CN115073608A - 一种猪瘟病毒e2的核酸-蛋白复合标记性疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物疫苗制备技术领域，公开了一种猪瘟病毒E2的核酸‑蛋白复合标记性疫苗，具体公开了Fd片段作为鉴别标签在制备猪瘟病毒亚单位疫苗和/或核酸疫苗中的应用，所述Fd片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明首次将Fd片段作为鉴别标签在制备猪瘟病毒亚单位疫苗和/或核酸疫苗中的应用，该多肽片段不仅能帮助蛋白质正确折叠，增强重组蛋白的免疫活性的功能，而且在免疫后产生的Fd抗体可与弱毒疫苗株免疫或者野毒株感染所产生的抗体区分开，可用于集约化猪场经典猪瘟的预防和净化。

Description

一种猪瘟病毒E2的核酸-蛋白复合标记性疫苗
技术领域
本发明属于生物疫苗制备技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒E2的核酸-蛋白复合标记性疫苗。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever，CSF)，又称经典猪瘟亦或古典猪瘟，是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的发热、急性、高度接触性传染病，四季均可发生。猪瘟病毒为单股正链RNA病毒，表面有囊膜，含有Erns、E1、和E2三个囊膜糖蛋白。其中E2蛋白为主要保护性抗原，分子量大小为51～55KD，既能与E1形成异源二聚体，也能形成自身同源二聚体结构。猪瘟病毒基因型分为多个亚型，我国目前流行的亚型多为2.1亚型和2.2亚型，其中 2.1型居多，但是血清型只有一个。
传统猪瘟病毒弱毒疫苗高效、安全，可以刺激机体同时产生良好的体液免疫和细胞免疫。包括LPC株、C株（也称HCLV）、GPE-株、Thiverval株、PAV株以及弱毒株等，其中以兔化弱毒C株（以下简称C株）在世界范围内使用最为广泛。然而，上述疫苗毒株和野毒株在血清学上高度相似，二者刺激机体产生的抗体难以相互区分开。因此，无法通过检测抗体来剔除感染的、和可疑的猪只来控制疫情，也使免疫过此类疫苗的猪及其产品的贸易受到限制。因此研制可进行鉴别诊断的新型猪瘟疫苗势在必行。
二十世纪九十年代荷兰的Moormann等研制出了第一代E2亚单位疫苗，使用杆状病毒在昆虫细胞内表达E2蛋白并纯化。目前商品化的E2亚单位疫苗，国际上只有一种油包水剂型的在出售，注射后二周产生免疫保护，保护期6个月。我国新疆天康畜牧生物技术股份有限公司的 E2亚单位疫苗在2018年获准上市，但仍然没有解决该疫苗需要二次注射的缺点。一些学者为增强E2蛋白的免疫原性做了一些尝试，比如用腺病毒表达E2，杆状病毒表达新型CSFV的E2。基于E2的多肽类疫苗也做了很多尝试，包括，单一多肽疫苗，多个多肽的混合疫苗，或将多个中和位点串联在一起的疫苗。这些疫苗缺乏E2的天然构象，实验结果都不尽人意，只能提供部分保护。然而，以上这些以蛋白或多肽为基础的亚单位疫苗只能刺激机体产生体液免疫，需要多次注射以应对猪瘟病毒野毒株的攻击，而且，这些疫苗均不具有鉴别诊断的能力。
猪瘟病毒的DNA疫苗具有同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫的功能，比如在E2基因之外，插入一些细胞因子，比如IL3、IL12，或细胞表面分子CD154、CD81等等来加强免疫反应。由于疫苗递送途径受限，目的基因表达量低，DNA在体内易降解等原因，大剂量、多次注射的效果也不尽人意。
目前还没有一个理想的猪瘟病毒标记疫苗，既可以同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，又能进行鉴别诊断、淘汰净化。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供Fd片段作为鉴别标签在制备猪瘟病毒亚单位疫苗和/或核酸疫苗中的应用。
本发明第二方面的目的，在于提供一种含有猪IgG的Fc片段的猪瘟病毒重组E2蛋白。
本发明第三方面的目的，在于提一种供编码本发明第二方面的猪瘟病毒重组E2蛋白的核酸分子。
本发明第四方面的目的，在于提供与本发明第三方面的核酸分子相关的生物材料。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第二方面的猪瘟病毒重组E2蛋白在制备预防或治疗猪瘟的疫苗中的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种猪瘟病毒E2亚单位疫苗。
本发明第七方面的目的，在于提供一种猪瘟病毒E2的核酸-蛋白复合疫苗。
本发明第八方面的目的，在于提供一种区别A免疫、B免疫、弱毒疫苗C株免疫或野毒株感染的鉴别方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供Fd片段作为鉴别标签在制备中猪瘟病毒亚单位疫苗和/或核酸疫苗中的应用，所述Fd片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述Fd，英文全称为Foldon，是T4噬菌体纤维蛋白的一个小多肽，具有帮助蛋白质正确折叠，增强重组蛋白的免疫活性的功能。
本发明第二个方面，在于提供一种猪瘟病毒重组E2蛋白，所述猪瘟病毒重组E2蛋白包括猪瘟病毒2.1亚型的E2ab片段、Fd片段和猪免疫球蛋白IgG的Fc片段，所述Fd片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述猪瘟病毒2.1亚型的E2ab片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述猪免疫球蛋白IgG的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述猪瘟病毒重组E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选的，所述猪瘟病毒E2重组蛋白还包括His标签。
优选的，所述His标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明第三个方面，在于提供一种供编码本发明第二方面的猪瘟病毒重组E2蛋白的核酸分子。
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明第四个方面，在于提供与本发明第三方面的核酸分子相关的生物材料，所述生物材料为(1)～(3)中任一种；
(1)表达盒，含有本发明第三方面的核酸分子；
(2)重组载体，含有本发明第三方面的核酸分子或(1)中的表达盒；
(3)重组细胞，含有本发明第三方面的核酸分子、(1)中的表达盒或(2)中的重组载体。
优选地，所述重组载体为质粒载体、病毒载体或细胞载体。
优选地，所述质粒载体可以是任选的质粒，所述病毒载体可以任选的病毒，所述细胞载体不包括繁殖材料。
优选地，所述细胞为昆虫细胞和/或哺乳动物细胞。
进一步优选地，所述昆虫细胞为昆虫细胞Sf9。
进一步优选地，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。
本发明第五方个方面，在于提供本发明第二方面的猪瘟病毒重组E2蛋白在制备预防或治疗猪瘟的疫苗应用。
本发明第三方面的核酸分子在制备预防或治疗猪瘟的疫苗应用。
本发明第四方面的生物材料在制备预防或治疗猪瘟的疫苗应用。
本发明第六个方面，在于提供一种猪瘟病毒E2亚单位疫苗，包括本发明第二方面的猪瘟病毒E2重组蛋白。
优选的，所述猪瘟病毒E2亚单位疫苗还包括药学上可接受的佐剂。
优选的，所述猪瘟病毒E2亚单位疫苗的制备方法为：将重组杆状病毒转染昆虫细胞，经培养表达得到猪瘟病毒E2重组蛋白，与佐剂混合得到。
优选的，所述昆虫细胞为昆虫细胞Sf9。
优选地，所述培养的条件为25～30℃培养2～3天。
优选地，所述培养表达后还包括蛋白纯化的步骤。
本发明第七个方面，在于提供一种猪瘟病毒E2的核酸-蛋白复合疫苗，所述核酸-蛋白复合疫苗包含核酸疫苗和本发明第六方面的猪瘟病毒E2亚单位疫苗。
优选的，所述核酸疫苗包括编码和表达SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的质粒。
优选的，所述核酸疫苗的制备方法为将编码和表达SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的质粒与水混合，即得到核酸疫苗。
优选地，所述核酸疫苗和本发明第六方面的猪瘟病毒E2亚单位疫苗的质量比为(3～7):4。
进一步优选地，所述核酸疫苗和本发明第六方面的猪瘟病毒E2亚单位疫苗的质量比为 (4～5):4。
本发明第八个方面，在于提供一种A免疫、B免疫、弱毒疫苗C株免疫或野毒株感染的鉴别方法，所述A为本发明第六方面的猪瘟病毒E2亚单位疫苗；所述B为本发明第七方面的核酸-蛋白复合疫苗；所述鉴别方法为非疾病诊断或治疗方法。
优选的，所述鉴别方法具体为：通过检测猪体内是否存在Fd抗体和猪瘟病毒E2抗体，若同时表达Fd抗体和猪瘟病毒E2抗体，若同时表达Fd抗体和E2抗体，则为本发明第六方面的猪瘟病毒E2亚单位疫苗或本发明第七方面的核酸-蛋白复合疫苗免疫的猪；若不表达Fd抗体，表达E2抗体，则为弱毒疫苗C株免疫或野毒珠感染的猪；
本发明还提供一种重组杆状病毒，所述重组杆状病毒含有本发明第三方面的核酸分子。
优选的，所述重组杆状病毒的制备方法包括以下步骤：将本发明第三方面的核酸分子插入载体pFastBac1中，构建重组质粒；转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，筛选含有重组杆质粒的重组大肠杆菌，提取重组杆粒的DNA；转染昆虫细胞Sf9，包装重组杆状病毒，获得的表达所述猪瘟病毒重组E2蛋白的重组杆状病毒。
本发明的有益效果是：
