WO2020060117A1 - 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2020060117A1
WO2020060117A1 PCT/KR2019/011915 KR2019011915W WO2020060117A1 WO 2020060117 A1 WO2020060117 A1 WO 2020060117A1 KR 2019011915 W KR2019011915 W KR 2019011915W WO 2020060117 A1 WO2020060117 A1 WO 2020060117A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
fragment
antigen
promoter
swine fever
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/011915
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이용직
안동준
최세은
송재영
조인수
Original Assignee
주식회사 바이오앱
대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 바이오앱, 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) filed Critical 주식회사 바이오앱
Priority to CN201980016219.1A priority Critical patent/CN112135630B/zh
Priority to US16/770,190 priority patent/US11484589B2/en
Priority to JP2020521575A priority patent/JP6993650B2/ja
Priority to BR112021005280-1A priority patent/BR112021005280A2/pt
Priority to EP19862863.8A priority patent/EP3854417A4/en
Publication of WO2020060117A1 publication Critical patent/WO2020060117A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A61K39/225—Porcine transmissible gastroenteritis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/187—Hog cholera virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24371—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

본 발명은 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원에 관한 것으로, 돼지 열병 항원에 Fc 단편을 결합시킴으로써 자체-면역 증강 효과를 가지는 백신 조성물 및 이의 제조 방법에 관하 것이다.

