KR101465231B1

KR101465231B1 - 돼지열병바이러스 검출용 바이오 프로브 및 이를 이용한 돼지열병바이러스 진단 방법

Info

Publication number: KR101465231B1
Application number: KR1020120149343A
Authority: KR
Inventors: 송재영; 최은진; 이창희; 이진용; 김은주; 임성인; 이은정; 고희영; 박경민; 정광면
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부); 주식회사 메디안디노스틱
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2014-11-26
Also published as: KR20140080860A

Abstract

본 발명은 (a) 나노물질; (b) 상기 나노물질의 표면과 공유결합으로 연결된(covalently linked to) 돼지열병바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 항체; 및 (c) 상기 항체가 결합된 상기 나노물질로 표면이 개질된 고체 기질로서의 유리 섬유(glass fiber)를 포함하는 돼지열병바이러스 검출용 바이오 프로브를 제공한다. 본 발명은 상기 바이오 프로브를 이용한 돼지열병바이러스 진단 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 소량의 시료를 이용하여 10분 이내로 신속하게 돼지열병바이러스의 존재 및 감염 여부를 측정할 수 있다.

Description

돼지열병바이러스 검출용 바이오 프로브 및 이를 이용한 돼지열병바이러스 진단 방법{A Bio Probe for Detecting Classical Swine Fever Virus and Method for Diagnosing Classical Swine Fever Virus Using the Same}

본 발명은 돼지열병바이러스 검출용 바이오 프로브 및 이를 이용한 돼지열병바이러스 진단 방법에 관한 것이다.

응집반응(agglutination)은 면역반응의 일종인 항원-항체반응의 하나로 입자들간의 응집을 의미하는 것으로서, 면역학 연구뿐 아니라 혈청학적 진단, 혈액형의 판정, 수혈 시 교착 적합 판단, 미생물학에서 박테리아의 정체를 밝히는데 사용되는 등 널리 이용되고 있다. 한편, 응집물이란 항원-항체가 서로 결합되어 부피가 증가된 상태를 말한다. 면역분석의 전형적인 예로는 방사선 면역분석법(Radioimmunoassy, RIA), 효소 면역분석법(Enzyme immunoassy,EIA), 입자응집 면역분석법 및 계수형(counting) 면역분석법이 있다. 그러나, RIA 및 EIA는 항원-항체 반응 후에 B(결합형)/F((유리형) 분리가 필요하며 분석결과를 얻기까지 많은 시간과 노동력이 요구되는 단점이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 단시간 내에 시료 내의 돼지열병바이러스 존재 여부를 분석할 수 있는 바이오 프로브를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 나노물질의 표면에 돼지열병바이러스의 항원에 특이적인 항체를 결합시키고 이를 유리 섬유 표면에 개질시킴으로써 바이오 프로브를 제조하는 경우, 단시간 내에 간편하면서도 정확하게 시료 내의 돼지열병바이러스 존재 여부를 결정할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 돼지열병바이러스 검출용 바이오 프로브를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오 프로브를 이용하는 돼지열병바이러스 진단 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 돼지열병바이러스 검출용 바이오 프로브를 제공한다:

(a) 나노물질;

(b) 상기 나노물질의 표면과 공유결합으로 연결된(covalently linked to) 돼지열병바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 항체; 및

(c) 상기 항체가 결합된 상기 나노물질로 표면이 개질된 고체 기질로서의 유리 섬유(glass fiber).

본 발명자들은 단시간 내에 시료 내의 병원체 여부를 분석할 수 있는 바이오 프로브를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 나노물질의 표면에 돼지열병바이러스의 항원에 특이적인 항체를 결합시키고 이를 유리 섬유 표면에 개질시킴으로써 바이오 프로브를 제조하는 경우, 단시간 내에 간편하면서도 정확하게 시료 내의 병원체 존재 여부를 결정할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 바이오 프로브는 (ⅰ) 돼지열병바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 나노물질의 표면에 공유결합으로 연결시키는 단계 및 (ⅱ) 상기 항체가 결합된 상기 나노물질을 고체 기질로서의 유리 섬유 표면에 결합시키는 단계를 거쳐서 제조할 수 있다.

