KR20200144506A

KR20200144506A - 개 파보바이러스 감염증 치료를 위한 항체 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200144506A
Application number: KR1020200073549A
Authority: KR
Inventors: 손은주; 이상민; 강향주; 박영민
Original assignee: 주식회사 바이오앱
Priority date: 2019-06-18
Filing date: 2020-06-17
Publication date: 2020-12-29
Also published as: KR102401075B1

Abstract

본 발명은 개 파보바이러스(Canine parvovirus, CPV)에 대한 중화능을 보이는 재조합 항체 scFv8(single-chain variable fragment 8)을 식물체에서 발현시키기 위한 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체에서 분리된 scFv8 항체 및 이를 유효성분으로 포함하는 개 파보바이러스 감염증에 대한 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

Description

개 파보바이러스 감염증 치료를 위한 항체 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도 {Recombinant vectors for the preparation of antibodies for the treatment of canine parvovirus infections and uses thereof}

본 발명은 개 파보바이러스(canine parvovirus, CPV) 감염증의 예방 또는 치료용 재조합 항체 scFv8(single-chain variable fragment 8)을 생산하기 위한 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체에서 분리된 scFv8 재조합 항체 및 이를 유효성분으로 포함하는 CPV 감염증에 대한 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

개 파보바이러스(Canine Parvovirus, CPV)는 개에서 발생하는 전염성 바이러스 질병이다. 고양이 범백혈구 감소증 바이러스가 개 파보바이러스로 변이된 것으로 여겨진다. 개 파보바이러스는 외막이 없는 ssDNA 바이러스이며 직경은 약 20~25 nm 정도의 크기를 가지며, 파보바이러스과(Parvoviridae)의 프로토파보바이러스(protoparvovirus)에 속한다. 파보바이러스는 분변이나 타액 등으로 개에서 개로 매우 높은 전염성을 보인다. 일반적으로 환절기에 많은 발병을 하며 주된 원인은 감염된 개와 같은 공간에서 생활하면서 분변이나 타액을 통한 직접적인 접촉에 의해 감염되며, 감염된 개의 분변과 타액이 묻어있는 애견용품이나 주인의 손을 통한 간접적인 접촉에 의해 감염된다. 예방접종을 진행한 개의 경우 파보바이러스에 대한 감염을 막을 수 있으나, 감염된 개는 치료가 없는 경우 높은 치사율을 보인다.

한편, 파보바이러스는 심근형과 장염형으로 나뉜다. 심근형은 주로 3~8주령까지의 강아지에서 나타난다고 보고되었으며, 감염 후 원기가 없어지고 급성심부전증을 나타내기도 하며, 높은 치사율을 나타낸다. 장염형 파보바이러스는 8주령 이후 개에서 나타나는데, 피가 섞여 있으며 심한 냄새를 나는 설사와 구토를 하며 원기와 식욕을 잃고 심한 탈수증세를 나타내다가 높은 확률로 사망하게 된다. 임신한 암컷이 파보바이러스에 감염된 경우 바이러스가 태반을 통과하여 태아에게 영향을 미치게 된다.

이러한 개 파보바이러스를 치료하기 위해서는 빠른 진단과 개의 나이가 중요하다. 초기치료를 통해서 생존률을 높일 수 있는데 치료는 광범위 항생제 투여, 항구토제 및 크리스탈로이드(Crystalloid) 수액 또는 콜로이드(Colloid) 수액을 정맥투여하는 것이다. 수액을 지속적으로 공급하면서 점차 상태가 좋아지면 소화가 잘되는 음식을 소량 급여한다. 2차 감염에 저항할 수 있는 생태와 백혈구 수치에 따라서 경구용 항생제를 투약한다. 빠른 확진을 통해서 2~3일 만에 회복하기도 하나, 2주까지 치료가 진행되기도 한다. 그러나, 치료가 잘되더라도 생존을 보장할 수 없다.

