JP2004504848A - ウキクサにおける生物学的に活性なポリペプチド類の発現 - Google Patents
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Abstract
生物学的に活性なポリペプチド類を、遺伝子操作されたウキクサから発現および分泌させるための、方法、核酸配列、および形質転換ウキクサ植物体またはウキクサノジュール培養体を提供する。ウキクサにおける改良された発現に関するポリペプチドをコードする発現カセットのヌクレオチド配列を修飾することにより、ウキクサにおける組換えポリペプチド類の発現が改良される。生物学的に活性なポリペプチドを、培地中へのポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチドに連結することによって、生物学的に活性なポリペプチド類のウキクサからの回収が改良される。
Description
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、遺伝子操作されたウキクサから生物学的に活性なポリペプチド類を発現および分泌させる方法および組成物に関する。
【０００２】
［発明の背景］
ウキクサは、単子葉植物ウキクサ（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）科の唯一のメンバーである。４属、３４種は、全て小さく、浮動性の淡水植物であり、その地理的範囲は地球全体に広がる（Ｌａｎｄｏｌｔ（１９８６）ウキクサのファミリーに関するバイオシステマティック調査：ウキクサのファミリーモノグラフ研究（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｕｃｋｗｅｅｄｓ：Ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｔｕｄｙ）Ｇｅｏｂａｔａｎｉｓｃｈｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＥＴＨ，Ｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｒｕｂｅｌ，Ｚｕｒｉｃｈ）。既知の形態学的に最も不完全な植物であるが、ほんどのウキクサ種は、根、幹、花、種子および葉状体を含む、はるかに大きい植物が有する組織および器官を全て具有する。ウキクサ種は広範囲に研究されており、その生態学、系統分類学、生活環、代謝、病気および悪疫易感受性、その生殖生物学、遺伝子構造、および細胞生物学について詳述するかなりの文献が存在する。（Ｈｉｌｌｍａｎ（１９６１）Ｂｏｔ．Ｒｅｖｉｅｗ ２７：２２１；Ｌａｎｄｏｌｔ（１９８６）ウキクサのファミリーに関するバイオシステマティック調査：ウキクサファミリーモノグラフ研究（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｕｃｋｗｅｅｄｓ：Ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｔｕｄｙ）Ｇｅｏｂａｔａｎｉｓｃｈｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＥＴＨ，Ｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｒｕｂｅｌ，Ｚｕｒｉｃｈ）。
【０００３】
ウキクサの成長習性は、微生物学的培養方法にとって理想的である。この植物は、酵母での無性的増殖に似た巨視的様式で、新しい葉状体の無性出芽（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｂｕｄｄｉｎｇ）によって急速に増殖する。この増殖は、成長点の細胞からの無性出芽によって起こる。成長点領域は小さく且つ葉状体の下表面にある。成長点の細胞は、葉状体の中心葉脈（ｍｉｄｖｅｉｎ）の両側の２つのポケット内にある。この小さい中心葉脈領域は、根が始まり、また各葉状体をその母葉状体に連結する茎が生じる部位でもある。成長点のポケットは、組織弁（ｔｉｓｓｕｅ ｆｌａｐ）で保護されている。葉状体は、これらのポケットから交互に出芽する。倍加時間は、種ごとに異なり、２０〜２４時間と短い（Ｌａｎｄｏｌｔ（１９５７）Ｂｅｒ．Ｓｃｈｗｅｉｚ．Ｂｏｔ．Ｇｅｓ．６７：２７１；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｂｕｌｌ．Ｉｎｓｔ．Ｃｈｅｍ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．２４：１９；Ｄａｔｋｏ ａｎｄ Ｍｕｄｄ（１９７０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．６５：１６；Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｚ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ．６２：３１６）。
【０００４】
