JP2022513056A - 植物体でウイルス様粒子を発現する組み換えベクター及びこれを利用したサーコウイルス様粒子を含むワクチン組成物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(S1)本発明の組み換えベクターを利用して植物体を形質転換する段階;
(S2)前記(S1)段階で得られた形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合して植物体混合液を製造する段階;
(S3)前記(S2)段階で収得した混合液をアガロースで充填されたカラムに注入して、PCV2カプシドタンパク質にポリヒスチジンタグが連結された組み換えタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階;
(S4)洗浄溶液をカラムに注入して洗浄する段階;及び
(S5)溶出溶液をカラムに注入してアガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階。
(S1)本発明の組み換えベクターを利用して植物体を形質転換する段階;
(S2)前記(S1)段階で得られた形質転換植物体からPCV2カプシドタンパク質を分離精製する段階;
(S3)前記(S2)段階で収得したPCV2カプシドタンパク質でウイルス様粒子を製造する段階;及び
(S4)前記(S3)段階で収得したウイルス様粒子を含むワクチン組成物を製造する段階。
(S1)本発明の組み換えベクターを利用して植物体を形質転換する段階;
(S2)前記(S1)段階で得られた形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合して植物体混合液を製造する段階;
(S3)前記(S2)段階で収得した混合液をアガロースで充填されたカラムに注入して、PCV2カプシドタンパク質にポリヒスチジンタグが連結された組み換えタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階;
(S4)洗浄溶液をカラムに注入して洗浄する段階;及び
(S5)溶出溶液をカラムに注入してアガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階。
(S1)本発明の組み換えベクターを利用して植物体を形質転換する段階;
(S2)前記(S1)段階で得られた形質転換植物体からPCV2カプシドタンパク質を分離精製する段階;
(S3)前記(S2)段階で収得したPCV2カプシドタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階;及び
(S4)前記(S3)段階で収得したウイルス様粒子を含むワクチン組成物を製造する段階。
(S1)本発明の組み換えベクターを利用して植物体を形質転換する段階;
(S2)前記(S1)段階で得られた形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合して植物体混合液を製造する段階;
(S3)前記(S2)段階で収得した混合液をアガロースで充填されたカラムに注入して、PCV2カプシドタンパク質にポリヒスチジンタグが連結された組み換えタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階;
(S4)洗浄溶液をカラムに注入して洗浄する段階;及び
(S5)溶出溶液をカラムに注入してアガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階。
(S1)本発明の組み換えベクターを利用して植物体を形質転換する段階;
(S2)前記(S1)段階で得られた形質転換植物体からPCV2カプシドタンパク質を分離精製する段階;
(S3)前記(S2)段階で収得したPCV2カプシドタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階;及び
(S4)前記(S3)段階で収得したウイルス様粒子を含むワクチン組成物を製造する段階。
図1の切断地図に示されたように、植物体で組み換えPCV2カプシドタンパク質を発現させることができるように組み換えした植物体発現用ベクターを作製した。
(2.1.植物発現ベクターの一過性発現)
前記実施例1で準備した植物発現ベクターをアグロバクテリウムLBA4404菌株にエレクトロポレーションを利用して形質転換させた。形質転換されたアグロバクテリウムを5mLのYEP液体培地(酵母抽出物10g、ペプトン10g、NaCl 5g、カナマイシン50mg/L、リファンピシン25mg/L)で28℃の条件で16時間の間振とう培養した後、1次培養液1mlを50mlの新しいYEP培地に接種して28℃の条件で6時間の間振とう培養した。このように培養されたアグロバクテリウムは、遠心分離(7,000rpm、4℃、5分)して収集した後、600nmの波長で吸光度(O.D)の値が1.0になるようにインフィルトレーション(Infiltration)バッファー[10mM MES(pH 5.7)、10mM MgCl2、200μMアセトシリンゴン]に懸濁させた。アグロバクテリウム懸濁液は、注射針を除去した注射器を利用してニコティアナ・ベンサミアナ葉の裏面に注入する方法でアグロインフィルトレーション(Agro-infiltration)を行った。
前記実施例2.1で準備した植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、水溶性画分(Supernatant;S)にあるタンパク質とペレット(Pellet;P)画分にあるタンパク質、水溶性画分とペンニッを全部含む画分(Total;T)をそれぞれ分離してウェスタンブロッティングで組み換えPCV2カプシドタンパク質の発現を確認した。より詳しくは、各画分30μLをSDS試料バッファーと混合した後に加熱した。そして、10%SDS-PAGEゲルに電気泳動してサイズ別に分離したタンパク質バンドを確認し、これをPVDF膜に移動させた後に、5%スキムミルクを利用してブロッキング段階を経た後に、ポリヒスチジンと反応する抗体を結合させ、ECL溶液を製造社で提供する方法により処理して組み換えPCV2カプシドタンパク質の発現を確認した。