먼저, 카르복실기(COOH)로 표면이 개질된 나노물질과 돼지열병바이러스의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 반응시켜 항체가 결합된 상기 나노물질을 제조한다. 본 발명에서 이용되는 나노물질은 바람직하게는 폴리스티렌 나노입자이며, 바람직하게는 1-500 nm, 보다 바람직하게는 20-300 nm, 보다 더 바람직하게는 40-200 nm, 보다 더욱 바람직하게는 60-150 nm, 가장 바람직하게는 100-130 nm의 크기를 갖는다.

상기 항체가 결합된 상기 나노물질의 안정성을 증가시키기 위해, 항체가 결합된 상기 나노물질을 고체 기질로서의 유리 섬유 표면에 결합시킨다. 본 발명에서 이용되는 유리 섬유는 당업계에 공지된 다양한 유리 섬유를 포함한다. 바람직하게는 붕규산염(borosilicate) 유리 섬유이다. 본 발명에서는 이용되는 유리 섬유의 형상 및 크기는 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 원형의 형상을 가지며, 2-100 mm 지름을 갖는다. 상기 항체가 결합된 상기 나노물질을 유리 섬유 표면에 결합시키는 단계는 흡착방식으로 실시될 수 있다. 바람직하게는 상기 흡착은 당 및 계면활성제를 항체가 결합된 나노물질과 혼합하고, 이를 유리 섬유 표면에 적용한 다음 건조하는 단계를 거쳐 실시할 수 있다. 상기 건조는 바람직하게는 50-60℃에서 10-90분간 실시한다.

본 발명에서 이용되는 당은 당업계에 공지된 다양한 당을 포함한다. 본 발명에서 이용되는 당은 바람직하게는 수크로오스, 프룩토오스, 글루코오스, 에리트리톨, 말티톨, 락티톨, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, D-타가토스, 트레할로스, 갈락토오스, 람노스, 사이클로덱스트린, 리불로오스, 트레오즈, 아라비노오제, 자일로오스, 릭소오스, 알로오스, 알트로오스, 만노스, 아이도즈, 락토오스, 말토오스, 전화당(invert sugar), 이소트레할로스, 네오트레할로스, 팔라티노스, 이소말툴로스, 에리드로우즈, 디옥시리보스, 굴로스, 아이도즈, 탈로스, 에리드루로우즈, 자일룰로오스, 프시코스, 투라노스, 셀로비오스, 글루코사민, 만노사민, 푸코스, 글루쿠론산, 글루콘산, 글루콘오-락톤, 아베쿠오스, 갈락토사민, 자일로-올리고당, 겐치오-올리고당, 갈락토-올리고당, 소르보스, 니게로-올리고당, 프룩토올리고당, 말토테트라올, 말토트리올, 말토-올리고당, 락툴로즈, 멜리바이오즈, 라피노오스, 람노스 및 리보오스이고, 바람직하게는 수크로오스, 말토오스 및 트레할로스이며, 가장 바람직하게는 수크로오스 및 트레할로스이다.

본 발명에서 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있고, 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용된다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온 성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드알킬에테르, 알콕시레이티드알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르, 폴리솔베이트류 및 슈가에스테르를 포함한다. 보다 바람직하게는 비이온성 계면활성제가 사용되며, 가장 바람직하게는 Tween-20 및 Triton X-100이 사용된다.

본 발명에서 항체를 표현하면서 사용하는 용어 “항원(antigen)”은 상술한 돼지열병바이러스로부터 유래된 것으로, 면역계를 자극하여 생체에 특이적 면역반응을 유도하는 물질을 의미하며, 본 발명에서 용어 “면역원(immunogen)”과 혼용되어 사용될 수 있다. 항원물질의 종류는 대단히 다양하며 그 개체에 대해 이물질이라면 원칙적으로 모두가 항원으로 인식한다. 단백질, 다당질, 핵산, 지질 및 이들의 복합체 등을 천연항원이라 한다. 또한 화학적으로 합성된 물질이라도 단백질(담체)등과 결합하면 면역계를 자극시킬 수 있다. 이들을 합텐(부착제) 또는 인공항원이라 한다.

