KR20230034141A - 아프리카 돼지열병 바이러스 유래 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방용 백신 - Google Patents

아프리카 돼지열병 바이러스 유래 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방용 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질 Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15, p35, E199L, 및/또는 F317L의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 및 상기 형질전환체에서 분리된 아프리카 돼지열병 바이러스의 Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15, p35, E199L, 및/또는 F317L항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 아프리카 돼지열병 예방용 백신 조성물 등에 관한 것이다.

Description

아프리카 돼지열병 바이러스 유래 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방용 백신 {Vaccines for prevention of African swine fever comprising antigen proteins derived from African swine fever virus}
본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스 (African swine fever virus) 유래 항원 단백질을 유효 성분으로 포함하는 아프리카 돼지열병 예방용 백신 등에 관한 것이다.
아프리카 돼지열병 (African swine fever, ASF)은, 아스파바이러스과 (Asfarviridae)에 속하는 아프리카 돼지열병 바이러스 (African swine fever virus, ASFV) 감염에 의한 돼지 전염병으로, 1921년 케냐에서 최초 보고가 있은 후, 주로 사하라 이남지역에서 발생보고가 있었고, 2007년 이후로 흑해연안인 죠지아, 아르메니아, 아제르바이잔 등 아프리카 이외 지역에서 그 발생 범위가 늘어나기 시작하였다. 특히 중국은 전세계 돼지 사육량의 절반 가량을 차지하는데, 2018년에서 처음으로 발병한 ASF에 의해 공식적으로는 약 700만 마리, 실제 추정으로는 약 2억마리를 살처분하면서 막대한 재산 피해를 입었다. 이후 ASF 발병을 통제하여왔으나, 올해 초 중국 북부지역에서 또 다시 ASF 발병 사례가 보고되었다. 베트남 역시 올해 ASF가 재발하여 올해 5월까지 2021년에만 약 36000마리, 2019년부터는 600만 마리 이상의 돼지를 도살하였으나, 계속해서 새로운 발병 사례가 전국에서 보고되고 있다. 또한, 발병 사례 없었던 말레이시아도 올해 2월 말 처음으로 ASF 바이러스가 검출됐다.
한국은 2019년 파주의 돼지 사육농가에서 ASF 발병이 최초로 보고되었으며, 이후 계속해서 경기도 및 강원도 일대에서 감염 사례가 보고되었다. 2020년 9월 경을 기준으로 야생멧돼지에서 아프리카 돼지열병을 확인한 시·군은 경기도에선 파주시, 연천군, 포천시이며, 강원도에선 철원군, 화천군, 춘천시, 양구군, 인제군, 고성군 등 9곳에 이른다. 이중 강원도 화천시가 285건으로 가장 많았으며, 경기도 연천군이 282건, 경기도 파주시가 98건으로 뒤를 이었다. 이에 ASF 확산을 막기 위해 광역 울타리를 설치하고 적극적인 멧돼지 포획 및 방역을 시행하였으며 그 결과 2020년 10월 강원도 화천 양돈농장에서의 감염 사례 이후 한동안 ASFV 감염이 보고되지 않았으나 최근 (2021년 8월) 강원도 돼지농장에서 ASF 발병 사례가 또 다시 보고되었다.
아프리카 돼지열병은 돼지에 감염시 폐사율이 100%에 이르고, 이 질병에 대한 백신이 개발되어 있지 않아 발생 즉시 처분해야 하는 위험도가 높은 전염병으로서 이를 예방하는 것은 매우 중요한 과제로 남아있다.
한편, 분자생물학과 유전공학 기술의 눈부신 발달은 식물 분야에도 적용되어 식물체로부터 유용 생리활성 물질을 생산하려는 노력들이 꾸준히 이어지고 있다. 식물에서 유용 물질을 생산하는 것은 생산 단가를 현저히 감소시킬 수 있으며, 종래 대중적 방법 (동물세포 또는 미생물에서 단백질을 합성하여 분리 정제하는 방법)에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원 (바이러스, 암유전자, 장독소 등)을 원천 배제할 수 있을 뿐만 아니라, 상품화 단계에서도 동물세포나 미생물과는 달리 종자로 종묘 (seed stock) 관리가 가능하다는 점에서 유리한 이점을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 아프리카 돼지열병 예방용 항원을 개발하고자 예의 노력한 결과, 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질들을 식물체에서 높은 효율로 발현시킬 수 있는 시스템을 개발하였으며, 상기 항원 단백질들 중 특정 단백질의 조합이 기타 ASFV 항원 단백질 조합에 비해 아프리카 돼지열병을 더욱 효과적으로 예방할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
KR 10-1663963 B1
아프리카 돼지열병 바이러스는 감염 세포의 세포질에서 복제되는 거대 이중 나선 DNA 바이러스이다. 이 바이러스는 돼지에게 폐사율이 높은 출혈열을 야기하면서도 질병의 징후 없이 매개체 구실을 할 법한 자연적 숙주 돼지, 혹멧돼지, 강멧돼지, 연진드기과에 속하는 물렁진드기 (Ornithodoros) 속을 지속적으로 감염시킨다. 이 바이러스는 돼지에게 치명적인 출혈열을 발생시키기 때문에 감염 전 미리 예방하는 것이 매우 중요한 전염병이다.
본 발명은 상기와 같은 아프리카 돼지열병의 예방 필요성 및 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로, 식물체를 이용하여 효율적인 생산이 가능할 뿐만 아니라, 높은 면역원성 (immunogenicity)을 나타내는 재조합 아프리카 돼지열병 바이러스 유래 재조합 항원 단백질, 이를 포함하는 백신 조성물 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스 (African swine fever virus, ASFV) 항원 단백질의 조합을 유효 성분으로 포함하는, 아프리카 돼지열병 예방용 백신 조성물로서, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 Lectin, CD2v, p72, p54, 및 p30 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조합이고,
단, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합이 Lectin 단백질 및 CD2v 단백질을 포함하는 경우, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 셋 이상의 항원 단백질로 이루어진 것을 특징으로 하는, 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 백신 조성물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(a) 상기 Lecin 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함함;
(b) 상기 CD2v 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함함;
(c) 상기 p72 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함함;
(d) 상기 p54 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함함; 및
(e) 상기 p30 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함함.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 ASFV 항원 단백질은 재조합 벡터를 이용하여 생산된 것이고, 상기 재조합 벡터는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 ASFV 단백질-코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(a) 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는, Lectin-코딩 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는, CD2v-코딩 폴리뉴클레오티드;
(c) 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는, p72-코딩 폴리뉴클레오티드;
(d) 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는, p54-코딩 폴리뉴클레오티드; 및
(e) 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는, p30-코딩 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(a) 서열번호 19의 NB 또는 서열번호 21의 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열번호 27의 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 서열번호 29의 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
(d) 서열번호 23의 M 도메인 또는 서열번호 25의 폴리히스티딘 태그 (polyhistidine tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 ASFV 항원 단백질은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체에서 생산된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 백신 조성물은 애쥬번트 (adjuvant)를 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 애쥬번트는 미네랄 오일 (mineral oil) 또는 에멀시겐 (Emulsigen)-계일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 백신 조성물을 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방용 백신 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간을 제외한 동물에게 본 발명에 따른 조성물 (혹은, Lectin, CD2v, p72, p54, 및 p30 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 조합)을 투여하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방, 개선, 및/또는 치료방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 조성물의 아프리카 돼지열병의 예방, 개선, 및/또는 치료 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 조성물의 아프리카 돼지열병의 예방용 백신의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 ASFV (African swine fever virus, ASFV) 항원 단백질의 조합을 유효 성분으로 포함하는 아프리카 돼지열병 예방용 사료 조성물로서, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 Lectin, CD2v, p72, p54, 및 p30 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조합이고,
단, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합이 Lectin 단백질 및 CD2v 단백질을 포함하는 경우, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 셋 이상의 항원 단백질로 이루어진 것을 특징으로 하는, 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 p72 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 p54 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 p15 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 p35 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 15의 아미노산서열을 포함하는 E199L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
식물체에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스의 항원 단백질 발현용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(a) 상기 p72 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함함;
(b) 상기 p54 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함함;
(c) 상기 p15 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 포함함;
(d) 상기 p35 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 포함함;
(e) 상기 E199L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16로 표시되는 염기서열을 포함함; 및
(f) 상기 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18로 표시되는 염기서열을 포함함.
본 발명의 다른 구현예에서, 서열번호 19의 NB (new chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 21의 BiP (chaperone binding protein)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 p72 단백질, p54 단백질, p15 단백질, p35 단백질, E199L 단백질, 또는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 27의 pFc2 (porcine Fc) 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 p72 단백질, p54 단백질, p15 단백질, p35 단백질, E199L 단백질, 또는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 29의 HDEL (His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 p72 단백질, p54 단백질, p15 단백질, p35 단백질, E199L 단백질, 또는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 19의 NB 또는 서열번호 21의 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 27의 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 29의 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; p72 단백질, p54 단백질, p15 단백질, p35 단백질, E199L 단백질, 또는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 형질전환체는 식물체일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 재조합 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질의 제조방법을 제공한다:
(S1) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
(S2) 상기 식물체 또는 배양액으로부터 재조합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 NB-코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고; 상기 BiP-코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고; 상기 pFc2-코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 28로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고; HDEL-코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
아프리카 돼지열병을 포함한 바이러스성 질병의 예방에 이용하기 위한 단백질, 특히 항원은 단백질의 접힘 (folding), 당화과정 (glycosylation) 등의 문제로 인하여 박테리아를 이용하지 못하고, 주로 동물세포를 이용하여 생산되고 있다. 그러나 동물세포를 이용한 백신 생산 방법은 대량 생산을 위한 설비 확충에 큰 비용이 소요되기 때문에 제조가 용이하지 않고, 항원의 가격이 고가인 경우가 대부분이다. 또한, 동물세포를 이용하여 제조된 항원들은 저장이 용이하지 않을 뿐만 아니라, 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 높다는 단점을 가지고 있다. 그러나 본 발명은 식물을 이용하여 이러한 단점을 보완하였다. 즉 식물세포는 동물세포와 달리 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 매우 낮고, 경작 면적만 확보되면 언제든지 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라, 식물체를 통하여 장기 보관이 가능하기 때문에, 안정적으로 저렴한 항원의 생산이 가능하다.
