CN109601007B - 一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法。将密码子优化的FMDV的P12A和3C基因两个ORF串联插入转移载体构建重组表达质粒；或通过启动子SV40下的包含P12A3C基因的单一ORF克隆入载体构建重组表达质粒，转化感受态细胞得到重组Bacmid‑DNA，转染sf9细胞，得到能够表达口蹄疫病毒样颗粒蛋白的昆虫细胞。将该细胞培养后收集上清，超滤浓缩、离心、层析纯化VLP，制备口蹄疫病毒样颗粒疫苗。

Description

一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法，以及以其制备的口蹄疫疫苗。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是一种急性、高度传染性的动物疾病。主要侵害偶蹄目动物，偶见于人和其它动物。易感动物主要包括牛、水牛、绵羊、山羊、骆驼和猪等20个科的70多种偶蹄类家养和野生哺乳动物。由于口蹄疫的高度传染性和对农业经济的重大影响，国际兽疫局(OIE)将其列为A类动物传染病的首位。

2005年亚洲1型口蹄疫的传入，2009年A型口蹄疫的传入，特别是近年来O型中和逃避变异株的广泛流行，已对我国的养猪业和养牛业造成不可估量的损失。对于大多数国家而言，以免疫预防为主的策略是控制和消灭口蹄疫的唯一有效途径，而免疫预防的难题来自口蹄疫病毒的高度变异性和多型性、动物机体特别是猪体对口蹄疫病毒疫苗免疫的顿感性、以及发展中国家较低水平的口蹄疫疫苗制备工艺和产品质量。根据充分的调查和研究，我国现有的口蹄疫全病毒灭活疫苗不但免疫效力差，而且副反应重，流行的O型变异株可基本上可逃逸现有疫苗的保护作用，这导致国家免费发放的疫苗少被使用、口蹄疫周而复始地流行。每次流行的间歇期是自然感染免疫而不是疫苗接种的结果；由于不同血清型病毒和变异株的同时存在和流行，口蹄疫感染常重复发生，所以研发和生产新型O型口蹄疫疫苗迫在眉睫。

传统疫苗包括灭活疫苗和弱毒疫苗两种类型。其中弱毒疫苗采用经典的弱化病毒的方式，将母毒通过在豚鼠，鸡胚或者细胞种经过多代的培养弱化，使病毒逐渐发生基因突变，产生弱毒毒株。弱毒毒株在组织培养物中经过大量扩增后，加入佐剂等制成疫苗。但由于病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒逃逸疫苗加工厂等不安全因素，世界上一些地区口蹄疫的暴发似乎与灭活疫苗中残存的活病毒有关，促使人们寻求一种更加安全有效的口蹄疫疫苗。口蹄疫弱毒疫苗在进行免疫预防的过程中，能产生一定水平的保护，对口蹄疫的流行有一定的控制作用。但是由于弱毒疫苗也是活病毒，在预防接种的过程中造成动物携带病毒的状态，在易感动物体内长期存活的过程中，弱毒的口蹄疫毒株很有可能恢复毒力。同时，弱毒病毒在易感动物体内的增殖也会对产生的保护免疫有抑止的作用，不能达到最佳的免疫效果。由于上述的原因，弱毒疫苗已经逐渐淘汰，但灭活疫苗还在许多国家和地区广泛应用。

由于口蹄疫病毒的不断变异和新病毒的出现，传统灭活和裂解疫苗对人类和牲畜的保护率在下降，灭活不彻底导致的散毒时有发生，研发新型亚单位疫苗尤为迫切。病毒样颗粒(Virus Like Particle，VLP)疫苗的出现为研发新型安全有效的疫苗提供了一个新的契机。VLP疫苗是通过分子生物学技术，表达病毒的一个或多个结构蛋白，这些结构蛋白具有天然的自组装配能力，可形成与天然病毒颗粒相似的空间构型和抗原表位但无病毒核酸，免疫原性强，又没有感染性，不存在灭活不完全或毒力回复的风险，并且表面有高密度的病毒抗原，保存了构象表位，可通过和全病毒感染机体一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生体液免疫和细胞免疫，缩短空窗期。VLP疫苗的优点还在于避免了灭活过程中可能破坏一些重要的抗原决定簇。此外，还有一个优点是可根据其需要任意改造抗原的氨基酸序列，使之能更好地刺激机体产生保护性免疫反应。

口蹄疫VLP疫苗商业化的关键是能够大量高效的制备口蹄疫VLP产品。目前重组疫苗常用的表达系统原核表达系统和酵母表达系统无法同时表达多个衣壳蛋白并自组装成为病毒样颗粒，昆虫细胞和杆状病毒系统能够很好解决这一问题。对于需要表达诸如口蹄疫等的由多个蛋白组成的病毒衣壳，这个系统具有巨大成本优势和产品的更佳免疫原性。相比原核表达系统和酵母系统表达的单个蛋白，经过纯化后再人工结合成为VLP,昆虫细胞和杆状病毒系统生产VLP疫苗过程大大简化，产率可以提高10-100倍，可以实现大规模生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从昆虫杆状病毒表达系统获得的口蹄疫病毒样颗粒。

本发明的另一目的在于提供一种口蹄疫疫苗。

本发明的再一目的在于提供一种同时含有口蹄疫病毒P12A基因和3C基因的重组表达载体。

为了提高蛋白的表达量，本发明利用昆虫细胞偏爱密码子对所述核酸序列进行了密码子优化。根据GenBank序列LOCUS AET43040 2332 aa linear VRL 15-FEB-2012DEFINITION polyprotein[Foot-and-mouth disease virus-type O]ACCESSIONAET43040，确定了导致我国口蹄疫流行的主要毒株(血清O型)及其基因序列。在此基础之上，按照昆虫细胞转译过程对密码子的偏爱性，化学合成口蹄疫VLP所需的编码基因片段。口蹄疫VLP的包装需要P12A和3C蛋白，所以化学合成序列分别对应P12A基因和3C基因。具体序列如下：

