WO2020256374A1

WO2020256374A1 - 아프리카 돼지열병의 예방을 위한 항원 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도

Info

Publication number: WO2020256374A1
Application number: PCT/KR2020/007764
Authority: WO
Inventors: 손은주; 이상민; 강향주
Original assignee: 주식회사 바이오앱
Priority date: 2019-06-17
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2020-12-24

Abstract

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 및 상기 형질전환체에서 분리된 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 또는 EP402 항원을 유효성분으로 포함하는 아프리카 돼지열병에 대한 백신 조성물 등에 관한 것이다.

Description

아프리카 돼지열병의 예방을 위한 항원 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도

본 발명은 아프리카 돼지열병 예방용 항원 EP153 및 EP402 단백질 생산용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 및 상기 형질전환체에서 분리된 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 또는 EP402 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스에 대한 백신 조성물 등에 관한 것이다.

본 출원은 2019년 6월 17일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0071879호 및 2020 6월 15일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0072205호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.

아프리카 돼지열병(African swine fever, ASF)은 아스파바이러스과( Asfarviridae)에 속하는 아프리카 돼지열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV) 감염에 의한 돼지 전염병으로, 1921년 케냐에서 최초 보고가 있은 후 주로 사하라 이남지역에서 발생보고가 있었고, 2007년 이후로 흑해연안인 죠지아, 아르메니아, 아제르바이잔 등 아프리카 이외 지역에서 그 발생 범위가 늘어나기 시작하였다. 특히 최근에는 우리나라와 교류가 많은 러시아 내에서 동서로 그 발생이 확산되고 있다. 아프리카 돼지열병은 돼지에 감염시 폐사율이 100%에 이르고, 이 질병에 대한 백신이 개발되어 있지 않아 발생 즉시 처분해야 하는 위험도가 높은 전염병으로서 이를 예방하는 것은 매우 중요한 과제로 남아있다.

한편, 분자생물학과 유전공학 기술의 눈부신 발달은 식물 분야에도 적용되어 식물체로부터 유용 생리활성 물질을 생산하려는 노력들이 꾸준히 이어지고 있다. 식물에서 유용 물질을 생산하는 것은 생산 단가를 현저히 감소시킬 수 있으며, 종래 대중적 방법(동물세포 또는 미생물에서 단백질을 합성하여 분리 정제하는 방법)에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원(바이러스, 암유전자, 장독소 등)을 원천 배제할 수 있을 뿐만 아니라, 상품화 단계에서도 동물세포나 미생물과는 달리 종자로 종묘(seed stock) 관리가 가능하다는 점에서 유리한 이점을 가지고 있다.

이에, 본 발명자들은 아프리카 돼지열병 청정국을 유지하고 질병의 유입에 대비하여, 아프리카 돼지열병 예방용 항원을 개발하고자 예의 노력한 결과, 아프리카 돼지열병 바이러스 특이 단백질 중 EP153 및 EP402 항원을 식물체에서 높은 효율로 발현시킬 수 있는 시스템을 개발하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

아프리카 돼지열병 바이러스는 감염 세포의 세포질을 복제하는 거대 이중 나선 DNA 바이러스이다. 이 바이러스는 돼지에게 폐사율이 높은 출혈열을 야기하면서도 질병의 징후 없이 매개체 구실을 할 법한 자연적 숙주 돼지, 혹멧돼지, 강멧돼지, 연진드기과에 속하는 물렁진드기(Ornithodoros) 속을 지속적으로 감염시킨다. 이 바이러스는 돼지에게 치명적인 출혈열을 발생시키기 때문에 감염 전 미리 예방하는 것이 매우 중요한 전염병이다.