본 발명에서 항원은 바람직하게는 돼지열병바이러스 LOM 계통 유래 항원이며, 보다 바람직하게는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 돼지열병바이러스 LOM 계통 유래 E2 항원이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “항체(antibody)”는 상기 항원에 대한 특이 항체로서, 항원 단백질에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다.

본 명세서에서, 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3 개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 항원 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체는 항원 단백질에 결합하여, 항원-항체 복합체를 형성한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 돼지열병바이러스 진단 방법을 제공한다:

(a) 본 발명의 바이오 프로브에 시료를 접촉시키는 단계;

(b) 상기 바이오 프로브 및 시료의 반응 결과물에 대한 광 산란(light scattering) 정도를 측정하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)의 측정 결과로부터 시료 내 돼지열병바이러스 여부를 분석하는 단계.

본 발명에서 병원체 진단에 사용되는 항체는 나노물질과 결합되어 있는 형태를 가짐으로써, 항원-항체 결합에 의한 면역응집반응 결과물의 크기는 나노물질이 결합되어 있지 않은 항원-항체 복합체에 비해 증가된 형태를 갖는다. 면역응집반응 결과물의 크기가 증가된 경우, 면역응집반응 결과물에 빛을 조사하였을 때 이로부터 산란되는 산란광의 강도 또한 증폭되기 때문에 본 발명의 바이오 프로브를 이용하면 용이하게 시료 내 돼지열병바이러스 여부를 판단할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “시료”란 생물학적 시료로서 조직, 세포, 오줌, 타액, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이들 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 바이오 프로브와 반응시켜서 병원체의 존재 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 바이오 프로브의 나노물질 표면에 연결된 항체는 시료 내의 항원 단백질과 결합하여, 면역응집반응을 나타낸다. 항원-항체 결합에 의한 면역응집반응 여부는 반응결과물에 빛을 조사하여 이로부터 산란되는 산란광을 측정함으로써 판별할 수 있다.

본 발명에서 광 산란 정도 측정은 당업계에 공지된 다양한 광 측정 장치를 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 먼저 측정하고자 하는 시료를 항체가 결합되어 있지 않는 바이오 프로브에 적용하여 반응시킨 다음, 빛을 조사한 후 광산란 정도를 측정하고, 같은 시료를 항체가 결합된 바이오 프로브에 적용하여 반응시킨 다음, 빛을 조사한 후 광 산란 정도를 측정한다. 바람직하게는 상기 광 산란 정도는 380 nm 파장에서 측정한다.

상기 항체가 결합된 바이오 프로브로부터 도출한 측정값에서 항체가 결합되어 있지 않은 바이오 프로브로부터 도출한 측정값에서 빼서 최종 측정값을 산출한다. 최종 측정값이 100 이상이면 양성, 100 미만이면 음성으로 판정함으로써 시료 내 병원체 여부를 분석한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 돼지열병바이러스 검출용 바이오 프로브를 제공한다.

(b) 본 발명은 상기 바이오 프로브를 이용한 돼지열병바이러스 진단 방법을 제공한다.

