KR20200144067A - 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아프리카 돼지열병 바이러스의 P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체에서 분리된 아프리카 돼지열병 바이러스의 P32 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지열병 진단용 조성물 및 키트 등에 관한 것이다.

Description

아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도 {Recombinant vectors for the preparation of antigens for diagnosis of African swine fever and uses thereof}
본 발명은 아프리카 돼지열병(African swine fever, ASF) 진단용 항원 P32 단백질 생산용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 및 상기 형질전환체에서 분리된 ASF 바이러스의 P32 단백질을 포함하는 아프리카 돼지열병 진단용 조성물 및 키트 등에 관한 것이다.
아프리카 돼지열병(African swine fever, ASF)은, 아스파바이러스과(Asfarviridae)에 속하는 아프리카 돼지열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV) 감염에 의한 돼지 전염병으로, 1921년 케냐에서 최초 보고가 있은 후, 주로 사하라 이남지역에서 발생보고가 있었고, 2007년 이후로 흑해연안인 죠지아, 아르메니아, 아제르바이잔 등 아프리카 이외 지역에서 그 발생 범위가 늘어나기 시작하였다. 특히 최근에는 우리나라와 교류가 많은 러시아 내에서 동서로 그 발생이 확산되고 있다. 아프리카 돼지열병은 돼지에 감염시 폐사율이 100%에 이르고, 이 질병에 대한 백신이 개발되어 있지 않아 발생 즉시 처분해야 하는 위험도가 높은 전염병으로 진단이 매우 중요하다.
아프리카 돼지열병 바이러스 특이 단백질 중에는 P15, P35, P72, P54, 및 P30 등이 항원성이 높은 것으로 알려져, 진단 후보군으로 고려되고 있다. 현재 아프리카 돼지열병 바이러스 항체를 이용한 진단용 키트는 생산된 바 없으며, 외국의 경우 P30 재조합 단백질을 이용한 항체진단키트(SVANOVIR 사) 등이 상업화되어 사용되고 있다.
한편, 분자생물학과 유전공학 기술의 눈부신 발달은 식물 분야에도 적용되어 식물체로부터 유용 생리활성 물질을 생산하려는 노력들이 꾸준히 이어지고 있다. 식물에서 유용 물질을 생산하는 것은 생산 단가를 현저히 감소시킬 수 있으며, 종래 대중적 방법(동물세포 또는 미생물에서 단백질을 합성하여 분리 정제하는 방법)에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원(바이러스, 암유전자, 장독소 등)을 원천 배제할 수 있을 뿐만 아니라, 상품화 단계에서도 동물세포나 미생물과는 달리 종자로 종묘(seed stock) 관리가 가능하다는 점에서 유리한 이점을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 아프리카 돼지열병 청정국을 유지하고 질병의 유입에 대비하기 위한 신속한 아프리카 돼지열병 항원 진단법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 아프리카 돼지열병 바이러스 특이 단백질 중 P32 재조합 단백질을 식물체에서 높은 효율로 발현시킬 수 있는 시스템을 개발하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
KR 10-1663963 B1
아프리카 돼지열병 바이러스는 감염 세포의 세포질을 복제하는 거대 이중 나선 DNA 바이러스이다. 이 바이러스는 돼지에게 폐사율이 높은 출혈열을 야기하면서도 질병의 징후 없이 매개체 구실을 할 법한 자연적 숙주 돼지, 혹멧돼지, 강멧돼지, 연진드기과에 속하는 물렁진드기(Ornithodoros) 속을 지속적으로 감염시킨다. 이 바이러스는 돼지에게 치명적인 출혈열을 발생시키기 때문에 조기에 진단하는 것이 매우 중요하다.