본 발명은 상기와 같은 아프리카 돼지열병의 예방 필요성 및 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로, 식물체를 이용하여 효율적인 생산이 가능할 뿐만 아니라, 높은 면역원성(immunogenicity)을 나타내는 재조합 아프리카 돼지열병 EP153 및 EP402 재조합 항원 단백질, 이를 포함하는 백신 조성물 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 아프리카 돼지열병 바이러스 재조합 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료 방법, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 제조 방법 및 상기 재조합 항원을 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 아프리카 돼지열병(African swine fever) 바이러스 EP153 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 아프리카 돼지열병 바이러스 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 식물체에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 생산을 위한 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 5의 BiP(chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 EP153 또는 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 pFc2(porcine Fc) 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 EP153 또는 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 EP153 또는 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 5의 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6의 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; EP153 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 10의 염기서열 또는 서열번호 11의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환체는 식물체일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 재조합 항원 단백질을 제공한다.

더욱이, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 재조합 항원 단백질의, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 재조합 항원 단백질의, 아프리카 돼지열병에 대한 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 수용성일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 EP153 재조합 항원 단백질; 및 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 EP402 재조합 항원 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 백신 조성물은 애주번트(adjuvant)를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 애주번트는 미네랄 오일(mineral oil) 또는 에멀시겐(Emulsigen)-계일 수 있으며, 오일-인-워터 타입(oil-in-water type)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 백신 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 동물에게 본 발명에 따른 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및 (b) 상기 식물체로부터 재조합 항원을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; (b) 상기 식물체로부터 재조합 항원을 분리 및 정제하는 단계; 및 (c) 상기 분리·정제된 재조합 항원을 이용하여 백신 조성물 또는 백신 키트를 제조하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 백신 조성물 또는 백신 키트의 제조 방법을 제공한다.

아프리카 돼지열병을 포함한 바이러스성 질병의 예방에 이용하기 위한 단백질, 특히 항원은 단백질의 접힘(folding), 당화과정(glycosylation) 등의 문제로 인하여 박테리아를 이용하지 못하고, 주로 동물세포를 이용하여 생산되고 있다. 그러나 동물세포를 이용한 백신 생산 방법은 대량 생산을 위한 설비 확충에 큰 비용이 소요되기 때문에 제조가 용이하지 않고, 항원의 가격이 고가인 경우가 대부분이다. 또한, 동물세포를 이용하여 제조된 항원들은 저장이 용이하지 않을 뿐만 아니라, 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 높다는 단점을 가지고 있다. 그러나 본 발명은 식물을 이용하여 이러한 단점을 보완하였다. 즉 식물세포는 동물세포와 달리 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 매우 낮고, 경작 면적만 확보되면 언제든지 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라, 식물체를 통하여 장기 보관이 가능하기 때문에, 안정적으로 저렴한 항원의 생산이 가능하다.

본 발명의 재조합 아프리카 돼지열병 바이러스 항원은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 수용해성(Water solubility)을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 또한, 체내에서 항원으로 작용하여 높은 면역원성을 나타내므로 신규한 아프리카 돼지열병 바이러스 백신 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 아프리카 돼지열병 바이러스 EP153과 EP402 항원 단백질의 발현을 위한 유전자의 배열을 나타낸 개열지도이다.

도 2는 아프리카 돼지열병 바이러스 EP153(좌측) 및 EP402(우측) 항원 단백질의 발현을 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행하여 얻은 밴드 사진이다(T, Total extract; S, Supernatant 분획; P, Pellet 분획).

도 3은 아프리카 돼지열병 바이러스 EP153(좌측) 및 EP402(우측) 항원 단백질을 분리 및 정제하여 전기영동 후 쿠마시 블루 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.

도 4는 본 발명의 EP153 및 EP402 재조합 항원 단백질의 항체 형성 능력을 확인하기 위한 마우스 실험의 개략도(상단) 및 ELISA를 통해 반응성을 확인한 결과 막대그래프(하단)로 나타낸 도이다.