(c) 본 발명의 바이오 프로브를 이용하면, 소량의 시료로부터 10분 이내로 신속하게 돼지열병바이러스의 존재 및 감염 여부를 측정할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 제조한 CSFV 항체의 항원(CSFV E2 단백질) 특이성을 ELISA 방법으로 확인한 결과이다.
도 2는 바이오 프로브 제조과정에 대한 개략도이다.
도 3은 유리 섬유, 항체가 결합된 나노물질을 결합시킨 유리 섬유의 표면을 SEM으로 촬영한 결과이다. (a) 500 배, (b) 2,000 배, (c) 4,000 배.
도 4는 돼지열병바이러스에 대한 광 산란법의 특이도를 측정한 결과이다.
도 5는 돼지열병바이러스에 대한 RT-PCR법의 특이도를 측정한 결과이다.
도 6은 돼지열병바이러스에 대한 ELISA법의 특이도를 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 돼지열병바이러스 항체 제작

CSFV LOM 백신(수의과학검역원)을 면역항원으로 하여 항체를 제조하였다. 먼저, CSFV LOM 백신 100 μl 및 프로인트 보강제(Freund's Adjuvant) 100 μl를 혼합하여, Balb/C 마우스 복강으로 2주 간격으로 4회 주사하여 면역시켰다. 4회차 면역 후 1주일째에 마우스로부터 혈액을 채취한 후, 혈청을 분리하고 이를 이용하여 간접(indirect) ELISA를 실시하였다. 마지막 면역은 CSFV LOM 백신 200 μl를 복강으로 주사함으로써 실시하였다. 마지막 면역 4일 후에 면역 마우스로부터 림프구(lympocytes)를 분리하고 이 세포를 PEG 방법을 이용하여 골수종세포인 SP2/0 Ag14(ATCC, 미국)와 융합하여 하이브리도마(hybridoma) 세포를 제조하였다.

목적항원인 CSFV LOM 바이러스 에 특이적으로 반응하는 클론을 선별하기 위해 제조한 하이브리도마 세포를 스크리닝 하였다. 하이브리도마 세포 배양 상등액을 목적항원(CSFV LOM 바이러스, 10⁵ TCID₅₀/ml)과 반응시킨 후, 면역형광시험법(immunofluorescence assay)을 실시하여 목적항원에 특이적으로 반응하는 세포를 1차적으로 스크리닝하였다. 1차 스크리닝에서 선별된 하이브리도마 세포 배양 상등액을 목적항원(CSFV LOM 바이러스, 10⁵ TCID₅₀/ml)과 반응시킨 후, 면역형광시험법을 실시하여 목적항원에 특이적으로 반응하는 세포를 2차적으로 스크리닝하였다. 2차 스크리닝에서 선별된 하이브리도마 세포로부터 항체를 수득하고, 단일항체 아이소타이핑 시약(Sigma, 미국)을 이용하여 IgG 항체를 선별하였다.

실시예 2: 항원 활성 확인(ELISA)

간접(indirect) ELISA 방법을 이용하여 실시예 1에서 제조한 항체의 항원 특이성(CSFV E2 단백질)을 확인하였다(도 1).

먼저, 재조합 단백질 2 종을(CSFV E2, CSFV E0) ELISA 플레이트에 1 μg/ml 농도로 분주한 후, 37℃에서 2시간 동안 고정시킨 다음, 0.05 M PBST로 3회 세척하였다. 1% PVP(Sigma)로 플레이트를 코팅 시킨 다음 0.05 M PBST로 3회 세척하고, 제작한 항체를 2 μg/ml 농도부터 2진 희석하여 7가지 농도로 ELISA 웰에 첨가하여 37℃에서 1시간동안 반응시키고, 0.05 M PBST로 3회 세척하였다. 제작한 항체와 반응하는 항-마우스 IgG 항체에 HRP를 커플링하여 100 ng/ml 농도로 분주하고 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음, 0.05 M PBST로 3회 세척하였다. TMB(MOSS) 100 μl를 넣어 발색을 유도한 다음 TMB STOP 용액으로 반응을 중지시켜 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도별로 고정한 항원과 반응하는 여부를 그래프를 통해 확인하였다.

실시예 3: 바이오 프로브 제조

바이오 프로브는 항체와 나노 입자(latex bead) 간의 결합복합체를 뜻하며 복합체 제조를 위해 공유결합 원리를 이용하여 아래와 같이 제조하였다.

1) 항체 준비: 실시예 1에서 제조한 항체 38 μg과 PBS 1 mL을 혼합하여 준비하였다.

