KR101663963B1 - 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 k205r에 대한 단클론항체 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물 - Google Patents

아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 k205r에 대한 단클론항체 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101663963B1
KR101663963B1 KR1020150015946A KR20150015946A KR101663963B1 KR 101663963 B1 KR101663963 B1 KR 101663963B1 KR 1020150015946 A KR1020150015946 A KR 1020150015946A KR 20150015946 A KR20150015946 A KR 20150015946A KR 101663963 B1 KR101663963 B1 KR 101663963B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
swine fever
african swine
monoclonal antibody
fever virus
cell line
Prior art date
Application number
KR1020150015946A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160094674A (ko
Inventor
정혜영
이지연
최정수
김현주
박지용
김용주
조인수
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020150015946A priority Critical patent/KR101663963B1/ko
Publication of KR20160094674A publication Critical patent/KR20160094674A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101663963B1 publication Critical patent/KR101663963B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R에 대한 단클론항체 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R의 특정 부위에 특이적으로 결합하는 단클론항체 1E7, 4H7 및 이를 생산하는 융합세포주, 및 상기 단클론항체들을 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 K205R 특이적 단클론항체들, 상기 단클론항체들을 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 진단 키트는 신속한 아프리카 돼지열병 바이러스의 검출에 유용하여, 국내 축산업을 보호하고 국내 가축방역에 기여할 수 있다.

Description

아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R에 대한 단클론항체 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물{Monoclonal Antibody Against African Swine Fever Virus Protein K205R and Composition for Diagnosing African Swine Fever Containing the Antibody}
본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R에 대한 단클론항체 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R의 특정 부위에 특이적으로 결합하는 단클론항체 1E7, 4H7 및 이를 생산하는 융합세포주, 및 상기 단클론항체들을 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
아프리카 돼지열병(African swine fever, ASF)은, 아스파비리대(Asfarviridae)에 속하는 아프리카 돼지열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV) 감염에 의한 돼지 전염병으로, 1921년 케냐에서 최초보고가 있은 후, 주로 사하라 이남지역에서 발생보고가 있었고, 2007년 이후로 흑해연안인 죠지아, 아르메니아, 아제르바이잔 등 아프리카 이외 지역에서 그 발생 범위가 늘어나기 시작하였다. 특히 최근에는 우리나라와 교류가 많은 러시아 내에서 동서로 그 발생이 확산되고 있다. 아프리카 돼지열병은 돼지에 감염시 폐사율이 100%에 이르고, 이 질병에 대한 백신이 개발되어 있지 않아 발생 즉시 처분해야 하는 위험도가 높은 전염병으로 진단이 매우 중요하다.
아프리카 돼지열병 바이러스 특이 단백질 중에는 p72, p54, p30 및 K205R 등이 항원성이 높은 것으로 알려져, 진단 후보군으로 고려되고 있다. 현재 아프리카 돼지열병 바이러스 항체를 이용한 진단용 키트는 생산된 바 없으며, 외국의 경우 p30 재조합 단백질을 이용한 항체진단키트(SVANOVIR 사), p32, p62, p72 재조합 단백질을 섞어 이용하는 항체진단키트(IDvet) 등이 상업화되어 사용되고 있다.
이에, 본 발명자들은 아프리카 돼지열병 청정국을 유지하고 질병의 유입에 대비하기 위한 신속한 아프리카 돼지열병 항체 진단법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 아프리카 돼지열병 바이러스 특이 단백질 중 K205R에 특이적으로 결합하는 단클론항체들을 개발하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
공개특허 제10-2014-0080860호 (공개일: 2014.07.01)
본 발명의 목적은 K205R 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체 1H7, 4E7 및 이들을 생산하는 융합세포주들을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단클론항체들을 포함하는 아프리카 돼지열병 진단용 조성물 및 진단 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00333의 융합세포주 및 이로부터 생산되는 단클론항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00334의 융합세포주 및 이로부터 생산되는 단클론항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 기탁번호 KCLRF-BP-00333의 융합세포주로부터 생산되는 단클론항체 및 상기 기탁번호 KCLRF-BP-00334의 융합세포주로부터 생산되는 단클론항체를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물을 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 K205R 특이적 단클론항체들, 상기 단클론항체들을 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 진단 키트는 신속한 아프리카 돼지열병 바이러스의 검출에 유용하여, 국내 축산업을 보호하고 국내 가축방역에 기여할 수 있다.
