Sitoplazmayla birlikte ifade edilen VP2 / 6/4 fraksiyonlarinin sükroz yogunluk gradyani analizini gösterir. 750nm'de ham absorbans ölçümleri, daha önce VP2/6/4'nin nokta bloti üzerinde tespit edilen protein piklerini dogrulamak için alinmistir.
Sekil 15 Sükroz yogunluk gradyani ile saflastirilmis VP2 / 6 partiküllerinin transmisyon elektron mikrograflarini gösterir. Hem (a) hem de (b) bakir izgarada görülen iki farkli bölümü göstermektedir. Saptanan tüm RLP'ler 70 - 100 nm çapindadir. Numuneler fare - anti VP6 antikoru (1: 2000) ile yakalanmistir. Çubuklar 200 nm'yi temsil eder.
Sekil ve rotavirüs VP2'nin (SEQ ID NO: 13 ve 14) nükleotid dizilerini gösterir. Sekil 16b , amino asit dizisini (SEQ ID NO: 2) ve rotavir'us VP4'ün nükleotid dizilerini (SEO lD NO: 15 ve 16) gösterir. 15 ve 16). Sekil ve nükleotit dizilerini Sekil 17A primer IF - WA_VP2 (opt). 51 + 3c'nin (SEK ID NO: 21) nükleotit dizisini n'L'ikIeotit dizisini gösterir. 22). Sekil 17C Yapi 1191'in sematik bir temsilini göstermektedir. Plazmid dogrusallastirma için kullanilan Sacll ve Stul kisitlama enzim bölgeleri, gösterim 'üzerinde açiklanmistir.
Sekil 18 soldan saga t - DNA sinirlarinda (alti çizili) yapi 1191'in nükleotit dizisini (SEK ID NO: 23) gösterir. 23) 1191 nolu yapi, soldan saga t - DNA sinirlarina (alti çizili) gelmektedir. Plastosiyanin - P19 - Plastosiyanin susturuou inhibitör ifade kaseti ile 2X358 / CPMV - HT/ NOS.
Sekil 19 Rotavirüs A WA susundan VP2 (opt) kodlayan nükleotit dizisini gösterir (SEK ID NO: 45).
Sekil 20 Rotavirüs A WA susundan VP2'nin amino asit dizisini (DIZI ID NO: 25) gösterir. 25).
Sekil 21 yapi numarasi 1710'un sematik bir gösterimini verir.
Sekil 22A yapi 193'ün sematik bir temsilini gösterir. Plazmid dogrusallastirma için kullanilan Sacll ve Stul kisitlama enzim bölgeleri, gösterim 'üzerinde açiklanmistir.
Sekil 22B yapi . Yapi 193, soldan saga t - DNA sinirlarindan (alti çizili) gösterilir. 2X358 / CPMV - HT / NOS, Plastosiyanin - P19 - Plastosiyanin susturma inhibitör ifade kaseti ile BeYDV (m) + Replikaz amplifikasyon sistemine dönüstürülür.
Sekil 23 ifade kaseti . ifade kaset numarasi 1710, 2X35S promotöründen NOS sonlandiriciya kadar gösterilir.
Rotavirüs A WA susundan VP2'nin (opt) alti çizilmistir.
Sekil 24 yapi numarasi 1711'In sematik bir gösterimini verir.
Sekil 25A primer IF - WA_VP6 (opt). 51 + 3c'nin (SEK ID NO: 28) nükleotit dizisini gösterir. Sekil 25B primer IF - WA_VP6 (opt). s1 - 4r'nin (SEK ID NO: 29) nükleotit dizisini gösterir. 29. Sekil 25c 2X358 promotöründen NOS sonlandiriciya (SEK lD NO: 30) kadar ifade kaseti numara 1713'ü gösterir. 30). Rotavirüs A WA susundan VP6'nin (opt) alti çizilmistir. Sekil 25d, Rotavirüs A WA susundan (SEK ID NO: 46) VP6'yi (opt) kodlayan n'ükleotit dizisini gösterir. 46).
Sekil 26 Rotavirüs A WA susundan VP6'nin amino asit dizisini (SEK ID NO: 31) gösterir. 31).
Sekil 27 yapi numarasi 1713"Un sematik temsilini gösterir.
Sekil kadar olan ifade kaset numarasi 1714"L`in nükleotit dizisini gösterir. Rotavirüs A WA susundan VP6'nin (opt) alti çizilmistir.
Sekil 29 yapi numarasi 1714'ün sematik bir gösterimini verir.
Sekil 30A IF - Rtx_VP4 (opt). 31 +30 primerinin nükleotit dizisini gösterir (SEK ID NO: 33). Sekil 3OB, primer If - Rtx_VP4 (opt). s1 - 4r'nin nükleotit dizisini gösterir (SEK ID NO: 34).
Sekil 31A kadar olan ifade kaset numarasi 1731'in nükleotit dizisini gösterir. 35). Rotavir'üs A Rotarix susundan VP4'ün (opt) alti çizilmistir. Sekil 31B RVA / Asi / USA / Rotarix - A gelen Rotavirüs A VP4"L'in optimize edilmis kodlama dizisini göstermektedir. 47Sekil 31C 2X358 promotöründen NOS sonlandiriciya (SEK ID NO: 44) kadar olan ifade kaset numarasi 1730'un nükleotit dizisini gösterir. . Rotavir'üs A Rotarix susundan VP4"ün (opt) alti çizilmistir.
Sekil 32 Rotavir'üs A Rotarix susundan gelen VP4'ün amino asit dizisini gösterir (SEK Sekil 33A yapi numarasi 1730'un sematik bir gösterimini verir. Sekil 33B, yapi numarasi 1731'in sematik bir temsilini göstermektedir.
Sekil 34A primer lF - Rtx_VP7 (opt). s1 +3C'nin nükleotit dizisini gösterir (SEK lD NO: 37). Sekil 34B, primer If - Rtx_VP4 (opt). s1 - 4r'nin nükleotit dizisini gösterir (SEK ID NO: 38). Sekil 34C 2X35S promotör'ünden NOS sonlandiriciya dek ifade kaset numarasi 1733"ün nükleotit dizisini gösterir. Rotaviri'is A asisi USA / Rotarix - susundan gelen VP7'yi kodlayan nükleotit dizisini gösterir (SEK ID NO: 48). Sekil 34E RVA / Asi/ USA / Rotarix - A41CBOSZA / 1988 / G1P1A [8] susundan (SEK ID NO: 54) gelen Rotavirüs A VP7'nin optimize edilmis kodlama dizisini gösterir.
(SEK ID NO: 39) gelen VP7'nin amino asit dizisini göstermektedir. 39).
Sekil 36 yapi numarasi 1733'ün sematik bir gösterimini verir.
Sekil 37 primer IF - Rtx_VP7 (opt). 52 +4C'nin nükleotit dizisini gösterir (SEK lD NO: Sekil 38 yapi 1192'i'Jn sematik bir temsilini gösterir. Plazmid dogrusallastirma için kullanilan Sacll ve Stul kisitlama enzim bölgeleri, gösterim 'üzerinde açiklanmistir.
Sekil 39 soldan saga t - DNA sinirlarinda (alti çizili) yapi 1192'nin nükleotit dizisini gösterir (SEK ID NO: 41). 41). Plastosiyanin - P19 - Plastosiyanin susturucu inhibitör ifade kaseti ile 2X3SS/CPMV - HT/PDlSP/NOS gösterilmistir.
Sekil 40A kadar olan ifade kaset numarasi 1735'in nükleotit dizisini gösterir. 42). Rotavirüs A asisi USA / Rotarix - A alti (SEK ID NO: 43) gelen PDISP /VP7'nin amino asit dizisini gösterir. 43).
Sekil 42 yapi numarasi 1735'in sematik bir gösterimini verir.
Rotavirüs A VP4 kodlama dizisini gösterir (SEK ID NO: 50). Sekil 433 , RVA / Simian optimize edilmis kodlama dizisini gösterir (DIZI ID NO: 51). Sekil 43C RVA/Simian - dizisini gösterir (SEK ID NO: 52). Sekil 43D RVA / Simian - tc / ZAF / SA11 - H96 / 1958 / G3PSB [2] susundan gelen Rotavirüs A VP7'nin optimize edilmis kodlama dizisini gösterir (SEK ID NO: 53).
Sekil 44A primer lF - Rtx_VP7 (opt). s1 +3C'nin nükleotit dizisini gösterir (SEK lD NO: 55). Sekil 44B, primer If - Rtx_VP4 (opt). s1 - 4r'nin nükleotit dizisini gösterir (SEK ID susundan gelen Rotavirüs A VP7'nin optimize edilmis kodlama dizisinin nükleotit dizisini gösterir (SEQ ID NO: 57). Sekil 44D2X358 promotöründen NOS sonlandiriciya (SEK ID NO: 58) kadar olan ifade kaset numarasi 1734'ün nükleotit susundan gelen VP7'nin alti çizilmistir. Sekil 44EROtavirüs A asisi USA / Rotarix - A41CBOSZA / gelen TrSp - VP7'nin amino asit dizisini göstermektedir. 59). Sekil 44Fyapi numarasi 1714'ün sematik temsilini gösterir.
Sekil 45 VP2 ve VPö'yi içeren rotavirüs benzeri partiküllerin, iyodiksanol yogunluk gradyani santrifüjüyle saflastirilmasini gösterir. Sekil 45A santrifüjlemeden önce yükün ve fraksiyonlar 1 ila 10'un (fraksiyon 1 tüpün en altindaki fraksiyondur) Coomassie boyali SDS - PAGE analizi. Rotavirüs antijenlerinin pozisyonlari oklarla gösterilmektedir. Sekil 453 Bir tavsan poliklonal anti - rotavirüs antikoru kullanilarak (A) 'daki ayni fraksiyonlarin Western blot analizi. Sekil 450 Bir tavsan poliklonal anti - VP2 antikoru kullanilarak (A) 'daki ayni fraksiyonlarin Western blot analizi.
Sekil 46 VP2, VPG ve VP7'yi içeren rotavirüs benzeri partiküllerin, iyodiksanol yogunluk gradyani santrifüjüyle saflastirilmasini gösterir. Sekil 46A santrifüjlemeden önce yükün ve fraksiyonlar 1 ila 10'un (fraksiyon 1 tüpün en altindaki fraksiyondur) Coomassie boyali SDS - PAGE analizi. Rotavirüs antijenlerinin pozisyonlari oklarla gösterilmektedir. Sekil 468 Bir tavsan poliklonal anti - rotavirüs antikoru kullanilarak (A) 'daki ayni fraksiyonlarin Western blot analizi. Sekil 460 Bir tavsan poliklonal anti - VP7 antikoru kullanilarak (A) 'daki ayni fraksiyonlarin Western blot analizi.
Sekil 47 VP2i VP4 ve VP7'yi içeren rotavirüs benzeri partiküllerin, iyodiksanol yogunluk gradyani santrifüjüyle saflastirilmasini gösterir. Sekil 47A santrifüjlemeden önce yükün ve fraksiyonlar 1 ila 10'un (fraksiyon 1 tüpün en altindaki fraksiyondur) Coomassie boyali SDS - PAGE analizi. Rotavirüs antijenlerinin pozisyonlari oklarla gösterilmektedir. Sekil 478 Bir tavsan poliklonal anti - rotavirüs antikoru kullanilarak (A) 'daki ayni fraksiyonlarin Western blot analizi. Sekil 47C Bir tavsan poliklonal anti - VP7 antikoru kullanilarak (A) 'daki ayni fraksiyonlarin Western blot analizi.
Sekil 48 VP2, VP4, VP6 ve VP7'yi içeren saflastirilmis rotavirüs benzeri partiküllerdeki VP4 içeriginin, anti - VP4'e özgü ELlSA ile degerlendirilmesini gösterir.
Sekil 49 VP2 ve VP6 (sol panel) ve VP2, VP4, VP6 ve VP7'yi (sag panel) içeren aritilmis rotavirüs benzeri partiküllerin cryo - elektron mikroskobu görüntüsünü gösterir.
Detayli Açiklama Asagidaki açiklama, tercih edilen bir düzenlemedir.
Mevcut bulus bir veya daha fazla rotavirüs yapisal proteini (yani bir rotavirüs benzeri partikül, rotavirüs VLP veya RLP) içeren virüs benzeri partiküllerle (VLP'ler) ve bitkilerde rotavirüs benzeri partikülleri (RLP'Ier) üretme yöntemleri ile ilgilidir.
Rotavirüs benzeri partikül (RIP), bu nedenle bir veya daha fazla rotavirüs yapisal proteinini içerebilir. RLP çift katmanli veya üçlü katmanli olabilir.
Mevcut bulus kismen lstem 1'e göre bir bitkide rotavirüs benzeri bir parçacigin (RIP) üretilmesi için bir yöntem saglar. Yöntem VP2, VP6 ve VP7'den seçilen birinci bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan birinci bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli bitki içinde aktif bir birinci düzenleyici bölgeyi içeren birinci bir nükleik asit, VP2. VP6 ve VP7'den seçilen ikinci bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan ikinci bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli bitki içinde aktif bir ikinci düzenleyici bölgeyi içeren ikinci bir nükleik asit ve VP2, VP6 ve VP7'den seçilen üçüncü bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan üçüncü bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli bitki içinde aktif bir üçüncü düzenleyici bölgeyi içeren üçüncü bir nükleik asidin bitkiye, bitkinin bir bölümüne veya bir bitki hücresine sokulmasini içerir, burada VP7'yi kodlayan birinci, ikinci ve üçüncü nükleotit dizisi kesik bir dogal sinyal peptidini veya bir bitki polipeptidinden gelen dogal olmayan bir sinyal peptidini içerir ve burada RLP VP2, VP6 ve VP7'yi içerir, veya bir bitkiye, bir bitki bölümüne veya bitki hücresine birinci bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan birinci bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli bitki içinde aktif bir birinci düzenleyici bölgeyi içeren birinci bir nükleik asit, ikinci bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan ikinci bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli bitki içinde aktif bir ikinci düzenleyici bölgeyi içeren ikinci bir nükleik asit ve üçüncü bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan üçüncü bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli bitki içinde aktif bir üçüncü düzenleyici bölgeyi içeren üçüncü bir nükleik asidi içeren bir bitki, bir bitki bölümü veya bitki hücresinin saglanmasini içerir, burada birinci rotavirüs yapisal proteini VP2, ikinci rotavirüs yapisal proteini VPS ve üçüncü rotavirüs yapisal proteini VP7'dir, burada VP? bir bitki polipeptidinden gelen kesik bir dogal bir sinyal peptidini veya dogal olmayan bir sinyal peptidini içerir; bitki, bir bitki bölümü veya bitki hücresinin birinci, ikinci ve üçüncü nükleik asidin geçici ifadesine izi veren kosullar altinda inkübe edilmesini, böylece RLP'nin üretilmesini, bitkinin, bitkinin bir bölümünün veya bitki hücresinin hasat edilmesini kalsiyumun varliginda, burada kalsiyum konsantrasyonu 1 mM ila 1000 mM arasindadir, bitki, bitki bölümü veya bitki hücresinden gelen RLP'Ierin ekstrakte edilmesi ve saflastirilmasi. rotavirüs susunda veya izolatinda bulunan, rotavirüsten izole edilen bir rotavirüs yapisal protein dizisinin tamamini veya bir kismini ifade edebilir. Böylece, rotavirüs yapisal protein terimi ve benzeri terimler virüsün yasam döngüsü sirasinda mutasyonla üretilen veya seçici basinca (örnegin, ilaç tedavisi, konak hücre yönelimi veya infektivite, vb) tepki olarak üretilen dogal olarak ortaya çikan rotavirüs yapisal protein dizisini içerir. Teknikte uzman kisilerce takdir edilecegi gibi, bu tür rotavir'us yapisal protein dizileri ve bunlarin varyantlari, rekombinant teknikler kullanilarak üretilebilir.
Dahasi, yapisal proteinler, örnegin VP2 ve VP6 gibi kapsid proteinlerini ve / veya örnegin VP4 gibi yüzey proteinlerini içerebilir. Yapisal protein ayrica örnegin VP7'yi içerebilir.
Rotavir'üs yapisal proteinin sinirlayici olmayan örnekleri rotavirüs protein VP2, VP4, VP6 ve VP7 ve VP2, ve VP4, VP6 VP7'nin bir fragmentini içerir. Mevcut bulusa göre kullanilabilen VP2, VP4, VP6 ve VP7'nin veya VP2, VP4, VP6 ve VP7 protein fragmentlerinin sinirlayici olmayan örnekleri arasinda, rotavir'us G9 P [6] susu, Sinirlayici olarak kabul edilmemesi gereken bir VP2 yapisal proteininin bir örnegi, SEK ID NO: 1 ve SEK ID NO: 25'in amino asit dizisinde belirtilmistir. 1 ve DIZI ID NO: 'dir. Ayrica, VP2 yapisal proteini SEK ID NO: 1, SEK ID NO: 25'de belirtilen diziyi veya bununla en az yaklasik % 90 - % 100 benzerlige sahip bir diziyi, örnegin % 91, benzerlik yüzdesiyle ihtiva edecek sekilde içerir. Ek olarak, bir VP2 yapisal proteini SEK ID NO: 13, 14, 25 ya da 45'de ortaya konan bir n'ukleotit dizisi ile ya da bununla en az yaklasik % 80 - 100 arasinda dizi benzerligi gösteren bir dizi ile, örnegin % 81, bu aralik içerisindeki herhangi bir benzerlik yüzdesiyle kodlanabilir.
Sinirlayici olarak kabul edilmemesi gereken bir VP4 yapisal proteininin bir örnegi, SEK ID NO: 2 ve SEK ID NO: 36'nin amino asit dizisinde belirtilmistir. 2 ve DlZl ID NO: 36. Ayrica, VP2 yapisal proteini SEK ID NO: 2, SEK ID NO: 36'de belirtilen diziyi veya2, DlZl lD NO: bununla en az yaklasik % 90 - % 100 benzerlige sahip bir diziyi, herhangi bir benzerlik yüzdesiyle ihtiva edecek sekilde içerir. Ek olarak, bir VP4 ile ya da bununla en az yaklasik % 80 - 100 arasinda dizi benzerligi gösteren bir dizi dizi benzerligi gibi bu aralik içerisindeki herhangi bir benzerlik yüzdesiyle kodlanabilir.
Sinirlayici olarak kabul edilmemesi gereken bir VP6 yapisal proteininin bir örnegi, SEK lD NO: 3 ve SEK ID NO: 31'in amino asit dizisinde belirtilmistir. 3 ve DIZI lD NO: 31. Ayrica, VP6 yapisal proteini SEK ID NO: 3, SEK lD NO: 31'de belirtilen diziyi veya3, DIZI lD NO: bununla en az yaklasik % 90 - % 100 benzerlige sahip bir diziyi, herhangi bir benzerlik yüzdesiyle ihtiva edecek sekilde içerir. Ek olarak, bir VP6 yapisal proteini SEK ID NO: 17, 18 ya da 46'da ortaya konan bir n'ukleotit dizisi ile ya da bununla en az yaklasik % 80 - 100 arasinda dizi benzerligi gösteren bir dizi ile, benzerligi gibi bu aralik içerisindeki herhangi bir benzerlik yüzdesiyle kodlanabilir.
Sinirlayici olarak kabul edilmemesi gereken bir VP7 yapisal proteininin bir örnegi, SEK lD NO: 4, SEK lD NO: 39, SEK lD NO: 43 ve SEK ID NO: 47'nin amino asit dizisinde belirtilmistir. 4, DIZI lD NO: 39, SEK lD NO: 43 ve DlZI lD NO: 47Ayrica, VP7 yapisal proteini SEK ID NO: 4, SEK ID NO: 39 ve SEK ID NO: 43'de belirtilen diziyi veya4, DIZI ID NO: 39 ve SEK ID NO: bununla en az yaklasik % 90 - % 100 gibi bu aralik içerisindeki herhangi bir benzerlik yüzdesiyle ihtiva edecek sekilde 54'da ortaya konan bir nükleotit dizisi ile ya da bununla en az yaklasik % 80 - 100 herhangi bir benzerlik yüzdesiyle kodlanabilir.
Amino asit dizisi benzerligi veya kimligi, BLAST (temel yerel hizalama arama araci) 2. 0 algoritmasini kullanan BLASTP ve TBLASTN programlarini kullanarak hesaplanabilir. Amino asit dizisi benzerligi veya kimligi hesaplama teknikleri teknikte uzman kisilerce iyi bilinmektedir ve BLAST algoritmasinin kullanimi ALTSCHUL ve kendiliginden bir araya gelen ve örnegin rotavir'us yapisal proteini gibi bir veya daha fazla yapisal proteini, örnegin bunlarla sinirli olmamakla birlikte VP2, VP4, VP6 ve / veya VP7 yapisal proteinini ifade eder. Rotavirüs yapisal proteinini içeren VLP'ler RLP'ler genellikle bir enfeksiyonda üretilen virionlara morfolojik ve antijenik olarak benzerdir, ancak çogaltilmaya yetecek kadar genetik bilgiye sahip degildir ve dolayisiyla bulasici degildir. VLP'ler bitki konak hücreleri de dahil olmak üzere uygun konak hücrelerde üretilebilir. Konak hücreden ekstrakte edildikten sonra ve uygun kosullar altinda izolasyon ve daha fazla saflastirma üzerine, VLP'ler bozulmamis yapilar halinde saflastirilabilir. RLP, tek, çift veya üç katmanli bir RLP olabilir. Tek katmanli RLP'ler VP2 veya VP6 gibi bir rotavirüs yapisal proteininin ifade edilmesi yoluyla elde edilebilir. Çift katmanli RLP'ler, örnegin VP4 ile veya VP4 olmadan, VP2 ve VP6'yi birlikte ifade ederek, iki rotavirüs yapisal proteininin ifade edilmesiyle elde edilebilir. Uç katmanli RLP'ler, en azindan üç rotavirüs yapisal proteininin es zamanli ifadesiyle, örnegin VP4'Iü ya da VP4'süz VP2, VPS ve VP7'nin birlikte sentezlenmesiyle elde edilebilir. VP4'ün birlikte ifadesi, dogal rotavirüsü andiran sivri uçlara sahip bir parçaciga neden olur. VP4; VP5 ve VP8 üretmek üzere islenebilir veya bölünebilir. Bu islem konak içerisinde endojen proteazlari kullanarak veya tripsin, tripsin benzeri bir proteaz, bir serin proteaz, bir kimotripsin benzeri proteaz, subtilisin gibi uygun bir proteazin birlikte ifade edilmesi yoluyla gerçeklesebilir.