본 발명은 상기와 같은 아프리카 돼지열병의 감염이 의심되는 개체를 신속하게 진단할 필요성 및 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로, 식물체를 이용하여 효율적인 생산이 가능할 뿐만 아니라, 진단 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)가 높은 재조합 아프리카 돼지열병 바이러스 항원, 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 진단용 조성물 또는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 아프리카 돼지열병 바이러스 항원을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 아프리카 돼지열병 진단 방법, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 재조합 항원의 제조 방법 및 상기 재조합 단백질을 포함하는 아프리카 돼지열병 진단용 조성물의 제조 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 아프리카 돼지열병(African swine fever) 바이러스 P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 식물체에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 BiP(chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 4의 폴리히스티딘(polyhistidine)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 6의 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환체는 식물체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 재조합 단백질을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 재조합 단백질의 아프리카 돼지열병 진단 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 아프리카 돼지열병의 진단에 이용되는 제제를 생산하기 위한 용도로서 상기 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 수용성일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 아프리카 돼지열병 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 아프리카 돼지열병 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 인간을 제외한 동물에서 유래한 생물학적 시료 내에서 항원-항체 반응을 통해 아프리카 돼지열병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병 진단 방법 또는 아프리카 돼지열병 결정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및 (b) 상기 식물체로부터 재조합 항원을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 재조합 항원의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; (b) 상기 식물체로부터 재조합 항원을 분리 및 정제하는 단계; 및 (c) 상기 분리·정제된 재조합 항원을 이용하여 진단용 조성물 또는 진단용 키트를 제조하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병 진단용 조성물 또는 키트의 제조 방법을 제공한다.
아프리카 돼지열병을 포함한 바이러스성 질병의 진단 및 예방에 이용하기 위한 단백질, 특히 항원은 단백질의 접힘(folding), 당화과정(glycosylation) 등의 문제로 인하여 박테리아를 이용하지 못하고, 주로 동물세포를 이용하여 생산되고 있다. 그러나 동물세포를 이용한 백신 생산 방법은 대량 생산을 위한 설비 확충에 큰 비용이 소요되기 때문에 제조가 용이하지 않고, 항원의 가격이 고가인 경우가 대부분이다. 또한, 동물세포를 이용하여 제조된 항원들은 저장이 용이하지 않을 뿐만 아니라, 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 높다는 단점을 가지고 있다. 그러나 본 발명은 식물을 이용하여 이러한 단점을 보완하였다. 즉 식물세포는 동물세포와 달리 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 매우 낮고, 경작 면적만 확보되면 언제든지 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라, 식물체를 통하여 장기 보관이 가능하기 때문에, 안정적으로 저렴한 항원의 생산이 가능하다.
본 발명의 재조합 아프리카 돼지열병 바이러스 항원은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 수용해성(Water solubility)을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 또한, 아프리카 돼지열병 바이러스에 대한 높은 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 나타내므로 다양한 분야에 폭넓게 사용 가능할 것으로 기대된다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 단백질을 이용하여 아프리카 돼지열병을 진단할 수 있는 조성물 또는 키트를 제작할 수 있고, 따라서 아프리카 돼지열병에 감염된 개체를 조기에 진단할 수 있어 질병의 확산 방지에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 항원의 발현을 위한 유전자의 배열을 나타낸 개열지도이다(NB, new chaperone binding protein; 6xHis, 폴리히스티딘 태그; HDEL, ER retention signal).
도 2는 식물체에서 P32 항원을 발현시킨 후, 분리정제하여 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다(T, Total extract; S, Supernatant 분획; P, Pellet 분획).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 항원을 발현시킨 후, 이의 순도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 조성물을 포함하는 아프리카 돼지열병에 대한 항체혈청진단키트를 제작하고, 스페인의 아프리카 돼지열병 표준 실험실에서 제공하는 혈청을 이용하여 상기 항체혈청진단키트의 반응성 및 민감도를 시험한 결과를 나타낸 도면이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 아프리카 돼지열병(African swine fever) 바이러스 P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 식물체에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
상기 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 단백질은 감염성 사이클의 초기 단계에서 바이러스의 내재화에 관여한다고 알려져 있다.