도 1은 단클론항체 1H7과 K205R 재조합 단백질간의 반응성(우) 및 단클론항체 4E7과 K205R 재조합 단백질간의 반응성(좌)을 확인하기 위해 웨스턴 블럿(Western-blot)을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 단클론항체 1H7가 인식하는 K205R 도메인을 확인하기 위해, K205R 유전자를 세부분(1-156번째 염기서열 부위(A), 1-309 번째 염기서열 부위(B), 1-456 번째 염기서열 부위(C))으로 나누어 발현시킨 후 웨스턴 블럿을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 단클론항체 1H7과 4E7을 이용하여 경쟁적 효소결합면역측정법(competitive enzyme-linked immunosorbent assay, c-ELISA)으로 야외가검 혈청을 평가한 결과를 나타낸 것이다(샘플 1~21: 아프리카 돼지열병 양성혈청, 샘플 22~71: 아프리카 돼지열병 음성혈청).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질인 K205R에 특이적으로 결합하는 항체인 4E7 및 1H7를 경쟁적 효소결합면역측정법(competitive enzyme-linked immunosorbent assay, c-ELISA)의 코팅항체 및 탐지항체로 하여 K205R을 검출할 수 있는 검출 키트를 개발하였다.
본 발명의 실시를 위해, K205R 단백질을 마우스에 투여하여 면역시킨 후, 마우스 비장에서 K205R에 특이적인 1H7 항체를 생산하는 B 세포를 분리하여 골수종 유래세포와 융합시킨 융합세포주를 제작하여, 서울대학교 의과대학 암연구소 한국세포주은행(KCLB; Korean Cell Line Bank)에 기탁하였다(기탁번호: KCLRF-BP-00333). 본 발명의 일 실시예에서, 웨스턴 블럿(Western-blot)을 통하여, 기탁번호 KCLRF-BP-00333의 융합세포주로부터 생산된 1H7 단클론항체와 K205R 재조합 단백질 간의 항원-항체 반응성을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R에 특이적으로 결합하는 단클론항체(monoclonal antibody)를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00333의 융합세포주 및 이로부터 생산되는 단클론항체에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 1H7 단클론항체가 인식하는 K205R 도메인을 확인하기 위해, K205R 유전자를 세 부분으로 나누어 각각 발현시키고, 웨스턴블러팅법을 이용하여 각각의 항원-항체 반응성을 확인한 결과, 서열번호 2의 염기서열이 포함된 항원의 부분을 1H7 항체가 인식하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 단클론항체는 상기 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R의 염기서열 중 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 번역된 부위를 항원결정기(epitope)로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시를 위해, K205R 단백질을 마우스에 투여하여 면역시킨 후, 마우스 비장에서 K205R에 특이적인 4E7 항체를 생산하는 B 세포를 분리하여 골수종 유래세포와 융합시킨 융합세포주를 제작한 후, 서울대학교 의과대학 암연구소 한국세포주은행(KCLB; Korean Cell Line Bank)에 기탁하였다(기탁번호: KCLRF-BP-00334).