Alternatif olarak, VP4, RLP ekstraksiyon prosedürünün herhangi bir asamasinda veya RLP saflastirmasindan sonra tripsin, tripsin benzeri bir proteaz, bir serin proteaz, bir kimotripsin benzeri proteaz, subtilisin gibi uygun bir proteaz eklenerek VP5 ve VP8 üretmek üzere islenebilir.
Rotavirüs yapisal proteinlerinin her biri farkli özelliklere ve boyutlara sahiptir ve RLP'ye eklenmesi için farkli miktarlarda gereklidir. "Rotavirüs VLP", "rotavirüs virüsü benzeri partikül (RVLP)", "rotavirüs virüs benzeri partikül (RLP)", "rotavirüs virüs benzeri partikül", "RVLP" veya "RLP" terimi, bir veya daha fazla rotavirüs yapisal proteinleri içeren virüs benzeri bir parçacigi (VLP) ifade eder. Rotavirüs yapisal protein örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, VP2, VP4 (veya VP5 ve VP8) VP6 ve VP? yapisal proteini içerebilir.
Bulusa göre olan bir bitkide RLP'leri üretme yönteminde, bir birinci rotavirüs yapisal proteinini, örnegin bir VP2 veya VP6 proteinini kodlayan bir birinci nükleik asit (birinci bir nükleik asit), bir ikinci rotavirüs yapisal proteinini, örnegin bir VP6 veya VP2 proteinini kodlayan ikinci bir nükleik asit ile birlikte ifade edilir. Bundan baska, bir üçüncü rotavirüs yapisal proteinini, örnegin VP7'yi kodlayan üçüncü bir nükleik asit birinci ve ikinci nükleik asit ile birlikte ifade edilir, böylece birinci, ikinci nükleik asitler ve üçüncü nükleik asitler bitkide birlikte ifade edilmektedir. Birinci nükleik asit, ikinci nükleik asit ve üçüncü nükleik asit, ayni asamada bitki içine sokulabilir veya sirayla bitkiye sokulabilir.
Bundan baska, bir birinci rotavirüs yapisal proteinini kodlayan bir birinci nükleik asidi, bir ikinci rotavirüs yapisal proteinini kodlayan bir ikinci nükleik asit ve bir üçüncü rotavirüs yapisal proteinini kodlayan bir üçüncü nükleik asidi ifade eden bir bitki, ayrica bir dördüncü rotavirüs yapisal proteini, örnegin bir VP? veya VP4 proteinini kodlayan bir dördüncü nükleik asit ile dönüstürülebilir, böylece birinci, ikinci nükleik asitler, üçüncü ve dördüncü nükleik asitler bitkide birlikte ifade edilir. VP4, uygun bir proteazi, örnegin tripsin, tripsin benzeri bir proteaz, bir serin proteaz, bir kimotripsin benzeri proteaz, subtilisini kodlayan bir nükleik asidin birlikte ifade edilmesi yoluyla konak içinde VP5 ve VP8 üretmek üzere islenebilir veya bölünebilir. Alternatif olarak, VP4, RLP ekstraksiyonunun herhangi bir asamasinda veya RLP saflastirmasindan sonra uygun bir proteaz, örnegin tripsin, tripsin benzeri bir proteaz, bir serin proteaz, bir kimotripsin benzeri proteaz, subtilisin eklenerek islenebilir.
Asagida daha ayrintili olarak tarif edildigi gibi, RLP'ler, bir bitkide, VP2, VP6 veya VP7'den seçilen bir veya daha fazla rotavirüs yapisal proteinini kodlayan bir nükleik asidin (bir birinci nükleik asit) ifade edilmesiyle üretilebilir. VP?, VP6 veya VP2'den seçilen ikinci bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan ikinci bir nükleik asit bitkide birlikte ifade edilir. Bundan baska, VP6, VP7 ya da VP2'den seçilen bir üçüncü rotavirüs yapisal proteinini kodlayan üçüncü bir nükleik asit, bitkide birlikte ifade edilmektedir. Birinci nükleik asit, ikinci nükleik asit ve üçüncü nükleik asit, ayni asamada bitki içine sokulabilir veya sirayla bitkiye sokulabilir. Nükleik asit, ikinci nükleik asit ve üçüncü nükleik asit, bitkiye geçici bir sekilde veya stabil bir sekilde sokulabilir.
Ayrica, bir birinci rotavirüs yapisal proteinini, örnegin bir VP2 proteinini kodlayan bir birinci nükleik asidi ifade eden bir bitki, bunlarla sinirli olmamak üzere VP6 veya VP7 gibi bir ikinci rotavirüs yapisal proteinini kodlayan bir ikinci nükleik asit ile dönüstürülür, böylece hem birinci ve ikinci nükleik asitler bitkide birlikte ifade edilir.
Bitki ayrica bir üçüncü rotavirüs yapisal proteinini kodlayan bir üçüncü nükleik asit ile, örnegin bunlarla sinirli olmamak üzere VP7 veya VP6 ile dönüstürülür.
Alternatif olarak, bir VP6 veya VP7 proteini (ikinci nükleik asit) ifade eden bir bitki VP2 proteini kodlayan birinci nükleik asit ile dönüstürülür, böylece hem birinci hem de ikinci nükleik asitler bitkide birlikte ifade edilir. Bitki ayrica bir üçüncü rotavirüs yapisal proteinini kodlayan bir üçüncü nükleik asit ile, örnegin bunlarla sinirli olmamak üzere llaveten, bir VP2 ve VP6 proteini gibi bir birinci ve ikinci rotavirüs yapisal proteinini kodlayan bir birinci ve ikinci nükleik asidi ifade eden bir bitki, bir üçüncü rotavirüs yapisal proteinini, örnegin VPT'yi kodlayan bir üçüncü nükleik asit ile dönüstürülür.
Bir bitkide RLP'leri üretme yöntemi, bitki içinde aktif bir düzenleyici bölgeye islevsel olarak bagli söz konusu üç veya daha fazla sayida rotavirüs yapisal proteini kodlayan üç veya daha fazla nükleik asidin ve bir veya daha fazla bölme hedefleme dizisi ve / veya bir amplifikasyon ögesinin, bitki içine, bitkinin bir bölümüne veya bitki hücresine sokulmasini içerir. Bitki, bitkinin bir bölümü veya bitki hücresi daha sonra bir veya daha fazla nükleik asidin ifadesine izin veren, böylece RLP'leri üreten kosullar altinda inkübe edilir. Bir veya daha fazla rotavirüs yapisal proteini VP2, VP4 (veya VP5 ve VP8), VP6, VP7, VP4 (veya VP5 ve VP8), VP6, VP7 veya bunlarin bir kombinasyonunun bir fragmenti olabilir.
Mevcut açiklama, ayrica, bunlarla sinirli olmamak üzere VP2, VP4 (veya VP5 ve VP8), VP6, VP7 veya bunlarin bir kombinasyonu gibi üç veya daha fazla rotavirüs yapisal proteininden olusan bir RLP saglar. RLP, bu bulusun sagladigi yöntemlerin biri veya daha fazlasiyla üretilebilir.
RLP'lerin olusumu, örnegin yogunluk gradyani santrifüjü veya boyut dislama kromatografisi gibi uygun herhangi bir yöntem kullanilarak tespit edilebilir. RLP'ler yapi ve boyut için, örnegin elektron mikroskopisi ya da boyut uzaklastirma kromatografisi ile degerlendirilebilir.
Boyut dislama kromatografisi için, toplam çözünebilir proteinler, ekstraksiyon tamponu içinde dondurulmus ezilmis bitki materyalinin homojenlestirilmesi (Polytron) yoluyla bitki dokusundan ekstrakte edilebilir ve çözünmeyen malzeme, santrifüjleme ile uzaklastirilir. Buz gibi soguk aseton veya PEG ile çöktürme de yararli olabilir. Çözünür protein miktari belirlenir ve ekstrakt bir Sephacryl TM kolonundan, örnegin bir Sephacryl TM 8500 kolonundan geçirilir. Blue Dextran 2000 kalibrasyon standardi olarak kullanilabilir. Kromatografiden sonra fraksiyonlar, fraksiyonun protein komplemanini belirlemek için imünoblot ile ayrica analiz edilebilir.
Ayrilan fraksiyon, örnegin bir üst faz (santrifüjlenmis, sedimentasyon uygulanmis veya çökeltilmisse) veya bir süzüntü (eger filtrelenirse) olabilir ve proteinler için veya örnegin, nanotüpler, nanokürecikler veya daha üst düzey, yüksek molekül agirlikli suprayapilar için, tek katmanli (sl), çift katmanli (dI) veya üç katmanli (tl) RLP'ler gibi partiküller için zenginlestirilir.
Ayrilan fraksiyon, ayrica, örnegin ilave santrifüjleme adimlari, çökeltme, kromatografik basamaklar (ör. boyut dislama, iyon degisimi, afinite kromatografisi), tegetsel akis filtrasyonu veya bunlarin bir kombinasyonu ile proteinler, suprayapi proteinleri veya daha yüksek dereceli partiküllerin izole edilmesi, saflastirilmasi, konsantre hale getirilmesi veya bunlarin bir kombinasyonu için islenebilir.
Saflastirilmis proteinlerin, suprayapi proteinlerinin veya RLP'ler gibi daha yüksek dereceli partiküllerin varligi, alaninda uzman kimselerin bildigi üzere, örnegin dogal veya SDS - PAGE ile, uygun bir saptama antikoru, kapiler elektroforez, elektron mikroskobu veya bir baska yöntem kullanilarak western analiziyle teyit edilebilir.
Bu bulusa göre üretilen RLP'ler, alaninda uzman kimselerin bildigi yöntemler kullanilarak bir bitkiden, bir bitki bölümünden veya bir bitki maddesinden saflastirilir, kismen saflastirilirlar veya oral bir asi olarak uygulanabilirler.
RLP saflastirmasi gradyan santrifüjleme içerebilir, örnegin sükroz, iyodiksanol, OptiPrep TM veya sezyum klorür (CsCI) yogunluk gradyanlari, dönüstürülmüs bitki biyokütlesinden RLP'leri saflastirmak veya kismen saflastirmak için kullanilabilir.
Ornegin Sekil 45'te gösterildigi gibi, bir iyodiksanol asamali gradyan veya iyodiksanol sürekli gradyani, RLP'yi ve / veya ifade edilen rotavirüs yapisal proteinlerini saflastirmak için kullanilabilir.
Kalsiyum (Ca2 +) konsantrasyonunun, üç katmanli parçacigin (TLP)çift katmanli parçaciga (DLP) dönüsümü için önemli oldugu gösterilmistir ve bu gerilime baglidir (bkz. Martin ve digerleri Journal of Virology, Ocak 2002). Dis kapsid proteinlerinin TLP'lerden tamamen kaybedilmesi (TLP dekapsidasyon), [Ca2 +] nanomolar araliginda gerçeklesir.
Dolayisiyla, RLP'nin saflastirilmasi ve / veya ekstraksiyonu, kalsiyum varliginda gerçeklestirilir ve gradyan santrifüjleme basamagi kalsiyum varliginda, örnegin CaCI2'nin varliginda, gerçeklestirilir. CaCI2 konsantrasyonu 1 mM ila 1000 mM mM ya da aralarindaki herhangi bir miktardir.
Bitkiler veya bitki frangmentleri minimum düzeyde islenebilir. "Minimum islem" terimi bitki maddesi, örnegin bir bitki ekstrakti, homojenat, bitki homojenatinin fraksiyonu veya benzerini elde etmek üzere kismen saflastirilan ve / veya ilgi konusu bir proteini içeren bir bitki veya bunun bir kismi anlamina gelmektedir (yani minimum islenmis).
Kismi saflastirma, bununla sinirli olmamakla birlikte bitki hücresel yapilarini bozmayi, böylece Örnegin bunlarla sinirli olmamak üzere, santrifüjleme, süzme veya bunlarin bir kombinasyonu ile ayrilabilen çözünebilen bitki bilesenlerini çözünmeyen bitki bilesenlerini içeren bir kompozisyon yaratmayi içerebilir. Bu baglamda, yaprak ya da diger dokularin hücre disi boslugunda salgilanan proteinler vakum ya da santrifüj ekstraksiyonu ile kolaylikla elde edilebilir ya da dokular hücre disi alanda proteinleri sikmak veya serbest birakmak için silindirlerle geçme ya da ögütme ya da benzerleri vasitasiyla basinç altinda ekstrakte edilebilirler. Minimal isleme, çözünebilir proteinlerin ham ekstraktlarinin hazirlanmasini da gerektirebilir, çünkü bu preparatlar ikincil bitki ürünlerinden ihmal edilebilir kontaminasyona sahip olacaktir. Ayrica, minimal isleme, yapraklardan çözünür proteinin sulu ekstraksiyonunu, ardindan uygun herhangi bir tuz ile çöktürmeyi de içerebilir. Diger yöntemler, ekstraktin dogrudan kullanimina izin vermek için büyük ölçekli maserasyon ve meyve suyu ekstraksiyonunu içerebilir. RLP'ler, mekanik veya biyokimyasal ekstraksiyon gibi uygun herhangi bir yöntem kullanilarak saflastirilabilir veya ekstrakte edilebilir.
Bir veya daha fazla rotavirüs yapisal proteini, taze bitkinin kg agirligi basina 2 g'a kadar bir miktarda sentezlenebilir. Ornegin, sentezlenen yapisal protein miktari taze agirligin kilogramina göre 1 ila 2 9 arasinda veya bunlar arasinda herhangi bir 1. 7, 1. 8, 1. 9, 2 9 veya bunlarin arasinda herhangi bir miktarda olabilir. Örnegin, yapisal protein, taze bitkinin kg agirligi basina 1. 54 g'a kadar bir miktarda sentezlenebilir.
Ayrica, RLP, taze bitkinin kg agirligi basina 1. 5 g'ye kadar bir miktarda sentezlenebilir. Ornegin, sentezlenen RLP miktari taze agirligin kilogrami basina 0. 5 ve 1. 5 9 arasinda veya bunlarin arasinda herhangi bir miktarda, örnegin agirligin Örnegin, RLP, taze bitkinin kg agirligi basina 1.1 g'a kadar bir miktarda sentezlenebilir.
Yukarida tanimlanan RLP'lerin boyutu (örnegin çap), örnegin dinamik isik saçilmasi (DLS) veya elektron mikroskop (EM) teknikleriyle ölçüldügü 'üzere, genellikle 50 ila 110 nm arasindadir veya bunlar arasindaki herhangi bir boyuttadir. Ornegin bozulmamis RLP yapisinin boyutu yaklasik 70 nm ila yaklasik 110 nm arasinda degisebilir veya bunlar arasindaki herhangi bir boyutta, örnegin 75 nm, 80 nm, 85 olabilir.
Bu bulus ayrica bir bitki, bir bitki bölümü veya bitki hücresinde bir RLP üretmek için, bir nükleik asidin dahil edilmesini içeren bir yöntem saglar; buradaki nükleik asit, bir bitkideki aktif bir düzenleyici bölgeye islevsel olarak bagli bir veya daha fazla örnegin insan kodonunun kullanimi veya bitki kodonu kullanimi için optimize edilebilir. Bundan baska, bir ya da daha çok rotavir'üs yapisal proteini, bir ya da daha çok amplifikasyon elemanina islevsel olarak baglanabilir. Ek olarak, bir veya daha fazla rotavirüs yapisal proteini, bir veya daha fazla bölme hedefleme dizisine islevsel olarak bagli olabilir. Nükleotit dizisi tarafindan kodlanan bir veya daha fazla rotavir'us yapisal proteini örnegin VP2, VP4, VP6 veya VP7 olabilir. Ayrica nükleotit dizisi tarafindan kodlanan bir veya daha fazla rotavir'us yapisal proteini örnegin A'dan G'ye kadar herhangi bir rotavirüs grubundan, ancak daha tercih edilen sekliyle rotavirüs grubu A'dan gelebilir. Bundan baska, nükleotit dizisi tarafindan kodlanan bir ya da daha çok rotavirüs yapisal proteini, G1 ila G27'ye ve P1 ila P34'e ve daha tercihan G1 ila G19'a kadar ve Pl ila P27'ye kadar G - ve P - tiplerinin herhangi bir kombinasyonunun bir genotipine sahip olan, bunlarla sinirli olmamakla birlikte G1P SA11 susunu içeren herhangi bir rotavir'L'is susundan olabilir.
Bu bulusta bahsedilen bir nükleik asit dizisi, bir diziye, eger nükleik asit dizisi bir veya daha fazla bir nükleotit dizisiyle hibritlesirse, dizinin bir tamamlayicisina veya burada açiklandigi gibi siki hibritlesme kosullari altinda nükleik asidin bir tamamlayicisina nükleotitler en az yaklasik % 70 veya % 70 ila % 100 veya bunlarin arasinda 96, 98, 100 ya da bunlarin arasinda herhangi bir miktarda belirli bir nükleotit dizisi uzunlugu ile eslestiginde, "esasen homolog", "esasen benzer", "esasen özdes" olurlar, bu durumda homolog diziler, burada tarif edilen dizi ya da kodlanmis ürünün özelliklerinin bir veya daha fazlasini sergilerler.
Ornegin mevcut bulus, bir bitkide, bir bitki, bir bitki bölümü veya bitki hücresinde bir RLP üretmek için, izole edilmis bir polinükleotidin sokulmasini içeren bir yöntem saglar; burada izole edilmis polinükleotit, en azindan bir veya daha fazla rotavirüs 53, 54. Polinükleotit, teknolojide bilinen yöntemlerin herhangi biri ile optimize edilen insan kodonu olabilir.
Ayrica, mevcut bulus, bir bitkide, bir bitki, bir bitki bölümü veya bitki hücresinde bir RLP üretmek için, nükleik asitlerin sokulmasini içeren bir yöntem saglar; burada Böyle bir dizi benzerligi veya özdesligi, DNASIS içinde saglanan gibi bir nükleotit dizisi karsilastirma programi kullanilarak belirlenebilir (örnegin, bunlarla sinirli olmamak üzere asagidaki parametreleri kullanir: GAP cezasi 5, üst diyagonallerin boyutu 5). Bununla birlikte, örnegin Smith ve Waterman`in algoritmalari (1981, Adv.
Appl. Math. 2: , Pearson & Lipman ( ve bu algoritmalarin (NIH yoluyla temin edilebilen GAP, BESTFlT, FASTA ve BLAST) bilgisayar ortaminda uygulanmasiyla veya manüel hizalama ve görsel denetimle (bkz. ör. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel ve digerleri, ed. 1995 takviyesi) ya da siki kosullar altinda Southern ya da Northern melezlestirme kullanilarak (bakiniz Maniatis ve digerleri, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) karsilastirma için dizilerin hizalanmasina iliskin diger yöntemler teknikte iyi bilinmektedir. Tercih edilen sekliyle, esasen homolog olan diziler, molekülün tanimlanmis bir uzunlugu boyunca en az yaklasik % 80 ve en çok tercih edilen sekliyle en az yaklasik % 90 dizi benzerligi sergiler.
Böyle siki hibridizasyon kosullarindan birine örnek, 65 °C'de 4 X SSC'de gece boyunca (yaklasik 16 - 20 saat arasi) hibridizasyon, bunu takiben O. 1 X SSC'de 65 °C'de bir saat, veya her biri 20 - 30 dakika boyunca olmak üzere 0. 1 X SSC'de 65 °C'de 2 yikamadir. Alternatif olarak, örnek niteligindeki siki bir hibridizasyon kosulu, hibridizasyon, ardindan 0. 1 X SSC'de 65 °C'de bir saat yikama veya her biri 20 veya °C'de 2 yikama veya 65 °C'de Church sulu fosfat tamponunda (% 7 SDS; O. 5M 0. 1 X SSC, % O. 1 SDS'de 65 °C'de 2 yikama veya essiz dizi bölgelerinin her biri için ile hibridizasyon.
Bir rotavirüs yapisal polipeptidini kodlayan bir nükleik asit bir "rotavirüs nükleik asidi", bir "rotavirüs nükleotit dizisi", bir "rotavirüs nükleik asidi" veya bir "rotavirüs nükleotit dizisi" olarak tanimlanabilir. Ornegin sinirlayici olarak düsünülmemesi gereken, bir veya daha fazla rotavirüs yapisal proteini veya rotavirüs yapisal polipeptidini içeren bir virüs benzeri partikül, bir "rotavirüs VLP", "RVLP" veya "RLP" olarak tarif edilebilir.
Birçok organizma, büyüyen bir peptit zincirinde belirli bir amino asidin yerlestirilmesi için kodlama yapmak üzere belirli kodonlarin kullanimi için bir egilim gösterir. Kodon tercihi veya kodon egilimi, organizmalar arasindaki kodori kullanimindaki farkliliklar, genetik kodun bozulmasindan kaynaklanir ve birçok organizmada iyi belgelendirilir.
Kodon egilimleri, siklikla, digerlerinin yani sira translate edilecek kodonlarin özelliklerine ve belirli transfer RNA (tRNA) moleküllerinin bulunabilirligine bagli oldugu düsünülen haberci RNA'nin (mRNA) translasyon verimi ile baglantilidir. Bir hücrede seçilen tRNA'larin baskinligi genellikle peptit sentezinde en sik kullanilan kodonlarin bir yansimasidir. Buna göre, genler, kodon optimizasyonuna dayali belirli bir organizmada optimal gen ifadesi için uyarlanabilir. Heterojen olarak ifade edilen bir proteini kodlayan nükleotit dizisinin optimize edilmesi islemi, ifade verimini artirmak için önemli bir adim olabilir. Optimizasyon gereklilikleri, konagin yabanci proteini üretme kabiliyetini artirmak için gerekli adimlari içerebilir. bir sayisini, baska bir organizmanin veya türün genlerinde kullanilan, daha sik veya en sik olabilen kodonlarla degistirerek ilgili hücrelerde arttirilmis ifade için bir nükleik asit dizisini modifiye etmek olarak tanimlanir. Çesitli türler, belirli bir amino asidin belirli kodonlari için özel egilim sergiler.