도 5는 본 발명의 EP153 및 EP402 재조합 항원 단백질의 항체 형성 능력을 확인하기 위한 돼지 실험의 개략도(상단) 및 ELISA를 통해 반응성을 확인한 결과 막대그래프(하단)로 나타낸 도이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질 유전자를 이용하면, 식물체에서도 높은 면역원성을 가지는 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질 EP153 및 EP402를 효율적으로 생산 및 분리가 가능하다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질은 안정적이고 효율적인 대량 생산이 가능하기 때문에, 저렴하며 안정적인 아프리카 돼지열병 바이러스 백신을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

이에, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 아프리카 돼지열병(African swine fever) 바이러스 EP153 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 아프리카 돼지열병 바이러스 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 식물체에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 생산을 위한 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

상기 EP153 항원 단백질은 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되거나, 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산으로 이루어지고, 상기 EP402 항원 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 코딩되거나, 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 EP153 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 EP402 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 EP153 항원 단백질 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 EP402 항원 단백질은 숙주의 면역 반응 메커니즘을 조절할 수 있다고 알려져 있는 단백질이다.

본 명세서에서 사용된 용어 “폴리뉴클레오티드”는 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한, 일반적으로 인산이에스테르 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들면 뉴클레오티드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 “골격” 결합, 예를 들면 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합(펩타이드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)뿐만 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “항원(antigen)”이란, 체내에서 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 총칭하며, 바람직하게는 바이러스, 화합물질, 세균, 꽃가루, 암세포 등 또는 이들의 일부 펩타이드 또는 단백질이나, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 BiP(Chaperone binding protein) 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 돼지의 Fc 단편(porcine Fc fragment; pFc2)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 EP153 또는 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에 위치할 수 있고, 상기 pFc2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 EP153 또는 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치할 수 있다.

본 명세서에 있어서, “재조합 벡터(recombinant vector)”란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 목적 항원(본 발명에서는, 아프리카 돼지열병 항원 EP153 및 EP402)을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 “벡터”는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, “복제 단위”란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 BiP 유전자, 히스-태그(His-tag, 최소 5개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노산 모티프), 소포체 신호 펩타이드(endoplasmic reticulum signal peptide, 소포체 표적화 서열과 같은 의미) 유전자, 클로닝 사이트(cloning site) 등을 추가로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 태그인 Fc 단편 이외에 추가 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 태그용 유전자로는, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있다.

상기 “BiP 유전자(도 1에서는 NB로 표시)”는, 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 유전자이고 가장 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 유전자이나, 서열번호 5의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 BiP 유전자는 재조합 단백질이 발현될 때 서열 일부가 잘려나가 일부 아미노산만이 남을 수도 있다.

본 명세서에 있어서, “Fc 단편(Fc fragment)”이란 면역글로불린이 파파인(papain)에 의해 소화되었을 때, 중쇄(heavy chain; H chain) 부분만이 S-S 결합으로 연결되고, 항원 결합부위를 가지지 않는 부분을 Fc 단편이라고 하며, 본 발명의 Fc 단편은 바람직하게는 돼지의 Fc 단편이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 7로 표시되는 돼지의 Fc 단편(pFc2)이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 Fc 단편은 서열번호 6으로 표시되는 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 6의 염기서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 “클로닝 사이트”란 벡터 내에서 각 유전자를 연결/구분하는 것을 목적으로 삽입된 것을 총칭한다.

상기 “소포체 신호 펩타이드(ER 신호 서열)”는 당업자에게 알려진 식물 소포체 신호 펩타이드라면 그 종류 및 아미노산 서열이 제한되지 않으며, 예를 들어 US 20130295065, WO2009158716 등의 문헌을 참고로 할 수 있다. 본 발명에서 상기 “소포체 신호 펩타이드”는 바람직하게는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu, 서열번호 9로 표시되는 폴리펩타이드)일 수 있으며, 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 소포체 신호 펩타이드는 서열번호 8의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 8의 염기서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 소포체 신호 펩타이드의 결합 위치는 식물세포 내에서 발현 또는 합성을 목적으로 하는 단백질의 C-말단에 추가(또는 연결)되는 것을 특징으로 한다.

