KR20170131207A - RbcS 융합 단백질을 이용하여 식물로부터 목적 단백질을　고발현하는 방법 및 목적 단백질 발현 식물체를 이용한 의료용 단백질의 경구투여용 조성물의 제조 방법 - Google Patents

RbcS 융합 단백질을 이용하여 식물로부터 목적 단백질을　고발현하는 방법 및 목적 단백질 발현 식물체를 이용한 의료용 단백질의 경구투여용 조성물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본 발명은 목적 단백질을 발현하는 식물, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법을 제공한다. 본 발명에 따른 식물세포를 이용한 목적 단백질 발현 시스템은 종래 식물세포 배양의 문제점을 해소하며, 바이오의약 단백질을 포함하는 목적 단백질을 대량생산함으로써, 식물유래 단백질 제품 등의 바이오 의약품의 상업화를 가능하게 하여 매우 효과적이다.

Description

RbcS 융합 단백질을 이용하여 식물로부터 목적 단백질을　고발현하는 방법 및 목적 단백질 발현 식물체를 이용한 의료용 단백질의 경구투여용 조성물의 제조 방법{A method of high level expression of target proteins as RbcS fusion proteins and method of preparing composition for oral delivery of the RbcS-fused target proteins expressed in leaf tissues as protein drugs}
본 발명은 목적 단백질을 발현하는 식물, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 엽록체에 존재하는 단백질인 RbcS(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit)에 목적 단백질을 융합하고 이를 식물체에 도입하여 대량 생산하는 기술 및 이를 이용한 바이오 의약품 경구투여용 조성물 제조에 관한 것이다.
바이오의약품(biopharmaceutical)이란 생체 내에 존재하는 물질을 의약품으로 사용하는 것을 말하며, 보다 넓은 의미로는 첨단 바이오 기술인 유전자재조합, 세포융합, 세포배양 등 생물공학기술을 기반으로 하여 생산된 의약품으로 정의할 수 있다. 이러한 바이오의약품은 단백질의약품, 치료용 항체, 백신, 유전자치료제 및 세포치료제로 분류된다.
현재 대부분의 재조합 단백질은 동물세포와 곤충세포와 같은 고등세포를 숙주로 이용하거나 효모나 박테리아와 같은 미생물을 통해 생산되고 있다. 그러나 동물세포 배양을 통한 재조합 단백질 생산은 배지가격이 비싸며, 인간에게 감염될 수 있는 바이러스 오염 가능성이 높고, 소 혈청유래 단백질의 유입 가능성으로 인해 이들을 제거하기 위한 별도의 정제공정이 필요하다는 단점이 있다. 또한, 박테리아나 이스트의 경우 재조합 단백질의 대량생산이 용이한 이점이 있는 반면에 단백질 합성 후 변형과정이 전혀 일어나지 않거나 인간과는 많이 달라서 당단백질의 생산에는 적합하지 않다는 문제점이 있다.
이에 최근에 재조합 단백질의 대체생산 시스템으로서 식물세포 배양이 부각되고 있다. 식물세포의 경우 동물 유래 바이러스나 병원균에 감염되지 않을 뿐만 아니라 동물유래 물질 혼입의 우려가 없어 안전한 생산 시스템으로 여겨지고 있다.
하지만, 식물세포 배양은 동물세포를 포함하는 다른 숙주들에 비해 상대적으로 낮은 단백질 발현 수준과 느린 생장속도를 나타낸다. 이에 식물 유래 바이오의약품의 상업화를 위해서 식물체에서 재조합 단백질을 생산하는 경우 도입 유전자의 발현 효율을 높이기 위한 기술 개발이 절실한 실정이다.
한편, 단백질 의약품은 주사 제형으로 인체에 투여하는 것이 가장 널리 사용되고 있으며, 단백질 의약품이 가장 효과적으로 작용할 수 있는 방법이지만, 환자에게 고통을 줄 수 있다는 문제가 있다. 특히 당뇨와 같은 대사성 질환의 경우 오랜 기간 정기적으로 주사를 이용해 투약하기에 환자의 고통이 엄청나게 크다. 이와 같은 이유로 단백질 의약품의 경구 투여 기술 개발이 절실한 실정이다. 식물체에서 생산해낸 바이오 의약품의 경우, 단백질을 순수 분리 정제해 내지 않고 경구 투여하는 것이 가능하기 때문에 획기적인 방법이 될 수 있으나, 한편으로 단백질 의약품을 경구투여 할 경우 위에서 분비되는 펩신(pepsin), 장에서 분비되는 트립신(trypsin)에 의해 분해된다는 문제가 있다.
