KR102557149B1 - 구제역 바이러스 혈청형 a 구조단백질에 대한 항체 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 - Google Patents
구제역 바이러스 혈청형 a 구조단백질에 대한 항체 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 구제역 바이러스 혈청형 A (김포주)에 대한 중화능 보유 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 포함하는 구제역 바이러스 혈청형 A에 대한 항체 탐지용 조성물 및 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 항체 탐지용 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 구제역 바이러스 혈청형 A (김포주)에 대한 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 혈청형 A에 대한 항체 탐지 방법 및 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 혈청형 A 항체 탐지용 키트에 관한 것이다.
구제역 바이러스 (Foot and Mouth Disease Virus; 이하, FMDV)는 Picornaviridae, aphthovirus에 속하는 RNA 바이러스로써 7종의 혈청형 (O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2, SAT3)과 70여종의 아형 바이러스가 분포하고 있다. FMDV에 감염된 개체 (예를 들어, 우제류 등)는 혀, 점막, 발굽 사이에 수포 및 가피를 형성하며 이병율이 높아 OIE에서 List A질병으로 분류하고 있고, 국내에서도 제 1종 법정 전염병으로 분류하고 있다.
국내에서는 2000년 이후 11차에 걸쳐 구제역이 발생하여 막대한 경제적 피해 (예를 들어, 2010년 안동에서 발생된 경우 직접적 피해규모 약 3조원 추정)가 초래되었으며, 일례로 2014년 12월부터 2015년 4월까지 7개 시도에서 약 185건, 2016년도 전북과 충남에서 1월 내지 3월 사이 21건의 구제역이 발생된 바 있다.
2010년도에 구제역 백신 정책이 실시된 이후로 구제역 백신에 사용되는 백신주는 국내 상황에 적합하도록 다양하게 선발되고 있으며, 2018년 하반기에 O-Campos 주 + A24 Cruzeiro주 + A Arg 2001주 (아르헨티나)와 O-Primorsky주 + A Zabaikalsky주 (러시아)가 도입되었다.
백신 접종국의 경우, 백신기반 구제역 콘트롤 프로그램에 있어서 감수성 동물(소, 돼지)에 대한 백신항체 수준 평가가 매우 중요한 항목 중 하나이다.
OIE 매뉴얼에 따르면, 구제역 구조단백질 (백신항체)항체 진단법으로 바이러스 중화시험법 (VNT, Virus Neutralization Test, 표준진단법)와 액상차단효소면역법 (LPBE) 등이 등재되어 있으나 중화시험법은 구제역바이러스 배양을 위한 BL-3등급 시설에서만 실험진행이 가능하며, 액상차단효소면역법은 불활화된 구제역 바이러스와 다클론항체를 이용한 방법으로써 실험실간 표준화가 어렵고 제한적이기 때문에 일반 실험실에서의 항체가 측정이 어렵다.
현재 국내에서는 구제역 백신주의 다변화 (A22 Iraq, A24 Cruzeiro, A Arg 2001, A Zabaikalsky)에 따른 백신별 항체수준을 검사할 수 있는 항체진단키트는 존재하지 않으며, 다국적 기업 제품(Prionics사, ID.vet사; FMDV A SP Ab ELISA)만이 국제적으로 사용하고 있으며 이러한 제품들은 소 혈청에 대한 평가만이 되어 있는 상태이다. 따라서 다변화된 구제역 백신바이러스에 따른 지역형 (topotype) 별, 축종별 항체가를 측정하는데는 한계가 있는 실정이다.
구제역 바이러스는 피코르나바이러스과 아프터바이러스 (Aphthovirus)속에 속하며, 여과성 병원체로서 처음 발견된 동물바이러스로서 소 등 우제류 동물에 감염된다. 바이러스의 입자는 직경이 22 내지 28nm이고, 외피 (envelope)가 없이 4종류의 구성 단백질 60분자로 구성된 캡시드 (Capsid)단백질이 5′말단에 VPg 단백질이 공유 결합된 외가닥의 (+)RNA를 둘러싸고 있다.
구제역바이러스는 7종의 혈청형인 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 구성되며, 혈청형 간 상호 방어 면역이 형성되지 않는다. 다시 말해서, 감수성 동물에 구제역바이러스 혈청형 A에 대한 백신을 접종하여 적정한 방어 면역이 형성되었더라도 다른 구제역바이러스 혈청형 Asia1 바이러스가 침입하게 되면 방어되지 못하고 구제역이 발생하게 된다.
또한, 혈청형이 달라서 발생하는 상기 상황뿐만 아니라 같은 혈청형 내에서도 지역형 (topotype)에 따라 백신에 의한 방어면역이 충분히 형성되지 않아 지역형에 의한 감염이 유발 될 수 있다. 이는 혈청형이 동일 하더라고 지역형에 따라 충분한 백신 방어가 형성되지 못할 수 있는 것으로써 백신주 다양화의 중요한 이유가 된다.