한편, 분자생물학과 유전공학 기술의 눈부신 발달은 식물 분야에도 적용되어 식물체로부터 유용 생리활성 물질을 생산하려는 노력들이 꾸준히 이어지고 있다. 식물에서 유용 물질을 생산하는 것은 생산 단가를 현저히 감소시킬 수 있으며, 종래 대중적 방법(동물세포 또는 미생물에서 단백질을 합성하여 분리 정제하는 방법)에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원(바이러스, 암유전자, 장독소 등)을 원천 배제할 수 있을 뿐만 아니라, 상품화 단계에서도 동물 세포나 미생물과는 달리 종자로 종묘(seed stock) 관리가 가능하다는 점에서 유리한 이점을 가지고 있다.

이에, 본 발명자는 종래 항생제, 항구토제 등의 투여로 한정된 개 파보바이러스 감염증 치료의 한계를 극복하고, 상기 감염증에 대하여 특이적인 치료제 개발 및 상기 치료제의 생산 및 적용에 있어 경제적인 효과를 달성할 수 있는 개 파보바이러스 치료용 항체를 개발하고자 노력한 결과, scFv8(single-chain variable fragment 8) 항체 단백질을 식물체에서 높은 효율로 발현시킬 수 있는 시스템을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.

KR

10-0563197

A

개 파보바이러스감염을 막기 위한 방법은 약독화된 개 파보바이러스 백신 접종을 통한 예방이 최선의 방법이며, 장염형의 경우 경증일때는 항구토제, 지사제를 사용하며, 중증일 때는 수분 및 전해질 보충을 위해 혈장 및 수액 요법을 병행하고 감염 후 4일 이내에 고도 면역 혈청을 접종하면 유효할 수 있으며, 부신피질 스테로이드제제나 2차 세균방지를 위한 항생제를 사용하는 것으로 알려져 있다. 감염시 염소제, 포르말린이나 그 일부 약품이 효과가 있는 것으로 알려져 있지만, 아직까지 특별한 치료제가 없는 실정이다. 개 파보바이러스 예방을 위한 조성물로서 한국등록특허 제10-0200324호(개 파보바이러스를 이용한 유전자 재조합 베큘로바이러스, 이를 이용한 VP2 재조합 단백질의 생산방법 및 이 재조합 단백질을 이용한 개 파보바이러스 감염증 백신)이 공지되어 있다, 또한, 개 파보바이러스 예방 및 치료를 위한 조성물로서 한국등록특허 제10-0563197호(개 파보바이러스 중화항원 결정기를 포함하는 VP2 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물), 한국특허공개 제10-2011-0137743호(개 파보바이러스 예방 및 치료를 위한 파보바이러스 고항원성 캡시드 단백질 및 이를 포함하는 사료용 조성물)가 공지되어 있으나, 이러한 성분은 제조공정이 까다로운 단점이 있다.

더욱이, 강아지는 통상 태어난 지 6~8주가 되어야 예방접종을 실시하는데, 예방접종을 실시하기 전에 파보바이러스에 감염되어 폐사하는 사례가 가장 많고, 파보바이러스 감염증에 대한 치료법 또한, 파보바이러스 자체를 치료하는 치료제는 현재 존재하지 않으며, 항생제, 항구토제 등을 이용한 대증치료가 일반적으로 행해지고 있는바, 개 파보바이러스 감염증에 대한 직접적인 치료제 개발이 시급한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 개 파보바이러스 치료제의 개발 필요성 및 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로, 개 파보바이러스에 대하여 우수한 중화능(neutralization ability)을 나타내는 항체 단백질인 scFv8(single-chain variable fragment 8)을 식물체를 이용하여 효율적인 생산이 가능하도록 한 재조합 벡터 및 이를 이용하여 생산된 재조합 항체를 유효성분으로 포함하는 개 파보바이러스 감염증에 대한 예방 또는 치료용 조성물 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 scFv8 항체 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체 및 상기 재조합 벡터를 이용하여 생산된 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 항체 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 재조합 항체의 제조 방법 및 상기 재조합 항체를 포함하는 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법 등을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 scFv8(single-chain variable fragment 8) 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 식물체에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스(Canine parvovirus) 감염증의 예방 또는 치료용 항체 생산을 위한 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서는 개 파보바이러스에 대하여 우수한 중화능을 보이는 항체 단백질 scFv8을 식물체에서 발현시킬 수 있도록 한 재조합 벡터를 제작하였고, 상기 벡터를 식물체에서 발현시킴으로써 재조합 항체를 경제적으로 대량 생산 할 수 있으며, 상기 재조합 항체를 이용하여 개 파보바이러스에 감염된 개체를 직접적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 서열번호 3의 BiP(chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 폴리히스티딘(polyhistidine)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6의 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 10의 염기서열 또는 서열번호 11의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환체는 식물체일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용하여 생산된, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 재조합 항체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 항체는 수용성일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 재조합 항체를 유효성분으로 포함하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 재조합 항체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 재조합 항체의, 개 파보바이러스 감염증에 대한 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 재조합 항체의, 개 파보바이러스 감염증에 대한 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 재조합 항체를 유효성분으로 포함하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및 (b) 상기 식물체로부터 재조합 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 재조합 항체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 동물에게 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 재조합 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