P12A基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列组成结构包括RsrII-Kozaksequence-起始密码子-HBS信号肽-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-终止密码子-SV40 PolyA信号-EcoRI。

3C基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，序列组成结构如下，分别用不同标识表示：SphI-Polyhedrin启动子-载体序列-起始密码子-HBS信号肽-3C-终止密码子-HindIII。

本发明首先提供了一种重组表达载体，其含有口蹄疫病毒P12A基因和3C基因；所述口蹄疫病毒P12A基因其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；或由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代或缺失一个或几个核苷酸，得到编码P12A蛋白的核苷酸序列；

所述口蹄疫病毒3C基因其核苷酸序列是如SEQ ID No.2所示或由SEQ ID No.2所示核苷酸序列经取代或缺失一个或几个核苷酸，得到编码3C蛋白的核苷酸序列。

本发明的重组表达载体，通过以下方法制备得到：用Sph I和Hind III对3C基因片段和pFastBac HT-B进行双酶切，酶切后3C基因片段与pFastBac HT-B进行连接转化，得到pFastBac HT-B-3C；用Rsr II和EcoR I对P12A基因片段和pFastBac HT-B-3C进行双酶切，酶切后进行连接转化，构建得到pFastBac HT-B-P12A-3C重组表达质粒。

含有本发明上述重组表达载体的宿主细胞属于本发明的保护范围。

进一步地，本发明提供一种口蹄疫病毒样颗粒，通过以下方法制备得到：(1)将上述重组表达载体转染昆虫细胞，得到能够表达口蹄疫病毒样颗粒蛋白的昆虫细胞；(2)培养该细胞5～7d后，收获细胞和上清，对上清进行超滤浓缩，离心，收集上清液，上清液经离子交换层析、疏水层析或分子筛层析，纯化后获得口蹄疫病毒样颗粒。

所述昆虫细胞为sf9细胞。

步骤(2)中，采用截留孔径为200-500nm的中空纤维柱进行微滤澄清，再用截留孔径优选300kDa的中空纤维柱超滤浓缩。

浓缩后样品进行蔗糖密度梯度离心，离心条件为25000rpm离心16h或35000rpm离心3h；离心液经中空纤维柱层析和离子交换层析，洗脱，收集穿过峰得到纯化的口蹄疫病毒样颗粒。批量制备VLP采用分子筛层析和离子交换层析两步法纯化VLP。

本发明提供了上述含有口蹄疫病毒P12A基因和3C基因的重组表达载体在制备口蹄疫病毒疫苗中的应用。

本发明提供了含有上述重组表达载体的宿主细胞在制备口蹄疫病毒疫苗中的应用。

本发明提供了上述方法制得的口蹄疫病毒样颗粒在制备口蹄疫病毒疫苗中的应用。

本发明提供了上述重组表达载体或含有该重组表达载体的宿主细胞或上述口蹄疫病毒样颗粒在预防动物感染口蹄疫病毒中的应用。

更进一步地，本发明提供了一种口蹄疫疫苗，含有本发明的口蹄疫病毒样颗粒。

本发明提供一种制备口蹄疫病毒样颗粒疫苗的方法，将本发明的口蹄疫病毒样颗粒用不同佐剂如206、201、铝佐剂配苗后制备成含100μg/ml病毒样颗粒的疫苗。

本发明的有益效果在于：

(1)利用最新发现的流行口蹄疫O型毒株有别于现有疫苗毒株的遗传信息(NCBIGenbank ACCESSION AET43040)，人工制备只包含病毒全部衣壳蛋白的病毒样颗粒疫苗。有别于现生产毒株的抗原表位的氨基酸序列。

(2)本发明采用对人类和动物无毒无害的昆虫杆状病毒系统和没有任何动物成份来源的无血清、无蛋白培养基培养细胞，不存在任何感染动物的致病因子，不需要高度密闭性生产场所。这不但消除了口蹄疫灭活疫苗生产中的安全隐患，也因此降低了疫苗的生产成本。本发明制得的口蹄疫病毒样颗粒疫苗不含有病毒遗传物质,因此不具有感染性，不存在工厂化散毒和灭活不彻底散毒的风险，可完全保证疫苗的安全性；

(3)口蹄疫病毒样颗粒疫苗具有与完整病毒相同的免疫学特性，电子显微镜下结构类似，不经灭活可以保持天然抗原表位，所以不但可以诱导体液而且可以诱导细胞免疫，接种动物后可诱导坚强而持久的免疫反应，具有完全的保护性免疫和较长的免疫保护期；

(4)口蹄疫病毒样颗粒疫苗不含有病毒的非结构蛋白3A、3B、3C，可依据3A、3B、3C抗体有效地进行感染动物和免疫接种动物的鉴别诊断，不存在任何干扰；

(5)VLP口蹄疫疫苗接种动物后，能产生快速的免疫保护、窗口期短，而且免疫动物产生的免疫力坚强、可获得完全的抗感染保护，可有效地防止免疫动物变成长期的病毒携带者和危险的传染源，这对于用免疫接种方法控制和清除口蹄疫的策略是完全必要的；