Description

돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조 방법
본 발명은 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질 생산용 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체에서 분리된 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질 및 이의 용도 등에 관한 것이다.
돼지 열병이란 돼지 열병 바이러스(classical swine fever virus; CSFV)가 원인 병원체인 질병으로서 사람이나 돼지 이외의 다른 동물에는 감염되지 않지만, 돼지와 야생 멧돼지에서는 일단 발병하게 되면 전파성이 매우 높으며 치료법이 없고 감염된 돼지들은 대부분이 폐사하는 치사율이 매우 높은 전염병이다. 돼지 열병은 세계동물보건기구(OIE)에서 매우 중요 질병으로 분류되어 있고, 국내에서도 가축전염병예방법에서 제1종 가축전염병으로 분류되는 질병으로, 폐사율과 이환율이 매우 높아 돼지 열병의 근절 없이는 양돈산업의 미래를 보장할 수 없다고 할 정도로 예방이 중요한 문제로 인식되는 전염병이다. 우리나라에서는 질병대책으로 순화생독 바이러스인 LOM strain으로 제조한 생독 백신으로 예방접종을 실시하고 있으나, 전문가들 및 일선 양돈종사자들은 끊임없이 LOM 백신의 병원성 및 안전성에 대한 문제를 제기하여 왔다(한국등록특허 10-1642727).
LOM 백신주 안전성에 대한 문제가 제기된 대표적인 사건은, 2002년에 돼지 열병 청정화 선언을 하고 비백신 정책을 하였으나, 2002년과 2003년에 전국적으로 돼지 열병이 재발생하여 2004년부터는 다시 전국의 모든 돼지들에 LOM 백신 접종을 재개하였는데, 이때 임신 모돈 접종에서 유사산의 사례가 많이 발생하여 이슈화가 된 사건이 있다. 또한, 1999년부터 돼지 열병 비백신 지역인 제주도에서는, 2004년에 사료의 첨가제로 사용하는 혈분제제 제품에 돼지 열병 LOM 백신주가 비의도적으로 오염되어 유통되었는데, 제주도 300 개 농가 중 150 개 농가의 백신주 감염 돼지들에게서 돼지 열병과 매우 유사한 증상이 발생하였고, 돼지 부검시에도 실질 장기에 특이적인 병변 증상을 보인 바도 있다. 최근 2014년도에는 제주도에서 돼지 열병 LOM 백신주가 잘못 유통되어 임신 모돈에 접종됨으로써 유사산과 태아에게 LOM 백신주가 수직 감염된 것이 확인되어, 백신의 안전성에 관한 문제가 재차 대두되고 있으며, 이를 대체할 효과적인 백신이 요구되는 실정이다. 따라서, 안정적으로 돼지 열병을 효과적으로 예방할 수 있는 신규한 백신의 필요성이 대두되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로, 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질, 이를 포함하는 백신 조성물, 및 이의 제조 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 열병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 E2 단백질은 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 돼지 열병 항원 종류라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 E2 단백질은 Fc 단편과 융합됨으로써 자체 면역 증강 반응(self-adjuvanting) 효과 및 증가된 용해성을 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 융합은 Fc 단편의 N 말단 또는 C 말단에 항원이 펩타이드 결합으로 연결된 형태일 수 있으나, Fc 단편과 항원이 결합되어 있는 형태라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 열병 예방용 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 돼지 열병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 돼지 열병의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질의 돼지 열병의 예방에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 돼지 열병 항원 E2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 프로모터 유전자, E2 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 순서로, 또는 프로모터 유전자, Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 E2 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 순서로 작동가능하도록 순차적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1a(Elongation factor-1 alpha) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 등이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 BiP(Chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 유전자, M17의 5' UTR(untranslational region) 부위 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질의 발현량을 증가시키며, Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질은 자체 면역 증강 효과 및 증가된 용해성을 가지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 효모 등과 같은 미생물, 곤충 세포, 인간을 포함한 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소 등과 같은 동물, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등일 수 있으며, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 및 유채를 포함하는 특용작물류; 및 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 및 튤립을 포함하는 화훼류 등일 수 있으나, 본 발명의 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 생명체라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 Fc 단편이 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 자체-면역 증강 효과를 가지는 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질의 생산 방법을 제공한다. 상기 형질전환체는 바람직하게는 세포 자체, 또는 세포를 포함하는 배양물일 수 있으며, 상기 배양액은 바람직하게는 세포를 배양한 후, 세포를 제거한 배양액일 수 있으나, 본 발명의 재조합 항원을 포함하고 있다면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질은 자체-면역 증강 효과를 가지기 때문에 추가의 면역항원보강제의 사용 없이도 소량의 백신 조성물로도 효과적인 돼지 열병 예방 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 항원의 용해성 및 안정성을 증가시켜 항원의 분리 및 보관이 용이하다. 