이에 본 발명자들은 엽록체에서 단백질 복합체를 이루어 안정적으로 존재하는 것으로 알려진 RbcS 유전자가 식물세포에서 목적 단백질의 발현을 증가시키며, 이 목적 단백질과 RbcS의 융합 단백질이 RbcL과 결합하여 거대분자를 만들게 됨으로써 위에 존재하는 펩신(pepsin)에 의한 단백질 분해에 대해서 저항성이 크게 증대된다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 목적 단백질의 고발현을 위한 RbcS 유전자 단편 및 유전자 컨스트럭트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 목적 단백질의 고발현을 위한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 목적 단백질을 고발현하는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 목적 단백질을 고발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 식물세포에서 목적 단백질의 고발현을 위한 발현 벡터를 제작하고 이를 활용하여 식물체로부터 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 목적 단백질과 RbcS 펩타이드 단편이 결합된 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 목적 단백질과 RbcS 펩타이드 단편이 결합된 된 상태에서 500 ~ 800 kD 크기의 거대복합체를 만들어서 소화기관 내에 존재하는 단백질 분해 효소에 저항성을 갖도록 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 목적 단백질과 RbcS 펩타이드 단편이 결합된 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 경구 투여용 약학 제형 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 식물세포 내에서 그 하류에 위치한 목적 단백질의 발현량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 리불로스 비스포스페이트 카복시라아제/옥시게나아제의 작은 서브유니트(RbcS, ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 유전자 단편을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) RbcS 유전자 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 순차적으로 연결된 목적 단백질의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 RbcS 유전자는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 목적 단백질은 항원, 항체, 항체 단편, 구조 단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소 저해제, 수송단백질, 리셉터, 리셉터의 단편, 생체방어 유도물질, 저장단백질, 이동단백질(movement protein), 익스플로이티브 프로틴(exploitive protein) 및 리포터단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 유전자 컨스트럭트는 RbcS 유전자의 5' 말단에 프로모터 유전자를 더 포함할 수 있으며, 상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에 단백질 태그 유전자를 더 포함할 수 있으며, 상기 단백질 태그는 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그 및 Xpress 태그로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환 되고 목적 단백질을 고발현하는 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 재조합 발현벡터를 제작하는 단계 및 상기 재조합 발현벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 고발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 재조합 발현벡터를 식물체에 도입하는 단계는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(polyethylenglycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 상기 재조합 발현벡터를 제작하는 단계, (b) 상기 재조합 발현벡터를 식물에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계, (c) 상기 형질전환 식물체를 배양하는 단계 및 (d) 상기 형질전환 식물체 또는 배양액으로부터 목적 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 재조합 발현벡터를 게놈에 존재하는 RbcS 유전자가 결손된 식물에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하고, 이로부터 목적 단백질을 효과적으로 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 목적 단백질 및 목적 단백질의 5` 말단에 결합된 RbcS 펩타이드 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 RbcS 펩타이드 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 융합 단백질은 500 ~ 800 kD의 거대 복합체일 수 있다. 융합 단백질의 크기는 RbcS 펩타이드 단편에 결합하는 목적 단백질의 크기에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 융합 단백질은 소화 효소에 저항성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 목적 단백질의 5` 말단에 RbcS 펩타이드 단편이 결합된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 약학 제형 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 목적 단백질의 5` 말단에 RbcS 펩타이드 단편이 결합된 융합 단백질을 발현하는 형질전환 식물체를 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 약학 제형 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 RbcS 펩타이드 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명은 목적 단백질을 발현하는 식물, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법을 제공한다. 