또한 국내에서는 소 이외에도 돼지에서도 구제역을 방어하기 위한 O+A 백신을 접종하고 항체수준을 항체진단키트로 진단하고 있기 때문에 돼지에서의 구제역 혈청형 A 항체가 측정이 중요할 수 있다.
특히, 구제역 백신이 접종된 돼지의 경우 구제역 O형 항체진단키트 상 양성으로 표현되었으나 현재 다국적기업 제품 (FMDV A SP Ab ELISA)에서는 음성으로 표현되는 위음성의 결과가 초래되고 있다. 따라서 다양한 구제역 백신주의 상용화와 다양한 축종에 따른 해당 백신의 항체 역가를 잘 표현해줄 수 있는 구제역 A형 항체진단법의 개발 및 상용화가 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 현재 국내에서 발생한 구제역 A형 (김포주)를 이용하여 중화능이 있는 단일클론항체를 개발하였으며, 이를 이용한 효소면역측정법 (ELISA,Enymne Linked Immunosorbent Assay) 등 구제역바이러스 A형에 대한 항체 진단키트에 적용하여, 다변화된 국내 백신 상황에 적합한 항체 역가 측정이 가능해 질 것으로 기대된다.
본 발명의 목적은 구제역 바이러스 (Foot and Mouth Disease Virus; 이하, FMDV) 혈청형 (serotype) A형에 대한 중화능 보유 항체 또는 그의 항원 결합단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 FMDV 혈청형 A에 대한 항체를 탐지할 수 있는 면역진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FMDV 혈청형 A에 대한 목적동물에서의 항체를 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 구제역 바이러스 혈청형 A (김포주)에 대한 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 혈청형 A에 대한 항체 탐지 방법 및 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 혈청형 A 항체 탐지용 키트에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 구제역 바이러스 (Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형 (serotype) A 김포주에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것이다.
완전한 항체는 2개의 전장 (full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나눠지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(u), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "단일클론항체"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단일클론항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.
본 발명에 있어서 단일클론항체는 수탁번호 KCTC 18845P인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 하이브리도마 세포는 불활화된 FMDV 혈청형 A (김포주, 면역원)를 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 구제역 바이러스 혈청형 A에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 100 ㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트 (Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2 내지 5주마다 2 내지 6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다. 피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3 내지 5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 골수종세포는, 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은, 예를 들어, B세포와 골수종세포를 1:1 내지 10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000 내지 6,000의 PEG를 10 내지 80%의 농도로 첨가하여, 30 내지 37 ℃에서 1 내지 10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 FMDV 혈청형 A에 대한 중화능 보유 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마는, 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
최종적으로, FMDV 혈청형 A에 대한 중화능 보유 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마는, 예를 들어, FMDV 혈청형 A에 대한 중화능 보유 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마에 대하여, 한계 희석 등의 방법에 의해 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에 있어서 단일클론항체는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM 타입일 수 있으며, 예를 들어, IgG1 타입일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 항체의 경쇄 불변 영역은 λ 또는 κ 형일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 용어 "항체 (antibody)"는 특정 항원의 특이 아미노산 서열을 특이적으로 인지하는 당단백질로써, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. 완전한 항체에 대한 설명은 상기 언급한 바와 같다.
본 발명에 있어서 용어 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 예는 구제역 바이러스 (Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형 (serotype) A형 김포주에 대한 중화능 보유 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 하이프리도마 세포는 수탁번호 KCTC 18845P인 것인 하이브리도마 세포일 수 있다.
본 발명에 있어서 하이브리도마 세포는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 2020년 9월 22일 자로 수탁번호 KCTC 18845P로 기탁하였다.
한편 기탁된 하이브라도마 세포는 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되고 상기 수탁 번호를 참조하여 일반인들에게 분양이 가능하다. 즉, 기탁물들은 기탁 시료 관리를 위한 가장 최근의 요청 이후 적어도 5년의 기간 동안, 어떤 경우에는 기탁일 이후 적어도 30년의 기간 동안 또는 그 기탁물의 개시를 공표하는 어느 특허의 강제 가능한 시기 동안, 그 기탁물의 생존을 유지하고 오염되지 않도록 모든 주의를 다하여 보관한다.
기탁자에게는 기탁물의 상태 때문에 요청 시 수탁기관이 시료를 분양할 수 없을 경우에는 그 기탁물을 대체해야 하는 의무가 있다. 대상이 되는 기탁물에 대한 일반인의 입수 가능성을 제한하는 모든 제약들은 그 기탁물을 개시하고 있는 특허가 허여되면 완전히 없어지게 된다.
