CN114276421A - 一种o型口蹄疫病毒的病毒样颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒，该病毒样颗粒的制备方法是将优化后的VP0、VP3、VP1基因分别插入到Pink‑HC载体上，然后再连接，得到Pink‑VP0/VP3/VP1重组质粒，将该重组质粒电转进入酵母感受态细胞中进行诱导表达，然后经纯化之后在电镜下观察，Pink‑VP0/VP3/VP1这个质粒在酵母细胞中可以组装成病毒样颗粒，将该病毒样颗粒制备成的疫苗能够对动物起到有效的保护作用。

Description

一种O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒

技术领域

本发明属于分子生物制品领域，具体涉及一种O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒。

背景技术

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)属于微RNA病毒科(Picornaviridae) 口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，该病毒由单股线状正链RNA和包围其外的衣壳蛋白两部分 组成，是目前已知动物病毒中最小病毒之一。成年动物感染口蹄疫病毒后，会导致生产性能 降低，种畜失去种用价值，奶畜产奶受到影响。幼龄动物感染后可导致出血性肠炎和心肌炎， 常因心肌麻痹而猝死，病死率高达100％，由于该病潜伏期短、发病率高、传播迅速，一旦 出现疫情，极易发生大范围的流行，给养殖业造成巨大的经济损失。

当前，疫苗接种仍是预防口蹄疫的有效手段，安全、高效的疫苗在预防口蹄疫发生的过 程中起着重要的作用，传统的疫苗包括弱毒疫苗和灭活疫苗，弱毒疫苗由于会出现毒力返祖 的潜在风险，已逐渐被取代，灭活疫苗由于灭活不彻底也会导致散毒的发生。在现有的新型 疫苗中，病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)疫苗不存在毒力返强，灭活不完全等风险， 且由于其本身的形态结构与相应的天然病毒结构高度相似但是不含有遗传物质，可以刺激机 体发生T细胞和B细胞免疫反应，具有良好的免疫原性，形成二十面体或者球形结构，更 加稳定而且衣壳里面没有遗传物质，安全性很高。

生产FMDV病毒样颗粒的疫苗，关键在于能够大规模的生产出高质量的FMDV病毒样颗粒，病毒样颗粒的生产包括病毒结构基因的克隆与表达、选取宿主表达系统、纯化、鉴定等几个环节。首先，结构基因的选择，P1基因编码病毒的抗原结构，是研究口蹄疫免疫机 制和新型疫苗的基础，P1基因在蛋白酶的作用下，裂解产生4种基因，1A、1B、1C、1D， 分别编码VP4、VP3、VP2、VP1这四种结构蛋白，并组装成口蹄疫病毒衣壳。第二，表达 系统的选择，主要的宿主表达系统中，细菌系统占最主要地位，其次是昆虫表达系统和酵母 系统，由于酵母表达系统无法同时表达多个衣壳蛋白并自组装成为病毒样颗粒，因此目前常 用的表达FMDV病毒样颗粒的为杆状病毒系统和大肠杆菌表达系统，但这两种表达系统都 存在表达的周期长，而且表达量不高的问题。第三，纯化和鉴定，纯化过程包括破碎、洗涤， 浓缩等常规步骤，在大规模生产中，还要求整个过程的产量高、时间短、收率高、稳定性强。 此外，病毒样颗粒的生产中还存在超速离心等工艺复杂，体外纯化造成的VLPs裂解为单体 等问题，这些缺陷直接导致了其免疫保护效果不佳，同时也加大了后续疫苗生产的难度及成 本。

发明内容

本发明的目的是提供一种O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒。

本发明的目的是提供一种O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒的制备方法。

本发明提供的O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒的制备方法是将优化后的VP0、VP3、VP1 基因分别插入到Pink-HC载体上，然后利用BglII和BamHI这对同尾酶依次将VP0、VP3插入到Pink-VP1质粒上，最终可以得到Pink-VP0/VP3/VP1重组质粒(图1b)。 Pink-VP0/VP3/VP1线性化之后电转进入Pink strain1酵母感受态细胞中，经过PAD平板的 筛选，PCR验证，得到重组酵母菌株，然后接种到BM培养基中诱导表达，表达的蛋白WB 检测后在电镜检查，发现表达的衣壳蛋白可以组装成病毒样颗粒。

本发明的目的是解决现有O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒表达系统的表达的周期长，表 达量不高的问题。

本发明的目的是解决现有O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒的制备工艺繁琐，不适宜大规 模生产的问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒，其表达系统为毕赤酵母表达系统。

