PT1305437E - Expressão de polipéptidos biologicamente activos na lentilha de água - Google Patents

Description

1

Descrição "Expressão de polipéptidos biologicamente activos na lentilha de água"

Campo da Invenção A presente invenção diz respeito a processos e composições para a expressão e secreção de polipéptidos biologicamente activos a partir de lentilhas de água submetidas a engenharia genética.

Antecedentes da Invenção

As lentilhas de água são os únicos membros da família monocotiledónea das Lemnáceas. Os quatro géneros e 34 espécies são todos pequenos, flutuando livremente na água corrente, cuja área geográfica se estende por todo o globo (Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae A Monograph Study Geobotanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich). Apesar de serem as plantas conhecidas morfologicamente mais reduzidas, a maior parte das espécies das lentilhas de água possuem todos os tecidos e orgãos das plantas muito maiores, incluindo raízes, caules, flores, sementes e frondes. As espécies de lentilhas de água foram estudadas extensivamente e existe literatura substancial com detalhes da sua ecologia, sistemática, ciclo de vida, metabolismo, susceptibilidade a pestes e doenças, à sua biologia reprodutiva, estrutura genética, e biologia celular. (Hillman (1961) Bot. Review 27:221; Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae- A Monograph Study Geobotanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich). 2 A forma de crescimento das lentilhas de água é ideal para processos de cultura microbianos. A planta prolifera rapidamente, através de germinação vegetativa de novas frondes, de uma maneira macroscópica análoga à propagação assexual nas leveduras. Esta proliferação ocorre por germinação vegetativa a partir de células meristemáticas. A região meristemática é pequena e é encontrada na superfície ventral da fronde. As células meristemáticas situam-se em duas bolsas, uma de cada lado da nervura central da fronde. A região da pequena nervura central é também o local a partir do qual se origina a raiz e aparece o caule que liga cada fronde à sua fronde mãe. A bolsa meristemática é protegida por uma aba do tecido. Rebentos de frondes alternam-se a partir destas bolsas. Tempos de duplicação variam por espécies e são tão curtos como 20-24 horas (Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67:271; Chang et al. (1977) Buli. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Datko e Mudd (1970) Plant Physiol. 65: 16; Venkataraman et al. (1970) Z. Pflanzenphysiol. 62:316). A cultura intensiva de lentilhas de água resulta nas taxas mais elevadas de acumulação de biomassa por unidade de tempo (Landolt e Kandeler (1987) The Family of Lemnaceae A Monograph Study vol. 2: Phytochemistry, Physiology, Application, Bibliography, Publicação do Geobotanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich), com acumulação de peso seco que vai de 6-15% de peso fresco (Tillberg et al. (1979) Physiol. Plant. 46:5; Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67:271; Stomp, dados não publicados). O teor em proteínas de várias espécies de lentilhas de água cultivadas sob condições variáveis foi reportado entre 15-45% de peso seco (Chang et al. (1977) Buli. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Chang e Chui (1978) Z. Pflanzenphysiol. 89:91; Porath et al. (1979) Aquatic Botanic 7:272; Appenroth et al. (1982) Biochem. Physiol. Pflanz. 177:251). 3

Utilizando estes valores, o nivel de produção de proteína por litro de meio na lentilha de água é da mesma ordem de grandeza de sistemas de expressão dos genes de levedura. A reprodução sexual na lentilha de água é controlada por componentes do meio e condições de cultura, incluindo o fotoperíodo e densidade de cultura. A indução de flores é um procedimento de rotina de laboratório com algumas espécies. Podem ser conseguidas plantas normalmente auto-polinizadas, e auto-cruzadas no laboratório agitando as culturas suavemente. Através deste processo foram desenvolvidas linhas auto-cruzadas de Lemna gibba. Foram identificadas mutações espontâneas (Slovin e Cohen (1988) Plant Physiol. 86, 522), e foi utilizada mutagénese química e de raios gama (utilizando EMS ou NMU) para produzir mutantes com características definidas. 0 cruzamento entre a espécie de L. gibba, mas de diferentes linhagens é entediante, mas pode ser efectuado, através de polinização manual controlada. A dimensão do genoma das lentilhas de água varia entre 0,25-1,63 pg ADN/2C com contagens de cromossomas que vão de 20 a 80 e com uma média de cerca de 40 nas Lemnaceae (Landolt (1986) Biosystematic Investígatíon on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae- A Monograph Study Geobotanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich). Níveis ploidicos são estimados variar entre 2-12C. Id. A diversidade genética nas Lemnáceas foi investigada utilizando produtos secundários, isozimas, e sequências de ADN (McClure e Alston (1966) Nature 4916:311; McClure e Alston (1966) Amer. J. Bot. 53:849; Vasseur et al. (1991) PI. Syst. Evvol. 177:139 (1991); Crawford e Landolt (1993) Syst. Bot. 10:389).

Plantas de lentilhas de água ou culturas de nódulos de lentilhas de água podem ser transformadas eficientemente com uma cassete de expressão contendo uma sequência nucleótidica de interesse por qualquer um de vários 4 processos incluindo a transferência do gene mediado por Agrobacterium, bombardeamento balístico, ou electroporação. Transformantes de lentilhas de água estáveis podem ser isolados através de transformação das células de lentilhas de água com a sequência nucleótidica de interesse e um gene que confere resistência a um agente de selecção, seguida de cultura das células transformadas num meio contendo o agente de selecção. Ver Patente US N° 6040,498 e WO 99/07210 de Stomp et al.

Um sistema genético de expressão de lentilhas de água disponibiliza uma tecnologia pivotal que seria útil para uma série de investigações e de aplicações comerciais. Para a investigação em biologia molecular de plantas como um todo, um sistema de plantas diferenciada que pode ser manipulado com a conveniência laboratorial disponibiliza um sistema muito rápido para se poder analisar as funções de desenvolvimento fisiológicas dos genes isolados. Para a produção comercial de polipéptidos valiosos um sistema à base de lentilhas de água possui várias vantagens em relação a sistemas microbianos ou de cultura de células existentes. As plantas demonstram processamento pós-tradução que são semelhantes às células de mamíferos, ultrapassando um grande problema associado com a produção microbiana de células de polipéptidos de mamíferos biologicamente activos e outros mostraram (Hiatt (1990) Nature 334:469) que sistemas de plantas possuem a capacidade de juntar proteínas de sub-unidades múltiplas, uma capacidade que falta muitas vezes em sistemas microbianos. O aumento de escala da biomassa de lentilhas de água para níveis necessários à produção comercial de proteínas recombinantes é mais rápido e mais eficiente do ponto de vista de custo do que o aumento de escala semelhante de células de mamíferos e ao contrário de outros sistemas sugeridos de produção de plantas por ex. soja e 5 tabaco, a lentilha de água pode ser cultivada em vasos de produção de biomassa completamente estanques e controlados, tornando a integração do sistema na infraestrutura existente de produção industrial de proteína muito mais fácil.

Estas características tornam a lentilha de água uma escolha ideal para desenvolver como um sistema eficiente à base de plantas para a produção de proteínas recombinantes. Neste contexto, a presente invenção disponibiliza processos e composições que aumentam a eficiência do sistema de expressão do gene de lentilhas de água como instrumento de produção de polipéptidos biologicamente activos.

Sumário da invenção A presente invenção diz respeito a processos para a expressão e recuperação de polipéptidos recombinantes biologicamente activos, utilizando lentilhas de água como sistema de expressão. Um aspecto da presente invenção disponibiliza um processo para níveis de expressão acrescidos de polipéptidos biologicamente activos nas lentilhas de água, resultando num rendimento acrescido em polipéptidos e possibilitando neste sistema a produção de quantidades úteis de polipéptidos biologicamente activos valiosos. Um outro aspecto da invenção revela processos para a secreção dirigida de polipéptidos biologicamente activos de plantas de lentilhas de água sujeitas a engenharia genética ou culturas de nódulos de lentilhas de água. Secreção dos polipéptidos expressos facilita a sua recuperação e evita a perda de actividade que pode resultar da moagem mecânica, da lise enzimática do tecido de lentilhas de água.

Numa concretização, a invenção abrange um processo de produção de polipéptido biologicamente activo recombinante 6 numa cultura de plantas de lentilhas de água, ou uma cultura de nódulos de lentilhas de água, compreendendo os passos de: (a) cultivo num meio de cultura de lentilhas de água de uma cultura de plantas de lentilhas de água, ou uma cultura de nódulos de lentilhas de água, em que a dita cultura de plantas de lentilhas de água ou dita cultura de nódulos de lentilhas de água é transformada de forma estável para expressar o dito polipéptido recombinante biologicamente activo, e em que o dito polipéptido biologicamente activo recombinante é expresso a partir de uma sequência nucleótidica compreendendo uma sequência de codificação para o dito polipéptido recombinante e uma sequência de codificação ligada de forma funcional que codifica para um péptido de sinalização que dirige a secreção do polipéptido recombinante; e (b) recolha do dito polipéptido recombinante a partir de um meio de cultura de lentilhas de água; em que a dita sequência do péptido de sinalização é seleccionada a partir de: (a) péptido de sinalização do α-2-b-interferão humano (b) péptido de sinalização de Arabidopsis thaliana chitinase; (c) péptido de sinalização modificado da α-amilase; e (d) (d) péptido de sinalização modificado da a-amilase apresentado na SEQ ID N° 7.

Preferencialmente, a dita sequência nucleótidica possui pelo menos um atributo seleccionado a partir de: (a) codões preferidos das lentilhas de água na sequência de codificação para o dito polipéptido recombinante; 7 (b) codões preferidos das lentilhas de água na sequência de codificação para o dito péptido de sinalização; (c ) um codão de iniciação da tradução que é flanqueado por uma sequência nucleótidica do contexto de iniciação da tradução preferido por uma planta. (d) uma sequência nucleótidica ligada de forma funcional compreendendo um intrão de uma planta que é inserido a montante da sequência de codificação; e (e) uma sequência leader ligada de forma funcional em 5' A invenção também disponibiliza uma cultura de plantas de lentilhas de água, ou cultura de nódulos de lentilhas de água, transformada de forma estável para expressar um polipéptido recombinante biologicamente activo a partir de uma sequência nucleótidica compreendendo uma sequência de codificação para o dito polipéptido recombinante e sequência de codificação para um péptido de sinalização e ligada de forma funcional que dirige a secreção do polipéptido recombinante; em que a dita sequência de sinalização peptídica é seleccionada a partir de: (a) péptido de sinalização do α-2-b-interferão humano (b) péptido de sinalização da chitinase de Arabidopsis thaliana; (c) o péptido de sinalização modificado da α-amilase; e (d) o péptido de sinalização modificado da a-amilase apresentado na SEQ ID N° 7. A invenção também disponibiliza uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência nucleótidica que codifica para o interferão a-2b apresentada na SEQ ID N°:2 ligada de forma funcional a um péptido de sinalização que codifica para uma sequência nucleótidica indicada na SEQ ID N° 3.