본 발명에 있어서 하이브리도마 세포의 제조 방법은 상기한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 일 예는 FMDV 혈청형 A에 대한 항체 탐지 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 FMDV 혈청형 A에 대한 항체를 탐지할 수 있는 방법은 효소면역측정법을 통해 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 웰 플레이트는 FMDV 혈청형 A에 특이적으로 결합하거나 FMDV 혈청형에 상관없이 모두 결합하는 단일클론항체가 고정되어있고 그 항체 위에 구제역바이러스 혈청형 A에서 유래된 유전자로부터 발현된 재조합단백질(예를 들어, 베큘로바이러스 발현시스템을 통해 발현된 P1-3C)이 비공유결합으로 결합된 것일 수 있으며, 예를 들어, 96 웰 플레이트인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 효소결합제 (conjugate)는 FMDV 혈청형 A (김포주)에 대한 중화능 보유 단일클론항체와 효소가 공유결합 된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 단일클론항체는 수탁번호 KCTC 18845P인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체인 것일 수 있다.
본 발명에서 구제역 바이러스 진단에 사용하고 있는 효소면역측정법은 일반적으로 항원-항체 반응을 이용하여 각종 질병의 검사를 가능하게 하는 진단법으로서 특이항체 위에 항원이 코팅되어있는 96웰 플레이트와 효소가 결합되어있는 특이항체(conjugate)를 이용하여 다수의 검체로 부터 검사하고자 하는 항체를 감지할 수 있는 면역검사법의 일종이다.
본 발명의 키트는 FMDV 혈청형 A (김포주)에 대한 중화능 보유 단일클론항체를 이용하여 구제역바이러스 백신이 접종된 동물 개체에서 유래한 다양한 시료에서 FMDV 혈청형 A에 대한 항체를 더욱 정확하게 진단할 수 있게 한다.
본 발명은 구제역 바이러스 혈청형 A (김포주)에 대한 중화능 보유 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 포함하는 구제역 바이러스에 대한 항체 탐지용 조성물 및 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 항체 탐지용 키트에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이브리도마 배양액 스크리닝을 위한 효소면역측정법의 원리를 보여주는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 구제역바이러스 A형 단일클론항체들을 이용한 구제역바이러스 항체진단용 효소면역측정법의 원리를 보여주는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 단일클론항체 5A16을 이용한 구제역바이러스 A형 항체진단용 효소면역측정법 민감성 (구제역 바이러스 백신 돼지 항혈청) 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 단일클론항체 5A16을 이용한 구제역바이러스 A형 항체진단용 효소면역측정법 특이도 (구제역 비발생지역 돼지 항혈청) 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 구제역바이러스 A형 단일클론항체들을 이용한 구제역바이러스 항체진단용 효소면역측정법의 원리를 보여주는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 단일클론항체 5A16을 이용한 구제역바이러스 A형 항체진단용 효소면역측정법 민감성 (구제역 바이러스 백신 돼지 항혈청) 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 단일클론항체 5A16을 이용한 구제역바이러스 A형 항체진단용 효소면역측정법 특이도 (구제역 비발생지역 돼지 항혈청) 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 하이브리도마의 제작 및 단일클론항체 생산, 성능 평가
1-1. 면역원 준비
FMDV A (김포주, 농림축산검역본부, 대한민국)를 BHK21 세포에 접종 후 37℃에서 24시간 배양을 통해 증폭된 FMDV A (김포주)를 수거하였다. 그 다음, 바이너리 에칠렌이민 (Binary Ethylenimine; BEI)을 0.003 N 농도로 처리한 후 37 ℃에서 24시간 동안 진탕배양하여 불활화시켰다. 그 다음, 티오황산나트륨 (sodium thiosulfate) 0.002 N을 첨가하여 중화시켰다. 불활화 배양 상층액에 PEG 6000 (Poly Ethylene Glycol; PEG)과 염화나트륨 (sodium chloride; NaCl)을 각각 7.5%, 2.3% 첨가하고 24시간 동안 4 ℃에서 교반 배양 (stirring incubation)하였다. PEG 6000 처리 상층액은 11,000 RPM에서 20분간 원심 분리한 후, 펠릿을 TN 버퍼 (pH 7.6)로 다시 풀어주었다. 11,000 RPM에서 20분간 다시 원심 분리하여 상층액을 설탕 밀도 기울기 원심 분리법 (sucrose density gradient centrifugation)으로 초원심 분리 (30,000 rpm, 4시간)하여 순도 높은 FMDV A 분획을 수득하였다.