(6)Lowry和Bradford法检测本发明的获得的VLP蛋白表达水平在120毫克/升培养上清。优化细胞培养条件可以达到更高水平；相比灭活疫苗在BHK细胞的表达水平高几十至上百倍。经透射电镜观察纯化样品呈现病毒样颗粒，颗粒直径在30nm左右，颗粒完整、规则；

(7)本发明生产成本低，能进行高密度细胞培养，不需要二氧化碳，温度在28℃且外源蛋白产量大大高于悬浮培养的BHK细胞，适合于工业化大生产。

总之，本发明提供口蹄疫病毒样颗粒不带有病毒核酸，无潜在致癌危险和散毒风险，具有良好的安全性，免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化，能够用于制备口蹄疫VLP疫苗，具有较好的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为限制性内切酶Sph I和Hind III对含3C基因的质粒和载体pFastBac HT-B进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳图，1为1kb DNA Ladder Marker，2为3C基因，3为pFastBac HT-B。

图2为用限制性内切酶Rsr II和EcoR I对鉴定正确的质粒HT-B-3C和含P12A基因的质粒进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳图，其中1:HT-B-3C ED RE，2-3:P12A片段ED RE，4：1kb DNA Ladder Marker。

图3为重组表达质粒PCR鉴定重组表达载体pFastBac HT-B-P12A-3C大肠杆菌转化克隆检测结果：其中，1为1kb DNA Ladder Marker，2为重组表达载体pFastBac HT-B-P12A-3C，3为pFastBac HT-B，4为pFastBac HT-B-3C，5为pFastBac HT-B-P12A。

图4为重组表达载体pFastBac HT-B-P12A-3C感染Sf9细胞后的上清和细胞进行了Western blot检测，结果显示在感染重组病毒的Sf9细胞细胞中出现81kD、47kD、35kD和24kD的目的条带，分别对应口蹄疫病毒P1蛋白、VP31蛋白、VP0蛋白和VP3/VP2/VP1蛋白，与预期蛋白分子量一致。

图5为利用分子筛纯化口蹄疫病毒样颗粒峰图，第一个峰为VLP，第二、第三个峰为分子量较小的蛋白。

图6为口蹄疫病毒样颗粒上阴离子交换层析柱的峰图。

图7为对纯化后的口蹄疫病毒样颗粒进行SDS-PAGE鉴定图。其中，1为Marker，2为纯化后的FMD VLP。

图8为纯化后的口蹄疫病毒样颗粒Western blot分析的结果照片。泳道1为Protein Marker(170、130、100、70、55、40、35、25、15、10kDa)，泳道2为纯化后的FMDV VLP。其中，30kDa处的条带为VP0，25kDa处的条带为VP1。

图9为纯化的口蹄疫病毒样颗粒透射电镜照片(放大倍数：200000倍)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件进行。

本发明实施例采用的杆状病毒表达系统(包括载体pFastBacHT-B、悬浮培养的Sf9细胞和感受态E.coli DH10Bac)购自美国Invitrogen公司产品。转染试剂

IIReagent(Cat no.10362-100)为Invitrogen公司产品；GPM-115昆虫细胞无血清培养基为本公司产品；SF900 III SFM为life technologies公司产品；限制性核酸内切酶Rsr II、EcoRI、SphI、Hind III和DNA连接酶(T4 DNA ligase)为New England Biolabs公司产品；Goldview染料、TaqDNA聚合酶、pfu DNA聚合酶和dNTPs为赛百盛公司产品；卡那霉素、庆大霉素、四环素、blu-gal和IPTG为拜尔迪公司产品；豚鼠抗A型FMDV多克隆抗体为中国农业科学院兰州兽医研究所产品；Dlight 800山羊抗豚鼠IgG抗体(目录号GtxGP-003-D800NHSX)为Immuno Reagents公司产品；凝胶回收试剂盒(目录号DP103-02)为Tiangen公司产品；质粒提取试剂盒(目录号MK014-2)为Tiangen公司产品。

PCR仪(型号：Mastercycler gradient)为德国Eppendorf公司产品；恒温孵箱(型号：DHP-9082)为上海一恒科技有限公司产品；微型离心机(型号：Lx-300)为Kylin-Bell实验设备有限公司产品；水浴锅(型号：DK-8K)为上海精宏实验设备有限公司产品；电泳仪(型号：DYY-6C)为北京市六一仪器厂产品；凝胶成相系统(型号：2020D)为BINTA公司产品；Odyssey(型号：LI-COR)为Li-Cor公司产品；倒置显微镜(型号：7S100)为日本尼康公司产品。

实施例1编码口蹄疫的P12A及3C蛋白的基因序列优化

根据GenBank序列号AET43040，(2332 aa linear VRL 15-FEB-2012；DEFINITIONpolyprotein[Foot-and-mouth disease virus-type O]ACCESSION AET43040，确定了最近导致我国口蹄疫流行的主要毒株(血清O型)及其基因序列。在此基础之上，按照昆虫细胞转译过程对密码子的偏爱性，设计了口蹄疫VLP所需的编码基因片段。口蹄疫VLP的包装需要P12A和3C蛋白，所以化学合成序列分别对应P12A基因和3C基因。

P12A基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列组成结构为：RsrII-Kozaksequence-起始密码子-HBS信号肽-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-终止密码子-SV40PolyA信号-EcoRI。

3C基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，序列组成结构为：SphI-Polyhedrin启动子-载体序列-起始密码子-HBS信号肽-3C-终止密码子-HindIII。

实施例2重组表达载体pFastBac HT-B-P12A-3C的构建

1、口蹄疫病毒P12A基因和3C基因串联插入转移载体pFastBac HT-B

用Sph I和Hind III对3C基因片段和pFastBac HT-B进行双酶切，酶切后3C基因片段与pFastBac HT-B进行连接转化，得到pFastBac HT-B-3C；用Rsr II和EcoR I对P12A基因片段和pFastBac HT-B-3C进行双酶切，酶切后进行连接转化。酶切结果见图1和图2。