ウキクサの集中培養によって、単位時間当たり最高率のバイオマス蓄積が得られ（Ｌａｎｄｏｌｔ ａｎｄ Ｋａｎｄｅｌｅｒ（１９８７）ウキクサ科−モノグラフ研究２巻：植物化学、生理学、応用、文献目録（Ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｔｕｄｙ Ｖｏｌ．２：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｂｉｂｌｉｏｇｒａｐｈｙ），Ｖｅｒｏｆｆｅｎｔｌｉｃｈｕｎｇｅｎ ｄｅｓ Ｇｅｏｂｏｔａｎｉｓｃｈｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ＥＴＨ， Ｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｒｕｂｅｌ，Ｚｕｒｉｃｈ）、その乾燥重量蓄積は、生体重の６〜１５％の範囲である（Ｔｉｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．４６：５；Ｌａｎｄｏｌｔ（１９５７）Ｂｅｒ．Ｓｃｈｗｅｉｚ．Ｂｏｔ．Ｇｅｓ．６７：２７１；Ｓｔｏｍｐ、未発表のデータ）。様々な条件で成長した多数のウキクサ種のタンパク質含量は、乾燥重量の１５〜４５％の範囲であると報告されている（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（１９７７）Ｂｕｌｌ．Ｉｎｓｔ．Ｃｈｅｍ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．２４：１９；Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｈｕｉ（１９７８）Ｚ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ． ８９：９１；Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ａｑｕａｔｉｃ Ｂｏｔａｎｙ ７：２７２；Ａｐｐｅｎｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｆｌａｎｚ．１７７：２５１）。これらの値によれば、ウキクサにおける、培地１リットル当たりのタンパク質産生レベルは酵母遺伝子発現系とほぼ同じである。
【０００５】
ウキクサにおける有性生殖は、培地成分、および光周期および培養密度を含む培養条件によって調節される。花誘導は、一部の種では、定型的な実験法である。植物は普通に自家受粉し、また、培養体を穏やかに振盪することによって、実験室で自己増殖を行うことができる。この方法によって、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａ（イボウキクサ）の同系繁殖系（ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅ）が開発された。自然突然変異が確認されており（Ｓｌｏｖｉｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８６，５２２）、明確に定められた特徴を備えた突然変異体の作成に、化学的突然変異誘発およびγ線突然変異誘発（ＥＭＳまたはＮＭＵを使用）が使用されてきた。Ｌ．ｇｉｂｂａの外交配は単調であるが、管理された、手による受粉によって行うことができる。ウキクサのゲノムサイズは、０．２５〜１．６３ｐｇ ＤＮＡ／２Ｃの間で変化し、染色体数は、２０〜８０の範囲であり、ウキクサ全体の平均は約４０である（Ｌａｎｄｏｌｔ（１９８６）ウキクサのファミリーに関するバイオシステマティック調査：ウキクサ科モノグラフ研究（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆＤｕｃｋｗｅｅｄｓ：Ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｔｕｄｙ）Ｇｅｏｂａｔａｎｉｓｃｈｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＥＴＨ，Ｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｒｕｂｅｌ，Ｚｕｒｉｃｈ）。倍数性レベルは、２〜１２Ｃ．Ｉｄ．の範囲であると推定される。ウキクサ内の遺伝的多様性は、二次生成物、アイソザイム、およびＤＮＡ配列を使用して調査研究されている（ＭｃＣｌｕｒｅ ａｎｄ Ａｌｓｔｏｎ（１９６６）Ｎａｔｕｒｅ ４９１６：３１１；ＭｃＣｌｕｒｅ ａｎｄ Ａｌｓｔｏｎ（１９６６）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔ．５３：８４９；Ｖａｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｐｌ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．１７７：１３９（１９９１）；Ｃｒａｗｆｏｒｄ ａｎｄ およびＬａｎｄｏｌｔ（１９９３）Ｓｙｓｔ．Ｂｏｔ．１０：３８９）。
【０００６】
ウキクサ植物またはウキクサノジュール培養は、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入、弾道衝撃（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、またはエレクトロポレーションを含む多数の方法のいずれか一つによって、関心のあるヌクレオチド配列を含有する発現カセットを用いて効率よく形質転換することができる。関心のあるヌクレオチド配列および選択物質に対する耐性を与える遺伝子の両者でウキクサ細胞を形質転換し、続いて選択物質を含有する培地で形質転換細胞を培養することにより、安定なウキクサ形質転換体を単離することができる。Ｓｔｏｍｐらに付与された米国特許第６，０４０，４９８号を参照されたい。
【０００７】