본 발명의 재조합 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 수용해성 (Water solubility)을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 또한, 체내에서 항원으로 작용하여 높은 면역원성을 나타내므로 신규한 아프리카 돼지열병 바이러스 백신 조성물로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명자들은 본 발명의 항원 단백질 5종 (Lectin, CD2v, p54, p72, 및 p30)을 포함하는 백신 조성물이 기타 항원 단백질 (p15, p35, E199L, F317L 등)을 추가로 포함하는 백신 조성물에 비해 아프리카 돼지열병 예방 효과가 더욱 뛰어난 것을 공격접종 실험을 통해 확인한 바, 본 발명에 따른 재조합 벡터 및 백신 조성물은 축산 업계 등에서 널리 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 식물체에서의 ASFV의 Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L 항원 단백질의 발현을 위한 유전자의 배열을 나타낸 개열지도이다.
도 2는 ASFV의 Lecin 항원 단백질을 분리 및 정제하여 전기영동 후 쿠마시 블루 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 ASFV의 CD2v 항원 단백질을 분리 및 정제하여 전기영동 후 쿠마시 블루 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 ASFV의 p72 항원 단백질의 발현을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하여 얻은 밴드 사진이다 (DT, Debris Total (데브리스 제거 전 총 샘플); T, Total extract (데브리스 제거 후 총 샘플); P, Pellet 분획; FT, Flow through 분획, 이하 동일).
도 4b는 ASFV의 p72 항원 단백질을 분리 및 정제한 뒤 농축 전후의 단백질 용액을 전기영동 후 쿠마시 블루 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다 (좌측, 농축 전의 p72 단백질 검출 결과; 우측, 농축 후의 p72 단백질 검출 결과).
도 5a는 ASFV의 p54 항원 단백질의 발현을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하여 얻은 밴드 사진이다.
도 5b는 ASFV의 p54 항원 단백질을 분리 및 정제한 뒤 농축 전후의 단백질 용액을 전기영동 후 쿠마시 블루 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다 (좌측, 농축 전의 p54 단백질 검출 결과; 우측, 농축 후의 p54 단백질 검출 결과).
도 6은 ASFV의 p30 항원 단백질을 분리 및 정제하여 전기영동 후 쿠마시 블루 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 ASFV의 p15 항원 단백질의 발현을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하여 얻은 밴드 사진이다.
도 7b는 ASFV의 p15 항원 단백질을 분리 및 정제하여 전기영동 후 쿠마시 블루 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 ASFV의 p35 항원 단백질을 분리 및 정제하여 전기영동 후 쿠마시 블루 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 ASFV의 E199L 항원 단백질의 발현을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하여 얻은 밴드 사진이다.
도 9b는 ASFV의 E199L 항원 단백질을 분리 및 정제한 뒤 농축 전후의 단백질 용액을 전기영동 후 쿠마시 블루 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다 (좌측, 농축 전의 E199L 단백질 검출 결과; 우측, 농축 후의 E199L 단백질 검출 결과).
도 10a는 100 g 또는 1 kg의 니코티아나 벤타미아 잎에서 추출한 ASFV의 F317L 항원 단백질의 발현을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하여 얻은 밴드 사진이다 (상단, 100 g의 잎으로부터 추출한 F317L 단백질 검출 결과; 하단, 1 kg의 잎으로부터 추출한 F317L 단백질 검출 결과).
도 10b는 100 g 또는 1 kg의 니코티아나 벤타미아 잎에서 추출한 ASFV의 F317L 단백질을 분리 및 정제하여 전기영동 후 쿠마시 블루 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다 (좌측, 100 g의 잎으로부터 추출한 F317L 단백질 검출 결과; 우측, 1 kg의 잎으로부터 추출한 F317L 단백질 검출 결과).
도 11은 돼지에 본 발명에 따른 5종 항원 백신 (Lectin, CD2v, p54, p72, 및 p30 조합), 9종 항원 백신 (Lectin, CD2v, p54, p72, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L 조합), 또는 PBS를 처리한 후 공격접종 실험을 진행하여 시간에 따른 돼지의 체온 및 생존율을 확인한 결과이다.
도 12는 돼지에 본 발명에 따른 5종 항원 백신, 9종 항원 백신, 또는 PBS를 처리한 후 공격접종 실험을 진행하여 시간에 따른 돼지의 혈중 바이러스 (Viremia) 수준을 측정한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 Lectin 재조합 단백질 발현을 위한 유전자 서열 (상단) 및 아미노산 서열 (하단)을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 구현예에 따른 CD2v 재조합 단백질 발현을 위한 유전자 서열 (상단) 및 아미노산 서열 (하단)을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 구현예에 따른 p72 재조합 단백질 발현을 위한 유전자 서열 (상단) 및 아미노산 서열 (하단)을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 구현예에 따른 p54 재조합 단백질 발현을 위한 유전자 서열 (상단) 및 아미노산 서열 (하단)을 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 구현예에 따른 p30 재조합 단백질 발현을 위한 유전자 서열 (상단) 및 아미노산 서열 (하단)을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 구현예에 따른 p15 재조합 단백질 발현을 위한 유전자 서열 (상단) 및 아미노산 서열 (하단)을 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 구현예에 따른 p35 재조합 단백질 발현을 위한 유전자 서열 (상단) 및 아미노산 서열 (하단)을 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 구현예에 따른 E199L 재조합 단백질 발현을 위한 유전자 서열 (상단) 및 아미노산 서열 (하단)을 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 구현예에 따른 F317L 재조합 단백질 발현을 위한 유전자 서열 (상단) 및 아미노산 서열 (하단)을 나타낸 것이다.
도 22는 돼지에 본 발명에 따른 5종 항원 백신 (Lectin, CD2v, p54, p72, 및 p30 조합; “Vax grp1”), 9종 항원 백신 (Lectin, CD2v, p54, p72, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L 조합; “Vax grp2”),또는 PBS를 투여한 후 (“PBS”), 0, 7, 14, 21, 28, 및 35일차에 항-p30 항체의 수준을 측정한 결과를 나타낸다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명자들은 아프리카 돼지열병 바이러스 (African swine fever virus, ASFV)의 다섯 가지 항원 단백질 Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L의 유전자를 이용하면, 식물체에서 높은 면역원성을 가지는 상기 각 ASFV 항원 단백질들을 효율적으로 생산하고 분리할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질은 안정적이고 효율적인 대량 생산이 가능하기 때문에, 저렴하며 안정적인 아프리카 돼지열병 바이러스 백신을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 Lectin, CD2v, p72, p54, 및 p30를 포함하는 다섯 가지 항원 단백질을 포함한 백신 조성물은 돼지에 투여했을 때 우수한 아프리카 돼지열병 예방 효과를 발휘하며, p15, p35, E199L, 및 F317L 등 기타 ASFV 항원 단백질을 추가로 포함하는 백신 조성물과 비교했을 때 효과가 더욱 현저한 것을 확인하였다. 즉, 본 발명은 종래 기술에 비해 더욱 현저한 아프리카 돼지열병 예방 효과를 달성할 수 있는 최적의 항원 단백질 조합 (Lectin, CD2v, p72, p54, 및 p30)을 발굴한 것에 의의가 있다.
이에, 본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스 (African swine fever virus, ASFV) 단백질-코딩 폴리뉴클레오티드의 조합을 포함하는 ASFV 항원 단백질 발현용 재조합 벡터를 제공하는 것을 목적으로 하며, 상기 ASFV 단백질-코딩 폴리뉴클레오티드의 조합은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조합인 것을 특징으로 한다:
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 Lectin 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CD2v 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 p72 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 p54 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 p30 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 p15 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 p35 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 15의 아미노산서열을 포함하는 E199L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
더욱 바람직하게는, 본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스 (African swine fever virus, ASFV) 단백질-코딩 폴리뉴클레오티드의 조합을 포함하는 ASFV 항원 단백질 발현용 재조합 벡터를 제공하는 것을 목적으로 하며, 상기 ASFV 단백질-코딩 폴리뉴클레오티드의 조합은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조합인 것을 특징으로 한다:
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 Lectin 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CD2v 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 p72 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 p54 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 p30 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
상기 재조합 벡터 내에서 상기 각 폴리뉴클레오티드가 배열된 순서에는 제한이 없다.
본 발명에 있어서, “아프리카 돼지열병 바이러스 (African swine fever virus)”는 아스파바이러스과 (Asfarviridae), 아스피바이러스속 (Asfivirus)에 속하는 약 200nm 정도의 DNA 바이러스로, 아프리카 돼지열병 (African swine fever, ASF)의 원인 인자이다. ASFV는 자연적 숙주 돼지, 혹멧돼지, 강멧돼지, 연진드기과에 속하는 Ornithodoros 속을 지속적으로 감염시키는데, 감염시 치명적인 출혈열을 발생시킨다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 상기 5가지 ASFV 단백질 (Lectin, CD2v, p72, p54, 및 p30) 코딩-폴리뉴클레오티드를 포함하며, 그 외의 ASFV 단백질-코딩 폴리뉴클레오티드는 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는, 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터는 ASFV의 항원 단백질인 p15, p35, E199L, 또는 F317L를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
상기 Lectin 항원 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지거나, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 lectin 단백질은 막횡단영역을 포함하는 것이거나, 또는 막횡단영역이 제거된 lectin 단백질일 수 있다.