将上述反应混合液混匀离心后于16℃连接过夜。取出-80℃冻存的E.coli DH5α感受态细胞置冰上至其融化，加入连接产物，轻弹管壁混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克90sec，立即冰浴1min，加入800μL无抗生素的LB培养基，在37℃条件下以150rpm摇菌50min，吸取100μL菌液涂布于Amp/LB平板上，37℃培养12～16h，观察菌落生长情况。从平板上挑取3个单菌落，分别接种于4mL的Amp/LB液体培养基中，37℃条件下200rpm摇菌培养过夜。提取质粒后，利用Rsr II/EcoR I和Sph I/Hind III分别进行双酶切鉴定。于37℃酶切反应3h，用1％琼脂糖凝胶电泳分析，挑取酶切鉴定正确的克隆测序确证。

从-80℃取出冻存的E.coli DH10Bac感受态细胞置冰上至其融化，吸出100μL加入含重组质粒2μL的1.5mL的EppendorF管中，轻弹管壁混匀，冰浴30min，42℃水浴热击45s，立即冰浴5min，加入800μL无抗生素的LB培养基，37℃下200rpm摇菌5h，吸取10μL菌液涂布于LB选择性平板上，37℃培养48h，观察菌落生长情况。

从平板上挑取白色单菌落3～4个，分别划线于LB选择性培养平板，于37℃培养24h，观察菌落表型变化。从不同菌落来源的划线平板上随机挑取3个仍为白斑的菌落，加入3mL的KTG/LB(含卡那霉素50μg/mL，庆大霉素7μg/mL，四环素10μg/mL)培养基中，于37℃、200rpm振摇培养16h。取1.5mL的培养物，室温条件下13,000rpm离心1min，收集沉淀。向沉淀中加入200μL溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,100μg/mLRNase A，pH 8.0)用涡旋器混匀重悬细菌沉淀后，加入200μL新鲜配制的溶液II(0.2mol/LNaOH,1％SDS)轻轻混匀，置室温放置5min，加入200μL 3mol/L的乙酸钾(pH 5.5)，轻柔颠倒混匀后，冰浴10min后室温下12,000rpm离心10min，将上清移至另一新的Eppendorf管中，加入等倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min后12,000rpm离心15min。将沉淀用70％的乙醇洗涤后，室温下12,000rpm离心5min，沉淀干燥后加入40μL TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH 8.0)溶解。

2、带有目的基因的重组Bacmid DNA的PCR鉴定

利用重组Bacmid mini-attTn 7两端的M13引物，可对插入基因进行PCR鉴定。

M13引物序列(由上海生工生物工程有限公司合成)如下：

M13F:5’GTTTTCCCAGTCACGAC 3’

M13R:5’CAGGAAACAGTCATGAC 3’

PCR扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸8min；30个循环，72℃延伸10min。

取5μL PCR扩增产物，用0.5％琼脂糖凝胶电泳分析。根据产物的大小判断是否转座成功。PCR鉴定结果见图3。说明正确构建得到表达载体pFastBac HT-B-P12A-3C。

实施例3重组杆状病毒目的蛋白的表达鉴定

1、rBacmid DNA转染Sf9细胞

1)Sf9细胞的培养用SF900 III SFM培养Sf9悬浮细胞，于27℃、110rpm振荡培养。转染前1d将Sf9细胞传代至6孔板，每孔密度为8×10⁵。

2)转染取两个Eppendorf管，分别加入A液和B液，体系如下：A液：将重组BacmidDNA 10μL和90μL的无血清、无抗生素的SF900 III培养基混合。

B液：取6μL脂质体Cellfectin II转染试剂(使用前充分颠倒混匀5～10次)与94μL无血清、无抗生素的SF900 III培养基混合。

A液和B液在室温下静置5min后，将A液和B液混合，轻弹管壁混匀，室温下放置30min。用2mL无血清、无抗生素的SF900 III培养基洗2次细胞，每孔加入800μL无血清、无抗生素的SF900 III培养基，再将上述A液和B液混合物逐滴加至每孔中，并轻摇混匀，置27℃孵育5h。将转染液移去，更换为新鲜的SF900 III SFM培养基，置27℃培养，每日观察细胞变化。

2、重组杆状病毒的鉴定

在转染5d后，若细胞出现典型CPE(细胞出现变圆、肿胀)，而正常对照Sf9细胞大小均匀、细胞核致密，无细胞病变出现，表明重组杆状病毒包装成功。收获上清，室温条件下500g离心5min，并分装至无菌冻存管中，此即为含重组杆状病毒的原代毒种。若细胞未出现典型CPE，收获上清，重新感染新的细胞。

将细胞传代至0.5-1×10⁶/ml时，将重组杆状病毒接种细胞扩增毒种，培养5～7d后收获培养上清，室温条件下500g离心5min，分装至无菌冻存管中，置-80℃备存，同时将细胞用PBS(pH 7.4)洗涤后离心沉淀，上清和细胞沉淀用于后续的Western blot鉴定。

重组杆状病毒表达目的蛋白的Western blot鉴定

样品制备：将收取的表达重组杆状病毒的细胞用细胞裂解液(0.1M碳酸氢钠溶液)裂解后，离心取上清，分别加入6×SDS蛋白电泳加样缓冲液，100℃煮沸5min；每孔上样10-20ul，双色预染Marker 2μL，进行蛋白电泳浓缩胶80v，分离胶120v。