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00334의 융합세포주 및 이로부터 생산되는 단클론항체에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 경쟁적 효소결합면역측정법(c-ELISA)의 원리를 이용하여, 단클론항체 4E7을 코팅항체(coating antibody)로 플레이트에 고정시키고, 단클론항체 1H7을 탐지항체(detection antibody)로 사용하여 K205R을 검출하는 진단 키트를 제작하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 기탁번호 KCLRF-BP-00333의 융합세포주로부터 생산되는 단클론항체 및 기탁번호 KCLRF-BP-00334의 융합세포주로부터 생산되는 단클론항체를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물, 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 키트는 경쟁적 효소결합면역측정법(competitive enzyme-linked immunosorbent assay, c-ELISA)을 이용하고, 상기 기탁번호 KCLRF-BP-00333의 융합세포주로부터 생산되는 단클론항체를 탐지항체로, 상기 기탁번호 KCLRF-BP-00334의 융합세포주로부터 생산되는 단클론항체를 코팅항체로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 c-ELISA를 이용한 진단키트에서, 플레이트 코팅에 사용하는 단클론항체 4E7은 아프리카 돼지열병 바이러스 K205R 진단항원을 포획하기 위한 항체로서, 일반적인 다른 아프리카 돼지열병 바이러스 K205R 특이 단클론항체를 사용해도 무방하다.
본 발명의 c-ELISA는 다음과 같은 과정을 거쳐 K205R을 검출할 수 있다. 먼저, 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R 특이적 단클론항체 4E7을 효소결합면역측정법(ELISA) 플레이트에 코팅한다.
그 다음, K205R 항원과 가검혈청시료를 1시간 동안 반응시키고, 상기 플레이트에 부착되지 않은 4E7 항체들을 세척하여 제거한다. 그 다음, 1시간 동안 반응된 K205R 항원과 가검혈청시료를 상기 플레이트에서 1시간 동안 반응시키고, 상기 플레이트에 부착되지 않은 K205R 항원과 가검혈청시료를 세척하여 제거한다.
그 다음, 단클론항체 1H7을 경합적으로 반응시키고, 플레이트에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거한다.
그 다음, 발색반응효소인 호스레디쉬 페록시다제(HRP)를 결합시킨 마우스 항체를 1H7에 대하여 반응시키고, 기질을 첨가한 후, 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사 혈청 중의 K205R 수준을 측정한다.
상기 발색반응효소는 호스레디쉬 페록시다제(HRP)외에도 알칼라인 포스포타제(alkaline phosphotase, ALP) 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R을 진단하는 데 유용한 키트를 제공하고 있다. 본 발명의 키트는 96-웰 플레이트와 같은 구획된 캐리어 수단, 코팅 항체, 탐지 항체, 발색반응효소 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 항체, 블로킹 버퍼, 표준 용액을 담는 튜브, 흡광도 측정기 등을 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예 1: 아프리카 돼지열병 바이러스 K205R 재조합 단백질의 합성
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 K205R 단백질을 합성하는 융합세포주를 제작하기 위하여, 먼저 서열번호 4의 염기서열을 갖는 K205R 특이적 프라이머(정방향) 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 K205R 특이적 프라이머(역방향)를 이용하여, K205R를 코딩하는 유전자(GenBank Accession No. KM262845.1)의 염기서열을 증폭시켰다.
서열번호 4: 5'-GGATCCATGGTTGAGCCACGC-3'
서열번호 5: 5'-GGTACCTTACTTCTTCATCAT-3'
그 다음, 히스티딘이 태그된 E. coli expression vector pRSET A (invitrogen)에 상기 증폭된 유전자를 클로닝하고 E. coli에 도입하여, K205R 재조합 단백질을 발현시켰다.
실시예 2: K205R 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 융합세포주( hybridoma )의 제작
실시예 1에서 발현시킨 K205R 단백질을 정제하여, 발브씨(Balb/c) 마우스 복강에 2주 간격으로 0.2ug/ml 3회 투여하여 면역시킨 후, 마우스 비장의 B 면역세포들을 분리하였다.
K205R에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 다양한 B 면역세포들 중, 1H7 항체를 생성하는 B 면역세포를, PEG(MW 150)을 이용하여 SP2/0 골수종 유래세포와 융합한 후 HAT배지로 배양하여 기탁번호 KCLRF-BP-00333의 융합세포주를 제작하고, 4E7 항체를 생성하는 B 면역세포도 마찬가지 방법으로 SP2/0 골수종 유래세포와 융합하여 기탁번호 KCLRF-BP-00334의 융합세포주를 제작하였다.