2) 나노 입자 준비: 0.05% 제조 기준으로 입자 원액(120 nm 카르복실 폴리스티렌 비드, bangs laboratories) 5 μL 및 PBS 0.995 mL을 혼합한 후, 12,000rpm 에서 15분간 원심분리하여 MES 버퍼를 이용하여 2회 세척하였다. 다시 MES 버퍼로 현탁하고 EDC 10 mg을 넣고 15분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 동일한 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고 PBS로 2회 세척하고 다시 PBS로 현탁하였다.

3) 복합체 제조: 상기 단계 1)에서 제조한 용액을 2)의 결과물에 섞고 상온에서 로테이터를 이용하여 3시간 반응시켰다.

4) 블로킹 및 세척: 제조된 복합체 이외에 반응하지 못한 항체를 제거하고 화학물질들을 불활성화 시키기 위하여 원심분리하여 상층액을 버리고 하이드록실라민을 1 mL 첨가하여 30분간 반응시킨 후 12,000rpm에서 15분간 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 다시 995 μL의 PBS를 첨가하였다. 완성된 바이오 프로브는 4℃에서 보관하였다.

실시예 4: 바이오 프로브 안정성 유지를 위한 건조

바이오 프로브 용액은 시간이 지날수록 활성이 떨어진다는 단점이 있다. 이 단점을 극복하고, 안정성을 확보하기 위해 유리 섬유 패드(glass fiber pad)(marck)에 40% 수크로오스(Sigma), 50% 트레할로스(Sigma), 0.01% 트윈(Sigma), 0.01% 트리톤(Sigma)을 각각 2.5 μl씩 넣고, 바이오 프로브 용액을 10 μl 넣어 지름 5 mm 유리 섬유 패드에 55℃에서 30분간 건조하였다. 수크로오스 및 트레할로스는 저농도의 항체를 패드에 고정하여 보관할 때, 안정성을 높여주며 패드에서 반응이 완료된 후 반응물이 패드에서 방출되는 것을 돕는다. 실제로 상기 4가지 화학물질을 첨가하지 않고 패드에 바이오프로브를 건조시키면 바이오프로브가 패드로부터 방출되는데 오랜 시간이 소요된다(데이터 미기재). 또한, 계면활성제는 항원-항체 반응의 비특이적 반응을 줄이기 위해 사용된다. 유리 섬유 패드의 건조 전, 후 및 샘플 로딩 후의 SEM 촬영 결과는 도 3a-c와 같다.

실시예 5: 건조 유리 섬유 패드를 이용한 검출 방법

항원-항체 응집반응에 따른 빛의 산란 정도는 다음의 단계를 통해 측정하였다.

a) 항체를 커플링 시키지 않은 바이오 프로브가 결합된 건조 유리 섬유 패드를 칩 주입구에 끼워 넣는다.

b) 검출하고자 하는 시료 50 μl를 주입구(1)에 로딩하고 반응채널(2)을 지나 광 산란 측정부(3)까지 시료가 다 채워지면(약 3-5초 소요), 광 산란(light scattering) 장치에 넣고 광 산란 측정부(3)의 빛의 산란 정도를 380 nm 파장대에서 총 4회 측정하고 평균값을 산출한다. 광 산란 측정부를 거친 시료는 모세관력 증대 채널(4)을 지나 배출구(5)로 배출된다.

c) 항체가 커플링된 바이오 프로브를 결합시킨 건조 유리 섬유 패드를 칩 주입구에 끼워 넣는다.

d) 상기 단계 c)에서 사용한 동일한 시료 50 μl를 주입구에 로딩하고 반응 채널을 지나 광 산란 측정부까지 시료가 다 채워지면, 광 산란 장치에 넣고 광 산란 측정부의 빛의 산란 정도를 380 nm 파장대에서 총 4회 측정하고 평균값을 산출한다.

e) 상기 단계 d)에서 측정한 값에서 상기 단계 b)의 측정값을 빼서 최종 측정값을 산출한다. 최종 측정값이 100 이상이면 양성, 100 미만이면 음성으로 판정한다.