蛋白印迹：将凝胶放在PVDF膜(PVDF膜预先置于甲醇溶液中30s激活)上，上下各放3张滤纸，将上述物品放至转膜电泳缓冲液中浸泡15min，以驱除留于滤膜上的气泡。按顺序安装电转移装置，在阴性电极板上依次放置3张滤纸、凝胶、PVDF膜、3张滤纸，确保各层精确对齐(从下到上)，并驱除各层间气泡，标记方位，合上阳极板。

转膜：60V恒压1h；封闭：用5％脱脂奶粉、4℃过夜；一抗：用豚鼠抗FMDV多克隆抗体(5％脱脂奶以1:500稀释)室温下孵育膜3h；洗膜：用PBST(吐温为1‰)洗膜三次，每次5min；二抗：山羊抗豚鼠Dlight800抗体(5％脱脂奶以1:2000稀释)，室温下避光孵育40min；洗膜：用PBST(吐温为1‰)洗膜三次，每次10min；检测：利用Odyssey的700和800两个荧光通道进行扫描鉴定。

将细胞传代至0.5-1×10⁶/ml时，用重组杆状病毒感染SF9细胞，感染5-7d后收集感染细胞培养上清，于4℃6000rpm离心10min，留取上清和细胞，以备鉴定与纯化。Westernblot鉴定见图4，结果显示在感染重组病毒的Sf9细胞细胞中出现81kD、47kD、35kD和24kD的目的条带，分别对应口蹄疫病毒P1蛋白、VP31蛋白、VP0蛋白和VP3/VP2/VP1蛋白，与预期蛋白分子量一致。结果提示，P1蛋白在昆虫细胞中实现了表达，且部分P1在3C蛋白的切割下成功切割为VP31、VP0、VP3/VP2/VP1。

实施例4重组杆状病毒表达口蹄疫VLP的纯化与鉴定

1、中空纤维柱超滤浓缩口蹄疫VLP

收集实施例3感染SF9细胞的培养上清，经0.8um过滤后置于4℃，细胞可储存于-20℃或立即用于纯化。细胞破碎：将收集的细胞称重，加入20倍体积的0.1M NaHCO₃(pH8.3)，置于室温裂解30min。12000rpm离心15min，4℃(3次)，收集上清，弃细胞。依次用0.8um,0.45um和0.2um滤膜进行过滤。浓缩：中空纤维柱清洗与平衡：用大量纯水冲洗NaOH浸泡的中空纤维柱(300kDa截流)，然后用PBS(pH7.4)平衡。连接好中空纤维柱、泵和待浓缩液体，形成液体回路循环。接通泵(10ml/min)开始纯化，将原液浓缩所需的体积。用大量PBS(pH7.4)进行清洗(10倍体积)，去除杂蛋白。回收剩余的液体，用0.2um滤器进行过滤，获得目的VLP颗粒。

2、超速离心法纯化口蹄疫VLP

分别配制20％、30％、40％、50％和60％的蔗糖溶液，用1×PBS溶液稀释。依次加入60％、50％、40％、30％和20％蔗糖溶液(各1ml)于超速离心管(Beckman)，然后加入待超离样本。做好标记。25000rpm离心16hr，4℃,离心机为Beckman Optima X-100。依次吸取各离心组分，经SDS-PAGE和western blotting鉴定后，将相应的组分透析除去蔗糖，获得纯化的样品。

3、柱层析法纯化口蹄疫VLP

FMDV昆虫细胞培养上清经300KDa中空纤维柱30倍浓缩，利用PBS缓冲液，层析介质为Sepharose 6 FF柱(XK16×70层析柱，层析介质高度63.5厘米)，流速1毫升/分钟，层析分离VLP和杂蛋白。结果见图5。第二次柱层析采用CaptoQ ImpRes离子交换层析柱，经10mMTris-HCl pH8.0透析第一柱的VLP峰上样，洗脱液为10mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl。收集穿过峰作为纯化的VLP，结果见图6。

4、纯化后FMD VLP的SDS-PAGE和Western blotting

结果见图7、8。图7为VLP纯化后SDS-PAGE图谱，在组成VLP的VP1和VP0位置具有对应条带，图8进一步用免疫印迹杂交证明组成VLP的蛋白是特异的。

Lowry法检测本发明的获得纯化蛋白终浓度为1800μg/ml，在疫苗配置上，很容易操作达到注射需要的抗原浓度。

5、电镜观察VLP

120KV透射电子显微镜的样品处理：样品浓度为0.1毫克/毫升，用漂浮法负染色，即取15微升样品液珠，用带支持膜的铜网盖在液珠上2分钟，取下铜网，用滤纸从边缘吸去多余的样品，再把铜网盖在15微升0.5％的醋酸铀染液液珠上2分钟，取下铜网，用滤纸从边缘吸去多余的染液，即可电镜观察。结果见图9，呈现病毒样颗粒，颗粒直径在30nm左右，颗粒完整、规则。

6、攻毒实验

免疫动物：将VLP样品用206佐剂乳化后免疫口蹄疫阴性猪，随机分为对照组3头和试验组7头。免疫后第7、14、21、28天抽取血清，Elisa鉴定口蹄疫抗体的效价并统计发病情况。

(1)免疫后O型LB-ELISA检测抗体情况，见表1。

表1 VLP免疫后O型抗体检测

(2)攻毒情况，结果见表2。

表2 对照组动物攻毒实验结果

在攻毒试验中，7头动物中6头获得完全保护，没有口蹄疫病变发生。只有1头动物即第436号动物四蹄发病，但是对照抗体的检测发现，这头动物抗体水平在7头动物中最高，注射14天后达到720，其它在11-180。这说明检测抗体所用的试剂盒来自于全病毒多克隆抗体，对VLP疫苗特异性不好。但是VLP疫苗抗原能够很好保护猪免于口蹄疫病毒感染，是一个很有效的抗原制备技术。