ウキクサ遺伝子発現系は、多数の調査研究および商業用途に有用であろう中枢的な技術を提供する。全体として、植物分子生物学の研究については、酵母と同様の研究における利便性を備えて操作することができる分化した植物系は、単離された遺伝子の発生上および生理学的な役割を分析するための非常に速やかなシステムを提供する。価値あるポリペプチド類の商業生産については、ウキクサに基づく系は、既存の微生物培養系または細胞培養系に勝る多数の利点を有する。植物は、生物学的に活性な哺乳類ポリペプチド類の微生物細胞産生と関連した一つの重大な問題を克服して、哺乳類細胞に似た翻訳後プロセッシングを示し、また、植物系は、マルチサブユニットタンパク質を構築する能力（微生物系でしばしば欠けている能力である）を有することが、他の研究者により証明されている（Ｈｉａｔｔ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：４６９）。組換えタンパク質の商業生産に必要なレベルへのウキクサバイオマスのスケールアップは、類似の哺乳類細胞のスケールアップより速く且つより費用効率が高く、また、他の推奨される植物産生系、例えば、大豆およびタバコと違って、ウキクサは、完全に封じられ（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）、管理されたバイオマス産生容器内で成長させることができるため、このシステムを既存のタンパク質産生産業基盤に組み込むことは、より容易である。
【０００８】
こうした特徴があるため、ウキクサは、組換えタンパク質を産生するための、効率のよい、植物に基づく系として開発する理想的な選択である。従って、本発明は、生物学的に活性なポリペプチド類を産生する手段としての、ウキクサ遺伝子発現系の効率を高める方法および組成物を提供する。
【０００９】
［発明の概要］
本発明は、ウキクサを発現系として使用して、生物学的に活性な組換えポリペプチド類を発現し、および回収するための方法および組成物に関する。本発明の一つの態様は、ウキクサにおける生物学的に活性なポリペプチド類の発現レベルを強化し、その結果として、この系での、ポリペプチド収量を増加し、価値ある生物学的に活性なポリペプチド類の有用な量の産生を可能にする方法を提供する。本発明の別の態様では、遺伝子操作されたウキクサ植物体またはウキクサノジュール培養体からの、生物学的に活性なポリペプチド類の指令された分泌方法を開示する。発現されるポリペプチドが分泌されることにより、その回収が容易になり、且つウキクサ組織の機械的粉砕または酵素的溶解によって生じうる活性の損失が防止される。
【００１０】
一つの実施形態では、本発明は、（ａ）ウキクサ培地内で、ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体を培養するステップであって、上記ウキクサ植物培養体または上記ウキクサノジュール培養体が、生物学的に活性な組換えポリペプチドを発現するように安定に形質転換されており、また上記生物学的に活性な組換えポリペプチドが、このポリペプチドに関するコード配列と培地中へのポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチドに関する作動可能に連結されたコード配列とを含むヌクレオチド配列から発現されることを特徴とするステップと、（ｂ）上記生物学的に活性なポリペプチドを、ウキクサ培養体から回収するステップとを含む、ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体で、生物学的に活性な組換えポリペプチドを産生する方法を含む。この方法の幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、（ａ）上記ポリペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、（ｂ）上記シグナルペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、（ｃ）植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列（ｐｌａｎｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｘｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に隣接する（ｆｌａｎｋｅｄ）翻訳開始コドンと、（ｄ）コード配列の上流に挿入された植物イントロンを含む、作動可能に連結されたヌクレオチド配列とからなる群から選択される少なくとも一つの特性を有する。この方法の幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドがウキクサ培地中に分泌される。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）ウキクサ培地内でウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体を培養するステップであって、上記ウキクサ植物培養体または上記ウキクサノジュール培養体が、上記生物学的に活性な組換えポリペプチドを発現するように安定に形質転換されており、また上記生物学的に活性な組換えポリペプチドが、このポリペプチドに関するコード配列と、培地中へのポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチドに関する作動可能に連結されたコード配列とを含むヌクレオチド配列から発現されることを特徴とするステップと、（ｂ）上記生物学的に活性なポリペプチドをウキクサ培地から回収するステップとを含む、ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体において、生物学的に活性な組換えポリペプチドを分泌する方法を含む。この方法の幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、（ａ）上記ポリペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、（ｂ）上記シグナルペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、（ｃ）植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列に隣接する翻訳開始コドンと、（ｄ）コード配列の上流に挿入された植物イントロンを含む作動可能に連結されたヌクレオチド配列とからなる群から選択される少なくとも一つの特性を有する。この方法の幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドがウキクサ培地中に分泌される。