구체적으로, 상기 Lectin 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 Lectin 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 CD2v 항원 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지거나, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 CD2v 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 CD2v는 CD2v 단백질의 막횡단영역 (transmembrane domain, TMD)을 포함하거나, 또는 막횡단영역이 제거된 CD2v 단백질일 수 있고, 바람직하게는 CD2v 단백질의 막횡단 영역으로부터의 N-말단 부위일 수 있다.
또한, 상기 p72 항원 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지거나, 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 p72 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 p54 항원 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지거나, 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 p54 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 p54 단백질은 막횡단영역이 제거된 p54 단백질 (p54dTM)일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 p54 단백질은 막횡단영역을 포함하는 것일 수 있다. 또는, 상기 p54 단백질은 막횡단영역이 제거되고, 이를 대신하여 링커 서열이 삽입된 것일 수 있다. 상기 링커 서열은 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 일 수 있다.
또한, 상기 p30 항원 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지거나, 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 p30 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 p15, p35, E199L, 및 F317L 항원 단백질은, 순서대로, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 각각 포함하거나, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 또는 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 각각 코딩되고, 가장 바람직하게는, 순서대로, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 또는 서열번호 17의 아미노산 서열로 각각 이루어지거나, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 또는 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 각각 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 p15, p35, E199L, 또는 F317L 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 순서대로, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 또는 서열번호 18로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 각각 포함할 수 있다.
또한, 상기 E199L은 막횡단영역을 포함하는 것이거나, 또는 막횡단영역이 제외된 것일 수 있다.
본 명세서에서, 특정 서열번호로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (혹은 펩타이드)란 이를 구성하는 폴리펩타이드 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 폴리펩타이드 분자의 일부 아미노산 서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 폴리펩타이드 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 특정 서열번호로 표시되는 폴리펩타이드는 해당 서열번호로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 아미노산 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 Lectin, CD2v, p54, p72, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L 항원 단백질은 아프리카 돼지열병 바이러스의 항원 단백질로서, 숙주의 면역 반응 매커니즘을 조절할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “폴리뉴클레오티드”는 디옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 포함한, 일반적으로 인산이에스테르 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들면 뉴클레오티드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 “골격” 결합, 예를 들면 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합 (펩타이드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)뿐만 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “항원 (antigen)”이란, 체내에서 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 총칭하며, 바람직하게는 바이러스, 화합물질, 세균, 꽃가루, 암세포 등 또는 이들의 일부 펩타이드 또는 단백질일 수 있으나, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 NB (new chaperone binding protein) 또는 BiP (chaperone binding protein) 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 돼지의 pFc2 단편 (porcine Fc fragments)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, HDEL (His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, M 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 폴리히스티딘 태그 (polyhistidine tag)를 코딩하는 폴리뉴클래오티드 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 하기 특징 중 하나 이상을 만족할 수 있다:
(a) 상기 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 ASFV 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에 위치함;
(b) 상기 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 ASFV 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치함;
(c) 상기 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 ASFV 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치함; 또는
(d) 상기 M 도메인 또는 폴리히스티딘 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 ASFV 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 방향에 위치함.
바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 상기 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함할 수 있으며, 이 때 각 유전자의 연결 순서에는 제한이 없으나, 바람직하게는 상기 재조합 벡터는 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15, p35, E199L, 및/또는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결될 수 있다.
혹은, 상기 재조합 벡터는 상기 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함할 수 있으며, 이 때 각 유전자의 연결 순서에는 제한이 없으나, 바람직하게는 상기 재조합 벡터는 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15, p35, E199L, 및/또는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결될 수 있다.
가장 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 상기 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 M 도메인 또는 폴리히스티딘 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함할 수 있으며, 이 때 각 유전자의 연결 순서에는 제한이 없으나, 바람직하게는 상기 재조합 벡터는 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; M 도메인 또는 폴리히스티딘 태그; Lectin, CD2v, p72, p54, 및/또는 p30 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결되거나, 또는 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; Lectin, CD2v, p72, p54, 및/또는 p30 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; M 도메인 또는 폴리히스티딘 태그; pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결될 수 있다.
혹은, 상기 재조합 벡터는 상기 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 M 도메인 또는 폴리히스티딘 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함할 수 있으며, 이 때 각 유전자의 연결 순서에는 제한이 없으나, 바람직하게는 상기 재조합 벡터는 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; M 도메인 또는 폴리히스티딘 태그; Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15, p35, E199L, 및/또는 F317L 단백질을 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결되거나, 또는 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15 단백질, p35 단백질, E199L 단백질, 및/또는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; M 도메인 또는 폴리히스티딘 태그; pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 폴리히스티딘 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ASFV 항원 단백질 유전자 중 Lectin을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향 및/또는 p30을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에만 위치한 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 M 도메인은 ASFV 항원 단백질 유전자 중 CD2v을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에만 위치한 것을 특징으로 할 수 있다. 또 다른 구체예에서는, 상기 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 p30을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에는 위치하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기와 같은 순서에 의해 연결된 경우, 즉 재조합 벡터가 도 1의 개열지도에 나타난 발현 카세트 (expression cassette)를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 또는 서열번호 50으로 표시되는 염기서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 또는 서열번호 50으로 표시되는 염기서열로 이루어지나, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 또는 서열번호 50으로 표시되는 염기서열과 각각 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 및 서열번호 50으로 표시되는 염기서열은 각각 서로 독립적인 플라스미드 벡터에 포함될 수 있으며, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 및 서열번호 50으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 조합이 단일 플라스미드 벡터 내에 포함될 수 있다.
본 명세서에 있어서, “재조합 벡터 (recombinant vector)”란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 목적 항원 (본 발명에서는, ASFV 항원인 Lectin, CD2v, p54, p72, p30, p15, p35, E199L, 및/또는 F317L)을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 “벡터”는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있으며, “복제 단위”란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 식물체에서 발현되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터 (promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리히스티딘 태그 (최소 5개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노산 모티프), 소포체 신호 펩타이드 (endoplasmic reticulum signal peptide, 소포체 표적화 서열과 같은 의미) 유전자, 소포체 잔류 신호 펩타이드 (endoplasmic reticulum retention signal peptide), 클로닝 사이트 (cloning site) 등을 추가로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 태그인 Fc 단편 이외에 추가 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 태그용 유전자로는, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그 (폴리히스티딘 태그), Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있다.
본 명세서에 있어서, “Fc 단편 (Fc fragment)”이란 면역글로불린이 파파인 (papain)에 의해 소화되었을 때, 중쇄 (heavy chain; H chain) 부분만이 S-S 결합으로 연결되고, 항원 결합부위를 가지지 않는 부분을 Fc 단편이라고 하며, 본 발명의 Fc 단편은 바람직하게는 돼지의 Fc 단편이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 28로 표시되는 돼지의 Fc 단편 (pFc2)이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 Fc 단편은 서열번호 28으로 표시되는 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 28의 염기서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 “클로닝 사이트”란 벡터 내에서 각 유전자를 연결/구분하는 것을 목적으로 삽입된 것을 총칭한다. 바람직하게는, 상기 클로닝 사이트는 서열번호 2, 4, 6, 8, 및 10 내에서 “tctaga”로 표시되는 서열, “ggatcc”로 표시되는 서열, “cccggg”로 표시되는 서열, 또는 “gagctc”로 표시되는 서열일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 “소포체 신호 펩타이드 (ER signal peptide)”는 단백질의 N-말단에 위치하는 신호 펩타이드로서, 새롭게 합성된 단백질이 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 내부로 들어가도록 유도하는 역할을 한다. 본 발명에 따른 소포체 신호 펩타이드는 당업자에게 알려진 식물 소포체 신호 펩타이드라면 그 종류 및 아미노산 서열이 제한되지 않으나, 바람직하게는 NB (New chaperone binding protein) 및 BiP (chaperone binding protein)에서 선택될 수 있다.
상기 “NB (New chaperone binding protein) 유전자”는, 바람직하게는 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 유전자이고 가장 바람직하게는 서열번호 20로 표시되는 유전자이나, 서열번호 20의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 “Bip (chaperone binding protein) 유전자”는, 바람직하게는 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 유전자이고 가장 바람직하게는 서열번호 22로 표시되는 유전자이나, 서열번호 22의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 NB 또는 BiP 유전자는 상술한 바와 같이 발현 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용되는 것으로서, 재조합 단백질이 발현될 때 서열 일부가 잘려나가 일부 아미노산만이 남을 수도 있고, 또는 서열 전부가 잘려나가 신호 펩타이드 서열 부위가 존재하지 않게 될 수 있다.
상기 “소포체 잔류 신호 펩타이드 (ER retention signal peptide)”는 단백질의 C-말단에 위치하는 신호 펩타이드로서, 소포체 내부에 존재하던 단백질이 분비 경로를 통해 골지체 (Golgi apparatus)로 빠져나갔을 때 상기 단백질이 다시 소포체로 되돌아오도록 (retention) 하는 역할을 한다. 본 발명에 따른 소포체 잔류 신호 펩타이드는 당업자에게 알려진 식물 잔류 소포체 신호 펩타이드라면 그 종류 및 아미노산 서열이 제한되지 않으나, 바람직하게는 KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) 서열 및 HDEL 서열에서 선택될 수 있다.