实施例5采用与实施例2不同方法构建的串联表达FMDV壳蛋白载体

通过启动子SV40下的包含P12A3C基因的单一ORF克隆入pFastBac HT-B构建重组表达质粒。按照VP0(VP2+VP4)—VP3—VP1—2A—3B3—3C的串联方式，将FMDV相关蛋白基因串联置于SV40启动子下表达。通过引物FMDF1和FMDR1进行PCR扩增P12A基因，引物FMDF2和引物FMDR2进行PCR扩增3B3和3C基因。纯化扩增得到的PCR产物，然后用无缝连接试剂盒将它们连接在一起。组成单个启动子的串联表达框。最终得到的序列如SEQ ID NO.9所示。

引物FMDF1：

CCATCGGGCGCGGATCTCGGTCCGAAACCATGGGAGCTGGACAGTCCTCCCCTGC，

引物FMDR1：

TTACCT TTA GAG CGA CTG GCT TCT TAA CAG GTC CTT CAT AAG GAC CTC CAGGGT TGG ACT CCA CGT CTC

引物FMDF2:

GCCAGTCGCTCTAAAGGTAAAGGCCAAGAACTTGATTGTGACTGAAtccggagctcctcctactgacctg

引物FMDR2:

CTA GTA CTT CTC GAC AAG CTT ACT CGT GGT GAG GCT CAG GGT CGA TGT GAGCC

参照实施例3、4的方法进行表达鉴定、VLP的纯化与鉴定，最终该串联方法得到的VLP得率约为33毫克/升培养液。

实施例6口蹄疫病毒样颗粒疫苗的制备

实施例4制得的FMDV VLP抗原与Montanide ISA 201 VG佐剂的混合乳液的配制方法：1、取等质量的FMDV VLP水相抗原与佐剂。

2、水浴加热至31℃。

3、将装有佐剂的烧杯置于水浴中，搅拌器距离杯底1cm。搅拌速度350rpm。

4、向佐剂中快速加入水相抗原。搅拌5min。

5、停止搅拌。降温至20度，静置1h。

6、乳液制备完成。在20度下静置一夜后，做质控检测。将口蹄疫病毒样颗粒用不同佐剂吸附后制备成含50-5000μg/ml病毒样颗粒的疫苗

各项指标检测结果：

性状：外观为略带粘滞性乳剂。

剂型：水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性：吸取疫苗10mL，加入离心管中，以3000r/min离心15min，离心管底部析出的水相应不超过0.5mL。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 金普诺安生物科技（苏州）有限公司

<120> 一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法

<130> KHP171117010.9

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2587

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggtccgaaa ccatgaaatt cttagtcaac gttgcccttg tttttatggt cgtatacatt 60