실시예 6: 검출 한계 비교

상기 방법에 의해 제조된 유리 섬유 패드를 이용하는 광 산란법의 검출 한도를 RT-PCR로 확인하였다.

RT-PCR은 본 발명의 출원인이 제조한 제품인 VDX-3011(CSFV 5NCR RT-PCR)을 사용하여 실시하였다. QIAGEN KIT를 이용하여 바이러스의 RNA를 추출하였다(바이러스 원액부터 1/10로 희석하여 7가지 농도). 상기 RT-PCR 제품의 시약(20 μl)과 추출된 바이러스 5 μl 섞어서 PCR 장치(TACARA)에 넣은 후, 50℃에서 30분, 95℃에서 15분 반응시키고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 40초의 조건으로 35사이클 반응시킨 다음, 72℃에서 5분간 반응시켰다. PCR 반응물을 1.5% 아가로오스 겔에 5 μl 넣고 전기영동을 수행한 후, 결과를 GELDOC(BIORAD)를 이용하여 분석하였다.

메디안에서 판매중인 CSFV AG ELISA 키트를 이용하여 간접 ELISA를 실시하였다. CSFV 항체가 코팅된 플레이트에 샘플 희석액 50 μl와 처리된 바이러스시료를 50 μl씩 넣고 음성대조(PBS)를 분주하였다. 37도에서 90분 반응 시킨 후, 3번 세척을 통해 반응하지 않은 용액을 털어 버리고 실시 예 1에서 사용한 항체에 HRP를 커플링한 컨쥬게이트를 500 ng/ml의 농도로 100 μl씩 각 웰에 분주하였다. 37도에서 1시간 반응 후에 3번 세척하고, TMB 용액을 100 μl 분주하고, 15분 후 TMB 스톱 용액을 50 μl 분주하여 ELISA 리더기(450 nm)에서 흡광도를 측정하였다. 각 샘플을 음성대조 흡광도로 나누어 S/N 비율로 다른 검출법과 비교하였다.

실험결과, 본 발명의 광산란법은 RT-PCR 진단방법에 비해 검출 한도가 10배 정도 낮고, ELISA 진단방법 보다 검출 한도가 100배 정도 높은 것으로 나타났다(표 1).

-	검사법	광산란법		샌드위치 ELISA		RT-PCR
-	검사법	S/N 비율	양성/음성	S/N 비율	양성/음성	양성/음성
바이러스농도 (TCID₅₀/ml)	100,000	3.59	양성	14.38	양성	양성
	10,000	2.96	양성	3.62	양성	양성
	1,000	2.24	양성	1.16	음성	양성
	100	1.69	양성	0.81	음성	양성
	10	1.12	음성	0.75	음성	양성
	1	0.45	음성	0.81	음성	음성
	0.1	0.93	음성	1.00	음성	음성
	PBS	1.00	음성	1.00	음성	음성

실시예 7: RT-PCR 진단방법과의 민감도 및 특이도 비교

상기 방법에 의해 제조된 유리 섬유 패드를 이용하는 광 산란법의 민감도 및 특이도를 CSFV LOM 확정 진단 방법인 RT-PCR 방법과 비교하였다. 측정 민감도는 양성으로 판별된 샘플 갯수를 양성으로 판별된 갯수 및 위음성을 나타낸 샘플 갯수를 더한 값으로 나누어 산출하였으며, 측정 특이도는 음성으로 판별된 샘플 갯수를 음성으로 판별된 샘플 갯수 및 위양성을 나타낸 샘플 갯수를 더한 값으로 나누어 산출하였다.