1-2. 면역화
1-1에서 수득한 불활화된 FMDV A (김포주)를 이용하여 실험동물 (balb/c mouse)에 면역 (immunization)을 실시하였다. 구체적으로, 항원으로서 불활화 FMDV A (김포주)를 0.25 mg/ml 농도로 200 ul 준비하고 Freund's Adjuvant (FA) 200 ul와 혼합하여 마우스(㈜오리엔트바이오) 복강에 2주 간격으로 1 내지 3차 면역을 실시하였다. 퓨전 면역 검사를 위해 3차 면역 1주 후, 마우스 혈청을 이용하여 간접(indirect) ELISA 검사를 실시하였다. 최종 부스팅을 위해 불활화 FMDV A (김포주) 100 ul를 복강으로 면역하고 4일 후 세포융합에 사용하였다.
1-3. 세포융합 및 하이브리도마 제조
면역화된 마우스 몸통 좌측에 위치한 비장 (spleen)을 적출하여 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 부유시켰다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양배지 DMEM과 혼합하여 비장세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음, 상기 현탁액을 1,200 rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 비장세포와 골수세포주(SP2/0 Ag14 (ATCC, USA))를 1:5의 세포 수 비율로 혼합한 후, 1,200rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 세포를 침전시켜 상층액은 제거하였다. 원심 분리된 세포를 천천히 분산시킨 후 폴리에틸렌 글리콜 1500 (PEG1500, Roche) 1.0 ml을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후 DMEM 1ml을 첨가하였다. 그 다음, DMEM 10 ml을 1분 동안 서서히 첨가하고, 37 ℃의 물에서 5분 동안 반응시킨 후 50.0 ml로 맞추고, 1,200rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 세포침전물을 분리배지 (HAT배지)에 1 X 105 내지 2 X 105 cells/ml 농도로 재현탁시키고, 96웰 플레이트에 0.1 ml씩 분주한 후 37 ℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포를 제조하였다.
1- 4. 하이브리도마 세포의 선별
상기 제조한 하이브리도마 세포군 중에서 FMDV 혈청형 A에 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여, 도 1과 같이 ELISA 분석 방법을 사용하였다.
구체적으로, 목적으로 하는 불활화 FMDV 혈청형 O, A 을 96웰 마이크로플레이트의 한 웰당 각각 100 ul(1 ug/ml)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 그 다음, 0.1% casein-PBS blocking 용액을 웰 당 100 ul씩 분주한 후 37 ℃에서 2 시간 동안 반응 후 인산 완충용액-트윈20(0.05% tween-20 (v/v)이 포함되어있는 인산완충용액, pH 7.4)(이하 PBS-T)로 3회 세척하였다.
그 다음, 하이브리도마 세포의 배양액을 각 웰에 100 ul씩을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, PBS-T 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스레디쉬 퍼옥시다제 (Goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBS-T로 3회 세척하였다. 세척한 후 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 가하여 반응시키고, 황산 0.5 M를 플레이트 각 웰에 50 ul씩 분주한 뒤 Sunrise ELISA reader(Tecan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 목적으로 하는 FMDV 혈청형 A에 반응성이 높고 FMDV 혈청형 O에 반응성이 적은 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 선별하였다.
선별된 하이브리도마 세포주를 제한 희석하여 클로닝을 진행하여 단일클론화 하였고, 이후 위와 같은 방법으로 목적 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다. 위와 같은 방법으로 불활화 FMDV 혈청형 A에 특이적으로 반응하는 3종의 단일클론항체가 선발되었으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
| No | Clone name | Isotype | FMDV A (김포주) 불활화바이러스 항원 |
FMDV O (진천주) 불활화바이러스 항원 |
| O.D450 | O.D450 | |||
| 1 | 5H56 | IgG1, k | 1.62 | 0.24 |
| 2 | 5H68 | IgG1, k | 1.49 | 0.08 |
| 3 | 5A16 | IgG1, k | 1.37 | 0.28 |
표 1에서 확인할 수 있듯이, 불활화 구제역 바이러스 A형 항원에 특이적으로 반응하고, 면역 글로불린 아형 IgG1인 단일클론항체 5A16를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 선발하여 2020년 9월 22일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC 18845P를 받았다.
1-5. 복수제작 및 단일클론항체 정제
FMDV 혈청형 A에 특이적으로 반응하는 3종 하이브리도마를 이용하여 생산된 복수 (ascitic fluids)를 0.45um 여과 후 프로테인 G 컬럼 (GE, Sweden)에 바인딩시켰으며, 용출 버퍼 (100mM glycin HClr, pH 2.8)를 이용하여 단일클론항체만 용출한 후, 투석 (MWCO 12,000 내지 14,000)을 통해 PBS (pH 7.0)로 버퍼 교환하였다. 정제된 단일클론항체는 -70℃ 에 보관하였다.