개 파보바이러스(canine parvovirus) 감염증을 포함한 바이러스성 질병을 예방하기 위한 백신들은 단백질의 접힘(folding), 당화과정(glycosylation) 등의 문제로 인하여 박테리아를 이용하지 못하고, 주로 동물 세포를 이용하여 생산되고 있다. 그러나 동물 세포를 이용한 단백질, 특히 항체 생산 방법은 대량 생산을 위한 설비 확충에 큰 비용이 소요되기 때문에 제조가 용이하지 않고, 항체의 가격이 고가인 경우가 대부분이다. 또한, 동물 세포를 이용하여 제조된 항체들은 저장이 용이하지 않을 뿐만 아니라, 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 높다는 단점을 가지고 있다. 그러나 본 발명은 식물을 이용하여 이러한 단점을 보완하였다. 즉 식물 세포는 동물 세포와 달리 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 매우 낮고, 경작 면적만 확보되면 언제든지 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라, 식물체를 통하여 장기 보관이 가능하기 때문에, 안정적으로 저렴한 항체 단백질의 생산이 가능하다.

또한, 본 발명에서 얻어진 재조합 scFv8(single-chain variable fragment 8) 항체 단백질을 이용하여 치료 효능이 우수한 신규 치료제의 개발이 가능하며, 개 파보바이러스 감염증으로 인해 폐사하는 사례가 증가하고 있는 상황에서 본 발명이 제공하는 재조합 scFv8 항체 단백질로 감염증의 근본적인 치료제 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.

나아가 본 발명의 재조합 scFv8 항체 단백질은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 수용해성(Water solubility)을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 또한, 체내에서 항체로 작용하여 높은 바이러스 중화능을 나타내므로 다양한 분야에 폭넓게 사용 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 재조합 scFv8(single-chain variable fragment 8) 항체 단백질의 발현을 위한 유전자의 배열을 나타낸 개열지도이다. 신호 펩타이드로서 발현된 scFv8을 식물의 소포체로 유도하기 위한 서열(BiP(NB), 상단) 또는 엽록체로 유도하기 위한 서열(RbcS, 하단)이 융합되어 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 재조합 scFv8 항체 단백질을 발현시키고, 식물의 소포체 또는 엽록체로의 표적화를 유도하여 분리·정제 한 다음, 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과(좌측, 소포체 표적화; 우측, 엽록체 표적화)를 나타낸 도면이다(T: Total, S: Supernatant, P: Pellet).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 재조합 scFv8 항체 단백질의 분리·정제 결과를 쿠마씨 블루(coomasie blue) 염색으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다(M: size ladder).
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 재조합 scFv8 항체 단백질의 혈구응집억제 분석(haemoglutintion inhibition assay)을 수행하여 항체의 유무 및 역가를 확인한 결과를 나타낸 도이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 재조합 scFv8(single-chain variable fragment 8) 항체 단백질 유전자를 이용하면, 식물체에서도 높은 바이러스 중화능을 가지는 재조합 항체 단백질인 scFv8을 효율적으로 생산 및 분리가 가능하다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 재조합 scFv8 항체 단백질은 안정적이고 효율적인 대량 생산이 가능하기 때문에, 저렴하며 안정적인 개 파보바이러스 감염증에 대한 치료제를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

이에, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 식물체에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스(Canine parvovirus) 감염증의 예방 또는 치료용 항체 생산을 위한 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

상기 재조합 scFv8 항체는 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되거나, 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산으로 이루어지나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “항체(antibody)”란, 천연의 것이거나 또는 부분적 또는 완전 합성에 의해 제조된 면역글로불린을 말한다. 항체는 그것이 천연으로 존재하는 혈장이나 혈청 등의 천연 자원이나 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 배양상청으로부터 단리될 수 있고, 또는 유전자 재조합 등의 방법을 사용함으로써 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 항체의 예로서는 면역글로불린의 아이소타입 및 그들 아이소타입의 서브클래스를 바람직하게 들 수 있다. 목적하는 결합 활성을 갖는 항체를 제작하는 방법은 당업자에 있어서 공지이다.