본 발명을 통해 식물체로부터 고효율, 고발현의 목적 단백질을 수득할 수 있어 식물체를 활용한 산업용 또는 의료용 단백질의 대량생산에 활용할 수 있으며, 특히 경구 투여용 단백질 의약품 생산 및 생산된 단백질을 순수 분리 없이 경구 투여용 약학 제형 조성물로 제조하는 데 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 RbcS 융합 컨스트럭트의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 RbcS 융합으로 인하여 목적 단백질이 식물세포에서 고발현 되는 것을 확인한 웨스턴 블럿 사진이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 RbcS 융합 단백질의 발현이 정상식물체보다 RbcS 결손 돌연변이체에서 더 높다는 것을 확인한 웨스턴 블럿 사진이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 형질전환 식물체에서 RbcS 융합 단백질의 발현을 확인한 웨스턴 블럿 사진이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 RbcS 단백질이 융합된 목적 단백질(RbcS-FL:leptin:HA)의 농도별 펩신 저항성 효과 실험 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 RbcS 단백질이 융합된 목적 단백질(RbcS-FL:leptin:HA)의 반응시간별 펩신 저항성 효과 실험 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 RbcS 단백질이 융합된 목적 단백질의 복합체 형성 확인 결과를 나타낸 Blue-Native PAGE 결과이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 RbcS-FL:leptin:HA의 소화관 내 안정성 확인 결과이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 융합 단백질 RFeEx4fG15의 고발현을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 융합 단백질 RFeEx4fG15의 루비스코 복합체 형성을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 식물세포에서 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 방법을 고안하기 위하여, 세포 내에서 목적 단백질을 안정화시킬 수 있는 단백질 도메인 융합에 주목하고, 애기장대의 엽록체에서 단백질 복합체를 이루어 안정적으로 존재하는 것으로 알려진 RbcS 유전자를 분리하였고, 상기 RbcS 유전자를 융합하면 식물세포에서 목적 단백질의 발현을 증가된다는 사실을 확인하였다(실시예 2 참조).
따라서 본 발명은 식물세포 내에서 그 하류에 위치한 목적 단백질의 발현량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 RbcS 유전자 단편을 제공한다.
상기 RbcS 유전자는 바람직하게 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) RbcS(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 유전자; 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 순차적으로 연결된 목적 단백질의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
본 발명의 유전자 컨스트럭트는 RbcS 유전자의 5' 말단에 프로모터 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 유전자 컨스트럭트는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에 단백질 태그 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 유전자 컨스트럭트는 발명은 (a) 프로모터 유전자; (b) rbcS(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 유전자; (c) 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 (d) 단백질 태그 유전자가 작동가능하게 순차적으로 연결된 것일 수 있다.
상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 RbcS 유전자는 리불로스 비스포스페이트 카복실레이즈/옥시제네이즈 소단위 서브유닛을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 가장 바람직하게는 아기장대에서 유래한 서열번호 1로 표시되는 RbcS 유전자일 수 있다.
상기에서 목적 단백질은 생산하고자 하는 단백질을 의미하는 용어로서, 특정 단백질로 한정되지는 않는다. 구체적으로 목적 단백질은 항원, 항체, 항체 단편, 구조 단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소 저해제, 수송단백질, 리셉터, 리셉터의 단편, 생체방어 유도물질, 저장단백질, 이동단백질(movement protein), 익스플로이티브 프로틴(exploitive protein) 및 리포터 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 목적 단백질로 부갑상선 호르몬(PTH, parathyroid hormone) 또는 렙틴(Leptin)을 사용하였다. 하지만 본 발명의 목적 단백질은 Leptin이나 PTH로 제한되지는 않는다. 본 발명은 또한 인간성장호르몬, GLP1, Exendin-4 등과 같은 다양한 작은 펩타이드성의 호르몬 등의 대량 발현에 이용할 수 있다. 이렇게 발현된 단백질은 RbcS와의 융합 부위에 특정 단백질 분해 사이트를 도입하여 RbcS로부터 분리하여 순수 정제할 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질 태그 유전자는 단백질을 분리 정제하기 위하여, 구분 가능하도록 하는 태그라면 이에 제한하지 않는다. 구체적으로 단백질 태그는 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그 및 Xpress 태그로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 RbcS 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 “재조합 발현 벡터”는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
RbcS 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다.
상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 식물세포에서 발현시키기 위한 적합한 벡터로는 pUC19 기반 플라스미드 또는 Ti 플라스미드 벡터가 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투마파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 잇는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
상기 적합한 벡터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 326 GFP 또는 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용하는 것이 바람직하며 당업자라면 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 식물 세포내에서 발현시킬 수 있는 어떠한 벡터라도 선택하여 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 재조합 벡터는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 프로모터, 목적단백질의 발현량을 증진시키는 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 순차적으로 작동 가능하게 연결된 재조합 발현 벡터이다.