进一步的，所述O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒含有优化后的VP0、VP3和VP1三个基因。

进一步的，所述优化后的VP0、VP3和VP1三个基因的重组表达载体为Pink-HC载体。

进一步的，所述优化后的VP0基因序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步的，所述优化后的VP3基因的基因序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，所述优化后的VP1基因的基因序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步的，所述O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒的制备方法为：

1)分别优化VP0、VP3和VP1三个基因；

2)将优化后的VP0、VP3和VP1三个基因，分别插入到Pink-HC载体上，构建重组 质粒Pink-VP0/VP3/VP1；

3)将1)中重组质粒Pink-VP0/VP3/VP1转入酵母感受态细胞中，进行诱导表达；

4)将3)中表达的产物进行纯化，纯化后得到O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

1、本发明提供了一种由毕赤酵母表达系统表达的O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒，毕赤 酵母表达系统具有蛋白翻译后的修饰功能，比大肠杆菌表达系统表达的蛋白具有更完整的修 饰结构，蛋白活性更高，同时还具有的表达周期短，表达量高的优势。

2、本发明采用的毕赤酵母表达系统的制备方法，制备工艺简单，更适合高密度发酵和 工业化生产。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及 其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为重组质粒图谱；

其中a为Pink-P1/3C质粒图谱；b为Pink-VP0/VP3/VP1质粒图谱；

图2为酶切结果图

a为Pink-P1酶切图；其中1为Pink-P1未酶切，2为Pink-P1单酶切，3为Pink-3C 双酶切；

b为Pink-P1/3C酶切图；其中1为Pink-P1/3C未酶切，2为Pink-P1/3C双酶切；

c为Pink-P1/3C检测图；其中P1-N,P1-1～P1-6为选取的6个样本，用P1-F/R引 物扩增的结果；其中3C-N,3C1-1～3C-6为选取的6个样本,用3C-F/R引物扩增的结果；

图3为Pink-VP0/VP3/VP1酶切结果图

a为1为Pink-VP0/VP3/VP1重组质粒的酶切结果图；其中1为Pink-VP0/VP3/VP1 未酶切图；2为Pink-VP0/VP3/VP1双酶切图；

b为Pink-VP0/VP3/VP1菌株的PCR检测图；其中Pink-P、S0-P、S0-1～S0-6为 用S0-F/R引物的扩增图，S3-1～S3-6为选取6个样本用S3-F/R引物扩增的结果；S1-1～S1-6 为选取6个样本用S1-F/R引物的扩增图；

图4为蛋白表达结果图；其中1和2是Pink-P1/3C两个转化子的超声破碎结果，3和4是玻璃珠破碎结果；

图5为Pink-VP0/VP3/VP1菌株的表达验证图；

图6为表达蛋白的纯化结果图；

图7为电镜效果图；

其中a为电镜下Pink-P1/3C的纯化结果；b为电镜下Pink-VP0/VP3/VP1的纯化结果；

具体实施方式

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

以下实施例中使用的试剂盒、载体、酶、宿主菌等生物原料均来自商业化产品。

实施例1.采用P1和3C基因进行O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒的制备

本实施例是将序列优化后的P1基因和3C基因通过合适的酶切位点分别插入到Pink-HC 质粒上得到Pink-P1和Pink-3C然后通过载体上的一对同尾酶BglII和BamHI将3C基因完 整的基因表达盒子插入到Pink-P1载体上经过筛选最终得到重组质粒Pink-P1/3C(图1a)。 将验证正确的重组质粒Pink-P1/3C线性化之后电转进入Pink strain1酵母感受态细胞中，经 过PAD平板的筛选，PCR验证，得到重组酵母菌株，然后接种到BM培养基中诱导表达， 表达的蛋白经WB检测后，再通过电镜检查组装成病毒样颗粒的情况。

具体方案为：

1.1重组质粒Pink-P1/3C的构建

根据GenBamk提供的O型口蹄疫的毒株O/BY/CHA/2010的P1基因和3C基因(ID：JN998085.1)，我们将该基因克隆到Pink-HC载体(购自Invitrogen公司Cat.no.A11154)上，然后用BglII酶将Pink-P1载体单酶切(表1)，将Pink-3C质粒用BglII和BamHI进行双酶 切(表2)，酶切体系如下：