또한, 상기 P32 단백질은 서열번호 1의 염기서열에 의해 코딩되거나, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 본 발명의 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 단백질을 코딩하는 염기서열은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “폴리뉴클레오티드”는 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한, 일반적으로 인산이에스테르 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들면 뉴클레오티드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 “골격” 결합, 예를 들면 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합(펩타이드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)뿐만 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 BiP(Chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 6개의 연속된 히스티딘(폴리히스티딘. polyhistidine)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에 위치할 수 있고, 상기 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HDEL 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “재조합 벡터(recombinant vector)”란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 목적 항원(본 발명에서는, 아프리카 돼지열병 항원 P32)을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 “벡터”는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, “복제 단위”란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 BiP 유전자, 히스-태그(His-tag, 최소 6개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노산 모티프), 소포체 신호 펩타이드(endoplasmic reticulum signal peptide, 소포체 표적화 서열과 같은 의미) 유전자, 클로닝 사이트(cloning site) 등을 추가로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 “유전자(도 1에서는 NB로 표시)”는, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 유전자이고 가장 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 유전자이나, 서열번호 3의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 BiP 유전자는 재조합 단백질이 발현될 때 서열 일부가 잘려나가 일부 아미노산만이 남을 수도 있다.
상기 “클로닝 사이트”란 벡터 내에서 각 유전자를 연결/구분하는 것을 목적으로 삽입된 것을 총칭한다.
상기 “소포체 신호 펩타이드(ER 신호 서열)”는 당업자에게 알려진 식물 소포체 신호 펩타이드라면 그 종류 및 아미노산 서열이 제한되지 않으며, 예를 들어 US 2013/0295065, WO 2009/158716 등의 문헌을 참고로 할 수 있다. 본 발명에서 상기 “소포체 신호 펩타이드”는 바람직하게는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu, 서열번호 7로 표시되는 폴리펩타이드)일 수 있으며, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 소포체 신호 펩타이드는 서열번호 6의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 6의 염기서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 소포체 신호 펩타이드의 결합 위치는 식물세포 내에서 발현 또는 합성을 목적으로 하는 단백질의 C-말단에 추가(또는 연결)되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 폴리히스티딘-태그 외에 이용 가능한 태그용 유전자는 일례로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있으며, 상기 IgG-Fc 태그는 인간, 쥐, 토끼 또는 돼지로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 선별용 마커 유전자에는, 일례로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 일례로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 일례로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 포함될 수 있으나, 상기 열거한 것들은 예시일 뿐 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 프로모터 유전자, BiP(new chaperone binding protein; NB) 신호 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 순서로 연결될 수 있다.
상기와 같은 순서에 의해 연결된 경우, 즉 도 1의 개열지도에 나타난 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 서열번호 8의 염기서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어지나, 서열번호 8의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 효모 등과 같은 미생물, 곤충 세포, 인간을 포함한 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소 등과 같은 동물, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 및 유채를 포함하는 특용작물류; 및 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 및 튤립을 포함 하는 화훼류 등일 수 있으나, 본 발명의 벡터로 형질전환될 수 있는 생명체라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “형질전환(transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체(transgenic organism)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아크로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “식물”은 본 발명의 항원을 포함하는 단백질을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 구체적으로는 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 Nicotiana benthamiana L. 또는 Nicotiana tabacum cv. xanthi 등의 품종을 이용할 수 있다.
상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기충격법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스의 P32 재조합 단백질(항원)을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 P32 재조합 단백질(항원)은 수용성일 수 있다. 보다 구체적으로, 식물체에서 발현된 재조합 P32 단백질은 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 수용성 분획에 용해되어 있는 것일 수 있다.
또한 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 P32 재조합 단백질(항원)은 90% 이상의 순도로 분리·정제될 수 있다. 보다 구체적으로, 식물체에서 발현된 재조합 P32 단백질은 통상의 분리·정제 방법을 이용하였을 때, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도의 재조합 P32 단백질을 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스의 P32 재조합 단백질(항원)을 유효성분으로 포함하는, 아프리카 돼지열병 진단용 조성물 또는 진단키트를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “진단”은 병리 상태의 존재 또는 발명 가능성을 확인하는 것을 의미한다. 그 중에서도 본 발명은 특히 아프리카 돼지열병의 진단에 유용하다. 본 발명의 재조합 벡터에 의해 생산된 P32 항원을 이용하면, 아프리카 돼지열병에 감염된 개체의 체내에서 생산되는 특정 항체를 검출할 수 있다. 즉, P32 항원은 아프리카 돼지열병을 진단하는데 유용한 지표(진단 마커)로 사용될 수 있다.