【００１２】
上記方法の幾つかの実施形態では、シグナルペプチドは、（ａ）ヒトα−２ｂ−インターフェロンシグナル配列と、（ｂ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）キチナーゼシグナル配列と、（ｃ）コメα−アミラーゼシグナル配列と、（ｄ）修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コメα−アミラーゼ配列と、（ｅ）ウキクサシグナル配列と、（ｆ）生物学的に活性な組換えポリペプチドに本来備わっているシグナル配列と、からなる群から選択される。この方法の一つの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３に記載の配列を有するコメα−アミラーゼシグナルペプチドである。
【００１３】
上記方法の幾つかの実施形態では、ウキクサ優先コドンはＬｅｍｎａ優先コドン類である。さらなる実施形態では、ウキクサ優先コドンは、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドン類またはＬｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ（コウキクサ）優先コドン類である。さらなる実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドに関するコード配列およびシグナルペプチドに関するコード配列から選択され少なくとも一つのコード配列が、７０〜１００％のＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドン類またはＬｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ優先コドン類を含む。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体を培養するステップであって、上記ウキクサ植物培養体または上記ウキクサノジュール培養体が、上記生物学的に活性な組換えポリペプチドを発現するように安定に形質転換されており、また上記生物学的に活性な組換えポリペプチドが、ウキクサにおける発現強化のために修飾されているヌクレオチド配列によりコードされていることを特徴とするステップと、（ｂ）上記生物学的に活性なポリペプチドを、上記ウキクサ植物培養体または上記ウキクサノジュール培養体から回収するステップとを含む生物学的に活性な組換えポリペプチドを産生する方法を含む。この方法の幾つかの実施形態では、ウキクサにおける発現強化のために修飾されたヌクレオチド配列は、（ａ）上記生物学的に活性な組換えポリペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、（ｂ）植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列に隣接する翻訳開始コドンと、（ｃ）このコード配列の上流に挿入された植物イントロンを含む、作動可能に連結されたヌクレオチド配列とからなる群から選択される、少なくとも一つの特性を有する。
【００１５】
この方法の幾つかの実施形態では、ウキクサ優先コドンはＬｅｍｎａ優先コドンである。さらなる実施形態では、ウキクサ優先コドンはＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドンまたはＬｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ優先コドンである。さらなる実施形態では、コード配列は７０〜１００％のＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドンまたはＬｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ優先コドンを含む。
【００１６】
上記方法の幾つかの実施形態では、植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列「ＡＣＣ」または「ＡＣＡ」からなり、上記コンテクストは、翻訳開始コドンの５’末端のすぐ隣に配置されている。
【００１７】
上記方法の幾つかの実施形態では、上記植物イントロンを含む作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、配列番号１に記載の配列である。
【００１８】
任意の上記方法のうち、幾つかの実施形態では、ウキクサ葉状体培養体またはウキクサノジュール培養体は、生物学的に活性な多量体タンパク質のサブユニットの全てを発現し、構築する。さらなる実施形態では、多量体タンパク質は、コラーゲン、ヘモグロビン、Ｐ４５０オキシダーゼ、およびモノクローナル抗体からなる群から選択される。
【００１９】