Mevcut bulus, bir bitkide, bir bitki bölümünde veya bitki hücresinde bölümünde bir RLP üretmek için sentetik polinükleotit dizilerinin dahil edilmesini içeren bir yöntem içerir; burada sentetik polinükleotit dizileri kodon optimize edilmistir, örnegin insan kodonu kullanimi veya bitki kodonu kullanimi için diziler optimize edilmistir. Kodon optimize edilmis polinükleotit dizileri daha sonra bitkilerde ifade edilebilir. Daha spesifik olarak, insan kodonu kullanimi veya bitki kodonu kullanimi için optimize edilen diziler bitkilerde ifade edilebilir. Teori ile sinirlanmak istememekle birlikte, insan kodonu için optimize edilen dizilerin, dizinin guanin - sitozin içerigini (GC içerigi) arttirdigi ve bitkilerde ifade verimi gelistirdigi düsünülmektedir.
Translasyonel olarak etkisiz protein kodlama bölgelerinin translasyonel kinetigini gelistirmek için teknikte bilinen farkli kodon optimizasyon teknikleri vardir. Bu teknikler esas olarak belirli bir konak organizma için kodon kullaniminin belirlenmesine dayanmaktadir. Belirli bir gen veya dizinin bu organizmada sentezlenmesi gerekiyorsa, bu tür genlerin ve dizilerin kodlama dizisi, daha sonra, ilgi konusu dizinin kodonlarinin konak organizmanin daha siklikla kullanilan kodonlarinin yerini alacak sekilde degistirilecektir.
Rotavirüs yapisal protein veya polipeptidi, viral bazli, DNA veya RNA ifade sistemi, örnegin bunlarla sinirli olmamak üzere bir komovirüs esasli ifade kaseti ve geminivirüs bazli amplifikasyon elemani içeren bir ifade sistemi içerisinde ifade edilebilir.
Burada tarif edilen ifade sistemi, iki parçali bir virüs veya iki parçali bir genomu olan bir virüse dayali bir ifade kasetini içerebilir. Ornegin, iki parçali virüsler Comoviridae ailesinden olabilir. Comoviridae ailesinin türleri Komovirüs, Nepovirüs, Fabavirüs, Cheravirüs ve Sadwavirüs'ü içerir. Komovirüsler, Cowpea mozaik virüsü (CPMV), Cowpea siddetli mozaik virüsü (CPSMV), Squash mozaik virüsü (SqMV), Red clover mottle virüsü (RCMV), Bean pod mottle virüsü (BPMV), Turnip ringspot virüsü (TuRSV) Broad bean true mozaik virüsü (BBtMV), Broad bean lekesi virüsü (BBSV), Radish mozaik virüsünü (RaMV) içerir. Bulusun çesitli yönleri için yararli olabilen güçlendirici elemanlar ihtiva eden komovirüs RNA - 2 dizilerinin 'Örnekleri arasinda bunlarla sinirli olmamak üzere sunlar bulunmaktadir: CPMV RNA - 2 (GenBank Erisim No. NC_, BPMV RNA - 2 (GenBank Erisim No. NC_003495), CPSMV RNA - 2 (GenBank Erisim No.
NC_, TuRSV RNA - 2 (GenBank Erisim No. NC_013219. 1). BBtMV RNA - 2 (GenBank Erisim No.
GU, RaMV (GenBank Erisim lki parçali komoviral RNA genomunun segmentleri, RNA - 1 ve RNA - 2 olarak adlandirilir. RNA - 1, replikasyona katilan proteinleri kodlarken RNA - 2, hücreden hücreye hareket için gerekli olan proteinleri ve iki kapsid proteinini kodlar. Ornegin, CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV veya BPMV de dahil olmak üzere herhangi bir uygun komovirüs tabanli kaset kullanilabilir, ifade kaseti CPMV'ye dayandirilabilir. bir hizlandiricinin veya diger düzenleyici elemanlarin kontrolü altinda olan ve bunlara islevsel olarak bagli olan bir ilgi konusu nükleik asidi içeren bir nükleotit dizisi anlamina gelir. lfade sistemleri ayni zamanda bir geminivirüsden gelen amplifikasyon elemanlari, örnegin fasulye sarisi cüce virüsünden (BeYDV) gelen bir amplifikasyon elemani içerebilir. BeYDV, dikotiledon bitkiler için uyarlanmis Mastreviruses cinsine aittir.
BeYDV, tek sarmalli bir dairesel DNA genomuna sahip monopartittir ve yuvarlanan bir daire mekanizmasi ile çok yüksek bir kopya sayisina çogalabilir. Bitkilerde hizli, yüksek verimli protein üretimi için BeYDV türevi DNA replikon vektör sistemleri kullanilmistir.
Burada kullanildigi sekliyle, "amplifikasyon elementleri" ifadesi, bir geminivirüs genomunun bir veya daha fazla uzun interjenik bölge veya uzun interjenik tekrarin (LlR) en azindan bir bölümünü içeren bir nükleik asit segmentini belirtir. Burada kullanildigi sekliyle "uzun interjenik bölge" veya "uzun interjenik tekrar", bir geminivirüs Rep proteini tarafindan eksizyon ve replikasyona aracilik edebilen bir rep baglanma sahasi içeren uzun bir interjenik bölgenin bir bölgesini belirtir. Bazi yönlerden, bir veya daha fazla LIR içeren nükleik asit segmenti ayrica bir geminivirüs genomunun kisa bir interjenik bölgesini veya küçük interjenik bölgesini (SIR) içerebilir. Burada kullanildigi sekliyle, "kisa interjenik bölge" veya "küçük interjenik bölge" komplementer iplikçigi (Mastrevirüslerin kisa IR'si (SlR)) ifade eder. Burada uygun herhangi bir geminivirüsden türetilmis amplifikasyon elemani kullanilabilir.
Biotechnology and Bioengineering, cilt106, 9 - 17). Eger yapida birden fazla LIR, örnegin iki LlR kullaniliyorsa, promotör, CMPV - HT bölgeleri ve ilgi konusu nükleik asit dizisi ve sonlandirici, iki LIR'in her biri tarafindan parantez içine alinir. Bundan baska, amplifikasyon elemani örnegin Halley - Stott ve dig. (2007) Archives of numarasi DQ458791 altinda saklanan diziden alir. LIR'Ieri içeren nükleik asit asit segmenti, 1154 ila 1212 nükleotidleridir.
Burada açiklandigi gibi, Nicotiana benthamiana yapraklarinin agroinfiltrasyonu ile fasulye sari cüce virüs (BeYDV) türevli vektörün ve bir Rep / RepA tedarik vektörünün birlikte verilmesi verimli replikon amplifikasyonu ve saglam protein üretimi Ile sonuçlanir.
Bir komovirüs temelli ifade kaseti ve bir geminivirüsden türetilmis amplifikasyon elemani ayri vektörlerde bulunabilir veya bilesen parçalari bir vektöre dahil edilebilir.
Eger iki vektör kullanilirsa, birinci ve ikinci vektörler bir bitki hücresine ayni anda veya ayri olarak verilebilir.
Söz konusu nükleik asidin ifadesini arttirmak için, burada tarif edildigi gibi ifade sistemine bir viral replikaz dahil edilebilir. Bir replikazin sinirlayici olmayan bir örnegi, BeYDV Rep ve RepA'yi (C2 / C1; Huang ve digerleri, 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, . Bir replikazin bir diger sinirlayici tarafindan açiklandigi gibi kaynagini Gen Bankasi erisim numarasi DQ458791 altinda saklanan diziden alir. C1: C2 genini içeren nükleik asit segmenti, 1310 ila 2400 nükleotidlerdir. bitkinin ayni dokusunda ayni zamanda ifade edildigi anlamina gelir. Bununla birlikte, nükleotit dizilerinin tam olarak ayni anda ifade edilmesi gerekmez. Daha ziyade, iki veya daha fazla nükleotit dizisi, kodlanmis ürünlerin etkilesime girme sansina sahip olacak sekilde ifade edilir. lki ya da ikiden fazla nükleotit dizisi, her iki dizinin de ifade edildigi kosullar altinda iki ya da daha fazla dizinin ayni anda yaklasik olarak ayni zamanda eklendigi bir geçici ifade sistemi kullanilarak birlikte ifade edilebilir.
Alternatif olarak, nükleotid dizilerinden birini içeren bir platform bitkisi, geçici bir sekilde platform bitkisine sokulan, örnegin bir veya daha fazla rotavirüs yapisal proteini gibi ilgili proteini kodlayan ek bir dizi ile istikrarli bir sekilde dönüstürülebilir.
Proteinin dogru katlanmasi proteinin stabilitesi, multimer olusumu, RLP'lerin olusumu ve fonksiyon için önemli olabilir. Bir proteinin katlanmasi, protein dizisi, proteinin nispi bollugu, hücre içi kalabalik derecesi, katlanmis, kismen katlanmis veya açilmis proteine baglanabilen veya bununla geçici olarak iliskilendirilebilen kofaktörlerin varligi da dahil olmak üzere ancak bunlarla sinirli olmayan bir veya daha fazla faktörden etkilenebilir. Ayrica, proteinin ifade edildigi bitki içindeki bölme veya alt bölme, proteinin ifade seviyelerini ve katlanmasini etkileyebilir.
Bir veya daha fazla rotavirüs yapisal proteininin ifadesi, transgenik bitkilerde agroinfiltrasyon yoluyla spesifik bitki hücre bölmesi ve / veya alt bölmelere hedeflenebilir. Bölme veya alt bölmeler, örnegin plastidler, endoplazmik retikül (ER), kloroplast veya apoplast olabilir. Teori ile sinirlanmak istememekle birlikte, bölme veya alt bölme hedeflemesi sitoplazmik birikim üzerine hedef bölmeye veya alt bölmelere protein birikiminde artis saglayabilir. Bölme veya alt bölme birikimi proteini, sitoplazmada bulunan proteazlar tarafindan bozunmaya karsi koruyabilir ve / veya bitki hücresinin islevini etkilemeden daha yüksek konsantrasyonda birikmesine izin verebilir.
Dolayisiyla, ifade kaseti veya vektörü, vektörden ifade edilen vektörü veya rotavirüs yapisal proteinini veya polipeptidi, bitkide arzu edilen bölmeye veya alt bölmeye yönlendirmek üzere uyarlanabilir.
Ornegin, ifade kaseti veya vektörü, ifade edilen bir rotavirüs yapisal proteinin veya polipeptidin, plastidlerin tilakoid membranlari ile, özellikle de tilakoid membranlarin aktarim mekanizmasi ile etkilesime girebilen bir bölümü içermelerini saglayacak sekilde plastidleri hedeflemesi için adapte edilebilir. Bu etkilesim, rotavirüs yapisal proteininin veya polipeptidin ifade edildigi sitoplazmadan plastid içerisine sokulmasina neden olabilir. Teori ile sinirlanmak istememekle birlikte, sitoplazmadan çikarma mekanizmasi, proteinlerin düzgün bir sekilde katlanmasi için önemli olabilir.
Takdir edilecektir ki, ifade kaseti veya vektörü kendiliginden plastitlerin dönüsmesini hedefleyecek sekilde adapte edilebilir ve rotavirüs yapisal proteininin veya polipeptitin ifadesi tamamen plastid içinde meydana gelebilir. edilebilecegi kastedilir. Bu tür hedefleme dizileri, vektörü veya ürününü, bir plastid gibi bitkide arzu edilen bölmeye veya alt bölmeye yönlendiren bir peptide dönüstürülebilir. Ornegin, proteinleri plastidlere hedeflemek için plastid sinyal peptitleri (teknolojide "plastid transit peptitleri" olarak anilacaktir) teknikte bilinmektedir. Kullanilabilecek olan bir plastid transit peptidinin sinirlayici olmayan bir örnegi rbcsl - cTP'dir. Bir kloroplast - transit peptit dizisinin uygun bir örnegi, örnegin, Solanum tuberosum'dan gelen Rubisco küçük - altbirim genidir (rbcSI).
Dolayisiyla, rotavirüs yapisal proteini veya polipeptidi, polipeptit veya proteinin geri kalan kismi ile ayni veya heterolog olan bir sinyal peptidi içerir. "Sinyal peptidi" terimi, teknolojide iyi bilinmektedir ve genel olarak, yeni translate edilen polipeptidin translokasyonunu belirli bir organele yönlendirebilen veya polipeptit zincirinin spesifik alanlarinin baskalarina göre konumlandirilmasina yardimci olan bir polipeptidin N - ucunda bulunan kisa bir (yaklasik 5 - 30 amino asit) amino asit dizisini ifade eder.
Sinirlayici olmayan bir örnek olarak, sinyal peptidi proteininin endoplazmik retikuluma translokasyonunu hedefleyebilir ve / veya bölünmeye yardimci olmak için dogmakta olan polipeptidin bir zar - ankor alanina göre N - uç proksimal alaninin konumlandirilmasina ve olgun proteinin, örnegin sinirlayici olarak düsünülmemesi gereken bir rotavirüs yapisal proteininin katlanmasina yardimci olabilir.
Bir sinyal peptidi (SP), protein veya virüs proteini için dogal olabilir veya bir sinyal peptidi, ifade edilen protein veya virüs proteininin primer dizisine göre heterolog olabilir. Örnegin, rotavirüs yapisal proteininin dogal sinyal peptidi, bir bitki sisteminde rotavirüs yapisal proteinini ifade etmek için kullanilabilir.
Bir sinyal peptidi, örnegin rotavirüs proteini disindaki bir virüsün bir protein, viral protein veya dogal yapisal proteini veya bir bitki, hayvan veya bakteriyel polipeptidi için dogal olmayabilir. Kullanilabilecek bir sinyal peptidinin sinirlayici olmayan bir nükleotitleri) 211499). Dahasi, sinyal peptidi tamamen silinebilir veya kesilebilir. 95, °/o 100'ünün veya bunlarin arasinda bulunan herhangi bir miktarinin sinyal peptidinden silinmesi kastedilir. Tercih edilen sekliyle, kesilmis amino asit kalintilari süreklidir ve kesme, ikinci metioninden itibaren cereyan etmektedir.
Dolayisiyla mevcut bulus, bir bitkide, bir bitki bölümünde veya bitki hücresinde bir RLP üretmek için, bir nükleik asidin dahil edilmesini içeren bir yöntem saglar; buradaki nükleik asit, VP7 rotavirüs yapisal proteinini ve dogal olmayan bir sinyal peptidini veya kesilmis dogal sinyal peptidini kodlar.
Bir bitkide, bir bitki bölümünde veya bitki hücresinde bir RLP üretme yöntemi, herhangi bir uygun bitki konaginda genetik yapilarin ifade edilmesini içerebilir. Uygun konak örnekleri, yonca, kanola, Brassica türleri, misir, Nicotiana türleri, patates, ginseng, bezelye, yulaf, pirinç, soya fasulyesi, bugday, arpa, ayçiçegi, pamuk ve benzeri tarimsal bitkileri içerir.
Rotavirüs yapisal proteinlerini kodlayan nükleotit dizileri 1, 2, 3, 4 veya 5 ikili plazmid vektörleri kullanilarak bitki konaklarina aktarilabilir. Bu nedenle, her ikili plazmid vektör bir rotavirüs yapisal proteini için kodlama yapan 1, 2, 3, 4 veya 5 nükleotit dizisini içerebilir.
Bir bitkide, bir bitki bölümünde veya bitki hücresinde bir RLP üretme yöntemi, ayrica bir 3 ' translate edilmemis bölge içerebilen bir veya daha fazla genetik yapi içerebilir.
Bir 3 ' translate edilmemis bölge, bir poliadenilasyon sinyali ve mRNA islemeyi veya gen ifadesini gerçeklestirebilen diger düzenleyici sinyalleri içeren bir DNA segmentini içeren bir gen bölümünü belirtir. Poliadenilasyon sinyali genelde mRNA öncüsünün 3 Poliadenilasyon sinyalleri yaygin olarak, 5 'AATAAA - 3' kanonik formuna yönelik homolojinin varligi ile fark edilir, ancak varyasyonlar nadir degildir. Uygun 3 ' bölgelerinin sinirlayici olmayan örnekleri, nopalin sintaz (NOS) geni, soya fasulyesi depolama proteini genleri gibi bitki genleri, ribuloz - l, 5 - bisfosfat karboksilaz geninin küçük alt - birimi (ssRUBISCO, US 4, 962, 028, burada referans olarak zikredilmektedir), US 7, 125, 978'de tarif edilen plastosiyanin ifadesini düzenleyen promotör gibi Agrobakteri tümörü indükleyen (Ti) plasmid genlerinin bir poliadenilasyon sinyalini içeren 3' transkribe translasyon uygulanmamis bölgelerdir.
Bir bitkide, bir bitki bölümünde veya bitki hücresinde bir RLP üretme yöntemi, gerekebilecegi gibi, gerek transkripsiyon hizlandiricilar gerekse diger hizlandiricilari da içerebilen bir veya daha fazla genetik yapi içerebilir. Hizlandiricilar, kopyalanan diziye 5 'veya 3' konumunda yerlestirilebilir. Hizlandirici bölgeleri alaninda uzman kimselerce iyi bilinir ve ATG baslatma kodonu, komsu dizileri ve benzerlerini içerebilir. Varsa, baslatma kodonu, kopyalanan dizinin dogru translasyonunu saglamak için kodlama dizisinin okuma çerçevesiyle ("çerçeve") bir fazda olabilir.
Bir bitkide, bir bitki bölümünde veya bitki hücresinde bir RLP üretme yöntemi, Ti plazmidleri, Ri plasmidleri, bitki virüsü vektörleri, dogrudan DNA transformasyonu, mikro enjeksiyon, elektroporasyon vb. kullanilarak yapilabilir. Bu tekniklerin incelemeleri için bakiniz, örnegin Weissbach ve Weissbach, Methods for Plant Corey, Plant Molecular Biology, 2. baski, (1988); and Miki and lyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. Plant Metabolism, 2. baski DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (ed), Addison Wesly, Langmans Ltd. London), sayfa 561 - 579 (1997). Diger yöntemler, dogrudan DNA alimi, Iipozomlarin kullanimi, elektroporasyonu, örnegin protoplastlar, mikro enjeksiyon, mikro - iticiler veya igneler (whisker) ve vakum infiltrasyonunun kullanimini içerir. Bakiniz, örnegin, Bilang ve Molecular Biology (Weissbach ve Weissbach, ed. , Academic Press Inc. , 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler ve Zielinski, ed. , Academic Press Inc. , 1992.
Geçici ifade Teori ile sinirlanmak istememekle birlikte, farkli rotavirüs yapisal proteinlerin protein konsantrasyonu ve orani, RLP'Ierin birlesme verimliligi için önemli olabilir.
Dolayisiyla, çokluk ve enfeksiyon zamani, protein konsantrasyonunu ve bitkilerdeki RLP'lerin toplam birlesme verimliligini manipüle etmek için önemli olabilir.
Bir bitkide, bir bitkin bölümünde veya bitki hücresinde bir RLP üretme yöntemi, bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan bir veya daha fazla yapinin geçici ifadesini içerebilir. Bir bitki, bitkinin bölümü veya bitki hücresinde rekombinant Agrobacterium tumefaciens'in epikromozomal ifadesine dayanan geçici bir ifade sistemi, çesitli hücre bölmelerini veya alt bblmeleri hedef alan rotavirüs yapisal proteinini ifade etmek için kullanilabilir. Geçici bir ifade sistemi, yüksek bir üretim hizi saglar. Bundan baska, bitkilerde rekombinant Agrobakterinin infiltrasyonundan birkaç gün sonra büyük miktarda protein elde edilebilir (Rybicki, 2010; Fischer ve digerleri, 1999). Ayni zamanda, uzun gen dizilerini ifade etmek ve ayni hücrede ayni anda ifade edilen birden fazla gene sahip olmak, multimerik proteinlerin etkili bir sekilde birlestirilmesini saglamak da mümkündür (Lombardi ve dig. , 2009).
Rotavirüs yapisal proteinlerini kodlayan nükleotit dizileri, bitki konagina 1, 2, 3, 4 veya 5 dönüstürülmüs Agrobacterium tumefaciens susuna aktarilabilir.
Bununla birlikte, geçici ifade sirasinda, transkripsiyon sonrasi gen susturma, bitkilerdeki heterolog proteinlerin ifadesini sinirlayabilir. Transgen mRNA'larin spesifik parçalanmasina karsi koymak için bir susturucu süpresorünün, örnegin bunlarla sinirli olmamak üzere, Tomato spotted wilt virüsünden gelen Nss'nin birlikte ifadesi kullanilabilir (Brigneti ve digerleri, 1998). Alternatif susturma baskilayicilari teknikte iyi bilinmektedir ve burada açiklandigi gibi kullanilabilirler (Chiba ve dig. , 2006, Virology 346: 7 - 14), örnegin bunlarla sinirli olmamakla birlikte HcPro, TEV - pI/HC - Pro (Tobacco etch virüsü - pl/HC - Pro), BYV - p21, p19 Tomato bushy stunt virüsü (TBSV p19), Tomato crinkle virüsü (TCV - CP) kapsid proteini, 2b Cucumber mozaik virüsü; CMV - 2b), p25 Potato virüsü X (PVX - p25), p11 Potato virüsü M (PVM - p23 Citrus tristexa virüsü (CTV - p23), p24 Grapevine Ieafroll - iliskili virüs - 2, (GLRaV - 2 p24), p10 Grapevine virüsü A, (GVA - p10), p14 Grapevine virüsü B (GVB - p14), p10 Heracleum Iatent virüsü (HLV - p10), veya p16 Garlic common latent virüsü (GCLV - p16). Bu nedenle, susturmanin bir baskilayicisi, örnegin HcPro, TEV - p1 / HCPro, BYV - p21, TBSV p19, TCV - CP, CMV - 2b, PVX - p25, PVM - - p16 veya GVA - p10, bir bitki ya da bir bitkinin bir bölümünde yüksek düzeyde protein üretimini saglamak için bir veya daha fazla rotavirüs yapisal proteini, örnegin VP2, VP4, VP6 veya bunlarin bir kombinasyonu ile birlikte ifade edilebilir.