기탁번호 KCLRF-BP-00333 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00334로부터 생산된 단클론항체의 아이소타이핑(isotyping) 결과, 2종 모두 IgG3 kappa임을 확인할 수 있었다.
실시예 3: K205R 특이적 단클론항체가 결합하는 항원결정기(epitope)의 분석
발현된 K205R 재조합 단백질과 상기 단클론항체들의 항원-항체 반응성을 확인하기 위해 웨스턴블럿(Western-blot)을 실시하였다 (도 1).
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 4E7 단클론항체는 구조적 에피토프(conformational epitope; 비연속성 에피토프)를 인식하여 웨스턴블러팅법으로는 반응성이 확인되지 않았으나, 1H7 단클론항체는 선형 에피토프(linear epitope)를 인식하여 웨스턴블러팅법으로 K205R과의 반응성이 확인되었다.
1H7 단클론항체가 인식하는 K205R 도메인을 확인하기 위해, K205R 유전자를 세부분(1-156번째 염기서열 부위, 1-309 번째 염기서열 부위, 1-456 번째 염기서열 부위)으로 나누어 벡터에 클로닝한 후 E. coli에 도입하여 발현시키고, 웨스턴블러팅법을 이용하여 각각의 항원-항체 반응성을 확인하였다 (도 2).
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 1-156번째 염기서열 부위(도 2의 A)를 발현시킨 재조합 단백질에서는 항원-항체 반응이 나타나지 않고, 1-309 번째 염기서열 부위(도 2의 B, 15kDa)를 발현시킨 재조합 단백질에서 항원-항체 반응이 보이기 시작하여, 1-456 번째 염기서열 부위(도 2의 C, 25kDa)를 발현시킨 재조합 단백질에서도 역시 항원-항체 반응이 나타나는 것으로 보아, 1H7 단클론항체의 경우 K205R 유전자의 157-309번째 염기서열 부위(서열번호 2)로부터 번역되는 아미노산 서열(서열번호 3)이 포함된 부분을 인식하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: c- ELISA 를 이용한 K205R 검출 키트의 제작
실시예 2에서 생산된 두 종(1H7, 4E7)의 K205R 특이적 단클론항체를 이용하여 K205R을 검출하는 c-ELISA를 개발하였다.
먼저, 단클론항체 4E7을 경쟁적 효소결합면역측정법(c-ELISA)에서 코팅항체(coating antibody)로 사용하기 위해 밤 사이에 플레이트에 4℃에서 코팅하였으며, 플레이트에 부착되지 않는 항체를 세척하였다.
블로킹 버퍼(Blocking buffer-PBST 용액 내에 5% BSA와 5% skim milk)를 4E7 항체가 코팅된 플레이트에 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, K205R 재조합 단백질과 양성혈청샘플, K205R 재조합 단백질과 음성혈청샘플, K205R 재조합 단백질과 가검혈청을 각각 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 양성혈청은 세계동물보건기구(OIE)의 ASF 국제표준 실험실인 영국의 퍼브라이트연구소(1두)와 남아프리카공화국 OVI(Onderstepoort veterinary institute)(20두)로부터 기부받아 사용하였으며, 음성혈청은 상업화되어 판매중인 아프리카 돼지열병 ELISA(IDvet) 키트를 이용하여 음성으로 확인된 국내 사육돼지 300두의 혈청을 이용하였다.
그 다음, 블로킹 버퍼를 제거한 후 K205R 재조합 단백질과 반응한 혈청을 플레이트에 넣어, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 세척하고, 단클론항체 1H7을 탐지항체(detection antibody)로서 플레이트에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
다시 플레이트를 세척하고, 발색반응효소인 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 마우스항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 플레이트를 세척하였으며, TMB 용액을 첨가하여 10분간 발색 후 흡광도를 450nm에서 측정하였다.