일반적으로 항체는 분자량이 큰 중쇄와 분자량이 작은 경쇄의 폴리펩티드가 이황화 결합(disulfide bond)으로 연결이 되어 이형 이중체(heterodimer)을 형성하며, 두 개의 이형 이중체가 다시 이황화 결합으로 연결이 되어 4중체(tetramer)를 형성한다. 중쇄를 만드는 폴리펩티드는 4개의 영역(domain)으로 되어 있는데 N-말단에서부터 가변영역, 불변영역 1, 불변영역 2 및 불변영역 3으로 구성되어 있으며, 경쇄를 만드는 폴리펩티드는 2개의 영역(domain)으로 되어 있는데 N-말단에서부터 가변영역, 불변영역으로 구성되어 있다. 이중에서 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역의 결합체가 1 개의 항원과 결합하게 된다.

세포를 표식해 주는 화학적 표식인자인 항원(antigen)과 이에 대한 항체(antibody)와의 반응은 고도의 특이성을 나타낸다. 항체와 상호작용하는 항원 부위를 항원 결정기 또는 에피토프(epitope)라 하고, 항원 결정기와 항체의 항원 결합부위인 가변영역이 특이적으로 결합하게 된다. 그러므로 항원 결합부위는 단 1개의 항원결정기와 결합할 수 있으므로 수 많은 항체들은 각자가 특정 결정기를 가진 항원에 대한 특유의 면역성을 제공할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “항원(antigen)”이란, 체내에서 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 총칭하며, 바람직하게는 바이러스, 화합물질, 세균, 꽃가루, 암세포 등 또는 이들의 일부 펩타이드 또는 단백질이나, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 “폴리뉴클레오티드”는 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한, 일반적으로 인산이에스테르 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들면 뉴클레오티드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 “골격” 결합, 예를 들면 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합(펩타이드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)뿐만 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 BiP(Chaperone binding protein, NB)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 6개의 연속된 히스티딘(폴리히스티딘, polyhistidine)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에 위치할 수 있고, 상기 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치할 수 있다.

본 명세서에 있어서, “재조합 벡터(recombinant vector)”란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 목적 단백질(본 발명에서는, 재조합 scFv8 항체 단백질)을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 “벡터”는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, “복제 단위”란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 BiP(NB) 유전자 또는 루비스코 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자, 히스-태그(His-tag, 최소 6개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노산 모티프), 소포체 신호 펩타이드(endoplasmic reticulum signal peptide, 소포체 표적화 서열과 같은 의미) 유전자, 클로닝 사이트(cloning site) 등을 추가로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 태그인 히스티딘 이외에 재조합 단백질을 용이하게 분리하기 위한 추가 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 태그용 유전자는 본 발명의 태그 단백질인 폴리히스티딘 태그 이외에 추가로 용이한 분리를 위해 포함되는 것으로서, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있다.

상기 “BiP(NB; chaperone binding protein) 유전자”는, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 유전자이고 가장 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 유전자이나, 서열번호 3의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 BiP(NB) 발현될 때 서열 일부가 잘려나가 일부 아미노산만이 남을 수도 있다.

상기 “클로닝 사이트”란 벡터 내에서 각 유전자를 연결/구분하는 것을 목적으로 삽입된 것을 총칭한다.

상기 “소포체 신호 펩타이드(ER 신호 서열)”는 당업자에게 알려진 식물 소포체 신호 펩타이드라면 그 종류 및 아미노산 서열이 제한되지 않으며, 예를 들어 US 20130295065, WO2009158716 등의 문헌을 참고로 할 수 있다. 본 발명에서 상기 “소포체 신호 펩타이드”는 바람직하게는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu, 서열번호 9로 표시되는 폴리펩타이드)일 수 있으며, 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 소포체 신호 펩타이드는 서열번호 8의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 8의 염기서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 소포체 신호 펩타이드의 결합 위치는 식물세포 내에서 발현 또는 합성을 목적으로 하는 단백질의 C-말단에 추가(또는 연결)되는 것을 특징으로 한다.