또한, 본 발명에 따른 발현 벡터를 이용함으로써 E2 단백질의 생산량을 현저히 증가시킬 수 있기 때문에 백신의 고효율 생산을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 pCAMBIA1300 벡터맵을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 VP1 재조합 단백질 발현을 위한 유전자의 배열을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 VP1 재조합 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 VP1 재조합 단백질의 안정성을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 VP1 재조합 단백질의 용해성을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 GP5 재조합 항원의 용해성을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 PCV2 재조합 단백질의 용해성 및 생산성을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 E2 재조합 항원의 생산량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 E2 재조합 항원을 1 회 투여하고 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 E2 재조합 항원을 2 회 투여하고 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명에서는 돼지의 면역글로불린 Fc 단편과 돼지 열병 항원 E2를 결합시키는 경우, 상기 단편에 의하여 항원의 발현량 및 생산성이 증가될 뿐만 아니라, 용해성 및 안정성이 증가된다는 것을 확인하고, 상기 돼지의 Fc 단편과 융합된 항원 E2, 상기 돼지의 Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 E2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 이용한 재조합 항원의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에 있어서, "Fc 단편(Fc fragment)"이란 면역글로불린이 파파인(papain)에 의해 소화되었을 때, 중쇄(heavy chain; H chain) 부분만이 S-S 결합으로 연결되고, 항원 결합부위를 가지지 않는 부분을 Fc 단편이라고 하며, 본 발명의 Fc 단편은 바람직하게는 돼지의 Fc 단편이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편이나, 목적 항원과 융합되었을 때, 목적 항원의 발현량 및 용해성을 증가시키는 Fc 단편이라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 Fc 단편은 서열번호 4의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열과 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상, 가장 바람직하게는 98 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 더 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "항원(antigen)"이란 체내에서 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 총칭하며, 바람직하게는 바이러스, 화합물질, 세균, 꽃가루, 암세포, 새우 등 또는 이들의 일부 펩타이드 또는 단백질이나, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "돼지 열병 바이러스(classical swine fever virus)"는 Pestivirus에 속하는 약 12.3 내지 12.5 kb 크기의 envelope-associated glycoprotein(E protein)의 일종인 E2 glycoprotein에 항원 결정 부위를 가지고 있어서, 돼지 열병 바이러스의 E2 단백질은 바이러스 중화항체 반응을 유발하고, 면역학적으로 돼지 열병의 방어 기작에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 돼지 열병 바이러스의 E2 단백질은 gp55라고도 칭하며, 바람직하게는 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시된다. 또한, 본 발명의 E2 단백질은 서열번호 13의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 13의 염기서열과 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "백신(vaccine)"이란 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "목적 단백질(target protein)"이란 본 발명에 따른 유전공학적 방법으로 생산하고자 하는 단백질을 말하는 것으로, 바람직하게는 상업적 용도로 이용되고 있는 대량으로 생산될 필요가 있는 항원들이며, 더욱 바람직하게는 항원, 항체, 항체의 단편, 구조 단백질, 조절 단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소의 단편, 효소 저해제, 수송 단백질, 수용체(receptor), 수용체의 단편, 생체방어 유도물질, 저장 단백질, 이동 단백질(movement protein), 익스플로이티브 단백질(exploitive protein), 리포터 단백질 등이나, 본 발명의 재조합 발현 벡터로 제조될 수 있는 단백질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "재조합 벡터(recombinant protein)"란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 돼지의 Fc 단편이 융합된 목적 항원을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 "벡터"는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, "복제 단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 단백질의 합성량을 증가시키기 위한 M17의 5' UTR 부위 유전자, 목적 단백질을 소포체로 이동시키기 위한 BiP 유전자, 단백질이 소포체 내에서 안정적으로 유지될 수 있도록 단백질의 분해를 최소화하기 위한 HDEL 유전자 등을 추가로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 재조합 단백질을 용이하게 분리하기 위한 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 태그용 유전자는 본 발명의 태그 단백질인 Fc 단편 이외에 추가로 용이한 분리를 위해 포함되는 것으로서, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있으며, 상기 선별용 마커 유전자에는 대표적으로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 대표적으로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1a(Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 대표적으로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 튜머패시언스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이나, 상기 예는 예시일 뿐 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "융합 항원(fusion antigen)"이란 돼지의 Fc 단편과 목적 항원이 융합된 재조합 항원을 의미하는 것으로, 바람직하게는 상기 Fc 단편과 융합됨으로써 용해성이 증가되며, 동시에 면역원성이 증가된 재조합 항원을 의미하나, 본 발명의 돼지의 Fc 단편과 결합된 재조합 항원이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "형질전환(transformation)"이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, "형질전환체(transgenic organism)"란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다. 상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.