本发明首次将Fd片段作为鉴别标签在制备猪瘟病毒亚单位疫苗和/或核酸疫苗中的应用，将该多肽片段插入在猪瘟病毒亚单位疫苗和/或核酸疫苗，不仅能帮助蛋白质正确折叠，增强重组蛋白的免疫活性的功能；在免疫后产生的Fd抗体可与弱毒疫苗株免疫或者野毒株感染所产生的抗体区分开，可用于集约化猪场经典猪瘟的预防和净化。
本发明首次将三个蛋白分子：猪瘟病毒E2、T4噬菌体纤维蛋白的多肽Fd和猪IgG的Fc 片段连接在一起作为猪瘟病毒的疫苗抗原，其中，Fd具有帮助蛋白质正确折叠，增强重组蛋白的免疫活性的功能，且可以作为免疫后的鉴别标签，猪IgG的Fc片段可以增强疫苗的活性。
本发明提供的核酸-蛋白复合疫苗是国际上首个猪瘟病毒核酸蛋白复合疫苗，不具有复制性，不会给猪场引入病毒；且该核酸-蛋白复合疫苗可产生专门针对2.1亚型强毒株的抗体，有望解决传统C株疫苗对2.1亚型强毒株保护力弱的问题。
本发明创新猪瘟病毒疫苗的组成和使用方法，即首次免疫通过注射核酸疫苗激活机体的细胞免疫和体液免疫反应，第二次加强免疫注射含有同一免疫原成分的蛋白疫苗，进一步强化体液免疫反应，使用后可以刺激机体同时产生抗原特异性体液免疫反应和抗原特异性细胞免疫反应，对预防病毒传播比蛋白类疫苗具有更明显的优势；而且该疫苗具有标签，免疫后产生的抗体可与免疫传统C株弱毒疫苗或者野毒珠感染所产生的抗体区分开，可用于集约化猪场经典猪瘟的预防和净化。
附图说明
图1为猪瘟病毒E2核酸-蛋白复合疫苗发明的技术路线图。
图2为猪瘟病毒E2重组蛋白的结构，其中，A为重组蛋白E2-FdFc和重组蛋白E2-Fd的结构示意图；B为猪瘟病毒E2的ab片段的结构图。
图3为昆虫细胞表达的猪瘟病毒E2重组蛋白的SDS-PAGE和免疫印迹结果图；其中，A 为纯化后的E2-FdFc/昆虫和E2-Fd/昆虫的SDS-PAGE和免疫印迹结果图；B为重组蛋白E2-FdFc/ 昆虫和E2-Fd/昆虫在同一块凝胶变性与非变性电泳检测蛋白聚合情况的结果图。
图4为在293A细胞中表达猪瘟病毒E2重组蛋白；其中，A为质粒pcDNA3.1-E2-FdFc的结构示意图；B为E2-FdFc/293的免疫印迹结果图；C为E2-FdFc/293在同一块凝胶变性与非变性电泳检测蛋白质聚合情况的结果图；D为E2-FdFc/293和E2-FdFc/昆虫的免疫印迹结果图；E 为E2-FdFc/293纯化后，与E2-FdFc/昆虫和E2-Fd/昆虫一起SDS-PAGE电泳检测目的蛋白纯度，图中，E2-FdFc/昆虫突变体是本实验室之前表达纯化的一个重组蛋白，空间构像不理想，未做后续研究。
图5为猪瘟病毒E2重组蛋白制备的亚单位疫苗免疫新西兰白兔并攻毒后的体温热曲线；其中，A为用E2-FdFc/昆虫制备的亚单位疫苗免疫新西兰白兔并攻毒后的体温热曲线；B为用 E2-Fd/昆虫制备的亚单位疫苗免疫新西兰白兔并攻毒后的体温热曲线；C为用E2-FdFc/293制备的亚单位疫苗免疫新西兰白兔并攻毒后的体温热曲线；D为用生理盐水制备的亚单位疫苗作为对照组免疫新西兰白兔并攻毒后的体温热曲线；图中★标出的横线表示正常体温的基线，高于基线则判定为发热。
图6为不同疫苗在仔猪体内的体液免疫反应结果图；其中，A为多肽Fd-KLH包板的ELISA 检测结果图；B为分别以7条多肽包板的ELISA检测结果图。
图7为核酸-蛋白复合疫苗在仔猪体内的细胞免疫反应结果图，图中，***代表P＜0.001，灰色柱代表E2来源的多肽刺激淋巴细胞，白色柱代表无关多肽刺激淋巴细胞。
图8为核酸-蛋白复合疫苗对猪瘟病毒强毒2.1亚型的识别能力及其疫苗标签的特异性结果图；其中A为2.1亚型强毒株和C株E2ab片段的氨基酸序列，图中用实线标记出C株来源的5 条多肽在E2上对应的位置，用虚线标记出2.1亚型强毒株来源的7条多肽在E2上对应的位置； B为分别以2.1亚型强毒株来源的7条多肽和C株来源的5条多肽分别包板的ELISA检测结果图；C为多肽Fd-KLH包板的ELISA检测结果图。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例1设计猪瘟病毒E2重组蛋白
构成猪瘟病毒E2重组蛋白的要素有四个：一是His标签，由10个组氨酸残基组成，用于免疫印记法鉴别蛋白及镍柱纯化，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；二是猪瘟病毒2.1亚型的 E2ab片段，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；三是Fd，英文全称为Foldon，是T4噬菌体纤维蛋白的一个小多肽，具有帮助蛋白质正确折叠，增强重组蛋白的免疫活性的功能，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；四是猪免疫球蛋白IgG的Fc片段，具有免疫增强作用，GenBank编号为AB205105.1，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
猪瘟病毒基因组由11个基因组成，其中E2基因编码的外膜蛋白E2包括a、b、c、和d等 4个亚基，a和b亚基在介导病毒粒子感染靶细胞中起着关键作用，也是中和抗体识别的主要部位，且E2的ab片段在天然结构中有6个半胱氨酸残基(黑色星星所示)可形成3对二硫键(图 2中B)。而猪免疫球蛋白IgG的Fc片段上含有6个半胱氨酸残基也可在不同的重组蛋白分子之间形成多聚体。因此，以E2的ab片段的基础，设计猪瘟病毒E2重组蛋白，在E2的ab片段的N端加上His标签、C端加上Fd片段和猪免疫球蛋白IgG的Fc片段，构成重组蛋白E2-FdFc (E2-FdFc/昆虫的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，所编码的DNA序列如SEQ ID No.8所示)；在E2的ab片段N端加上His标签、C端加上Fd片段，构成重组蛋白E2-Fd(E2-Fd/昆虫的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，所编码的DNA序列如SEQ ID No.10所示)，两种猪瘟病毒E2重组蛋白的结构如图2中A所示。
实施例2猪瘟病毒E2重组蛋白的昆虫细胞表达及纯化
1.构建昆虫细胞表达载体
构建昆虫细胞表达载体：将实施例1构建出的猪瘟病毒E2重组蛋白E2-FdFc和E2-Fd的基因人工合成后，分别插入到表达载体pFastbac1中，构建得到重组质粒pFastbac1-E2-FdFc和重组质粒pFastbac1-E2-Fd。
转化：用热激方法将两种重组质粒分别转化感受态细胞E.coli DH10Bac中，加900μL不含抗生素的S.O.C.液体培养基(将胰蛋白胨20g、酵母抽提物5g，NaCl 0.5g于950mL去离子水中溶解，再加入10mL250mmol/L的KCl，调节pH至7.0，去离子水定容至975mL，高温高压灭菌；冷却至60℃以下后，加入20mL无菌的1mol/L葡萄糖(18g葡萄糖溶解于100mL去离子水中，0.22μm滤膜过滤除菌)，再加入5mL 2mol/L的无菌MgCl2溶液)，220转/分钟，37℃培养4小时；预先将含有50μg/mL卡那霉素，7μg/mL庆大霉素，10μg/mL四环素的LB固体平板上涂布10μL浓度为24mg/mL的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、40μL浓度为20mg/mL的5- 溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)，晾干10分钟，然后取100μL培养4小时后的菌液涂布平板，37℃倒置培养48小时。
鉴定：挑取平板上的白色单克隆菌落接种于含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、 10μg/mL四环素的LB液体培养基中，220转/分钟，37℃培养4小时；利用PCR鉴定含有重组杆质粒的阳性克隆菌，PCR引物为M13通用引物：
M13 Forward(-40)(SEQ ID No.5)：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'；
M13 Reverse(SEQ ID No.6)：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'。
质粒抽提：用杆状病毒穿梭载体Bacmid小量抽提试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司，货号：D0031)提取重组杆粒DNA，得到无内毒素的重组杆粒DNA。表达载体pFastbac1 及感受态细胞E.coli DH10Bac均购自武汉淼灵生物科技有限公司。
2.包装杆状病毒
将处于对数生长期(密度为2～4×106个细胞/mL)的昆虫细胞Sf9稀释至1×106个细胞/mL，接种至六孔板中，每孔加入2mL，在27℃培养箱中放置1小时，使细胞下沉贴壁。在这期间制备重组杆粒DNA与转染试剂Cellfectin Reagent(购自赛默飞世尔科技公司，货号： 10362-100)的混合物(一个孔的剂量配制如下：用100μL昆虫细胞培养基IB905(购自壹生科(深圳)有限公司，货号：L11001)稀释1μg重组杆粒DNA；用100μL昆虫细胞培养基IB905稀释6μL转染试剂；将上述两种稀释液合并，轻轻混匀，室温孵育15分钟)。吸去六孔板中的培养基，在DNA与转染试剂混合物的管内加入800μL昆虫细胞培养基 IB905，轻轻混匀，加入到六孔板中，27℃孵育5小时；吸去细胞上清，然后在每孔中加入2mL昆虫细胞培养基IB905，27℃孵育72小时，收集上清即为P0代重组杆状病毒。将P0代重组杆状病毒按病毒/细胞感染比例(MOI)为0.1的比例感染处于对数生长期的昆虫细胞Sf9，27℃培养72小时，收集细胞上清得到P1代重组杆状病毒。进一步将P1 代重组杆状病毒按照MOI为0.1的比例感染处于对数生长期的昆虫细胞Sf9，27℃培养 72小时，得到P2代重组杆状病毒。