실시예 2. 구제역바이러스 A형 항체진단용 효소면역측정법 반응성 분석
2-1. 96 웰 플레이트에 구제역 재조합 항원 부동화 (immobilization)
구제역 바이러스에 공통으로 반응하는 기존의 70.17 단일클론항체를 96웰 마이크로플레이트의 한 웰 당 각각 100 ul씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 단일클론항체는 인산 완충용액-트윈20 (0.05% tween-20 (v/v)이 포함되어있는 인산완충용액, pH 7.4)(이하 PBS-T)으로 세척하여 제거하였다. 3% BSA-PBS 블로킹 용액을 웰 당 200 ul씩 분주한 후 상온에서 2 시간 동안 반응 후, PBS-T로 3회 세척하였다. 구제역 재조합 A형 항원 (원액)을 웰 당 100 ul씩 분주한 후 37 ℃에서 1시간 동안 반응 후, 반응하지 않은 항원은 PBS-T로 세척하였다.
2-2. 효소-단일클론항체 컨쥬게이트 제조
상용화 HRP 컨쥬게이트 키트 (Roche, cat. no. 11 829 696 001)를 이용하여 사용자 메뉴엘에 따라 HRP 커플링을 수행하였다.
2-3. 검체 희석버퍼 (specimen dilution buffer)
혈청을 희석하기 위한 검체 희석버퍼는 PBS-T를 사용하였다.
2-4. 효소면역측정법 반응성 시험
구제역 재조합 항원이 원액 농도로 코팅되어있는 96웰 마이크로 플레이트에, 구제역 바이러스 백신을 맞은 돼지, 소 항혈청과 구제역 비발생지역 돼지 항혈청 20 uL와 검체 희석버퍼 80 uL를 섞어, 각 웰에 100 ul씩을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그 다음, PBS-T 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 항혈청을 제거하였다. 여기에 효소-단일클론항체 컨쥬게이트를 다양한 농도 (0.2ug/ml)로 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그 다음, PBS-T로 3회 세척하였다. 세척한 후 퍼옥시다제의 기질용액 (TMB)을 가하여 반응시키고, 황산 0.5 M를 플레이트 각 웰에 50 ul씩 분주하였다. 그 다음, Sunrise ELISA reader (Tecan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 항원에 대한 반응성 측정하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
| Antigen | FMDV Type A (A22 Iraq주) 재조합단백질 항원 | FMDV Type A (김포주) 재조합단백질 항원 |
||||
| mAb clone | 5H56 | 5H68 | 5A16 | 5H56 | 5H68 | 5A16 |
| Sample | O.D450 | O.D450 | O.D450 | O.D450 | O.D450 | O.D450 |
| Type O/A/Asia1 Vaccine Positive (Merial 3가; Swine) |
0.269 | 0.260 | 0.461 | 0.877 | 0.933 | 0.146 |
| Type A Vaccine Positive (Merial 1가; Bovine) |
0.334 | 0.350 | 0.244 | 1.677 | 1.661 | 0.494 |
| Type O/A Vaccine Positive (Merial 2가; Swine) | 0.164 | 0.176 | 0.147 | 0.684 | 0.778 | 0.204 |
| Negative 1 (Swine) | 1.027 | 1.153 | 0.904 | 2.020 | 2.453 | 1.109 |
| Negative 2 (Swine) | 1.052 | 1.137 | 0.821 | 2.172 | 2.285 | 0.979 |
| Negative 3 (Swine) | 1.238 | 1.219 | 0.917 | 1.995 | 2.019 | 1.057 |
| NC | 1.159 | 1.268 | 1.065 | 2.191 | 2.347 | 1.279 |
표 2에서 확인할 수 있듯이 FMDV Type A (김포주, Iraq주) 재조합단백질 항원과 5H56, 5H68 단일클론항체의 반응성은 5A16 단일클론항체보다 blocking능이 덜 한 것으로 확인되어 5A16 단일클론항체가 3가지 항체 중 가장 구제역바이러스 A형 항체진단용에 알맞은 것으로 파악되었다.
실시예 3. 구제역바이러스 항체에 효소면역측정법 민감성 및 특이도 평가
구제역 재조합 A형 항원이 원액으로 coating 되어있는 96웰 마이크로플레이트에 구제역 바이러스 백신을 맞은 돼지 항혈청과 구제역 비발생지역의 돼지 항혈청 (특이성 검증용 시료) 각 20 ul과 검체 희석버퍼 80 ul를 섞어 각 웰에 100 ul을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, PBS-T 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 검체를 제거하였다. 여기에 효소-단일클론항체 5A16 컨쥬게이트를 0.1ug/ml 농도로 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBS-T로 3회 세척하였다. 세척한 후 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 가하여 반응시키고, 황산 0.5 M를 플레이트 각 웰에 50 ul씩 분주한 뒤 Sunrise ELISA reader(Tecan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 항원에 대한 반응성 측정하여, 그 결과를 표 3 및 도 3 (구제역백신 돼지 항혈청 평가결과)과 표 4 및 도 4 (구제역 비발생지역 돼지 항혈청 평가결과)에 나타내었다.