상기 선별용 마커 유전자에는 일례로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 일례로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 일례로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 포함될 수 있으나, 상기 열거한 것들은 예시일 뿐 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 프로모터 유전자; BiP(chaperone binding protein, NB) 또는 루비스코 신호 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 6개의 연속된 히스티딘(histidine)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 순서로 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 순서에 의해 연결된 경우, 즉 본 발명에 따른 재조합 벡터가 도 1에의 상단 또는 하단의 개열지도에 나타난 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 서열번호 10 또는 서열번호 11의 염기서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 서열번호 10 또는 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어지나, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 효모 등과 같은 미생물, 곤충 세포, 인간을 포함한 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소 등과 같은 동물, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 및 유채를 포함하는 특용작물류; 및 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 및 튤립을 포함 하는 화훼류 등일 수 있으나, 본 발명의 벡터로 형질전환될 수 있는 생명체라면 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “형질전환(transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체(transgenic organism)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아크로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “식물”은 본 발명의 항체를 포함하는 단백질을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 구체적으로는 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 Nicotiana benthamiana L. 또는 Nicotiana tabacum cv. xanthi 등의 품종을 이용할 수 있다.

상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기충격법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 재조합 항체를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 항체는 수용성일 수 있다. 보다 구체적으로, 식물체에서 발현된 scFv8 재조합 항체는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 수용성 분획에 용해되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 재조합 항체는 90% 이상의 순도로 분리·정제될 수 있다. 보다 구체적으로, 식물체에서 발현된 scFv8 재조합 항체는 통상의 분리·정제 방법을 이용하였을 때, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도의 scFv8 재조합 항체를 얻을 수 있다.

본 명세서에 있어서, “용해성(solubility)”이란 목적 단백질(항체) 또는 펩타이드가 체내에 투여하기 적합한 용매에 용해될 수 있는 정도를 의미한다. 구체적으로는 특정 온도에서 주어진 용매에 대하여 용질이 포화된 정도를 나타내는 것일 수 있다. 용해성은 용질의 포화 농도를 결정함으로써 측정할 수 있으며, 예컨대 용매에 용질을 과량으로 첨가하고 이를 교반하고 여과한 다음, 농도를 UV 분광기 또는 HPLC 등을 사용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 높은 용해성은 재조합 단백질의 분리·정제에 유리하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 장점을 가진다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 재조합 항체를 유효성분으로 포함하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 재조합 항체의, 개 파보바이러스 감염증에 대한 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 명세서에 있어서, “예방(prevention)”이란 본 발명에 따른 scFv8 재조합 항체 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여에 의해 개 파보바이러스에 의한 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, “치료(treatment)”란 본 발명에 따른 scFv8 재조합 항체 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여에 의해 개 파보바이러스 감염증의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, “개체(individual)”란 본 발명에 따른 scFv8 재조합 항체 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없으나, 바람직하게는 개를 의미한다.

한편, 본 발명에 따른 “예방 또는 치료용 조성물”은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 “예방 또는 치료용 조성물”은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 1928, 2208, 2906, 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 1828, 2906, 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₃), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16(Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈(Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입(AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈(N, Es), 웨코비(W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 수의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 개체 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 수의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 재조합 항체를 유효성분으로 포함하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환 시키는 단계; 및 (b) 상기 식물체로부터 재조합 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 재조합 항체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 인간을 제외한 동물에게 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 재조합 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 재조합 scFv8 항체 단백질을 발현하는 재조합 벡터의 제조

도 1에 나타낸 개열지도와 같이 식물체에서 재조합 scFv8 항체 단백질을 발현시킬 수 있도록 재조합한 식물 발현 벡터를 제작하였다. 보다 자세하게는, scFv8에 대한 유전자 서열을 식물체에서의 발현에 최적화되도록 하여 scFv8 항체 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1)를 합성하였다.