본 명세서에 있어서, "용해성(solubility)"이란 목적 단백질 또는 펩타이드가 인체에 투여하기 적합한 용매에 용해될 수 있는 정도를 의미한다. 구체적으로는 특정 온도에서 주어진 용매에 대하여 용질이 포화된 정도를 나타내는 것일 수 있다. 용해성은 용질의 포화 농도를 결정함으로써 측정할 수 있으며, 예컨대 용매에 용질을 과량으로 첨가하고 이를 교반하고 여과한 다음, 농도를 UV 분광기 또는 HPLC 등을 사용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 높은 용해성은 재조합 단백질의 분리정제에 유리하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 장점을 가진다.
본 명세서에 있어서, "예방(prevention)"이란 본 발명에 따른 백신 조성물의 투여에 의해 돼지 열병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, "치료(treatment)"란 본 발명에 따른 돼지의 Fc 단편과 목적 항원이 융합된 재조합 단백질의 투여에 의하여 돼지 열병을 억제시키거나 그 질환의 정도를 완화시키거나, 치유 또는 치료하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, "개체(individual)"란 본 발명의 백신 조성물이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.
본 발명의 "백신 조성물"은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 또한, 추가로 기존에 알려져 있는 "면역항원보강제(adjuvant)"를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보강제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 각각의 용량은 본 발명의 재조합 단백질의 멸균용액 ㎖ 당 0.1 내지 1000 ㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100 ㎍을 함유한다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "면역항원보강제(adjuvant)"란 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 지칭하며, "자체 면역 증강 반응(self-adjuvanting)"이란, 기존 항원과 비교하여 재조합 항원 자체가 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 반응을 의미하며, 바람직하게는 항원에 돼지의 Fc 단편을 결합시킴으로써 항원의 면역원성이 증가된 것을 의미한다.
본 발명의 "사료 조성물"은 본 발명의 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질을 포함하는 사료로서, 상기 사료로는 돼지고기, 소고기, 닭고기 등의 부산물을 비롯하여, 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시 리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료라면 제한이 없다. 이러한 사료에 본 발명의 E2 단백질을 첨가하여 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: pFc 융합 VP1 재조합 단백질 발현 벡터 제조
목적 단백질의 발현량을 증가시키는 동시에 용해성을 개선하여 분리 정제 효율을 높인 재조합 단백질을 제조하기 위한 발현 벡터를 제조하기 위하여, 돼지의 면역글로불린 Fc 단편(porcine Fc fragment; pFc)의 pFc1(서열번호 1), pFc2(서열번호 3), 또는 pFc3(서열번호 5)을 이용하여 발현 벡터를 제작하였다. 보다 자세하게는, 도 1 및 2에 나타난 바와 같이, pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 M17의 5' UTR(untranslational region) 부위 유전자(서열번호 7), BiP(chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 8), 구제역 바이러스(Food-and-mouth disease virus; FMDV)의 VP1 유전자(서열번호 9); pFc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 순서대로 클로닝하여 발현 벡터를 제작하였다. pFc 단편은 각각 pFc1, pFc2, 또는 pFc3을 삽입하여 서로 다른 발현 벡터를 제조하였다.
실시예 2: pFc 융합 VP1 재조합 단백질 발현 실험
2.1. pFc 융합 VP1 재조합 단백질의 발현량 확인 실험
실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 pFc 융합 VP1 재조합 단백질 발현 벡터의 단백질 발현량을 확인하기 위하여, 상기 벡터를 애기장대 잎에서 분리한 원형질체(protoplast)에 PEG-매개 형질전환(PEG-mediated transformation) 방법으로 도입하여 형질전환체를 제조한 후에, 배양된 원형질체를 수집 및 용해하여 이로부터 발현되는 재조합 단백질인 BiP:FMDV-VP1:pFc 발현 양상을 pFc를 인식하는 anti-pig secondary antibody(1:5,000, Abcam)를 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 보다 자세하게는, 세포 용해액 30 μL를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다. 그리고 10 % SDS-PAGE 겔에 전기영동하여 크기별로 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5 % 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블록킹 단계를 거친 후에, 항체와 단백질을 결합시키고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 pFc 융합 재조합 단백질을 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 다양한 pFc 단편들 중 pFc2 단편을 결합시킨 재조합 단백질의 발현량이 가장 높은 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 동일한 면역글로불린 단편이라고 하여, 동일한 효과를 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.
2.2. pFc 융합 VP1 재조합 단백질의 안정성 확인 실험
실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 pFc 융합 재조합 단백질 발현 벡터의 단백질 안정성을 확인하기 위하여, 재조합 단백질을 추출한 당시 시료(0)와 4 ℃에서 한시간 동안 보관한 후의 시료(1)를 각각 실시예 2.1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시하여 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, pFc2 단편이 결합된 재조합 단백질의 발현량이 가장 높으며, 안정성 또한 높은 것을 확인하였다.
2.3. pFc2 융합 VP1 재조합 단백질의 용해성 확인 실험
실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 pFc2 융합 재조합 단백질 발현 벡터의 단백질 용해성(solubility)을 확인하기 위하여, 상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머패시언스( Agrobacterium tumefaciens)를 담배 식물( Nicotiana benthamiana)의 잎에 접종하는 일과성 발현(transient expression) 방식으로 pFc2 융합 재조합 단백질(BiP:FMDV-VP1:pFc2)을 발현시킨 후에 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 용액에 포함되어 있는 soluble 형태(S)의 단백질과 펠릿(pellet; P) 부분에 있는 단백질을 이용하여 실시예 2.1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 대조군으로는 기존에 알려져 있는 셀룰로오스 결합 모듈(cellulose binding module; CBM3)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 13)를 pFc 단편 대신 융합시킨 재조합 단백질을 이용하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, pFc2 융합 재조합 단백질은 펠릿 부분에서는 관찰되지 않는 반면, 용액 내에 포함되어 있는 것을 확인하였다. 그러나 셀룰로오스 결합 도메인을 융합시킨 재조합 단백질의 경우에는 펠릿 부분에서 재조합 단백질이 상당수 관찰되었다. 상기 결과를 통하여, pFc2 융합 재조합 단백질은 목적 단백질과 pFc2 단편의 결합으로 인한 구조적 변형을 통해 용해성이 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여, pFc2 융합 재조합 단백질은 분리정제에 유리하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: pFc2 융합 GP5 재조합 항원 용해성 확인 실험