| ELISA Kit | 단클론항체 5A16 항체 이용 Kit | 타사키트(Prionics사) | |||
| 축종 | Sample | OD | S/N | OD | S/N |
| 돼지 | 1 | 0.276 | 0.16 | 1.102 | 0.56 |
| 2 | 0.107 | 0.06 | 1.752 | 0.90 | |
| 3 | 0.394 | 0.23 | 1.058 | 0.54 | |
| 4 | 0.526 | 0.31 | 0.613 | 0.31 | |
| 5 | 0.631 | 0.37 | 0.645 | 0.33 | |
| 6 | 0.233 | 0.14 | 1.008 | 0.52 | |
| 7 | 0.242 | 0.14 | 0.635 | 0.33 | |
| 8 | 0.395 | 0.23 | 0.454 | 0.23 | |
| 9 | 0.234 | 0.14 | 0.778 | 0.40 | |
| 10 | 0.140 | 0.08 | 1.107 | 0.57 | |
| 11 | 0.268 | 0.16 | 0.992 | 0.51 | |
| 12 | 0.095 | 0.06 | 0.465 | 0.24 | |
| 13 | 0.097 | 0.06 | 0.588 | 0.30 | |
| 14 | 0.174 | 0.10 | 0.932 | 0.48 | |
| 15 | 0.612 | 0.36 | 0.698 | 0.36 | |
| 16 | 0.161 | 0.09 | 0.746 | 0.38 | |
| 17 | 1.048 | 0.62 | 0.970 | 0.50 | |
| 18 | 0.455 | 0.27 | 0.868 | 0.45 | |
| 19 | 0.290 | 0.17 | 0.621 | 0.32 | |
| 20 | 0.120 | 0.07 | 1.771 | 0.91 | |
| 21 | 0.257 | 0.15 | 0.454 | 0.23 | |
| 22 | 0.294 | 0.17 | 1.101 | 0.56 | |
| 23 | 0.626 | 0.37 | 1.011 | 0.52 | |
| 24 | 0.281 | 0.16 | 1.040 | 0.53 | |
| 25 | 0.437 | 0.26 | 0.743 | 0.38 | |
| 26 | 0.140 | 0.08 | 0.984 | 0.50 | |
| 27 | 0.879 | 0.52 | 1.604 | 0.82 | |
| 28 | 0.132 | 0.08 | 1.111 | 0.57 | |
| 29 | 0.273 | 0.16 | 1.056 | 0.54 | |
| 30 | 0.168 | 0.10 | 1.189 | 0.61 | |
| 31 | 0.618 | 0.36 | 0.934 | 0.48 | |
| 32 | 0.384 | 0.23 | 0.538 | 0.28 | |
| 33 | 0.515 | 0.30 | 0.564 | 0.29 | |
| 34 | 0.376 | 0.22 | 0.356 | 0.18 | |
| 35 | 0.544 | 0.32 | 1.342 | 0.69 | |
| 36 | 0.190 | 0.11 | 1.111 | 0.57 | |
| 37 | 0.190 | 0.11 | 0.625 | 0.32 | |
| 38 | 0.164 | 0.10 | 0.779 | 0.40 | |
| 39 | 0.154 | 0.09 | 0.893 | 0.46 | |
| 40 | 0.148 | 0.09 | 1.363 | 0.70 | |
| 41 | 0.174 | 0.10 | 1.001 | 0.51 | |
| 42 | 0.182 | 0.11 | 0.954 | 0.49 | |
| 43 | 0.449 | 0.26 | 0.826 | 0.42 | |
| 44 | 0.485 | 0.28 | 0.473 | 0.24 | |
| 45 | 0.150 | 0.09 | 0.846 | 0.43 | |
| 46 | 0.209 | 0.12 | 0.840 | 0.43 | |
| 47 | 0.102 | 0.06 | 0.779 | 0.40 | |
| 48 | 0.209 | 0.12 | 0.767 | 0.39 | |
| 49 | 0.282 | 0.17 | 0.848 | 0.43 | |
| 50 | 0.565 | 0.33 | 0.659 | 0.34 | |
| 51 | 0.371 | 0.22 | 0.572 | 0.29 | |
| 52 | 0.715 | 0.42 | 0.890 | 0.46 | |
| 53 | 0.776 | 0.46 | 1.074 | 0.55 | |
| 54 | 0.197 | 0.12 | 1.169 | 0.60 | |
| 55 | 0.699 | 0.41 | 0.992 | 0.51 | |
| 56 | 0.300 | 0.18 | 0.620 | 0.32 | |
| 57 | 0.357 | 0.21 | 0.692 | 0.36 | |
| 돼지 | 58 | 0.909 | 0.53 | 0.705 | 0.36 |
| 59 | 0.133 | 0.08 | 1.038 | 0.53 | |
| 60 | 0.144 | 0.08 | 1.095 | 0.56 | |
| 61 | 0.331 | 0.19 | 0.754 | 0.39 | |
| 62 | 0.212 | 0.12 | 0.880 | 0.45 | |
| 63 | 0.338 | 0.20 | 1.220 | 0.63 | |
| 64 | 0.205 | 0.12 | 0.924 | 0.47 | |
| 65 | 0.496 | 0.29 | 0.636 | 0.33 | |
| 66 | 0.205 | 0.12 | 0.879 | 0.45 | |
| 67 | 0.138 | 0.08 | 1.172 | 0.60 | |
| 68 | 0.415 | 0.24 | 0.765 | 0.39 | |
| 69 | 0.484 | 0.28 | 1.080 | 0.55 | |
| 70 | 0.194 | 0.11 | 0.833 | 0.43 | |