보다 구체적으로는, pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터(promoter) 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 BiP(chaperone binding protein, NB; 서열번호 3) 또는 루비스코 시그널 펩타이드(RuBisCO signal peptide; 서열번호 4)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 재조합 scFv8 항체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 1), 6 개의 연속된 히스티딘(histidine)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 6), 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 8)를 순서대로 연결하여 재조합 scFv8 항체 단백질의 식물 발현 벡터를 제작하였다.

실시예 2: 재조합 scFv8 항체 단백질의 발현 확인

2.1. 식물발현 벡터 일과성 발현(Transient expression)

상기 실시예 1에서 준비한 식물발현 벡터를 아그로박테리아 LBA4404 균주에 전기충격법(Electrophoration)을 이용하여 형질전환 시켰다. 형질전환된 아그로박테리아를 5 mL의 YEP 액체배지(효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 리팜피신 25 mg/L)에서 28℃의 조건으로 16시간 동안 진탕 배양한 후 1차 배양액 1 mL을 50 mL의 새 YEP 배지에 접종하여 28℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양 하였다. 이렇게 배양된 아그로박테리아는 원심분리(7,000 rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 600 nm의 파장에서 흡광도(O.D) 값이 1.0이 되도록 인필트레이션(Infiltration) 버퍼[10 mM MES (pH 5.7), 10 mM MgCl₂, 200 μM 아세토시링곤]에 현탁시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나(nicotiana benthamiana) 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 수행하였다.

2.2. 식물에서 재조합 scFv8 항체의 발현 확인

상기 실시예 2.1에서 준비한 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 수용성 분획(Supernatant; S)에 있는 단백질과 펠릿(Pellet; P) 분획에 있는 단백질, 수용성 분획과 펠릿을 모두 포함하는 분획(Total; T)을 각각 분리하여 웨스턴 블롯팅으로 재조합 scFv8 항체의 발현을 확인하였다. 보다 자세하게는, 실시예 1의 두 가지 재조합 벡터를 이용하여 생산된 scFv8 항체의 각 분획 30 μL를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다. 그리고 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동하여 크기별로 분리된 단백질 밴드를 확인하고, 이를 PVDF 막으로 이동시킨 후 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블로킹 단계를 거친 다음, 폴리히스티딘과 반응하는 항체를 결합하고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 재조합 scFv8 항체의 발현을 확인하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, BiP(NB)를 포함하는 재조합 벡터에 의해 생산된 scFv8 항체는 높은 효율로 발현되었음을 확인하였다. 발현된 재조합 scFv8 항체의 50%는 수용성 분획에서 확인되었고, 나머지 50%는 펠릿 분획에서 확인되었다.

루비스코 시그널 펩타이드(RbcS)를 포함하는 재조합 벡터에 의해 생산된 scFv8 항체의 경우, 상기 BiP(NB)를 포함하는 재조합 벡터에 의해 생산된 scFv8 과는 다르게, 발현된 총 단백질의 95% 이상이 펠릿 분획에서 확인되었다. 따라서 하기 실시예는 BiP(NB) 시그널 펩타이드를 융합한 재조합 scFv8 항체를 이용하여 실험을 진행하였다.

실시예 3: 재조합 scFv8 항체 단백질의 분리·정제 확인

상기 실시예 2.1에서 준비된 재조합 scFv8 항체가 발현되는 니코티아나 벤타미아 잎 10 g에 단백질 추출 용액[50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 0.5% Triton X-100] 100 mL을 첨가하고 블렌더로 조직을 파쇄한 후 13,000 rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 단백질 추출액을 회수하였다. 상기 단백질 추출액으로부터 재조합 scFv8 항체의 분리·정제를 위해 Ni-NTA 레진(Nikel charged Nitrilotriacetic acid resin)이 충진된 컬럼으로 친화성 크로마토그래피를 실시하였다. 상기 컬럼에 레진을 5 mL 충진한 후 50 mL의 세척용액[50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 M NaCl]으로 평형화시켰다. 회수한 단백질 추출액을 컬럼에 적용하고 평형화시킨 다음, 세척용액 100 mL을 흘려보내 레진을 세척하고, 용출용액[50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 M NaCl, 300 mM Imidazole]으로 재조합 scFv8 항체를 용출하였다. 재조합 scFv8 항체가 포함된 용출 용액은 10 kDa 크기의 필터를 사용하여 버퍼 교체 및 농축을 시행하였다. 분리 정제된 재조합 scFv8 항체는 전기영동(SDS-PAGE) 후 쿠마시 염색법(Coomassie staining)을 통해 확인하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 재조합 scFv8 항체는 90% 이상의 순도로 분리되었으며, 본래의 항체와 비교하여 큰 변이나 변형 없이 잘 정제되었다. 이러한 결과는 단백질을 식물에서 발현시키는 경우 당 구조가 변이되어 생산 효율이 떨어질 수 있는 문제점이 발견되지 않았음을 확인한 것으로, 본 발명에 따른 개 파보바이러스에 대한 재조합 scFv8 항체는 식물에서 잘 생산되는 것을 확인한 결과이다.