그 다음, 가검혈청평가를 통하여 샘플의 PI 값을 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
[수학식 1]
PI= [(음성 레퍼런스 혈청 OD - 테스트 샘플 OD)/음성 레퍼런스 혈청 OD - 강 양성 레퍼런스 혈청 OD)] X 100)
상기 수학식 1에서, PI 값이 40이하이면 음성, PI 값이 41 이상이면 양성 판정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 평가에 사용된 음성, 양성의 가검혈청을 기준으로 샘플의 PI값을 측정한 결과, 실시예 2에서 생산한 단클론항체 2종(1H7, 4E7)을 이용한 c-ELISA와, 상업화되어 상용중인 IDvet ELISA 키트의 결과가 거의 동일하여 본 발명의 c-ELISA의 정확도가 높음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00333 20141224 한국세포주연구재단 KCLRFBP00334 20141224
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management: Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs) <120> Monoclonal Antibody Against African Swine Fever Virus Protein K205R and Composition for Diagnosing African Swine Fever Containing the Antibody <130> YPD201406-0074 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 618 <212> DNA <213> K205R protein from African Swine Fever Virus <400> 1 atggttgagc cacgcgaaca gttttttcaa gacctgcttt cagcagtgga tcaacaaatg 60 gacactgtaa aaaatgacat aaaagacatc atgaaagaaa aaacatcttt tatggtgtca 120 ttcgaaaact ttatagaacg ttacgatacc atggaaaaaa atattcaaga ccttcagaat 180 aagtacgaag aaatggcggc caaccttatg accgtcatga cggatacaaa aattcagctt 240 ggagccatta tcgcccaact tgagattctg atgataaatg gcactccact tccggcaaaa 300 aaaacaacga ttaaggaggc tatgccccta ccttcatcaa acacgaacaa tgatcaaacg 360 agtcctcccg cctcaggcaa aacaagtgaa acacctaaaa aaaatcccac gaatgcaatg 420 ttcttcacgc gtagcgaatg ggcatcctcg aaaacttttc gagaaaagtt tttaacacca 480 gaaattcagg ccatattgga tgagcagttt gcaaacaaga ccgggatcga aagattgcat 540 gccgagggtc tttacatgtg gagaacccaa ttctctgacg aacagaagaa aatggtcaaa 600 gagatgatga agaagtaa 618 <210> 2 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 157-309 gene sequence of K205R <400> 2 aaaaatattc aagaccttca gaataagtac gaagaaatgg cggccaacct tatgaccgtc 60 atgacggata caaaaattca gcttggagcc attatcgccc aacttgagat tctgatgata 120 aatggcactc cacttccggc aaaaaaaaca acg 153 <210> 3 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Translation of 157-309 gene sequence of K205R <400> 3 Lys Asn Ile Gln Asp Leu Gln Asn Lys Tyr Glu Glu Met Ala Ala Asn 1 5 10 15 Leu Met Thr Val Met Thr Asp Thr Lys Ile Gln Leu Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Ala Gln Leu Glu Ile Leu Met Ile Asn Gly Thr Pro Leu Pro Ala Lys 35 40 45 Lys Thr Thr 50 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for K205R <400> 4 ggatccatgg ttgagccacg c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for K205R <400> 5 ggtaccttac ttcttcatca t 21

Claims (9)

  1. 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00333의 융합세포주.
  2. 제1항의 기탁번호 KCLRF-BP-00333의 융합세포주에 의해 생산되는 단클론항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단클론항체는 상기 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R를 코딩하는 유전자 염기서열 중 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 번역된 부위를 항원결정기(epitope)로 하는 것을 특징으로 하는 단클론항체.
  4. 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 K205R에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00334의 융합세포주.
  5. 제4항의 기탁번호 KCLRF-BP-00334의 융합세포주에 의해 생산되는 단클론항체.
  6. 제1항의 기탁번호 KCLRF-BP-00333의 융합세포주로부터 생산되는 단클론항체 및 제4항의 기탁번호 KCLRF-BP-00334의 융합세포주로부터 생산되는 단클론항체를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물.