pFc2 단편을 돼지 생식기호흡증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome; PRRS)의 GP5 항원 단백질과 융합시키기 위하여, 돼지 GP5 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 11)를 실시예 1의 재조합 벡터 내에 포함되어 있는 구제역 바이러스의 VP1 유전자 대신에 삽입하여 GP5:pFc2 재조합 항원을 발현하는 재조합 벡터를 제조하였다. 그리고 상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머패시언스( Agrobacterium tumefaciens)를 담배 식물( Nicotiana benthamiana)의 잎에 접종하는 일과성 발현(transient expression) 방식으로 pFc2 융합 GP5 재조합 항원(GP5:pFc2)을 발현시킨 후에 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 용액에 포함되어 있는 soluble 형태(S)의 단백질과 펠릿(pellet; P) 부분에 있는 단백질을 이용하여 실시예 2.1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 대조군으로는 pFc 단편 대신 CBM3(서열번호 14)가 융합된 GP5 재조합 항원을 이용하였고, CBM3 융합 GP5 재조합 항원의 경우에는 웨스턴 블롯팅을 위하여 HA antibody를 이용하여 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, pFc2 융합 GP5 재조합 항원은 펠릿 부분에서는 약간의 단백질이 관찰되는 반면, 대부분 용액 내에 포함되어 있는 것을 확인하였다. 그러나 CBM3를 융합시킨 GP5 재조합 항원의 경우에는 펠릿 부분에서 재조합 단백질이 상당수 관찰되었다. 상기 결과를 통하여, pFc2 융합 재조합 단백질은 단백질의 종류에 관계없이 용해성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 통하여, 돼지의 면역글로불린 Fc 단편, 특별히, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 pFc2 단편을 목적 단백질에 융합시킴으로써, 목적 단백질의 발현량을 증가시키는 동시에, 용해성을 증가시켜, 목적 단백질을 안정적으로 용이하게 분리 및 보관할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: pFc2 융합 PCV2 재조합 단백질의 생산성 및 용해성 확인 실험
pFc2 단편을 돼지 서코바이러스 2형(Porcine circovirus Type 2; PCV2) 단백질과 융합시키기 위하여, 돼지 서코바이러스 2형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 15)를 실시예 1의 재조합 벡터 내에 포함되어 있는 구제역 바이러스의 VP1 유전자 대신에 삽입하여 PCV2:pFc2 재조합 단백질을 발현하는 재조합 벡터를 제조하였다. 그리고 상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머패시언스( Agrobacterium tumefaciens)를 담배 식물( Nicotiana benthamiana)의 잎에 접종하는 일과성 발현(transient expression) 방식으로 pFc2 융합 PCV2 재조합 단백질을 발현시킨 후에 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 용액에 포함되어 있는 soluble 형태(S)의 단백질과 펠릿(pellet; P) 부분에 있는 단백질을 이용하여 실시예 2.1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 대조군으로는 pFc 단편 대신 His tag가 융합된 PCV2 재조합 단백질을 이용하였고, His-tag 융합 PCV2 재조합 단백질의 경우에는 웨스턴 블롯팅을 위하여 anti-His antibody를 이용하여 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, pFc2 융합 PCV2 재조합 단백질의 경우에는 대부분 용액 내에 포함되어 있을 뿐만 아니라, His-tag가 융합된 PCV2 재조합 단백질과 비교하여 생산량이 현저히 증가된 것을 확인하였다.
실시예 5: pFc2 융합 E2 재조합 단백질 발현 실험
5.1. pFc2 융합 항원 단백질의 분리
pFc2 단편을 항원 단백질에 융합하여 사용가능한지 확인하기 위하여, 돼지 열병 항원인 E2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 17)를 실시예 1의 재조합 벡터 내에 포함되어 있는 구제역 바이러스의 VP1 유전자 대신에 삽입하여, BiP:E2:pFc2 재조합 단백질을 발현하는 재조합 벡터를 제조하였다. 그리고 제조된 재조합 벡터를 아그로박테리움-매개 형질전환 방법(Agrobacterium-mediated transformation)으로 애기장대에 형질전환시키고, 카나마이신(Kanamycin)에 대한 내성을 가지는 애기장대를 선별하고, 세대진전을 통해 pFc2가 융합된 E2 재조합 단백질의 발현이 안정된 호모 종자를 최종 확보하여, 형질전환 식물체를 제조하였다. 그리고 단백질 추출에 보편적으로 사용되는 단백질 추출 버퍼를 이용하여 최종 확보된 형질전환 식물체 8 g으로부터 단백질을 분리하고, protein A-sepharose column을 장착한 AKTA prime(GE Healthcare)을 이용하여 pFc 융합 E2 재조합 단백질을 분리하였다. 그리고 대조군으로는 pFc 단편 대신 셀룰로오스 결합 도메인(서열번호 19)을 융합시킨 BiP:E2:CBD 재조합 단백질을 사용하였다. CBD가 융합된 E2 재조합 단백질은 비결정 셀룰로오스(amorphous cellulose; AMC)를 사용하여 형질전환 식물체 5 g으로부터 분리하였다. 그리고 분리된 재조합 단백질은 인산화완충용액(phosphate buffered saline; PBS)를 이용하여 투석 후에 원심 필터 튜브(Centrifugal filter tube)를 사용하여 농축하였다. 그리고 분리된 재조합 단백질의 양을 정량하기 위하여, SDS-PAGE를 실시한 후에 쿠마씨 블루(coomassie blue)로 염색하였다. 이때, BSA(bovine serum albumin)를 이용한 표준곡선(standard curve)을 이용하여 재조합 단백질을 정량하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 셀룰로오스 결합 도메인이 융합된 E2 재조합 항원의 경우에는 식물체 1 g 당 약 30 μg이 생산되는 반면, pFc2 단편이 융합된 E2 재조합 항원의 경우에는 식물체 1 g 당 302 μg이 생산되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, pFc2 단편을 이용하여 목적 항원의 발현량을 10 배 이상 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
5.2. pFc2 융합 E2 재조합 항원의 면역원성 및 바이러스 중화능 확인 실험