가장 바람직하게는 상기 ER 잔류 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 HDEL (His-Asp-Glu-Leu, 서열번호 29로 표시되는 아미노산)일 수 있으며, 서열번호 30으로 표시되는 염기서열로 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 소포체 신호 펩타이드는 서열번호 30의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 30의 염기서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 소포체 신호 펩타이드의 결합 위치는 식물세포 내에서 발현 또는 합성을 목적으로 하는 단백질의 C-말단에 추가 (또는 연결)되는 것을 특징으로 한다.
상기 소포체 신호 펩타이드 및 소포체 잔류 신호 펩타이드에 관한 정보는 US 20130295065, WO2009158716 등의 문헌을 참고로 할 수 있다.
상기 선별용 마커 유전자에는 일례로 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신 (kanamycin), G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페닐콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 일례로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, SV40 (Simian virus 40) 프로모터, RSV (Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α (Elongation factor-1 alpha) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, MacT (CaMV 35S+MAS; Mac 프로모터의 3' 말단 뉴클레오티드가 T로 치환됨) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 일례로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터, 애기장대의 HSP18.2 터미네이터, 애기장대의 RD29B 터미네이터 등이 포함될 수 있으나, 상기 열거한 것들은 예시일 뿐 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 효모 등과 같은 미생물, 곤충 세포, 인간을 포함한 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소 등과 같은 동물, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 및 유채를 포함하는 특용작물류; 및 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 및 튤립을 포함 하는 화훼류 등일 수 있으나, 본 발명의 벡터로 형질전환될 수 있는 생명체라면 이에 제한되지 않는다. 가장 바람직하게는, 상기 형질전환체는 니코티아나 (Nicotiana) 속 식물일 수 있다.
본 명세서에 있어서, “형질전환 (transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체 (transgenic organism)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아크로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “식물”은 본 발명의 항원을 포함하는 단백질을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 구체적으로는 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속 (Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 Nicotiana benthamiana L. 또는 Nicotiana tabacum cv. xanthi 등의 품종을 이용할 수 있다.
상기 형질전환체는 형질전환 (transformation), 형질감염 (transfection), 아그로박테리움 (Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 초음파 처리법 (sonication), 전기충격법 (electroporation) 및 PEG (Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된, 아프리카 돼지열병 바이러스에 대한 항체 유도용 재조합 단백질을 제공한다. 즉, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된, Lectin, CD2v, p54, p72, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L 재조합 항원 단백질을 제공한다. 상기 항원 단백질들은 각각 별개의 재조합 벡터 (즉, 각각 별개의 핵산 분자)로부터 생산된 것일 수 있고, 2 이상의 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 (즉, 단일 핵산 분자)로부터 생산된 것일 수 있다. 특히, 즉, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된, Lectin, CD2v, p54, p72, 및 p30 재조합 항원 단백질을 제공하는 것을 주요 목적으로 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 Lectin, CD2v, p54, p72, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L 재조합 항원 단백질은 수용성일 수 있다. 보다 구체적으로, 식물체에서 발현된 Lectin, CD2v, p54, p72, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L 재조합 항원 단백질은 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 수용성 분획에 용해되어 있는 것일 수 있다.
또한 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 Lectin, CD2v, p54, p72, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L 재조합 항원 단백질은 85% 이상의 순도로 분리, 정제될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 식물체에서 발현된 Lectin, CD2v, p54, p72, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L 재조합 항원 단백질은 통상의 분리, 정제 방법을 이용하였을 때, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도의 Lectin, CD2v, p54, p72, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L 재조합 항원 단백질을 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질의 조합을 유효 성분으로 포함하는 아프리카 돼지열병 예방용 백신 조성물로서, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15, p35, E199L, 및/또는 F317L 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조합인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 Lectin, CD2v, p72, p54, 및 p30로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조합일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 Lectin, CD2v, p72, p54, 및 p30로 이루어진 것이다. 또한, 본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질의 조합을 유효 성분으로 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15, p35, E199L, 및/또는 F317L 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조합인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 아프리카돼지열병의 예방용 약학적 조성물이다.
이하, 본 발명의 백신 조성물에 대한 설명은 본 발명의 약학적 조성물에 대해서도 동일하게 적용되며, 반대로 본 발명의 약학적 조성물에 대한 설명은 본 발명의 백신 조성물에 대해서도 동일하게 적용된다.
바람직하게는, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합이 Lectin 단백질 및 CD2v 단백질을 포함하는 경우, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 셋 이상의 항원 단백질로 이루어질 수 있다. 즉, Lectin 단백질 및 CD2v 단백질을 포함하는 조성물은, 상기 Lectin 단백질 및 상기 CD2v 단백질 외에 기타 ASFV 항원 단백질 (예컨대, p72, P54, 및/또는 p30)을 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 백신 조성물에 포함된 상기 ASFV 항원 단백질은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 ASFV 항원 단백질은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 식물체에서 생산된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 백신 조성물은 Lectin, CD2v, p72, p54, 또는 p30 재조합 단백질 이외의 ASFV 항원 단백질은 더 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 상기 Lectin, CD2v, p72, p54, 또는 p30 재조합 단백질 이외의 ASFV 항원 단백질은 p15, p35, E199L, 및 F317L로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 즉, 가장 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 백신 조성물은 Lectin, CD2v, p54, p72, 및 p30 재조합 항원 단백질 5종을 포함하는 백신 조성물이며, 추가적인 항원 (p15, p35, E199L, F317L 등)을 더 포함하는 백신에 비해 ASFV 항원에 대한 항체 생성 유도 효과, ASFV 감염 억제 효과, 및 아프리카 돼지열병 예방 효과 등이 더욱 높은 것을 특징으로 한다. 예컨대, 상기 백신 조성물은 p15, p35, E199L, F317L 등을 더 포함하는 백신에 비해 더욱 신속하게 ASFV 항원에 대한 항체 생성을 유도할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료 방법은 Lectin, CD2v, p72, p54, 또는 p30 재조합 단백질 이외의 ASFV 항원 단백질 (예를 들어, p15, p35, E199L, 및/또는 F317L)은 상기 개체에 투여하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 백신 조성물은 애쥬번트 (adjuvant)를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 애쥬번트는 미네랄 오일 (mineral oil) 또는 에멀시겐 (Emulsigen)-계일 수 있고, 더욱 바람직하게는, Drakeol 5 오일계 애쥬번트일 수 있으며, 가장 바람직하게는 SEA1일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 “애쥬번트 (Adjuvant)”란, 백신 또는 약학적으로 활성 있는 성분들에 첨가되어 면역 반응을 증가시키거나 영향을 주는 물질 또는 조성물을 말한다. 대표적으로 면역원 (immunogen)용 캐리어 또는 보조 물질 및/또는 다른 약학적으로 활성이 있는 물질 또는 조성물을 통상적으로 의미한다. 전형적으로, 용어 “애쥬번트”는 넓은 개념에서 해석되어야 하며, 상기 애주번트에 통합되거나 상기 애주번트와 함께 투여된 항원의 면역원성 (immunogenicity)을 증진시킬 수 있는 넓은 범위의 물질 또는 책략 (stratagerm)을 의미한다. 또한, 애주번트는, 이에 제한되지 않고, 면역 강화제 (immune potentiator), 항원 전달계 또는 이들의 조합으로 나뉘어질 수 있다. 적절한 애쥬번트의 예로, 알루미늄 하이드록사이드, 프로이드 완전 또는 불완전 애쥬번트, DEAE 덱스트란, 레바미솔, PCG 및 poly I:C 또는 poly A:U를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 Drakeol 5 오일 기반의 SEA1 애쥬번트를 사용하였다.
본 명세서에 있어서, “백신 (vaccine)”이란 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “용해성 (solubility)”이란 목적 단백질 또는 펩타이드가 인체에 투여하기 적합한 용매에 용해될 수 있는 정도를 의미한다. 구체적으로는 특정 온도에서 주어진 용매에 대하여 용질이 포화된 정도를 나타내는 것일 수 있다. 용해성은 용질의 포화 농도를 결정함으로써 측정할 수 있으며, 예컨대 용매에 용질을 과량으로 첨가하고 이를 교반하고 여과한 다음, 농도를 UV 분광기 또는 HPLC 등을 사용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 높은 용해성은 재조합 단백질의 분리정제에 유리하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 장점을 가진다.