상기 선별용 마커 유전자에는 일례로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 일례로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 일례로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 포함될 수 있으나, 상기 열거한 것들은 예시일 뿐 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 프로모터 유전자, BiP(chaperone binding protein; NB) 신호 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; EP153 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 돼지의 Fc 단편(pFc2)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 순서로 연결될 수 있다.

상기와 같은 순서에 의해 연결된 경우, 즉 도 1의 상단 또는 하단의 개열지도에 나타난 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 서열번호 10 또는 서열번호 11의 염기서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 서열번호 10 또는 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어지나, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 효모 등과 같은 미생물, 곤충 세포, 인간을 포함한 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소 등과 같은 동물, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 및 유채를 포함하는 특용작물류; 및 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 및 튤립을 포함 하는 화훼류 등일 수 있으나, 본 발명의 벡터로 형질전환될 수 있는 생명체라면 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “형질전환(transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체(transgenic organism)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아크로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “식물”은 본 발명의 항원을 포함하는 단백질을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 구체적으로는 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 Nicotiana benthamiana L. 또는 Nicotiana tabacum cv. xanthi 등의 품종을 이용할 수 있다.

상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기충격법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된, 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 재조합 항원 단백질 또는 EP402 재조합 항원 단백질을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 EP153 재조합 항원 단백질 또는 EP402 재조합 항원 단백질은 수용성일 수 있다. 보다 구체적으로, 식물체에서 발현된 EP153 재조합 항원 단백질 또는 EP402 재조합 항원 단백질은 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 수용성 분획에 용해되어 있는 것일 수 있다.

또한 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 EP153 재조합 항원 단백질 또는 EP402 재조합 항원 단백질은 85% 이상의 순도로 분리·정제될 수 있다. 보다 구체적으로, 식물체에서 발현된 EP153 재조합 항원 단백질 또는 EP402 재조합 항원 단백질은 통상의 분리·정제 방법을 이용하였을 때, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도의 EP153 재조합 항원 단백질 또는 EP402 재조합 항원 단백질을 얻을 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된, 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 재조합 항원 단백질; 또는 EP402 재조합 항원 단백질; 또는 상기 EP153 재조합 항원 단백질 및 EP402 재조합 항원 단백질 모두를 유효성분으로 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된, 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 재조합 항원 단백질; 또는 EP402 재조합 항원 단백질; 또는 상기 EP153 재조합 항원 단백질 및 EP402 재조합 항원 단백질을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된, 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 재조합 항원 단백질 또는 EP402 재조합 항원 단백질의 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된, 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 재조합 항원 단백질 또는 EP402 재조합 항원 단백질의 아프리카 돼지열병에 이용되는 백신을 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 백신 조성물은 애주번트를 더 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “애주번트(Adjuvant)”란, 백신 또는 약학적으로 활성 있는 성분들에 첨가되어 면역 반응을 증가시키거나 영향을 주는 물질 또는 조성물을 말한다. 대표적으로 면역원(immunogen)용 캐리어 또는 보조 물질 및/또는 다른 약학적으로 활성이 있는 물질 또는 조성물을 통상적으로 의미한다. 전형적으로, 용어 “애주번트”는 넓은 개념에서 해석되어야 하며, 상기 애주번트에 통합되거나 상기 애주번트와 함께 투여된 항원의 면역원성(immunogenicity)을 증진시킬 수 있는 넓은 범위의 물질 또는 책략(stratagerm)을 의미한다. 또한, 애주번트는, 이에 제한되지 않고, 면역 강화제(immune potentiator), 항원 전달계 또는 이들의 조합으로 나뉘어질 수 있다. 적절한 애주번트의 예로, 알루미늄 하이드록사이드, 프로이드 완전 또는 불완전 애주번트, DEAE 덱스트란, 레바미솔, PCG 및 poly I:C 또는 poly A:U를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 미네랄 오일(mineral oil)을 포함하는 애주번트로서 Seppic 사의 MONTANIDE ^TM ISA 15 A VG 애주번트(Oil-in-Water, O/W type) 또는 에멀시겐(Emulsigen)-계 애주번트로서 DDA(dimethyldioctadecyl ammonium bromide)를 포함하는 MVP adjuvants 사의 에멀시겐-D 애주번트(O/W type)를 사용하였다.