  7. 제6항의 조성물을 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 키트는 경쟁적 효소결합면역측정법(competitive enzyme-linked immunosorbent assay, c-ELISA)을 이용하는 것을 특징으로 하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 키트는 기탁번호 KCLRF-BP-00333의 융합세포주로부터 생산되는 단클론항체를 탐지항체로, 기탁번호 KCLRF-BP-00334의 융합세포주로부터 생산되는 단클론항체를 코팅항체로 사용하는 것을 특징으로 하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 키트.
KR1020150015946A 2015-02-02 2015-02-02 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 k205r에 대한 단클론항체 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물 KR101663963B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150015946A KR101663963B1 (ko) 2015-02-02 2015-02-02 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 k205r에 대한 단클론항체 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150015946A KR101663963B1 (ko) 2015-02-02 2015-02-02 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 k205r에 대한 단클론항체 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160094674A KR20160094674A (ko) 2016-08-10
KR101663963B1 true KR101663963B1 (ko) 2016-10-11

Family

ID=56713293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150015946A KR101663963B1 (ko) 2015-02-02 2015-02-02 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 k205r에 대한 단클론항체 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101663963B1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109810948A (zh) * 2019-01-18 2019-05-28 中国农业科学院兰州兽医研究所 抗非洲猪瘟病毒k205r蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体
KR20200144067A (ko) 2019-06-17 2020-12-28 주식회사 바이오앱 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도
KR20200144068A (ko) 2019-06-17 2020-12-28 주식회사 바이오앱 아프리카 돼지열병의 예방을 위한 항원 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도
KR20230034141A (ko) 2021-08-27 2023-03-09 주식회사 바이오앱 아프리카 돼지열병 바이러스 유래 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방용 백신

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102433177B1 (ko) * 2019-06-12 2022-08-17 연세대학교 원주산학협력단 아프리카 돼지 열병 바이러스 유래 p104 단백질 절편 및 이의 용도
KR102433180B1 (ko) * 2019-06-12 2022-08-17 연세대학교 원주산학협력단 아프리카 돼지 열병 바이러스 유래 p205 단백질 절편 및 이의 용도
CN112444626B (zh) * 2019-08-30 2023-09-12 洛阳普泰生物技术有限公司 一种非洲猪瘟病毒抗体elisa检测试剂盒及其制备方法
CN115916803A (zh) * 2020-04-14 2023-04-04 株式会社准绳生命科学 非洲猪瘟疫苗组合物
CN112063757A (zh) * 2020-09-23 2020-12-11 河南格悦检测技术有限公司 一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用
CN112500478B (zh) * 2020-12-12 2021-07-16 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ6及其制备方法
WO2022196849A1 (ko) * 2021-03-19 2022-09-22 한국생명공학연구원 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단을 위한 항원 단백질 조성물 및 이의 용도
CN113278066B (zh) * 2021-05-25 2021-12-14 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种全猪源非洲猪瘟病毒单克隆抗体及其制备方法
WO2023191487A1 (ko) * 2022-03-30 2023-10-05 연세대학교 원주산학협력단 아프리카돼지열병 바이러스 유래 p62 및 f20572 단백질 절편 및 이들의 용도
CN115925887B (zh) * 2022-10-27 2024-02-09 华中农业大学 非洲猪瘟病毒pA104R蛋白免疫优势性B细胞抗原表位及其单克隆抗体与应用
CN115819564B (zh) * 2022-12-19 2023-11-14 四川大学 一种检测非洲猪瘟的单链抗体、试剂盒及方法
CN116444653B (zh) * 2023-03-09 2024-03-15 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一株阻断性非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用
CN116903709B (zh) * 2023-07-03 2024-05-07 华中农业大学 一种非洲猪瘟病毒pK205R蛋白抗原表位肽及其单克隆抗体与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102967703A (zh) 2012-09-06 2013-03-13 中国动物卫生与流行病学中心 一种用于elisa诊断的生物安全性非洲猪瘟抗原多因子血清