任意の上記方法のうち、幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドは哺乳類ポリペプチドである。さらなる実施形態では、哺乳類ポリペプチドは治療用ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、哺乳類ポリペプチドは、インスリン、成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、β−グルコセレブロシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、網膜芽腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンジオスタチン、レプチン、モノクローナル抗体、サイトカイン類、受容体類、ヒトワクチン類、動物ワクチン類、植物ポリペプチド類、および血清アルブミンからなる群から選択される。
【００２０】
任意の上記方法のうち、幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドはα−２ｂ−インターフェロンである。さらなる実施形態では、α−２ｂ−インターフェロンはヒトα−２ｂ−インターフェロンである。さらなる実施形態では、ヒトα−２ｂインターフェロンは、配列番号４または配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
任意の上記方法のうち、幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドは、α−２ｂ−インターフェロンの生物学的に活性な変異形であり、上記生物学的に活性な変異形は、配列番号４または配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【００２２】
任意の上記方法のうち、幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドは酵素である。
【００２３】
他の実施形態において、本発明は、上記方法のいずれかの、安定に形質転換されたウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体を含む。さらなる実施形態では、安定に形質転換されたウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体は、Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ属、Ｗｏｌｆｆｉａ属、Ｗｏｌｆｉｅｌｌａ属、およびＬｅｍｎａ属からなる群から選択される。さらなる実施形態では、安定に形質転換されたウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体は、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｉｓｃｕｌａ（ヒメウキクサ）、Ｌｅｍｎａ ａｅｑｕｉｎｏｃｔｉａｌｉｓ（ナンゴクアオウキクサ）、およびＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａからなる群から選択される。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列の、生物学的に活性な変異形のアミノ酸配列であって、該生物学的に活性な変異形が、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号５に示すアミノ酸配列の生物学的に活性な変異形のアミノ酸配列であって、該生物学的に活性な変異形が、配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列がウキクサ優先コドンを含むことを特徴とする核酸分子を含む。さらなる実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列である。
【００２５】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号６に記載のコメα−アミラーゼシグナルペプチドアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７に記載の、修飾されたコメアミラーゼシグナルペプチドアミノ酸配列からなる群から選択されるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列がウキクサ優先コドンを含むことを特徴とする核酸分子を含む。さらなる実施形態では、ヌクレオチド配列は配列番号３に記載のヌクレオチド配列である。
【００２６】
他の実施形態において、本発明は、配列番号３に示す、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と、配列番号５に示す成熟ヒトα−２ｂ−インターフェロンをコードするヌクレオチド配列とを含む、ウキクサでヒトα−２ｂ−インターフェロンを発現および分泌させるための核酸分子を含む。シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列および上記成熟ヒトα−２ｂ−インターフェロンをコードするヌクレオチド配列は作動可能に連結されている。さらなる実施形態では、核酸分子は、配列番号１に示すイントロン包含ヌクレオチド配列をさらに含み、上記イントロン包含配列は、上記シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列および上記成熟ヒトα−２ｂ−インターフェロンをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【００２７】
これらの態様および本発明の他の態様を、以下に示す本発明の説明に、より詳細に開示する。