3.从昆虫细胞High-five中纯化重组蛋白
将P2代重组病毒按MOI为1的比例感染处于对数生长期的High-five昆虫细胞，27℃培养 96小时；收集细胞，高压均质机1000bar压力，破碎细胞3次(购自安拓思纳米技术(苏州) 有限公司，型号：AH-1500)；8000转/分钟，离心15分钟；利用Western-blot检测离心得到的上清液和沉淀，结果表明猪瘟病毒E2重组蛋白均以包涵体形式存在。接着，先用2M盐酸胍(盐酸胍2M、Tris 50mM、NaCl 150mM、EDTA 1mM和Ttitonx-100 1％，调pH至8.0)清洗包涵体蛋白，8000rpm离心15min，弃上清，再用6M盐酸胍(盐酸胍6M、Tris 50mM、NaCl 150mM和DTT 3mM，调PH至8.0)对包涵体蛋白进行变性溶解，最后用截留分子量为5KD的透析袋(购自湖南翊博生物科技有限公司，货号：MD34-5000)，4℃环境下，50倍体积透析液(Tris50mM、NaCl 150mM，调pH至8.0)透析24小时，每8小时更换一次透析液，以去除变性剂，得到复性后的蛋白。最后利用镍柱亲和层析对蛋白进行纯化，具体步骤如下：(1)用20mM 咪唑缓冲液(咪唑20mM、Tris 50mM和NaCl 150mM，调pH至8.0)平衡亲和层析柱；(2) 包涵体复性后的蛋白样品上样；(3)20mM咪唑缓冲液洗去部分杂蛋白；(4)按照浓度由低到高的顺序，分别用含有50mM(咪唑50mM、Tris 50mM和NaCl 150mM，调pH至8.0)、150mM (咪唑150mM、Tris50mM和NaCl 150mM，调pH至8.0)、和250mM(咪唑250mM、Tris 50mM 和NaCl 150mM，调pH至8.0)咪唑的缓冲液梯度洗脱目标蛋白，收取250mM咪唑洗脱液，用截留分子量为10KD的AMICON ULTRA-15离心超滤管(购自密理博(上海)贸易有限公司，货号：UFC901096)脱盐浓缩样品，即得到纯化后的猪瘟病毒E2重组蛋白，分别命名为E2-FdFc/ 昆虫和E2-Fd/昆虫；分别利用聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot鉴定纯化后的目的蛋白，具体实验过程如下：
(1)聚丙酰胺凝胶电泳：聚丙酰胺凝胶电泳实验利用SDS-PAGE试剂盒(购自索莱宝生物科技有限公司，货号：P1200)进行。聚丙酰胺凝胶电泳包括变性电泳和非变性电泳，二者的唯一区别在于样品前处理方法有所不同，变性电泳：样品配制为10μL 5×SDS上样缓冲液，加入40μL待检样品，煮沸10分钟，10000转/分钟离心1分钟；非变性电泳：样品配制为10μL 5×SDS上样缓冲液，加入40μL待检样品，混匀即可。灌制15％的分离胶和5％的浓缩胶，上样量为每孔5μg蛋白样品；在80V稳压电泳约30分钟，待蛋白样品至分离胶和浓缩胶界面时，换用120V稳压电泳，至溴酚蓝前缘移动到凝胶底部，结束电泳，取出凝胶，直接考马斯亮蓝染色检查蛋白纯度，或继续进行Western-blot实验。
(2)Western-blot：聚丙酰胺凝胶电泳结束，将含目的蛋白的凝胶切下，置于转膜缓冲液 (39mM Glycine、48mM Tris、0.037w/v％SDS和20v/v％甲醇)中浸泡待用，将PVDF膜(购自赛默飞世尔科技公司)置于甲醇中浸泡1分钟，再放入转膜缓冲液中平衡3分钟；分别取出 PVDF膜和凝胶，将PVDF膜平铺在凝胶上，PVDF膜和凝胶两侧各放三层滤纸，凝胶在负极， PVDF膜在正极，放入电转仪中，4℃、300mA，转移时间170分钟；取出PVDF膜，置于含有5w/v％脱脂奶粉的TBST中(8.8g氯化钠，20mL 1M pH8.0的Tris-HCl)，37℃封闭2小时；取出PVDF膜，置入由5w/v％的脱脂奶粉稀释的一抗中(Anti-6×His Tag antibody或鼠抗Fd-KLH 多克隆抗体，其中，Anti-6×His Tag antibody购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号： D191001；鼠抗Fd-KLH多克隆抗体由本实验室制备得到)，稀释比例为1:3000，4℃孵育过夜；取出PVDF膜，用TBST洗涤4次，每次5分钟，加入5w/v％BSA稀释的二抗HRP-IgG
(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：D110087)，稀释比例为1:7000，37℃孵育1小时；取出PVDF膜，TBST洗涤4次，每次5分钟，加1mL ECL显色液(购自七海复泰生物科技有限公司，货号：E002-100)，凝胶成像仪拍照。
结果如图3所示(其中图3中A均是在变性电泳的基础上得到)，SDS电泳显示E2-FdFc/ 昆虫和E2-Fd/昆虫蛋白纯化后为单一条带，大小分别为50KD和26KD左右；Western-blot显示出两种重组蛋白中的Fd肽段和His标签。综上可以看出，应用昆虫细胞Sf9表达系统成功表达出了两种重组蛋白，即E2-FdFc/昆虫和E2-Fd/昆虫。
实施例3设计猪瘟病毒E2重组蛋白，并用HEK293细胞表达
1.设计猪瘟病毒E2重组蛋白
将编码E2-FdFc的基因前面加信号肽DNA(SEQ ID No.11)，后面加His标签(SEQ IDNo.1)，优化密码子使其适合在哺乳动物细胞内表达。优化后的基因片段为总长度约1000bp的DNA片段，将其命名为E2-FdFc/293(E2-FdFc/293的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，所编码的DNA 序列如SEQ ID No.13所示)。
2.构建表达载体
将人工合成的E2-FdFc/293的基因插入pcDNATM3.1(+)哺乳动物表达载体中(购自赛默飞世尔科技中国有限公司，货号：V79020)，构建重组质粒pcDNA3.1-E2-FdFc，如图4中A所示。
3.猪瘟病毒E2重组蛋白的表达与鉴定
将pcDNA3.1-E2-FdFc质粒转染至HEK293A细胞，具体转染步骤如下：
(1)细胞铺板：将生长良好的HEK 293A细胞进行铺板(12孔板)，铺板时间为转染前一天进行，每孔加入1mL稀释好的细胞(细胞密度0.75×105个/mL)，5％CO2、37℃培养，待细胞长成60％～70％的覆盖率即可进行转染(铺板时间至转染时间小于24小时)；
(2)转染：按照转染试剂盒LipofectamineTM2000(购自赛默飞世尔科技中国有限公司，货号：11668030)的说明书进行操作，取两个离心管，离心管1中加入100μL Opti-MEM培养基和1μg pcDNA3.1-E2-FdFc质粒；离心管2中加入100μL Opti-MEM培养基和2μLlipofectamine 2000，每个处理平行3次；两个离心管分别轻轻混匀，避免剧烈吹打，静止2～3分钟(小于5 分钟)；吸取100μL离心管2中的溶液加至离心1中，轻轻混匀，避免剧烈吹打，室温下静置 15分钟；在等待时，挑选细胞铺板最均匀且覆盖率在60％～70％之间的孔，将孔中培养基去除，保留少量培养基，避免细胞变干，每孔加入500μL Opti-MEM培养基；将离心管1中的混合液贴壁缓慢加入孔中，每孔200μL，摇动培养板，轻轻混匀；将12孔板置于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时；将12孔板中的培养基更换成含有5v/v％FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO2继续培养65小时；吸除细胞培养液，每孔加入100μL的PBS重悬，得到转染后的细胞悬液。
利用Western-blot对转染后的细胞悬液进行鉴定，实验步骤同实施例2，唯一的区别在于样品前处理为取20μL步骤(2)得到的细胞悬液，加入5μL 5×SDS上样缓冲液，煮沸10min。
结果如图4中B所示，293A细胞成功表达了目的蛋白(E2-FdFc/293)，该蛋白可分别被 Fd抗体和His标签抗体识别。此外，用同一块凝胶变性非变性电泳检测蛋白质聚合情况，结果如图4中C所示，E2-FdFc/293变性前的蛋白质分子量比变性后的大3倍多，其原因为该重组蛋白由3个以上的单体组成，且根据蛋白条带位置估计，推测为4聚体。进一步比较哺乳动物细胞293A表达的E2-FdFc/293和昆虫细胞表达的E2-FdFc/昆虫，由图4中D可以看出，哺乳动物细胞293A表达的E2-FdFc/293比昆虫细胞表达的E2-FdFc/昆虫分子量大，表明哺乳动物细胞可以更完整地糖基化E2-FdFc分子。
4.从悬浮培养的HEK293细胞中大量表达并纯化重组蛋白
以100mL培养瓶(溶液体积占瓶体积的1/5)为例：
转染前准备：在20mL 293无血清CD培养基(购自北京义翘神州科技有限公司，货号：SMM 293-TI)培养基中接种密度为0.3×106个细胞/mL的HEK293细胞，37℃，175转/分钟，5％CO2条件下悬浮培养3天，待细胞密度升至大约2～3×106个细胞/mL时用CD培养基稀释细胞密度至 1×106个细胞/mL，每瓶细胞的体积仍然调整为20mL，然后继续培养2小时，开始转染。
转染：首先在900μL 0.15M的NaCl中加入10μg DNA，混匀，室温放置5min，得到DNA稀释液；往DNA稀释液中加入40μL的Sinofection(购自北京义翘神州科技有限公司，货号：STF02)，混匀后室温放置10分钟；取出细胞，将DNA和转染试剂的混合液逐滴加入，边加边轻轻摇匀，然后旋紧瓶口放回摇床(36.5℃，5％CO2，175转/分钟)继续培养；48小时后检测基因表达。另外，在转染后第1、3、5天分别添加5％体积的293无血清加料液(购自北京义翘神州科技有限公司，货号：M293-SUPI-100)。
纯化：培养至第7天，收集细胞，用高压均质机1000bar的压力破碎细胞三次，8000转/ 分钟，离心15分钟，取上清液，用0.22μM滤器过滤后进行亲和层析镍柱纯化(具体步骤同实施例2)，得到纯化后的重组蛋白E2-FdFc/293，结果如图4中E所示。