表1：Pink-P1的单酶切体系

表2：Pink-3C的双酶切体系

将体系混合均匀后放置在37℃环境下酶切2小时。酶切后(图2a)电泳检测片段大小。 将线性化的Pink-P1载体和3C片段，用Takara的DNA ligastion kit连接酶(CodeNo.6023Q) 将其进行16℃过夜连接，连接体系如下：

表3：连接体系

构建的重组质粒Pink-P1/3C用双酶切进行鉴定(图2b)可以得到符合预期的条带。

1.2重组质粒的电转及阳性菌落筛选

将验证正确的质粒Pink-P1/3C的菌株过夜培养，用omega质粒大提试剂盒提取足量的 质粒(约10ug)用Spel内切酶酶切2小时(酶切体系见表4)，电泳结束后电泳检测保证质 粒彻底线性化。然后向反应结束之后的酶切体系中加入十分之一体积的3M的醋酸钠和2倍 体积的无水乙醇，混合均匀之后，放置在-20的冰箱中静置1小时，放入4时的离心机中12000rpm离心2min，弃掉上清液，加入1mL的70％的乙醇溶液混合均匀后12000rpm离心2min，洗涤两次。将离心后的沉淀放在通风处使乙醇挥发干净，然后加入适量的ddH2O重 悬沉淀。将线性化的质粒电转进入Pink strain1感受态细胞中，然后涂布PAD平板，将平板 放置在30，培养箱中生长，约3-4天长出白色菌落取出。

表4：SpeI单酶切体系

待平板上有菌落长出时，挑取白色的的菌落过夜培养，在Pink-P1/3C平板上挑取了6 个菌落，取适量的菌液离心收集菌泥用天根的酵母DNA提取试剂盒提取酵母菌落的DNA然后分别用对应的引物进行PCR验证(PCR反应体系见表5)。分别用P1-F/R和3C-F/R引 物对Pink-P1/3C的菌株进行检测(图2c)，电泳结果发现其中3个转化子是阳性的。

表5：PCR反应体系

1.3酵母菌株的诱导表达

将鉴定正确的酵母菌分别命名为Pink-P1/3C，将这个菌株甘油菌接种到30ml的BMGY 培养基中，200rpm温度300条件下培养至OD₆₀₀的值为2-6时，4000rpm离心5min收集菌泥，然后加入到100ml的BMMY培养中继续培养，每隔24小时加入适量的甲醇进行诱导 使其终浓度为0.5％-1％，继续培养96小时后结束培养。

1.4表达蛋白的Western-Blot检测

酵母菌诱导表达结束后，5000rpm，离心5min后用无菌的PBS重悬洗涤后再次离心收 集菌泥。按照1g菌泥湿重加入10ml的PBS缓冲液混合均匀后用超声破碎进行破碎或者是酸洗玻璃珠进行破碎(图4中的泳道1和2是Pink-P1/3C两个转化子的超声破碎结果，泳 道3和4是玻璃珠破碎结果)，超声破碎的条件为350W，工作3S，间隔3S，破碎8min破 碎2次。将破碎液放入4。的离心机中12000rpm，离心30min收集分离上清和沉淀。接着 进行SDS-PAGE电泳，待电泳结束后将凝胶转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，然后用5％ 的脱脂乳进行4脱过夜封闭，37封孵育一抗1小时，TBST清洗数遍之后，37数孵育二抗1 小时，TBST清洗后用发光液进行曝光检测。Pink-P1/3C的两个菌株用VLP疫苗免疫动物制 备的血清作为一抗曝光(图4)，可以看到表达的蛋白在80KDa的P1的条带比较亮，而切 割完全的VP蛋白条带却很浅，表示3C的切割效果不好，表达的大量是前体蛋白P1。

1.5VLPs的纯化

向破碎离心后的菌液上清中缓慢加入饱和的硫酸铵溶液，边搅拌边加入，使其终浓度达 到40％时，继续搅拌6小时。12000rpm离心30min收集沉淀，收集上清作为阴性对照，用 少量的PBS将沉淀重悬，放入透析袋中透析24小时，每6小时更换缓冲液。

待透析结束后用5％-40％的蔗糖梯度对样品进行梯度离心，去1mL透析后的样品加入 到蔗糖梯度中，35000rpm离心3小时，收集离心后样品进行检测。Pink-P1/3C纯化后经过 WB检测(图6a)发现多都是P1蛋白，切割完全的VP蛋白量很少。