［発明の詳細な説明］
【００２８】
本発明では、遺伝子操作されたウキクサ植物体およびウキクサノジュール培養体からの、生物学的に活性なポリペプチド類の発現および回収を改良する方法を開示する。これらの方法は以下のステップを含む。
【００２９】
（１）少なくとも一つの生物学的に活性なポリペプチドを発現するように安定に形質転換されたウキクサ植物体またはウキクサノジュール培養体を培養するステップであって、このポリペプチドがウキクサにおける発現増強のために修飾されたヌクレオチド配列によってコードされていることを特徴とするステップと、生物学的に活性な該ポリペプチドをウキクサ培養体から回収するステップ。本発明に包含されるヌクレオチド配列に対する修飾としては、ウキクサ優先コドンをコード配列に使用すること、植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列を翻訳開始コドンに使用すること、およびこのポリペプチドをコードする配列の上流に植物イントロン配列を含むヌクレオチド配列を挿入することなどがあるが、それらに限定されない。
【００３０】
（２）ポリペプチドの培地中への分泌を指令するシグナル配列を含む少なくとも一つの生物学的に活性なポリペプチドを発現する、安定に形質転換されたウキクサ植物またはウキクサノジュール培養体を培養し、続いて該生物学的に活性なポリペプチドを培地から回収するステップ。この方法の一つの実施形態では、ウキクサにおける発現増強のために、生物学的に活性なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が修飾されている。あるいは、別の実施形態では、ウキクサにおける発現増強のために、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が修飾される。一つの実施形態では、ウキクサにおける発現増強のために、生物学的に活性なポリペプチドとシグナルペプチドとの両者をコードするヌクレオチド配列が修飾される。
【００３１】
別の態様として、本発明は、上記方法による生物学的に活性なポリペプチド類を産生する形質転換されたウキクサ植物体またはウキクサノジュール培養体を含む。
【００３２】
別の態様として、本発明は、生物学的に活性なヒトα−２ｂ−インターフェロンをウキクサで産生する方法および核酸配列を開示する。
【００３３】
［定義］
「ポリペプチド」は、単量体または多量体のタンパク質またはペプチドを指す。
【００３４】
「生物学的に活性なポリペプチド」は、通常、生物学的関連でポリペプチドに由来すると考えられる一つ以上の生物学的機能または一連の活性を実施する能力を有するポリペプチドを指す。用語、「生物学的に活性な」は、タンパク質が工業的プロセスまたは化学的プロセスでの、または治療薬、ワクチン、または診断用試薬としての使用に関心のある十分な活性を有する限り、自然のタンパク質と比較して生物学的活性が変化している（例えば抑制または強化されている）ポリペプチド類を含むことを、当業者は理解するであろう。生物学的活性は、当該技術分野で利用できるいずれかの方法で決定することができる。例えばインターフェロンファミリーメンバーのタンパク質の生物学的活性は、インターフェロン特異的抗体との相互作用、ウイルス感染に対する耐性を高める能力、またはインターフェロン制御遺伝子標的の転写を調節する能力を含む、多数の方法で決定することができる。
【００３５】
本明細書で使用される「関心のあるヌクレオチド配列」は、ウキクサにおける発現を企図したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。例えば本発明に従って形質転換されたウキクサを使用して、治療用ポリペプチド類（例えば獣医用または医療用）または免疫原性ポリペプチド類（例えばワクチン接種用）をコードするヌクレオチド配列を発現させることができる。
【００３６】
用語「発現」または「産生」は、遺伝子産物の転写、翻訳、およびアセンブリを含む、遺伝子産物の生合成を指す。
【００３７】
用語「ウキクサ」は、ウキクサ科のメンバーを指す。この科は、現在、以下の通りに４属、３４種のウキクサに分類されている。
Ｌｅｍｎａ属（Ｌ．ａｅｑｕｉｎｏｃｔｉａｌｉｓ、Ｌ．ｄｉｓｐｅｒｍａ、Ｌ．ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｇｉｂｂａ、Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｌ．ｍｉｎｏｒ、Ｌ．ｍｉｎｉｓｃｕｌａ、Ｌ．ｏｂｓｃｕｒａ、Ｌ．ｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ、Ｌ．ｔｅｎｅｒａ、Ｌ．ｔｒｉｓｕｌｃａ、Ｌ．ｔｕｒｉｏｎｉｆｅｒａ、Ｌ．ｖａｌｄｉｖｉａｎａ）；Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ属（Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｓ．ｐｏｌｙｒｒｈｉｚａ、Ｓ．ｐｕｎｃｔａｔａ）；Ｗｏｌｆｆｉａ属（Ｗａ．ａｎｇｕｓｔａ、Ｗａ．ａｒｒｈｉｚａ、Ｗａ．ａｕｓｔｒａｌｉｎａ、Ｗａ．ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｗａ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｗａ．ｃｏｌｕｍｂｉａｎａ、Ｗａ．ｅｌｏｎｇａｔａ、Ｗａ．ｇｌｏｂｏｓａ、Ｗａ．ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａ、Ｗａ．ｎｅｇｌｅｃｔａ）およびＷｏｌｆｉｅｌｌａ属（Ｗｌ．