본 명세서에 있어서, “항원(antigen)”이란 체내에서 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 총칭하며, 바람직하게는 바이러스, 화합물질, 세균, 꽃가루, 암세포 등 또는 이들의 일부 펩타이드 또는 단백질이나, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 인간을 제외한 동물에서 유래한 생물학적 시료 내에서 항원-항체 반응을 통해 아프리카 돼지열병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및 (b) 상기 식물체로부터 재조합 항원을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 재조합 항원의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; (b) 상기 식물체로부터 재조합 항원을 분리 및 정제하는 단계; 및 (c) 상기 분리·정제된 재조합 항원을 이용하여 진단용 조성물 또는 진단용 키트를 제조하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병 진단용 조성물 또는 키트의 제조 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 아프리카 돼지열병 바이러스의 P32 항원을 발현하는 재조합 벡터의 제조
도 1의 개열지도와 같이 식물체에서 아프리카 돼지열병 바이러스 항원 P32 단백질(감염성 사이클의 초기 단계에서 바이러스의 내재화에 관여한다고 알려진)을 발현시킬 수 있도록 재조합한 식물 발현 벡터를 제작하였다. 보다 자세하게는, 아프리카 돼지열병 바이러스의 P32 단백질에 대한 유전자 정보를 확보하고, 식물체에서의 발현에 최적화된 서열로 P32 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1)를 합성하였다.
구체적으로, pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터(promoter) 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 BiP(chaperone binding protein) 신호 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 3), 아프리카 돼지열병 바이러스의 P32 항원 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 1), 6개의 연속된 히스티딘(Histidine)으로 구성된 히스-태그(His-tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 6)를 순서대로 연결하여 아프리카 돼지열병 바이러스의 P32 단백질의 식물 발현 벡터를 제작하였다.
실시예 2: P32 항원의 발현 및 확인
2.1. 식물발현 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 항원 벡터의 일과성 발현(Transient expression)
상기 실시예 1에서 준비한 식물발현 벡터를 아그로박테리(Agrobacterium) LBA4404 균주에 전기충격법(electrophoration)을 이용하여 형질전환 시켰다. 형질전환된 아그로박테리아를 5 mL의 YEP 액체배지(효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 리팜피신 25 mg/L)에서 28℃의 조건으로 16시간 동안 진탕배양한 후 1차 배양액 1 mL을 50 mL의 새 YEP 배지에 접종하여 28℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양 하였다. 이렇게 배양된 아그로박테리아는 원심분리(7,000 rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 600 nm의 파장에서 흡광도(O.D) 값이 1.0이 되도록 인필트레이션(Infiltration) 버퍼[10 mM MES (pH 5.7), 10 mM MgCl₂, 200 μM 아세토시링곤]에 현탁시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 수행하였다.
2.2. 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 항원의 발현 확인
상기 실시예 2.1에서 준비한 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 수용성 분획(Supernatant; S)에 있는 단백질과 펠릿(Pellet; P) 분획에 있는 단백질, 수용성 분획과 펠릿을 모두 포함하는 분획(Total; T)을 각각 분리하여 웨스턴 블롯팅으로 재조합 P32 항원 단백질의 발현을 확인하였다. 보다 자세하게는, 각 분획 30 μL를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다. 그리고 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동 하여 크기별로 분리된 단백질 밴드를 확인하고, 이를 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블록킹 단계를 거친 다음, 폴리히스티딘과 반응하는 항체를 결합시키고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 재조합 P32 항원 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 재조합 P32 항원 단백질이 높은 효율로 발현되었음을 확인하였고, 발현된 재조합 P32 항원 단백질의 95% 이상이 수용성 분획에서 확인되었다.