1.6电镜观察

取10uL的样品滴加到200目的铜网上，室温放置4min，用滤纸吸干铜网上样品溶液。 滴加10uL的PBS缓冲液清洗，滤纸吸干后重复清洗一次。取3％的磷钨酸10uL滴加到铜网上静置2min后，用滤纸将其吸干，然后用日立HT7700电镜进行观察。Pink-P1/3C的菌 株表达的蛋白经过硫酸铵和蔗糖纯化后发现大量都是P1蛋白，但是也进行了电镜观察(图7a)，没有观察到病毒样颗粒。

实施例2.采用VP0、VP3、VP1基因进行O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒的制备

本方案是将序列优化后的VP0、VP3、VP1基因分别插入到Pink-HC载体上，然后利用BglII和BamHI这对同尾酶的方法依次将VP0、VP3插入到Pink-VP1质粒上，最终可以得 到Pink-VP0/VP3/VP1重组质粒(图1b)。将验证正确的重组质粒Pink-P1/3C和 Pink-VP0/VP3/VP1线性化之后电转进入Pink strain1酵母感受态细胞中，经过PAD平板的筛 选，PCR验证，得到重组酵母菌株，然后接种到BM培养基中诱导表达，表达的蛋白经WB 检测后，再通过电镜检查组装成病毒样颗粒的情况。具体方案为：

2.1重组质粒Pink-VP0/VP3/VP1的构建

首先将序列优化后的VP0、VP3、VP1基因分别插入到Pink-HC载体上，将Pink-VP1的质粒用BglII快切酶进行单酶切，然后用Bgl II和BamH I将Pink-VP3质粒进行双酶切，然后进行连接。

表6：Pink-VP1的单酶切体系

表7：Pink-VP3的双酶切体系

表8：Pink-VP1和VP3表达盒片段的连接体系

获得Pink-VP3/VP1重组质粒后，接着用Bgl II将载体单酶切，然后用BglII和BamHI 将Pink-VP0的质粒双酶切，然后再进行连接，最终获得Pink-VP0/VP3/VP1质粒。

表9：Pink-VP3/VP1的单酶切体系

表10：Pink-VP0的双酶切体系

表11：Pink-VP3/VP1和VP0表达盒的连接体系

将Pink-VP0/VP3/VP1的重组质粒经双酶切(图3a)进行鉴定。

2.2重组质粒的电转及阳性菌落筛选

将验证正确的Pink-VP0/VP3/VP1菌株过夜培养，用omega质粒大提试剂盒提取足量的 质粒(约10ug)用Spel内切酶酶切2小时，电泳结束后电泳检测保证质粒彻底线性化。然 后向反应结束之后的酶切体系中加入十分之一体积的3M醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，混 合均匀之后，放置在-20℃冰箱中静置1小时，放入4℃的离心机中12000rpm离心2min，弃掉上清液，加入1mL的70％的乙醇溶液混合均匀后12000rpm离心2min，洗涤两次。将离 心后的沉淀放在通风处使乙醇挥发干净，然后加入适量的ddH₂O重悬沉淀。将线性化的质 粒电转进入Pink strain1感受态细胞中，然后涂布PAD平板，将平板放置在30℃培养箱中生 长，约3-4天长出白色菌落取出。

表12：SpeI单酶切体系

待平板上有菌落长出时，挑取白色的的菌落过夜培养，从Pink-VP0/VP3/VP1平板上挑 取了6个菌落。取适量的菌液离心，收集菌泥，用天根的酵母DNA提取试剂盒提取酵母菌 落的DNA然后分别用对应的引物进行PCR验证。

用S0-F/R、S3-F/R和S1-F/R引物对Pink-VP0/VP3/VP1菌株进行PCR检测(图3b)，电泳后发现6个转化子都是阳性的。

表13：PCR反应体系

2.3酵母菌株的诱导表达

将鉴定正确的酵母菌分别命名为Pink-VP0/VP3/VP1。将该菌株甘油菌接种到30ml的毕 赤酵母培养基(BMGY)中，200rpm温度30℃条件下培养至OD₆₀₀的值为2-6时，4000rpm离心5min，收集菌泥，然后加入到100ml的BMMY培养中继续培养，每隔24小时加入适 量的甲醇进行诱导使其终浓度为0.5％-1％，继续培养96小时后结束培养。

2.4表达蛋白的Western-Blot检测

酵母菌诱导表达结束后，5000rpm，离心5min后用无菌的PBS重悬洗涤后再次离心收 集菌泥。按照湿重为1g的菌泥，加入10ml的PBS缓冲液，混合均匀后进行超声破碎或用酸洗玻璃珠进行破碎(图4中的泳道)，超声破碎的条件为350W，工作3S，间隔3S，破碎 8min破碎2次。将破碎液放入4℃的离心机中12000rpm，离心30min收集分离上清和沉淀。 接着进行SDS-PAGE电泳，待电泳结束后将凝胶转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，然后用 加入5％的脱脂乳，进行4℃过夜封闭，37℃孵育一抗1小时，TBST清洗数遍之后，37℃孵 育二抗1小时，TBST清洗后用发光液进行曝光检测。