Mevcut bulus, ayrica, yukarida açiklandigi gibi bir yöntem saglar, burada bitkide ek bir (dördüncü veya besinci) nükleotit dizisi ifade edilir, bir susturucu baskilayici kodlayan ek (dördüncü veya besinci) nükleotit dizisi bitki içinde aktif ilave bir (dördüncü veya besinci) düzenleyici bölgeye islevsel olarak baglidir. Susturma baskilayicisini kodlayan nükleotit dizisi, örnegin Nss, HcPro, TEV - pi / HC - Pro, GVA - p10 olabilir.
Asagida tarif edildigi gibi, geçici ifade yöntemleri, bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan bir veya daha fazla yapiyi ifade etmek için kullanilabilir (bakiniz Liu ve Kapila ve digerleri, 1997, tarafindan tarif edildigi gibi vakuma dayali geçici bir ifade yöntemi kullanilabilir. 1997 de kullanilabilir. Bu yöntemler, bunlarla sinirli olmamak üzere, Agro asilama veya Agro - infiltrasyon, siringa infiltrasyonu gibi bir yöntem de olabilir, bununla birlikte, yukarida belirtildigi gibi diger geçici yöntemler de kullanilabilir. Agro asilama, Agro - infiltrasyon veya siringa infiltrasyonu ile arzu edilen nükleik asidi içeren bir Agrobakteri karisimi bir dokunun, örnegin yapraklar, bitkinin hava kismi (gövde, yapraklar ve çiçek dahil), bitkinin diger kisimlari (gövde, kök, çiçek) veya bütün bitkinin hücreler arasi bosluklarina girer. Epidermisi geçtikten sonra Agrobakteri t - DNA kopyalarini enfekte eder ve hücrelere aktarir. t - DNA epizomal olarak transkribe edilir ve mRNA, enfekte hücrelerde ilgili proteinin üretimine yol açacak sekilde translate edilir, ancak t - DNA'nin çekirdegin içine geçisi geçicidir.
Dönüstürülmüs bitki hücrelerinin tanimlanmasina yardimci olmak için, bir bitkide, bir bitki bölümünde veya bitki hücresinde bir RLP üretme yöntemi, bitki seçilebilir markörler de dahil olmak üzere yapilar içerebilir. Yararli seçilebilir markörler, örnegin gentamisin, higromisin, kanamisin veya fosfinotrisin, glifosat, klorosülfüron ve benzeri bir antibiyotik gibi kimyasallara direnç saglayan enzimleri içerir. Benzer sekilde, GUS (beta - glukuronidaz) gibi renk degisikligi ile veya Iusiferaz veya GFP gibi Iüminesan ile tanimlanabilen bir bilesigin üretilmesini saglayan enzimler da kullanilabilir.
Bir bitkide, bir bitki bölümünde veya bitki hücresinde bir RLP üretme yöntemi, RLP'leri ifade eden transgenik bitkiler, bitki hücreleri veya tohumlari üretme yöntemlerini de içerebilir. Bitki hücrelerinden bütün bitkilerin rejenerasyonuna iliskin yöntemler de teknikte bilinmektedir. Genel olarak dönüstürülmüs bitki hücreleri, dönüstürülebilir bitki hücrelerinin tanimlanmasini kolaylastirmak için seçilebilir markörlerin kullanildigi antibiyotikler gibi seçici ajanlar içerebilen uygun bir ortamda kültürlenir. Kallus olustuktan sonra, bilinen yöntemlere uygun olarak uygun bitki hormonlarinin kullanilmasiyla sürgün olusumu tesvik edilebilir ve sürgünler, bitkilerin yenilenmesi için köklendirme maddesine aktarilir. Bitkiler daha sonra tohumlardan veya bitkisel çogaltma teknikleri kullanilarak, tekrarlayan kusaklar olusturmak için kullanilabilir.
Transgenik bitkiler, doku kültürleri kullanilmadan da üretilebilir.
Mevcut basvurudaki "düzenleyici bölge", "düzenleyici eleman" veya "promotör" terimlerinin kullanilmasi, DNA ya da RNA ya da hem DNA hem de RNA'dan olusabilen bir genin protein kodlama bölgesinin yukari akis yönünde, tipik olarak, ancak her zaman olmasa da, nükleik asidin bir kismini yansitir. Düzenleyici bir bölge aktif oldugunda, veya ilgili bir genle islevsel olarak birlestiginde ya da bagli oldugunda; bu, ilgili genin ifadesi ile sonuçlanabilir. Bir düzenleyici unsur, organ özgüllügüne aracilik edebilir veya gelisimsel veya zamansal gen aktivasyonunu kontrol etme yetenegine sahip olabilir. Bir "düzenleyici bölge", promotör elemanlari, bir bazal promotör aktivitesi sergileyen çekirdek promotör elemanlari, harici bir uyarana tepki olarak indüklenebilir elemanlari, negatif düzenleyici elemanlar veya transkripsiyonel hizlandiricilar gibi promotör aktiviteye aracilik eden elemanlari içerebilir. Burada kullanildigi sekliyle "düzenleyici bölge", transkripsiyonu takiben aktif olan elemanlari, örnegin translasyonel ve transkripsiyonel hizlandiricilari, translasyonel ve transkripsiyonel baskilayicilari, yukari akis aktive edici dizileri ve mRNA instabilite belirleyicileri gibi gen ifadesini modüle eden düzenleyici elemanlari da içerebilir. Bu son elemanlarin birçogu kodlama bölgesinin yakininda bulunabilir.
Bu açiklama baglaminda, "düzenleyici eleman“ veya "düzenleyici bölge" terimi tipik olarak, her zaman olmasa da, çogunlukla, yapisal bir genin kodlayan dizisine (5 ') göre yukari akista, RNA polimeraz için tanima ve / veya belirli bir bölgede transkripsiyonun baslatilmasi için gerekli olan diger faktörleri saglayarak kodlama anlasilmalidir ki, intronlar içine yerlestirilen diger nükleotit dizileri veya dizinin 3' ucu ayni zamanda ilgili bir kodlama bölgesinin ifadesinin düzenlenmesine katkida bulunabilir. Belirli bir bölgedeki baslatmayi saglamak için RNA polimeraz veya diger transkripsiyonel faktörlerin taninmasini saglayan bir düzenleyici eleman örnegi, bir promotör elemandir. Okaryotik promotör unsurlarinin hepsi degil ancak çogu, bir transkripsiyonel baslangiç bölgesinin yaklasik 25 baz çift yukari akisinda yer alan adenosin ve timidin nükleotit baz çiftlerinden olusan muhafaza edilmis bir nükleik asit dizisi olan bir TATA kutusu içerir. Bir promotör eleman, transkripsiyonun baslatilmasindan sorumlu olan bir bazal hizlandirici elemanin yani sira gen ifadesini degistiren diger düzenleyici elemanlari (yukarida listelenen) içerir.
Gelisimsel olarak düzenlenen, indüklenebilir veya yapici olanlar da dahil olmak üzere çesitli düzenleyici bölge türleri vardir. Gelisimsel olarak düzenlenen veya kontrolündeki bir genin diferansiyel ifadesini kontrol eden bir düzenleyici bölge, belirli organlarin veya dokunun gelisimi sirasinda belirli zamanlarda bu organin veya bu organ dokularinin içerisinde aktive edilir. Bununla birlikte, gelisimsel olarak düzenlenen bazi düzenleyici bölgeler belirli organlarda veya dokularda spesifik gelisim evrelerinde aktif olabilmektedirler, ayrica bitki içindeki diger organlarda ve dokularda da gelisimsel olarak düzenlenmis bir sekilde veya bazal bir seviyede aktif olabilmektedirler. Dokuya özgü düzenleyici bölgelerin örnekleri için örnegin bkz. napin promotörünü ve cruciferin promotörünü içeren spesifik bir düzenleyici bölge Plant Cell 14: 125 - 130). Yapraga özgü bir promotöre bir örnek, plastosiyanin promotörü içerir (bkz. US 7, 125, 978). lndüklenebilir bir düzenleyici bölge, bir indükleyiciye tepki olarak bir veya daha fazla DNA dizisinin veya geninin dogrudan veya dolayli olarak transkripsiyonunu aktive edebilen bir düzenleyici bölgedir. Bir indükleyici yoklugunda DNA dizileri veya genleri kopyalanmayacaktir. Tipik olarak, transkripsiyonu etkinlestirmek için indüklenebilir bir düzenleyici bölgeye spesifik olarak baglanan protein faktörü, indükleyici tarafindan dogrudan veya dolayli olarak aktif forma dönüstürülen inaktif bir formda mevcut olabilmektedir. Bununla birlikte, protein faktörü de yok olabilir. lndükleyici, bir protein, metabolit, büyüme regülatörü, herbisit veya fenolik bilesik gibi bir kimyasal madde olabilir veya dogrudan isi, soguk, tuz veya toksik elementler tarafindan veya dolayli olarak bir virüs gibi bir patojen veya bir hastalik ajani tarafindan uygulanan fizyolojik stres olabilir. lndüklenebilir bir düzenleyici bölge içeren bir bitki hücresi, indükleyicinin püskürtme, sulama, isitma veya benzeri yöntemler vasitasiyla hücre veya bitkiye harici olarak uygulanmasiyla bir indükleyiciye maruz birakilabilir. lndüklenebilir düzenleyici elemanlar, bitkilerden veya bitki genlerinden türetilebilir (örn. Gatz, C. ve promotörlerin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, tetrasiklin uyarilabilir steroid indüklenebilir promotör (Aoyama. T. ve Chua, NH, 1997, Plant 1. 2, 397 - 404) ve etanol ile indüklenebilir promotör (Salter, MG ve digerleri, 1998, Plant Journal sitokinin indüklenebilir IB6 ve CKI genleri (Brandstatter, l. ve Kieber, 1. 1, 1998, Plant indüklenebilir eleman olan DR5 yer alir (Ulmasov, T. ve digerleri, 1997, Plant Cell 9, 1963 - 1971).
Bir yapisal düzenleyici bölge, bir bitkinin çesitli parçalari boyunca ve bitki gelisimi boyunca sürekli bir gen ifadesini yönlendirir. Bilinen yapisal düzenleyici elemanlarin örnekleri, CaMV 358 transkriptiyle baglantili promotörleri (Odell ve dig. , 1985, 646), Arabidopsis ubikitin 1 ve 6 genlerini (Holtorf ve digerleri, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637 - 646) ve tütün translasyonel baslatma faktörü 4A genini (Mandel ve digerleri, Burada kullanilan "yapisal" terimi mutlaka, yapisal düzenleyici bölgenin kontrolü altindaki bir genin mutlaka tüm hücre tiplerinde ayni seviyede ifade edildigini göstermez, ancak bollukta degisimin gözlenmesiyle birlikte, genin genis bir hücre yelpazesinde ifade edildigine isaret eder. Yapisal düzenleyici elemanlar, islevsel olarak baglandiklari nükleotit dizisinin transkripsiyonunu ve / veya translasyonunu daha da gelistirmek için diger dizilerle birlestirilebilir. Ornegin, CPMV - HT sistemi, Cowpea mozaik virüsünün (CPMV) translate edilmemis bölgelerinden türetilir ve iliskili kodlama dizisinin gelistirilmis translasyonunu gösterir. "Yerli" terimi, nükleik asit veya amino asit dizisinin dogal olarak ortaya çiktigi veya "dogal tipte" oldugu anlamina gelmektedir. "Islevsel olarak bagli" terimi, söz konusu dizilerin, örnegin bir düzenleyici elemanin ve ilgili bir kodlama bölgesinin, dogrudan veya dolayli olarak, gen ifadesinin arabuluculugu veya modülasyonu gibi amaçlanan bir fonksiyonu gerçeklestirmek için etkilesime girdigi anlamina gelir. lslevsel olarak baglanmis dizilerin etkilesimi, örnegin, islevsel olarak baglanmis dizilerle etkilesen proteinlerin araciliginda meydana gelebilir.
Bir bitki içerisinde üretilen RLP, bitki spesifik N - glikanlar içeren bir rotavirüs VP7 yapisal proteinini indükleyebilir. Bu nedenle, bu bulus ayrica bitki spesifik N - glikanlara sahip VP7 ihtiva eden bir RLP'yi de temin etmektedir. modifiye N - glikanlara sahip VP7 üretilebilir. Ornegin indirgenmis fosfatlanmis, ksilosile edilmis veya her ikisi de, fukozilatlanmis ve ksilosile edilmis N - glikanlar ile modifiye edilmis bir glikozilasyon paterni içeren VP7 elde edilebilir, burada protein, fukosilasyonu, ksilosilasyonu içermez, veya her ikisini birden içermez ve artmis galaktosilasyon içerir. Ayrica, translasyon sonrasi modifikasyonlarin modüle edilmesi, örnegin terminal galaktozun eklenmesi, VP7'yi ifade eden dogal tipli bir bitkiye kiyasla ifade edilen VP7'nin fukosilasyonunun ve ksilosilasyonunun azaltilmasina neden olabilir. Örnegin, degistirilmis bir glikozilasyon paternine sahip olan VP7'nin sentezi, VP7'yi beta - 1. 4 galaktoziltransferazi (GalT) örnegin bunlarla sinirli olmamak üzere, memeli GalT veya insan GalT'sini kodlayan bir nükleotit dizisi ile birlikte ifade ederek gerçeklestirilebilir, ancak burada baska kaynaklardan gelen GalT da kullanilabilir.
GalT'nin katalitik alani, bir GNT1 - GalT hibrid enzimi üretmek Için N - asetilglukozamilinil transferazin (CTL) bir CTS alanina (yani, sitoplazmik kuyruk, transmembran alan, gövde bölgesi) kaynastirilabilir ve hibrid enzim VP7 ile birlikte ifade edilebilir. VP7, ayni zamanda, bunlarla sinirli olmamak üzere, memeli GnT - IIl veya insan GnT - Ill'ü gibi N - asetilglukosaminil transferaz III'ü (GnT - III) kodlayan bir nükleotit dizisi ile birlikte ifade edilebilir, diger kaynaklardan gelen GnT - III de kullanilabilir. Ek olarak, GnT - lll'e kaynasmis GNT1'in CTS'sini içeren bir GNT1 - GnT - III hibrid enzimi de kullanilabilir.
Dolayisiyla, mevcut açiklama, modifiye edilmis N - glikanlara sahip olan VP7'yi içeren RLP'Ier de saglar.
Teori ile sinirlanmak istememekle birlikte, VP7 üzerindeki bitki N - glikanlarinin varligi, antijen sunan hücreler tarafindan VP7'nin baglanmasini tesvik ederek bagisiklik tepkisini uyarabilir. Bitki N glikanini kullanarak bagisiklik tepkisinin uyarilmasi Saint- Jore - Dupas ve digerleri, 2007, tarafindan önerilmistir. (2007).
Mevcut bulus, asagidaki örneklerde daha ayrintili olarak açiklanacaktir. Örnekler Rotavirüs proteinlerinin sentezlenmesi ve N. benthamiana bitki yapraklarinda VLP'lerin üretimi Asagidaki analiz, G9 P [6] rotavirüs susundan rotavirüs kapsid proteinlerini kullanmis ve rotavirüs benzeri partiküllerin tütün N. benthamiana yaprak hücrelerinin çesitli bölmelerinde olusup olusmadigini degerlendirmistir. Tütün bitki yapraklarinda VP2 ve VP6'nin birlikte ifadesi ve VP2, VP6, VP7 ve VP4'ün çesitli kombinasyonlari arastirilmistir.
Gereçler ve Yöntem Plazmid yapimi VP2, VP4, VP6 ve VP7 için bitki kodonu optimize rotavirüs cDNA'Iari Geneart, Almanya tarafindan tedarik edilmistir. Plazmid DNA üreticinin talimatlarina göre DH5 - a kimyasal olarak kompetent E. coli hücrelerine (E. cloni TM, Lucigen) dönüstürülmüstür. Bu çalismada Rainer Fischer (Fraunhofer lnstitute for Molecular Biology and Applied Ecology, IME, Almanya) tarafindan saglanan yeni çiftli Agrobakteri vektörleri pTRAc (sitoplazma), pTRAkc - rbcs1 - CTP (kloroplast hedefleme) ve pTRAkc - ERH (endoplazmik retikül hedeflemesi) kullanilmistir. Ek bir vektör, pTRAkc - A (apoplast), pTRAkc - ERH'nin modifikasyonundan çoklu klonlama alanindaki Ncol ve Xhol bölgelerinde restriksiyon enzimi (RE) sindiriminden türetilmistir (Sekil 3). Bu, ER'deki proteinleri tutan histidin etiketi ve KDEL dizisini kaldirir. Proteinler bunun yerine apoplasti hedef alir.
VP2, VP4 ve VP6 cDNA'si, VP7, Af / II / Xhol ile kesilirken, Ncol / Xhol ile sindirilen sinir enzimidir (RE). Restriksiyon enzimleri Afllll, Ncol ve Mlul uyumlu yapiskan uçlara sahiptir. DNA'nin pTRAc, pTRAkc - rbcs - cTP ve pTRAkc - A'ya dogrudan klonlanmasi için, vektörler sirasiyla AfIlI /Xhol, Mlul / Xhol ve Ncol / Xhol bölgelerinde sindirilmistir. Vektörlerde DNA'nin klonlanmasi standart protokol uyarinca gerçeklestirilmis ve ardindan kimyasal olarak kompetent E. coli DH5 - a hücrelerine dönüstürülmüstür (E. cloni TM, Lucigen). Seçilen rekombinant koloniler koloni PCR ile dogrulanmistir. pTRAkc - ERH içinde klonlama için bir Notl restriksiyon enzimi bölgesi, her dört rotavirüs cDNA'nin durdurma kodonunu degistirmek için PCR amplifikasyonu tarafindan eklenmistir. cDNA, Tablo 1'de ayrintili olarak anlatildigi gibi primerler ile amplifiye edilmistir. PCR reaksiyon kosullari, 95 °C'de 5 dakika süreyle denatürasyon, bunu takiben 95 °C'de 30 saniye boyunca denatürasyon, 52 °C'de 1 dakika tavlama ve 1. 5 dakika boyunca 72 °C'de uzatmayi içerir. llave 20 dakika ve 72 °C`de 5 dakika. Bundan sonra, amplifiye edilmis fragmentler üreticinin talimatlarina göre pGEM - T - Easy (Promega) içine klonlanmistir. Dönüsüm, kimyasal olarak kompetent E. coli DH5 - a'da (E. cloni TM, Lucigen) gerçeklestirilmistir. Daha sonra koloni PCR, seçilen koloniler üzerinde diger üç yapi için yapildigi gibi gerçeklestirilmistir.
Tablo 1: ER vektörü klonlamasi için rotavirüs cDNA primerleri Primer Dizi R. E bölgesi Oryantasyon eklenmistir VP2F 5' - TTCCATGGCTTACCGTAAAAGG - 3' - SEK ID NO 5 Ileri VP2R 5' - ATGCGGCCGCAAGCTCGTTCATAATCCTCATG - 3' Notl SEK ID NO 6 Geri VP4F 5' - TTCCATGGCTTCCCTCATCTAC - 3' - SEK ID NO 7 Ileri VP4R 5' - ATGCGGCCGCAAGACGGCACTGGAGAATGAG. 3' Notl SEK ID NO 8 Geri VPöF 5' - TTCCATGGATGTGCTCTACTC - 3' - SEK ID NO 9 Ileri VP6R 5' - ATGCGGCCGCCTTCACGAGCATGGAACG - 3' Notl SEK ID NO 10 Geri VP7F 5' - GTACATGTACGGAATCGAGTAC - 3' - SEK ID NO 11 Ileri VP7R 5' - ATGCGGCCGCCACACGGTAGTAGAAAGCAGC - 3' Notl SEK ID NO 12 Geri Pozitif kolonilerdeki pGEM - VP DNA'Iar, PCR'nin dogrulugunu dogrulamak üzere dizilenmistir. DNA, Ncol / Notl ile sindirilmis ve uygun DNA fragmenti, pTRAkc - ERH - VP olusturmak üzere Ncol ve Notl bölgelerinde pTRAkc - ERH'ye klonlanmistir.
Dönüsüm daha sonra, daha önce yapildigi gibi E. coli DH5 - a hücrelerinde gerçeklestirilmistir. Seçilen kolonilerde rotavirüs DNA'sini kontrol etmek için koloni PCR de gerçeklestirilmistir.
Agrobakteri dönüsümü Agrobacterium tumefaciens GV3101 susu Profesör Rainer Fischer (Fraunhofer lnstitute for Molecular Biology and Applied Ecology lME, Aachen, Almanya) tarafindan saglanmis ve daha önce tarif edildigi gibi elektrokompetent yapilmistir (Shen ve Forde, 1989). Izole edilmis rotavirüs pTRA - VP yapilarinin üç yüz nanogrami O. 1 cm'lik bir elektro bosluk küveti (BioRadTM) içinde 100 ml elektrokompetent GV3101 hücreleri ile karistirilmis, daha sonra asagidaki ayarlar altinda bir GenePulser'de (BioRad) elektroporasyona tabi tutulmustur: 1. 8 W, 25 mF rifampisin (rif) ihtiva eden LA plakalarina kaplanmadan önce 900 ml LB içinde 27 °C'de 1 saat süreyle inkübasyona izin verilmistir. Plakalar 3 gün 27 °C'de inkübe edilmistir. Pozitif transformantlari kontrol etmek için plasmid DNA, rekombinant Agrobacterium kolonilerinden izole edilmis ve E. coli kompetent DH5 - a hücrelerine geri dönüstürülmüstür. Bunlar daha sonra 100 mg / ml ampisilin (amp) LA üzerinde seçilmistir. Basarili transformantlari dogrulamak için cDNA üzerinde koloni PCR ve restriksiyon enzimi sindirimleri yapilmistir. ilgili rekombinant Agrobakterinin gliserol stoklari - 70 °C'de yapilmis ve muhafaza edilmistir.