또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. “프로모터”란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. “식물 프로모터”는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. “구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이며, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환 되고 목적 단백질을 고발현하는 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 재조합 재조합 발현벡터를 제작하는 단계; 및 상기 재조합 발현벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 고발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
상기 식물 발현 벡터의 식물세포 또는 식물체로의 도입은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG (Polyethylen glycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 애기장대 원형질체의 형질전환에는 PEG-매개성 형질전환 방법을, 그리고 애기장대 형질전환체 제작에는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법을 사용하였다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 이용하여 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명의 목적 단백질을 생산하는 방법은, (a) 상기 재조합 발현벡터를 제작하는 단계; (b) 상기 재조합 발현벡터를 식물에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환 식물체를 배양하는 단계; 및 (d) 상기 형질전환 식물체 또는 배양액으로부터 목적 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 목적 단백질 생산 방법에 있어서, 상기 식물은 게놈에 존재하는 RbcS 유전자가 결손된 식물일 수 있다.
상기 형질전환된 식물세포로부터 목적 단백질을 생산하는 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환 시킨 다음, 목적 단백질이 발현되도록 적당한 시간 동안 배양한 후, 형질전환 된 세포로부터 수득할 수 있다. 이때 상기 목적 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지된 방법이라면 모두 사용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 애기장대로 형질전환체를 제작하였으나 이에 한정되는 것은 아니며, 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물에서 분리된 원형질체 모두 본 발명의 방법에서 사용 가능하다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 목적 단백질 및 목적 단백질의 5` 말단에 결합된 RbcS 펩타이드 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 융합 단백질은 500 ~ 800 kD의 거대 복합체를 형성하여 소화 기관 내의 단백질 분해 효소에 대한 저항성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 목적 단백질의 5` 말단에 RbcS 펩타이드 단편이 결합된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 약학 제형 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 목적 단백질의 5` 말단에 RbcS 펩타이드 단편이 결합된 융합 단백질을 발현하는 형질전환 식물체를 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 약학 제형 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 RbcS 펩타이드 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 재조합 발현 벡터 제작
본 발명자들은 발현 벡터로 [35S 프로모터]-[RbcS 유전자]-[목적 단백질 유전자]-[HA 태그]가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 사용하였다(도 1). 발현 벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝한 후 식물세포에서 발현시키면 RbcS가 융합된 상태로 발현되고, 엽록체로 이동하여 축적된다.
본 발명의 일실시예에서 목적 단백질로는 부갑상선호르몬(parathyroid hormone, PTH)을 사용하였으며, 발현 벡터의 제작 방법은 하기와 같다. 애기장대 지노믹 DNA를 주형으로 'XbaI-RbcS N-termianl sequence'로 구성된 정방향 프라이머(서열번호 6)와 'BamHI-RbcS C-terminal sequence'로 구성된 역방향 프라이머(서열번호 7)를 이용하여 PCR 반응을 수행하여 RbcS 유전자를 증폭하였다. 또한 PTH가 포함된 플라스미드 DNA를 주형으로 'BamHI-PTH N-termianl sequence'로 구성된 정방향 프라이머(서열번호 8)와 'XhoI-stop codon-HA C-terminal sequence'로 구성된 역방향 프라이머(서열번호 9)를 이용하여 PCR 반응을 수행하여 HA-태그가 융합된 PTH 유전자를 증폭하였다. 상기 증폭된 PCR 산물을 각각 XbaI/BamHI(첫번째 PCR산물) 및 BamHI/XhoI(두번째 PCR 산물)으로 절단하고 정제하였다. 이 두 PCR 산물을 XbaI/XhoI으로 절단한 326 GFP(Arabidopsis Biological Resource Center, Ohio State University, Ohio, USA) 플라스미드 내 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터(서열번호 3)와 NOS 종결자 사이에 클로닝하여 발현벡터 RbcS:PTH:HA를 제작하였다.
실시예 2. RbcS 융합 벡터의 단백질 발현 효과 비교
상기 실시예 1에서 제조된 발현벡터를 애기장대 잎에서 분리한 원형질체에 PEG-매개성 형질전환 방법으로 도입하여 형질전환체를 제조한 후, 이로부터 발현되는 RbcS 융합 단백질의 양을 웨스턴 블럿(Western blot) 분석 방법으로 비교하였다.