또한, 도 3의 SDS-PAGE 결과에서 P32로 표기된 lane에서 확인할 수 있는 바와 같이 P32를 제외한 추가적인 단백질 밴드는 전혀 나타나지 않았으며, BSA(bovine serum albumin)를 이용한 표준곡선(standard curve)을 이용하여 재조합 단백질을 정량한 결과 높은 순도의 P32 항원 단백질이 분리됨을 확인하였다.
상기와 같이 본 발명의 아프리카 돼지열병 바이러스의 P32 재조합 단백질은 본래의 단백질과 비교하여 큰 변이나 변형 없이 잘 정제되었다. 이러한 결과는 단백질을 식물에서 발현시키는 경우 당 구조가 변이되어 생산 효율이 떨어질 수 있는 문제점이 발견되지 않았음을 확인한 것으로, 본 발명에 따른 아프리카 돼지열병 바이러스의 P32 재조합 단백질이 식물에서 잘 생산되는 것을 확인한 결과이다.
실시예 3: P32 항원의 ASF 표준혈청에 대한 반응성 확인
상기 실시예 2.2에서 준비한 P32 항원 단백질을 이용하여 항체혈청진단키트 시제품을 제작하고 스페인 ASF표준 실험실에서 제공하는 혈청으로 반응성 및 민감도 테스트를 진행하였다.
그 결과 도 4 및 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 재조합 P32 항원 단백질로 제작된 본 발명의 ASF 진단용 키트는 제공된 샘플 결과와 마찬가지로 음성과 양성 결과에서 100% 동일하게 나타났으며, 또한, 양성 최소한계로 설정된 혈청(도 4, limi; 표 1, positive limit control Ref. serum)에서 양성 판정이 확인되어 특이성 및 민감성이 뛰어난 것으로 확인되었다.
순번 혈청 (도 4의 레이블) 바이러스 감염 여부 (실제) 키트 시험
결과		 결과 일치
여부
1 Ref. serum 13 (13) O 양성 일치
2 Ref. serum 14 (14) O 양성 일치
3 Ref. serum 15 (15) O 양성 일치
4 Ref. serum 16 (16) O 양성 일치
5 Ref. serum 17 (17) X 음성 일치
6 Ref. serum 18 (18) X 음성 일치
7 Ref. serum 19 (19) O 양성 일치
8 Ref. serum 20 (20) O 양성 일치
9 Ref. serum 21 (21) O 양성 일치
10 Ref. serum 22 (22) O 양성 일치
11 양성 대조군 Ref. Serum (po) O 양성 일치
12 양성 최소한계 Ref. Serum (limi) O 양성 일치
13 Negative serum 1 (Ne 1) X 음성 일치
14 Negative serum 2 (Ne 2) X 음성 일치
15 Negative serum 3 (Ne 3) X 음성 일치
16 Negative serum 4 (Ne 4) X 음성 일치
17 Negative serum 5 (Ne 5) X 음성 일치
18 Negative serum 6 (Ne 6) X 음성 일치
19 Negative serum 7 (Ne 7) X 음성 일치
20 Negative serum 8 (Ne 8) X 음성 일치
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (18)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 아프리카 돼지열병(African swine fever) 바이러스 P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    식물체에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 BiP(chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 4의 폴리히스티딘(polyhistidine)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 4의 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    서열번호 6의 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, P32 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HDEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 형질전환체는 식물체인 것을 특징으로 하는, 형질전환체.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 재조합 단백질.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 단백질은 수용성인 것을 특징으로 하는, 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 재조합 단백질.
  15. 제13항의 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 아프리카 돼지열병 진단용 조성물.
  16. 제13항의 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 아프리카 돼지열병 진단용 키트.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 생산된 아프리카 돼지열병 바이러스 P32 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 인간을 제외한 동물에서 유래한 생물학적 시료 내에서 항원-항체 반응을 통해 아프리카 돼지열병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 아프리카 돼지열병 진단 방법.
  18. 하기의 단계를 포함하는 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 재조합 항원의 제조 방법:
    (a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
    (b) 상기 식물체로부터 재조합 항원을 분리 및 정제하는 단계.
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