实施例4不同种猪瘟病毒E2重组蛋白的免疫保护性
利用实施例2和实施例3表达纯化得到的E2-Fd/昆虫、E2-FdFc/昆虫和E2-FdFc/293为免疫原，免疫新西兰白兔，考察3种不同猪瘟病毒E2重组蛋白的免疫保护性。
配制疫苗：以配制50mL疫苗为例，具体配制过程如下：在搅拌状态下，向卡波姆母液(将 0.25g卡波姆用20mL PBS溶解，4℃浸泡过夜，调整pH为7.2，磁力搅拌器充分混匀，使卡波姆变为凝胶，120℃，20分钟高压灭菌)中逐滴加入大豆磷脂母液(将3g大豆磷脂用3mL无水乙醇溶解，用0.2μm过滤器过滤除菌)、1mg霍乱毒素B亚单位(Choleratoxin Bsubunit，CTB，购自Sigma公司，货号：C9903-5MG)和1mg非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(Cytidine-phosphatte-guanonine，CpG-ODN，自行设计，由华大基因合成，该CpG-ODN的核苷酸序列为SEQ ID No.14)，混匀后，加入用适量PBS溶解的猪瘟病毒E2抗原蛋白，之后继续加入PBS至50mL，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗(猪瘟病毒E2抗原蛋白的最终浓度为150μg/mL)。用上述方法分别制备3种重组蛋白疫苗。
免疫：选择50日龄左右，体重1.5公斤左右的新西兰白兔，雄性，随机分为4组，每组2 只。实验组分别皮下注射1mL上述3种疫苗，对照组注射同样体积的生理盐水。免疫48小时后每隔6小时测一次体温，至126小时体温测试结束。21天后同样剂量加强免疫一次。42天后，每只兔子耳缘静脉注射1mL猪瘟兔化弱毒C株(注射前用生理盐水将1头份/mL的猪瘟兔化弱毒疫苗8000倍稀释)。
通过对新西兰白兔分别注射三种重组蛋白疫苗，并观察免疫48小时后，新西兰白兔的体温变化，结果如图5所示，与对照组相比，E2-FdFc/昆虫可明显延迟发热的时间，而E2-FdFc/293 可完全阻止发热，可见，HEK293细胞表达的重组蛋白可完全保护新西兰白兔不出现体温热反应，表明哺乳动物细胞表达的重组蛋白作为疫苗具有更好的保护性。
实施例5猪瘟病毒核酸和蛋白复合疫苗在猪体内的体液免疫反应
根据实施例4的实验结果，可初步推断如果直接将质粒pcDNA3.1-E2-FdFc免疫动物，将具有较好的候选疫苗的可能性，进一步考察E2-FdFc/昆虫蛋白和质粒pcDNA3.1-E2-FdFc在仔猪体内的体液免疫反应。
1.免疫仔猪
选取15公斤左右的断奶仔猪6头，随机分为3组，每组2头。3组分别为A组：蛋白疫苗组(两次均注射1mL含有200ug的E2-FdFc/昆虫蛋白，使用201佐剂(购自赛彼科(上海)特殊化学品有限公司，货号：36075M)配制，具体配制方法如下：蛋白抗原溶液和佐剂201按重量比1:1分别装入两个容器中，放在水浴锅中分别加热到32℃；先将磁力搅拌器设置温度到32℃，然后在磁力搅拌器上，80转/分钟的搅拌速度下，缓慢加蛋白抗原溶液到佐剂中，根据乳化量调整搅拌速度，10mL乳化量搅拌速度为350转/分钟，50mL搅拌速度为800转/分钟，搅拌持续5 分钟；在20℃冷浴中冷却1小时)、B组：核酸疫苗组(两次均注射2mL含有250μg的质粒pcDNA3.1-E2-FdFc，用生理盐水溶解)和C组：核酸-蛋白复合疫苗组(第一次注射2mL含有250μg的质粒pcDNA3.1-E2-FdFc，用生理盐水溶解；第二次注射1mL含有200ug的E2-FdFc/昆虫蛋白，使用201佐剂)。按分组情况将疫苗经耳后肌肉注射到仔猪体内，两次免疫之间间隔20天，分别在第一次免疫前的当天和第二次免疫后第20天前腔静脉采血。新鲜血液不加抗凝剂，4℃过夜后，离心分离血清，用于后续的ELISA实验。
2.ELISA实验
利用2.1亚型猪瘟病毒的多肽(分别为2.1-1、2.1-2、2.1-3、2.1-4、2.1-5、2.1-6和2.1-7，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、 SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示，由吉尔生化(上海)有限公司合成，7条多肽均来自猪瘟病毒2.1亚型E2ab片段，其多肽的首尾有几个重复氨基酸)以及多肽Fd-KLH(先合成Fd序列，然后偶联上KLH(钥孔虫戚血蓝蛋白)基团，Fd的氨基酸序列如SEQ IDNo.22所示，由吉尔生化(上海)有限公司合成)对所采集的待测血清进行ELISA实验，考察各免疫组处理对仔猪体液免疫反应。具体实验步骤如下：
(1)包被：利用包被缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl，pH 8.8)将多肽分别配制成终浓度为20μg/mL 的溶液，100μL/孔包被于96孔酶标板，4℃过夜，弃去孔内的溶液，用PBST(pH7.4)洗涤3 次，每次3分钟；
(2)封闭：每孔加入300μL封闭液(5w/v％脱脂乳粉，用PBS配制)封闭2小时，弃去封闭液，PBST洗涤3次，每次3分钟；
(3)一抗孵育：利用PBS(pH 7.4)将待测血清进行稀释(稀释比例分别为1:2000、1:4000、 1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000)，每孔加入100μL，37℃，孵育60分钟，弃去孔内的溶液，PBST洗涤5次，每次3分钟；
(4)二抗孵育：每孔中加100μL HRP-鼠抗猪(购自北京博尔西科技有限公司，货号：BHR797)二抗稀释液(用PBS 1:2000稀释)，37℃，孵育30分钟，弃去孔内溶液，PBST洗涤5次，每次3分钟；
(5)显色：每孔加入100μL TMB显色液(购自Thermo公司，货号：34021)，显色10 分钟；
(6)终止、读数：每孔加入50μL 1M硫酸，终止反应；将酶标板置于酶标仪上，读取450nM 波长出的吸光度值(OD值)。
以多肽Fd-KLH包板，通过ELISA方法检测3组动物血清中的抗Fd标签抗体，可见核酸- 蛋白复合疫苗组(C组)与蛋白疫苗(A组)在免疫后，其血清均产生了较好的针对疫苗标签 Fd的体液免疫反应，其抗体滴度在1:32000至1:128000之间；而只注射核酸疫苗的B组免疫前和免疫后，以及其他组的免疫前血清均未产生标签抗体(图6中A)。
然而，用来源于2.1亚型猪瘟病毒强毒E2的7条多肽分别包板，ELISA实验检测血清(1:100 倍稀释)中针对这些多肽的抗体水平，结果显示，与免疫前血清相比，蛋白免疫组(A组)免疫后血清只产生了极低水平的抗体滴度，核酸-蛋白复合疫苗组(C组)免疫后的血清则表现出良好的多肽识别能力，可以识别来源于E2ab片段上不同位置的3个多肽，分别为2.1-1、2.1-4 和2.1-7(图6中B黑色箭头所指的多肽)，其中，核酸-蛋白复合免疫组的动物血清“蛋白/质粒 /免疫后-2”与多肽2.1-7的ELISA结果显示OD450的值为2.95±0.08，其他血清的值均小于2.0，表明核酸-蛋白复合疫苗更易产生针对猪瘟病毒的保护性免疫反应。
实施例6猪瘟病毒核酸-蛋白复合疫苗在猪体内的细胞免疫反应
在实施例5结果的基础上，进一步考察核酸-蛋白复合疫苗在仔猪体内的细胞免疫反应，其细胞免疫反应检测方法为酶联免疫斑点实验。
酶联免疫斑点实验
(1)取7mL血液(实施例5中核酸-蛋白复合疫苗组免疫后第20天，采集的新鲜血液)加入到含有170μL肝素钠抗凝剂(用生理盐水将肝素钠粉末配制成浓度为10μg/mL的溶液，肝素钠购自北京索莱宝科技有限公司，货号：9041-08-1)的离心管中，轻柔颠倒混匀，得到血样混合液，备用；
(2)在50mL无菌离心管中加入15mL淋巴细胞分离液(购自天津市灏阳生物制品科技有限责任公司，货号：LTS1110)；
(3)用PBS(pH 7.4)将步骤(1)中的血样混合液按1:1的比例稀释混匀；
(4)将步骤(3)稀释好的血样用移液器竖直缓慢滴加到步骤(2)中准备好的50mL的离心管中，滴加时要缓慢滴加，速度太快造成的冲击力会破坏淋巴细胞分离液和血样之间的界面；然后，2000r/min水平离心30min，且离心机设置成“no break”模式(避免急剧的减速度将分好层的界面打破)；
(5)离心完成后，离心管中的溶液一共会分为4层，最底层是红细胞，红细胞上面一层是淋巴细胞分离液，最上面一层是PBS，在淋巴细胞分离液和PBS中间有一层环状的乳白色淋巴细胞富集层，吸出中间那层乳白色淋巴细胞，放入无菌15mL离心管中，加入10mLPBST，混匀洗涤淋巴细胞2次，2000r/min离心10min，弃去上清液；
(6)用1mL含10v/v％FBS的1640培养基重悬细胞，取出10μL细胞悬液与含有0.08v/v％的台盼蓝染色液的溶液(台盼蓝染色液由Gibco公司生产，货号：15250-061，用PBS配制)按照1:1的比例充分混匀，并置于显微镜下进行活细胞计数；
(7)将猪干扰素γ酶联免疫斑点法PLUS(HRP)(Porcine IFN-γELISpotPLUS kit(HRP) 购买自MabTech公司，货号：3130-4HPW-2，该试剂盒内含生物素-P2C11抗体、Streptavidin-HRP 和TMB显色底物)中用铝膜密封的预包被板放入超净工作台，撕开包装，向每孔中加入200μL PBS洗涤4次；然后每孔加入200μL含10v/v％FBS的1640培养基，室温孵育活化1小时；