| 71 | 0.333 | 0.20 | 0.481 | 0.25 | |
| 72 | 0.350 | 0.21 | 0.793 | 0.41 |
| ELISA Kit | 단클론항체 5A16 항체 이용 Kit | ||
| 축종 | Sample | OD | S/N |
| 돼지 | S01 | 0.805 | 1.08 |
| S02 | 0.866 | 1.16 | |
| S03 | 0.848 | 1.14 | |
| S04 | 0.923 | 1.24 | |
| S05 | 0.826 | 1.11 | |
| S06 | 0.766 | 1.03 | |
| S07 | 0.775 | 1.04 | |
| S08 | 0.806 | 1.08 | |
| S09 | 0.652 | 0.88 | |
| S10 | 0.894 | 1.20 | |
| S11 | 0.884 | 1.19 | |
| S12 | 0.869 | 1.17 | |
| S13 | 0.798 | 1.07 | |
| S14 | 0.815 | 1.09 | |
| S15 | 0.754 | 1.01 | |
| S16 | 0.826 | 1.11 | |
| S17 | 0.774 | 1.04 | |
| S18 | 0.756 | 1.01 | |
| S19 | 0.848 | 1.14 | |
| S20 | 0.868 | 1.17 | |
| S21 | 0.770 | 1.03 | |
| S22 | 0.772 | 1.04 | |
| S23 | 0.784 | 1.05 | |
| S24 | 0.834 | 1.12 | |
| S25 | 0.803 | 1.08 | |
| S26 | 0.831 | 1.12 | |
| S27 | 0.835 | 1.12 | |
| S28 | 0.844 | 1.13 | |
| S29 | 0.771 | 1.04 | |
| S30 | 0.762 | 1.02 | |
| S31 | 0.810 | 1.09 | |
| S32 | 0.811 | 1.09 | |
| S33 | 0.832 | 1.12 | |
| S34 | 0.879 | 1.18 | |
| S35 | 0.933 | 1.25 | |
| S36 | 0.911 | 1.22 | |
| S37 | 0.742 | 1.00 | |
| S38 | 0.809 | 1.09 | |
| S39 | 0.732 | 0.98 | |
| S40 | 0.846 | 1.14 | |
| S41 | 0.776 | 1.04 | |
| S42 | 0.836 | 1.12 | |
| S43 | 0.843 | 1.13 | |
| S44 | 0.836 | 1.12 | |
| S45 | 0.805 | 1.08 | |
| S46 | 0.764 | 1.03 | |
| S47 | 0.814 | 1.09 | |
| S48 | 0.836 | 1.12 | |
| S49 | 0.884 | 1.19 | |
| S50 | 0.826 | 1.11 | |
| S51 | 0.812 | 1.09 | |
| S52 | 0.893 | 1.20 | |
| S53 | 0.802 | 1.08 | |
| S54 | 0.814 | 1.09 | |
| S55 | 0.817 | 1.10 | |
| S56 | 0.792 | 1.06 | |
| S57 | 0.844 | 1.13 | |
| 돼지 | S58 | 0.831 | 1.12 |
| S59 | 0.852 | 1.14 | |
| S60 | 0.859 | 1.15 | |
| S61 | 0.775 | 1.04 | |
| S62 | 0.802 | 1.08 | |
| S63 | 0.776 | 1.04 | |
| S64 | 0.847 | 1.14 | |
| S65 | 0.806 | 1.08 | |
| S66 | 0.808 | 1.09 | |
| S67 | 0.782 | 1.05 | |
| S68 | 0.905 | 1.22 | |
| S69 | 0.776 | 1.04 | |
| S70 | 0.764 | 1.03 | |
| S71 | 0.782 | 1.05 | |
| S72 | 0.836 | 1.12 | |
| S73 | 0.786 | 1.06 | |
| S74 | 0.849 | 1.14 | |
| S75 | 0.853 | 1.15 | |
| S76 | 0.956 | 1.28 | |
| S77 | 0.816 | 1.10 | |
| S78 | 0.841 | 1.13 | |
| S79 | 0.828 | 1.11 | |
| S80 | 0.906 | 1.22 | |
| S81 | 0.886 | 1.19 | |
| S82 | 0.879 | 1.18 | |
| S83 | 0.947 | 1.27 | |
| S84 | 0.947 | 1.27 | |
| S85 | 0.865 | 1.16 | |
| S86 | 0.840 | 1.13 | |
| S87 | 0.796 | 1.07 | |
| S88 | 0.861 | 1.16 | |
| S89 | 0.918 | 1.23 | |
| S90 | 0.886 | 1.19 | |
| S91 | 0.944 | 1.27 | |
| S92 | 0.962 | 1.29 |
표 3 내지 표 4 및 도 3 내지 도 4에서 확인할 수 있듯이, 5A16을 이용한 항체 효소면역측정법은 구제역 바이러스 백신을 맞은 돼지 항혈청에서 타사키트보다 블로킹 능이 높았으며, 구제역 비발생지역의 돼지 항혈청과는 반응하지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 단일클론항체 5A16의 특이 항원 결정부위 분석
5A16 단일클론항체의 항원 결정부위를 확인하기 위하여 구제역 바이러스 A형 VP1 항원 부위를 오브알부민이 결합된 합성펩타이드로 제작하여 ELISA 분석 방법을 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 목적으로 하는 FMDV 혈청형 A 합성 펩타이드를 96웰 마이크로 플레이트의 한 웰당 각각 100 ul (8 ug/ml)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 그 다음, 0.1% casein-PBS blocking 용액을 웰 당 100 ul씩 분주한 후 37 