Numa concretização do processo, o péptido de sinalização é o péptido de sinalização da α-amilase, cuja sequência é apresentada na SEQ ID N° 3.

Nalgumas das concretizações dos processos acima, os codões preferidos das lentilhas de água são codões ppreferidos de Lemna.

Nalgumas concretizações dos processos acima, os codões preferidos das lentilhas de água são os codões preferidos da Lemna-gibba ou Lemna minor. Noutras concretizações, pelo menos uma sequência de codificação seleccionada a partir da sequência de codificação para o polipéptido biologicamente activo recombinante e a sequência de codificação para o péptido de sinalização compreende entre 70-100% de codões preferidos de Lemna-gibba ou codões preferidos de Lemna minor.

Nalgumas concretizações, a sequência nucleótidica no contexto da iniciação da tradução preferida pela planta consiste na sequência nucleótidica "ACC" ou "ACA", em que o dito contexto encontra-se posicionado numa posição imediatamente adjacente ao terminal 5' do codão de iniciação da tradução.

Nalgumas concretizações a sequência nucleótidica ligada de forma funcional compreendendo o dito intrão da planta é a sequência apresentada na SEQ ID N°:l.

Nalgumas concretizações, a cultura de frondes de lentilhas de água ou cultura de nódulos de lentilhas de água expressa e reúne todas as subunidades de uma proteína multimérica biologicamente activa. Noutras concretizações, a proteína multimérica é seleccionada a partir do grupo constituído por colagénio, hemoglobina, P450 oxidase, e um anticorpo monoclonal.

Nalgumas concretizações, o polipéptido recombinante biologicamente activo é um polipéptido de um mamífero. 9

Noutras concretizações, o polipéptido de mamífero é um polipéptido terapêutico. Nalgumas concretizações o polipéptido de mamífero é seleccionado a partir do grupo constituído por: insulina, hormona de crescimento, a-interferão, β-interferão, β-glucocerebrosidase, β-glucoronidase, proteína da retinoblastoma, proteína p53, angiostatina, leptina, anticorpos monoclonais, citocinas, receptores, vacinas humanas, vacinas animais, polipéptidos de plantas, e albumina do soro.

Nalgumas concretizações de qualquer um dos processos acima o polipéptido recombinante biologicamente activo é a-2b-interferão. Noutras concretizações o a-2b-interferão é o a-2b-interferão humano. Noutras concretizações o a-2b-interferão humano possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 5.

Nalgumas concretizações de qualquer um dos processos acima, o polipéptido recombinante biologicamente activo é uma variante biologicamente activa do a-2b-interferão, em que a variante biologicamente activa possui pelo menos uma identidade de sequência de 80% com a SEQ ID N°:4 ou SEQ ID N° : 5.

Nalgumas concretizações de qualquer um dos processos acima, os polipéptidos recombinantes biologicamente activos é uma enzima.

Noutras concretizações, a invenção compreende a cultura das plantas de lentilhas de água, ou culturas de nódulos de plantas de lentilhas de água transformadas de forma estável, através de qualquer um dos processos acima. Noutras concretizações, a cultura das plantas de lentilhas de água, ou cultura de nódulos de lentilhas de água transformadas de forma estável são seleccionadas a partir do grupo constituído pelo género Espirodela, género Wolffia, género Wolfiella e género Lemna. Noutras concretizações, a cultura de plantas de lentilhas de água 10 transformada de forma estável ou cultura de nódulos de plantas de lentilhas de água são seleccionadas a partir do grupo constituído por Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis, e Lemna gibba.

Noutras concretizações, a invenção compreende uma molécula de ácido nucleico para a expressão e secreção de a-2b-interferão humano nas lentilhas de água compreendendo a sequência nucleótidica que codifica para o péptido de sinalização indicada na SEQ ID N°:3, e a sequência nucleótidica que codifica para o interferão a-26 maduro humano indicada na SEQ ID N°:5, em que a sequência nucleótidica que codifica para o péptido de sinalização e a dita sequência nucleótidica que codifica para o interferão a-26 maduro humano encontram-se ligadas de forma funcional. Noutras concretizações, a molécula de ácido nucleico compreende adicionalmente a sequência nucleótidica compreendendo intrões indicada na SEQ ID N°:l, em que a dita sequência nucleótidica compreendendo os intrões se encontra ligada de forma funcional à sequência nucleótidica que codifica para o dito péptido de sinalização e a dita sequência nucleótidica que codifica para o interferão a-2b maduro humano.

Estes e outros aspectos da presente invenção são revelados em maior detalhe na descrição da invenção fornecida abaixo.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 A Figura 1 apresenta níveis de interferão (determinados por um imunoensaio de sandwich de fase sólida) no meio e tecido de uma cultura transformada de lentilhas de água, como descrito no Exemplo 1. 11

Figura 2 A Figura 2 apresenta os niveis de interferão (determinados por um imunoensaio de sandwich de fase sólida) no meio e tecido de culturas de lentilhas de água transformadas, de acordo com o descrito no Exemplo 2.

Descrição Detalhada da Invenção

Na presente invenção, são revelados processos para melhorar a expressão e recuperação de polipéptidos biologicamente activos a partir de plantas de lentilhas de água sujeitas a engenharia genética e culturas de nódulos de lentilhas de água. Estes processos compreendem os passos apresentados acima.

Num outro aspecto, a presente invenção compreende plantas de lentilhas de água transformadas ou culturas de nódulos de lentilhas de água que produzem polipéptidos biologicamente activos de acordo com os processos acima.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção revela processos e sequências de ácidos nucleicos para produzir a-2b-interferão humano biologicamente activo nas lentilhas de água.

Definições: "Polipéptido" diz respeito a qualquer proteína ou péptido monomérico ou multimérico. "Polipéptido biologicamente activo" diz respeito a um polipéptido que possui a capacidade de efectuar uma ou várias funções biológicas, ou um conjunto de actividades normalmente atribuídas a polipéptidos num contexto biológico. Os peritos no estado da técnica vão considerar que o termo "biologicamente activo" inclui polipéptidos em que a actividade biológica é alterada, quando comparada com 12 a proteína nativa (por ex. suprimida ou reforçada), desde que a proteína possua uma actividade suficiente para ter interesse na utilização em processos industriais ou químicos, ou como agente terapêutico, vacina, ou reagente de diagnóstico. A actividade biológica pode ser determinada, através de qualquer processo disponível no estado da técnica. Por exemplo, a actividade biológica de membros da família de interferões de proteínas pode ser determinada, através de vários processos incluindo a sua interacção com anticorpos específicos do interferão, através da sua capacidade de aumentar a resistência à infecção virai, ou à sua capacidade de modular a transcrição de alvos génicos regulados pelo interferão. A "sequência nucleótidica de interesse", quando aqui utilizada diz respeito a qualquer sequência nucleótidica que codifica para um polipéptido destinado à expressão na lentilhas de água. Por exemplo, as sequências nucleótidicas que codificam para polipéptidos terapêuticos (por ex. para uso médico ou veterinário) ou imunogénico (por ex. para vacinação) podem ser expressos utilizando lentilhas de água transformada de acordo com a presente invenção.

Os termos "expressão" ou "produção" dizem respeito à biossíntese de um produto génico, incluindo a transcrição, tradução e montagem do dito produto génico. 0 termo "lentilhas de água" diz respeito a membros da família das Lemnáceas. Esta família encontra-se actualmente dividida entre quatro géneros e 34 espécies de lentilhas de água como se segue: genus Lemna (L. aequinoctialis, L. disperma, L. ecuadoriensis, L. gibba, L. japonica, L. minor, L. miniscula, L. obscura, L. perpusilla, L. tenera, L. trisulca, L. turionifera, L. valdiviana); género Espirodela (S. intermédia, S. polyrrhiza, S. punctata); género Wolffia (Wa. Angusta, Wa. Arrhiza, Wa. Australiana, Wa. Borealis, Wa. Brasiliensis, Wa. Columbiana, Wa. 13

Elongata, Wa. Globosa, Wa. Microscópica. Wa. Neglecta) e género Wolfiella (wi. Caudata, wi. Denticulata, wi. Gladiata, Wl. Hyalína, Wl. Lingulata, WI. Repunda, WI. Rotunda, e WI. Neotropica) . Qualquer outro género ou espécies de Lemnáceas, se existirem, são também aspectos da presente invenção. Espécies Lemna podem ser classificadas utilizando o esquema taxonómico descrito por Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The family of Lemnaceae- A Monograph Study Geobotanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurique. 0 termo "cultura de nódulos de lentilhas de água", quando aqui utilizado diz respeito a uma cultura compreendendo células de lentilhas de água em que pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% das células são células diferenciadas. Uma "célula diferenciada", quando aqui utilizado é uma célula com pelo menos um fenótipo caracteristico (por ex. uma morfologia distintiva da célula ou a expressão de um ácido nucleico marcador ou proteína) que o distingue de células não diferenciadas, ou de células encontradas noutros tipos de tecidos. As células diferenciadas da cultura de nódulos de lentilhas de água aqui descrita formam uma superfície suave coberta com células de cultura interligadas fundidas nas suas paredes celulares adjacentes a nódulos que começaram a organizar-se em primórdios de frondes dispersos, através do tecido. A superfície do tecido da cultura do nódulo possui células epidérmicas ligadas umas às outras através de plasmadesmata.

Quando aqui utilizado "codões preferidos das lentilhas de água" diz respeito a codões que possuem uma frequência de utilização de codão nas lentilhas de água superior a 17%. 14

Quando aqui utilizado "codões preferidos de Lemna" diz respeito a codões que possuem uma frequência de utilização de codões no género Lemna ou maior do que 17%.

Quando aqui utilizado "codões preferidos de Lemna gibba" diz respeito a codões que possuem uma frequência de utilização de codões em Lemna-gibba maior do que 17% em que a frequência de utilização do codão em Lemna gibba foi obtida a partir da base de dados de utilização de codão (GenBank Release 113,0; a vsoecies= http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cg. Lemna+gibba+[gbpln]) . "Codão de iniciação de tradução" diz respeito ao codão que inicia a tradução do ARNm transcrito da sequência nucleótidica de interesse. "Sequência nucleótidica do contexto de iniciação de tradução", quando aqui utilizado diz respeito à identidade dos três nucleótidos posicionados directamente 5' em relação ao codão de iniciação da tradução.

Quando aqui utilizada "secreção" diz respeito à translocação de um polipéptido, através da membrana plasmática e da parede celular de uma célula de planta hospedeira.