본 발명의 백신 조성물 또는 약학적 조성물 내의 상기 항원 단백질의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 근육내 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다. 예컨대, 본 명세서에 있어서, “개체 (individual)”란 본 발명의 재조합 아프리카 돼지열병 항원 단백질이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 예컨대, 본 명세서에 있어서, “예방 (prevention)”이란 본 발명에 따른 재조합 아프리카 돼지열병 항원 단백질의 투여에 의해 아프리카 돼지열병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 명세서에 있어서, “치료 (treatment)”란 본 발명에 따른 재조합 아프리카 돼지열병 항원 단백질의 투여에 의해 아프리카 돼지열병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
추가로 서술하면, 본 발명의 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 슈크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 백신 조성물 2 ml당 Lectin, CD2v, p54, p72, p15, p35, E199L, 및/또는 F317L은 각각 10 μg 내지 1 mg, 10 내지 900 μg, 10 μg 내지 800 μg, 10 μg 내지 700 μg, 10 μg 내지 600 μg, 10 μg 내지 500 μg, 10 μg 내지 400 μg, 10 μg 내지 300 μg, 10 μg 내지 200 μg, 50 μg 내지 150 μg, 70 μg 내지 130 μg, 80 μg 내지 120 μg, 또는 90 μg 내지 110 μg이 포함되어 있을 수 있고, p30는 1 μg 내지 100 μg, 1 μg 내지 90 μg, 1 μg 내지 80 μg, 1 μg 내지 70 μg, 1 μg 내지 60 μg, 1 μg 내지 50 μg, 10 μg 내지 50 μg, 15 μg 내지 45 μg, 20 μg 내지 40 μg, 또는 25 μg 내지 35 μg이 포함되어 있을 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 백신 조성물을 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방용 백신 키트를 제공한다. 상기 키트에는 본 발명의 백신 조성물 외에도 백신 투여 등을 위해 당업계에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 상기 키트에는 본 발명에 따른 백신 조성물, 재조합 벡터 등에 대한 특징이나 정보가 기재된 설명서가 포함되어 있을 수 있으며, 본 발명에 따른 백신 조성물의 제조방법이 기재된 지시서가 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 재조합 ASFV 항원 단백질의 제조방법을 제공한다:
(S1) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
(S2) 상기 식물체 또는 배양액으로부터 재조합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 아프리카 돼지열병 예방용 백신 조성물 또는 백신 키트의 제조방법을 제공한다:
(S1) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계;
(S2) 상기 식물체 또는 배양액으로부터 재조합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계; 및
(S3) 상기 분리 및 정제된 재조합 항원 단백질을 이용하여 백신 조성물 또는 백신 키트를 제조하는 단계.
상기 (S1) 단계의 '형질전환'에 대한 구체적인 설명은 상술한 바와 같다. 상기 (S1) 단계의 형질전환 방법은 구체적인 종류에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 아그로박테리움 (Agrobacterium)-매개 형질전환 방법을 통해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 (S1) 단계는 본 발명에 따른 재조합 벡터를 아그로박테리아 균주에 형질전환 시키는 단계, 상기 형질전환된 아그로박테리아 균주를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 균주를 식물체에 투여 (주입 혹은 접종)하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물체는 담배일 수 있다.
상기 (S2) 단계의 재조합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계는 당업계에 공지된 단백질 분리 및 정제 방법을 제한 없이 적용하여 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 단백질의 분리는 형질전환된 식물체에 단백질 추출 용액을 첨가하여 수행될 수 있다. 또한, 상기 단백질의 정제는 크로마토그래피를 수행하여 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피일 수 있으며, 이 때 사용되는 리간드는 단백질 A, Ni-IDA 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질의 조합을 유효 성분으로 포함하는 아프리카 돼지열병 예방용 사료 조성물을 제공하며, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 Lectin, CD2v, p72, p54, 및 p30 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조합을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합이 Lectin 단백질 및 CD2v 단백질을 포함하는 경우, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 셋 이상의 항원 단백질로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 사료 조성물에 포함된 상기 ASFV 항원 단백질은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 ASFV 항원 단백질은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 식물체에서 생산된 것을 특징으로 한다.
또한, 바람직하게는, 본 발명에 따른 사료 조성물은 Lectin, CD2v, p54, p72, 및 p30 재조합 항원 단백질을 모두 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하며, 가장 바람직하게는, 상기 사료 조성물은 Lectin, CD2v, p72, p54, 또는 p30 재조합 단백질 이외의 ASFV 항원 단백질 (p15, p35, E199L, 및 F317L)은 더 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
상기 사료 조성물에 있어서 “사료”의 구체적인 예로는 돼지고기, 소고기, 닭고기 등의 부산물을 비롯하여, 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시 리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료라면 제한이 없다. 이러한 사료에 본 발명에 따른 Lectin, CD2v, p54, p72, 및 p30 재조합 항원 단백질을 첨가하여 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 아프리카 돼지열병 바이러스의 항원을 발현하는 재조합 벡터의 제조
도 1의 개열지도에 나타난 바와 같이, 식물체에서 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질 Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15, p35, E199L, 또는 F317L을 발현시킬 수 있도록 재조합한 식물 발현 벡터를 제작하였다. 보다 자세하게는, 아프리카 돼지열병 바이러스의 Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L 단백질에 대한 유전자 정보를 확보하고, 식물체에서의 발현에 최적화된 서열로 각각 Lectin 단백질 코딩 유전자 (서열번호 2), CD2v 단백질 코딩 유전자 (서열번호 4), p72 단백질 코딩 유전자 (서열번호 6), p54 단백질 코딩 유전자 (서열번호 8), p30 단백질 코딩 유전자 (서열번호 10), p15 단백질 코딩 유전자 (서열번호 12), p35 단백질 코딩 유전자 (서열번호 14), E199L 단백질 코딩 유전자 (서열번호 16), 및 F317L 단백질 코딩 유전자 (서열번호 18)를 합성하였다.
각 재조합 벡터의 구체적인 구성은 다음과 같다:
Lectin 항원 단백질 발현을 위한 재조합 벡터
pCAMBIA1300 벡터에 CaMV 35S 프로모터 (promoter) 유전자와 HSP 종결자 (terminator)를 삽입하고 그 사이에 NB (new chaperone binding protein) 신호 펩타이드 (signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 20), 폴리히스티딘-태그 (polyhistidine tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 26), 아프리카 돼지열병 바이러스의 Lectin 항원 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 2), pFc2 (porcine Fc) 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 28), 및 HDEL (His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 30)를 순서대로 연결하여 아프리카 돼지열병 바이러스의 Lectin 항원 단백질의 식물 발현 벡터를 제작하였다.
CD2v 항원 단백질 발현을 위한 재조합 벡터
pCAMBIA1300 벡터에 CaMV 35S 프로모터 유전자와 HSP 종결자를 삽입하고 그 사이에 NB 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 20), M 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 24), 아프리카 돼지열병 바이러스의 CD2v 항원 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 4), pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 28), 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 30)를 순서대로 연결하여 아프리카 돼지열병 바이러스의 CD2v 항원 단백질의 식물 발현 벡터를 제작하였다.
p72 항원 단백질 발현을 위한 재조합 벡터
pCAMBIA1300 벡터의 선별마커인 하이그로마이신 저항성 유전자를 human calreticulin 1 유전자로 치환하고, Mac 프로모터의 3' 말단 뉴클레오타이드가 T로 치환된 MacT 프로모터 유전자 및 애기장대 RD29B 종결자를 삽입하였으며, 그 사이에 BiP (chaperone binding protein) 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 22), 아프리카 돼지열병 바이러스의 p72 항원 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 6), pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 28), 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 30)를 순서대로 연결하여 아프리카 돼지열병 바이러스의 p72 항원 단백질의 식물 발현 벡터를 제작하였다.
p54 항원 단백질 발현을 위한 재조합 벡터
pCAMBIA1300 벡터에 CaMV 35S 프로모터 유전자와 HSP 종결자를 삽입하고 그 사이에 NB 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 20), 아프리카 돼지열병 바이러스의 p54 항원 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 8), pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 28), 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 30)를 순서대로 연결하여 아프리카 돼지열병 바이러스의 p54 항원 단백질의 식물 발현 벡터를 제작하였다.
p30 항원 단백질 발현을 위한 재조합 벡터
pCAMBIA1300 벡터에 CaMV 35S 프로모터 유전자와 HSP 종결자를 삽입하고 그 사이에 NB 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 20), 아프리카 돼지열병 바이러스의 p30 항원 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 10), 폴리히스티딘-태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 26), 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 30)를 순서대로 연결하여 아프리카 돼지열병 바이러스의 p30 항원 단백질의 식물 발현 벡터를 제작하였다.
p15 항원 단백질 발현을 위한 재조합 벡터
pCAMBIA1300 벡터에 CaMV 35S 프로모터 유전자와 HSP 종결자를 삽입하고 그 사이에 NB 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 20), 아프리카 돼지열병 바이러스의 p15 항원 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 12), pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 28), 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 30)를 순서대로 연결하여 아프리카 돼지열병 바이러스의 p15 항원 단백질의 식물 발현 벡터를 제작하였다.
P35 항원 단백질 발현을 위한 재조합 벡터
pCAMBIA1300 벡터에 CaMV 35S 프로모터 유전자와 HSP 종결자를 삽입하고 그 사이에 NB 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 20), 아프리카 돼지열병 바이러스의 p35 항원 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 14), pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 28), 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 30)를 순서대로 연결하여 아프리카 돼지열병 바이러스의 p35 항원 단백질의 식물 발현 벡터를 제작하였다.
E199L 항원 단백질 발현을 위한 재조합 벡터
pCAMBIA1300 벡터의 선별마커인 하이그로마이신 저항성 유전자를 turnip crinkle virus-coat protein(TCV-CP) 유전자로 치환하고, Mac 프로모터의 3' 말단 뉴클레오타이드가 T로 치환된 MacT 프로모터 유전자 및 애기장대 RD29B 종결자를 삽입하였으며, 그 사이에 NB 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 20), 아프리카 돼지열병 바이러스의 E199L 항원 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 16), pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 28), 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 30)를 순서대로 연결하여 아프리카 돼지열병 바이러스의 E199L 항원 단백질의 식물 발현 벡터를 제작하였다.