에서 2 시간 동안 반응 후, 인산 완충용액-트윈20 (0.05% tween-20 (v/v)이 포함되어있는 인산완충용액, pH 7.4)(이하 PBS-T)로 3회 세척하였다. 그 다음, 정제된 단일클론항체 5A16를 각 웰에 100 ul (1ug/ml)씩을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, PBS-T 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스레디쉬 퍼옥시다제 (Goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBS-T로 3회 세척하였다. 세척한 후 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 가하여 반응시켰다. 그 다음, 황산 0.5 M를 플레이트 각 웰에 50 ul씩 분주한 뒤 Sunrise ELISA reader (Tecan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여, 5A16 단일클론항체와 FMDV A VP1 펩타이드 항원과의 반응성 결과를 표 5에 나타내었다.
FMDV A VP1 펩타이드 (구제역 바이러스 VP1 A형 펩타이드, FMDV A/GP/SKR/2018)의 서열은 PGNRRGDSGPLVVKPATQLPA (서열번호 1)이다.
| No | Clone name | FMDV A (김포주) VP1 합성펩타이드 항원 | OVA 항원 |
| O.D450 | O.D450 | ||
| 1 | 5A16 | 1.483 | 0.047 |
표 5에서 확인할 수 있듯이, 단일클론항체 5A16는 구제역 바이러스 A형의 VP1의 특정 항원 부위에 반응하는 것을 확인하였다.
Claims (9)
- 수탁번호 KCTC 18845P인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것인, 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형 (serotype) A 김포주를 중화시킬 수 있는 단일클론항체.
- 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 IgG1 타입인 것인, 단일클론항체.
- 삭제
- 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형 (serotype) A 김포주에 대한 중화능 보유 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 18845P인 하이브리도마 세포.
- 삭제
- 수탁번호 KCTC 18845P인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것인, 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형 (serotype) A 김포주에 대한 중화능 보유 단일클론항체를 포함하는 FMDV 혈청형 A형 항체 탐지용 면역진단키트.
- 삭제
- 수탁번호 KCTC 18845P인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것인, 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형 (serotype) A 김포주를 중화시킬 수 있는 단일클론항체를 이용한 FMDV 혈청형 A에 대한 항체 탐지 방법.
- 삭제
Priority Applications (1)
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| KR1020200139481A KR102557149B1 (ko) | 2020-10-26 | 2020-10-26 | 구제역 바이러스 혈청형 a 구조단백질에 대한 항체 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020200139481A KR102557149B1 (ko) | 2020-10-26 | 2020-10-26 | 구제역 바이러스 혈청형 a 구조단백질에 대한 항체 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 |
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| KR1020200139481A KR102557149B1 (ko) | 2020-10-26 | 2020-10-26 | 구제역 바이러스 혈청형 a 구조단백질에 대한 항체 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 |
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-
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- 2020-10-26 KR KR1020200139481A patent/KR102557149B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 비특허문헌 1: VIROLOGY JOURNAL. 2016* |
Also Published As
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| KR20220055224A (ko) | 2022-05-03 |
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