Quando aqui utilizado "ligado de forma funcional" no que diz respeito a sequências nucleótidicas diz respeito a sequências nucleótidicas múltiplas que são colocadas numa relação funcional umas com as outras. Geralmente, sequências de ADN ligadas de forma funcional são contíguas, e quando necessárias ligam duas regiões de codificação de proteínas, na grelha de leitura. A. Cassettes de Expressão

De acordo com a presente invenção, lentilhas de água transformada de forma estável são obtidas por transformação 15 com uma sequência nucleótidica de interesse contida numa cassette de expressão. A cassete de expressão compreende uma região de iniciação transcricional ligada ao ácido nucleico, ou gene de interesse. Uma tal cassete de expressão é disponibilizada com uma pluralidade de locais de restrição para inserção do gene ou genes de interesse (por ex. um gene de interesse, dois genes de interesse, etc.) para estarem sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. A cassete de expressão pode codificar para um gene único de interesse. Em concretizações particulares da invenção, o ácido nucleico a ser transferido contém duas ou mais cassetes de expressão, cada uma das quais codifica para pelo menos um gene de interesse. A região de iniciação transcricional (por ex. um promotor) pode ser nativo ou homólogo ou estranho ou heterólogo em relação ao hospedeiro, ou poderia ser a sequência natural, ou uma sequência sintética. Por estranho entende-se que a região de iniciação transcricional não é encontrada no hospedeiro de tipo selvagem no qual a região de iniciação transcripcional é introduzida. Quando aqui utilizado um gene quimérico compreende uma região de codificação ligada de forma funcional a uma região de iniciação da transcrição que é heteróloga em relação à sequência de codificação.

Pode ser utilizado qualquer promotor conhecido do estado da técnica de acordo com a presente invenção (incluindo leveduras bacterianas, fungos, insectos, mamíferos e promotores de plantas). Por exemplo, podem ser utilizados promotores de plantas, incluindo promotores de lentilhas de água.

Promotores exemplificativos incluem, mas não se encontram limitados ao promotor do virus do mosaico da couve-flor 35S, os promotores da opina sintetase (por ex. 16 nos, mas, ocs, etc.), o promotor da ubiquitina, o promotor da actina, o promotor da pequena sub-unidade da ribulose bifosfato (RubP) carboxilase, e o promotor da álcool desidrogenase. 0 promotor da pequena sub-unidade da ribulose bifosfato (RubP) carboxilase é conhecido do estado da técnica (Silverthorne et al. (1990) Plant. Mol. Biol. 15:49). Outros promotores de virus que infectam as plantas, preferencialmente lentilhas de água são também adequados incluindo, mas não se encontrando limitados a promotores isolados do virus do mosaico de Dasheen, Chlorella virus (por ex. o promotor da adenina metiltransferase do virus da Chlorella; Mitra et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 26:85), virus de vira-cabeça-do tomateiro, virus do chocalho do tabaco, virus da necrose do tabaco, virus do anel do tabaco, virus do anel do tomate, virus do mosaico do pepino, virus stunt do amendoim, virus do mosaico de alfa-alfa, badnavirus baciliforme da cana-de-açúcar e semelhantes.

Finalmente, podem ser escolhidos promotores para dar o nivel desejado de regulação. Por exemplo, nalguns casos, pode ser vantajosos utilizar um promotor que confere uma expressão constitutiva (por ex. o promotor da manopina sintase de Agrobacterium tumefaciens). Alternativamente, noutras situações pode ser vantajoso utilizar promotores que são activados na resposta a estímulos ambientais específicos (por ex. promotores do gene do choque de calor, promotores génicos indutíveis pela geada, promotores génicos indutíveis por patogéneos, promotores génicos indutíveis por feridas, e promotores génicos indutíveis por luz/escuridão), ou reguladores do crescimento da planta (por ex. promotores de genes indutíveis por ácido abcíssico, e auxinas, citoquininas, e ácido giberélico) . Como outra alternativa, podem ser escolhidos promotores que 17 dão uma expressão específica do tecido (por ex. raiz, folhas, e promotores específicos das flores). A força global de um determinado promotor pode ser influenciada pela combinação e organização espacial de sequências nucleótidicas que actuam em cis, tal como as sequências activadoras a montante. Por exemplo, sequências nucleótidicas de activação derivadas do gene da octopina sintase do Agrobacterium tumefaciens podem aumentar a transcrição do promotor da Agrobacterium tumefaciens mannopine sintase (ver patente U.S. 5,955,646 de Gelvin et al.). Na presente invenção, a cassete de expressão pode conter sequências de activação nucleótidicas inseridas a montante da sequência promotora para reforçar a expressão da sequência nucleótidica de interesse. Numa concretização, a cassete de expressão inclui três sequências de activação a montante derivadas do gene da octopina sintase da Agrobacterium tumefaciens ligadas de forma funcional a um promotor derivado de um gene da manopina sintase de Agrobacterium tumefaciens (ver Patente U.S. 5,955,646). A cassete transcricional inclui na direcção 5'-3' da transcrição, uma região de iniciação transcricional e de tradução, uma sequência nucleótidica de interesse, e uma região de terminação transcripcional e de tradução funcional nas plantas. Qualquer sequência de terminação adequada conhecida no estado da técnica pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação transcricional, pode ser nativa com a sequência nucleótidica de interesse, ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de terminação convenientes encontram-se disponíveis no plasmídeo-Ti de A. tumefaciens, tal como a octopina sintetase e regiões de terminação da nopalina sintetase. Ver também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Gent. 262:141; Proudfoot (1991) Cell 64:671; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141; Mogen et 18 al. (1990) Plant Cell 2: 1261; Munroe et al. (1990) Gene 91:151; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627. Exemplos adicionais de sequências de terminação são a pequena sub-unidade da sequência de terminação da RubP carboxilase da ervilha e a sequência de terminação do virus do mosaico da couve-flor 35S. Outras sequências de terminação adequadas serão evidentes para os peritos no estado da técnica.

Alternativamente, o(s) gene(s) de interesse pode(m) ser disponibilizado (s) em qualquer outra cassete de expressão adequada conhecida no estado da técnica.

As cassetes de expressão podem conter mais do que um gene ou sequência de ácido nucleico a ser transferida e expressa na planta transformada. Assim, cada sequência de ácido nucleico vai estar ligada de forma funcional às sequências reguladoras 5' e 3'. Alternativamente, podem ser fornecidas cassetes de expressão múltipla.

Geralmente, a cassete de expressão pode compreender um gene marcador seleccionável para a selecção de células transformadas ou tecidos. Genes marcadores seleccionáveis incluem genes que codificam para uma resistência antibiótica, tal como aqueles que codificam para a fosfotransferase II da neomicina (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como os genes que conferem resistência a compostos herbicidas. Genes de resistência herbicida codificam habitualmente para uma proteína alvo modificada insensível ao herbicida ou para uma enzima que degrada ou destoxifica o herbicida na planta antes de poder actuar. Ver DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513; DeBlock et al. (1989) Plant Physiol. 91:691; Fromm et al. (1990) Bio Technology 8:833; Gordeon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603. Por exemplo, foi obtida resistência aos herbicidas glicofosfato ou sulfonilureia utilizando genes que codificam para as enzimas alvo mutantes, 5-enolpiruvil 19 chiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) e acetolactato sintase (ALS). Foi obtida resistência ao glufosinato de amónio, boromoxinil, e 2,4-diclorofenóxiacetato (2,4-D) utilizando genes bacterianos que codificam para a fosfinotricina acetiltransferase, uma nitralase, ou um 2,4-diclorofenóxiacetato monooxigenase, que destoxifica os respectivos herbicidas.

Para os objectivos da presente invenção, genes marcadores seleccionáveis incluem, mas não se encontram limitados a genes que codificam para a neomicina fosfotransferase II (Fraley et al. (1986) CRC Criticai Reviews in Plant Science 4.1); cianamida hidratase (Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:4250); aspartato quinase; dihidrodipicolinato sintase (Perl et al. (1993) BioTechnology 11:715); gene bar (Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100:1503; Meagher et al. (1996) Crop Sei. 36:1367); tryptophan descarboxilase (Goddijin et al. (1993) Plant. Mol. Biol. 22:907); neomicina fosfotransferase (NEO; Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:327); hygromycin fosfotransferase (HPT ou HYG; Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074); dihidrofolate redutase (DHFR; Kwok et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:4552); fosfinotricina acetiltransferase (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513); ácido 2,2-diclopropiónico desalogenase (Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330); ácido acetohidrolase sintase (Pat US N° 4,761,373 de Anderson et al., Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266); 5-enolpiruvil-chiquimato-fosfato sintase (aroA; Cornai et al. (1985) Nature 317:741); haloarilnitrilase (WO 87/04181 de Stalker et al.); acetil-coenzima A carboxilase (Parker et al, (1990) Plant Physiol. 92:1220); dihidropteroato sintase (sull; Guerineau et al. (1990) Plant. Mol. Biol. 15:127); e polipéptido de 20 fotosistema II de 32 kDa (psbA; Hirschberg et al. (1983) Science 222: 1346 (1983).

Também estão incluídos genes que codificam para a resistência a: gentamicina (por ex., aacCl, Wohlleben et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 217:202-208); cloroanfenicol (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987); metotrexato (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant. Mol. Biol. 5:103; Zhijan et al. (1995) Plant Science 108:219; Meijer et al. (1991) Plant. Mol. Biol. 16:807); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131); bleomicin (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant. Mol. Bio. 15:127); bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:419); 2,4-D (Steber et al. (1989) BioTecnology 7:811); fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513); espectinomicina (Bretagne-Sagnard e Chupeau, Transgenic Research 5:131). O gene bar confere resistência herbicida a herbicidas do tipo do glufosinato, tal como fosfinotricina (PPT) ou bialaphos, e semelhantes. Como aqui referido, outros marcadores seleccionáveis que poderiam ser utilizado nas construções de vectores incluem, mas não se encontram limitados ao gene pat, também para o bialafos e resistência à fosfinotricina, o gene ALS para a resistência à imidazolinona, o gene HPH ou HYG para a resistência à higromicina, o gene da EPSP sintase para a resistência ao glifosato, o gene Hml para a resistência à toxina Hc, e outros agentes selectivos utilizados em rotina e conhecidos de um perito no estado da técnica. Ver Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506; Chistopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6314; Yao et al. (1992) Cell 71:63; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419: Barkley et 21 al. (1980) The Operon 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555; Brown et al. (1987) Cell 49:603; Figge et al. (1988) Cell 52:713; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sei. USA 86:5400; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sei. USA 86:2549; Deuschle et al. (1990) Science 248:480; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3952; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:5072; Wyborski et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19:4647; Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol. And. Struc. Biol. 10:143; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591; Kleinschmidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094; Gatz et al. (1992) Plant J. 2:397; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology 78; e Gill et al. (1988) Nature 334:721. Não se pretende que a lista acima de genes marcadores seleccionáveis seja limitante. Qualquer gene marcador seleccionável pode ser utilizado na presente invenção. B. Modificação das Sequências Nucleótidicas para expressão reforçada nas lentilhas de Água A presente invenção disponibiliza a modificação da sequência nucleótidica expressa para reforçar a sua expressão nas lentilhas de água. Uma de tais modificações é a síntese da sequência nucleótidica de interesse utilizando codões preferidos das lentilhas de água. Estão disponíveis processos no estado da técnica para sintetizar sequências nucleótidicas com codões preferidos pelas plantas.

Ver por ex. Patente US n° 5,380,831 e 5,436,391; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 15:3324: Iannacome et al. (1997) Plant. Mol. Biol. 34:485; e Murray et al., (1989) Nucleic Acids. Res. 17:477. Os codões 22 preferidos podem ser determinados a partir dos codões de frequência mais elevada nas proteínas expressas nas lentilhas de água. Por exemplo, a frequência da utilização de codões para Lemna gibba é encontrada na página da internet: http://www.kazusa.or.jp/codon/cqi-bin/showcodon.cgi? species=Lemna+gibba+[gbpln], e a frequência de utilização do codão para Lemna minor é encontrada na página da internet http://www.kazusa.or.jp/codão/cgibin/showcodon.cgi?species= Lemna+minor+[gbpln]. É reconhecido que os genes que foram optimizados para a expressão nas lentilhas de água e outras monocotiledóneas podem ser utilizados nos processos da invenção. Ver, por ex., EP0359472, EP0385962, W091/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Netl. Acad. Sei. USA 88:3324; Iannacome et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:485; e Murray et al. (1989) Nuc. Acids. Res. 17:477, e semelhantes são aqui incorporadas por referência. É ainda reconhecido que toda ou qualquer parte da sequência do gene pode ser optimizada ou sintética. Por outras palavras, podem também ser utilizadas sequências completamente optimizadas ou sequências parcialmente optimizadas. Por exemplo, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% dos codões podem ser codões preferidos das lentilhas de água. Numa concretização, entre 90 e 96% dos codões são codões preferidos das lentilhas de água. A sequência de codificação da sequência nucleótidica de interesse pode compreender codões utilizados com uma frequência de pelo menos 17% na Lemna gibba. Numa concretização, a sequência nucleótidica modificada é o interferão-a-2B humana que codifica para a sequência nucleótidica apresentada na SEQ ID n°2, que contém 93% codões preferidos das lentilhas de água. 23

Podem igualmente ser efectuadas outras modificações da sequência nucleótidica de interesse para aumentar a sua expressão nas lentilhas de água. Estas modificações incluem, mas não se encontram limitadas a eliminação de sequências que codificam sinais falsos de poliadenilação, sinais dos locais de união de exão-intrão, repetições semelhantes a transposão, e outras sequências bastante bem concretizadas que podem ser perniciosas para a expressão génica. 0 teor em G-C da sequência pode ser ajustado para niveis médios para um dado hospedeiro celular, calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possivel, a sequência pode ser modificada para evitar estruturas previstas de ARNm de gancho de cabelo secundárias.

Existem diferenças conhecidas entre as sequências nucleótidicas do contexto óptimo de iniciação de tradução para codões de iniciação de tradução em animais e plantas e a composição desta sequências nucleótidica do contexto de iniciação da tradução pode influenciar a eficiência da iniciação da tradução. Ver, por exemplo, Lukaszewicz et al. (2000) Plant Science 154:89-98; e Joshi et al. (1997); Plant Mol. Biol. 35:993-1001. Na presente invenção, a sequência nucleótidica do contexto de iniciação da tradução para o codão de iniciação da tradução da sequência nucleótidica de interesse pode ser modificada para aumentar a expressão nas lentilhas de água. Numa concretização, a sequência nucleótidica é modificada de modo a que os três nucleótidos directamente a montante do codão de iniciação da tradução da sequência nucleótidica de interesse sejam "ACC". Numa segunda concretização, estes nucleótidos são "ACA". A expressão de um transgénico na lentilha de água pode também ser reforçada pela utilização de sequências leader 5' . Tais sequências leader podem actuar para reforçar a 24 tradução. Leaders de tradução são conhecidos no estado da técnica e incluem, mas não se encontram limitados, a leaders de picornavírus, por ex., EMCV (região não codificante da encefalomiocardite 5'; Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6126); leaders potyvirus, por ex. leader TEV (Tobacco Etch virus; Allison et al. (1986) Virolov 154:9); proteína ligante da cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP; Macajak e Sarnow (1991) Nature 353:90): leader não traduzido do ARNm da proteína de revestimento do vírus do mosaico alfa-alfa (AMV ARN 4; Jobling e Gehrke (1987) Nature 325:622); leader do vírus do mosaico do tabaco (TMV; Gallie (1989) Molecular Biology de ARN, 23-56); leader do vírus etch da batata (Tomashevskaya et al. (1993) J. Gen. Virai. 74:2717 — 2724) ; região não traduzida Fed-1 5' (Dickey (1992) EMBO J. 11: 2311-2317); região não traduzida RbcS 5' (Silverthorne et al. (1990) J.Plant. Mol. Biol. 15:49-58); e leader do vírus mosqueado clorótico do milho (MCMV; Lommel et al. (1991)

Virology 81:382). Ver também, Dell-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965. Sequência leader compreendendo a sequência do intrão da planta, incluindo a sequência do intrão do gene da desidrogenase do milho, o gene da catalase da semente de rícino, ou o gene do metabolismo do triptofano da Arabidopsis PAT1 verificou-se também aumentar a tradução eficiente em plantas (Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol.

Biol. 15:913-920). Numa concretização da presente invenção, a sequência nucleótidica correspondente aos nucleótidos 1222-1775 do gene 1 da desidrogenase do álcool do milho (GenBank Accession Number X04049) apresentada na SEQ ID N°: 1, é inserida a montante da sequência nucleótidica de interesse para reforçar a eficiência da sua tradução. É reconhecido que podem ser utilizadas na presente invenção quaisquer modificações da sequência nucleótidica 25 amplificadora da expressão das lentilhas de água descrita acima, incluindo quaisquer modificações únicas, ou qualquer combinação possível de modificações. A frase "modificada para amplificação da expressão nas lentilhas de água", quando aqui utilizada diz respeito a uma sequência nucleótidica que contém, qualquer uma ou qualquer combinação destas modificações. C. Péptidos de Sinalização

As proteínas secretadas usualmente traduzidas a partir de precusores polipéptídicos que incluem um "péptido de sinalização" que interactua com uma proteína receptora na membrana do retículo endoplásmico (RE) para dirigir a translocação da cadeia de polipéptido em crescimento, através da membrana e para o retículo endoplasmático para a secreção a partir da célula. Este péptido de sinalização é muitas vezes cindido a partir do polipéptido precursor para produzir um polipéptido "maduro" em que falta o péptido de sinalização. Numa concretização da presente invenção, um polipéptido biologicamente activo é expresso nas lentilhas de água a partir de uma sequência nucleótidica que se encontra ligada de forma funcional a uma sequência nucleótidica que codifica para um péptido de sinalização que dirige a secreção do polipéptido para o meio de cultura. Péptidos de sinalização que tomam como alvo a translocação da proteína para o retículo endoplásmico (para secreção fora da célula) são conhecidos do estado da técnica. Ver, por exemplo, Patente US N° 6,020, 169 de Lee et al. Na presente invenção, pode ser utilizado qualquer péptido de sinalização da planta para tomar como alvo a expressão do polipéptido para o RE. Nalgumas concretizações, o péptido de sinalização é o péptido de sinalização da endoquinase básica da Arabidopsis thaliana 26 (SEQ ID N° 8); aminoácidos 14-34 com o n° de acesso da NCBI de proteínas BAA82823), o péptido de sinalização da extensina (Stiefel et al. 1990) Plant Cell 2:785-793), o péptido de sinalização da α-amilase do arroz (SEQ ID N° 6; aminoácidos 1-31 com o n° de acesso da NCBI de proteínas AAA33885), ou a sequência de sinalização modificada da a-amilase do arroz (SEQ ID N°:7). Noutra concretização, o péptido de sinalização corresponde ao péptido de sinalização de uma proteína secretada das lentilhas de água.

Alternativamente, um péptido de sinalização de mamíferos pode ser utilizado para tomar como alvo os polipéptidos recombinantes expressos nas lentilhas de água submetidas a engenharia genética para secreção. Foi demonstrado que as células das plantas reconhecem péptidos de sinais de mamíferos que tomam como alvo o retículo endoplásmico, e que estes péptidos de sinalização podem dirigir a secreção de polipéptidos não apenas, através da membrana plasmática, mas também através da parede celular da planta. Ver patente US de invenção N°s 5, 202,422 e 5, 639, 947 de Hiatt et al. Numa concretização da presente invenção, o péptido de sinalização do mamífero que toma como alvo a secreção do polipéptido é o péptido de sinalização a-2b-interferão humano (aminoácidos 1-23 de com o N° de acesso da NCBI N° de proteínas AAB59402 e SEQ ID N°:4).

Numa concretização, a sequência nucleótidica que codifica para o péptido de sinalização encontra-se modificada para a expressão acrescida nas lentilhas de água, utilizando qualquer modificação ou combinação das modificações reveladas na secção B acima para a sequência nucleótidica de interesse. Noutra concretização, o péptido de sinal da α-amilase codificada pela sequência nucleótidica modificada apresentada na SEQ ID N° 3, que 27 contém aproximadamente 93% dos codões preferidos das lentilhas de água. 0 polipéptido secretado biologicamente pode ser recolhido a partir do meio de cultura, através de quaisquer meios convencionais conhecidos do estado da técnica e purificados por cromatografia, electroforese, diálise, extracção solvente-solvente, e semelhantes. D. Plantas de lentilhas de água transformadas e culturas de nódulos de lentilhas de água

As lentilhas de água transformadas de forma estável utilizadas nesta invenção podem ser obtidas, através de qualquer método conhecido no estado da técnica. Numa concretização, as lentilhas de água transformadas de forma estável são obtidas, através de um dos processos de transferência de genes revelados na Patente de invenção US N° 6, 040,498 de Stomp et al. Estes processos incluem a transferência de genes por bombardeamento balístico com microprojécteis revestidos com um ácido nucleico compreendendo a sequência nucleótidica de interesse, transferência génica por electroporação, e transferência génica mediada por Agrobacterium compreendendo um vector compreendendo a sequência nucleótidica de interesse. Numa concretização, as lentilhas de água transformadas de forma estável são obtidas, através de qualquer um dos processos mediados pela Agrobacterium revelados na Patente US N° 6,040,498 de Stomp et al. A Agrobacterium utilizada é Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. É preferido que as plantas de lentilhas de água transformadas de forma estável utilizadas nestes processos exibam uma morfologia normal e sejam férteis por reprodução sexual. Preferencialmente, as plantas transformadas da presente invenção contêm uma cópia única do ácido nucleico 28 transferido, e o ácido nucleico transferido não possui nenhuns rearranjos significativos. Também são preferidas plantas de lentilhas de água em que os ácidos nucleicos transferidos se encontram presentes num baixo número de cópias (i.e. não mais do que 5 cópias, alternativamente, não mais do que três cópias, como uma outra alternativa, menos do que três cópias do ácido nucleico por célula transformada).

As lentilhas de água transformadas de forma estável expressam uma hormona de uma proteina biologicamente activa, factor de crescimento, ou citocina, ou insulina, ou hormona de crescimento (em particular, hormona de crescimento humano). Alternativamente, a lentilha de água expressa β-glucuronidase biologicamente activa. As lentilhas de água podem exprimir a-2b-interferão, por exemplo precursor do a-2b-interferão humano (Número de Acesso da NCBI de proteínas AAB59402; apresentado na SEQ ID N°4), ou a-2b-interferão maduro humano (aminoácidos 24-188 de NCBI de proteínas com o número de acesso N° AAB9401; apresentado na SEQ ID N°5) ou variantes biologicamente activas.

Por "variante biologicamente activa" do a-2b-interferâo humano entende-se um polipéptido derivado do polipéptido nativo por supressão ( a chamada truncagem) ou a adição de um ou vários aminoácidos do terminal-N e/ou terminal C da proteína nativa; a supressão ou a adição de um ou vários aminoácidos num ou vários locais na proteína nativa; ou substituição de um ou vários aminoácidos num ou vários locais da proteína nativa. Uma variante biologicamente activa dos polipéptidos de a-2b-interferão compreendidos na presente invenção são biologicamente activos, isto é continuam a possuir a actividade biológica desejada, ou do a-2b-interferão nativo, incluindo a 29 capacidade de aumentar a resistência a infecções virais, ou a capacidade de modular a transcrição dos alvos génicos regulados pelo a-2b-interferão. Tais variantes biologicamente activas podem resultar de, por exemplo, polimorfismo genético, ou de manipulação humana. Variantes biologicamente activas de uma proteína nativa de a-2b-interferão da invenção vão ter pelo menos cerca de 50%, 60%, 65%, 70%, geralmente pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, preferencialmente pelo menos cerca de 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 98%, 99% ou mais de identidade de sequência da sequência de aminoácidos indicados na SEQ ID N°4 ou SEQ ID N°5. Assim, uma variante biologicamente activa de um a-2b-interferão da invenção pode diferir daquela proteína por menos do que 1-15 resíduos de aminoácidos, tão poucos como 1-10, tais como 6-10, tão poucos como 5, tão poucos como 4, 3, 2, ou mesmo 1 resíduo de aminoácido. Exemplos de variantes biologicamente activas do α-interferão humano são conhecidas do estado da técnica. Ver, por exemplo, Patente Europeia de invenção EP211148B1, e Patente US Nos. 4,748,233, 4,801,685, 4,816,566, 4,973,479, 4,975,276, 5,089,400, 5,098,703, 5,231,176 e 5,869,293. A comparação de sequências e determinação da percentagem de identidade e percentagem de semelhança entre duas sequências pode ser conseguida utilizando um algoritmos matemático. Numa concretização preferida, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453 que é incorporado no programa GAP do pacote de software GCG (disponível em www.accelrys. com), utilizando uma matriz BLOSSUM62 ou uma matriz PAM250, e um peso das lacunas de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso do comprimento de 1,2,3, 4,5,ou 6. Ainda, numa outra concretização preferida, 30 a identidade de percentagem entre duas sequências nucleótidicas é determinada utilizando o programa GAP no pacote de software GCG, utilizando a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915) e um peso de lacunas de 40, 50, 60, 70 ou 80, e um peso do comprimento de 1,2,3,4,5, ou 6. Um conjunto particular de parâmetros (e o que poderia ser utilizado se o operador não estiver certo sobre quais os parâmetros que deverão ser aplicados para determinar se a molécula estiver dentro de uma limitação da identidade de sequência da invenção) é a utilização da matriz de pontuação BLOSUM62 com um peso de lacunas de 60 e um peso do comprimento de 3) . A identidade percentual entre dois aminoácidos ou sequências nucleótidicas pode também ser determinada utilizando o algoritmos de E. Meyers e W. Miller (1989) CABIOS 4:11-17 que foi incorporado por referência no programa ALIGN (versão 2.0), utilizando uma tabela de pesos de resíduos PAM120, uma pena de comprimento de gap de 12 e uma pena de gap de 4.

Numa concretização, as plantas de lentilhas de água transformadas de forma estável, ou culturas de nódulos expressam polipéptidos biologicamente activos que não podem ser eficazmente produzidos comercialmente pelos sistemas existentes de expressão génica devido ao custo ou às limitações logísticas, ou a ambos. Por exemplo, algumas proteínas não podem ser expressas em sistemas de mamíferos, porque as proteínas interferem com a viabilidade celular, a proliferação celular, a diferenciação celular, ou o conjunto de proteínas nas células de mamíferos. Tais proteínas incluem, mas não se encontram limitadas à proteína do retinoblastoma, p53, angiostatina, e leptina. A presente invenção pode ser vantajosamente utilizada para produzir proteínas reguladoras de mamíferos; não é 31 provável, dado a grande distância evolutiva entre as plantas superiores e mamíferos que estas proteínas vão interferir com processos reguladores nas lentilhas de água. As lentilhas de água transgénicas podem também ser utilizadas para produzir grandes quantidades de proteínas, tais como albumina do soro (em particular albumina do soro humano), hemoglobina, e colagénio que desafiam as capacidades de produção dos sistemas de expressão existentes.

Finalmente, sistemas de plantas superiores podem ser submetidos a engenharia genética para produzir proteínas multiméricas biologicamente activas (por ex. anticorpos monoclonais, hemoglobina, P450 oxidase, e colagénio, e semelhantes), muito mais facilmente do que podem os sistemas de mamíferos. A título de exemplo, uma estratégia para produzir proteínas multiméricas biologicamente activas nas lentilhas de água utiliza um vector de expressão contendo os genes que codificam para todas as sub-unidades de polipéptidos. Ver, por ex. During et al. (1990) Plant. Mol. Biol. 15:281 e van Engelen et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:1701. O vector é então introduzido nas células de lentilhas de água utilizando qualquer processo de transformação conhecido, tal como um bombardeamento balístico ou uma transformação mediada por Agrobacterium. Este processo resulta em linhas celulares clonais que expressam todos os polipéptidos necessários para construir a proteína multimérica. Uma variação nesta estratégia é fazer construções de genes únicos, misturar o ADN destas construções e depois administrar esta mistura de ADNs em células de plantas utilizando bombardeamento balístico de transformação mediada pela Agrobacterium. Como uma outra variação, alguns ou todos os vectores podem codificar para mais do que uma sub-unidade da proteína multimérica (i.e de modo a que haja menos clones de lentilhas de água a serem 32 cruzados do que o número de sub-unidades na proteína multimérica). Numa concretização alternativa, cada clone de lentilhas de água expressa pelo menos uma das subunidades da proteína multimérica, e clones de lentilhas de água que secretam cada sub-unidade são cultivados em conjunto e a proteína multimérica é construída no meio das várias subunidades secretadas. Nalgumas alturas pode ser desejável produzir menos do que todas as subunidades de uma proteína multimérica, ou mesmo uma única sub-unidade de proteína, numa planta de lentilha de água transformada, ou nódulo de cultura de lentilhas de água, por ex. para processos industriais, ou químicos, ou para fins de diagnóstico, terapêuticos, ou vacinação.

Exemplos

Os exemplos seguintes são oferecidos com o objectivo de ilustrar a invenção e não como limitação.

Vectores de Expressão 0 vector de expressão pBMSP-1 utilizado nalguns exemplos é descrito na Patente de invenção US N° 5,955,646. A cassete transcricional pBMSP-1 contém três cópias de uma sequência nucleótidica de activação transcricional derivada da Agrobacterium tumefaciens octopina sintase e, uma sequência nucleótidica de activação transcricional adicional derivada do gene da manopina sintase da Agrobacterium tumefaciens, uma região promotora derivada do gene da manopina sintase da Agrobacterium tumefaciens, um local de poli-ligação para inserção da sequência nucleótidica que codifica para o polipéptido de interesse, e uma sequência de terminação derivada do gene da nopalina sintase da Agrobacterium tumefaciens. 0 vector de expressão 33 pBMSP-1 contém também uma sequência nucleótidica que codifica para a neomicina fosfotransferase II como marcador seleccionável. Transcrição da sequência marcadora seleccionável é conduzida por um promotor derivado do gene da nopalina sintase da Agrobacterium tumefaciens. 0 vector de expressão pBMSP-3, também utilizado nalguns dos exemplos seguintes, contém os componentes do vector de expressão pBMSP-1 descrito acima e contém adicionalmente uma sequência nucleótidica correspondente aos nucleótidos 1222-1775 do gene da álcool desidrogenase do milho (GenBank Accession Number X04049) inserido entre o promotor e o agente de poli-ligação.

Construções de expressão para a produção do interferão g-2b humano nas lentilhas de água

As construções de expressão seguintes foram construídas utilizando processos bem conhecidos do estado da técnica. Ver por exemplo, Sambrook, J. Fritsh, E. F., e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. 34

Tabela 1

Nome da construção Vector de expressão Péptido de sinalização Sequência que codifica para o interferão IFN01 p-BMSP-1 Nenhum Interferão não optimizado (nucleótidos 580— 1077 do GenBank com o N° de acesso J00207 IFN02 p-BMSP-3 Interferão não-optimizado (nucleótidos 511-579 do GenBank com o n° de acesso J00207) Interferão não optimizado (nucleótidos 580— 1077 do GenBank com o N° de acesso J00207 IFN03 p-BMSP-3 Endoquitinase de Arabidopsis thaliana (nucleótidos 338-399 do GenBank com o n° de acesso AB023460 com um "A" adicional adicionado ao terminal 3' da sequência) Interferão não optimizado (nucleótidos 580— 1077 do GenBank com o N° de acesso J00207 IFN05 p-BMSP-3 a-amilase modificada do arroz* (que codifica para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°7) Interferão não optimizado (nucleótidos 580— 1077 do GenBank com o N° de acesso J00207 35

Tabela 1 (continuação)

Nome da construção Vector de expressão Péptido de sinalização Sequência que codifica para o interferão IFN07 p-BMSP-3 α-amilase do arroz do tipo selvagem (nucleótidos 34-126 com o N° de Acesso do GenBank M24286, que codifica para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°6) Interferão não optimizado (nucleótidos 580-1077 do GenBank com o N° de acesso J00207) IFN08 p-BMSP-3 α-amilase do arroz do tipo selvagem optimizada(SEQ ID N°3) Interferão não optimizado (nucleótidos 580-1077 do GenBank com o N° de acesso J00207) IFN09 p-BMSP-3 α-amilase do arroz do tipo selvagem optimizada(SEQ ID N°3) Interferão optimizado (SEQ ID N° : 2) IFN10 p-BMSP-3 Nenhum Interferão optimizado (SEQ ID N° : 2) IFN11 p-BMSP-1 α-amilase do arroz do tipo selvagem optimizada(SEQ ID N°3) Interferão optimizado (SEQ ID N° : 2) IFN12 p-BMSP-1 Nenhum Interferão optimizado (SEQ ID N° : 2) * A sequência nucleótidica que codifica para o péptido de sinalização modificado da α-amilase corresponde a nucleótidos 34-126 com o N° de Acesso do GenBank n° M24286, com excepção de que os nucleótidos 97-102 foram alterados de "CTTGGC" para "ATCGTC" 36

Transformação das Lentilhas de Água

Frondes de lentilhas de água ou cultura de nódulos das lentilhas de água (derivadas da estirpe de Lemna minor 8627 nestes exemplos) são transformadas com as construções de expressão descritas acima utilizando processos de transformação mediados pelas Agrobacterias. Estirpe de Agrobacterium tumefaciens C58Z707, uma estirpe desarmada de gama larga de hospedeiros C58 (Hepburn et al. (1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969) é utilizada nestes exemplos para transformação. As construções de expressão descritas acima são mobilizadas em A. tumefaciens por electroporação, ou por um processo de reprodução triparental utilizando E. coli MM2 94 que alberga o plasmídeo de mobilização pRK2013 (Hoekema et al. (1983) Nature 303: 179-180; Ditta et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 77: 7347-7350). Estirpes C58Z707 compreendendo as construções de expressão descritas acima são colocadas em meio mínimo AB (Chilton et al., (1974) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71:3672-3676) ou em meio YEB (1 g/L de extracto de levedura, 5g/L de extracto de carne, 5 g/L de peptona, 5 g/L de sacarose, 0,5 g/L de MgSCt) contendo estreptomicina a 500 mg/L, espectinomicina a 50 mg/L e sulfato de canamicina a 50 mg/L e cultivada de um dia para o outro a 28°C.

Nestes exemplos, a estirpe de Lemna minor 8627 é utilizada para transformação apesar de poder ser utilizada qualquer estirpe de Lemna. São cultivadas frondes em meio líquido de Schenk e de Hildebrandt (Schenk e Hildebrandt (1972) Can. J. Bot. 50:199) contendo 1% de sacarose e 10 μΜ de ácido indoleacético a 23°C sob um fotoperíodo de 16 horas de luz/ 8 horas de escuridão com uma intensidade luminosa de aproximadamente 4 0 μΜ/ιη2.3. Para inoculação são separadas dos maciços frondes individuais e colocadas a flutuar sobre meio de inoculação durante aproximadamente 2 37 a 20 minutos. O meio de inoculação é meio de Schenk e de Hildebrandt (pH 5.6) suplementado com 0.6 M de manitol e 100 μΜ de acetosiringona, com a estirpe apropriada de Agrobacterium tumefaciens compreendendo a expressão de construção presente numa concentração de cerca de 1 x 109 células/ml. Estas frondes são então transferidas para um meio de Schenk e Hildebrandt (pH 5.6) contendo 1% de sacarose, 0,9% de agar, e 20 mg/ml de acetosiringona e são co-cultivados durante 3 a 4 dias no escuro a 23°C. A seguir a co-cultura, as frondes são transferidas para a recuperação em meio de Schenk e de Hildebrandt ou meio de Murashige e Skoog (Murashige e Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473) suplementado com 200 μρ/ιηΐ de sulfato de canamicina. As frondes são descontaminadas das Agrobactérias infestantes transferindo o tecido infectado para meio fresco com antibiótico cada 2 a 4 dias. As frondes são incubadas nesse meio durante aproximadamente quatro semanas em condições de baixa luminosidade (1-5 μΜ/m2.s) .

Culturas de nódulos das lentilhas de água para transformação são produzidas como se segue. Frondes das lentilhas de água são separadas, as raízes são cortadas com um escalpelo estéril, e as frondes são colocadas com o lado ventral para baixo, em meio de Murashige e Skoog (número do catálogo M-5519; Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO) pH 5,6, suplementado com 5 μΜ de ácido 2,4-diclorofenóxiacético, 0,5 μΜ l-fenil-3-(1,2,3-tiadiazol-5-il)ureia tidiazuron (Sigma P6186), 3% de sacarose, 0.4 Difco Bacto-agar (Fisher Scientific), e 0,15% de gelrite (Sigma). São cultivadas frondes durante 5-6 semanas. Nesta altura aparecem os nódulos (pequenas massas celulares amareladas), geralmente a partir da parte central do lado ventral. Este tecido do nódulo é desligado da fronde mãe e cultivado em meio Murashige e Skoog suplementado com 3% de 38 sacarose, 0,4% de Difco Bacto-agar, 0,15% de Gelrite, 1 μΜ de ácido 2,4-diclorofenóxiacético 1 μΜ e 2 μΜ de benziladenina.

Culturas de nódulos de lentilhas de água são transformadas como se segue. A estirpe adequada de Agrobacterium tumefaciens é cultivada em agar de dextrose de batata ou YEB agar com 50 mg/1 de canamicina e 100 μΜ de acetosiringona, e novamente suspensa em meio Murashige e Skoog suplementado com 0,6 M de manitol e 100 μΜ de acetosiringona. Tecido da cultura de nódulos é inoculado imergindo na solução de bactérias novamente em suspensão durante 1-2 minutos, transferido para remover o excesso de fluido e aplica-se em meio de co-cultura constituído por meio de Murashige e Skoog suplementado com auxina e citoquinina optimizada para promover o crescimento de nódulos e 100 μΜ de acetosiringona.

Para a selecção, tecido da cultura de nódulos é transferido para o meio de regeneração de Murashige e Skoog com 3% de sacarose, 1 μΜ de 2,4-diclorofenóxiacetato, 2 μΜ de benziladenina, 0,4% de Difco Bacto-Agar, 0,15% de Gelrite 500 mg/L de cefotaxime, e 200 mg/L de sulfato de canamicina e cultivadas durante aproximadamente 4 semanas sob luz contínua (20-40 μΜ/ιη2.3). O tecido dos nódulos é transferido cada 7 dias para meio de cultura fresco. A selecção é completada, quando o tecido do nódulo apresenta um crescimento vigoroso no agente de selecção. Nalguns exemplos, as culturas de lentilhas de água transformadas são transferidas directamente para o meio de regeneração para selecção, em vez de serem submetidas a selecção em meio de co-cultura.

Para a regeneração de lentilhas de água transformadas, a cultura de nódulos seleccionada é transferida para meio de regeneração (meio 0,5xSchenk e Hildebrandt suplementado 39 com 1% de sacarose e 200 mg/1 de canamicina) para organizar e produzir plantas. A cultura de nódulos é incubada em meio de regeneração com luz total durante aproximadamente 3 semanas, até aparecerem frondes. Frondes completamente organizadas são transferidas para meio liquido de Schenk e Hildebrandt com 1-3% de sacarose e incubadas com luz total para subsequente proliferação clonal.

Detecção do Interferão Biologicamente Activo Produzido a partir de Frondes de Lentilhas de Água ou Cultura de Nódulos de Lentilhas de água O interferão biologicamente activo é detectado através de vários ensaios, incluindo um imunoensaio em sandwich de fase sólida como descrito por Staehlin e tal. (1981) Methods Enzymol. 79:589-594 e Kelder e tal. (1986) Methods Enzymol. 119: 582-587, aqui incorporado por referência, e um ensaio de inibição de um efeito citopático (descrito por Tovey e tal. (1978) Nature 276:270-272. O interferão secretado é recolhido do meio de cultura das lentilhas de água, enquanto que o interferão não secretado é recolhido de plantas de lentilhas de água moídas ou lisadas ou de tecido de nódulos de lentilhas de água. O imunoensaio de fase sólida em sandwich para o interferão é efectuado utilizando um kit dos laboratórios PBL (New Brunswick, NJ) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o interferão é capturado por um anticorpo ligado aos poços das placas microtituladoras. Um segundo anticorpo é então utilizado para revelar o anticorpo ligado. Um anti-corpo anti-secundário conjugado com a peroxidase do rábano-silvestre (HRP -do inglês horseradish peroxidase) é então utilizado para marcar o interferão. Tetrametil benzidina (TMB) inicia uma alteração de cor catalisada pela peroxidase de modo que o nível do 40 interferão possa ser observado e comparado com um padrão. Um anticorpo monoclonal específico para o interferão a-2b-interferão (Cat. N° 11105, Laboratórios PBL) é utilizado neste ensaio nos presentes exemplos. O ensaio do efeito de inibição citopático é efectuado de acordo com os processos de Tovey e tal. (1978) Nature 276: 270-272. Resumidamente, diluições em duplicado em série da preparação a ser ensaiada são diluídas numa placa de microtitulação de 96 poços (Falcon Inc.) num volume de 100 μΐ de meio essencial de Eagles mínimo (Life Technologies Inc) suplementada com 2% de soro fetal de vitela (Life Technologies Inc) em paralelo com diluições em duplicado da preparação de referência de IFN-alfa do National Institutes of Human Health dos EUA (G-002-901-527). Vinte mil células humanas amnióticas (linha WISH) são então adicionadas a cada poço da placa de microtitulação num volume de 100 μΐ de meio com 2% de soro fetal de vitela. As células são incubadas de um dia para o outro numa atmosfera de 5% de CO2 no ar a 37°C, o meio é removido e substituído por 200 μΐ de meio com 2% de soro fetal de vitela contendo o vírus da estomatite vesicular numa multiplicidade de infecção de 0,1. As células são ainda incubadas de um dia para o outro numa atmosfera de 5% de CO2 no ar a 37°C e o efeito citopático devido à replicação do vírus é então avaliado com um microscópio de visível. Os títulos de interferão são expressos como o recíproco da diluição de IFN que originou 50% de protecção contra os efeitos citopáticos do vírus. Os títulos de interferão são expressos em unidades de referência internacional em relação ao título da preparação de referência.

Os exemplos seguintes demonstram a expressão do interferão biologicamente activo nas lentilhas de água. 41

Exemplo 1

Foi efectuado um estudo para determinar os níveis de IFN na cultura em meio e tecido para vários tempos numa cultura em descontínuo. Um conjunto de vasos de cultura de 20-30 ml 175 oz. foram inoculados no dia 0 com 20 frondes de uma linhagem previamente identificada como expressando níveis detectáveis de a-2b-interferão humano (IFN). As culturas foram feitas crescer em condições autotróficas tamponizadas com luminosidade contínua elevada fornecida por lâmpadas fluorescentes de crescimento de plantas/aquário. Para cada intervalo de tempo - dias 5,7, 13,15 e 18- o peso fresco e volume de meios foram medidos para quatro culturas. De cada cultura foram obtidas amostras de meio e de tecido e foi adicionado um cocktail de um inibidor da protease de plantas. As amostras de tecido foram feitas crescer e agitadas em vórtice a frio. O sobrenadante foi recolhido. Extractos de meio e de tecido foram armazenados a -70°C até todas as amostras serem recolhidas.

Foram determinados os níveis de IFN em meio e em extractos de tecido no mesmo dia utilizando o imunoensaio de sandwich de fase sólida descrito acima. A cultura total de IFN no meio e no tecido foi calculada multiplicando as concentrações de IFN medidas e o volume do meio e o peso fresco para a cultura, respectivamente. A Figura 1 apresenta os níveis relativos de IFN nos dias 7, 13, 15, e 18 comparado com o dia 5. O último ponto representa o valor médio de três culturas em vez de quatro devido à perda de uma cultura.

Exemplo 2

Foi efectuado um estudo para determinar os níveis de IFN na cultura em meio e tecido para vários tempos numa cultura em descontínuo. Um conjunto de vasos de cultura de 24-30 ml 175 oz. foram inoculados no dia 0 com 20 frondes da mesma 42 linhagem do exemplo 1. As culturas foram feitas crescer em condições autotróficas não tamponizadas com luminosidade continua elevada fornecida por lâmpadas fluorescentes de crescimento de plantas/aquário. Para cada intervalo de tempo - dias 7, 10, 12, 14, 17 e 19- o peso fresco e volumes médios foram medidos para quatro culturas. De cada cultura foram obtidas amostras de meio e de tecido e foi adicionado um cocktail de um inibidor da protease de plantas. As amostras de tecido foram feitas crescer e agitadas em vórtice a frio. O sobrenadante foi recolhido. Extractos de meio e de tecido foram armazenados a -70°C até todas as amostras serem recolhidas.

Foram determinados os níveis de IFN no mesmo dia utilizando o imunoensaio de sandwich de fase sólida descrito acima. A cultura total de IFN no meio e no tecido foi calculada multiplicando as concentrações de IFN medidas e o volume do meio e o peso fresco para a cultura, respectivamente. A Figura 2 apresenta os níveis relativos de IFN nos dias 14, 17, e 19 comparado com o dia 12. Os níveis de IFN do meio no dia 7 e no dia 10 encontravam-se abaixo da gama alargada do protocolo do ensaio de imunidade.

Exemplo 3

Foram produzidas linhagens de lentilhas de água transformadas com as construções de expressão listadas na Tabela 1 utilizando os processos descritos acima. Estas linhagens de lentilhas de água transformadas foram cultivadas durante 14 dias sob condições autotróficas. Albumina do soro de bovino numa concentração de 0,2 mg/ml foi incluída no meio de crescimento. No dia 14, foram preparados extractos de meio e de tecido como descrito no Exemplo 1, e os níveis de interferão nestes extractos foram determinados utilizando o imunoensaios em sandwich de fase 43 sólida descrito acima. A Tabela 2 indica o número de linhagens de lentilhas de água testadas e a concentração média de interferão no meio para cada construção de expressão. A tabela 3 apresenta os niveis de interferão no tecido de lentilhas de água para as linhagens de lentilhas de água transformadas com as construções de expressão do interferão que não continham um péptido de sinalização (IFN01, IFN10, e IFN12). São apresentados tanto o nível médio do interferão para todas as linhas clonais testadas para a construção designada como o nível de interferão para a linhagem de expressão máxima.

Tabela 2

Construção de Expressão # de Linhas Clonais Testadas Concentração média de Interferão (ng/ml) IFN01 41 0 IFN02 75 2,3 IFN03 41 0,18 IFN05 44 2,5 IFN07 41 1,5 IFN08 41 1,4 IFN09 41 30,3 IFN10 41 0 IFN11 39 9,9 IFN12 41 0

Tabela 3

Valor Médio Linhagem de maior expressão Construção de IFN % de proteína solúvel total % de Proteína solúvel total IFN01 0,00003 0,0001 IFN10 0,00064 0,0074 IFN12 0,00014 0,001 44 A actividade biológica do interferão produzido por estas linhagens transformadas de lentilhas de água foi testada através da inibição do ensaio de inibição do efeito citopático descrito acima. A tabela 4 indica os resultados para a linhagem de maior expressão para cada construção. A actividade do interferão é apresentada para o meio daquelas construções contendo um péptido de sinalização e para o tecido para aquelas construções que não possuem um péptido de sinalização.

Tabela 4

Linhagem de maior expressão Construção de IFN Material de Origem IU/ml (meio) IU/mg de proteína total (tecido) IFN01 Tecido 40 IFN 02 Meio 16000 IFN 03 Meio 320 IFN 05 Meio 6400 IFN 07 Meio 6000 IFN 08 Meio 3200 IFN 09 Meio 200000 IFN010 Tecido 19300 IFN011 Meio 30000 IFN012 Tecido 150

As caracteristicas seguintes podem ser observadas nos dados neste exemplo: (1) A secreção do interferão foi detectada apenas para aquelas linhagens de lentilhas de água transformadas com construções de expressão contendo um péptido de sinalização. Comparar, por exemplo com a concentração do interferão no meio para IFN02, IFN03, IFN05, IFN07, IFN08, IFN09 e IFN011 com aquela do IFN01, IFN10, e IFN12. (2) A secreção do interferão foi detectada para todas as construções de expressão contendo um péptido 45 de sinalização, em que a sequência de sinalização do interferão nativo humano produz o maior nivel de interferão secretado. Comparar, por exemplo, os niveis de interferão produzidos por IFN02 com aqueles produzidos por IFN03 e IFN05. (3) A utilização de codões preferidos das lentilhas de água conduz a uma expressão reforçada do interferão. Comparar, por exemplo, os niveis de interferão produzidos pelo IFN09 com aqueles do IFN05. (4) Foram conseguidos niveis de expressão mais elevados, através de optimização de codões de mais do que apenas do péptido de sinalização. Comparar, por exemplo, IFN08 com IFN09. (5) A inclusão da sequência do intrão da álcool desidrogenase do milho na expressão de construção resultou em niveis mais elevados na expressão do interferão. Comparar, por exemplo, IFN09 com IFN11 e IFN10 com IFN12 (6) . Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os niveis de interferão expressos a partir da construção contendo o péptido de sinalização da α-amilase (IFN05) em comparação com o que contém o péptido de sinalização da a-amilase modificado (IFN07).

Listagem de Sequências «ΪΚΜ&ΚΪΧ 5¾. DXsíw, t.yíís íSsssis-Xs, 6»ί>;-:

S.>^sssj* «í 0:-oi«sesK¥ Μ·*6 ® OxxàMXS *ss-s> «arts? •·ικ·:· m «í?m® X::':· i:·; X! <ÍS&> í.Ss *:vr>> .?;$ íV!5;:>®Í5v-v7-.:S'! *; ?sx í:«síS£0 !*r w»« Ví^x* ΐ, o <::;:> rm :'SíS>2í8ins^ iJ»Xs; *«<$*$« 5$X:.y*>CJÍÍJv tssssc.s$í,>; à<«tatai;s« ΐχίΛ.ϋ;ί;8%'·ϊ «««rçwsa* 8ν«ί,«·νί!\ίϊ;ΐ asasse skss

Vf VCUí-'(.'8i".uí ÇKWKsmtx asxçtvruí; ss§«s<j:jí:-jí: vXàíSSíít* «xsttççjsat v1··' ?’> aXí.^vX.íxu· t8'S;i<j »»*>;·; t<Jt«S8Cfcí& &a£e&&»3&e Uí.ti-i-em ?ct«8S«saa

cttíjss^att «t«sa««ws ítc^tscacs ccç.^sasKcs fcíST.Y:*!»^» s s vja ««*>;.* $fcs*fcstt«a jaaHçxssfc KOtUJÍSCBS iS#r.«it^»çS ísumun

Ui-scs-staivU' ua* Χλ.χίΧ.Ηνί.οΛ *' ' í X5>>.><\«X:-S ãáij^íjsttsíjc wrn<szsmm «.•jatgaavsi^ a-.aií.í.í.xía t.jí-^caaxn s«a*$a»$9X.

SvWssXSTv síxsxsttvi? tXXxcfcaçá;;

66 m = S:í <··:.;:< SOS :sí.« i 5 <> 568 hm hH 47 2

«21' :« iftg «Slte D>vA Ϊ¥4^ΐκ;Φί -íSSSJ» <£SS> OusSíwBed ísdsfí spSmixse síácl8«s&tesèí|*iance assstèfcg hussan a.ps-2& in&fasca <ÍSte CDS «222> ijí j ,..· {48$ «ιοφ- 2 íge jjàc CSC coc 03$ a cc caE a^c Cíffi es« tas CSC «SC acc etc Sta CpS teu ?£« Sis m- $ts 3«í aiy SSf Ãrg Asrs ?!»' teu 5\«t i s 1.0 Ϊ.Ϊ Ctq ea«t atq »35e «gs ate te« «t? ttt iigc tçe etg «sg sa« teu t&v. AI* CU» Sfcsi Airg s:ie ter Ae» Sha &«¥ Oy« Steu Lyá Asr> 20 ÍS 30 SSJt ca-s as« • srt «* Stc eeç P3S 3T«3 «a? cte esc «a-g tfc ÃS5 Ms Ssp SÍ» &Si6 6lft Sis Slu Sra Sly Asa Sio 21¾¾ Sis .ss 4S n ate get gag acg ate Cf® «tí Ctc GâG; gsg atg ate eag cag *t.E tte 132 Ws Ai* ®Ui íltt ris fss Vai ii&tí SiS Gitt n« Sia Si]. 11« Sím 5K 53 80 sàc «fcg tt-r age acc M9 gae age fccg· gee çraes «*& <m ac« <.'l·} 2S0 A3Í5 teu S«f ftjf t,ys *.«P Sw: ,S«£ Âí,a ?.:iíi Tfjs Asp ÇJs ¥te tee ÍS Ή1 75 80 Ctí «*« SAf tts tsc ase ÇF&S st« WMT esg «te aae. gac etg faf 2βί teAi Asp I-y.S Fns '•yr ?hv Slu íissst Vyx Sla sin &aa Âs.a Asp teu Slu âS SS s5 gs«r tgs stg ate gtt 5W gtt W seg ciíp «tf iie Λ£:ρ 53« Λ1® £γ& vai ris •siy Giy Val ?hr 3*a TSr iro. teu 3í6t J>y« 188 i® 5tÕ W efAC «pC ate £fc£ sec <1^ ege as® tas ttc cgs «tft seçs ctc 384 Ssi ítsp Ses lie htoi àia Vsl &rg Lys 'íj«r 2&6 cl» ítóg ria Tks tea Λ li Í2ÍS liS tse ítc aag pf aag S4Í age eej tge t'SS P'J gte çtt C-pC S33 Tyt iiUiS Lyss Sia Ays tys ?ys Sar Pí® Cys Ma Τκρ Siei Vai Vai .¾¾ 13S i:ss 140 Ç«tJ PO ate a*« ÍÇK tcc tts sge «tg asc aec aas «te «&s jsg sst ate Ála ôlu íl« 5fet ãjfg SíBS SSjs Ssr tesi Set ac jftan teu •Sb; eis* Sssr US ilt 1SS i|0 etc cg® ICC sag S*S tãa APS hm Aro S«5T iys ííi:í ♦ t«3 «210> 2 s£1?sâÉ «212>D8A. «21 &? 0:y*B ssSva dfefc-3 «esartsgeaff teetgaAeae sagsatetoe tetsecesgto sgtcçtt&te $0 gtcCtCCtcg fgctgafeag caactte&ee gcc$$e 98 48 <>£ ; \>ν Λ ·:·.ϊ i i > ί-ΑΤ

<5 ί'ϊ-S· HãCUS Sfi5>i-S>':S fíUC AU teu rta 5A« Ais ús Seu Ui AU Saiu te« UÍ U» seu C/S 1 5 ií> 3 5 í.ys Ses S«5 Çf!í Ses VU síy â;-; Aí>£ í.«:: iro Cia Ais Ur :.S:í n 55 35 Ôiy :;<·? M$ Arg Ur mt seu Í.«S Á.U U » ;<«t. Ã.i-i! &»$ 5U Ses 3$ íS Í5 MU Se* Çys ti«« Ays ÚÉ? Ará sis M# Sus 8.1y ?iu 5íí> Sia &U 55 55 <5iu ílua SJy Aã» 81« >>·* si» «y» Ais Si» “lir Π» Are Ul L«a MU ss ?e 55 se SiU ;·<»>· ri·.· 81» <ii!·. iu SÁS As» X-«8 Afce Sás- t&T 54<S ftísjí Sisí SSi $s ss 55 fti* AÀ« Asp Sla tfvs U« isu Aísp àyss 5U> Cví »r Si Si Asa S-ys- U5 Í>33 :U9 i»a «i» teu ú» AS^ u« SU .·«.·; Cy» VSl U« Si» «iy- Vei Ul %%$ 3?5 Sis ΪΑ* AiS ihv 5r» íssu lis» Ay» íii» fta® 5U iiã «us Ais Vai ,¾¾ sys 135 555 U3 ''>·ϊ: Í5MS Si» Ar a Sis SAí: Us ¥í<X ieu Ays Bis T?S Ur Sfse i«t* 555 m 355 €;:: Ais SÍ» U3 Vai Ais S3u n« sísí A;·.; S*r 5í:ã Ser àsu U5 i'i<> 335 SSi a.t As» As» Sis íi.U Ser Me Aí.·; s«r tys «w 555 i55 UU:· &

Ui-i :«í «;.;>

UiU HSi"* S&SWftt ·: 55;;:- 1: 49 ííffi 3'- t«a to Sis. to S3:S to í.iSS S3 y Ssj- Ar:; -to‘ to‘ í.ss K«5 3 3 15 ii< to 1-5 S JU.-S Si» S$t to .3s’5 33* Sai' to to to Sys: 3sls 5ys Asy 55 SS 55 to! to As» to 5.1 y 5%« to Ssifi Sis 53.» to Si>- Asa >13® to Si» 55' 45 45 5-S'fi Ais Sis ΊΆϊ li* ?Kft 5*3 La» B.is Sis Kat 31s 5>3a Si» íiA to 454 55 55 to 3·*« to 5*3 to 5-5 S to to Sfii to Ais to As>-! Sis to to 55 '53 J5 55 to As? í.ys to *y« ttiX 53.» to S.i.a 43.» toi Ass to li:» SÍ.5 ss 55 15 to «VS v*3 to to 44y to 5.3 y Vísi to- 53» T3« Así 5«» Mt »ys 155 355 iiS Si» Afijt .·>*: 13« toí. Ais to to i-ys i.Y'í 55« 51» As» U« 33x ;to i 35 355 33* ia-S to Si» SyS 3-ys to to to C>-5 sis Í'i5 Sis V*1 to ÁsS m m lis Sis Sis ii«- to toí S«í ífes Ses S>«« Sís» to As» 3S5 SiA Sl» 5»:· 345 353 35:5 555 to 3\*$ to to Sis 355 as to 5 toVto -to 3;. f4sr vSiwOíyíÃSS'»* s<»X>> & M*fc 31« V*í t«» -to Sw «st ?.»í Ãs» Ays Sis lh* tss S«« S>«» to l 3 i$ 53 v«i to ii« v»i to to SJy :to to to as» to tj» áls S-iy 35 3¾ 33 sí 'ΪΌ> 3 ;to 1 > 33 .··;::··· tor :ã: ·.::· Μ34ί5> Ã5-S5:toS: <333:.·

Sito S&hSÍSSCÍ '·>·>·: toto:·-»:-!-»: SSSSÍ 3-:5::33 \-'5.S3> 5 8*ΐ 33.fi vsi to tesfi Tfc$ to %*i *JS& 5»V« SiS Sfc* to S«£ to to 3 « 53 53 to 3'«« 35« to to -5'3i· to to 3*5 to A:5® to tfc* Ai* βΙγ η is η <3 i3> 3 ' :.: : - :>: -1-:5- -'3*: --:5: is Aritosp?» «si to Tbx As» to fim to to to 33* 33* to 3-** to to 3*3 5 & 33 35 to to to Aí* 33* 35

Lisboa, 8 de Novembro de 2010

Claims (16)

1 Reivindicações 1. Processo de produção de um polipéptido recombinante biologicamente activo numa cultura de lentilhas de água, ou numa cultura de nódulos de lentilhas de água, compreendendo as etapas constituídas por: (a) cultivar num meio de cultura de lentilhas de água, uma cultura de lentilhas de água, ou uma cultura de nódulos de lentilhas de água, na qual a dita cultura de lentilhas de água, ou a dita cultura de nódulos de lentilhas de água é transformada de forma estável para expressar o dito polipéptido recombinante biologicamente activo, e na qual o dito polipéptido recombinante biologicamente activo é expresso a partir de uma sequência nucleótidica compreendendo uma sequência de codificação para o dito polipéptido recombinante e uma sequência ligada de maneira funcional que codifica para um péptido de sinalização que dirige a secreção do polipéptido recombinante; e (b) recolher o dito polipéptido recombinante a partir do meio de cultura de lentilhas de água; no qual a dita sequência do péptido de sinalização é escolhida entre: (a) péptido de sinalização do a-2b-interferão humano; (b) péptido de sinalização da quitinase de Arabidopsis thaliana; (c) péptido de sinalização da α-amilase do arroz; e (d) péptido da α-amilase do arroz apresentada na SEQ ID N° : 7.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polipéptido recombinante é o a-2b-interferão, uma hormona de crescimento, ou um anticorpo monoclonal. 2

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a dita sequência nucleótidica possui pelo menos uma das caracteristicas escolhidas entre: (a) codões preferidos das lentilhas de água na sequência que codifica para o dito polipéptido recombinante; (b) codões preferidos das lentilhas de água na sequência que codifica para o dito péptido de sinalização; (c) codão de iniciação da tradução que é flanqueado por uma sequência nucleótidica de um contexto de iniciação da tradução preferida nas plantas; (d) sequência nucleótidica ligada de forma funcional compreendendo um intrão da planta que é inserido a montante da sequência de codificação; e (e) uma sequência leader 5' ligada de forma funcional.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que os ditos codões preferidos das lentilhas de água são os codões preferidos de Lemna gibba ou os codões preferidos de Lemna minor.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que pelo menos uma sequência de codificação escolhida entre a sequência de codificação para o dito polipéptido recombinante é a sequência de codificação para o dito péptido de sinalização compreende 70-100% de codões preferidos de Lemna gibba ou os codões preferidos de Lemna minor.

6. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que o dito intrão da planta possui a sequência apresentada na SEQ ID N°: 1. 3

7. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a dita sequência nucleótidica de um contexto de iniciação da tradução preferido nas plantas é constituída pela sequência nucleótidica "ACC" ou "ACA", em que o dito contexto se encontra imediatamente adjacente à extremidade 5' do codão de iniciação da tradução.

8. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o dito a-2b-interferão possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID N° 4: ou SEQ ID N°:5.

9. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o dito a-2b-interferão é o a-2b-interferão humano.

10. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o dito a-2b-interferão possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 4, ou SEQ ID N°5.

11. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito péptido de sinalização é o péptido de sinalização da a-amilase do arroz que possui a sequência apresentada na SEQ ID N° 3.

12. Cultura de lentilhas de água ou de nódulos de lentilhas de água transformada de forma estável para expressar um polipéptido recombinante biologicamente activo a partir de uma sequência nucleótidica compreendendo uma sequência que codifica para o dito polipéptido recombinante e uma sequência ligada de maneira funcional que codifica para um péptido de sinalização que dirige a secreção do polipéptido recombinante; na qual a dita sequência de péptido de sinalização é escolhida entre: (a) péptido de sinalização do a-2b-interferão humano, 4 (b) péptido de sinalização da quitinase de Arabidopsis thaliana; (c) péptido de sinalização da α-amilase do arroz; e (d) péptido da α-amilase do arroz modificado apresentado na SEQ ID N°:7.

13. Cultura de lentilhas de água, ou cultura de nódulos de lentilhas de água transformada de forma estável de acordo com a reivindicação 12, em que a dita cultura de lentilhas de água, ou cultura de nódulos de lentilhas de água é escolhida no grupo constituído pelo género espirodela, do género Wolffia, ou do género Wolfiella e do género Lemna.

14. Cultura de lentilhas de água, ou cultura de nódulos de lentilhas de água transformada de forma estável de acordo com a reivindicação 13, em que a dita cultura de lentilhas de água, ou cultura de nódulos de lentilhas de água é escolhido entre Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis, e Lemna gíbba.

15. Molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência nucleótidica que codifica para o a-2b-interferão apresentado na SEQ ID N° 2 ligado de maneira funcional à sequência nucleótidica que codifica para um péptido de sinalização apresentado na SEQ ID N°:3.

16. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 15, compreendendo ainda a sequência nucleótidica compreendendo um intrão apresentado na SEQ ID N°:l, em que a dita sequência nucleótidica contendo um intrão, a dita sequência nucleótidica que codifica para um péptido de sinalização e a dita sequência nucleótidica que codifica para o a-2b-interferão encontram-se ligadas de forma funcional. Lisboa, 8 de Novembro de 2010.