F317L 항원 단백질 발현을 위한 재조합 벡터
pCAMBIA1300 벡터의 선별마커인 하이그로마이신 저항성 유전자를 turnip crinkle virus-coat protein(TCV-CP) 유전자로 치환하고, Mac 프로모터의 3' 말단 뉴클레오타이드가 T로 치환된 MacT 프로모터 유전자 및 애기장대 RD29B 종결자를 삽입하였으며, 그 사이에 NB 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 20), 아프리카 돼지열병 바이러스의 F317L 항원 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 18), pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 28), 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 30)를 순서대로 연결하여 아프리카 돼지열병 바이러스의 F317L 항원 단백질의 식물 발현 벡터를 제작하였다.
실시예 2. 재조합 ASF 바이러스 항원 단백질의 발현 확인
2-1. 식물발현 벡터의 일과성 발현 (transient expression)
상기 실시예 1에서 준비한 아프리카 돼지열병 항원 단백질 (Lectin, CD2v, p72, p54, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L)의 식물 발현 재조합 벡터 각각을 아그로박테리아 LBA4404 균주에 전기충격법 (electrophoration)을 이용하여 형질전환 시켰다. 형질전환된 아그로박테리아를 5 mL의 YEP 액체배지 (효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 리팜피신 25 mg/L)에서 28℃의 조건으로 16시간 동안 진탕 배양한 후 1차 배양액 1 mL을 50 mL의 새 YEP 배지에 접종하여 28℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양 하였다. 이렇게 배양된 아그로박테리아는 원심분리 (7,000 rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 600 nm의 파장에서 흡광도 (O.D) 값이 1.0이 되도록 인필트레이션 (Infiltration) 버퍼 [10 mM MES (pH 5.7), 10 mM MgCl₂, 200 μM 아세토시링곤]에 현탁시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 수행하였다.
2-2. ASF 바이러스의 항원 단백질의 분리 및 정제
상기 실시예 2-1에서 준비한 니코티아나 벤타미아나 잎에서 재조합 단백질들을 분리 및 정제하기 위해, 각 재조합 단백질을 발현하는 니코티아나 벤타미아 잎에 단백질 추출 용액을 첨가하고 블렌더로 조직을 파쇄한 후 13,000 rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 단백질 추출액을 회수하였다. 상기 추출액으로부터 각각의 ASF 바이러스 항원 단백질을 분리정제하기 위해 단백질 A-세파로스 레진 (protein A-sepharose resin)이 충진된 컬럼으로 친화성 크로마토그래피를 실시하였다. 상기 컬럼에 단백질 A 레진을 충진한 후 세척액으로 평형화시켰다. 회수한 단백질 추출액을 컬럼에 적용하고 평형화시킨 다음, 세척액을 흘려보내 레진을 세척하고 용출용액으로 각각의 재조합 단백질을 용출시켰다. 재조합 항원 단백질이 포함된 용출용액은 중화용액을 가해 적절한 pH로 중화한 후, 30 kDa 컷오프의 필터를 사용하여 버퍼 교체 및 농축을 수행했다. 분리 정제된 재조합 항원 단백질은 전기영동 (SDS-PAGE) 후 쿠마시 염색법(Coomassie staining)을 통해 농도를 확인하였다.
p30 단백질의 경우 다음의 과정을 통해 분리, 정제했다: p30을 발현하는 니코티아나 벤타미아 잎에 단백질 추출 용액을 첨가하고 블렌더로 조직을 파쇄한 후 13,000 rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 단백질 추출액을 회수하였다. 상기 추출액으로부터 p30을 분리정제하기 위해 Ni-IDA 레진이 충진된 컬럼으로 친화성 크로마토그래피를 실시하였다. 먼저 상기 컬럼에 Ni-IDA 레진을 충진한 후 세척액으로 평형화시켰다. 회수한 단백질 추출액을 컬럼에 적용하고 평형화시킨 다음, 세척액을 흘려보내 레진을 세척하고 용출용액으로 p30 단백질을 용출시켰다. p30 단백질이 포함된 용출용액은 10 kDa 컷오프의 필터를 사용하여 버퍼 교체 및 농축을 수행했다. 분리 정제된 p30 단백질은 전기영동 (SDS-PAGE) 후 쿠마시 염색법을 통해 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 2 내지 10b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 아프리카 돼지 열병 바이러스 항원 단백질 모두 본래의 단백질과 비교하여 큰 변이나 변형 없이 잘 정제된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 단백질을 식물에서 발현시키는 경우 당 구조가 변이되어 생산 효율이 떨어질 수 있는 문제점이 발견되지 않았음을 검증한 것으로, 본 발명에 따른 아프리카 돼지 열병 바이러스 재조합 항원 단백질이 식물에서 잘 생산되는 것을 확인한 것이다.
재조합 항원 단백질별 분리, 정제 조건 및 결과는 다음과 같다:
Lectin 항원 단백질 (분자량: 40651.82; 도 2)
(1) 단백질 추출 조건: 니코티아나 벤타미아 잎 1kg, 단백질 추출액 2L
(2) 단백질 분리정제: 약 80 mL의 단백질 A 레진이 충진된 컬럼에서 30분간 바인딩 (binding) 후 20분간 레진 다운 (resin down)
- 추출액 (extraction buffer)/세척액: 50 mM Tris-Cl (pH 7.2), 100 mM NaCl, 100 mM Sodium sulfite (-W), 0.5% Triton X-100 (-W2), 1.5% PVPP (-W)
- 용출액 (elution buffer): 50 mM Sodium citrate (pH 3.0), 100 mM NaCl
- 중화 버퍼: 1 M Tris (pH 7.5로 중화)
- 최종 버퍼: 50 mM Sodium citrate, 약 150 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, pH 7.5
(3) 최종 단백질 농도 (Nanodrop 기준): 1.02 μg/μL
(4) 최종 수율 (Nanodrop 기준): 54 mg/kg
CD2v 항원 단백질 (분자량: 55214.70; 도 3)
(1) 단백질 추출 조건: 니코티아나 벤타미아 잎 1kg, 단백질 추출액 2L
(2) 단백질 분리정제: 약 100 mL의 단백질 A 레진이 충진된 컬럼에서 60분간 바인딩 후 20분간 레진 다운 (resin down)
- 추출액 /세척액: 100 mM Tris-Cl (pH 7.5), 154 mM NaCl, 0.5% Triton X-100 (-W2), 100 mM Sodium sulfite (-W), 1.5% PVPP (-W)
- 용출액: 50 mM Sodium citrate (pH 3.0), 154 mM NaCl
- 중화 버퍼: 1 M Tris (pH 7.5로 중화)
- 최종 버퍼: 50 mM Sodium citrate, 154 mM NaCl, pH 7.5가 될 때까지 1M Tris-HCl을 첨가함.
(3) 최종 단백질 농도 (Nanodrop 기준): 1.2 μg/μL
(4) 최종 수율 (Nanodrop 기준): 68.67 mg/kg
p72 항원 단백질 (분자량: 100405.77 (다만, 7개 glycosylation site에 의해 14 kDa 증가); 도 4a 및 4b)
(1) 단백질 추출 조건: 니코티아나 벤타미아 잎 1kg, 단백질 추출액 2L
(2) 단백질 분리정제: 약 100 mL의 단백질 A 레진이 충진된 컬럼에서 60분간 바인딩 후 20분간 레진 다운 (resin down)
- 추출액 /세척액: 100 mM Tris-Cl (pH 7.5), 154 mM NaCl, 0.5% Triton X-100 (-W2), 100 mM Sodium sulfite (-W), 1.5% PVPP (-W)
- 용출액: 50 mM Sodium citrate (pH 3.0), 154 mM NaCl
- 중화 버퍼: 1.5 M Tris (pH 7.5로 중화)
- 최종 버퍼: 50 mM Sodium citrate, 154 mM NaCl, pH 7.5가 될 때까지 1M Tris-HCl을 첨가함.
(3) 최종 단백질 농도 (Nanodrop 기준): 0.57 μg/μL
(4) 최종 수율 (Nanodrop 기준): 7.06 mg/kg
p54 항원 단백질 (분자량: 43956.09 (다만, 1개 glycosylation site에 의해 2 kDa 증가); 도 5a 및 5b)
(1) 단백질 추출 조건: 니코티아나 벤타미아 잎 0.1kg, 단백질 추출액 0.2L
(2) 단백질 분리정제: 약 10 mL의 단백질 A 레진이 충진된 컬럼에서 70분간 바인딩 후 20분간 레진 다운 (resin down)
- 추출액: 100 mM Tris-Cl (pH 7.4), 154 mM NaCl, 0.5% Triton X-100 (-W2), 100 mM Sodium sulfite, 1.5% PVPP, 0.5x PI
- 세척액: 100 mM Tris-Cl (pH 7.4), 154 mM NaCl, 0.5% Triton X-100 (-W2)
- 용출액: 50 mM Sodium citrate (pH 3.0), 154 mM NaCl
- 최종 버퍼: 1 N NaOH (pH 7.4가 될 때까지 1M Tris-HCl을 첨가함)
(3) 최종 단백질 농도 (Nanodrop 기준): 1 mg/ml
(4) 최종 수율 (Nanodrop 기준): 71 mg/kg
p30 항원 단백질 (분자량: 22993.95; 도 6)
(1) 단백질 추출 조건: 니코티아나 벤타미아 잎 1kg, 단백질 추출액 2L
(2) 단백질 분리정제: 약 100 mL의 단백질 A 레진이 충진된 컬럼에서 60분간 바인딩 후 20분간 레진 다운 (resin down)
- 추출액: 50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 0.5% Triton X-100, 50 mM Glycine, 100 mM Na2SO3, 10 mM Ascorbic Acid, 1.5% PVPP
- 세척액: 50 mM Tris-Cl (pH 7.4), 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole (W1,2), 100 mM Imidazole (W3), 0.5% Triton X-100 (W1)
- 용출액: 50 mM Tris-Cl (pH 7.4), 300 mM NaCl, 250 mM Imidazole
- 최종 버퍼: 50 mM Tris-Cl pH 7.4, 300 mM NaCl, 50 mM KCl
(3) 최종 단백질 농도 (Nanodrop 기준): 0.3 μg/μL (volume: 93 ml)
(4) 최종 수율 (Nanodrop 기준): 27.9 mg/kg
p15 항원 단백질 (분자량: 44114.34; 도 7a 및 7b)
(1) 단백질 추출 조건: 니코티아나 벤타미아 잎 1.5kg, 단백질 추출액 1L
(2) 단백질 분리정제: 약 100 mL의 단백질 A 레진이 충진된 컬럼에서 60분간 바인딩 후 20분간 레진 다운 (resin down)
- 추출액 /세척액: 50 mM Tris-Cl (pH 7.2), 100 mM NaCl, 0.5% Triton X-100 (-W2), 100 mM Sodium sulfite (-W), 1.5% PVPP (-W), 1 mM PMSF
- 용출액: 50 mM Sodium citrate (pH 3.0), 100 mM NaCl
- 중화 버퍼: 0.5 M NaOH (pH 7.5로 중화)
- 최종 버퍼: 50 mM Sodium citrate, 100 mM NaCl, pH 7.5가 될 때까지 1M Tris-HCl을 첨가함.