tcttacatct atgcgggagc tggacagtcc tcccctgcta ctggatccca gaaccagtcc 120

ggaaacactg gatccatcat caacaactac tacatgcagc agtaccagaa ctccatggac 180

actcagctgg gagacaacgc tatctccgga ggatccaacg agggatccac tgacactact 240

tccactcaca ctactaacac tcagaacaac gactggttct ccaagctggc ttcctccgct 300

ttctccggac tgttcggagc tctgctggct gacaagaaga ctgaggagac tactctgctg 360

gaggacagaa tcctgactac tagaaacgga cacactactt ccactactca gtcctccgtg 420

ggaatcactc acggatacgc tactgctgag gacttcgtga acggacctaa cacttccgga 480

ctggagacta gagtggtgca ggctgagaga ttcttcaaga ctcacctgtt cgactgggtg 540

acttccgacc ctttcggaag atgctacctg ctggagctgc ctactgacca caagggagtg 600

tacggatccc tgactgactc ctacgcttac atgagaaacg gatgggacgt ggaggtgact 660

gctgtgggaa accagttcaa cggaggatgc ctgctggtgg ctatggtgcc tgagctgtgc 720

tccatcgaga gaagagagct gttccagctg actctgttcc ctcaccagtt catcaaccct 780

agaactaaca tgactgctca catcaaggtg cctttcgtgg gagtgaacag atacgaccag 840

tacaaggtgc acaagccttg gactctggtg gtgatggtgg tggctcctct gactgtgaac 900

actgagggag ctcctcagat caaggtgtac gctaacatcg ctcctactaa cgtgcacgtg 960

gctggagagt tcccttccaa ggagggaatc ttccctgtgg cttgctccga cggatacgga 1020

ggactggtga ctactgaccc taagactgct gaccctgtgt acggaaaggt gttcaaccct 1080

cctagaaaca tgctgcctgg aagattcact aacctgctgg acgtggctga ggcttgccct 1140

actttcctgc acttcgacgg agacgtgcct tacgtgacta ctaagactga ctccgacaga 1200

gtgctggctc agttcgacct gtccctggct gctaagcaca tgtccaacac tttcctggct 1260

ggactggctc agtactacac tcagtactcc ggaactgtga acctgcactt catgttcact 1320

ggacctactg acgctaaggc tagatacatg atcgcttacg ctcctcctgg aatggagcct 1380

cctaagactc ctgaggctgc tgctcactgc atccacgctg agtgggacac tggactgaac 1440

tccaagttca ctttctccat cccttacctg tccgctgctg actacgctta cactgcttcc 1500

gacgctgctg agactactaa cgtgcaggga tgggtgtgcc tgttccagat cactcacgga 1560

aaggctgagg gagacgctct ggtggtgctg gcttccgctg gaaaggactt cgagctgaga 1620

ctgcctgtgg acgctagaca gcagactact tccactggag agtccgctga ccctgtgact 1680

gctactgtgg agaactacgg aggagagact caggtgcaga gaagacacca cactgacgtg 1740

tccttcatcc tggacagatt cgtgaaggtg actcctaagg actccatcaa cgtgctggac 1800

ctgatgcaga ctccttccca cactctggtg ggagctctgc tgagaactgc tacttactac 1860

ttcgctgacc tggaggtggc tgtgaagcac gagggagacc tgacttgggt gcctaacgga 1920

gctcctgagg ctgctctgga caacactact aaccctactg cttaccacaa ggctcctctg 1980

actagactgg ctctgcctta cactgctcct cacagagtgc tggctactgt gtacaacgga 2040

aactgcaagt acgctggagg atccctgcct aacgtgagag gagacctgca ggtgctggct 2100

cagaaggctg ctagacctct gcctacttcc ttcaactacg gagctatcaa ggctactaga 2160

gtgactgagc tgctgtacag aatgaagaga gctgagactt actgccctag acctctgctg 2220

gctgtgcacc cttccgctgc tagacacaag cagaagatcg tggctcctgt gaagcagtcc 2280

ctgaacttcg acctgctgaa gctggctgga gacgtggagt ccaaccctgg aacttcctaa 2340

gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca 2400

cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc 2460

agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 2520

ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat 2580

cgaattc 2587

<210> 2

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcatgcatca tggagataat taaaatgata accatctcgc aaataaataa gtattttact 60

gttttcgtaa cagttttgta ataaaaaaac ctataaatat tccggattat tcataccgtc 120

ccaccatcgg gcgcggatct cgctgcgaaa ccatgaaatt cttagtcaac gttgcccttg 180

tttttatggt cgtatacatt tcttacatct atgcgtccgg agctcctcct actgacctgc 240

agaagatggt gatgggaaac actaagcctg tggagctgat cctggacgga aagactgtgg 300

ctatctgctg cgctactgga gtgttcggaa ctgcttacct ggtgcctaga cacctgttcg 360

ctgagaagta cgacaagatc atgctggacg gaagagctat gactgactcc gactacagag 420

tgttcgagtt cgagatcaag gtgaagggac aggacatgct gtccgacgct gctctgatgg 480

tgctgcacag aggaaacaga gtgagagaca tcactaagca cttcagagac actgctagaa 540

tgaagaaggg aactcctgtg gtgggagtga tcaacaacgc tgacgtggga agactgatct 600

tctccggaga ggctctgact tacaaggaca tcgtggtgtg catggacgga gacactatgc 660

ctggactgtt cgcttacaga gctgctacta aggctggata ctgcggagga gctgtgctgg 720

ctaaggacgg agctgacact ttcatcgtgg gaactcactc cgctggagga aacggagtgg 780

gatactgctc ctgcgtgtcc agatccatgc tgctgaagat gaaggctcac atcgaccctg 840

agcctcacca cgagtaagct t 861

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttttcccag tcacgac 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggaaacag tcatgac 17

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccatcgggcg cggatctcgg tccgaaacca tgggagctgg acagtcctcc cctgc 55

<210> 6

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttacctttag agcgactggc ttcttaacag gtccttcata aggacctcca gggttggact 60

ccacgtctc 69

<210> 7

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccagtcgct ctaaaggtaa aggccaagaa cttgattgtg actgaatccg gagctcctcc 60

tactgacctg 70

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctagtacttc tcgacaagct tactcgtggt gaggctcagg gtcgatgtga gcc 53

<210> 9

<211> 2989

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggtccgaaa ccatgggagc tggacagtcc tcccctgcta ctggatccca gaaccagtcc 60