pFc2 융합 E2 재조합 항원이 생체 내에서 항체를 유도하여 면역원성 및 바이러스 중화능을 가지는지 확인하기 위하여, 6 주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다. 보다 자세하게는, 실험군 마우스에 pFc2 융합 E2 재조합 항원 1 μg을 1 회(6 주령), 또는 2 회(6 주령 및 8 주령) 투여하였고, 음성 대조군 마우스에는 인산염완충용액을 투여하였다. 그리고 양성 대조군으로는 셀룰로오스 결합 도메인이 융합된 E2 재조합 항원을 실험군과 동일한 양으로 동일한 시기에 투여하였다. 각각의 항원 투여 시에는 동량의 프로인트 면역항원보강제(Freund's adjuvant)를 혼합하여 투여하였고, 1 회 투여군에는 보조제(complete adjuvant)를 2 회 투여군에는 1 차에는 보조제를, 2 차에는 불완전 보조제(incomplete adjuvant)를 투여하였다. 그리고 실험을 시작하는 시점과 항원을 투여하고 일주일 이후부터 매주 채혈하여 돼지열병 바이러스에 대한 임상진단용 항체키트(CSFV-ab ELISA Kit, 메디안 디노스틱)를 이용하여 투여 항원에 대한 특이항체의 생성 여부 및 항체의 지속성을 확인하였다. 2 회 투여군은 2 차 투여를 모두 완료한 시점부터 일주일 이후에 채혈을 시작하였다. 각각의 군마다 5 마리의 마우스를 이용하여 실험을 진행하였으며, 그 결과는 표 1, 도 9 및 10에 나타내었다. 표 1의 S/P value는 0.14 이상의 값인 경우에는 양성으로, 0.14 미만의 값인 경우에는 음성으로 판정하였다.
S/P value
Ag 1w 2w 3w 4w 5w 6w 7w Fn.
E2:CBD Mouse 1 -0.10 0.33 0.69 1.04 1.58 1.42 1.62 1.26
Mouse 2 -0.01 0.32 0.82 0.87 0.84 0.89 0.63 0.72
Mouse 3 -0.07 0.90 0.89 0.80 0.85 1.21 1.41 1.47
Mouse 4 -0.04 0.21 0.31 0.25 0.30 0.35 0.43 1.15
Mouse 5 -0.07 0.14 0.31 0.46 0.74 0.96 1.08 0.96
E2:pFc2 Mouse 1 0.44 1.30 2.18 2.27 2.19 2.07 1.91 2.09
Mouse 2 1.15 1.75 2.65 3.14 3.23 2.82 2.87 2.80
Mouse 3 0.06 0.57 1.25 1.40 1.17 1.08 1.11 1.06
Mouse 4 0.40 1.72 2.66 2.59 2.58 2.55 2.49 3.10
Mouse 5 0.44 1.54 3.00 2.55 2.66 2.71 2.43 2.95
도 9에 나타난 바와 같이, 항원을 1 회 투여하였을 때 pFc2 융합 E2 재조합 항원의 경우에는 투여 후 1 주일이 지난 시점부터 높은 반응성을 나타내며, 반응성이 8 주 이상 유지되는 것을 확인하였다. 반면, 셀룰로오스 결합 도메인이 융합된 E2 재조합 항원의 경우에는 양성값을 나타내긴 하나, 그 반응성이 pFc2 융합 E2 재조합 항원과 비교해서 낮은 것을 확인하였다.
도 10 및 표 1에 나타난 바와 같이, 항원을 2 회 투여하였을 때는 셀룰로오스 결합 도메인이 융합된 E2 재조합 항원의 경우에도 반응성이 1 회 투여 시와 비교하여 증가되었으나, pFc2 융합 E2 재조합 항원과 비교하였을 때는 여전히 반응성이 낮은 것을 확인하였다.
또한, 동일한 마우스의 혈청 시료는 농림축산검역본부에 의뢰하여 바이러스 중화능을 확인하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.
실험차수 항원 개체번호 중화항체값
2-1차(2회 주사) E2:CBD 1 64
2 32
3 32
4 32
5 128
E2:pFc2 1 128
2 256
3 32
4 256
5 512
2-2차(1회 주사) E2:CBD 1 4
2 4
3 <4
4 <4
5 <4
E2:pFc2 1 256
2 256
3 64
4 128
5 64
음성 <4
양성 2048
표 2에 나타난 바와 같이, 셀룰로오스 결합 도메인이 융합된 E2 재조합 항원의 경우에는 항원의 1 회 투여 시, 일부 마우스에서는 음성값을 나타내나, pFc2 융합 E2 재조합 항원의 경우에는 1 회 투여 시나 2 회 투여 시나 모두 높은 역가의 바이러스 중화능을 나타내는 것을 확인하였다.
5.3. pFc2 융합 E2 재조합 항원의 바이러스 중화능 확인 실험
pFc2 융합 E2 재조합 항원이 자돈(piglet)에서도 동일하게 높은 역가의 바이러스 중화능을 나타내는지 확인하기 위하여, 돼지 열병 항체 음성돈 4 두를 선별하여 pFc2 융합 E2 재조합 항원을 2 회 투여하고, 2 주 간격으로 획득된 혈청을 농림축산검역본부에 의뢰하여 바이러스 중화능을 확인하였다. 그 결과는 표 3에 나타내었다.
일령 0주(1차접종) 2주(2차접종) 4주 6주 8주 10주 12주
개체별 중화항체 중화항체 중화항체 중화항체 중화항체 중화항체 중화항체
E2:pFc2 #7 1 <1 8 7 7 7 6
#8 <1 1 9 8 7 8 6
#9 <4 4 8 7 6 5 5
#10 2 4 10 9 7 7 6
평균 1.5 2.25 8.75 7.75 6.75 6.75 5.75
표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 3.2의 마우스를 이용하여 진행한 실험과 동일하게 모든 자돈에서 양성값을 나타내는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, pFc2 단편을 융합하여 제조한 재조합 항원의 경우에는 기존의 셀룰로오스 융합 E2 재조합 항원과 비교하여 항원의 생산성이 증가되고, 재조합 항원의 면역 반응이 빠를 뿐만 아니라, 반응성이 현저히 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, pFc2 단편이 자체 면역 증강 반응(self-adjuvanting) 효과를 나타내어, 기존의 항원에 pFc2 단편을 융합시킴으로써 자체-면역항원보강제(self-adjuvant) 효과를 나타내어, 목적 항원의 면역원성을 현저히 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 생산성 및 안정성을 증가시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 pFc2 융합 E2 재조합 항원을 신규한 돼지 열병 백신 조성물로 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
이하 본 발명의 약학적 조성물 및 사료 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 조성물의 제조
1.1. 산제의 제조
pFc2 융합 E2 재조합 항원 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1.2. 정제의 제조
pFc2 융합 E2 재조합 항원 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1.3. 캡슐제의 제조
pFc2 융합 E2 재조합 항원 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1.4. 주사제의 제조
pFc2 융합 E2 재조합 항원 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2,974 mg
Na 2HPO 42H 2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1.5. 액제의 제조
pFc2 융합 E2 재조합 항원 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적정량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음, 정제수를 가하여 전체를 100 mL로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 2. 사료 조성물의 제조
pFc2 융합 E2 재조합 항원 100 mg
비타민 E 0.7 mg
L-카르니틴 0.7 mg
통상의 사료 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하여 사료를 제조한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 돼지의 Fc 단편과 융합된 열병 항원 E2 단백질은 자체-면역 증강 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 항원의 용해성 및 안정성이 증가되어 백신의 안정성이 증가될 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 발현 벡터를 이용함으로써 열병 항원 E2 단백질의 생산량을 현저히 증가시킬 수 있기 때문에 돼지 열병 백신의 생산에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (16)