본 명세서에 있어서, “백신(vaccine)”이란 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “용해성(solubility)”이란 목적 단백질 또는 펩타이드가 인체에 투여하기 적합한 용매에 용해될 수 있는 정도를 의미한다. 구체적으로는 특정 온도에서 주어진 용매에 대하여 용질이 포화된 정도를 나타내는 것일 수 있다. 용해성은 용질의 포화 농도를 결정함으로써 측정할 수 있으며, 예컨대 용매에 용질을 과량으로 첨가하고 이를 교반하고 여과한 다음, 농도를 UV 분광기 또는 HPLC 등을 사용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 높은 용해성은 재조합 단백질의 분리정제에 유리하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 장점을 가진다.

본 명세서에 있어서, “예방(prevention)”이란 본 발명에 따른 재조합 아프리카 돼지열병 항원 단백질의 투여에 의해 아프리카 돼지열병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, “치료(treatment)”란 본 발명에 따른 재조합 아프리카 돼지열병 항원 단백질의 투여에 의해 아프리카 돼지열병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, “개체(individual)”란 본 발명의 재조합 아프리카 돼지열병 항원 단백질이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.

본 발명의 “백신 조성물”은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된, 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 재조합 항원 단백질; 또는 EP402 재조합 항원 단백질; 또는 상기 EP153 재조합 항원 단백질 및 EP402 재조합 항원 단백질 모두를 유효성분으로 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 백신 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 인간을 제외한 동물에게 본 발명에 따른 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및 (b) 상기 식물체로부터 재조합 항원을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; (b) 상기 식물체로부터 재조합 항원을 분리 및 정제하는 단계; 및 (c) 상기 분리·정제된 재조합 항원을 이용하여 백신 조성물 또는 백신 키트를 제조하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 백신 조성물 또는 백신 키트의 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 및 EP402 항원을 발현하는 재조합 벡터의 제조

도 1의 개열지도에 나타난 바와 같이, 식물체에서 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질 EP153(도 1 상단) 또는 EP402(도 1 하단)를 발현시킬 수 있도록 재조합한 식물 발현 벡터를 제작하였다. 보다 자세하게는, 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 및 EP402 단백질에 대한 유전자 정보를 확보하고, 식물체에서의 발현에 최적화된 서열로 각각 EP153 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1) 및 EP402 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 3)를 합성하였다.

보다 구체적으로는, pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터(promoter) 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 BiP(chaperone binding protein; NB) 신호 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 5), 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 또는 EP402 항원 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(각각 서열번호 1, 서열번호 3), pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 6), 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 8)를 순서대로 연결하여 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 또는 EP402 항원 단백질의 식물 발현 벡터를 제작하였다.

실시예 2: 재조합 EP153 및 EP402 항원 단백질의 발현 확인

2.1. 식물발현 벡터의 일과성 발현(transient expression)

상기 실시예 1에서 준비한 아프리카 돼지열병 항원 EP153 또는 EP402의 식물 발현 재조합 벡터를 아그로박테리아 LBA4404 균주에 전기충격법(electrophoration)을 이용하여 형질전환 시켰다. 형질전환된 아그로박테리아를 5 mL의 YEP 액체배지(효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 리팜피신 25 mg/L)에서 28℃의 조건으로 16시간 동안 진탕 배양한 후 1차 배양액 1 mL을 50 mL의 새 YEP 배지에 접종하여 28℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양 하였다. 이렇게 배양된 아그로박테리아는 원심분리(7,000 rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 600 nm의 파장에서 흡광도(O.D) 값이 1.0이 되도록 인필트레이션(Infiltration) 버퍼[10 mM MES (pH 5.7), 10 mM MgCl₂, 200 μM 아세토시링곤]에 현탁시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나( Nicotiana benthamiana) 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 수행하였다.