(3) 최종 단백질 농도 (Nanodrop 기준): 0.5 mg/ml
(4) 최종 수율 (Nanodrop 기준): 98.6 mg/kg
p35 항원 단백질 (분자량: 61323.42; 도 8)
(1) 단백질 추출 조건: 니코티아나 벤타미아 잎 0.5kg, 단백질 추출액 1L
(2) 단백질 분리정제: 약 100 mL의 단백질 A 레진이 충진된 컬럼에서 60분간 바인딩 후 20분간 레진 다운 (resin down)
- 추출액 /세척액: 50 mM Tris-Cl (pH 7.2), 100 mM NaCl, 0.5% Triton X-100 (-W2), 100 mM Sodium sulfite (-W), 15g PVPP (-W)
- 용출액: 50 mM Sodium citrate (pH 3.0), 100 mM NaCl
- 중화 버퍼: 1 M Tris (pH 7.5로 중화)
- 최종 버퍼: 50 mM Sodium citrate, 100 mM NaCl, pH 7.5가 될 때까지 1M Tris-HCl을 첨가함.
(3) 최종 단백질 농도 (Nanodrop 기준): 0.53 μg/μL (volume: 약 110 ml)
(4) 최종 수율 (Nanodrop 기준): 116.6 mg/kg
E199L 항원 단백질 (분자량: 46485.20 (다만, 2개 glycosylation site에 의해 4 kDa 증가); 도 9a 및 9b)
(1) 단백질 추출 조건: 니코티아나 벤타미아 잎 1kg, 단백질 추출액 2L
(2) 단백질 분리정제: 약 100 mL의 단백질 A 레진이 충진된 컬럼에서 60분간 바인딩 후 20분간 레진 다운 (resin down)
- 추출액: 100 mM Tris-Cl (pH 7.2), 154 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 100 mM Sodium sulfite, 1.5% PVPP, 1 mM PMSF (DMSO)
- 세척액: 100 mM Tris-Cl (pH 7.2), 154 mM NaCl, 0.5% Triton X-100 (-W2)
- 용출액: 50 mM Sodium citrate (pH 3.0), 154 mM NaCl
- 중화 버퍼: 0.2 N NaOH (pH 7.5로 중화)
(3) 최종 단백질 농도 (Nanodrop 기준): 1 mg/ml
(4) 최종 수율 (Nanodrop 기준): 70.3 mg/kg
F317L 항원 단백질 (분자량: 62777.73 (다만, 3개 glycosylation site에 의해 6 kDa 증가); 도 10a 및 10b)
(1) 단백질 추출 조건: 니코티아나 벤타미아 잎 100 g 및 단백질 추출액 200 mL; 또는 니코티아나 벤타미아 잎 1 kg 및 단백질 추출액 2 L
(2) 단백질 분리정제: 약 10 mL의 단백질 A 레진이 충진된 컬럼에서 60분간 바인딩 후 20분간 레진 다운 (resin down)
- 추출액: 100 mM Tris-Cl (pH 7.5), 154 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 100 mM Sodium sulfite, 1.5% PVPP, 1 mM PMSF (DMSO)
- 세척액: 100 mM Tris-Cl (pH 7.5), 154 mM NaCl, 0.5% Triton X-100 (-W2)
- 용출액: 50 mM Sodium citrate (pH 3.0), 154 mM NaCl
- 중화 버퍼: 0.2 N NaOH (pH 7.5로 중화)
(3) 최종 단백질 농도 (Nanodrop 기준): 1 mg/ml
(4) 최종 수율 (Nanodrop 기준): 14 mg/kg
실시예 3. 5종 항원 또는 9종 항원 백신에 의한 ASF 바이러스 방어 효과 확인
상기 실시예 2에서 분리 및 정제된 ASF 바이러스 항원 단백질의 투여에 의한 ASF 바이러스 감염 예방 효과 및 상기 백신의 안정성을 확인하기 위해, 하기 표 1에 기재한 바와 같이 총 18마리의 돼지를 6 마리씩 3 그룹으로 나누어 방어능 시험을 수행했다. 구체적으로, 동물모델을 5종 항원 백신 (Lectin, CD2v, p54, p72, 및 p30 조합) 처리 그룹 (G1), 및 9종 항원 백신 (Lectin, CD2v, p54, p72, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L 조합) 처리 그룹 (G2), PBS 처리 대조군 그룹 (G3)으로 나누었다. p30를 제외한 ASFV 항원 단백질은 벡신에 각각 100 μg씩 포함되고, p30는 30 μg이 포함되도록 하였으며, 1회 접종당 돼지 1마리에 2 mL의 백신을 투여했다.
Group 공격접종방법 Vaccine (2 mL)
G1 (6 pigs) IM (2 pigs) Lectin+CD2v+p54+p72+p30 (100μg each except p30, P30는 30μg), SEA1
Sentinel (4 pigs)
G2 (6 pigs) IM (2 pigs) Lectin+CD2v+p54+p72+p30+p15+p35+E199L+F317L (100μg each except p30, p30는 30μg), SEA1
Sentinel (4 pigs)
G3 (6 pigs) IM (2 pigs) PBS
Sentinel (4 pigs)
방어능 시험 일정은 표 2에 나타냈다. 재조합 단백질 항원 칵테일을 SEA1 애쥬번트 (adjuvant)와 혼합하여 백신을 제조하고 3주 간격으로 2회 근육주사를 시행하였고, 2차 주사 후 2주가 경과되었을 때 각 그룹별 2마리에 아프리카 돼지열병 바이러스 (야생형 ASF 바이러스)를 근육주사를 통해 공격접종하였다. 그룹별 나머지 4마리는 아프리카 돼지열병 바이러스를 근육접종받은 돼지와 같은 사육실에서 관리하며 공격접종받은 돼지로부터 방출되는 바이러스와 접촉하게 하여 수평 감염 (horizonal infection)을 유도했다 (Sentinel). 공격접종 후 매일 증상을 관찰하였으며, 감염 증상 (41.1 ℃ 이상의 고온)이 나타난 돼지는 시험 종료 시점 이전에 조기 안락사하여 혈청을 채취하였다. 구체적으로, 경정맥 (jugular vein) 또는 전방 대정맥 (anterior vena cava)로부터 3 내지 5 mL의 혈청을 수득하였으며 (18 내지 20G, 1 1/2 니들을 사용함), 폐, 간, 비장, 신장, 림프절, 및 췌장 등의 감염된 조직을 분리하였다.
Schedule Animal treatments 1차 접종 2차 접종 공격 접종 종료
day post vaccination 0 7 14 21 28 35 42 49
day post challenge 0 7 14
sampling serum (specific Ab against self antigen; ELISA) Y Y Y Y Y Y Y Y
serum (Ab against p30, CD2v; Jishu ELISA) Y Y Y Y Y Y Y Y
serum (viremia; real-time PCR) Y Y Y
PBMC (IFN-γ; ELISA) Y Y
lung, spleen, liver, lymph nodes, kidneys, pancreas (viremia; real-time PCR) Y
* 공격접종 후 매일 관찰, 체온측정-clinical score, 체온, 생존률
* 1차/2차 접종: 각 2 mL, IM(근육주사)
* challenge: 102 HAD50 ASFV-Vietnam, IM(2 pigs per group)
공격접종에 따른 돼지들의 체온 변화 및 생존율 결과는 도 11에 나타냈다. 아프리카 돼지열병 바이러스를 직접 공격접종 받은 각 군별 2마리는 모두 공격접종 일주일이 되는 시점 전후에 폐사하였다. 그러나 5종 항원 백신을 투여한 그룹 (G1)의 비 공격접종 돼지들은 모두 40.5 ℃ 미만의 체온을 보였고 2주동안 모두 생존하였다. 반면에 9종 항원 백신을 투여한 그룹 (G2)의 비공격접종 돼지 3마리는 고열로 인해 모두 11일만에 폐사하였으며 대조군 (G3)의 비공격접종 돼지 3마리 중 한마리는 증상이 없이 생존하였으나 한마리는 고열로 13일째 폐사, 나머지 한마리는 11일째부터 고열이었으나 실험기간으로 설정한 2주동안은 생존하였다.