前記実施例2.1で準備した組み換えPCV2カプシドタンパク質が発現するニコティアナ・ベンサミアナ葉50gにタンパク質抽出溶液[50mM Tris-HCl(pH 8.2)、300mM NaCl、10mM imidazole、0.5% Triton X-100]100mLを添加し、ブレンダーで組織を破砕した後、13,000rpmで4℃で30分間遠心分離して、タンパク質抽出液を回収した。前記タンパク質抽出液から組み換えPCV2カプシドタンパク質の分離精製のためにNi-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid)アガロースレジンで充填されたカラムでアフィニティークロマトグラフィーを実施した。前記カラムにレジンを10mL充填した後、100mLの洗浄溶液[50mM Tris-HCl(pH8.2)、300M NaCl、10mM イミダゾール]で平衡化させた。回収したタンパク質抽出液をカラムに適用し、平衡化させた後、洗浄溶液100mLを流してレジンを洗浄し、溶出溶液[50mM Tris-HCl(pH8.2)、300mM NaCl、250mM イミダゾール]で組み換えPCV2カプシドタンパク質を溶出した。組み換えPCV2カプシドタンパク質が含まれた溶出溶液は、30kDaの大きさのフィルターを使用してウイルス様粒子を作るための緩衝溶液[50mM Tris-HCl(pH7.4)、300mM NaCl、100mM アルギニン、最終pHは7.2に調節する]でバッファー交換及び濃縮を実施した。分離精製された組み換えPCV2カプシドタンパク質は、電気泳動(SDS-PAGE)後、クマシー染色法を通じて確認した(図3参照)。
組み換えPCV2カプシドタンパク質は、自己集合を通じて組み換えPCV2ウイルス様粒子を形成する。したがって、組み換えPCV2ウイルス様粒子を分離するために、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。サイズ排除クロマトグラフィー(HiLoad 16/600 SuperdexTM 200pg)は、溶出溶液[50mM Tris-Cl(pH7.4)、300mM NaCl、0.5mM EDTA]を利用して平衡化した。実施例3で得られた分離精製された組み換えPCV2カプシドタンパク質が含まれた緩衝溶液5mgをサイズ排除クロマトグラフィーカラムにローディングし、サイズ別に分離して、一番目のピーク画分を獲得した。ウイルス様粒子の形成の有無を確認するために獲得した画分は、Native-PAGE電気泳動を行った。また、分離精製した組み換えPCV2カプシドタンパク質の精製度を確認するためにSDS-PAGE電気泳動を行った。前記のサイズ排除クロマトグラフィーで分離した結果とNative-PAGE及びSDS-PAGE電気泳動結果は、図4に示した。
サイズ排除クロマトグラフィーで分離した一番目と二番目の画分に含まれた組み換えPCV2aカプシドタンパク質を最終濃度が100nMになるように溶出溶液[50mM Tris-Cl(pH7.4)、300mM NaCl、0.5mM EDTA]に希釈してネガティブ染色を行った。5μLのタンパク質溶液をカーボンでコーティングされた銅グリッドで1分間反応させた後、濾過紙を利用してタンパク質溶液を除去し、3次蒸留水で3回洗浄した。この際、カーボンでコーティングされた銅グリッドは、プラズマ(Plasma)とともに1分間反応させて疎水性(hydrophobic)の特性を親水性(hydrophilic)特性に変換して、タンパク質がカーボンに良好に付着するようにする。最終的に1%酢酸ウラニルで1分間反応させてネガティブ染色した後、濾過紙で染色溶液を除去し、常温で12時間乾燥した。準備したグリッドは、透過電子顕微鏡(Tecnai T10、Philips、日本)を使用して20,000倍の倍率でイメージを取得した。
前記実施例5で確認された組み換えPCV2ウイルス様粒子を含む組成物の抗体形成の有無を確認するための実験を進め、動物用医薬品の国家出荷承認検証基準[1-2-04-03豚サーコウイルスtype2遺伝子組み換え不活化ワクチン(PCV2抗体力価試験)]によって進めた。体重300~350gのモルモット9匹を準備して、3匹は対照群、6匹は実験群として、筋肉で1/2頭分を接種し、2週後に2次接種を実施した。ここで、前記対照群は、抗原なしにPBSのみを1ml投与した群を意味し、実験群は、それぞれ50μg及び100μgのPCV2抗原に50%アルミニウムヒドロキシド ゲルを添加した群を意味する。2次接種2週後に3匹の対照群と共に採血して、ELISA kitで抗体価を測定した。吸光度ELISAの測定は、製造会社の試験方法によって行った。抗体形成結果は、図6に示した。
前記実施例5で確認されたPCV2ウイルス様粒子を含む組成物にアルミニウムヒドロキシド(Al(OH)3)アジュバントを添加したワクチン組成物を利用してPCV2中和抗体の形成有無を確認した。実験は、動物用医薬品の国家出荷承認検証基準(1-2-04-03豚サーコウイルス2型遺伝子組み換え不活化ワクチン)によって進めた。体重300~350gのモルモット6匹を準備し、2匹は対照群、4匹は実験群として、実験群には、筋肉で1/2頭分を接種し、2週後に2次接種を実施した。2次接種2週後に2匹の対照群と共に採血して、間接蛍光抗体検査法(Immuno-fluorescence assay)で確認した。ウイルス中和実験の結果は、下記表1に示した。
Claims (25)
- 配列番号1で表示されるアミノ酸配列を含むルビスコトランジットペプチド(RuBisCO transit peptide)をコードするポリヌクレオチド、及び配列番号3又は配列番号5で表示されるアミノ酸配列を含むPCV2(Porcine circovirus type 2)カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、植物体発現用組み換えベクター。
- 前記ルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号2で表示される塩基配列を含み、前記PCV2カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号4又は配列番号6で表示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の植物体発現用組み換えベクター。
- 前記組み換えベクターが、配列番号7で表示されるアミノ酸配列を含むポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の植物体発現用組み換えベクター。