Rekombinant Agrobakteri infiltrasyonu A. Bu çalismada kullanilan Tumefeciens LBA 4404 (pBlN - NSs), Marcel Prins'den (Laboratory of Virology, Wageningen University, Binnenhaven, Hollanda) elde edilmistir. Tomato spotted wilt virüsünde (TSWV) bulunan NSS susturma baskilayicisini içerir. Gliserol stoklarindan gelen rekombinant Agrobakteri (pTRA - VP) LB içinde 50 mg / ml karb, 30 mg / ml kan ve 50 mg / ml rif ile 27 °C'de gece boyunca büyütülmüstür. Daha sonra rekombinant Agrobakteri ve LBA4404'ün (pBlN - NS'Ier) her biri indüksiyon ortaminda (LB, 10 mM 2 - (N - morfolino) etansülfonik asit mg / ml rif ve pH 5. 6) inoküle edilmistir.
Kültürler gece boyunca 27 °C'de inkübe edilmistir. Agrobakteri hücreleri, 4 °C'de 5 dakika boyunca 4000 rpm'de santrifüjle toplanmis ve daha sonra 2 ml infiltrasyon ve steril su) yeniden süspanse edilmistir. Hücrelerin optik yogunlugu (OD600) dogrulanmis ve O. 25'lik bir ODGOO elde etmek için infiltrasyon ortami ile seyreltilmistir. Her bir pTRA - VP yapisi için, LBA4404, rekombinant Agrobakteri ile 0. 'lik bir nihai ODGOO elde etmek üzere karistirilmistir. Birlikte ifade etme çalismalari için, her yapi, toplam olarak, örnegin 0. 5'lik bir ODBOO'ya; örnegin VP2 - O. 25 ve VP6 - 0. 25, karisim için OD600 0. 5'e esit olana kadar ilave edilmistir. lndüksiyon ve infiltrasyon ortaminda kullanilan asetosiringone, agrobakteride vir genlerinin aktivasyonuna yardimci olur.
Yarali bitki hücreleri, agrobakteride Vir A ve Vir G genleri tarafindan saptanan fenolik bilesikleri serbest birakarak, daha sonra konak hücrelerde protein ifadesinin indüksiyonuna yol açar (Zupan, J. ve dig., 2000). Daha sonra, hücreler asetosiringonun vir genlerini indükleyebilmesi için 1 saat oda sicakliginda inkübe edilmistir. Uç haftalik dogal tip N. bentha - miana bitkileri, VP proteinlerini ifade eden rekombinant agrobakteri ile infiltre edilmistir. Bu, ya bütün bitkilerin vakum infiltrasyonu ya da bitki yapraklari ventral tarafindaki abeksiyel hava alanlarina rekombinant agrobakteri (pTRA - VP) enjeksiyonu ile ilgilidir. Rekombinant agrobakteri, susturucu baskilayici LBA 4404 (pBlN - N85) ile veya bu olmadan infiltre edilmistir.
Baslangiçta, her bir bitkiye, yapi basina bir siringa kullanarak 2 ml agrobakteri infiltrasyon ortami süspansiyonu enjekte edilmistir. Yapi basina bir bitki yedi günlük bir deneme zamaninda kullanilmistir. VP2, VP6 ve VP4'ün ayni anda N. benthamiana bitki yapraklarinin sitoplazmasinda ifade edildigi rotavirüs proteinlerinin ortak ifadesi gerçeklestirilmistir. Arastirilan kombinasyonlar VP2 / 6 ve VP2 / 6 / 4'tür.
VP4 "pik" proteini VPö'ya baglanabilir ve bu nedenle RLP yapilarina eklenebilme olasiliklari vardir. VP7 klonlamasi denenmis ancak konak hücrelerde toksisite sorunlari bir sorun oldugunu kanitlamistir. Rekombinant VP7 agrobakteri, infiltrasyon sonrasi bir gün içerisinde yaprak hücrelerini Öldürmüstür. Bunu 'Önlemek için, 17 °C'Iik düsük bir sicaklikta infiltre edici ve deneme zamanlarinin 3. ve / veya 5. günlerinden sonra infiltre edici bitkiler gibi çesitli yöntemler denenmistir. Bu nedenle VP7, tütün bitkilerindeki zehirli dogasi nedeniyle birlikte ifade çalismalarinda atlanmistir.
Protein Ekstraksiyonu Bütün yapraklar veya yapi basina iki yaprak diski hasat edilmis ve sivi azot içinde ögütülmüstür. Zemin yapragi maddesi, Tam Proteaz lnhibitorü (EDTA içermeyen; Roche) içeren steril PBS içerisinde yeniden süspanse edilmistir. Bu, daha sonra 13000 rpm'de 5 dakika santrifüje tabi tutulmus ve peletler (bitki yapragi maddesi) atilmistir. Daha sonra her bir yapinin 100 ml'si 5X SDS - PAGE yükleme tamponu ile karistirilmis ve 95 °C'de 2 dakika kaynatilmistir, SDS - PAGE jelleri ve western blotlar üzerinde daha ileri analiz için hazir hale getirilmistir. Geri kalan numuneler gelecekte kullanilmak üzere - 20 °C`de saklanmistir. Sekil 4, rotavirüs cDNA'si için klonlama ve infiltrasyon prosedürüne genel bir bakis sunmaktadir.
Apoplast protein ekstraksiyonu Ek bir ekstraksiyon prosedürü pTRAkc - A, apoplast yapilari üzerinde gerçeklestirilmistir. Apoplast, plazma membrani ve bitki hücrelerinin hücre duvarlari arasindaki serbest difüzyon boslugudur (Sekil 5a). Sitoplazmada ifade edilen proteinler onlari apoplasta hedefleyen bir disari aktarim (export) dizisine sahiptir, dolayisiyla burada birikirler. Takip eden ekstraksiyon prosedüründe, her ekstraksiyon gününden itibaren bütün yapraklar ya tam Proteaz lnhibitörü içeren steril PBS ile vakumla ya da enjeksiyonla infiltre edilmistir. Vakum infiltrasyonu için, tek tek bitki yapraklari, PBS içinde süspanse edilmis ve bir vakum tankinda 10 dakika süreyle 100 mbar'de bir vakum uygulanmistir. Yapraklar daha sonra tabaninda bir delik olan spin kolonlarina yuvarlanarak yavasça (Qiagen spin kolonlarina benzer sekilde) yerlestirilmistir (Sekil 5b2). Delikler kati yaprak maddesinin geçmesine izin vermeden yapraklardan akiskanin kolayca geçmesine izin verir. Spin kolonlari, 2 ml Eppendorf tüplerine yerlestirilmis ve 15 dakika boyunca 4000 rpm'de santrifüj uygulanmistir (Sekil 5b3). Süzüntü toplanmis ve SDS - PAGE jelleri için protein yükleme boyasi ve her filtrat numunesinin 100 ul'sine western blot analizi eklenmistir.
Western Blotlar ve Coomassie boyalari Western blotlar ve Coomassie mavisi boyali SDS - PAGE jelleri daha önce tarif edildigi gibi kullanilmistir. Western blotlarda ilgili proteinlerin her birinin problanmasi için fare antirotavirüsü VP6 antikoru (US Biologicals) (1: 5000), anti - fare histidin etiketi antikoru (Sigma®) (1: 2000), tavuk anti - VP2 ve tavuk anti - VP4 serumu (1: 2000) kullanilmistir. Bir Syngene Gel Belgeleme Sistemi kullanilarak bantlarin yogunluk taramasi ile proteinlerin nicellestirilmesi için Coomassie mavisi boyali SDS - PAGE jelleri kullanilmistir.
Elektron Mikroskobu lfade edilen proteinlerin RLP'IerIe birlesip birlesmedigini belirlemek için immüno - tutsak partiküllerin transmisyon elektron mikroskopisi (TEM), sitoplazmanin VP6, VP2 varliginda olmak üzere gerçeklestirilmistir. Isin bosaltilmis karbon / bakir izgaralari 5 dakika süreyle 20 ml fare anti - rotavirüs VP6 antikoru (1: 5000) üzerine yerlestirilmis ve daha sonra 3 kere steril damitilmis su ile yikanmistir. lzgaralar daha sonra 10 ml protein ekstraklari üzerine konmus ve steril distile su ile 3 kez tekrar yikanmadan önce 2 dakika birakilmistir. Son olarak, Izgaralar, bir TEM (Zeiss 912 OMEGA Enerji Filtresi lletim Elektron Mikroskobu, Cape Town Universitesi) altinda incelemeden önce 1 dakika boyunca 20 ml % 2 uranil asetat üzerinde yüzdürülmüstür.
Sakroz gradyanlarindan izole edilen numuneler için, sükroz ilk önce bakir izgaralarinda bagisiklikla - tutma öncesi diyaliz yoluyla uzaklastirilmalidir.
Uzaklastirilamazsa, sükroz kristalleri, Izgaralar üzerinde kristaller olusturdugu için, bagli karbon ve materyalin yapisini bozarak, TEM'nin altinda örneklerin kesin görüntülemesini engeller. Sükroz fraksiyonlari, 10 000 MW diyaliz kasetine yerlestirilmis ve tampon degisimi yapilmadan Önce 0. 4 M NaCI içeren steril PBS içinde diyaliz edilmis ve karistirilarak gece boyunca 4 °C`de birakilmistir. Diyaliz ile hacim arttikça, protein numuneleri konsantre olmayi gerektirir. Numuneler, vakumla dondurularak 3 saat kurutulmus ve 2 ml steril PBS içinde yeniden süspanse edilmis, daha ileri analizler için hazir hale getirilmistir.
RLP'lerin sükroz gradyan saflastirmasi Bitki protein Özleri baslangiçta kati bitki maddesini uzaklastirmak için miracloth'dan filtrelenmistir. % 10 ila% 60 sükrozdan olusan sükroz gradyanlarinin her biri 40 ml tüpler içine steril PBS (pH 7. 4) içinde çözülmüs 5 ml sükrozun alti katmani yaratilarak yerlestirilmistir. Daha sonra, 5 ila 10 ml'lik hacimlerde berraklastirilmis protein numuneleri, her bir gradyanli kolonun üstüne yüklenmistir. ultrasantrif'uj, 1 saat dakika boyunca 4 °C'de gerçeklestirilmistir. Santrifüj isleminin sonunda, 2 ml'lik fraksiyonlar, her kolonun tabanindan tüp delinerek toplanmistir. Ardindan ilgili proteinler içeren fraksiyonlari belirlemek için nokta blotlari gerçeklestirilmistir. Her fraksiyon için, 1 ml numune, nitroselüloz membran üzerinde bir izgaraya yüklenmis ve daha sonra BSA bloke edici tampon ile bloke edilmistir. Western blot analizi daha sonra her zamanki gibi gerçeklestirilmistir. Proteinler, VP6 için fare anti - VPG problanmistir.
Toplam çüzünebilir Protein Analizi Toplam çözünebilir protein (TSP), Bradford analizleriyle belirlenmistir. Bu, VP2 / 6'yla birlikte ifade edilen sitoplazmadaki birikmis protein seviyelerini karsilastirmak için gerçeklestirilmistir. Standart olarak bir seyreltme serisinde protein lgG (1. 43 mg / ml stok) kullanilmistir. 5 ml standart ve numunelerin her biri temiz bir kuru mikrotitrasyon plakasina ilave edilmistir. Toplam Çözünür Protein Reaktifleri A ve B, üreticinin talimatlarina göre ilave edilmistir (Bio - Rad Dc Protein Deneyi). Tüm deneyler üçer defa yapilmistir. Absorbans Okumalari, bir mikroplaka okuyucu (Bio -tek PowerWave XS) kullanilarak 750 nm'de kaydedilmistir.
Sonuçlar Bitki yapragi hücre bölmelerinde VP6'nin ifadesi VP6 ifade edilmis ve susturma baskilayicisi ile birlikte veya bu olmadan tüm hücresel bölmeleri (Sekil 6; (çizgi isaretleri VP6, ~ 42 kDa)) hedef almistir. Sitoplazmada, protein, bir hafta süreyle deneme sirasinda sitoplazmada artan protein birikimi ile deneme zamaninin ilk gününden itibaren ifade edilmistir (Sekil 6a). ER'de, protein birikimi, yalnizca 3. günde açikça görülmüstür (Sekil 6b). Protein, diger proteinlerden daha yüksek bir bant boyutunda (yaklasik 11 kDa daha fazla) bulunmustur. Bu, proteinin C - terminal ucuna eklenen 6 histidin - etiketinin yani sira, bölünme bölgesinin (pProEx vektör dizisine bakiniz) bur sonucu olabilir.
Kloroplastlarda protein birikimi 1 ve 3. günler arasinda gerçeklesmistir (Sekil 6 proteinler üzerinde bir etkiye sahip olmustur. 5. ve 7. günlerde protein ifadesi yoktur.
Apoplast, tipki ER'de oldugu gibi, deneme zamaninin 3. ve 5. günleri arasinda en iyi protein birikimine (Sekil 6 "apoplast") sahip olmus ve 1. ve 7. günlerinde hiç protein birikimi gerçeklesmemistir. Susturma baskilayici, özellikle 3. günde olumlu bir etkiye sahip olmustur; bu da disarida birakildigi zamanla karsilastirildiginda daha yüksek protein algilama seviyeleriyle sonuçlanmistir. Muhtemelen VP6 proteini üzerindeki sinyallesme etiketinin bölünmesinin bir sonucu olarak ~ 40 kDa isaretinde iki bandin ER, kloroplastlar ve apoplastin hepsi 3. günde en yüksek protein ifadesini sergilemistir, burada en fazla protein susturma baskilayicisi varliginda birikmistir.
Sitoplazma, deneme zamaninda yüksek ve artan protein ifadesi sergilemesi açisindan protein birikiminde en iyisi olmustur.
Histidin etiketli rotavirüs proteinlerinin sitoplazmadaki ifadesi Dört rotavirüs VP`si ek bir vektör olan pTRAc - HT içine klonlanmistir. Bu vektör, sitoplazmayi hedefleyen proteinlere yönelik bir 6 - histidin etiketi içerir ve ilgili proteinler için antikorlar mevcut degilse, bir anti - histidin etiketi antikoru kullanilarak tespiti kolaylastirir. Olgumuzda sadece VP6'nin ticari olarak temin edilebilen bir antikoru var ve bu nedenle bu prosedürü serum beklerken tüm proteinlerin erken tespiti için denedik. Sitoplazma da VP6 ifadesi için ise yaramis ve diger proteinleri denemek için bizi motive etmistir. 7 Günlük bir deneme zamaninin üçüncü gününde çikan ekstraktlarin Western blot sonuçlari, VP2, VP4 ve VP6'nin basarili sekilde ifadesini göstermistir (Sekil 7a).
Bitkilerde VP7 ekspresyonu elde etmek için çesitli teknikler denenmistir. Bununla birlikte, VP7 ile infiltre edilen bitkiler, 1. günden itibaren sararmis yapraklar sergilemis ve deneme zamaninin seyrinde solgunlasmaya baslamistir (Sekil 7b). Bu kosullar altinda, infiltrasyonun 1. gününden sonra bile, bitki hâlâ makul derecede iyi göründügünde, hiçbir protein ifadesi tespit edilmemistir.
Bitkilerde VP2 ve VP4'ün ifadeleri VP2 ve VP4, N. benthamiana bitki yapraklarinda infiltre edilmis ve ER, kloroplast, sitoplazma ve apoplasti hedef almistir. E. coli'de herhangi bir pozitif klon elde edemedigimiz için apoplast vektörünü hedefleyen VP2'yi ifade edemedik. Bununla birlikte, protein basariyla ifade edilmis ve diger tüm 3 bölmeyi hedef almistir (Sekil 8a). Ekstraktlarin western blotlarin analizinde tavuk anti - VP2 ve anti - VP4 serumu (1: 2000) kullanilmistir. VP2 ve VP4 bantlari sirasiyla Sekil 8a ve 8b'de görüldügü gibi hemen altinda görülebilir. lfadenin, VP2 için sitoplazmada ve ER'de, diger taraftan VP4 için sitoplazmada ve apoplastta en iyi oldugu bulunmustur. Susturma baskilayici, proteinlerin ifadesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olmamistir. VP2 ER yapisinda sadece hafifçe ifadeyi artirmistir ve western blot'da görüldügü gibi geri kalan kisimda ifadeyi pek fazla artirmamistir. VP4 yapilari susturucu baskilayici varliginda ifade edilmistir.
Sitoplazmada VP2 l 6 ve VP2 I 6 / 4'ün birlikte ifadesi Sitoplazmanin, rotavirüs kapsid proteini ifadesi için en iyi oldugu görülmüs ve en yüksek ekstraksiyon verimini sergilemistir. Dolayisiyla, tüm ifade çalismalari, sitoplazmayi hedefleyen proteinlerle yapilmistir.
VP2 ve VP6'nin, farelerde koruyucu immünojenik tepkiler içeren RLP'Ier olusturdugu ve bu nedenle sitoplazmada VP2 / 6 ve VP2 / 6 / 4'ün birlikte ifadesi arastirilmistir.
Birlikte ifade edilen VP2 / 6 / 4'ün 3. gün ekstraktlari, anti - VP2 ve VP4 serumu (Sekil 9). VP6 ifadesi daha önce belirlendigi gibi çok yüksek olmus, ancak VP2 ve VP4 ifadesi, çok zayif olan bandin 100 kDa isaretinde görüldügü gibi çok düsük olmustur. Bu, VP6'nin asiri ifadesinde daha fazla konak hücre kaynaklarinin kullanilmasina, dolayisiyla VP2 ve / veya VP4 için daha az kaynagin birakilmasina neden olan birlikte ifade edilmeye atfedilebilir. Saptanan bandin hem VP2 hem de VP4 ya da 2 proteinden biri olup olmadigini belirlemek de kolay olmamistir. 130 kDa'nin üzerinde görünen bant, dimerize VP6 proteinleri olabilir. 55 kDa isaretinde görünen bant büyük ihtimalle bol bitki enzimi Rubisco'dur.
Protein partikülleri ve bir araya getirilmis RLP'Ieri kontrol etmek için sitoplazmayla ifade edilen VP6'nin yani sira birlikte ifade edilen VP2 / 6 ve VP2 / 6/4 üzerinde transmisyon elektron mikroskobu analizi gerçeklestirilmistir (Sekil 10). Bu ayni zamanda VP2 ve / veya VP4'ün basariyla birlikte ifade edildigini belirlemistir. Tek basina ifade edildiginde VP6, Sekil 10b'deki okla gösterildigi gibi protein kiliflarini olusturmak üzere bir araya gelir. VP2 ilavesi üzerine partiküller, RLP'leri olusturmak üzere toplanmistir (Sekil 10c). VP2, diger proteinlerin bir araya getirilmesine ve sonunda tam bir rotavirüs yapisinin olusturulmasina olanak saglayan iskele proteini gibi davranir. VP6, VP2'ye baglanmistir, ancak birlikte ifade edilen VP2 / 6 / 4'de VP4 yapilarini belirlemek hala kolay degildir. Sekil 10d'deki elektron mikrografi sadece saf birlesmis VP2 / 6 partikülleri olabilir. Bununla birlikte, proteinlerin bir araya gelmesi sirasinda VP4 VP6'ya baglanir ve bunun VP7 baglanmadan önce gerçeklestigi gösterilmistir. Muhtemelen bu VP4 yapilari kararli degildir ve elektronik mikroskopi hazirlama prosedürleri sirasinda RLP yapisindan düsebilir.
VP2 I 6 ve VP2 I 6 I 4'ün sükroz gradyan saflastirmasi VP2 / 6 ve VP2 / 6/4, % 10 ila % 60 sükroz arasinda degisen bir sükroz gradyani üzerinde saflastirilmistir (Sekil 11a). Tüplerin her birinin tabanindan 2 mI'Iik fraksiyonlar toplanmis ve hangi fraksiyonlarin proteinleri içerdigini belirlemek için fare anti - VP6 antikoru ve / veya tavuk anti - VP2 ve VP4 serumu ile problanmistir. VP2 / 6 için proteinler fraksiyon 16 ve 17'de bulunmustur, çünkü bunlar blot üzerinde VP6 proteini için pozitiftir (Sekil 11b). Tavuk anti - VP2 ve VP4 serum ile VP2 / 6/4 blot analizi, tüm fraksiyonlar boyunca pozitif sonuçlar vermistir. Bu, tavuk serumu tarafindan yüksek düzeyde arka plan proteini tespiti sonucunda meydana gelmis olabilir. Bununla birlikte, noktalarin yogunlugu, Sekil 11c'de görüldügü gibi, muhtemelen bu fraksiyonlarda ilgili proteinlerin daha yüksek konsantrasyonundan dolayi fraksiyon 17 ve 18'de en yüksek olmustur.
Bu sonuçlar bir araya getirildiginde (Sekil 11b ve 110), rotavirüs proteinlerinin 16 ila arasindaki fraksiyonlarda oldugu görülmüstür.
Fraksiyonlarin Western Blot ve Coomassie boyalari VP2 ve VP6 proteinlerinin mevcudiyetini 13 ila 20 arasindaki fraksiyonlarda dogrulamak için birlikte ifade edilen VP2 / 6'nin bir western blot ve SDS - PAGE analizi yapilmistir. Fare anti - VP6 antikoru ile problanan VP6 proteini için Western blot analizi, 16 ila 20 arasindaki fraksiyonlarda pozitif olmustur (Sekil 12a, alt ok ve Sekil 120). Tavuk anti - VP2 serumu ile problanan VP2 proteini, fraksiyon 17 ila 20'de tespit edilmistir (Sekil 12a, üst ok). VP2'nin geçmis birlikte ifade çalismalarindaki VP6'dan daha az ifade ettigi gösterilmistir ve bu Sekil 1Za'da gösterilmistir, burada VP2 protein bantlari VP6'ya kiyasla daha düsük bir yogunluga sahiptir.