Pink-VP0/VP3/VP1(Pink-VPs)菌株挑选了3个进行后续的实验，取破碎后的全菌样品 和离心后的上清样品进行检测，分别用VP2单抗作为一抗进行检测，菌株表达后的破碎上 清(图5a)，可以看到在VP0(VP2+VP4)的位置处有特异性条带，25KDa处也有比较淡的条带(VP2)；采用His标签单抗作为一抗进行检测(图5b)，发现这3个菌株表达后的全菌 和上清均可检测到目的蛋白，在35KDa位置(VP0)和25KDa位置(VP3/VP1)可以看到 特异性条带。

2.5VLPs的纯化

向破碎离心后的菌液上清中缓慢加入饱和的硫酸铵溶液，边搅拌边加入，使其终浓度达 到40％时，继续搅拌6小时。12000rpm离心30min收集沉淀，收集上清作为阴性对照，用 少量的PBS将沉淀重悬，放入透析袋中透析24小时，每6小时更换缓冲液。

待透析结束后用5％-40％的蔗糖梯度对样品进行梯度离心，35000rpm离心3小时，收 集离心后样品进行检测。Pink-VP0/VP3/VP1纯化后的WB检测结果如图所示(图6b)。

然后采用Lowry法对纯化后的Pink-VP0/VP3/VP1蛋白进行检测，蛋白用超滤管浓缩之 后的终浓度为2000μg/ml。

2.6电镜观察

取10uL的样品滴加到200目的铜网上，室温放置4min，用滤纸吸干铜网上样品溶液。 滴加10uL的PBS缓冲液清洗，滤纸吸干后重复清洗一次。取3％的磷钨酸10uL滴加到铜网上静置2min后，用滤纸将其吸干，然后用日立HT7700电镜进行观察。Pink-VP0/VP3/VP1菌株表达的蛋白经过纯化后，放在电镜下进行观察(图7b)，分别在不同的视野下观察，可以看到直径在25nm左右的病毒样颗粒，颗粒完整规则。

实施例3攻毒试验

将实施例2中的FMDV的病毒样颗粒制备成疫苗，免疫动物选择口蹄疫阴性的猪，免疫剂量为100ug/只，免疫后在第7天、第14天、第21天、第28天检测血清内FMDV抗体 的效价(液相阻断ELISA试剂盒)。

序号	第7天	第14天	第21天	第28天
					1	22	45	45	90
2	32	128	128	128
					3	16	128	256	360
4	45	90	90	90
					5	22	90	360	360
6	11	45	180	180
					7	22	90	128	90
8	11	45	360	360
					9	11	45	180	180
对照	<4	<4	<4	<4

采用剂量为10³ID₅₀进行攻毒试验，攻毒后每天进行发病情况的检查和记录，前10天， 未发现对照组外的动物发生病变，9头动物中9头获得完全保护，没有口蹄疫病变发生。说 明FMDV病毒样颗粒疫苗能够很好保护猪免于口蹄疫病毒感染。而対照组的蹄部均可以看 到比较明显的病变，有的动物唇部也可看到水泡。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 天津瑞普生物技术股份有限公司

<120> 一种O型口蹄疫病毒样颗粒

<141> 2021-12-24

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 909

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggagctgggc aatcctcccc ggccacaggt tcgcagaatc aatctggcaa tacaggcagc 60