  1. 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 열병 예방용 백신 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 E2 단백질은 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 E2 단백질은 Fc 단편과 융합됨으로써 자체 면역 증강 반응(self-adjuvanting) 효과 및 증가된 용해성을 가지는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  4. 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 열병 예방용 사료 조성물.
  5. 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 돼지 열병 항원 E2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질 생산용 재조합 벡터.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 E2 단백질은 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 프로모터 유전자, 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 및 EF-1a(Elongation factor-1 alpha) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  9. 제 5 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 BiP(Chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  10. 제 5 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  11. 제 5 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 M17의 5' UTR(untranslational region) 부위 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  12. 제 5 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  13. 제 5 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체.
  14. (a) 제 13 항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 Fc 단편이 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 자체-면역 증강 효과를 가지는 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질의 생산 방법.
  15. 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 돼지 열병의 예방 또는 치료 방법.
  16. 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편과 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 돼지 열병의 예방 또는 치료 용도.
PCT/KR2019/011915 2018-09-19 2019-09-16 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조 방법 WO2020060117A1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980016219.1A CN112135630B (zh) 2018-09-19 2019-09-16 猪瘟疫苗组合物及其制备方法
US16/770,190 US11484589B2 (en) 2018-09-19 2019-09-16 Vaccine composition for classical swine fever and preparation method thereof
JP2020521575A JP6993650B2 (ja) 2018-09-19 2019-09-16 豚コレラワクチン用組成物およびその製造方法
BR112021005280-1A BR112021005280A2 (pt) 2018-09-19 2019-09-16 composição para vacina contra febre suína e método de preparação da mesma
EP19862863.8A EP3854417A4 (en) 2018-09-19 2019-09-16 COMPOSITION FOR VACCINE AGAINST SWINE FEVER AND METHOD FOR PREPARATION