RT-PCR 방법에 의해 양성으로 판별된 5개의 샘플 및 음성으로 판별된 45개의 샘플을 상기 방법에 의해 제조된 본 발명의 유리 섬유 패드에 적용하여 측정한 결과, 양성 샘플 5개 모두 양성으로 판별되었고, 음성 샘플 45개 가운데 1개가 양성으로 판별되었다. 위음성을 나타낸 샘플은 0개, 위양성을 나타낸 샘플은 1개였다. RT-PCR 방법과 비교한 본원발명의 진단방법의 측정 민감도는 100%, 특이도는 98%를 나타냈다(표 2).

RT-PCR 방법과의 비교

CSFV 진단		광산란법			측정 민감도 (양성/(양성+위음성)	100%
		양성	음성	합
RT-PCR	양성	5	0	5	측정 특이도 (음성/(음성+위양성)	98%
	음성	1	44	45
	합	6	44	50

실시예 8: 광 산란법, RT-PCR 및 ELISA 법의 특이도 확인

상기 방법에 의해 제조된 유리 섬유 패드를 이용하는 광 산란법의 CSFV에 대한 특이도를 확인하기 위해, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) US 타입, PRRSV EU 타입, 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus, JEV), 뇌심근염바이러스(encephalomyocarditis virus, EMCV), 신종 인플루엔자 H1N2, 아데노바이러스(Adenovirus, ADV), 돼지파보바이러스(Porcine Parvovirus, PPV), 돼지써코 바이러스 2(Porcine circovirus type 2, PCV2), 폐조직, 혈액 및 정액을 샘플로 하여 광 산란법을 실시하였다. 상기 바이러스의 타이터는 표 3과 같으며, 실제 실험에서는 1/10로 희석하여 사용하였다.

바이러스명	역가
신종플루 H1N1	2⁷ HA TCID₅₀/ml 타이터
PRRSV US	10³TCID₅₀/ml 타이터
PRRSV EU	10²TCID₅₀/ml 타이터
JEV	10⁶TCID₅₀/ml 타이터
EMCV	10^5.1TCID₅₀/ml 타이터
CSFV	10⁵TCID₅₀/ml 타이터
SIV H1N2	10⁶TCID₅₀/ml 타이터
ADV	10^7.5TCID₅₀/ml 타이터
PPV	10^6.1TCID₅₀/ml 타이터
PCV2	10⁵TCID₅₀/ml 타이터

각 시료 반응에 따른 광세기(intensity)를 측정한 결과, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스, 일본뇌염바이러스, 뇌심근염바이러스, 아데노바이러스, 돼지파보바이러스 및 돼지써코 바이러스 2 시료에서 100 이하의 약한 광세기를 보였으나, 돼지열병바이러스에서 약 220의 강한 광세기를 보여, 본 발명의 항체가 결합된 유리 섬유 패드가 돼지열병바이러스에 있어 높은 특이도를 갖는다는 것을 확인하였다(도 4).

돼지열병바이러스에 대한 RT-PCR 법의 특이도를 측정한 결과, 신종 인플루엔자 H1N2, 아데노바이러스, 돼지파보바이러스, 돼지써코 바이러스 2 및 야외시료에서 20 이하의 특이도를 나타냈으며, 돼지열병바이러스에서 약 110의 특이도를 보였다(도 5).