ｃａｕｄａｔａ、Ｗｌ．ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔａ、Ｗｌ．ｇｌａｄｉａｔａ、Ｗｌ．ｈｙａｌｉｎａ、Ｗｌ．ｌｉｎｇｕｌａｔａ、Ｗｌ．ｒｅｐｕｎｄａ、Ｗｌ．ｒｏｔｕｎｄａ、およびＷｌ．ｎｅｏｔｒｏｐｉｃａ）。ウキクサの他の属または種も、もし存在すれば、本発明の態様である。Ｌｅｍｎａ種は、Ｌａｎｄｏｌｔ （１９８６） Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｕｃｋｗｅｅｄｓ：Ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｔｕｄｙ Ｇｅｏｂａｔａｎｉｓｃｈｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＥＴＨ， Ｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｒｕｂｅｌ， Ｚｕｒｉｃｈに記載の分類表を使用して、分類することができる。
【００３８】
本明細書で使用される用語「ウキクサノジュール培養体」は、細胞の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、９５％、９０％、９５％、または１００％が分化した細胞であるウキクサ細胞を含む培養体を指す。本明細書で使用される「分化した細胞」は、未分化の細胞または他の組織型において見られる細胞と区別する少なくとも一つの表現型の特徴（例えば独特の細胞形態またはマーカー核酸またはタンパク質の発現）を有する細胞である。本明細書に記載のウキクサノジュール培養体の分化した細胞は、近接する細胞壁にて融合した相互接合した細胞のタイル状の平滑面を形成し、組織全体にわたって散在する葉状体原基に組織化し始めたノジュールを有する。ノジュール培養の組織の表面は、原形質連絡（ｐｌａｓｍａｄｅｓｍａｔａ）を介して互いに接合する表皮の細胞を有する。
【００３９】
本明細書で使用される「ウキクサ優先コドン」は、ウキクサにおけるコドン使用頻度が１７％より大きいコドンを指す。
【００４０】
本明細書で使用される「Ｌｅｍｎａ優先コドン」は、Ｌｅｍｎａ属におけるコドン使用頻度が１７％より大きいコドンを指す。
【００４１】
本明細書で使用される「Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドン」は、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａにおけるコドン使用頻度が１７％より大きいコドンを指し、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａにおけるコドン使用頻度は、Ｃｏｄｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｌｅａｓｅ１１３，０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝Ｌｅｍｎａ＋ｇｉｂｂａ＋［ｇｂｐｌｎ］）から入手した。
【００４２】
「翻訳開始コドン」は、関心のあるヌクレオチド配列から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するコドンを指す。
【００４３】
本明細書で使用される「翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列」は、翻訳開始コドンの５’に接した３つのヌクレオチドを指す。
【００４４】
本明細書で使用される「分泌」は、宿主植物細胞の原形質膜および細胞壁の両者を横切るポリペプチドの移行を指す。
【００４５】
ヌクレオチド配列に関連して本明細書で使用される「作動可能に連結された」は、互いに機能的関係に配置されている多数のヌクレオチド配列を指す。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は近接しており、また２つのタンパク質コード領域が接合することが必要な場合にはリーディングフレーム内にある。
【００４６】
［Ａ．発現カセット］
本発明によれば、安定に形質転換されたウキクサは、発現カセット内に含まれる関心のあるヌクレオチド配列を用いた形質転換によって得られる。発現カセットは、関心のある核酸または遺伝子に連結された転写開始領域を含む。このような発現カセットは、調節領域の転写制御下に置かれる関心のある遺伝子（例えば関心のある一つの遺伝子、関心のある二つの遺伝子、等）を挿入するための複数の制限部位を具備する。この発現カセットは、ただ一つの関心のある遺伝子をコードしてもよい。本発明のある特定の実施形態では、導入される核酸は２つ以上の発現カセットを含有し、それぞれが少なくとも一つの関心のある遺伝子をコードする。
【００４７】
転写開始領域、（例えばプロモーター）は、天然のままであってもよく、宿主と相同であっても外来または非相同であってもよく、または天然の配列であっても合成の配列であってもよい。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主に転写開始領域が存在しないことを意図する。本明細書で使用されるキメラ遺伝子は、コード配列に非相同である転写開始領域に作動可能に連結したコード配列を含む。
【００４８】