2.2. 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 및 EP402 항원 단백질의 발현 확인

상기 실시예 2.1에서 준비한 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 수용성 분획(Supernatant; S)에 있는 단백질과 펠릿(Pellet; P) 분획에 있는 단백질, 수용성 분획과 펠릿을 모두 포함하는 분획(Total; T)을 각각 분리하여 웨스턴 블롯팅으로 재조합 EP153과 EP402 항원 단백질의 발현을 확인하였다. 보다 자세하게는, 각 분획 30 μL를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다. 그리고 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동 하여 크기별로 분리된 단백질 밴드를 확인하고, 이를 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블로킹 단계를 거친 다음, 폴리히스티딘과 반응하는 항체를 결합하고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 재조합 EP153과 EP402 항원 단백질의 발현을 확인하였다.

그 결과 도 2(좌측)에 나타난 바와 같이, 재조합 EP153 항원 단백질은 높은 효율로 발현되었음을 확인하였다. 발현된 재조합 EP153 항원 단백질의 90% 이상이 수용성 분획에서 확인되었으며, 약 10% 미만이 펠릿 분획에서 확인되었다.

재조합 EP402 항원 단백질의 경우(도 2 우측), EP153 항원 단백질과 비교하여 발현 효율은 약간 낮았으나, EP153 항원의 경우와 유사하게 발현된 총 단백질의 90% 이상이 수용성 분획에서 발현되었음이 확인되었고, 약 10% 미만이 펠릿 분획에서 확인되었다.

따라서 하기 실시예에서는 BiP(Chaperone binding protein; NB) 신호 펩타이드를 융합한 재조합 EP153과 EP402 항원 단백질을 이용하여 실험을 진행하였다.

실시예 3: 아프리카 돼지열병 바이러스의 EP153 및 EP402 항원 단백질의 분리 및 정제

상기 실시예 2.1에서 준비된 재조합 EP153과 EP402 항원 단백질이 발현되는 니코티아나 벤타미아 잎 100 g에 단백질 추출 용액[50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 0.5% Triton X-100] 100 mL을 첨가하고 블렌더로 조직을 파쇄한 후 13,000 rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 단백질 추출액을 회수하였다. 상기 단백질 추출액으로부터 재조합 EP153과 EP402 항원 단백질의 분리정제를 위해 단백질 A-세파로스 레진(protein A-sepharose resin)이 충진된 컬럼으로 친화성 크로마토그래피를 실시하였다. 상기 컬럼에 레진을 10 mL 충진한 후 100 mL의 세척용액[50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 M NaCl]으로 평형화시켰다. 회수한 단백질 추출액을 컬럼에 적용하고 평형화시킨 다음, 세척용액 100 mL을 흘려보내 레진을 세척하고 용출용액[50 mM Sodium citrate (pH 3.0), 300 mM NaCl]으로 재조합 EP153과 EP402 항원 단백질을 용출시켰다. 재조합 EP153과 EP402 항원 단백질이 포함된 용출용액은 0.1 N NaOH로 pH 7.2로 중화한 후 30 kDa 크기의 필터를 사용하여 버퍼 교체 및 농축을 시행하였다. 분리 정제된 재조합 EP153과 EP402 항원 단백질은 전기영동(SDS-PAGE) 후 쿠마시 염색법(Coomassie staining)을 통해 확인하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 재조합 EP153과 EP402 항원 단백질은 본래의 단백질과 비교하여 큰 변이나 변형 없이 잘 정제되었다. 이러한 결과는 단백질을 식물에서 발현시키는 경우 당 구조가 변이되어 생산 효율이 떨어질 수 있는 문제점이 발견되지 않았음을 확인한 것으로, 본 발명에 따른 아프리카 돼지열병 바이러스의 재조합 EP153과 EP402 항원 단백질이 식물에서 잘 생산되는 것을 확인한 결과이다.