- 前記組み換えベクターが、プロモーターとターミネータとの間に、ルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチド、及びPCV2カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドが順次に連結されていることを特徴とする、請求項3に記載の植物体発現用組み換えベクター。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の組み換えベクターで形質転換された、形質転換植物体。
- 下記の段階を含む、組み換えPCV2カプシドタンパク質の分離精製方法:
(S1)請求項1~4のいずれか一項に記載の組み換えベクターを利用して植物体を形質転換する段階;
(S2)前記(S1)段階で得られた形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合して植物体混合液を製造する段階;
(S3)前記(S2)段階で収得した混合液をアガロースで充填されたカラムに注入して、PCV2カプシドタンパク質にポリヒスチジンタグが連結された組み換えタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階;
(S4)洗浄溶液をカラムに注入して洗浄する段階;及び
(S5)溶出溶液をカラムに注入してアガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階。 - 前記タンパク質抽出緩衝溶液が、10~100mMトリス(Tris)、100~300mM塩化ナトリウム(NaCl)、0.01~0.5%Triton X-100(polyethylene glycol p-(1、1、3、3-tetramethylbutyl)-phenylether)、及び5~300mMイミダゾールを含むことを特徴とする、請求項6に記載の分離精製方法。
- 前記アガロースは、Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid)アガロースであることを特徴とする、請求項6に記載の分離精製方法。
- 前記(S1)段階は、組み換えベクターが導入されたバクテリアを利用して植物体を形質転換することを特徴とする、請求項6に記載の分離精製方法。
- 前記バクテリアは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)であることを特徴とする、請求項9に記載の分離精製方法。
- 下記の段階を含む、ウイルス様粒子を含むワクチン組成物の製造方法:
(S1)請求項1~4のいずれか1項に記載の組み換えベクターを利用して植物体を形質転換する段階;
(S2)前記(S1)段階で得られた形質転換植物体からPCV2カプシドタンパク質を分離精製する段階;
(S3)前記(S2)段階で収得したPCV2カプシドタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階;及び
(S4)前記(S3)段階で収得したウイルス様粒子を含むワクチン組成物を製造する段階。 - 前記ワクチン組成物の製造方法は、アジュバントを添加する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項11に記載の製造方法。
- 前記植物体は、シロイヌナズナ、ダイズ、タバコ、ナス、トウガラシ、ジャガイモ、トマト、ハクサイ、キャベツ、及びレタスよりなる群から選ばれる双子葉植物;又はイネ、ムギ、コムギ、ライムギ、とうもろこし、サトウキビ、エンバク、及びタマネギよりなる群から選ばれる単子葉植物であることを特徴とする請求項11に記載の製造方法。
- 前記(S1)段階は、組み換えベクターが導入されたバクテリアを利用して植物体を形質転換することであることを特徴とする請求項11に記載の製造方法。
- 前記バクテリアは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)であることを特徴とする、請求項14に記載の製造方法。
- 前記(S3)段階は、PCV2カプシドタンパク質が含まれた緩衝溶液のpHを変化させることによってウイルス様粒子を製造することを特徴とする、請求項11に記載の製造方法。
- 前記緩衝溶液は、50~100mMトリス(Tris)、300~1000mM塩化ナトリウム(NaCl)、及び10~100mMアルギニンを含み、pHは6.9~7.5であることを特徴とする、請求項16に記載の製造方法。
- 前記pHは7.2であることを特徴とする、請求項17に記載の製造方法。
- 請求項11に記載の製造方法により製造された、ワクチン組成物。
- 前記ワクチン組成物は、アジュバントをさらに含むことを特徴とする、請求項19に記載のワクチン組成物。
- 前記アジュバントは、アラム(alum)であることを特徴とする、請求項20に記載のワクチン組成物。
- 請求項19に記載のワクチン組成物に含まれているPCV2ウイルス様粒子であり、
前記粒子は、サイズ排除クロマトグラフィーで分子量が1,800kDa以上、2,200kDa以下であり、Native-PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)で分子量が669kDa以上で示され、ネガティブ染色法で染色後、透過電子顕微鏡で観察したとき、直径20~30nmの間の球状又は環状であることを特徴とする、PCV2ウイルス様粒子。 - 請求項11に記載の製造方法により製造されたワクチン組成物を個体に投与して豚サーコウイルス感染症を予防する方法。
- 請求項11に記載の製造方法により製造されたワクチン組成物の豚サーコウイルス感染症の予防用途。
- 請求項11に記載の製造方法により製造された組成物の豚サーコウイルス感染症の予防に用いられるワクチンを生産するための用途。
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KR102438044B1 (ko) * | 2020-06-17 | 2022-09-01 | 대한민국 | 재조합 제2형 돼지써코바이러스 항원 및 이의 용도 |
KR20220122815A (ko) * | 2021-02-25 | 2022-09-05 | 주식회사 바이오앱 | 식물 발현 시스템을 이용한 알팔파 모자이크 바이러스 유사 입자 제조 방법 및 이의 활용 |