구체적으로, 세포 용해액 30 ㎍을 SDS 시료 버퍼와 혼합하여 가열하였고, 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동하였다. 분리된 단백질을 PVDF 막에 이동시키고, 5% 스킴 밀크(skim milk)로 차단하였다. 이후 anti-HA 항체(1 : 1000 희석)와 함께 반응시켰고, 고추냉이 퍼옥시데이즈(HRP, horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시켰다. 이후 ECL 용액을 제조사의 방법대로 처리하였다.
실시예 3. 식물 세포 내에서 RbcS 융합으로 인한 단백질 발현량 분석
RbcS 융합으로 인한 단백질 발현량의 증가를 확인하기 위하여 PTH:HA의 상부에 RbcS 전체 유전자(full-length, 서열번호 1)를 설치한 플라스미드 유전자를 사용하였고, 대조군으로는 RbcS 전체 유전자 대신 RbcS 트랜지트 펩타이드(RbcS transit peptide, 서열번호 10)를 PTH:HA의 상부에 설치한 플라스미드 유전자를 사용하였다. 이들 유전자를 PEG-매개성 형질전환 방법으로 애기장대의 잎에서 분리한 원형질체에 도입하고 24시간 배양 후 원형질체를 수집, 용해하여 정량한 후 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 애기장대 원형질체에서 RbcS 전체 유전자를 융합시킨 PTH:HA의 발현이 대조군인 RbcS 트랜지트 펩타이드를 융합시킨 PTH:HA의 발현보다 더 높은 것으로 나타났다. 이로부터, RbcS 유전자를 융합 파트너로 사용하면 목적 단백질의 발현량을 향상시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. 야생형 식물과 RbcS 유전자가 결손된 식물에서 RbcS 융합으로 인한 단백질 발현량 비교 분석
RbcS 유전자가 결손된 식물에서 RbcS 융합 단백질의 발현량을 분석하기 위해 RbcS 유전자가 결손된 돌연변이 애기장대를 숙주세포로 사용하였다.
구체적으로, 야생형 애기장대와 RbcS 유전자가 결손된 돌연변이 애기장대의 잎에서 각각 원형질체를 분리하고, RbcS 전체 유전자(서열번호 1)를 융합시킨 PTH:HA 유전자를 PEG -매개성 형질전환 방법으로 원형질체에 도입한 다음 24시간 동안 배양한 후 원형질체를 수집, 용해하고 정량하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, RbcS 전체 유전자를 융합시킨 PTH:HA의 발현이 야생형 애기장대보다 RbcS 유전자가 결손된 돌연변이체에서 더 높은 것으로 나타났다. 이로부터, RbcS 유전자가 결손된 돌연변이체에서 RbcS 융합 단백질을 발현시키는 방법을 활용하여 목적 단백질의 발현량을 효율적으로 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. RbcS 융합 단백질이 발현되는 형질전환 식물체의 제작
RbcS 융합에 의해 목적 단백질의 발현이 향상된 형질전환 식물체를 제조하였다. 식물체 형질전환용 플라스미드는 아래와 같이 제작하였다. 먼저 Leptin을 포함하고 있는 플라스미드 DNA를 주형으로 'BamHI-leptin N-termianl sequence'로 구성된 정방향 프라이머(서열번호 12)와 'XhoI-stop codon-HA C-terminal sequence'로 구성된 역방향 프라이머(서열번호 13)를 이용하여 PCR 반응을 수행하여 HA-태그가 융합된 leptin 유전자를 증폭하였다. 상기 증폭된 PCR 산물을 BamHI/XhoI으로 절단하고 정제한 후 BamHI/XhoI으로 절단한 RbcS:PTH:HA 플라스미드 DNA에 클로닝하여 RbcS:leptin:HA를 제작하였다.