실시예 4: 재조합 scFv8 항체의 중화항체가 및 혈구응집억제 분석 (haemoglutintion inhibition assay)에 의한 면역원성 평가

상기 실시예 3에서 준비된 재조합 scFv8 항체를 마이크로 플레이트에 1열에는 α-MEM 배지를 75 μL씩 A~D줄까지 분주하고, PBS에 녹인 항체 25 μL를 A와 C줄의 각 1열에 분주한 후(4배 희석), 50 μL씩 12열까지 2배 계단 희석(serial two-fold dilution, 또는 2진 희석) 희석하여 이중(duplicate)으로 실험을 진행하였다. 개 파보바이러스(CPV)를 200 TCID₅₀/0.1mL 로 희석하여 준비하였다. 모든 well에 개 파보바이러스를 50 μL씩 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 중화하였다. 이후, A72 세포를 1.5-2.5 × 10⁵ cells/mL로 준비하고, 중화된 well에 세포를 50 μL씩 분주한 다음 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 6일간 배양하였다. 상층액 50 μL를 u-bottom 플레이트에 옮겨 1% 돼지 혈구와 반응시키고, 혈구응집이 억제된 well을 선도하였다.

그 결과 도 4a 및 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 식물에서 생산한 개 파보바이러스의 중화항체가는 1:16,384배로 높은 역가가 확인되었으며, Back titeration은 10^1.875 TCID₅₀/0.1mL로 시험의 유효성이 확인되었다.

샘플	시험값
CPV 항체	2^14 (16,384배)
Back titeration	10^1.875 TCID₅₀/mL

앞선 실험에서는 양성 혈청이 없어 직접적인 비교가 힘들기 때문에 반복 실험을 진행하면서 양성 대조군으로 개 파보바이러스에 대한 양성 혈청을 사용하였다. 희석 버퍼에 따른 차이점을 분석하기 위해, 개 파보바이러스 항체를 PBS와 TBS 버퍼로 2배 희석하여, 최대 24배까지 희석하고, 돼지 혈구와 반응시켜 응집이 억제되는 최대 희석배수를 결정하였다.

그 결과 도 4b에 나타난 바와 같이, 식물에서 생산한 개 파보바이러스 항원 단백질을 주입하여 얻은 혈청은 16,384배의 역가를 나타내었으며, 희석 버퍼의 종류에 의한 차이는 관찰되지 않았다. 이에 반해, 대조군인 양성 혈청은 4,096배로 나타나, 식물 유래 항원의 면역원성이 더 높은 것으로 나타났다.

샘플	Log₂ HI titer	비고
Anti-CPV 항체 (PBS)	14 (1 : 16,384)	-
Anti-CPV 항체 (TBS)	14 (1 : 16,384)	-
CPV 양성 혈청1	12 (1 : 4,096)	백신 다회 접종하여 고도면역화한 개 혈청
CPV 양성 혈청2	12 (1 : 4,096)	백신 다회 접종하여 고도면역화한 개 혈청