WO2023077145A1 (en) * | 2021-11-01 | 2023-05-04 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | A method for production of self-replicating, nucleic acid-loaded, virus-like particles (vlp-na) and the uses thereof |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003010507A2 (en) * | 2001-07-16 | 2003-02-06 | Ahram Biosystems Inc. | System for intracellular process monitoring and in vivo drug screening |
WO2008151215A1 (en) * | 2007-06-04 | 2008-12-11 | Merial Limited | Production of porcine circovirus proteins in plants |
US20140322267A1 (en) * | 2013-04-30 | 2014-10-30 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Orf2 protein of pcv2 subtype a (pcv2a) for use in cross-protection |
JP2017205109A (ja) * | 2016-05-20 | 2017-11-24 | ポステック アカデミー−インダストリー ファウンデーション | RbcS融合タンパク質を利用して植物から目的タンパク質を高発現する方法及び目的タンパク質発現植物体を利用した医療用タンパク質の経口投与用組成物の製造方法 |
WO2018050872A1 (en) * | 2016-09-16 | 2018-03-22 | Leukocare Ag | A novel method for obtaining efficient viral vector-based compositions for vaccination or gene therapy |
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DK2094872T4 (da) * | 2006-12-15 | 2020-05-18 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Behandling af anti-PCV2-antistofseropositive svin med PCV2-antigen |
US20090017064A1 (en) * | 2007-07-10 | 2009-01-15 | Wyeth | Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus |
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---|---|---|---|---|
WO2003010507A2 (en) * | 2001-07-16 | 2003-02-06 | Ahram Biosystems Inc. | System for intracellular process monitoring and in vivo drug screening |
WO2008151215A1 (en) * | 2007-06-04 | 2008-12-11 | Merial Limited | Production of porcine circovirus proteins in plants |
US20140322267A1 (en) * | 2013-04-30 | 2014-10-30 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Orf2 protein of pcv2 subtype a (pcv2a) for use in cross-protection |
JP2017205109A (ja) * | 2016-05-20 | 2017-11-24 | ポステック アカデミー−インダストリー ファウンデーション | RbcS融合タンパク質を利用して植物から目的タンパク質を高発現する方法及び目的タンパク質発現植物体を利用した医療用タンパク質の経口投与用組成物の製造方法 |
WO2018050872A1 (en) * | 2016-09-16 | 2018-03-22 | Leukocare Ag | A novel method for obtaining efficient viral vector-based compositions for vaccination or gene therapy |
WO2018180568A1 (ja) * | 2017-03-27 | 2018-10-04 | 学校法人 新潟科学技術学園 | 変異型2-デオキシ-シロ-イノソース合成酵素 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
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CHOI J. ET AL.: "Definition: Capsid protein", DATABASE UNIPROT[ONLINE], JPN6022021846, 25 April 2018 (2018-04-25), ISSN: 0004787850 * |
KIM, S. ET AL.: "Arabidopsis thaliana Rubisco small subunit transit peptide increases the accumulation of Thermotoga", TRANSGENIC RES, vol. 19, JPN6022021844, 2010, pages 489 - 497, ISSN: 0004787849 * |
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