Onceden nokta blotlar tarafindan VP6 proteinini içerdigi tespit edilen, birlikte ifade edilen VP2 / 6'nin fraksiyonlari 16 ve 17 (Sekil 11b) bir SDS - PAGE jeli üzerinde elektroforezlenmistir. VP2 I 6 ham protein konsantrasyonunu belirlemek için bilinen bir konsantrasyonda bir protein, SF9 böcek hücresi ile ifade edilen VP6 (O. 91 mg / ml) dahil edilmistir (Sekil 11b ve c). Bu, bir Syngene Gel Dokümantasyon Sistemi kullanilarak ham protein bandinin (serit ham etiketli) yogunluk taramasiyla yapilmistir ve dolayisiyla yaprak maddesinin kilogrami basina VP2 / 6 miktarini belirlememize izin vermistir. Protein verimi yaklasik 1. 54 g / kg taze agirlik (FW) olarak bulunmustur. 1. 1 gram saflastirilmis RLP, 1 gram bitki materyalinden (1. 1 g / kg) elde edilmistir.
VP2 I 6'nin Toplam Çözünebilir Protein Analizi Toplam çözünebilir protein (TSP), VP2 / 6 proteininin göreli miktarlarini belirlemek için birlikte ifade edilen VP2 / 6 fraksiyonlari üzerinde tespit edilmistir (Sekil 13).
Protein konsantrasyonlari, bir IgG standardi kullanilarak sirasiyla, fraksiyon 17 ve 18 fraksiyonlarda VP2 / 6'ya karsilik gelen protein bantlari, bir Syngene Gel Belgeleme Sisteminde yogunluk taramasiyla hesaplanmis ve sirasiyla yaklasik 0. 108 mg / ml ve 0. 202 mg / ml olarak bulunmustur.
Böylece, 17 ve 18 fraksiyonlarindaki VP2 / 6 için TSP her ikisi için de yaklasik % 20 olmustur. Sükroz kolonundaki RLP'Ierin çogunun% 15 - 25 sükroz arasinda bulundugu bulunmustur; bu degerler 15 ila yaklasik 20 fraksiyonlarina karsilik gelir ve grafigin aniden zirveye çiktigi ve daha sonra düstügü kaydedilir. Ekstrakttaki çesitli malzemelerin yogunlugundaki farkliliklar, ayristirmayi ve böylece ilgilenilen proteinleri saflastirmayi saglamistir. Coomassie mavisi ile boyanan SDS - PAGE jelleri, proteinlerin nispeten saf oldugunu gösteren tek belirgin bir bant göstermistir (Sekil Saflastirilmis VP2 / 6 TEM'i Saflastirilmis VP2 / 6 fraksiyonlari birlikte toplanmis ve bir transmisyon elektron mikroskopu üzerinde incelemeden önce sükrozu uzaklastirmak için yüksek tuzlu PBS içinde diyalize tabi tutulmustur. TEM, safligi belirlemek ve saflastirma prosedüründen sonra RLP'Ierin saglam kaldigini kontrol etmek için yapilmistir. Sekil 15'ten görülebilecegi gibi, çogunlukla konak hücrenin ürünlerinden olusan arka plan materyalinin çogu (Sekil 10b, C ve d) çikarilmis ve geriye RLP'Ier kalmistir. RLP'Ierin çogu saglam kalmis ama bazilari muhtemelen EM izgarasindaki kosullar nedeniyle deformasyonun bir sonucu olarak seklini kaybetmis gibi görünmüstür.
N. benthamiana'da rotavirüs yapisal proteinlerin ifadesinin ön analizi Bu ön analiz, örnek bir konak ifade sistemi olarak N. benthamiana yapraklarinda rotavirüs yapisal proteini VP2 (SEK ID NO: 1), VP4 (SEK ID NO: 2), VP6 (SEK ID NO: 3) ve VP7'nin (SEK lD NO: 4) ifadesine odaklanmistir. Burada seçilen rotavirüs türü agirlikli olarak Güney Afrika ve diger Sahra alti bölgelerinde dolasan bir G9 P [6] susudur. Bu susu hedef alan bir RLP asisi, Sahra alti Afrika'daki hastalik yükünü hafifletmeye yardimci olacaktir.
Bu analizde agrobakteri aracili geçici bir ifade sistemi kullanilmistir. Transgenik ifadenin tersine, geçici ifade, konagin kromozomunda rotavirüs kapsid proteini genlerinin entegrasyonu olmaksizin nispeten kisa sürede proteinlerin hizli ifadesine izin verir. Çogu protein, N. benthamiana yapraklarinda rekombinant agrobakteri infiltrasyonunun 3. gününe kadar belirlenebilir miktarlara kadar ifade edilmis ve biriktirilmistir. Asagida gösterildigi gibi, tablo 2'de detaylandirildigi üzere, bitki yapragi hücre bölmelerinde VP2, VP4 ve VPö'yi içeren birkaç rotavirüs yapisal proteininin basarili sekilde sentezlenmesi gbzlenmistir: Tablo 2: Çesitli yaprak hücresi bölmelerinde rotavirüs VP proteinlerinin ifadesi Yaprak Hücresi Bblmesi 0 = ifade yok 1 = ifade edilmis Kapsid Apoplast Kloroplast Sitoplazm ER VP2 0 1 1 1 VP4 1 O 1 1 VP6 1 1 1 1 VP7 O 0 0 O Glikoprotein VP7'nin ifadesi muhtemelen bitki hücreleri üzerindeki toksik etkileri nedeniyle gözlemlenmemistir. Bu 'ön çalismada, dogal sinyal peptidini içeren bir VP7'nin kullanildigi belirtilmelidir. Ayrica, birlikte ifa denemeleri sirasinda 3. günde infiltrasyon denenmistir. Bu, proteinin ifade edilip edilmedigini ve bundan hemen sonra RLP'leri olusturmak için VP2 ve VP6 ile birlesip birlesmediklerini görmek için denenmistir. Bu çalismada gözlemlendigi gibi rekombinant VP7'nin toksik dogasi daha Önce tarif edilmistir (Williams ve dig., 1995; McCorquodale, 1987; Arias ve dig., 1986).
Transgenik patateslerde geçmis VP7 ifade çalismalari bildirilmistir (Li ve dig., 2006; VP7 kullanmis ve Li ve dig. ve Wu ve dig. (Li ve dig., 2006; Wu ve dig., 2003) insan grubu A G1 VP7 kullanmistir. Burada tarif edilen sonuçta insan rotavirüsü G9 VP7 kullanilmistir.
VP2 ifade edilmis ve uygun cDNA'yi klonlayamadigimiz için apoplast hariç tüm bölmeleri hedef almistir ve zaman kisitlamalari diger yapilarla devam etmeden önce yalnizca birkaç denemeye izin vermistir. VP2'nin ifade seviyelerinin tüm bölmelerde önemli ölçüde düsük oldugu kaydedilmistir. Saldana ve dig., 2006, tarafindan aktarilan geçmis bir çalismada bitki hücrelerinde mRNA'nin tespit edilmesine ragmen, bitkide ifade için optimize edilmis dizisine sahip bir VP2'nin ifade edilmesinin imkansiz oldugu sonucuna varilmistir. Bununla birlikte, sentetik DNA kullanarak, bunu domates bitki hücrelerinde ifade etmeyi basarmislardir. VP2 ifadesindeki zorlugun nedeni büyük olasilikla uygun olmayan mRNA translasyonunun sonucu veya mRNA'nin bitki hücrelerini istikrarsizlastiran bazi dizi motifleri içermesinden kaynaklanmaktadir (Kawaguchi ve Bailey-Serres, 2002). VPö'ya kiyasla VP2'nin düsük ifade seviyelerinin kaniti, hem bitki hem de böcek hücresi ifadesi çalismalarinda görülmüstür, Mena ve dig. (2006), Saldana ve dig. (2006), Vieira ve ark. (2005) ve Labbe ve dig. (1991).
Virion yapisinin yüzeyinde sivri uçlar olusturan dis kapsid proteini olan VP4, sitoplazmada, ER ve apoplastta birikim için ifade edilmis ve hedeflenmistir.
Kloroplastlarda hiçbir protein birikimi tespit edilmemistir. VP2 için gözlemlendigi gibi, VP4 için protein ifade seviyeleri, western blotlar üzerinde VP6'da görülenden daha düsük olmustur. Protein, VP5 ve VP8 olmak üzere iki proteinde sonuçlanan bir tripsin bölünme bölgesine sahiptir. N. benthamiana yapraklarindaki lokal tripsin, üretildiginde proteinlerin bir kismini parçalayarak, belirlenmis bölmelerde birikmis ve bozulmamis VP4 konsantrasyonlarinin düsük olmasina neden olabilir. Proteinin büyük bir nötrlestirici antijen oldugu gösterilmis, ancak asi gelistirme için tüm proteini klonlamak için birkaç girisim yapilmistir (Khodabandehloo ve dig., 2009; Mahajan ve dig., 1995; Nishikawa ve dig., 1989). Bununla birlikte, böcek-hücresi ve maya ifadesi sisteminde VP4'ün ya VPS ya da VP8 alt birimlerinin ifadesini gösteren birkaç çalisma yapilmistir (Andres ve dig., 2006; Favacho ve dig., 2006; Kovacs-Nolan ve dig., 2001). Bugüne kadar, bu çalisma, bitki ifade sistemindeki tüm proteinin ifadesini gösteren ilk çalismayi temsil etmektedir.
VP6, bu bölmedeki 1. günden 7. güne kadar protein birikimiyle sitoplazmada gözlenen, asiri ifadeyle birlikte tüm bölmelerde ifade edilmistir. Bu, proteaz aktivitesinin ve gen susturulmasinin, sitoplazmada yabanci proteinin birikimini azalttigini veya engelledigini öneren bazi literatür kaynaklarina aykiridir (Fischer ve dig., 2004). Buna ek olarak, dogru pH kosullari göz Önüne alindiginda, VP6'nin, çalismamizda görülen partiküllere çok benzeyen boru seklinde veya helezon seklindeki partikülleri olusturmak için kendiliginden bir araya geldigi bilinmektedir (Sekil 9b) (Estes ve dig., 1987). VP6, viral çekirdegin yaklasik % 50'sini olusturur ve bu nedenle bir rotavir'us asisinin gelistirilmesinde temel bir antijendir. Yukarida elde edilen sonuç, sitoplazmada VP2, VP6 ve VP4"L'in birlikte ifade edilmesini daha fazla arastirmamizi sagladi.
Sitoplazmada birlikte ifade edildiginde, VP2 ve VP6, RLP'leri olusturmak üzere toplanmistir. Geçici ifade sisteminden 1. 27-1. 54 g / kg FW arasinda çok yüksek protein verimleri gözlenmistir. Sükroz kolonu 'üzerinde saflastirildiginda, tutulan VP'lerin miktari 1. 1 g / kg FW olmustur. 1 g / kg FW. Bu verim, 1. 5 g / kg FW'ye kadar bir verimle N. benthamiana'da geçici bir ifade sistemi kullanan IgG antikorunun (2006), simdiye kadar transgenik domates bitkilerinde rotavir'üs VP2 ve VP6'yi basariyla ve yaklasik % 1 toplam çözünür protein seviyesine ulasarak birlikte ifade eden tek grup olmustur. Böcek hücresi ifade sisteminde VP2 / 6'nin birlesmesi ayrica rotavir'us enfeksiyonuna karsi koruyucu bagisiklik temin ettigi gösterilmistir (Zhou ve dig., Saldana ve dig., 2006). Dolayisiyla, bitki ifade sisteminde 'ürettigimiz VP2 / 6 RLP'ler, bir alt birim rotavir't'is asisi gelistirme için uygun adaydir.
VP2 / 6/4 de birlikte ifade edilmis ve tespit edilmistir. Birlikte ifade edilen proteinlerin toplam protein absorbans okumasinda görülen ilk zirve (Sekil 14, fraksiyon 16), VP2 / 6 / 4"L`i bir araya getirebilir, ancak bu fraksiyonun bir TEM altinda incelenmesinde hiçbir RLP tespit edilmemistir. Gözlemlenen protein piki, VP4 monomerlerinin veya ilgili VP5 ve VP8 alt birimlerinin birikiminden kaynaklanabilir. Ikinci bir zirve (fraksiyon 18), bir TEM altinda incelendiginde, VP2 / 6 örneginde görülen RLP yapilarina çok benzer RLP yapilari sergilemistir. Bununla birlikte, Crawford ve digerleri, daha önce, Ayni gözlemi hepsi normal TEM altinda benzeyen VP2 / 6/7 RLP'ler, VP 2/6/RLP'ler ve VP2 / 6 RLP'ler için biz de yaptik.
Yapilar Rotavirüs A WA susundan gelen VP2'yi kodlayan optimize edilmis bir dizi, asagidaki PCR-esasli yöntem kullanilarak Plasto_pr0 / P19 / Plasto_ter ifade kasetini içeren bir plasmid içinde 2X358-CPMV-HT-NOS ifade sistemi içine klonlanmistir. VP2 kodlama dizisini içeren bir fragment, optimize VP2 gen dizisi (SEK lD NO: 45) sablon olarak kullanilarak, lF-WA_VP2 (opt). 51 +30 (Sekil 17Ai SEK ID NO: 21) ve lF- WA_VP2(opt). s primerleri kullanilarak amplifiye edilmistir. Dizi optimizasyonu için, VP2 protein dizisi (Genbank eriisim numarasi CAA33074) geri translate edilmis ve insan kodon kullanimi, GC içerik ve mRNA yapisi için optimize edilmistir. PCR ürünü In-Fusion klonlama sistemi (Clontech, Mountain View, CA) kullanilarak 2X35S/CPMV-HT/NOS ifade sisteminde klonlanmistir. Yapi numarasi 1191 (Sekil 17C) Sacll ve Stul restriksiyon enzimleri ile sindirilmis ve dogrusallastirilmis plazmid ln-Fusion birlesme tepkimesi için kullanilmistir. Yapi numarasi 1191, ilgili genlerin CPMV HT-tabanli ifade kasetinde gen promotoru ve sonlandiricisi altinda susturmanin TBSV P19 baskilayicisinin birlikte ifadesi için bir gen yapisini içerir. Omurga pCAMBlA ikili plazmiddir ve soldan saga t-DNA sinirlarinda dizi Sekil 18'de sunulur (SEK lD NO: 23). Elde edilen yapiya . Rotavir'üs A susu WA'dan gelen VP2'nin amino asit dizisi Sekil 20'de sunulmustur (SEK lD NO: 25). Plazmid 1710'un bir gösterimi Sekil 21'de sunulur.
B- + Replikaz amplifikasyon sistemine klonlanmasi (yapi numarasi 1711) Rotavirüs A WA susundan gelen VP2'yi kodlayan optimize edilmis bir dizi, asagidaki PCR-esasli yöntem kullanilarak Plast0_pro / P19 / Plasto_ter ifade kasetini içeren bir plasmid içinde BeYDV(m)+replikaz amplifikasyon sistemini içeren 2X35S-CPMV-HT- NOS içine klonlanmistir. VP2 kodlama dizisini içeren bir fragment, optimize VP2 gen dizisi (SEK ID NO: 45) sablon olarak kullanilarak, IF-WA_VP2 (opt). 51 +30 (Sekil 17A, SEK ID NO: 21) ve lF-WA_VP2(opt). s primerleri kullanilarak amplifiye edilmistir. Dizi optimizasyonu için, VP2 protein dizisi (Genbank eriisim numarasi CAA33074) geri translate edilmis ve insan kodon kullanimi, GC içerik ve mRNA yapisi için optimize edilmistir. PCR ürünü In-Fusion klonlama sistemi (Clontech, Mountain View, CA) kullanilarak 2X358/CPMV-HT/NOS ifade kasetinde BeYDV(m) amplifikasyon sistemine klonlanmistir. Yapi 193 (Sekil 22A) Sacll ve Stul restriksiyon enzimleri ile sindirilmis ve dogrusallastirilmis plazmid CPMV HT-tabanli ifade kasetinde BeYDV(m) amplifikasyon sistemine “In Fusion" klonlama için amaçlanan bir alici plazmiddir. Ayrica, yonca plastosiyanin gen promotor'u ve sonlandiricisi altinda susturmanin TBSV P19 baskilayicisinin birlikte ifadesi için bir gen yapisini içerir. Omurga pCAMBIA ikili plazmiddir ve soldan saga t- DNA sinirlarinda dizi Sekil . Elde edilen yapiya 1711 numarasi verilmistir (Sekil 23, SEK ID NO: 27). Rotavir'üs A susu WA'dan gelen VP2'nin amino asit dizisi Sekil 20'de sunulmustur (SEK lD NO: 25). Plazmid 1711'un bir gösterimi Sekil 24'de sunulur.
Rotavir'üs A WA susundan gelen VP6'yi kodlayan optimize edilmis bir dizi, asagidaki PCR-esasli yöntem kullanilarak Plasto_pr0 / P19 / Plast0_ter ifade kasetini içeren bir plasmid içinde 2X358-CPMV-HT-NOS ifade sistemi içine klonlanmistir. VP6 kodlama dizisini içeren bir fragment, optimize VP6 gen dizisi (SEK lD NO: 46) sablon olarak kullanilarak, lF-WA_VP6 (opt). 31 +30 (Sekil 25A, SEK ID NO: 28) ve lF- WA_VP6(opt). s primerleri kullanilarak amplifiye edilmistir. Dizi optimizasyonu için, VP6 protein dizisi (Genbank erisim numarasi AAA47311) geri translate edilmis ve insan kodon kullanimi, GC içerik ve mRNA yapisi için optimize edilmistir. PCR 'ürünü In-Fusion klonlama sistemi (Clontech, Mountain View, CA) kullanilarak 2X358/CPMV-HT/NOS ifade sisteminde klonlanmistir. Yapi numarasi 1191 (Sekil 17C) Sacll ve Stul restriksiyon enzimleri ile sindirilmis ve dogrusallastirilmis plazmid In-Fusion birlesme tepkimesi için kullanilmistir. Yapi numarasi 1191, ilgili genlerin CPMV HT-tabanli ifade kasetinde gen promotörü ve sonlandiricisi altinda susturmanin TBSV P19 baskilayicisinin birlikte ifadesi için bir gen yapisini içerir. Omurga pCAMBlA ikili plazmiddir ve soldan saga t-DNA sinirlarinda dizi Sekil 18'de sunulur (SEK lD NO: 23). Elde edilen yapiya . Rotavirüs A susu WA'dan gelen VP6'nin amino asit dizisi Sekil 26'de sunulmustur (SEK lD NO: 31). Plazmid 1713'ün bir gösterimi Sekil 27'de sunulur. amplifikasyon sistemine klonlanmasi (yapi numarasi 1714) Rotaviri'is A WA susundan gelen VP6'yi kodlayan optimize edilmis bir dizi, asagidaki PCR-esasli yontem kullanilarak Plasto_pro / P19 / Plasto_ter ifade kasetini içeren bir plasmid içinde BeYDV(m)+replikaz amplifikasyon sistemini içeren 2X358-CPMV-HT- NOS içine klonlanmistir. VP6 kodlama dizisini içeren bir fragment, optimize VP6 gen dizisi (SEK ID NO: 46) sablon olarak kullanilarak, IF-WA_VP6 (opt). 81 +30 (Sekil 25A, SEK ID NO: 28) ve lF-WA_VP6(opt). s primerleri kullanilarak amplifiye edilmistir. Dizi optimizasyonu için, VP6 protein dizisi (Genbank erisim numarasi AAA47311) geri translate edilmis ve insan kodon kullanimi, GC içerik ve mRNA yapisi için optimize edilmistir. PCR ürünü In-Fusion klonlama sistemi (Clontech, Mountain View, CA) kullanilarak 2X358/CPMV-HT/NOS ifade kasetinde BeYDV(m) amplifikasyon sistemine klonlanmistir. Yapi 193 (Sekil 22A) Sacll ve Stul restriksiyon enzimleri ile sindirilmis ve dogrusallastirilmis plazmid CPMV HT-tabanli ifade kasetinde BeYDV(m) amplifikasyon sistemine "In Fusion" klonlama için amaçlanan bir alici plazmiddir. Ayrica, yonca plastosiyanin gen promotör'u ve sonlandiricisi altinda susturmanin TBSV P19 baskilayicisinin birlikte ifadesi için bir gen yapisini içerir. Omurga pCAMBIA ikili plazmiddir ve soldan saga t- DNA sinirlarinda dizi Sekil 2ZB'de sunulur (SEK ID NO:26). Elde edilen yapiya 1714 numarasi verilmistir (Sekil 28, SEK ID NO: 32). Rotavir'üs A susu WA'dan gelen VP6'nin amino asit dizisi Sekil 26'de sunulmustur (SEK lD NO: 31). Plazmid 1714'un bir gösterimi Sekil 29'de sunulur. kodlayan optimize edilmis bir dizi, asagidaki PCR-esasli yöntem kullanilarak Plasto_pr0 / P19 / Plast0_ter ifade kasetini içeren bir plasmid içinde 2X3SS-CPMV- HT-NOS içine klonlanmistir. VP4 kodlama dizisini içeren bir fragment, optimize VP4 gen dizisi (SEK ID NO: 47) sablon olarak kullanilarak, lF-Rtx_VP4(opt). s1+3c (Sekil 3OA, SEK ID NO: 33) ve IF-Rtx_VP4(opt). s primerleri kullanilarak amplifiye edilmistir. Dizi optimizasyonu için, VP4 protein dizisi (Genbank erisim numarasi AEX30660) geri translate edilmis ve insan kodon kullanimi, GC içerik ve mRNA yapisi için optimize edilmistir. PCR 'ürünü In-Fusion klonlama sistemi (Clontech, Mountain View, CA) kullanilarak 2X3SS/CPMV-HT/NOS ifade kasetinde klonlanmistir. Yapi numarasi Sacll ve Stul restriksiyon enzimleri ile sindirilmis ve dogrusallastirilmis plazmid In-Fusion birlesme tepkimesi için kullanilmistir. Yapi numarasi 1191, ilgili genlerin CPMV HT- tabanli ifade kasetinde "In Fusion" klonlama için amaçlanan bir alici plazmiddir.