ggaaacactg gatccatcat caacaactac tacatgcagc agtaccagaa ctccatggac 120

actcagctgg gagacaacgc tatctccgga ggatccaacg agggatccac tgacactact 180

tccactcaca ctactaacac tcagaacaac gactggttct ccaagctggc ttcctccgct 240

ttctccggac tgttcggagc tctgctggct gacaagaaga ctgaggagac tactctgctg 300

gaggacagaa tcctgactac tagaaacgga cacactactt ccactactca gtcctccgtg 360

ggaatcactc acggatacgc tactgctgag gacttcgtga acggacctaa cacttccgga 420

ctggagacta gagtggtgca ggctgagaga ttcttcaaga ctcacctgtt cgactgggtg 480

acttccgacc ctttcggaag atgctacctg ctggagctgc ctactgacca caagggagtg 540

tacggatccc tgactgactc ctacgcttac atgagaaacg gatgggacgt ggaggtgact 600

gctgtgggaa accagttcaa cggaggatgc ctgctggtgg ctatggtgcc tgagctgtgc 660

tccatcgaga gaagagagct gttccagctg actctgttcc ctcaccagtt catcaaccct 720

agaactaaca tgactgctca catcaaggtg cctttcgtgg gagtgaacag atacgaccag 780

tacaaggtgc acaagccttg gactctggtg gtgatggtgg tggctcctct gactgtgaac 840

actgagggag ctcctcagat caaggtgtac gctaacatcg ctcctactaa cgtgcacgtg 900

gctggagagt tcccttccaa ggagggaatc ttccctgtgg cttgctccga cggatacgga 960

ggactggtga ctactgaccc taagactgct gaccctgtgt acggaaaggt gttcaaccct 1020

cctagaaaca tgctgcctgg aagattcact aacctgctgg acgtggctga ggcttgccct 1080

actttcctgc acttcgacgg agacgtgcct tacgtgacta ctaagactga ctccgacaga 1140

gtgctggctc agttcgacct gtccctggct gctaagcaca tgtccaacac tttcctggct 1200

ggactggctc agtactacac tcagtactcc ggaactgtga acctgcactt catgttcact 1260

ggacctactg acgctaaggc tagatacatg atcgcttacg ctcctcctgg aatggagcct 1320

cctaagactc ctgaggctgc tgctcactgc atccacgctg agtgggacac tggactgaac 1380

tccaagttca ctttctccat cccttacctg tccgctgctg actacgctta cactgcttcc 1440

gacgctgctg agactactaa cgtgcaggga tgggtgtgcc tgttccagat cactcacgga 1500

aaggctgagg gagacgctct ggtggtgctg gcttccgctg gaaaggactt cgagctgaga 1560

ctgcctgtgg acgctagaca gcagactact tccactggag agtccgctga ccctgtgact 1620

gctactgtgg agaactacgg aggagagact caggtgcaga gaagacacca cactgacgtg 1680

tccttcatcc tggacagatt cgtgaaggtg actcctaagg actccatcaa cgtgctggac 1740

ctgatgcaga ctccttccca cactctggtg ggagctctgc tgagaactgc tacttactac 1800

ttcgctgacc tggaggtggc tgtgaagcac gagggagacc tgacttgggt gcctaacgga 1860

gctcctgagg ctgctctgga caacactact aaccctactg cttaccacaa ggctcctctg 1920

actagactgg ctctgcctta cactgctcct cacagagtgc tggctactgt gtacaacgga 1980

aactgcaagt acgctggagg atccctgcct aacgtgagag gagacctgca ggtgctggct 2040

cagaaggctg ctagacctct gcctacttcc ttcaactacg gagctatcaa ggctactaga 2100

gtgactgagc tgctgtacag aatgaagaga gctgagactt actgccctag acctctgctg 2160

gctgtgcacc cttccgctgc tagacacaag cagaagatcg tggctcctgt gaagcagtcc 2220

ctgaacttcg acctgctgaa gctggctgga gacgtggagt ccaaccctgg aggtccttat 2280

gaaggacctg ttaagaagcc agtcgctcta aaggtaaagg ccaagaactt gattgtgact 2340

gaatccggag ctcctcctac tgacctgcag aagatggtga tgggaaacac taagcctgtg 2400

gagctgatcc tggacggaaa gactgtggct atctgctgcg ctactggagt gttcggaact 2460

gcttacctgg tgcctagaca cctgttcgct gagaagtacg acaagatcat gctggacgga 2520

agagctatga ctgactccga ctacagagtg ttcgagttcg agatcaaggt gaagggacag 2580

gacatgctgt ccgacgctgc tctgatggtg ctgcacagag gaaacagagt gagagacatc 2640

actaagcact tcagagacac tgctagaatg aagaagggaa ctcctgtggt gggagtgatc 2700

aacaacgctg acgtgggaag actgatcttc tccggagagg ctctgactta caaggacatc 2760

gtggtgtgca tggacggaga cactatgcct ggactgttcg cttacagagc tgctactaag 2820

gctggatact gcggaggagc tgtgctggct aaggacggag ctgacacttt catcgtggga 2880

actcactccg ctggaggaaa cggagtggga tactgctcct gcgtgtccag atccatgctg 2940

ctgaagatga aggctcacat cgaccctgag cctcaccacg agtaagctt 2989

Claims (9)

1.一种重组表达载体，其特征在于，含有口蹄疫病毒P12A基因和3C基因；所述口蹄疫病毒P12A基因如序列表中SEQ ID No.1所示；

所述口蹄疫病毒3C基因其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，通过以下方法制备得到：用Sph I和Hind III对3C基因片段和pFastBac HT-B进行双酶切，酶切后3C基因片段与pFastBac HT-B进行连接，得到pFastBac HT-B-3C；用Rsr II和EcoR I对P12A基因片段和pFastBac HT-B-3C进行双酶切，酶切后进行连接，构建得到pFastBac HT-B-P12A-3C重组表达质粒。

3.含有权利要求1~2任一所述的重组表达载体的宿主细胞，包括：真菌、昆虫、脊椎动物或植物细胞。

4.一种口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于，通过以下方法制备得到：（1）将权利要求1~2任一所述的重组表达载体转染昆虫细胞，得到能够表达口蹄疫病毒样颗粒蛋白的昆虫细胞；（2）培养该细胞后，收获细胞和上清，对上清进行超滤浓缩，离心，收集上清液，上清液经离子交换层析、疏水层析或分子筛层析，纯化后获得口蹄疫病毒样颗粒。

5.如权利要求4所述的口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于，所述昆虫细胞为sf9、sf21或High5细胞。

6.如权利要求4所述的口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于，步骤（2）中，采用截留孔径为200-500nm的中空纤维柱进行培养液澄清，截留孔径选300kDa的超滤浓缩；回收剩余液体进行层析分离VLP。

7.权利要求1~2任一所述的重组表达载体或权利要求3所述的宿主细胞或权利要求4~6任一所述的口蹄疫病毒样颗粒在制备口蹄疫病毒疫苗中的应用。

8.一种口蹄疫疫苗，其特征在于，含有权利要求4~6任一所述的口蹄疫病毒样颗粒。

9.一种制备权利要求8所述疫苗的方法，其特征在于，将口蹄疫病毒样颗粒用不同佐剂吸附后制备成含50-5000μg/ml病毒样颗粒的疫苗。

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