상기 제조한 재조합 벡터에서 RbcS:Leptin:HA를 포함하는 영역을 잘라 pCAMBIA1300 벡터의 멀티 클로닝 사이트에 XbaI 과 EcoRI 제한효소를 이용하여 35S 프로모터-RbcS:Leptin:HA:NOS 종결자 형태의 유전자 컨스트럭트를 클로닝함으로써 형질전환용 재조합 벡터를 제조하였다. 이후, 상기 제조된 형질전환용 재조합 벡터를 아그로박테리움-매개 형질전환 방법을 이용하여 형질전환된 식물체를 제조하였다. 이때, 제조된 형질전환용 벡터의 기본 벡터인 pCABIA1300은 하이그로마이신 내성 검사를 통해 본 발명의 방법으로 형질전환된 식물체를 선별하였다. 또한, 내성 검사로 선별된 식물체는 웨스턴 블럿을 통해 단백질이 잘 발현되는 라인을 찾아 형질전환 1세대를 확보하였고(도 4), 형질전환 2세대에서는 하이그로마이신 내성 검사를 이용하여 “죽는 개체 : 살아남은 개체”가 1 : 3의 비율로 깨끗하게 나오는 라인을 선별하였으며, 이들 라인 중 형질전환 3세대에서 모두 살아남는 개체를 호모(homo)로 선정하여 라인을 유지함으로써 형질전환된 식물체 라인을 확보하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 형질전환체 1 내지 5, 8 및 11에서 여러 밴드가 관찰되어 목적 단백질(RbcS:Leptin:HA)이 고발현 되는 것을 확인하였다.
실시예 6. RbcS 융합 단백질의 펩신 저항성 효과
상기 실시예 5와 같이 RbcS-FL:Leptin:HA의 형질전환 식물체를 만들고 이를 이용하여 인 비트로(in vitro)에서 펩신에 대한 저항성을 조사하였다.
구체적으로, 해당 형질전환 식물체는 온실에서 4주 가량 키운 뒤, 잎을 수확하여 동결건조 한 후, 곱게 갈아 가루 상태로 제작하였다. 이 가루 형태의 형질전환 식물체를 각 10 mg씩 취하여 pH 2.0의 버퍼와 혼합한 후, 0, 200,400 ng/μl농도의 펩신을 처리하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이 후, 펩신의 활성을 낮추기 위하여 얼음에 시료를 10분 가량 두어 온도를 낮추고, pH 8.8의 1.5 M Tris 버퍼를 처리하여 pH를 높임으로써 다시 한번 펩신의 활성을 낮추었다. 이후, 세포를 초음파 분해(sonication)방법으로 깨고, 버퍼와 혼합하여 10분간 끓인 후, 14,000 rpm에서 잔여물을 제거하였다. 이후, 100 μg에 해당하는 시료를 정량하여 SDS-PAGE하고 웨스턴 블럿을 수행하였다. 펩신 처리에 따른 융합 단백질의 저항성을 비교하기 위한 대조군으로 ER 단백질인 BiP(chapheron binding protein), 복합 단백질을 형성하는 엽록체 단백질인 Lhcb4(chlorophyll a-b binding protein) 단백질을 사용하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, RbcS 전체 유전자를 융합시킨 Leptin 단백질(RFL-Leptin)의 경우, 높은 농도로 처리한 펩신과의 반응에서 Bip 보다 높은 분해 저항성을 나타내었고, 또 다른 복합체를 형성하는 Lhcb4와는 비슷한 정도로 분해 저항성을 나타내었다.
상기에서 RbcS 융합 단백질의 농도별 펩신 처리에 따른 분해 저항성을 확인하였고, 이어서 400 ng/μl 펩신에 대한 반응 시간을 30분, 1시간, 2시간으로 다양하게 하여 분해 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 반응 시간이 길어짐에도 불구하고 여전히 다른 단백질들과 달리 분해 저항성을 나타내었다.
실시예 7. RbcS - Leptin의 소화관 내의 안정성 확인
소화관 내에서 RbcS-FL:leptin:HA 단백질의 안정성을 측정하기 위해 마우스에 강제 식이 한 후 위와 소장에서 음식물을 수득하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.