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> BioApplications Inc. <120> Recombinant vectors for the preparation of antibodies for the treatment of canine parvovirus infections and uses thereof <130> MP19-173P1 <150> KR 10-2019-0072518 <151> 2019-06-18 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of scFv8 antibody <400> 1 gatattgttc ttactcagtt tccaggttct ctagctgtat ctcttggtca aagggcaact 60 ataagctgca aggccagtca aagagttgat tacgatggtg tgtcttacat gaattggtat 120 caacaaaaac ctggtcagcc cccaaagtta ttgattaacg ctgcttcaga cctcgagtcc 180 ggtatacctg caagattctc tgggaccggc tcaggcactg attttacgtt gaatattcat 240 cctgtagaag aggaggacgc ggctacatat tattgtcagc aatctaatta tgatccttgg 300 acttttggtg gtggtactaa attggagatc aagggtgggg gaggcagtgg cggaggtgga 360 tcaggtggag gtgggtccga aatccagctt cagcagacag gtccagaact tgtgcaacca 420 ggagcttcgg ttaagatcag ttgtaaagca agcggataca gttttacaga ttatattatg 480 gtgtgggtta agcagtctca cggtaaggga ttggagtgga ttggtaatat taatccgtac 540 catggtagaa cagcttataa cctgaagttc aaaggaaaag caaccctgac agttgataag 600 tcttcatcca ccgcttttat gcaattgaac tctcttattt ctgaagactc tgccgttttc 660 tattgcgtca gaaaaggcta tgttgaaggt ggaggattag attactgggg tcaaggaact 720 tcagttatag ttagtagc 738 <210> 2 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of scFv8 antibody <400> 2 Asp Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Arg Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Asn Ala Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Tyr Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile 115 120 125 Gln Leu Gln Gln Thr Gly Pro Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala Ser Val 130 135 140 Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Ile Met 145 150 155 160 Val Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn 165 170 175 Ile Asn Pro Tyr His Gly Arg Thr Ala Tyr Asn Leu Lys Phe Lys Gly 180 185 190 Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met Gln 195 200 205 Leu Asn Ser Leu Ile Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys Val Arg 210 215 220 Lys Gly Tyr Val Glu Gly Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Ser Val Ile Val Ser Ser 245 <210> 3 <211> 273 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of BiP(NB) <400> 3 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt taa 273 <210> 4 <211> 237 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of RuBisCO 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<400> 9 His Asp Glu Leu 1 <210> 10 <211> 1045 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of full BiP-scFv8-6xHis-HDEL construct <400> 10 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt taaggatccg atattgttct tactcagttt 300 ccaggttctc tagctgtatc tcttggtcaa agggcaacta taagctgcaa ggccagtcaa 360 agagttgatt acgatggtgt gtcttacatg aattggtatc aacaaaaacc tggtcagccc 420 ccaaagttat tgattaacgc tgcttcagac ctcgagtccg gtatacctgc aagattctct 480 gggaccggct caggcactga ttttacgttg aatattcatc ctgtagaaga ggaggacgcg 540 gctacatatt attgtcagca atctaattat gatccttgga cttttggtgg tggtactaaa 600 ttggagatca agggtggggg aggcagtggc ggaggtggat caggtggagg tgggtccgaa 660 atccagcttc agcagacagg tccagaactt gtgcaaccag gagcttcggt taagatcagt 720 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Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 scFv8(single-chain variable fragment 8) 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
식물체에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스(Canine parvovirus) 감염증의 예방 또는 치료용 항체 생산을 위한 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 BiP(chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 항체 생산을 위한 재조합 벡터.
제2항에 있어서,
상기 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 항체 생산을 위한 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 폴리히스티딘(polyhistidine)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 항체 생산을 위한 재조합 벡터.
제4항에 있어서,
상기 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 항체 생산을 위한 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 항체 생산을 위한 재조합 벡터.
제6항에 있어서,
상기 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 항체 생산을 위한 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 6의 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 8의 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 항체 생산을 위한 재조합 벡터.
제8항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; scFv8 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 항체 생산을 위한 재조합 벡터.
제8항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 10의 염기서열 또는 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 항체 생산을 위한 재조합 벡터.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체.
제11항에 있어서,
상기 형질전환체는 식물체인 것을 특징으로 하는, 형질전환체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 생산된, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 재조합 항체.
제13항에 있어서,
상기 재조합 항체는 수용성인 것을 특징으로 하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 재조합 항체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 생산된 재조합 항체를 유효성분으로 포함하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 생산된 재조합 항체를 유효성분으로 포함하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 키트.
하기의 단계를 포함하는 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 재조합 항체의 제조 방법:
(a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
(b) 상기 식물체로부터 재조합 항체를 분리 및 정제하는 단계.
인간을 제외한 동물에게 제15항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개 파보바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법.