이와 같은 결과는 본 발명에 따른 5종 항원 백신 (Lectin, CD2v, p54, p72, 및 p30 조합)이 뛰어난 돼지 열병 바이러스 예방 효과가 있음을 보여주는 것이며, 특히 종래 ASF 바이러스 백신 항원으로 사용되어온 p15, p35, E199L, 및 F317L 항원 단백질을 추가로 조합하는 것은 (즉, 9종 항원 백신) 오히려 백신의 기능을 저해하여 아프리카 돼지 열병 예방 효과를 떨어뜨린다는 것을 시사한다.
실시예 4. 5종 항원 또는 9종 항원 백신 투여 후 공격접종에 따른 혈중 바이러스 (Viremia) 수준 확인
이어서, 실시예 3의 공격접종 시험을 수행한 돼지의 혈중 바이러스 (Viremia; “바이러스 혈증”으로도 지칭됨) 수준을 측정하여 본 발명에 따른 백신의 아프리카 돼지 열병 바이러스 예방 효과를 확인하였다.
구체적으로, 혈중 바이러스 수준을 측정하기 위해 공격접종 후 0, 3, 7, 10, 및 14일이 경과한 시점에 각 돼지로부터 혈청을 추출하였으며, ASF 바이러스 특이적 프라이머 및 프로브를 이용해 실시간 중합효소-연쇄반응 (real time-polymerase chain reaction)을 수행한 뒤 시료별 Ct 값을 비교하였다. 실험에 사용한 ASF 바이러스 특이적 프라이머 서열은 하기와 같다:
Figure pat00001
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 5종 항원 백신을 투여한 돼지 (G1) 중 ASF 바이러스를 접촉-접종 (contact challenged)한 돼지는 접종 후 7일이 경과할 때까지 혈중 ASF 바이러스 수준이 매우 낮아 검출되지 않았으며 (UD), 접종 후 10일이 되었을 때 일부 돼지에서 바이러스가 검출되었으나 매우 낮은 수준이며 14일째에는 검출되지 않았다. 반면, 9종 항원 백신을 투여한 돼지 (G2) 중 ASF 바이러스를 접촉-접종한 돼지는 접종 후 7일이 경과했을 때부터 ASF 바이러스가 검출되었으며, 10일이 경과했을 때에는 혈중 바이러스 수준이 증가하여 같은 시점의 대조군 그룹에 비해 혈중 바이러스 수준이 더욱 높아진 것으로 나타난 바, 백신을 전혀 투여하지 않는 것에 비해서도 바이러스 예방 효과가 오히려 더욱 떨어진 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상술한 바와 같이 9종 항원 백신을 투여한 돼지는 공격접종 후 11일이 경과했을 때 열병 증상이 악화되어 사전 안락사하였다.
상기 결과는 본 발명에 따른 5종 항원 백신 (Lectin, CD2v, p54, p72, 및 p30 조합)이 ASF 바이러스의 감염 및 증식을 억제하여 뛰어난 돼지 열병 예방 효과를 달성할 수 있음을 증명하는 것이며, 특히 종래 ASF 바이러스 백신 항원으로 사용되어온 p15, p35, E199L, 및 F317L 항원 단백질을 추가로 조합하는 것은 (즉, 9종 항원 백신) 오히려 백신의 효과를 저해하여 바이러스의 감염 및 체내 증식을 전혀 예방할 수 없음을 보여준다.
실시예 5. 5종 항원 또는 9종 항원 백신 투여 후 항-ASFV 항체의 수준 확인
다음으로, 혈청 내 항-ASFV 항체의 수준을 확인하기 위해, 백신 항원이 코팅된 플레이트를 사용하여 백신접종 후 시간에 따른 항-p30 항체 생성 정도를 모든 개체에서 모니터링하였다 (백신접종 후 0, 7, 14, 21, 28, 및 35일차에 실시함). 5종 항원 백신을 투여 받은 그룹은 백신접종 후 21일차부터 항-p30 항체의 수준이 검출되었으며, 백신접종 후 28일 및 35일차에는 백신이 투여된 모든 개체에서 높은 수준의 항-p30 항체가 검출되었으며 9종 항원 백신을 투여받은 그룹보다 평균적으로 높은 항체반응이 확인되었다 (도 22).
상기 결과는 본원발명에 따른 5종 및 9종 항원 백신 모두 돼지열병바이러스 항원에 대한 항체 생성을 유도할 수 있으나, 특히 5종 항원 백신은 9종 항원 백신에 비해 더 높은 수준의 항체 생성을 더욱 신속하게 유도할 수 있음을 보여준다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 식물체에서 발현시키기 위한 아프리카 돼지열병 바이러스 특이 단백질을 발현하는 벡터를 제작하였으며, 상기 재조합 단백질이 조합된 ASF 바이러스 백신을 돼지에 투여하였을 때 부작용 없이 ASF 바이러스에 대한 항체의 생성을 안정적으로 유도되는 것을 확인하였다. 특히, 다섯 가지의 항원 (Lectin, CD2v, p54, p72, 및 p30)이 조합된 5종 백신을 투여 받은 돼지는 바이러스에 노출된 후에도 체중이 안정적으로 증가하고, ASFV 바이러스혈증 (viremia)이나 발열이 관찰되지 않았으며, 100%의 생존율을 보인 바, 상기 5종 항원 백신이 ASF 바이러스의 감염 및 체내 증식을 효과적으로 억제하여 아프리카 돼지열병을 억제할 수 있음을 확인하였다. 특히, 상기 5종 항원 백신의 항체 생성 유도 효과는 9종 항원 백신 (Lectin, CD2v, p54, p72, p30, p15, p35, E199L, 및 F317L)에 비해 우수한 것이 확인된 바, 이는 항원 단백질 Lectin, CD2v, p54, p72, 및 p30의 조합이 종래 백신에 비해 뛰어난 아프리카 돼지열병 예방 효과를 달성할 수 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 5종 항원 백신은 신규한 아프리카 돼지열병 바이러스 백신 조성물로 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (22)

  1. 아프리카 돼지열병 바이러스 (African swine fever virus, ASFV) 항원 단백질의 조합을 유효 성분으로 포함하는 아프리카 돼지열병 예방용 백신 조성물로서, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 Lectin, CD2v, p72, p54, 및 p30 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조합이고,
    단, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합이 상기 Lectin 단백질 및 상기 CD2v 단백질을 포함하는 경우, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 셋 이상의 항원 단백질로 이루어진 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물:
    (a) 상기 Lecin 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함함;
    (b) 상기 CD2v 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함함;
    (c) 상기 p72 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함함;
    (d) 상기 p54 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함함; 및
    (e) 상기 p30 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함함.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 ASFV 항원 단백질은 재조합 벡터를 이용하여 생산된 것이고, 상기 재조합 벡터는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 ASFV 단백질-코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물:
    (a) 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는, Lectin-코딩 폴리뉴클레오티드;
    (b) 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는, CD2v-코딩 폴리뉴클레오티드;
    (c) 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는, p72-코딩 폴리뉴클레오티드;
    (d) 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는, p54-코딩 폴리뉴클레오티드; 및
    (e) 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는, p30-코딩 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물:
    (a) 서열번호 19의 NB 또는 서열번호 21의 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (b) 서열번호 27의 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (c) 서열번호 29의 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (d) 서열번호 23의 M 도메인 또는 서열번호 25의 폴리히스티딘 태그 (polyhistidine tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 ASFV 항원 단백질은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체에서 생산된 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 애쥬번트 (adjuvant)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 애쥬번트는 미네랄 오일 (mineral oil) 또는 에멀시겐 (Emulsigen)-계인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방용 백신 키트.
  9. 인간을 제외한 동물에게 제1항의 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병의 예방 방법.
  10. ASFV (African swine fever virus, ASFV) 항원 단백질의 조합을 유효 성분으로 포함하는 아프리카 돼지열병 예방용 사료 조성물로서, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 Lectin, CD2v, p72, p54, 및 p30 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조합이고,
    단, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합이 Lectin 단백질 및 CD2v 단백질을 포함하는 경우, 상기 ASFV 항원 단백질의 조합은 셋 이상의 항원 단백질로 이루어진 것을 특징으로 하는, 사료 조성물.
  11. 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 p72 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 p54 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 p15 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 p35 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 15의 아미노산서열을 포함하는 E199L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    식물체에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스의 항원 단백질 발현용 재조합 벡터.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터:
    (a) 상기 p72 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함함;
    (b) 상기 p54 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함함;
    (c) 상기 p15 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 포함함;
    (d) 상기 p35 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 포함함;
    (e) 상기 E199L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16로 표시되는 염기서열을 포함함; 및
    (f) 상기 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18로 표시되는 염기서열을 포함함.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 19의 NB (new chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 21의 BiP (chaperone binding protein)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 p72 단백질, p54 단백질, p15 단백질, p35 단백질, E199L 단백질, 또는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 27의 pFc2 (porcine Fc) 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 p72 단백질, p54 단백질, p15 단백질, p35 단백질, E199L 단백질, 또는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 29의 HDEL (His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 p72 단백질, p54 단백질, p15 단백질, p35 단백질, E199L 단백질, 또는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  19. 제11항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 19의 NB 또는 서열번호 21의 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 27의 pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 29의 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 NB 또는 BiP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    p72 단백질, p54 단백질, p15 단백질, p35 단백질, E199L 단백질, 또는 F317L 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    pFc2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 형질전환체는 식물체인 것을 특징으로 하는, 형질전환체.
KR1020220097525A 2021-08-27 2022-08-04 아프리카 돼지열병 바이러스 유래 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방용 백신 KR20230034141A (ko)

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