구체적으로 RbcS-FL:Leptin:HA가 형질전환된 식물체의 잎을 액체 질소 하에 동결건조 한 후, 곱게 갈아 가루 상태로 제작하였다. 이를 PBS에 현탁하였고, 소화관에서의 시간을 정확히 조절하기 위해 존드(zoned)를 이용하여 C57BL/6 마우스(n = 5)의 위로 80 mg(leaf 건조중량 기준)/개체를 직접 투여하였다. 투여 30분 후, 위와 소장에서 음식물을 수득하여 RIPA lysis buffer에 넣고, 초음파 분쇄를 하였다. 원심분리(14,000 xg)를 통해 세포 잔여물을 제거하였고, Bradford 단백질 정량을 통해 20 μg의 단백질을 SDS-PAGE젤에 로딩하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. HA 항체를 이용하여, RbcS-FL:leptin:HA의 존재를 확인하고자 하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 위에서 음식물을 수거했을 때, 대부분의 개체에서 본래 분자량의 RbcS-FL:leptin:HA가 검출되었다. 동시간에 소장에서는 위에 비해서는 소화가 더 진행된 것으로 보이지만 본래 분자량의 RbcS-FL:leptin:HA 검출이 되었다. 이로부터 RbcS가 융합된 목적 단백질을 경구 투여했을 때 소화관 내에서 소화 효소에 의해 분해되지 않고 안정적으로 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. RbcS 융합 단백질의 루비스코 복합체 형성 확인
상기 실시예에서 제조한 RbcS-FL:Leptin:HA가 Leptin 유전자 융합여부와 관계없이 여전히 루비스코 복합체(rubisco complex)를 형성하는지를 확인하기 위해 Blue-Native PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시하였다.
Blue-Native PAGE분석은 중합체 형태의 단백질을 확인하는 방법으로서, 구체적으로 다음과 같은 과정을 거쳤다. 형질전환 식물체를 온실에서 4주 가량 키운 뒤, 잎을 수확하여 동결건조 한 후, 곱게 갈아 가루 상태로 제작하였다. 이 가루 형태의 형질전환 식물체를 각 10 mg씩 취하여 Bis-Tris 버퍼에 혼합한 후, 초음파 분쇄로 세포를 깨고, 정량하였으며, 다음으로 비이온 세제(non-ionic detergent)인 n-도데실 베타-D-말토사이드(n-Dodecyl β-D-maltoside)를 첨가하여 용해하였다. 이후, CBB-G(coomassie brilliant blue-G250)와 함께 섞은 뒤, 4 ~ 16% 농도 구배의 Blue-Native 겔에 전기영동 후, 상기 실시예와 동일한 방법으로 웨스턴 블럿을 수행하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 융합 단백질이 루비스코 복합체를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9. 다른 목적 단백질에 있어서 RbcS 융합 단백질의 루비스코 복합체 형성 확인
상기 실시예 8에서 확인한 바와 같이 RbcS가 융합된 목적 단백질이 루비스코 복합체(rubisco complex)를 이룬다는 것을 보다 분명히 하기 위해 Leptin 외에 다른 목적 단백질에 대해서 확인해 보았다.
구체적으로, 상기 RbcS-Leptin:HA 재조합 벡터에서 Leptin:HA 부분을 제거하고 exendin-4(서열번호 14)와 GM1 결합 펩타이드(G15)(서열번호 16) 가 융합된 DNA 조각을 재조합하였다(RFeEx4fG15). 제조한 재조합 벡터를 애기장대 잎에서 분리한 원형질체에 PEG-매개성 형질전환 방법으로 도입하였고, 24시간 후에 발현되는 RbcS 융합 단백질의 양을 웨스턴 블럿 분석방법으로 확인하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 목적 융합 단백질(RFeEx4fG15)이 예상된 크기(29 kD)로 과발현됨을 확인할 수 있었다.