한편, ELISA 법의 특이도를 측정한 결과, 돼지열병바이러스 시료 이외 다른 바이러스 시료에 대해서는 반응성이 낮고, 돼지열병바이러스와의 반응성은 높은 것으로 나타났다(도 6).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> MEDIAN Diagnostics Inc. <120> A Bio Probe for Detecting Classical Swine Fever Virus and Method for Diagnosing Classical Swine Fever Virus Using the Same <130> PN120499 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1020 <212> DNA <213> CSFV LOM strain E2 nucleotides <400> 1 cggctagcct gcaaggaaga ttacaggtac gcactatcat caaccaatga gatagggcta 60 ctcggggccg gaggtctcac caccacctgg gaagaataca accacgattt gcaactgaat 120 gacgggaccg ttaaggccat ttgcgtggca ggttccttta aaatcacagc acttaatgtg 180 gtcagtagga ggtatttggc atcattgcat aaggaggctt tacccacttc tgtgacattc 240 gagctcctgt tcgacgggac caacccatca actgaggaaa tgggagatga cttcgggttc 300 gggctgtgcc cgtttgatac gagtcctgtt gtcaagggaa agtacaatac aaccttgttg 360 aacggtagtg ctttctatct tgtctgtcca atagggtgga cgggtgttat agagtgcaca 420 gcagtgagcc caacaactct gagaacagaa gtggtaaaga ccttcaggag ggacaagccc 480 tttccgcaca gaatggattg tgtgaccaca acagtggaaa atgaagattt attctactgt 540 aattgggggg gcaactggac atgtgtgaaa ggtgaaccag tggtctacgc gggggggcta 600 gtaaaacaat gcagatggtg tggctttgac ttcaatgagc ctgacggact cccacactac 660 cccataggta agtgcatttt ggcaaatgag acaggttaca gaatagtgga ttcaacagac 720 tgtaacagag atggtgttgt aatcagcaca gaggggagtc atgagtgctt gatcggtaac 780 acaaccgtca aggtgcatgc atcagatgaa agactgggcc ccatgccatg cagacctaaa 840 gagaccgtct ctagtgaagg acctgtaagg aaaacttcct gtacattcaa ctacgcaaaa 900 actttgaaga acaagtacta tgagcccagg gacagctatt tccagcaata tatgcttaag 960 ggcgagtatc agtactggtt tgacctggac gtgactgacc gccactcaga ttacttcgca 1020 1020 <210> 2 <211> 340 <212> PRT <213> CSFV LOM strain E2 amino acids <400> 2 Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Thr Asn 1 5 10 15 Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Glu Glu 20 25 30 Tyr Asn His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys 35 40 45 Val Ala Gly Ser Phe Lys Ile Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg 50 55 60 Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Glu Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe 65 70 75 80 Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp 85 90 95 Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys 100 105 110 Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val 115 120 125 Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro 130 135 140 Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Asp Lys Pro 145 150 155 160 Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp 165 170 175 Leu Phe Tyr Cys Asn Trp Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu 180 185 190 Pro Val Val Tyr Ala Gly Gly Leu Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly 195 200 205 Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys 210 215 220 Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp 225 230 235 240 Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Ser His Glu Cys 245 250 255 Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu 260 265 270 Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Thr Val Ser Ser Glu Gly Pro 275 280 285 Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Ala Lys Thr Leu Lys Asn 290 295 300 Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys 305 310 315 320 Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val Thr Asp Arg His Ser 325 330 335 Asp Tyr Phe Ala 340

Claims

다음을 포함하는 돼지열병바이러스(Classical swine fever virus, CSFV) 검출용 바이오 프로브:
(a) 나노물질;
(b) 상기 나노물질의 표면과 공유결합으로 연결된(covalently linked to) 돼지열병바이러스 LOM 계통(strain) E2 단백질 항원에 특이적으로 결합하는 항체; 및
(c) 상기 항체가 결합된 상기 나노물질로 표면이 개질된 고체 기질로서의 유리 섬유(glass fiber).
제 1 항에 있어서, 상기 나노물질은 폴리스티렌 나노입자인 것을 특징으로 하는 바이오 프로브.
제 1 항에 있어서, 상기 유리 섬유는 붕규산염(borosilicate) 유리섬유인 것을 특징으로 하는 바이오 프로브.
제 1 항에 있어서, 상기 고체 기질은 당(sugar) 및 계면활성제를 이용하여 상기 항체가 결합된 상기 나노물질로 표면이 개질된 것을 특징으로 하는 바이오 프로브.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 돼지열병바이러스 LOM 계통 E2 단백질은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 바이오 프로브.
다음의 단계를 포함하는 돼지열병바이러스 진단 방법:
(a) 상기 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 중 어느 한 항의 바이오 프로브에 시료를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 바이오 프로브 및 시료의 반응 결과물에 대한 광 산란(light scattering) 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 측정 결과로부터 시료 내 돼지열병바이러스 존재 여부를 분석하는 단계.