(8)在同一试管中分别加入步骤(6)中用含10v/v％FBS的1640培养基重悬后的细胞和刺激物(刺激物多肽E2或刺激物p1(作为对照刺激物)，其中，刺激物多肽E2为来源于猪瘟病毒强毒株2.1亚型的7条多肽，名称分别为2.1-1，2.1-2，2.1-3，2.1-4，2.1-5，2.1-6，和2.1-7，其氨基酸序列同实施例5，将上述7条多肽合成后混合，溶于含有10v/v％FBS的1640培养基中，使每条多肽的浓度为200μg/mL；刺激物p1为含有与E2氨基酸序列无关的4条多肽，4条多肽分别为p1-1、p1-2、p1-3和p1-4，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.23、SEQ IDNo.24、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26，将上述4条多肽经吉尔生化(上海)有限公司合成后混匀，溶于含有10v/v％FBS的1640培养基中，使每条多肽的浓度为200μg/mL)，使细胞数量为2×106个/mL，每条多肽的终浓度为20μg/mL，混匀，得到细胞/刺激物的混合物；
(9)去除Elispot板子中的培养基，加入细胞/刺激物的混合物，每孔100μL，每个细胞样品重复加4个孔；然后将Elispot板放在37℃、5％CO2的培细胞培养箱中培养36小时；培养期间不能多次开关细胞培养箱的门，更不能移动Elispot板；
(10)培养完成后，拿出Elispot板，在超净工作台中去除各孔内的上清液，每孔加入250μL 的PBS进行洗涤，加入PBS后停留1分钟再拍掉PBS，重复6次，洗涤过程中要防止液体飞溅，造成污染；
(11)用含0.5v/v％FBS的PBS稀释检测抗体至浓度为0.5μg/mL，加入到Elispot板中，每孔100μL，4℃冰箱孵育过夜；将Elispot板从4℃冰箱拿出，室温放置1小时，用PBS洗涤6 次，洗涤方式同步骤(10)；
(12)向Elispot板中加入Streptavidin-HRP的稀释液(用含0.5v/v％FBS的PBS 1:1000稀释)，每孔加入100μL，室温孵育1小时，用PBS洗涤6次，洗涤方式同步骤(10)；
(13)向Elispot板中每加入TMB显色底物，每孔100μL，显色到出现明显斑点时，立即用去离子水冲洗；待显色停止后，把板子放在超净工作台中用无菌风吹干，拍照计数(斑点数)。
如图7所示，猪瘟病毒E2的核酸-蛋白复合疫苗可在猪体内产生极显著的特异性细胞免疫水平，与刺激物p1相比，淋巴细胞被E2来源的多肽刺激后，分泌γ干扰素的淋巴细胞数量显著增加，其产生特异性免疫反应的淋巴细胞数平均每孔中可高达2000个以上。
实施例7检测核酸-蛋白复合疫苗对2.1亚型强毒株的识别能力及其疫苗标签的特异性
利用2.1亚型猪瘟病毒的多肽(分别为2.1-1、2.1-2、2.1-3、2.1-4、2.1-5、2.1-6和2.1-7)、多肽Fd-KLH和C株E2ab片段的多肽(分别为C-1、C-2、C-3、C-4和C-5，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31所示，由吉尔生化(上海)有限公司合成)，对实施例5中核酸-蛋白复合疫苗组免疫前当天以及免疫后第 20天所采集的待测血清(以猪瘟病毒标准阳性血清和猪瘟病毒标准阴性血清分别作为阳性对照和阴性对照，均购于中国兽医药品监察所，由免疫与C株同基因型的病毒制备而来)进行ELISA 实验，进一步分析免疫核酸-蛋白复合疫苗产生的抗体是否具有识别2.1亚型强毒株E2的能力，以及是否可以应用疫苗标签将其与免疫C株疫苗所产生的抗体区分开来。具体实验步骤如下：
(1)包被：利用包被缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl，pH 8.8)将多肽分别配制成终浓度为20μg/mL 的溶液，100μL/孔包被于96孔酶标板，4℃过夜，弃去孔内的溶液，用PBST(pH7.4)洗涤3 次，每次3分钟；
(2)封闭：每孔加入300μL封闭液(5w/v％脱脂乳粉，用PBS配制)封闭2小时，弃去封闭液，PBST洗涤3次，每次3分钟；
(3)一抗孵育：利用PBS(pH 7.4)将待测血清进行稀释(稀释比例分别为1：1000、1:2000、 1:4000、1:8000、1:16000、1:32000)，每孔加入100μL，37℃，孵育60分钟，弃去孔内的溶液， PBST洗涤5次，每次3分钟；
(4)二抗孵育：每孔中加100μL HRP-鼠抗猪(购自北京博尔西科技有限公司，货号：BHR797)二抗稀释液(用PBS 1:2000稀释)，37℃，孵育30分钟，弃去孔内溶液，PBST洗涤5次，每次3分钟；
(5)显色：每孔加入100μL TMB显色液，显色10分钟；
(6)终止、读数：每孔加入50μL 1M硫酸，终止反应；将酶标板置于酶标仪上，读取450nM 波长出的吸光度值(OD值)。
通过对比2.1亚型强毒株E2ab片段和C株E2ab片段的氨基酸序列，发现在C株序列上某些氨基酸与2.1亚型序列上同一位置的氨基酸不一样(图8中A深灰色标出的氨基酸)，这也是导致二者作为免疫原刺激机体产生的抗体，具有不同识别能力的主要原因。
以2.1亚型强毒株来源的7条多肽和C株来源的5条多肽分别进行包板，检测动物血清中抗猪瘟病毒E2的抗体，结果表明，与猪瘟病毒标准血清相比，核酸蛋-白复合疫苗-免疫后的血清可特异性识别3条来源于2.1亚型强毒株E2的多肽(分别为2.1-1、2.1-4和2.1-7)，而标准阳性血清更倾向于识别C株来源的多肽以及识别与C株氨基酸序列相似程度更高的多肽(图8 中B)，表明与C株相比，核酸-蛋白复合疫苗有望更有能力识别并阻止2.1亚型强毒株的感染。此外，以多肽Fd-KLH包板，检测动物血清中的抗Fd标签抗体，可见只有核酸-蛋白复合疫苗免疫后的血清产生了特异性的高效价抗体，免疫前血清和标准血清均未产生标签抗体，表明酸蛋-白复合疫苗可以产生高效价的、特异性的抗Fd标签的抗体，此抗体可以将疫苗与野毒感染所产生的抗体及时区分开，对集约化猪场的猪瘟净化具有重要的意义。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东海大集团股份有限公司
广东海大畜牧兽医研究院有限公司
<120> 一种猪瘟病毒E2的核酸-蛋白复合标记性疫苗
<130>
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
His His His His His His His His His His
1 5 10
<210> 2
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Arg Leu Ser Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr
1 5 10 15
Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Arg
20 25 30
Glu Tyr Ser His Gly Leu Gln Leu Asp Asp Gly Thr Val Arg Ala Ile
35 40 45
Cys Thr Ala Gly Ser Phe Lys Val Ile Ala Leu Thr Val Val Ser Arg
50 55 60
Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr
65 70 75 80
Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Ser Pro Ala Ile Glu Glu Met Gly
85 90 95
Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Thr Pro Val Val
100 105 110
Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu
115 120 125
Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser
130 135 140
Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Lys Arg Glu Lys
145 150 155 160
Pro Phe Pro His Arg Ala Asp Cys Val Thr Thr
165 170
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25
<210> 4
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ile Cys Pro Ala Cys Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
1 5 10 15
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr
20 25 30
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser
35 40 45
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys
50 55 60
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile
65 70 75 80
Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn
85 90 95
Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu
115 120 125
Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe
130 135 140
Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu
145 150 155 160
Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly
165 170 175
Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln
180 185 190
Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn
195 200 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gttttcccag tcacgac 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caggaaacag ctatgac 17
<210> 7
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met His His His His His His His His His His Met Arg Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Pro
20 25 30
Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Arg Glu Tyr Ser His Gly
35 40 45
Leu Gln Leu Asp Asp Gly Thr Val Arg Ala Ile Cys Thr Ala Gly Ser
50 55 60
Phe Lys Val Ile Ala Leu Thr Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Leu His Lys Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe
85 90 95
Asp Gly Thr Ser Pro Ala Ile Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe
100 105 110
Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Thr Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn
115 120 125
Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly
130 135 140
Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg
145 150 155 160
Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Lys Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg
165 170 175
Ala Asp Cys Val Thr Thr Asp Lys Thr His Thr Gly Tyr Ile Pro Glu
180 185 190
Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val
195 200 205
Leu Leu Ser Thr Phe Leu Asp Lys Thr His Thr Ile Cys Pro Ala Cys
210 215 220
Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225 230 235 240
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp
245 250 255
Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly
260 265 270
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn
275 280 285
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp
290 295 300
Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro
305 310 315 320
Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu
325 330 335
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser
340 345 350
Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
355 360 365
Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr
370 375 380
Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe
405 410 415
Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys
435 440
<210> 8
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgcatcacc accatcacca ccatcatcac catatgcgtc tgtcctgcaa ggaagactac 60
cgttacgcca tctcctccac caacgaaatc ggtcctctgg gtgccgaggg cctgaccacc 120
acctggcgtg agtacagcca cggtctgcag ctggacgacg gcaccgtccg cgctatctgc 180
actgccggtt ccttcaaggt cattgccctg accgtcgtgt cccgtcgcta cctggcctcc 240
ctgcacaagc gtgccctgcc tacctccgtg accttcgaac tgctgttcga cggtacttcc 300
cctgccatcg aagagatggg tgacgacttc ggcttcggtc tgtgcccttt cgacaccacc 360
cctgtcgtga agggtaaata caacaccact ctgctgaacg gctccgcttt ctacctggtg 420
tgccctatcg gttggaccgg cgtcatcgag tgcaccgctg tcagccctac taccctgcgc 480
actgaggtcg tcaagacctt caagcgtgaa aagcctttcc cccaccgcgc tgactgcgtc 540
accactgaca agactcacac tggctacatc cctgaggccc cccgtgacgg tcaggcttac 600
gtgcgtaagg acggtgaatg ggtcctgctg tccactttcc tggacaagac tcataccatc 660
tgccccgcct gcgaatcccc cggtccctct gtcttcatct tcccccccaa gcccaaggac 720
actctgatga tcagccgcac cccccaggtg acctgcgtgg tggtggacgt cagccaggaa 780
aaccctgaag tccagttctc ctggtacgtc gacggtgtcg aggtccacac tgcccagact 840
cgccccaagg aggagcagtt caactccact taccgcgtcg tgtccgtgct gcctatccag 900
caccaggact ggctgaacgg caaggagttc aagtgcaagg tcaacaacaa ggacctgccc 960
gctcccatca ctcgtatcat cagcaaggct aagggccaga ctcgcgagcc tcaggtctac 1020
accctgcccc cccacgccga ggagctgtca aggtccaagg tctccatcac ctgcctggtc 1080
atcggcttct accctcctga catcgacgtg gaatggcagc gtaacggcca gcctgagcct 1140
gaaggtaact accgtaccac ccctccccag caggacgtcg acggtaccta cttcctgtac 1200
tccaagttca gcgtggacaa ggcctcctgg cagggtggtg gtatcttcca gtgcgctgtc 1260
atgcacgagg ctctgcacaa ccactacacc cagaagtcca tctccaagac ccccggcaag 1320
taa 1323
<210> 9
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met His His His His His His His His His His Met Arg Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Pro
20 25 30
Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Arg Glu Tyr Ser His Gly
35 40 45
Leu Gln Leu Asp Asp Gly Thr Val Arg Ala Ile Cys Thr Ala Gly Ser
50 55 60
Phe Lys Val Ile Ala Leu Thr Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Leu His Lys Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe
85 90 95
Asp Gly Thr Ser Pro Ala Ile Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe
100 105 110
Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Thr Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn
115 120 125
Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly
130 135 140
Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg
145 150 155 160
Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Lys Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg
165 170 175
Ala Asp Cys Val Thr Thr Asp Lys Thr His Thr Gly Tyr Ile Pro Glu
180 185 190
Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val
195 200 205
Leu Leu Ser Thr Phe Leu
210
<210> 10
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgcatcacc accatcacca ccatcatcac catatgcgtc tgtcctgcaa ggaagactac 60
cgctacgcta tcagcagcac taacgaaatc ggtcccctgg gtgccgaggg cctgaccact 120
acttggcgcg aatactccca cggcctgcag ctggacgacg gtaccgtgcg tgctatctgc 180
accgccggct ccttcaaggt cattgctctg accgtggtga gccgtcgtta cctggcttcc 240
ctgcacaagc gtgccctgcc tacctccgtg actttcgagc tgctgttcga cggcaccagc 300
cctgctatcg aggagatggg tgacgacttc ggtttcggcc tgtgcccctt cgacaccact 360
cctgtggtga agggtaaata caacaccacc ctgctgaacg gctccgcttt ctacctggtc 420
tgccccatcg gttggaccgg tgtcatcgaa tgcactgccg tctcccctac cactctgcgt 480
actgaggtgg tgaagacctt caagcgtgag aagcctttcc cccaccgcgc tgactgcgtc 540
accaccgaca agacccacac cggctacatc cctgaggccc ctcgcgacgg tcaggcttac 600
gtgcgcaagg acggtgagtg ggtcctgctg agcaccttcc tgtaa 645
<210> 11
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atggatgcca tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtgtttgtc 60
tctcccagc 69
<210> 12
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Arg Leu Ser Cys Lys Glu Asp Tyr Arg
20 25 30
Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu Gly
35 40 45
Leu Thr Thr Thr Trp Arg Glu Tyr Ser His Gly Leu Gln Leu Asp Asp
50 55 60
Gly Thr Val Arg Ala Ile Cys Thr Ala Gly Ser Phe Lys Val Ile Ala
65 70 75 80
Leu Thr Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Arg Ala
85 90 95
Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Ser Pro
100 105 110
Ala Ile Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe
115 120 125
Asp Thr Thr Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn
130 135 140
Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile
145 150 155 160
Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys
165 170 175
Thr Phe Lys Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Ala Asp Cys Val Thr
180 185 190
Thr Asp Lys Thr His Thr Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly
195 200 205
Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe
210 215 220
Leu Asp Lys Thr His Thr Ile Cys Pro Ala Cys Glu Ser Pro Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr
275 280 285
Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg
325 330 335
Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr
355 360 365
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370 375 380
Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Ser Val
405 410 415
Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr
435 440 445
Pro Gly Lys Ala His His His His His His His His His His
450 455 460
<210> 13
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
atggatgcca tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtgtttgtc 60
tctcccagcc ggcttagctg caaggaggac tatcgctacg ccatatcctc aaccaacgag 120
attggccccc tgggtgcgga aggcctgact accacctgga gggagtacag ccacgggctc 180
cagttggacg atggcactgt gagagcaatc tgcaccgcgg gaagctttaa ggtgatagcc 240
ctgacggtcg taagcaggag gtatcttgcc agtttgcaca agagggctct gcccaccagc 300
gtaaccttcg agcttctgtt cgacggcaca tcaccggcga tcgaggagat gggtgacgac 360
tttggctttg gcctgtgccc cttcgatacc acccccgtcg tgaaaggcaa gtacaacacg 420
acactgctca acggcagcgc cttttacctg gtgtgtccca tcggatggac cggcgtcatc 480
gagtgcacag cggtttcccc tactacgctg aggaccgaag tggtcaagac cttcaagcga 540
gagaagccct ttccccacag ggcggattgt gtgaccaccg acaaaaccca caccggctac 600
atccccgagg cccccaggga cggccaggcg tacgtgagga aggatggcga gtgggtgctg 660
ctgtccactt tcctggacaa gacccatacg atctgtccag cctgcgagtc cccaggccca 720
tcagtgttca ttttcccccc taagcccaag gacaccctga tgatcagccg gaccccgcag 780
gtgacctgtg tggttgtgga cgtgagccaa gagaacccgg aggtgcaatt ctcctggtac 840
gtagatgggg tggaagtcca cacggcccag accaggccta aagaggagca gttcaacagc 900
acgtacaggg tggttagcgt gctgcccatc cagcaccagg actggttgaa tggcaaagag 960
ttcaagtgca aggtgaacaa caaggatctg cctgccccta ttactcggat catctccaag 1020
gccaagggcc aaaccaggga gccccaggtc tataccctgc ctccgcacgc ggaggagctg 1080
agcaggtcca aggtgtcaat cacgtgcctg gtgatcggct tctatccccc tgacatcgac 1140
gtggagtggc agaggaatgg ccaacccgaa ccagagggca actaccgcac cacacccccc 1200
caacaggatg tggatggtac ctacttcctg tatagcaagt tcagcgtgga taaggcgagc 1260
tggcagggag gcggcatctt ccagtgcgcc gtgatgcacg aggcactgca taaccactac 1320
acccagaaga gcatcagtaa gacccctggt aaggctcatc accaccatca ccaccatcat 1380
caccattaa 1389
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggtgcatcga tgcagggg 18
<210> 15
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu
1 5 10 15
Gly Leu Thr Thr Thr Trp
20
<210> 16
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Thr Thr Thr Trp Arg Glu Tyr Ser His Gly Leu Gln Leu Asp Asp Gly
1 5 10 15
Thr Val Arg Ala Ile Cys Thr Ala Gly Ser Phe Lys
20 25
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Gly Ser Phe Lys Val Ile Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu
1 5 10 15
Ala Ser Leu His Lys Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu
20 25 30
<210> 18
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Ser Pro Ala Ile Glu Glu Met
1 5 10 15
Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Ser Pro Phe Asp Thr
20 25
<210> 19
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Ala Ile Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Ser Pro Phe
1 5 10 15
Asp Thr Thr Pro Val Val Lys
20
<210> 20
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr
20 25
<210> 21
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu
1 5 10 15
Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Lys Arg Glu Lys Pro Phe Pro His
20 25 30
<210> 22
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu Ser Ser
1 5 10
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Ala Gln Gly Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Lys Val Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln
1 5 10
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Ala Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His
1 5 10
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Ala Ile Ser Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu
1 5 10 15
Thr Thr Thr Trp
20
<210> 28
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Thr Thr Thr Trp Lys Glu Tyr Asn His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly
1 5 10 15
Thr Val Lys Ala Ser Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys
20 25
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu
1 5 10 15
Ala Ser Leu His Lys Lys Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu
20 25 30
<210> 30
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 30
Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met
1 5 10 15
Gly Asp Asp Phe Arg Ser Gly Leu Cys Pro Phe
20 25
<210> 31
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 31
Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val
1 5 10 15
Lys Thr Phe Arg Arg Asp Lys Pro Phe Pro His
20 25

Claims (10)

1.Fd片段作为鉴别标签在制备猪瘟病毒亚单位疫苗和/或核酸疫苗中的应用，所述Fd片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种猪瘟病毒E2重组蛋白，其特征在于，所述猪瘟病毒E2重组蛋白包括猪瘟病毒2.1亚型的E2ab片段、Fd片段和猪免疫球蛋白IgG的Fc片段，所述Fd片段的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；优选的，所述猪瘟病毒2.1亚型的E2ab片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选的，所述猪免疫球蛋白IgG的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述的猪瘟病毒E2重组蛋白，其特征在于，所述猪瘟病毒E2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；优选地，所述猪瘟病毒E2重组蛋白还包括His标签。
4.编码权利要求2或3所述的猪瘟病毒E2重组蛋白的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.8所示。
5.与权利要求4所述的核酸分子相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为(1)～(3)中任一种；
(1)表达盒，含有权利要求4所述的核酸分子；
(2)重组载体，含有权利要求4所述的核酸分子或(1)中表达盒；
(3)重组细胞，含有权利要求4所述的核酸分子、(1)中表达盒或(2)中重组载体。
6.(a1)～(a3)中任一项在制备预防或治疗猪瘟的疫苗中的应用；
(a1)权利要求2所述的猪瘟病毒E2重组蛋白；
(a2)权利要求4所述的核酸分子；
(a3)权利要求5所述的生物材料。
7.一种猪瘟病毒E2亚单位疫苗，包括权利要求2或3所述的猪瘟病毒E2重组蛋白。
8.一种猪瘟病毒E2的核酸-蛋白复合疫苗，包含核酸疫苗和权利要求7所述的猪瘟病毒E2亚单位疫苗。
9.根据权利要求8所述的核酸-蛋白复合疫苗，其特征在于，所述核酸疫苗包括编码和表达SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的质粒；优选地，所述核酸疫苗和所述的猪瘟病毒E2亚单位疫苗的质量比为(3～7):4。
10.一种区别A免疫、B免疫、弱毒疫苗C株免疫或野毒株感染的鉴别方法；
所述A为权利要求7所述的猪瘟病毒E2亚单位疫苗；所述B为权利要求8或9所述的核酸-蛋白复合疫苗免疫；
所述鉴别方法为非疾病诊断或治疗方法。
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