또한, 목적 융합 단백질(RFeEx4FG15)이 루비스코 복합체 형성 여부를 확인하기 위해 상기와 같은 방법으로 재조합 벡터를 원형질체에 도입한 후 Blue native-PAGE를 수행하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 원래 29 kD인 융합 단백질이 CBB(coomassie brilliant blue)에서 480 kD 부근에 보이는 밴드(rubisco complex)보다 더 큰 단백질 복합체로 확인되었고, 이는 목적 융합 단백질이 정상적으로 루비스코 복합체를 형성하였다는 것을 의미한다. 이로부터, 목적 단백질 종류와 관계 없이 본 발명의 RbcS 단편을 융합 파트너로 사용하였을 때 안정적으로 루비스코 복합체를 형성할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> A method of high level expression of target proteins as RbcS fusion proteins and method of preparing composition for oral delivery of the RbcS-fused target proteins expressed in leaf tissues as protein drugs <130> 1062189 <150> KR 10-2016-0062409 <151> 2016-05-20 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 782 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbcS <400> 1 atggcttcct ctatgctctc ttccgctact atggttgcct ctccggctca ggccactatg 60 gtcgctcctt tcaacggact taagtcctcc gctgccttcc cagccacccg caaggctaac 120 aacgacatta cttccatcac aagcaacggc ggaagagtta actgcatgca ggtcatttat 180 atttcttctt tcactttttt attattccat atgatttttt tcggttcttt cttcgaatct 240 acataaacta atatcattgg aaaaatcgaa aaaataggtg tggcctccga ttggaaagaa 300 gaagtttgag actctctctt accttcctga ccttaccgat tccgaattgg ctaaggaagt 360 tgactacctt atccgcaaca agtggattcc ttgtgttgaa ttcgagttgg aggtaattaa 420 acaaaattta aacatctata taaactagct agatcttagg aaaatttggt ttaatatatt 480 aggatcttga 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Trp Lys 115 120 125 Leu Pro Leu Phe Gly Cys Thr Asp Ser Ala Gln Val Leu Lys Glu Val 130 135 140 Glu Glu Cys Lys Lys Glu Tyr Pro Asn Ala Phe Ile Arg Ile Ile Gly 145 150 155 160 Phe Asp Asn Thr Arg Gln Val Gln Cys Ile Ser Phe Val Ala Tyr Lys 165 170 175 Pro Pro Ser Phe Thr Gly 180 <210> 3 <211> 835 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35S promoter <400> 3 agattagcct tttcaatttc agaaagaatg ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg 60 cagcaggtct catcaagacg atctacccga gcaataatct ccaggaaatc aaataccttc 120 ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ctgcatcaag aacacagaga 180 aagatatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc 240 acaaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttccc actgaatcaa 300 aggccatgga gtcaaagatt caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg 360 aacagttcat acagagtctc ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg 420 tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 480 gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 540 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16 aggtcttcta ctaagcctcc tctttctcct cttggt 36 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G15 <400> 17 Arg Ser Ser Thr Lys Pro Pro Leu Ser Pro Leu Gly 1 5 10

Claims (22)

  1. 서열번호 1로 표시되는 목적 단백질의 발현량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 RbcS(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 유전자 단편.
  2. (a) RbcS(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 유전자; 및
    (b) 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 순차적으로 연결된 목적 단백질의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 RbcS 유전자는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 항원, 항체, 항체 단편, 구조 단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소 저해제, 수송단백질, 리셉터, 리셉터의 단편, 생체방어 유도물질, 저장단백질, 이동 단백질(movement protein), 익스플로이티브 프로틴(exploitive protein) 및 리포터 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질인 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 유전자 컨스트럭트는 RbcS 유전자의 5' 말단에 프로모터 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 고발현을 위한 컨스트럭트.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 유전자 컨스트럭트는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에 단백질 태그 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 단백질 태그는 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그 및 Xpress 태그로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터.
  10. 제9항의 재조합 발현벡터로 형질전환 되고 목적 단백질을 고발현하는 형질전환 식물체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 목적 단백질을 고발현하는 형질전환 식물체.
  12. 제9항에 따른 재조합 발현벡터를 제작하는 단계; 및 상기 재조합 발현벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 고발현하는 형질전환 식물체의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 재조합 발현벡터를 식물체에 도입하는 단계는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(polyethylenglycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조방법.
  14. (a) 제9항에 따른 재조합 발현벡터를 제작하는 단계;
    (b) 상기 재조합 발현벡터를 식물에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 형질전환 식물체를 배양하는 단계; 및
    (d) 상기 형질전환 식물체 또는 배양액으로부터 목적 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 식물은 게놈에 존재하는 RbcS 유전자가 결손된 식물인 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 생산 방법.
  16. 목적 단백질 및 목적 단백질의 5` 말단에 결합된 RbcS 펩타이드 단편을 포함하는 융합 단백질.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 RbcS 펩타이드 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 500 ~ 800 kD의 거대 복합체인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 소화 효소에 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  20. 목적 단백질의 5` 말단에 RbcS 펩타이드 단편이 결합된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 약학 제형 조성물.
  21. 목적 단백질의 5` 말단에 RbcS 펩타이드 단편이 결합된 융합 단백질을 발현하는 형질전환 식물체를 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 약학 제형 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    상기 RbcS 펩타이드 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 경구 투여용 약학 제형 조성물.

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