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101465231B1 (ko) 2012-12-20 2014-11-26 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 돼지열병바이러스 검출용 바이오 프로브 및 이를 이용한 돼지열병바이러스 진단 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102967703A (zh) 2012-09-06 2013-03-13 中国动物卫生与流行病学中心 一种用于elisa诊断的生物安全性非洲猪瘟抗原多因子血清

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Archives of Virology. Vol. 153, No. 12, pp. 2303-2306 (2008)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109810948A (zh) * 2019-01-18 2019-05-28 中国农业科学院兰州兽医研究所 抗非洲猪瘟病毒k205r蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体
CN109810948B (zh) * 2019-01-18 2021-09-17 中国农业科学院兰州兽医研究所 抗非洲猪瘟病毒k205r蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体
KR20200144067A (ko) 2019-06-17 2020-12-28 주식회사 바이오앱 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도
KR20200144068A (ko) 2019-06-17 2020-12-28 주식회사 바이오앱 아프리카 돼지열병의 예방을 위한 항원 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도
KR20230034141A (ko) 2021-08-27 2023-03-09 주식회사 바이오앱 아프리카 돼지열병 바이러스 유래 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방용 백신

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160094674A (ko) 2016-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101663963B1 (ko) 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 k205r에 대한 단클론항체 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물
KR102019008B1 (ko) 메르스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 융합 단백질을 이용한 메르스 코로나바이러스 검출 방법
KR101421460B1 (ko) Ｈ５ 조류 인플루엔자 진단 및 감시를 위해 유용한 ｈ５ 서브타입-특이적 결합 단백질
KR101785290B1 (ko) 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단용 단클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이 단클론항체를 사용하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단방법
US7303913B2 (en) Rapid diagnostic methods of Peste des Petits Ruminants using recombinant nucleocapsid protein expressed in insect cells and monoclonal antibody
JPWO2007043582A1 (ja) Ｓａｒｓウイルスヌクレオカプシドタンパク質を測定するための測定方法、測定用試薬キット、試験具、ｓａｒｓウイルスヌクレオカプシドタンパク質に対するモノクローナル抗体及び前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
JP6324970B2 (ja) 抗ウロプラキンｉｉ抗体システムおよび方法
CN114088941B (zh) 一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的双抗体夹心elisa试剂盒
KR100832870B1 (ko) 사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론항체 및 이것의 용도
CN113416247B (zh) 沙门菌鞭毛蛋白抗体及其制备方法和应用
KR102086089B1 (ko) 재조합 n 단백질에 대한 단클론항체를 이용한 아까바네바이러스 블러킹 효소결합면역측정법
CN107167606B (zh) 多诊断试剂盒
CN101591390B (zh) 抗h5n1来源的禽流感病毒核蛋白np的单克隆抗体及其应用
KR102029394B1 (ko) 치쿤구니아 바이러스 감염 진단용 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이를 이용한 치쿤구니아 바이러스 감염 진단 방법
Zhang et al. Development of a potential diagnostic monoclonal antibody against capsid spike protein VP27 of the novel goose astrovirus
KR100832867B1 (ko) 사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론항체 및 이것의 용도
KR101080071B1 (ko) 재조합 ｎ 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 리프트계곡열 경합적 효소결합면역측정법
Sun et al. Identification of a highly conserved epitope on avian influenza virus non-structural protein 1 using a peptide microarray
JP6446274B2 (ja) 口蹄疫ウイルスと反応する抗体
CN110894216B (zh) 一种猪流行性腹泻病毒抗原表位肽、单克隆抗体及应用
KR20220074286A (ko) 흰반점증후군 바이러스에 특이적인 재조합 항체 및 이의 용도
CN112724203A (zh) 一种非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽及其应用
KR101741206B1 (ko) 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트
KR102517114B1 (ko) 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트
CN111705039B (zh) 一种分泌抗sox17单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant