DE102020004714A1 - Verwendung der T4-Foldon-Peptiddomäne als Surrogatmarker in Immunoassays - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung der T4-Foldon-Peptiddomäne (Fd) als Surrogatmarker in einem immunologischen Verfahren zur qualitativen und quantitativen Überwachung (Monitoring) von Immunantworten bzw. zur Charakterisierung von Antikörper-Profilen (Immunoassay).

Description

  • Die Erfindung betrifft die Verwendung der T4-Foldon-Peptiddomäne (Fd) als Surrogatmarker in einem immunologischen Verfahren zur qualitativen und quantitativen Überwachung (Monitoring) von Immunantworten bzw. zur Charakterisierung von Antikörper-Profilen (Immunoassay).
  • Coronaviren stellen eine ernsthafte Bedrohung für die globale Gesundheit dar, wie das schwere akute respiratorische Syndrom (SARS), das nahöstliche respiratorische Syndrom (MERS) und COVID-19 belegen. Das SARS-Coronavirus (SARS-CoV), das MERS-Coronavirus (MERS-CoV) und das neuartige SARS-CoV-2-Coronavirus sind die Erreger von SARS-, MERS- und COVID-19-Krankheitsausbrüchen. Es werden daher dringend sichere Impfstoffe benötigt, die schnell wirksame und lang anhaltende virus-spezifische Immunantworten gegen diese Infektionserreger auslösen. Dies ist in Anbetracht der aktuellen und nach wie vor um sich greifenden COVID-19-Pandemie besonders wichtig. Zahlreiche Corona Impfstoffe verwenden die T4-Foldon-Peptiddomäne (Fd) zur Verbesserung der Immunantwort.
  • Im Rahmen vieler Infektionserkrankungen, beispielsweise einer SARS-CoV2-Infektion, bilden sich nicht nur Antikörper, die zu einer Neutralisierung der viralen Infektion, sondern eventuell sogar zu einer Verstärkung der Krankheitssymptome führen. Dieser Prozess wird „Antibody-dependent Enhancement (ADE)“ genannt. Die Ursache sind infektionsverstärkende Antikörper, die an die Oberfläche von Viren binden, jedoch diese nicht neutralisieren, sondern zu einer verbesserten Aufnahme des Virus in eine Zelle führen und damit die Ausbreitung und Vermehrung des Virus begünstigen. Infektionsverstärkende Antikörper fördern daher eine Immunpathogenese und bilden eine mögliche Gefahr bei der Entwicklung und Verwendung von Vakzinen, die dann zu einem sog. „Vaccinedependent Enhancement (VDE)“ der Infektion führen können
  • Zudem stellt sich die wichtige Frage, worin sich die Antikörper-Profile von COVID-19-Patienten, die kaum oder nur schwache Symptome zeigen, von Patienten unterscheiden, die auf die Intensivstation verlegt und sogar beatmet werden müssen.
  • Beim SARS-Cov-2-Coronavirus ist das Spike(S)-Glycoprotein auf der Virushülle entscheidend für die Übertragung und Infektion und bestimmt den Tropismus des Virus- und Wirtszelleneintritts. Tropismus bezeichnet in der Virologie die Fähigkeit eines Virus, eine bestimmte Sorte von Zellen oder bestimmte Gewebe zu infizieren und sich dort zu vermehren. SARS-CoV-2 bindet über eine Domäne (sog. „Receptor-binding Domaine, RBD) der S1-Untereinheit des S-Proteins an den ACE2-Rezeptor (ACE2 = „Angiotensine-Converting Enzyme 2“) und verwendet dann seine C-terminale Transmembranuntereinheit (S2) zur Fusion mit der Wirtszellmembran. Aufgrund dieser lebenswichtigen funktionellen Eigenschaft und der festgestellten Antigenität ist das S-Protein ein wichtiges Ziel für die Impfstoffentwicklung. Die nativen S-Proteine existieren als trimere Form auf der Oberfläche des Virus. Wenn jedoch seine Ektodomäne (darunter versteht man den Abschnitt (Domäne) eines Membranproteins, der in den Extrazellulärraum ragt) oder die Untereinheit S1 in eukaryotischen Systemen als rekombinantes Protein exprimiert wird, liegt das Protein überwiegend in monomerer Form vor.
  • Man hat daher versucht, zur Verbesserung der Antigenität von potentiellen Vakzinen die trimeren Formen auf der Virenoberfläche nachzuahmen. Ein Peptid mit 27 Aminosäureresten, dass als Foldon-Domäne bezeichnet wird und vom C-Terminus des Fibritins aus dem Bakteriophage-T4 abgeleitet ist (daher auch die Bezeichnung T4-Foldon-Peptiddomäne), stellt eine natürliche Trimerisierungsdomäne dar, die zur Trimerisierung von Peptiden oder Proteinen führt. Der Einschluss einer T4-Foldon-Peptiddomäne in ein potentielles Vakzin fördert die Ausbildung einer trimeren Struktur und es wurde gezeigt, dass dadurch die Immunogenität mehrerer viraler Antigene, einschließlich Influenzavirus-Hämagglutinin, HIV-1-Glykoprotein und SARS-CoV S1/S-Ektodomäne, unterstützt wird.
  • Der Einschluss einer T4-Foldon-Peptiddomäne in ein potentielles Vakzin kann mit beliebigen biotechnologischen Methoden (z.B. DNA-, RNA-Vakzine) oder als rekombinantes Fusionsprotein erfolgen. Beispielsweise durch die gemeinsame Expression von translatierter DNA- oder mRNA-Sequenzen, die ein potentielles Antigen und die T4-Foldon-Peptiddomäne kodieren, bzw. durch die chemische Peptidtotalsynthese eines potentiellen Antigens mit einer T4-Foldon-Peptiddomäne oder als rekombinantes Protein.
  • Es wurde zudem gefunden, dass verschiedene Tiere Antikörper gegen die T4-Foldon-Peptiddomäne bilden können, beispielsweise Lamas und Kaninchen. Dabei kann es sich um Antikörper vom Typ IgM, IgA, IgG mit seinen Subtypen IgG1, IgG2, IgG3, IgG 4 handeln.
  • Erfindungsgemäß wird hier die Verwendung der T4-Foldon-Peptiddomäne (Fd) als Surrogatmarker in einem immunologischen Verfahren zur qualitativen und quantitativen Überwachung (Monitoring) von Immunantworten bzw. zur Charakterisierung von Antikörper-Profilen (Immunoassay) angegeben. Als Surrogatmarker (synonym: Surrogatparameter; von lat. surrogatum = Ersatz) bezeichnet man in klinischen Studien allgemein einen Messwert, dessen Beeinflussung die Wirkung einer Intervention, also z.B. einer Therapie, auf ein übergeordnetes medizinisches Phänomen, z.B. das Auftreten einer Krankheit oder eines Symptoms, anzeigen soll. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der T4-Foldon-Peptiddomäne (Fd) als Surrogatmarker werden gegen diese gerichtete Antikörper qualitativ oder quantitativ bestimmt, wodurch es beispielsweise möglich ist, festzustellen, ob das Vorhandensein der Antikörper auf eine vorherige Impfung mit T4-Foldon-Peptiddomäne-haltigen (z.B. Fusionsproteine) oder -exprimierenden (z.B. mRNA) Vakzinen zurückzuführen ist oder auf normal vorhandene (präexistierende) Antikörper (z.B. spezifischer oder kreuzreagierender Natur).
  • Die beanspruchte Erfindung betrifft somit die im Hauptanspruch definierte Verwendung.
  • Bevorzugte und/oder vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
  • Das erfindungsgemäß verwendete T4-Foldon-Peptid ist an sich bekannt und hat folgende Aminosäuresequenz:
  • GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
  • Dem Fachmann ist klar, das einzelne oder auch mehrere Aminosäurereste durch isofunktionelle Aminosäurereste ausgetauscht werden können, ohne die Trimerisierungsfunktion zu beeinträchtigen. Isofunktionelle Aminosäuren sind dem Fachmann geläufig, so dass hier auf eine Auflistung verzichtet werden kann. Die T4-Foldon-Peptiddomäne kann am C-terminalen oder am N-terminalen Ende einen Biotinrest und einen oder mehrere (z.B. 2) PEG2-Spacer aufweisen. Auch weitere Markierungen (Tags) sind möglich. PEG2 ist chemisch 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure. Die PEG2-Spacer haben die Funktion, dem Biotinrest den Kontakt mit einer Avidin- oder Streptavidin-Bindungsdomäne zu ermöglichen, so dass es zur Ausbildung einer Avidin-Biotin-Bindung kommt, durch die die T4-Foldon-Peptiddomäne als Antikörper-Fänger genutzt werden kann.
  • Die an die T4-Foldon-Peptiddomäne gebundenen Antikörper können auf beliebige Weise gemessen werden, beispielsweise mit einem ELISA („Enzyme-linked Immunosorbent Assay“), Multiplex-ELISA oder mit BEAD-Assays. Auch eine massenspektrometrische Erfassung der gebundenen Antikörper ist möglich.
  • Die erfindungsgemäße Verwendung eignet sich insbesondere auch zur Untersuchung der Effektivität von SARS-CoV-2-mRNA-Vakzinen mit eingebauten T4-Foldon-Peptiden als Trimerisierungsdomänen. Die erfindungsgemäße Verwendung eignet sich außerdem insbesondere zur qualitativen und quantitativen Überwachung (Monitoring) der durch B-Zellen vermittelten Immunität nach einer Impfung mit SARS-CoV-2-Vakzinen mit eingebauten T4-Foldon-Peptiden als Trimerisierungsdomänen. Die quantitative Erfassung des Antikörper-Titers über die Zeit erlaubt, eine Normierung der gegen das SARS-CoV2-Virus gerichteten Antikörper, die als neutralisierend und nicht-neutralisierend eingestuft werden bzw. deren Titer in Relation zu dem T4-Foldon-Peptid-Titer gesetzt werden.
  • Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird die Existenz einer T4-Foldon-Peptid-Trimer vermittelten Immunität in T-Zell-ELISpot-Messungen geprüft, um zu klären, ob T4-Foldon-Peptid-spezifische T-Zellen im ELISpot-Assay aktiviert werden. Der ELISpot-Assay („Enzyme-Linked Immuno Spot Assay“) dient zum Nachweis sezernierter Cytokine oder Antikörper, die von einzelnen Immunzellen nach Stimulation mit Antigenen sezerniert und an einer Membran immobilisiert werden. Auch die Verwendung des T4-Foldon-Peptides als MHC-Tetramer ist möglich. MHC-Tetramere finden in einem sog. Tetramer-Assay (auch als Tetramer-Färbung bekannt) Verwendung. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem tetramere Proteine zum Nachweis und zur Quantifizierung von T-Zellen verwendet werden, die für ein bestimmtes Antigen in einer Blutprobe spezifisch sind. Die im Assay verwendeten Tetramere bestehen aus vier Haupthistokompatibilitätskomplexmolekülen (MHC = Major Histocompatibility Complex), die sich auf der Oberfläche der meisten Zellen im Körper befinden
  • T4-Foldon-Peptid-Vakzine können nämlich dazu führen, das SARS-CoV2-assoziierte Virus-spezifische B- und T-Zell-Antworten T4-Foldon-Peptid-abhängig werden, was bei einer SARS-CoV2-Infektion natürlich nicht der Fall ist, so dass diese T- und B-Zellen bei einer SARS-CV2-Infektion gar nicht aktiviert werden. Der Körper hätte durch die Impfungen dann einen Impfschutz erhalten, aber möglicherweise unter der Kontrolle linearer T4-Foldon-Peptid-Sequenzen, die mit dem MHC-Komplex (MHC = Major Histocompatibility Complex) interagieren und deshalb die entsprechenden gegen SARS-CoV2 gerichteten B- (MHC Klasse II vermittelt) und T-Zellen (MHC Klasse I vermittelt) nicht mehr aktivieren können.
  • Insbesondere können diese Antikörper unerwartete Impf-Nebenwirkungen auslösen, die zu kurzfristigen und längerfristigen Impfschäden beitragen könnten, falls diese Antikörper mit Strukturen des menschlichen Organismus kreuzreagieren sollten.
  • Mit der Verwendung des T4-Foldon-Peptid-Trimers werden in der In-vitro-Diagnostik bzw. in Geweben, Flüssigkeiten wie Blutproben bestimmt:
    • • Interagieren Substanzen mit dem Peptid?
    • • Welche Substanzen sind es?
    • • Handelt es sich um Antikörper?
    • • Welche Art der Antikörper treten qualitativ auf?
    • • Quantitative Bestimmung der Peptid-Antikörper-Reaktivitäten der Antikörper-Subtypen.
    • • Erfolgte eine Vakzinierung mit T4-Foldon-haltigen Impfstoffen (Fusionsproteine)?
    • • Erfolgte eine Vakzinierung mit DNA- oder RNA-Vakzinen, die zu einer Expression der T4-Foldon-Domäne führte?
    • • Lassen sich Proteine, die an das T4-Foldon-Trimer binden, aufreinigen und charakterisieren (immunochemisch bzw. massenspektrometrisch)?
    • • Welche Antikörper werden mittels T4-Foldon-Trimer aufgereinigt?
    • • Ist der T4-Foldon-Antikörper-Titer über eine Vakzinierung entstanden oder handelt es sich um normal vorkommende Antikörper (spezifischer oder kreuzreagierender Natur)?
    • • Durch die Aufreinigung von T4-Foldon-Antikörpern kann in High-density-peptide- und protein-Assays geklärt werden, ob diese Antikörper mit menschlichen Gewebestrukturen kreuzreagieren und damit zu Nebenwirkungen/Impfschäden führen könnten.
    • • Es ist zu klären, ob prä-existierende T4-Foldon-Trimer-Antikörper Einfluß auf die Effizienz der Vakzinierung mit T4-Foldon-abhängigen Antikörpern haben.
    • • Die T4-Foldon-Antikörper dienen als Nachweis für eine vorhergehende Impfung mit T4-Foldon-haltigen bzw. exprimierenden Impfstoffen.
    • • Der Titer-Verlauf über die Zeit gibt ein Maß für den zeitlichen Verlauf an, ob die einzelnen Antikörper gegen das SARS-CoV2- und/oder gegen das T4-Foldon-Trimer gerichtet unterschiedliche Titerverläufe (Antikörperprofile) haben.
    • • Der T4-Foldon-Antikörper-Titer ermöglicht die Verwendung als qualitativer und quantitativer Surrogatmarker für die Effizienz und den Verlauf einer SARS-CoV2-spezifischen Impfung.
  • Im folgenden wird die Erfindung lediglich beispielhaft am SARS-CoV2-Corona-Virus erläutert:
    • Es werden rekombinante Proteine wie das Spike-Protein, sowie das N-Capsid-Protein, bzw. Peptide dieser Peptide, bzw. das T4-Foldon-Peptid über Biotin an eine MesoScale-Platte (im Handel von Meso Scale Discovery, Inc erhältlich) gebracht und dann mit einem Puffer abgesättigt.
  • Es werden dann die Blutproben von Probanden gewonnen: Die entweder Covid-19 schon durchge- Tabelle 1
    Tag7 Tag 7 Tag 7 Tag 14 Tag 28 Tag90 Tag180 Tag360 Tag 0
    Anti-IgM Anti-IgA Anti-IgG Anti-IgG Anti-IgG Anti-IgG Anti-IgG Anti-IgG Anti-IgG
    Gesunder Patient N-Capsid Protein 1452 655 2554 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
    Spike-Protein 736 2366 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
    Foldon-Peptid 840 166 3451 n.d. n.d, n.d. n.d. n.d. n.d.
    MHC-I-Peptid 2400 80 160 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
    MHC-II-Peptid 3450 98 433 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
    COVID-19 Patient N-Capsid Protein 450365 46243 12043 45326 95466 16432 12453 13423 n.d.
    Spike-Protein . 640232 34167 23431 56000, 87276 23578 16500 12786 n.d.
    Foldon-Peptid 1306 1534 2321 2456 2731 2144 2155 1342 n.d.
    MHC-I-Peptid 3256 2365 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
    MHC-II-Peptid 2765 290 3122 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
    SARS.CoV2 Infection
    Vakzine mit Foldon N-Capsid Protein 3121 2333 5634 3255 3521 45287 78432 14504 9573
    Spike-Protein 245121 24024 27432 36387 23329 54045 594347 25322 14564
    Foldon-Peptid ; 25460 8657 17254 . 25325 12403 9254 4032 2387 2196
    MHC-I-Peptid 5302 59 3687 4675 n.d n.d n.d n.d n.d
    MHC-II-Peptid 4367 47 2452 3654 n.d n.d n.d n.d n.d
    Tag 28 (2.Vaccinat.)
    Vakzine mit Foldon N-Capsid Protein 3121 2333 5634 3255 5323 4785 3333 4354 1459
    Spike-Protein 245121 24024 67432 86387 77458 240678 129765 45032 7876
    Foldon-Peptid 25460 8657 27254 45325 47532 87455 30434 23565 354
    MHC-I-Peptid 5302 59 3687 4675 4634 4123 2876 4539 4764
    4 MHC-II-Peptid 4367 47 2452 3654 3521 3574 4321 3888 4544
    Tabelle 2
    Anti-IgM-Tag7 Anti-IgA-Tag 7 Anti-IgG-Tag7 Anti-IgG-Tag 14 Anti-IgG-Tag 28 Anti-IgG-Tag90 Anti-IgG-Tag180 Anti-IgG-Tag360 Ant-IgG-Tag 0
    Gesunder Patient - N-Capsid Protein 1452 655 2554 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
    Gesunder Patient - Spike-Protein 954 736 2366 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
    Gesunder Patient - Foldon-Peptid 840 166 3451 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
    COVID-19 Patient - N-Capsid Protein 450365 46243 12043 45326 95466 16432 12453 13423 n.d.
    COVID-19 Patient - Spike-Protein 640232 34167 23431 56000 87276 23578 16500 12786 n.d.
    COVID-19 Patient - Foldon-Peptid 1306 1534 2321 2456 2731 2144 2155 1342 n.d.
    Vakzine mit Foldon - N-Capsid Protein 3121 2333 5634 3255 3521 45287 78432 14504 9573
    Vakzine mit Foldon - Spike-Protein 245121 24024 27432 36387 23329 54045 59434 25322 14564
    Vakzine mit Felden - Foldon-Peptid 25460 8657 17254 25325 12403 9254 4032 2387 2196
    Vakzine mit Foldon - N-Capsid Protein 3121 2333 5634 3255 5323 4785 3333 4354 1459
    Vakzine mit Foldon - Spike-Protein 245121 24024 67432 86387 77458 240678 129765 45032 7876
    Vakzine mit Foldon - Foldon-Peptid 25460 8657 27254 45325 47532 87455 30434 23565 354

Claims (6)

  1. Verwendung der T4-Foldon-Peptiddomäne (Fd) als Surrogatmarker in einem immunologischen Verfahren (Immunoassay) zur qualitativen und quantitativen Überwachung (Monitoring) von Immunantworten bzw. zur Charakterisierung von Antikörper-Profilen.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die T4-Foldon-Peptidomäne in antigenhaltige bzw. antigenexprimierende Vakzine integriert ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das antigenhaltige Vakzin mindestens ein Fusionsprotein umfasst, dass mindestens ein Antigen und mindestens eine T4-Foldon-Peptiddomäne aufweist.
  4. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das antigenexprimierende Vakzin mindestens eine mRNA umfasst, die mindestens ein Fusionsprotein codiert, das mindestens ein Antigen und mindestens eine T4-Foldon-Peptiddomäne aufweist.
  5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Antigen ein SARS-CoV-2-Antigen ist.
  6. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in dem Immunoassay qualitativ und quantitativ gegen die T4-Foldon-Peptiddomäne gebildete Antikörper bestimmt werden.
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CN115073608A (zh) * 2022-03-22 2022-09-20 广东海大集团股份有限公司 一种猪瘟病毒e2的核酸-蛋白复合标记性疫苗

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