attatcaata attactatat gcaacagtac cagaacagta tggacaccca attaggggat 120

aacgccatat ccggtggcag caacgaaggc agtactgata ccacatcaac gcacactaca 180

aatacacaaa acaatgattg gttctcaaag ttggcttcgt cagcgttttc aggcttattc 240

ggtgctctgc ttgcagacaa aaaaaccgag gaaaccactc tactagaaga taggatcttg 300

accacgagga acggacacac tacctctacg acacaatcga gtgtaggaat cacgcatggt 360

tacgcaacgg cggaagattt tgtgaacggg cctaacactt ccgggctaga gacacgcgtt 420

gtacaagcag aacgtttttt taaaacccat cttttcgact gggttacgag tgaccctttc 480

gggcggtgtt atcttctcga gttacccact gatcacaagg gtgtctatgg gtctctcaca 540

gactcttatg cgtacatgag aaatgggtgg gatgtggaag taaccgccgt aggaaaccag 600

ttcaacggcg gatgcctgct tgtcgctatg gttcccgagt tgtgtagcat tgagcggcgt 660

gagctctttc agctgacgct atttccacac cagttcataa accctagaac aaatatgacc 720

gcgcatatca aagtaccgtt tgtcggtgtt aaccgatatg accagtataa ggtgcacaag 780

ccgtggactc tcgtcgtcat ggtcgtggcc ccattgacgg taaatactga gggagctccc 840

cagattaaag tgtacgcaaa tatagcccca actaatgttc atgttgcggg cgagttcccc 900

tcgaaggaa 909

<210> 2

<211> 660

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggcatctttc ccgtagcatg ttctgacggt tatggaggat tggtgacaac agatccaaag 60

accgccgacc cggtatatgg caaagtcttt aatccacctc ggaacatgtt gccgggtcgt 120

tttacgaacc tcttagacgt agcggaagcg tgcccaacct ttttacattt cgatggagat 180

gtgccttacg tcactacaaa aactgactct gatcgcgttc tcgcccaatt tgatctgtcg 240

ctcgccgcaa aacatatgag taacactttc ctagcggggc ttgcgcaata ttacacccag 300

tactcgggga ccgtcaatct acatttcatg tttacgggcc ctactgatgc caaagcaaga 360

tatatgattg cctacgctcc gcctggtatg gagcccccca agacgcccga agccgcagct 420

cactgcatcc acgctgagtg ggacacgggg ctaaactcca agttcacttt ctccataccg 480

tacttaagtg ccgcggacta tgcttatacc gcttcagacg ctgcggaaac aacaaatgtg 540

cagggatggg tgtgtctttt tcagataacg cacggtaagg cagaggggga tgcgctggtt 600

gtccttgcaa gcgcaggcaa agacttcgaa ctgaggttgc cagttgatgc tcgacaacaa 660

<210> 3

<211> 639

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

actactagta ctggtgaatc cgcggatccg gtcaccgcca cagtcgaaaa ctatgggggg 60

gagacgcagg tgcaacgacg gcaccacacc gacgtaagtt ttattctaga taggtttgtt 120

aaggtgacgc ctaaagattc gataaatgtg ctcgacttga tgcagactcc gtctcataca 180

cttgtaggag cgctcctgcg gacagcaact tactatttcg ccgatctgga ggtagcagtg 240

aagcatgaag gagacctgac gtgggtgcct aatggagcac ccgaggcagc tttggataat 300

acaacgaacc caaccgctta tcataaggcg ccactcacgc gtttagcctt gccctacacc 360

gctccacata gagttctggc cactgtttac aacggcaact gtaagtatgc ggggggctca 420

cttcccaacg tccgcggtga cttacaagtc ctagcccaaa aggcagctcg accgcttcct 480

acaagcttca attacggcgc aatcaaagcg acgagagtta ccgagttgct ctataggatg 540

aaacgcgctg aaacatactg cccccgtcct ttactagcgg tccacccatc cgccgcacgc 600

cacaaacaga agatcgtagc tccggtaaaa caaagcctt 639

Claims (7)

1.一种O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒，其特征在于：所述O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒的表达系统为毕赤酵母表达系统。

2.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒，其特征在于：所述O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒含有优化后的VP0、VP3和VP1三个基因。

3.根据权利要求2所述的O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒，其特征在于：所述优化后的VP0、VP3和VP1三个基因的重组表达载体为Pink-HC载体。

4.根据权利要求2所述的O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒，其特征在于：所述的优化后的VP0基因序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求2所述的O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒，其特征在于：所述的优化后的VP3基因的基因序列如SEQ ID NO:2所示。

6.根据权利要求2所述的O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒，其特征在于：所述的优化后的VP1基因的基因序列如SEQ ID NO:3所示。

7.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒，其特征在于：所述O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒的制备方法为：

1)分别优化VP0、VP3和VP1三个基因；

2)将优化后的VP0、VP3和VP1三个基因，分别插入到Pink-HC载体上，构建重组质粒Pink-VP0/VP3/VP1；

3)将1)中重组质粒Pink-VP0/VP3/VP1转入酵母感受态细胞中，进行诱导表达；

4)将3)中表达的产物进行纯化，纯化后得到O型口蹄疫病毒的病毒样颗粒。

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