실시예 4: 마우스에서 재조합 EP153 및 EP402 항원 단백질 투여에 따른 아프리카 돼지열병에 대한 항체 형성 확인

상기 실시예 3에서 분리·정제된 EP153과 EP402 항원 단백질의 항체 형성 능력을 확인하기 위해, 하기 표 1에 기재한 바와 같이 6주령 BALB/c 마우스를 각 그룹당 3마리씩 5그룹으로 나누어 항체 형성 테스트를 진행하였다. PBS를 처리한 그룹(Control group), EP153 항원 단백질을 1 μg 처리한 그룹(EP153 1-1 내지 1-3; 총 3 마리), 5 μg 처리한 그룹(EP153 5-1 내지 5-3; 총 3 마리), EP402 항원 단백질을 1 μg 처리한 그룹(EP402 1-1 내지 1-3; 총 3 마리), 그리고 5 μg 처리한 그룹(EP402 5-1 내지 5-3; 총 3 마리)으로 나누었다. Seppic 사의 MONTANIDE ^TM ISA 15 A VG 애주번트(adjuvant) 20%와 함께 2주 간격으로 2회 근육주사를 시행하였고(도 4 상단 참조), 2차 주사 후 2주가 경과된 시점에서 마우스를 안락사하여 혈청을 채취하였다. EP153과 EP402 항원 단백질을 각 well 당 15 ng씩 플레이트에 코팅한 후, 상기 채취한 혈청과의 반응성을 ELISA를 통해 확인하였다.

그룹 (x는 1, 2 또는 3)	항원	애주번트	총 부피
Control	PBS	-	100 μL
EP153 1-x	EP153 (1 μg) + TBS (79 μL)	15 A VG (20 μL)	100 μL
EP153 5-x	EP153 (5 μg) + TBS (75 μL)	15 A VG (20 μL)	100 μL
EP402 1-x	EP402 (1 μg) + TBS (79 μL)	15 A VG (20 μL)	100 μL
EP402 5-x	EP402 (5 μg) + TBS (75 μL)	15 A VG (20 μL)	100 μL

그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 재조합 EP153 또는 EP402 항원 단백질로 마우스에서 면역 반응을 유도하였을 때, 항체가 잘 형성됨을 확인하였다. 또한, EP153과 EP402 모두 1 μg 과 5 μg 접종에서 항체 형성이 유사한 경향을 보였으며, 이러한 결과는 소량의(1 μg) 항원 단백질만으로도 충분한 양의 항체가 형성됨을 나타내는 것이다.

게다가, 상기 두 항원 단백질 조성물 모두 1회 접종보다는 2회 접종 시 형성되는 항체의 양이 증가하는 경향을 나타냈다.

실시예 5: 돼지에서 재조합 EP153 및 EP402 항원 단백질 투여에 따른 아프리카 돼지열병에 대한 항체 형성 확인

상기 실시예 3에서 분리·정제된 EP153과 EP402 항원 단백질의 항체 형성 능력을 목적 동물인 돼지에서 확인하기 위해 3~4주령 새끼 돼지를 각 그룹당 2마리씩 2그룹으로 나누어 항체 형성 테스트를 진행하였다. 하기 표 2에 기재한 바와 같이, EP153 항원 단백질 150 μg, EP402 항원 단백질 150 μg, CCMV 100 μg 및 20% 15 A VG 애주번트를 처리한 그룹(G1-x; x는 1 또는 2로서 총 2마리), EP153 항원 단백질 150 μg, EP402 항원 단백질 150 μg, CCMV 100 μg 및 20% Emulsigen D 애주번트를 처리한 그룹(G2-x; x는 1 또는 2로서 총 2마리)으로 나누어 실험을 진행하였다. 근육으로 1/2두분을 1차 접종하고 3주 후에 2차 접종을 시행하였다(도 5 상단 참조). 상기 접종 단위 '1/2두분'은 총 부피 2 mL의 백신을 1 mL로 1차 접종하고, 나머지 1 mL을 2차 접종함을 의미한다. ELISA로 항체가를 측정하기 위한 채혈은 접종 전(0 dpv), 1차 접종 후 3주 후(21 dpv), 2차 접종 2주 후(35 dpv)에 각각 진행하였다.