Ayrica, yonca plastosiyanin gen promotör'u ve sonlandiricisi altinda susturmanin TBSV P19 baskilayicisinin birlikte ifadesi için bir gen yapisini içerir. Omurga pCAMBIA ikili plazmiddir ve soldan saga t-DNA sinirlarinda dizi Sekil 18'de sunulur (SEK lD NO: 23). Elde edilen yapiya 1730 numarasi verilmistir (Sekil 31, SEK ID NO: amino asit dizisi bir Sekil 32'de sunulur (SEK lD NO: 36). Plazmid 1730'un bir gösterimi Sekil 33A'da sunulur.
E- + Replikaz amplifikasvon sistemine klonlanmasi (yapi numarasi 1731) kodlayan optimize edilmis bir dizi, asagidaki PCR-esasli yöntem kullanilarak Plasto_pro / P19 / Plasto_ter ifade kasetini içeren bir plasmid içinde BeYDV(m)+replikaz amplifikasyon sistemini içeren 2X358-CPMV-HT-NOS içine klonlanmistir. VP4 kodlama dizisini içeren bir fragment, optimize VP4 gen dizisi (SEK NO: 33) ve lF-Rtx_VP4(opt). s primerleri kullanilarak amplifiye edilmistir. Dizi optimizasyonu için, VP4 protein dizisi (Genbank erisim numarasi AEX30660) geri translate edilmis ve insan kodon kullanimi, GC içerik ve mRNA yapisi için optimize edilmistir. PCR ürünü 2X358/CPMV- içine klonlanmistir. amplifikasyon sistemine klonlanmistir. Yapi 193 (Sekil 22A) SaCIl ve Stul restriksiyon enzimleri ile sindirilmis ve dogrusallastirilmis plazmid ln-Fusion birlesme tepkimesi için kullanilmistir. Yapi numarasi amplifikasyon sistemine "In Fusion" klonlama için amaçlanan bir alici plazmiddir.
Ayrica, yonca plastosiyanin gen promotör'u ve sonlandiricisi altinda susturmanin TBSV P19 baskilayicisinin birlikte ifadesi için bir gen yapisini içerir. Omurga pCAMBIA ikili plazmiddir ve soldan saga t-DNA sinirlarinda dizi Sekil 22B'de sunulur (SEK lD NO: 26). Elde edilen yapiya 1731 numarasi verilmistir (Sekil 31, SEK ID NO: amino asit dizisi bir Sekil 32'de sunulur (SEK lD NO: 36). Plazmid 1731'un bir gösterimi Sekil 3138'de sunulur. dogal sinyal peptiti ile kodlayan optimize edilmis bir dizi, asagidaki PCR-esasli y'ontem kullanilarak Plasto_pro / P19 / Plasto_ter ifade kasetini içeren bir plasmid içinde 2X358-CPMV-HT-NOS ifade sistemi içine klonlanmistir. VP7 kodlama dizisini içeren bir fragment, optimize VP7 gen dizisi (SEK ID NO: 54) sablon olarak kullanilarak, IF-Rtx_VP7(opt). s. sl-4r (Sekil 34B, SEK ID NO: 38) primerleri kullanilarak amplifiye edilmistir. Dizi optimizasyonu için, VP7 protein dizisi (Genbank erisim numarasi AEX30682) geri translate edilmis ve insan kodon kullanimi, GC içerik ve mRNA yapisi için optimize edilmistir. PCR ürünü ln-Fusion klonlama sistemi (Clontech, Mountain View, CA) kullanilarak 2X35S/CPMV-HT/NOS ifade sisteminde klonlanmistir. Yapi numarasi 1191 (Sekil 17C) Sacll ve Stul restriksiyon enzimleri ile sindirilmis ve dogrusallastirilmis plazmid In-Fusion birlesme tepkimesi için kullanilmistir. Yapi numarasi 1191, ilgili genlerin CPMV HT-tabanli ifade kasetinde "ln Fusion" klonlama için amaçlanan bir alici plazmiddir. Ayrica, yonca plastosiyanin gen promotörü ve sonlandiricisi altinda susturmanin TBSV P19 baskilayicisinin birlikte ifadesi için bir gen yapisini içerir. Omurga pCAMBIA ikili plazmiddir ve soldan saga t-DNA sinirlarinda dizi Sekil 18'de sunulur (SEK ID NO: 23). Elde edilen yapiya 1733 numarasi verilmistir (Sekil 34C, SEK lD NO: 24). Rotavir'üs A asisi ABD/Rotarix- (SEK ID NO: 39). Plazmid 1733'un bir gösterimi Sekil 36'da sunulur. dogal sinyal peptidinin kesik bir versiyonu ile kodlayan optimize edilmis bir dizi, asagidaki PCR-esasli y'ontem kullanilarak Plasto_pro / P19 / Plasto_ter ifade kasetini içeren bir plasmid içinde 2X35S-CPMV-HT-NOS ifade sistemi içine klonlanmistir.
VP7 kodlama dizisini içeren bir fragment, optimize VP7 gen dizisi (Sekil 44C'den nt s. sl-4r (Sekil 44B, SEK lD NO: 56) primerleri kullanilarak amplifiye edilmistir. Dizi optimizasyonu için, VP7 protein dizisi (Genbank erisim numarasi AEX30682) geri translate edilmis ve insan kodori kullanimi, GC içerik ve mRNA yapisi için optimize edilmistir. PCR ürünü In-Fusion klonlama sistemi (Clontech, Mountain View, CA) kullanilarak 2X358/CPMV-HT/NOS ifade sisteminde klonlanmistir. Yapi numarasi 1191 (Sekil 17C) Sacll ve Stul restriksiyon enzimleri ile sindirilmis ve dogrusallastirilmis plazmid ln-Fusion birlesme tepkimesi Için kullanilmistir. Yapi numarasi 1191, ilgili genlerin CPMV HT-tabanli ifade kasetinde "ln Fusion" klonlama için amaçlanan bir alici plazmiddir. Ayrica, yonca plastosiyanin gen promotör'u ve sonlandiricisi altinda susturmanin TBSV P19 baskilayicisinin birlikte ifadesi için bir gen yapisini içerir. Omurga pCAMBlA ikili plazmiddir ve soldan saga t-DNA sinirlarinda dizi Sekil 18'de sunulur (SEK ID NO: 23). Elde edilen yapiya .
Rotavir'us A asisi ABD/Rotarix-A41CBOSZA/1988/G1P1A [8] susundan gelen, kesik sinyal peptidine sahip VP7'nin amino asit dizisi Sekil 44E'de sunulur (SEK ID NO: 59). Plazmid 1734'un bir gösterimi Sekil 44F'de sunulur.
G-+RepIikaz amplifikasvon sistemine klonlanmasi (yapi numarasi 1735) kodlayan bir dizi, asagidaki PCR-esasli yöntem kullanilarak Plasto_pro / P19 / Plasto_ter ifade kasetini içeren bir plasmid içinde 2X35S-CPMV-HT-PDlSP-NOS ifade sistemi içine klonlanmistir. Dogal tip sinyal peptidi olmaksizin VP7 kodlama dizisini içeren bir fragment, optimize VP7 gen dizisi (SEK lD NO: 54) sablon olarak kullanilarak, lF-Rtx_VP7(opt). 32 +4c (Sekil 37A, SEK ID NO: 40) ve lF- Rtx_VP7(opt). sl-4r (Sekil 34B, SEK ID NO: 38) primerleri kullanilarak amplifiye edilmistir. Dizi optimizasyonu için, VP7 protein dizisi (Genbank erisim numarasi AEX30682) geri translate edilmis ve insan kodon kullanimi, GC içerik ve mRNA yapisi için optimize edilmistir. PCR 'ürünü In-Fusion klonlama sistemi (Clontech, Mountain View, CA) kullanilarak 2X358/CPMV-HT/NOS ifade sisteminde yonca PDl sinyal peptidi ile çerçeve içinde klonlanmistir. Yapi 1192 (Sekil 38AA) Sacll ve Stul restriksiyon enzimleri ile sindirilmis ve dogrusallastirilmis plazmid ln-Fusion birlesme tepkimesi için kullanilmistir. Yapi numarasi 1191, ilgili genlerin bir CPMV HT-tabanli ifade kasetinde bir yonca PDI sinyal peptidi ile çerçeve içinde "In Fusion" klonlamasi için amaçlanan bir alici plazmiddir. Ayrica, yonca plastosiyanin gen promotörü ve sonlandiricisi altinda susturmanin TBSV P19 baskilayicisinin birlikte ifadesi için bir gen yapisini içerir. Omurga pCAMBIA ikili plazmiddir ve soldan saga t-DNA sinirlarinda dizi Sekil 39'de sunulur (SEK ID NO: 41). Elde edilen yapiya 1735 numarasi verilmistir (Sekil 40, SEK ID NO: 42). Rotaviri'is A asisi ABD/Rotarix- Tablo 3. RLP'lerin üretimi için sentezlenen genlerin açiklamasi.
SEQ ID No Antijen K'öken susu Dizi t'ür'i'i * Açiklanan sekil 47 VP4 Rotarix Optimize edilmis 31 B 50 VP4 SA11 Dogal tip 43A 51 VP4 SA11 Optimize edilmis 438 54 VP7 Rotarix Optimize edilmis 34E 53 VP7 SA11 Dogal tip 43D 52 VP7 SA11 Optimize edilmis 430 * Optimize edilmis diziler, tercih edilen insan kodon kullanimi lehine ve GC içerigi artirmak için modifiye edilmistir Tablo 4. RLP'lerin üretimi için bir araya gelen ve test edilen yapilarin açiklamasi.
Ifade Amplifikasyon Sinyal Antijen Gen SEQ ID Yapi sistemi sistemi peptidi'r (sus) *1 PCR için kullanilan numarasi CPMV HT - - [Optimize] RVA (WA)SEK lD NO: SEK ID NO: SEK ID NO: SEK ID NO: SEK ID NO: SEK ID NO: SEK ID NO: 54 1733 CPMV HT - TrSp [optimize] RVA (Rtx)SEK ID NO: 54 1734 CPMV HT - SpPDI [optimize] RVA (Rtx)SEK ID NO: 54 1735 CPMV HT BeYDV (m) + rep WtSp RVA (Rtx) VP7 SEK ID NO: 54 1736 CPMV HT BeYDV (m) + rep TrSp RVA (Rtx) VP7 SEK ID NO: 54 1737 CPMV HT BeYDV (m) + rep SpPDI [optimize] RVA (Rtx)SEK ID NO: 54 1738 CPMV HT - - RVA (SA11)VP4 SEK ID NO: 50 1760 CPMV HT BeYDV (m) + rep - RVA (SA11)VP4 SEK ID NO: 50 1761 CPMV HT - - RVA (SA11)VP4 SEK ID NO: 51 1770 CPMV HT BeYDV (m) + rep - RVA (SA11)VP4 SEK ID NO: 53 1771 CPMV HT - WtSp RVA (SA11)VP7 SEK ID NO: 53 1763 CPMV HT - TrSp RVA (SA11)VP7 SEK ID NO: 53 1764 CPMV HT - SpPDI RVA (SA11)VP7 SEK ID NO: 53 1765 CPMV HT BeYDV (m) + rep WtSp RVA (SA11)VP7 SEK ID NO: 53 1766 CPMV HT BeYDV (m) + rep TrSp RVA (SA11)VP7 SEK ID NO: 53 1767 CPMV HT BeYDV (m) + rep SpPDI RVA (SA11)VP7 SEK ID NO: 53 1768 CPMV HT - WtSp RVA (SA11)VP7 SEK ID NO: 52 1773 CPMV HT - TrSp RVA (SA11) VP7 SEK ID NO: 54 1774 CPMV HT - SpPDI RVA (SA11) VP7 1775 CPMVPH' BeYDV(m)+rep MhSp RVA(SA11)VP7 1776 CPMVPH' BeYDV(nû+rep “Sp RVA(SAH)VP7 1777 CPMV HT BeYDV (m) + rep SpPDI RVA (SA11) VP7 SEQ ID NO 52 1778 1' WtSp: Dogal tip sinyal peptit, SpPDI: Yonca protein disülfür izomeraz geninden klonlanan bitki kökenli sinyal peptidi, TrSp: kesik, dogal tip sinyal peptidi, WtSp (M30) içinde 2. lVlet'de TrSp ba Ian ici. * [îptirçrliize]i dizinin kodon kullanimi, GC içerigi ve RNA yapisina dayanarak optimize edilmis olmasi anlamina gelir.
Gen yapilarinin kurulmasi ve agrobakteri dönüsümü 1710, 1713, Agropacterium 1730 ve 1734 plazmidleri dahil olmak üzere tüm plazmidler, (AGL1; ATCC, Manassas, VA elektroporasyon ile dönüstürmek için kullanilmistir (Mattanovich ve dig. , 1989, tu mefaciens'i Nucleic Acid Res. 17: 6747) alternatif olarak, CaCl2 ile hazirlanmis kompetent hücreleri kullanilarak isi soku (XU ve dig. , 2008, Plant Methods 4) uygulanabilir.
Olusturulan A. tumefaciens suslarindaki plazmidlerin bütünlügü, restriksiyon haritasi ile teyit edilmistir. Verilen bir ikili plazmid ile dbnüstürülen A. tumefaciens susu, AGLI / dönüstürülmüs A. tumefaciens susu "AGLI / 1710" olarak adlandirilir.
Bitki biyokütlesinin hazirlanmasi, inokülum, agroinfiltrasyon ve hasat Nicotiana benthamiana bitkileri, ticari bir turba yosun substrati ile dolu alanlarda tohumlardan yetistirilmistir. Bitkilerin 16/8 isik periyodu altinda sera içinde ve 25 °C gündüz / 20 “C gece sicaklik rejiminde büyümelerine izin verilmistir. Ekimden üç hafta sonra bireysel bitkiler alinmis, kaplara nakledilmis ve ayni çevre kosullari altinda üç hafta boyunca serada yetismeye birakilmistir.
Her bir yapi ile transfekte edilen agrobakteri, bitki kökenli bir LB ortaminda morfolino) etansülfonik asit (MES) ve 50 mg / ml kanamisin pH5. 6 ile takviye edilmistir. Agrobakteri süspansiyonlari, her yapi için uygun bir orana ulasmak için karistirilmis ve infiltrasyon ortami (10 mM MgCl2 ve 10 mM MES pH 5. 6) ile 2. 5X OD600'a getirilmistir. A. tumefaciens süspansiyonlari gece boyunca 4 °C'de saklanmistir. Infiltrasyon gününde, kültür partileri, 2. 5 süspansiyon hacmi içinde infiltrasyon ortami ile seyreltilmis ve kullanimdan önce isinmaya birakilmistir. N. benthamiana'nin bütün bitkileri bakteri süspansiyonuna hava geçirmez bir paslanmaz çelik tank içinde 20 - 40 Torr'luk bir vakum altinda 2 dakika boyunca bas asagi yerlestirilmistir. lnfiltrasyonun ardindan, bitkiler hasata kadar 3 - 12 günlük bir inkübasyon süresi için seraya geri gönderilmistir. Hasat edilen biyokütle partiküllerin saflastirilmasi için kullanilana kadar (- 80 ° C) dondurulmustur.
Rotavirüs benzeri partiküllerin ekstraksiyonu ve saflastirilmasi Proteinler dondurulmus biyokütleden 3 hacim ekstraksiyon tamponu (TNC: 10 mM Tris pH 7. 4, ile bir karistiricida mekanik ekstraksiyon yoluyla ekstrakte edilmistir. Sablon tamponu: 10 mM tris - HCl, 100 mM NaCl pH=8.
OBuIamaç, büyük kalintilari uzaklastirmak için büyük bir gözenekli naylon filtreden geçirilmis ve 5000 °C'de 5 dakika süreyle 4 °C'de santrifüje tabi tutulmustur. Ust faz toplanmis ve ilave kalintilari gidermek için yeniden 5000 g'de 30 dakika (4 ° C) santrifüj edilmistir. Ust faz derin süzülmüs ve ultra - süzülmüstür ve süzüntü, rotavirüs benzeri partikülleri konsantre hale getirmek için 75 000 g'de 20 dakika (4 ° C) santrifüj edilmistir. Partikülleri içeren pelet, 1/12 hacim TNC içinde yeniden süspanse edilmis ve çözünmeyen maddeler 5 dakika süreyle 5000 9'de bir santrifüjle uzaklastirilmistir. Ust faz, iyodiksanol yogunluk gradyanlarina yüklenmeden önce Miracloth üzerinde süzülmüstür.
Yogunluk gradyanli santrifüjleme asagidaki sekilde gerçeklestirilmistir. % 5 ila % 45 iodiksanol kademesindeki gradyanlar içeren tüpler hazirlanmis ve rotavirüs benzeri partikülleri ihtiva eden, süzülen ekstraktlar üzerine yüklenmistir. Gradyanlar 120 000 9'de 4 saat (4 ° C) santrifüje tabi tutulmustur. Santrifüjden sonra, asagidan yukariya kadar 1 ml fraksiyonlar toplanmis ve Coomassie boyali SDS - PAGE ve Western blot ile analiz edilmistir. Daha ileri analiz için seçilen fraksiyonlar için iyodiksanolü uzaklastirmak üzere, seçilen fraksiyonlar, 20 dakika boyunca 75 000 g'de santrifüjlenmis (4 °C) ve pelet haline gelen partiküller taze TNC tamponda yeniden süspanse edilmistir.
SDS - PAGE ve immünoblotlama Protein konsantrasyonlari, BCA protein analizi (Pierce Biochemicals, Rockport IL) ile belirlenmistir. Proteinler, indirgeyici ya da indirgeyici olmayan kosullar altinda SDS - PAGE ile ayrilmis ve Coomassie Blue ile boyanmistir. Boyanmis jeller taranmis ve densitometri analizi, Image.] Software (NIH) kullanilarak gerçeklestirilmistir. lmmünoblotlama için, elektroforezlenmis proteinler, polivinilen diflorid (PVDF) zarlarina elektro - transfer edilmistir (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, yagsiz süt ve % 0. 1 Tween - 20 ile 16 - 18 saat süreyle 4 °C'de bloke edilmistir. lmmünoblotlama, % O. 1 TBS - Tween 20'de % 2 yagsiz süt içinde 2 mg / ml'lik uygun bir antikorla (Tablo 5) inkübe edilerek gerçeklestirilmistir. Kemilüminesans tespiti için kullanilan ikinci antikorlar Tablo 5'de belirtildigi gibi % 0.1 TBS - Tween 20'de% 2 yagsiz süt içinde seyreltildigi belirtilen antikorlardir. lmmünoreaktif kompleksler, substrat olarak Iuminol kullanilarak kemilüminesans ile tespit edilmistir (Roche Diagnostics Corporation). insan lgG antikorunun yabanturpu peroksidaz - enzim konjügasyonu, EZ - Link Plus® Aktive Edilmis Peroksidaz konjügasyon kiti (Pierce, Rockford, lL) kullanilarak gerçeklestirilmistir.
Tablo 5: Rotavirüs antijenlerinin imünoblotlanmasi için elektroforez kosullari, antikorlar ve seyreltmeler.
Rotavirüs Elektroforez Primer antikor Seyreltmelkincil Seyreltme Antijen durumu Antikor VP2 Azalan Tavsan poliklonal anti -1 mg/ml Keçi anti - tavsan1: 10 000 VP2 (Profesör Koki (JIR 111 - 035 - Taniguchi tarafindan 144) saglanmistir) VP7 (Profesör Koki (JIR 111 - 035 - Taniguchi tarafindan 144) saglanmistir) Taniguchi) Anti - VP4 Enzim baglantili immüno sorbent analizi (ELISA) U tabanli 96 - kuyucuklu mikrotitre plakalari, 10 mM PBS pH7. 4 (fosfat - tamponlu bir fare monoklonal anti - VP4'ü (Profesör Koki Taniguchi tarafindan saglanmistir) ile kaplanmistir. Inkübasyondan sonra, plakalar üç sefer % 0. 1 Tween - 20 ihtiva eden edilmistir. . Bloke etme adimindan sonra, plakalar üç sefer % 10 Tween - 20 ihtiva eden 10 mM PBS pH7. 4, 1 M NaCl ile yikanmistir. Numuneler ilave edilmis ve plakalar 37 °C'de 1 saat inkübe edilmistir. Plaka daha sonra 3 kez % 10 Tween - 20 yikanmistir. Kalan tüm yikama adimlari için yikama tamponu ayni kalmis ve üçüncü yikama sirasinda plakalar, yikama çözeltisini tamamen bosaltmadan önce oda sicakliginda 10 dakika inkübe edilmistir. % O. 1 Tween - 20 ihtiva eden 10 mM PBS saglanmistir) büyütülen tavsan poliklonal antikoru ilave edilmis ve plakalar 37 °C'de 1 oraninda seyreltilmis rotavirüse karsi (Profesör Taniguchi tarafindan saat inkübe edilmistir. Plakalar daha sonra 3 kez yikanmis ve % 0. 1 Tween - 20 BSA ile 1: 5000 oraninda seyreltilmis yaban turpu peroksidaz konjuge keçi anti - tavsan antikoru (111 - 035 - 144, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) ilave edilmis ve plakalar 37 °C'de 1 saat inkübe edilmistir. Plakalar 3 kez yikanmistir. Nihai yikamalardan sonra, plakalar oda sicakliginda 20 dakika SureBlue TMB peroksidaz substrati (KPL, Gaithersburg, MD) ile inkübe edilmistir. Reaksiyon IN HCI ilave edilerek durdurulmus ve A450 degerleri, bir Multiskan Ascent plaka okuyucu (Thermo Scientific, Waltham, MA) kullanilarak ölçülmüstür.
VP2 ve VP6 içeren rotavirüs benzeri partiküllerin üretimi.