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2018-0112445 2018-09-19
KR1020180112445A KR102053009B1 (ko) 2018-09-19 2018-09-19 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020060117A1 true WO2020060117A1 (ko) 2020-03-26

Family

ID=68837384

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/011915 WO2020060117A1 (ko) 2018-09-19 2019-09-16 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11484589B2 (ko)
EP (1) EP3854417A4 (ko)
JP (1) JP6993650B2 (ko)
KR (1) KR102053009B1 (ko)
CN (1) CN112135630B (ko)
BR (1) BR112021005280A2 (ko)
WO (1) WO2020060117A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102288367B1 (ko) * 2018-11-15 2021-08-11 주식회사 바이오앱 식물체에서 바이러스-유사 입자를 발현하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 써코바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법
KR102477054B1 (ko) * 2020-03-24 2022-12-14 주식회사 바이오앱 웅취 제거용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물
KR20210119231A (ko) 2020-03-24 2021-10-05 주식회사 바이오앱 동물의 중성화용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물
CN115073608B (zh) * 2022-03-22 2023-05-02 广东海大集团股份有限公司 一种猪瘟病毒e2的核酸-蛋白复合标记性疫苗
CN114908056B (zh) * 2022-05-18 2024-04-16 华中农业大学 一种表达猪PRV gDFc或gBFc融合蛋白的重组CHO细胞系及其构建方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150113934A (ko) * 2014-03-31 2015-10-08 한미약품 주식회사 면역글로불린 Fc 단편 결합을 이용한 단백질 및 펩타이드의 용해도를 개선시키는 방법
KR101642727B1 (ko) 2015-12-31 2016-07-27 대한민국 약독화된 돼지열병 바이러스 생마커백신주 및 이를 이용한 경구투여용 백신 조성물
CN106519041A (zh) * 2016-11-24 2017-03-22 唐山怡安生物工程有限公司 猪免疫球蛋白Fc片段和猪瘟E2融合蛋白在CHO细胞株的构建方法及其制备方法和应用
KR101732624B1 (ko) * 2014-12-22 2017-05-08 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) 식물 유래의 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039406B (zh) * 2015-07-10 2018-08-28 武汉中拓康明生物科技有限公司 一种猪IgG1 Fc重组杆状病毒作为猪用疫苗载体的制备方法
CN115073608B (zh) * 2022-03-22 2023-05-02 广东海大集团股份有限公司 一种猪瘟病毒e2的核酸-蛋白复合标记性疫苗

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150113934A (ko) * 2014-03-31 2015-10-08 한미약품 주식회사 면역글로불린 Fc 단편 결합을 이용한 단백질 및 펩타이드의 용해도를 개선시키는 방법
KR101732624B1 (ko) * 2014-12-22 2017-05-08 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) 식물 유래의 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조방법
KR101642727B1 (ko) 2015-12-31 2016-07-27 대한민국 약독화된 돼지열병 바이러스 생마커백신주 및 이를 이용한 경구투여용 백신 조성물
CN106519041A (zh) * 2016-11-24 2017-03-22 唐山怡安生物工程有限公司 猪免疫球蛋白Fc片段和猪瘟E2融合蛋白在CHO细胞株的构建方法及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE NCBI 12 January 2013 (2013-01-12), "IgG heavy chain precursor [Sus scrofa", XP055693893, Database accession no. BAM75542.1 *
DATABASE NCBI 9 November 2012 (2012-11-09), "IgG heavy chain constant region, partial [Sus scrofa", XP055694632, Database accession no. BAM66310.1 *
See also references of EP3854417A4

Also Published As

Publication number Publication date
US20200289641A1 (en) 2020-09-17
CN112135630A (zh) 2020-12-25
US11484589B2 (en) 2022-11-01
CN112135630B (zh) 2024-02-27
JP2021508315A (ja) 2021-03-04
KR102053009B1 (ko) 2019-12-09
JP6993650B2 (ja) 2022-01-13
EP3854417A4 (en) 2022-07-20
BR112021005280A2 (pt) 2021-06-29
EP3854417A1 (en) 2021-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020060117A1 (ko) 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조 방법
KR101732624B1 (ko) 식물 유래의 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조방법
WO2017195919A1 (ko) 식물 유래의 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조방법
KR20190110605A (ko) 돼지 코로나바이러스 백신
WO2020159169A2 (ko) 당화된 ag85a 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물 및 이의 제조방법
US10857217B2 (en) Antigen fused with porcine Fc fragment and vaccine composition comprising the same
WO2020213898A1 (ko) 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물 및 이의 제조 방법
WO2020059961A1 (ko) 돼지의 fc 단편과 융합된 항원 및 이를 포함하는 백신 조성물
WO2020256374A1 (ko) 아프리카 돼지열병의 예방을 위한 항원 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도
WO2020111814A1 (ko) 광견병 예방용 백신 조성물 및 이의 제조 방법
KR102444019B1 (ko) 아프리카 돼지열병의 예방을 위한 항원 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도
WO2020256419A1 (ko) 개 파보바이러스 감염증 치료를 위한 항체 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도
KR20200144506A (ko) 개 파보바이러스 감염증 치료를 위한 항체 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도
KR20180114684A (ko) 신규한 Stx2e 에피토프 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물
KR100812637B1 (ko) 항원 결정기를 포함하는 재조합 개 로타바이러스 ｖｐ４단백질 및 이에 대한 항체
KR20230034141A (ko) 아프리카 돼지열병 바이러스 유래 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방용 백신
CN117897171A (zh) 包含源自非洲猪瘟病毒的抗原蛋白的用于预防非洲猪瘟的疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020521575

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19862863

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112021005280

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019862863

Country of ref document: EP

Effective date: 20210419

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112021005280

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20210319