그룹	항원	애주번트	총 부피
G1-x(2마리)	EP153 (150 μg) + EP402 (150 μg) + CCMV(100 μg)	15 A VG (20%)	2 mL
G2-x(2마리)	EP153 (150 μg) + EP402 (150 μg) + CCMV(100 μg)	Emulsigen-D (20%)	2 mL

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, EP153과 EP402 항원 단백질을 포함하는 조성물을 투여함에 따라 돼지의 체내에서 항체가 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 조성물의 1회 접종보다는 2회 접종 시 형성되는 항체의 양이 증가하는 경향을 나타냈다. 이러한 결과는 상기 실시예 4의 마우스 실험 결과와 동일한 양상을 나타낸 것이다. 따라서 본 발명에 따른 백신 조성물은 2회 접종으로 최적의 항체 형성 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

본 발명의 재조합 아프리카 돼지열병 바이러스 항원은 식물체를 이용하여 효율적인 생산이 가능할 뿐만 아니라, 높은 수용해성(Water solubility)을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 또한, 체내에서 항원으로 작용하여 높은 면역원성(immunogenicity)을 나타내므로 아프리카 돼지열병 바이러스 감염을 예방하거나 감염증을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있어 산업적 이용 가치가 클 것으로 예상된다.

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 아프리카 돼지열병(African swine fever) 바이러스 EP153 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 아프리카 돼지열병 바이러스 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,

식물체에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 생산을 위한 재조합 벡터.
제1항에 있어서,

상기 재조합 벡터는 서열번호 5의 BiP(chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 생산을 위한 재조합 벡터.
제2항에 있어서,

상기 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 EP153 또는 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 생산을 위한 재조합 벡터.
제1항에 있어서,

상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 pFc2(porcine Fc) 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 생산을 위한 재조합 벡터.
제4항에 있어서,

상기 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 EP153 또는 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 생산을 위한 재조합 벡터.
제1항에 있어서,

상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 생산을 위한 재조합 벡터.
제6항에 있어서,

상기 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 EP153 또는 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 생산을 위한 재조합 벡터.
제1항에 있어서,

상기 재조합 벡터는 서열번호 5의 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

서열번호 6의 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

서열번호 8의 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 생산을 위한 재조합 벡터.
제8항에 있어서,

상기 재조합 벡터는 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; EP153 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 EP402 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 생산을 위한 재조합 벡터.
제8항에 있어서,

상기 재조합 벡터는 서열번호 10의 염기서열 또는 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 생산을 위한 재조합 벡터.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체.
제11항에 있어서,

상기 형질전환체는 식물체인 것을 특징으로 하는, 형질전환체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 재조합 항원 단백질.
제13항에 있어서,

상기 단백질은 수용성인 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 재조합 항원 단백질.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 EP153 재조합 항원 단백질; 및 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 EP402 재조합 항원 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제15항에 있어서,

상기 백신 조성물은 애주번트(adjuvant)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제16항에 있어서,

상기 애주번트는 미네랄 오일(mineral oil) 또는 에멀시겐(Emulsigen)-계인 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제13항의 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 백신 키트.
인간을 제외한 동물에게 제15항의 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료 방법.
하기의 단계를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 항원의 제조 방법:

(a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및

(b) 상기 식물체로부터 재조합 항원을 분리 및 정제하는 단계.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 재조합 항원 단백질의, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료 용도.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 항체 유도용 재조합 항원 단백질의, 아프리카 돼지열병에 대한 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도.