VP2 ve VP6 içeren rotavirüs benzeri partiküller, Nicotiana bentha - miana'daki geçici karisimini içeren agrobakteri asi ile agro - infiltre edilmis ve hasattan önce 7 gün inkübe edilmistir. Rotavirüs benzeri partiküller, malzemeler ve yöntemler bölümünde tarif edilen metodoloji kullanilarak biyokütleden saflastirilmistir. Saflastirilmis ekstraktlarin iyodiksanol yogunluk gradyani üzerinde santrifüj edilmesinden sonra, tüpün tabanindan ilk on fraksiyon Coomassie boyali SDS - PAGE ile analiz edilmistir.
Sekil 45A'da gösterildigi gibi, rotavirüs antijenleri (VP2 ve VP6) agirlikli olarak, rotavirüs benzeri partiküllerin bulunmasi beklenen bir konsantrasyon olan, iyodiksanol konsantrasyonunun yaklasik % 35 oldugu yogunluk gradyaninin fraksiyon 2 ve 3'ünde bulunmustur. Bu fraksiyonlarda bitki proteinleri tarafindan çok az kirlenme görülmüstür. Fraksiyonlarin anti - rotavirüs hiperimmün tavsan serumu ve poliklonal tavsan anti - VP2 antikorlariyla yapilan Western blot analizi, yogunluk gradyan fraksiyonlarinda VP2 ve VP6'nin kimligini dogrulamistir (Sekil 458 ve 45C).
Fraksiyonlar 2 ve 3 bir araya toplanmis ve iyodiksanol yüksek hizli santrifüjleme ve yeniden süspanse etmeyle uzaklastirilmis ve saflastirilmis partiküller, VP2 ve VP6'nin rotavirüs partikülüne benzeyen partiküller halinde toplanmasini onaylamak için kriyo elektron mikroskobu analizine (Nanolmaging Services Inc. , La Jolla, CA) gönderilmistir. Sekil 49'da (sol panel) gösterildigi gibi, VP2 / VP6 partiüküllerinin cryoEM görüntüleri antijenlerin rotavirüs benzeri partiküllere benzemek üzere dogru bir sekilde toplandigini dogrulamistir.
VP2, VP6 ve VP7 içeren rotavirüs benzeri partiküllerin üretimi.
VP2, VP6 ve VP7 içeren rotavirüs benzeri partiküller, Nicotiana benthamiana'da oraninda bir karisimini içeren agrobakteri asi ile agro - infiltre edilmis ve hasattan önce 7 gün inkübe edilmistir. Rotavirüs benzeri partiküller, malzemeler ve yöntemler bölümünde tarif edilen metodoloji kullanilarak biyokütleden saflastirilmistir.
Saflastirilmis ekstraktlarin iyodiksanol yogunluk gradyani üzerinde santrifüj edilmesinden sonra, tüpün tabanindan ilk on fraksiyon Coomassie boyali SDS - PAGE ile analiz edilmistir. Sekil 46A'da gösterildigi gibi, rotavirüs antijenleri (VP2, VP6 ve VP7) agirlikli olarak, rotavirüs benzeri partiküllerin bulunmasi beklenen bir konsantrasyon olan, iyodiksanol konsantrasyonunun yaklasik % 35 oldugu yogunluk gradyaninin fraksiyon 2 ve 3'ünde bulunmustur. Bu fraksiyonlarda bitki proteinleri tarafindan çok az kirlenme görülmüstür. Fraksiyonlarin anti - rotavirüs hiperimmün tavsan serumu ve poliklonal tavsan anti - VP7 antikorlariyla yapilan Western blot analizi, yogunluk gradyan fraksiyonlarinda VP6 ve VP7'nin kimligini dogrulamistir (Sekil 468 ve 460).
VP2, VP4, VP6 ve VP7 içeren rotavirüs benzeri partiküllerin üretimi.
VP2, VP4, VP6 ve VP7 içeren rotavirüs benzeri partiküller, Nicotiana benthamiana'da AGL1/1734'ün bir 1: 1: 1: 1 oraninda bir karisimini içeren agrobakteri asi ile agro - infiltre edilmis ve hasattan önce 7 gün inkübe edilmistir. Rotavirüs benzeri partiküller, malzemeler ve yöntemler bölümünde tarif edilen metodoloji kullanilarak biyokütleden saflastirilmistir. Saflastirilmis ekstraktlarin iyodiksanol yogunluk gradyani üzerinde santrifüj edilmesinden sonra, tüpün tabanindan ilk on fraksiyon Coomassie boyali SDS - PAGE ile analiz edilmistir. Sekil 47A'da gösterildigi gibi, dört rotavirüs antijeninden üçü (VP2, VP6 ve VP7) görünürdür ve agirlikli olarak, rotavirüs benzeri partiküllerin bulunmasi beklenen bir konsantrasyon olan, iyodiksanol konsantrasyonunun yaklasik % 35 oldugu yogunluk gradyaninin fraksiyon 3'ünde bulunmustur. Bu fraksiyonlarda bitki proteinleri tarafindan çok az kirlenme görülmüstür. Ayni analiz saflastirilmis insan rotavirüs virionu üzerinde yapildiginda, VP4 gözlenemedigi için, Coomassie boyali jel içerisinde VP4'ün saptanabilir seviyede olmamasi beklenmistir. Fraksiyonlarin anti - rotavirüs hiperimmün tavsan serumu ve poliklonal tavsan anti - VP7 antikorlariyla yapilan Western blot analizi, yogunluk gradyan fraksiyonlarinda VP6 ve VP7'nin kimligini dogrulamistir (Sekil 478 ve 470). lyodiksanol, hizli santrifüjleme ve tekrar süspansiyon yoluyla fraksiyon 3'ten uzaklastirilmis ve saflastirilmis partiküller, VP4`ün varliginin teyit edilmesi için ELISA ile analiz edilmistir. Sekil 48'de sunulan sonuçlar, ELISA'nin özellikle VP4'ü VP2 / VP6 içeren negatif kontrol partikülleri olarak tanidigini ve VP7'nin sadece arka plan sinyal seviyesi ile sonuçlandigini göstermektedir. Buna karsilik, VP2, VP4, VP6 ve VP7 antijenlerinden olusan saflastirilmis partiküllerin 3 farkli lotunun analizi, ayni kosullar altinda denendiginde güçlü ve düzgün sinyaller vermistir. Saflastirilmis VP2 / VP4 / VP6 / VP7 RLP'Ieri, dört antijenin rotavir'us partik'üIüne benzeyen partiküller halinde toplandigini onaylamak için kriyo elektron mikroskobu analizine (Nanolmaging Services lnc. , La Jolla, CA) gönderilmistir. Sekil 49'da (sag panel) gösterildigi gibi, VP2NP4/VP6NP7 partiküllerinin cryoEM görüntüleri antijenlerin rotavirüs benzeri partiküllere benzemek 'üzere dogru bir sekilde toplandigini dogrulamistir.

Claims (11)

ISTEMLER
1. Bir bitkide, bir bitki bölümünde veya bitki hücresinde bir rotavirüs benzeri partikül (RLP) üretmek için bir yöntem olup, özelligi; asagidakileri içermesidir: a) VP2, VP6 ve VP7'den birinden seçilen bir birinci rotavirüs yapisal proteinini kodlayan birinci bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli olan, bitki içinde aktif bir birinci düzenleyici bölgeyi içeren birinci bir nükleik asit, VP2, VP6 ve VP7'den birinden seçilen ikinci bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan ikinci bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli olan, bitki içinde aktif bir ikinci düzenleyici bölgeyi içeren ikinci bir nükleik asit ve VP2, VP6 ve VP7'den birinden seçilen üçüncü bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan üçüncü bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli olan, bitki içinde aktif bir üçüncü düzenleyici bölgeyi içeren üçüncü bir nükleik asidin bitkiye, bitkinin bir bölümüne veya bir bitki hücresine yerlestirilmesi, burada VP7'yi kodlayan birinci, ikinci ve üçüncü nükleotit dizisinin kesik bir dogal sinyal peptidini veya bir bitki polipeptidinden gelen dogal olmayan bir sinyal peptidini içermesi ve burada RLP'nin VP2, VP6 ve VP7'yi içermesi; veya a) bir bitkiye, bir bitki bölümüne veya bitki hücresine birinci bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan birinci bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli olan, bitki içinde aktif bir birinci düzenleyici bölgeyi içeren birinci bir nükleik asit, ikinci bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan ikinci bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli olan, bitki içinde aktif bir ikinci düzenleyici bölgeyi içeren ikinci bir nükleik asit ve üçüncü bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan üçüncü bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli olan, bitki içinde aktif bir üçüncü düzenleyici bölgeyi içeren üçüncü bir nükleik asidi içeren bir bitki, bir bitki bölümü veya bitki hücresinin saglanmasini içermesi, burada birinci rotavirüs yapisal proteininin VP2 olmasi, ikinci rotavirüs yapisal proteininin VP6 olmasi ve üçüncü rotavirüs yapisal proteininin VP7 olmasi, burada VP7'nin bir bitki polipeptidinden gelen kesik bir dogal bir sinyal peptidini veya dogal olmayan bir sinyal peptidini içermesi; b) bitki, bir bitki bölümü veya bitki hücresinin birinci, ikinci ve üçüncü nükleik asidin geçici ifadesine izin veren kosullar altinda inkübe edilmesi, böylece RLP'nin üretilmesi, c) bitkinin, bitki bölümünün veya bitki hücresinin hasat edilmesi, ve d) kalsiyum konsantrasyonu 1 mM ila 1000 mM arasinda olmak üzere kalsiyumun varliginda, bitki, bitki bölümü veya bitki hücresinden gelen RLP'lerin ekstrakte edilmesi ve saflastirilmasini Içermesidir.
2. Istem 1'in yöntemi olup, özelligi; bitki içinde aktif bir dördüncü düzenleyici bölgeyi içeren ve dördüncü bir rotavirüs yapisal proteinini kodlayan dördüncü bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli dördüncü bir nükleik asidin a) adimindaki bitkiye, bitkinin bir bölümüne veya bir bitki hücresine yerlestirilmesi ve b) adimindaki bitki, bitkinin bir bölümü veya bitki hücresi inkübe edilirken ifade edilmesi, burada dördüncü rotavirüs yapisal proteininin VP4 olmasidir.
3. Istem 1'in yöntemi olup, özelligi; birinci rotavirüs yapisal proteinin VP2 olmasi, ikinci rotavirüs yapisal proteinin VP6 olmasi ve üçüncü rotavirüs yapisal proteinin VP7 olmasidir.
4. Istem 1'in yöntemi olup, özelligi; bir bitkinin, bir bitki bölümünün veya bitki hücresinin, bitkide aktif olan ve dördüncü bir rotavirüs yapisal proteini kodlayan dördüncü bir nükleotit dizisine islevsel olarak bagli dördüncü bir düzenleyici bölge içeren bir dördüncü nükleik asit ile saglanmasi, burada dördüncü rotavirüs yapisal proteininin VP4 olmasidir.
5. Istem 1 - 4'ten herhangi birinin yöntemi olup, özelligi; birinci, ikinci, üçüncü veya dördüncü nükleotit dizisi veya bunlarin bir kombinasyonunun, bir Cowpea Mozaik Virüsü (CPMV) düzenleyici bölgeye islevsel olarak baglanmasidir.
6. Istem 1 - 4'den herhangi birinin yöntemi olup, özelligi; VP2'yi kodlayan nükleotit dizisinin, SEK ID NO: 13, SEK lD NO: 14 veya SEK lD NO: 45 ile tanimlanan bir nükleotit dizisi ile % 80 ila % 100 özdeslige sahip olmasi, VP6'yi kodlayan nükleotit dizisinin, SEK ID NO: 17, SEK lD NO: 18 veya SEK ID NO: 46 ile tanimlanan bir nükleotit dizisi ile % 80 ila % 100 özdeslige sahip olmasi, VP7'yi tanimlanan bir nükleotit dizisi ile % 80 ila % 100 özdeslige sahip olmasi, VP4'ün SEK özdeslige sahip olmasidir.
7. Istem 1'in yöntemi olup, özelligi; birinci, ikinci ve üçüncü nükleik asidin, bitkiye, bir bitki bölümüne ya da bitki hücresine birinci, ikinci ve üçüncü nükleik asidin 1: 1: 1 oraninda bir karisimini ihtiva eden bir agrobakteri asisi ile agro - infiltrasyon yoluyla verilmesi, burada birinci, ikinci ve üçüncü nükleik asidin bitkide geçici olarak ifade edilmesi ve bitkinin Nicotiana Benthamiana olmasidir.
8. Istem 2'nin yöntemi olup, özelligi; birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü nükleik asidin, bitkiye, bir bitki bölümüne ya da bitki hücresine birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü nükleik asidin 1: 1: 1: 1 oraninda bir karisimini ihtiva eden bir agrobakteri asisi ile agro - infiltrasyon yoluyla verilmesi, burada birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü nükleik asidin bitkide geçici olarak ifade edilmesi ve bitkinin Nicotiana Benthamiana olmasidir.
9. istem 1 - 5'den herhangi birinin yöntemi olup, özelligi; nükleotit dizisinin kodon kullaniminin, tercihen insan kodon kullanimi, arttirilmis GC içerigi veya bunlarin bir kombinasyonu olarak ayarlanmasidir.
10. istem 1 veya 4'ün yöntemi olup, özelligi; birinci, ikinci ve üçüncü nükleotit dizisinin bir translasyon artirici elemana islevsel olarak bagli olmasidir.
11. Istem 1'in yöntemi olup, özelligi; dogal olmayan sinyal peptidinin bir alfalfa protein disülfid izomeraz (PDI) sinyal peptidi olmasidir.
TR2018/02091T 2012-05-11 2013-05-10 Bitkilerde rotavirüs - benzeri partikül üretimi. TR201802091T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261646058P 2012-05-11 2012-05-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201802091T4 true TR201802091T4 (tr) 2018-03-21

Family

ID=49550032

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/02091T TR201802091T4 (tr) 2012-05-11 2013-05-10 Bitkilerde rotavirüs - benzeri partikül üretimi.

Country Status (24)

Country Link
US (1) US20150216961A1 (tr)
EP (3) EP3321358A3 (tr)
JP (2) JP6435259B2 (tr)
KR (1) KR102162118B1 (tr)
CN (2) CN104284978B (tr)
AU (2) AU2013258849B2 (tr)
BR (1) BR112014027736A2 (tr)
CA (2) CA2942279A1 (tr)
DK (2) DK2847324T3 (tr)
EA (1) EA032089B1 (tr)
ES (2) ES2658987T3 (tr)
HK (1) HK1206059A1 (tr)
HU (2) HUE035753T2 (tr)
IL (1) IL235290B (tr)
MX (2) MX356314B (tr)
MY (1) MY183566A (tr)
NO (1) NO2853853T3 (tr)
PH (2) PH12014502373A1 (tr)
PL (2) PL3597757T3 (tr)
PT (2) PT3597757T (tr)
SG (1) SG11201406996VA (tr)
TR (1) TR201802091T4 (tr)
TW (2) TWI614339B (tr)
WO (1) WO2013166609A1 (tr)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015128397A (ja) * 2014-01-08 2015-07-16 国立大学法人広島大学 亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、および、当該遺伝子を用いた出芽酵母の選択的培養方法
CA2974438A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Medicago Inc. Rotavirus-like particle production in plants
ES2898701T3 (es) * 2015-05-21 2022-03-08 Univ Xiamen Proteína VP4 de rotavirus truncada y aplicación de la misma
US10548970B2 (en) * 2015-10-05 2020-02-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Human rotavirus G9P[6] strain and use as a vaccine
WO2017081110A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Curevac Ag Rotavirus vaccines
WO2017182958A1 (en) * 2016-04-19 2017-10-26 Csir Plant-produced chimaeric orbivirus vlps
GB201617480D0 (en) * 2016-10-14 2016-11-30 University Of Cape Town Production of soluble HIV envelope trimers in planta
WO2020168424A1 (en) * 2019-02-19 2020-08-27 Medicago Inc. Rotavirus vp7 fusion proteins and rotavirus-like particles comprising them
CN112251461B (zh) * 2020-10-22 2022-08-23 植链(上海)生物科技有限公司 一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用
WO2022182224A1 (en) * 2021-02-23 2022-09-01 Universiti Malaya A process for producing pharmaceutical or other heterologous protein via agrobacterium-mediated transformation of mucuna bracteata
CN114875047A (zh) * 2022-05-27 2022-08-09 江苏三仪生物工程有限公司 一种优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白vp4的重组表达及应用

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5428147A (en) 1983-04-15 1995-06-27 Mycogen Plant Science, Inc. Octopine T-DNA promoters
EP0152295B1 (en) 1984-02-09 1991-03-20 Royal Children's Hospital Research Foundation Live attenuated human rotavirus vaccine and preparation thereof
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US4636385A (en) 1985-02-15 1987-01-13 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Vaccine, method for its preparation, and use thereof in vaccinating humans against rotavirus infection
US4751080A (en) 1985-08-26 1988-06-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against rotavirus diseases
US4704275A (en) 1985-08-26 1987-11-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against rotavirus diseases
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US4927628A (en) 1987-09-21 1990-05-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against rotavirus diseases and method of preparing same
KR0171434B1 (ko) 1990-11-16 1999-02-01 윌리엄 케이. 슈버트 인체 로타바이러스, 백신 및 방법
WO2000020557A2 (en) 1998-10-07 2000-04-13 Boyce Institute For Plant Research At Cornell University Gemini virus vectors for gene expression in plants
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
WO2001059070A1 (en) * 2000-02-12 2001-08-16 Kim Won Yong Production method of recombinant rotavirus structural proteins and vaccine composition
KR100422158B1 (ko) * 2000-02-12 2004-03-10 (주)익스플로젠 재조합 로타바이러스의 구성체 단백질의 생산방법 및 이방법으로 생산된 백신 조성물
FR2806087B1 (fr) * 2000-03-07 2002-10-18 Agronomique Inst Nat Rech Particules pseudovirales de rotavirus et leur utilisation pour vectoriser des proteines ou des acides nucleiques
JP4698144B2 (ja) 2003-07-31 2011-06-08 富士通セミコンダクター株式会社 半導体装置の製造方法
CN1624141A (zh) * 2003-12-03 2005-06-08 中国农业科学院生物技术研究所 提高轮状病毒vp7或vp4植物表达含量的方法及产品
CN100569939C (zh) * 2004-02-26 2009-12-16 中国人民解放军免疫学研究所 表达人源轮状病毒外壳蛋白的转基因植物产品及其预防婴幼儿腹泻的用途
EP1885173A4 (en) * 2005-05-27 2009-02-18 Univ Central Florida CHLOROPLASTE DEVELOPED FOR THE EXPRESSION OF PHARMACEUTICAL PROTEINS
AU2006309286A1 (en) * 2005-06-01 2007-05-10 Dow Global Technologies, Inc. Production of multivalent virus like particles
CN1772902A (zh) * 2005-09-30 2006-05-17 中国农业大学 轮状病毒vp6蛋白的一种编码基因及其应用
EP1969001A2 (en) * 2005-11-22 2008-09-17 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Norovirus and sapovirus antigens
CA2615372A1 (en) * 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
EP2238253B1 (en) * 2007-11-27 2012-09-12 Medicago Inc. Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
US9169296B2 (en) * 2008-05-29 2015-10-27 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Expression and assembly of human group C rotavirus-like particles and uses thereof
AU2009285667B2 (en) 2008-08-27 2015-05-28 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University A DNA replicon system for high-level rapid production of vaccines and monoclonal antibody therapeutics in plants
AU2011325827B2 (en) * 2010-11-04 2016-08-04 Medicago Inc. Plant expression system

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018171058A (ja) 2018-11-08
IL235290A0 (en) 2014-12-31
EP3321358A3 (en) 2018-06-20
CA2942279A1 (en) 2013-11-14
SG11201406996VA (en) 2014-11-27
HK1206059A1 (en) 2015-12-31
DK2847324T3 (en) 2018-02-12
PL3597757T3 (pl) 2021-05-31
AU2013258849B2 (en) 2018-12-13
WO2013166609A1 (en) 2013-11-14
EP2847324B1 (en) 2018-01-03
EP3597757A1 (en) 2020-01-22
CN104284978A (zh) 2015-01-14
TWI614339B (zh) 2018-02-11
HUE035753T2 (hu) 2018-08-28
MX2018006186A (es) 2020-11-12
IL235290B (en) 2021-03-25
CA2872803A1 (en) 2013-11-14
AU2013258849A1 (en) 2014-11-13
TW201825681A (zh) 2018-07-16
CA2872803C (en) 2016-10-11
TWI705139B (zh) 2020-09-21
EP2847324A1 (en) 2015-03-18
PH12014502373B1 (en) 2015-01-12
MX2014013671A (es) 2015-05-07
CN108570456A (zh) 2018-09-25
KR102162118B1 (ko) 2020-10-07
HUE052625T2 (hu) 2021-05-28
BR112014027736A2 (pt) 2017-10-10
PT2847324T (pt) 2018-03-02
MY183566A (en) 2021-02-26
ES2845698T3 (es) 2021-07-27
NO2853853T3 (tr) 2018-04-21
ES2658987T3 (es) 2018-03-13
KR20150013713A (ko) 2015-02-05
US20150216961A1 (en) 2015-08-06
CN104284978B (zh) 2018-02-02
TW201346028A (zh) 2013-11-16
EP2847324A4 (en) 2016-03-23
EA201492014A1 (ru) 2015-02-27
JP2015517304A (ja) 2015-06-22
PL2847324T3 (pl) 2018-06-29
EP3597757B1 (en) 2020-10-28
AU2019201694A1 (en) 2019-04-04
DK3597757T3 (da) 2021-01-11
EA032089B1 (ru) 2019-04-30
MX356314B (es) 2018-05-23
PH12014502373A1 (en) 2015-01-12
JP6435259B2 (ja) 2018-12-05
EP3321358A2 (en) 2018-05-16
PH12018501452A1 (en) 2019-03-11
PT3597757T (pt) 2020-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201802091T4 (tr) Bitkilerde rotavirüs - benzeri partikül üretimi.
US9017987B2 (en) Expression of proteins in plants
US20210393765A1 (en) Rotavirus vp7 fusion proteins and rotavirus-like particles comprising them
US20190345454A1 (en) Rotavirus-like particle production in plants