当該技術分野で既知の適するプロモーターを、本発明に従って使用することができる（細菌プロモーター、酵母プロモーター、真菌プロモーター、昆虫プロモーター、哺乳類、および植物プロモーターを含む）。例えばウキクサプロモーターを含む植物プロモーターを使用してもよい。代表的なプロモーターとしては、カリフラワー・モザイクウイルス３５Ｓプロモーター、オパイン合成酵素プロモーター（例えばｎｏｓ、ｍａｓ、ｏｃｓ、等）、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、リブロースビスフォスフェート（ＲｕｂＰ）カルボキシラーゼ小サブユニットプロモーター、およびアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターなどがあるが、その限りではない。ウキクサＲｕｂＰカルボキシラーゼ小サブユニットプロモーターは、当該技術分野で既知である（Ｓｉｌｖｅｒｔｈｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９）。植物、好ましくはウキクサを感染させるウイルス由来の他のプロモーターも適する。サトイモモザイクウイルス、クロレラウイルス（例えばクロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼプロモーター；Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８５）、トマト黄化壊疽ウイルス、タバコ茎壊疽ウイルス、タバコ壊死ウイルス、タバコ輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、キウリモザイクウイルス、落花生幹ウイルス（ｐｅａｎｕｔ ｓｔｕｍｐ ｖｉｒｕｓ）、アルファルファモザイクウイルス、サトウキビバシリフォーム（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂａｃｉｌｉｆｏｒｍ）バドナウイルス等から単離されたプロモーターなどがあるが、その限りではない。
【００４９】
最後に、所望のレベルの制御を与えるようにプロモーターを選択することができる。例えば場合によっては、構成的発現を与えるプロモーター（例えば、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のマンノピンシンターゼプロモーター）を使用することが有利なこともある。あるいは、他の状況では、特定の環境的刺激に応答して活性化されるプロモーター（例えば熱ショック遺伝子プロモーター、感想誘導性遺伝子プロモーター、病原体誘導性遺伝子プロモーター、創傷誘導性遺伝子プロモーター、および明／暗誘導性遺伝子プロモーター）または植物成長制御因子（例えばアブシジン酸、オーキシン類、サイトカイニン類、およびジベレリン酸によって誘導される遺伝子由来のプロモーター）を使用することが有利であろう。さらなる代替として、組織特異的な発現を与えるプロモーター（例えば根、葉、および花特異的プロモーター）を選択することができる。
【００５０】
所与のプロモーターの総体的な強さは、シス作動性ヌクレオチド配列の組合せおよび上流活性化配列等の空間的組織化による影響を受ける。例えばアグロバクテリウムツメファシエンス・オクトピンシンターゼ遺伝子に由来する活性化ヌクレオチド配列は、アグロバクテリウムツメファシエンス・マンノピンシンターゼプロモーターからの転写を増強することができる（Ｇｅｌｖｉｎらに付与された米国特許第５，９５５，６４６号参照）。本発明では、発現カセットは、関心のあるヌクレオチド配列の発現を増強するために、プロモーター配列の上流に挿入された活性化ヌクレオチド配列を含有することができる。一つの実施形態では、発現カセットは、アグロバクテリウムツメファシエンス・マンノピンシンターゼ遺伝子由来のプロモーターに作動可能に連結されたアグロバクテリウムツメファシエンス・オクトピンシンターゼ遺伝子由来の３つの上流活性化配列を含む（米国特許第５，９５５，６４６号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）参照）。
【００５１】
本転写カセットは、転写の５’−３’方向に、転写および翻訳開始領域、関心のあるヌクレオチド配列、および植物で機能する転写および翻訳終止領域を含む。当該技術分野で既知の任意の適する終止配列を、本発明に従って使用することが可能である。この終止領域は、転写開始領域を含む自然のものであってもよく、関心のあるヌクレオチド配列を含む自然のものであってもよく、または別のソースに由来してもよい。便利な終止領域は、アグロバクテリウムツメファシエンスのＴｉ−プラスミドから入手でき、例えば、オクトピン・シンセターゼ終止領域およびノパリン・シンセターゼ終止領域等である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１；Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１；Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１；Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１；Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９６２７も参照されたい。さらなる代表的な終止配列は、エンドウＲｕｂＰカルボキシラーゼ小サブユニット終止配列およびカリフラワー・モザイクウイルス３５Ｓ終止配列である。他の適する終止配列は、当業者に明白になるであろう。
【００５２】
あるいは、当該技術分野で既知の、任意の他の適する発現カセット上に、関心のある遺伝子を提供してもよい。
【００５３】
本発現カセットは、導入され、形質転換植物で発現される一つより多い遺伝子または核酸配列を含んでもよい。従って、各核酸配列は、５’制御配列および３’制御配列に作動可能に連結される。あるいは、多数の発現カセットを提供してもよい。
【００５４】
一般に、本発現カセットは、形質転換された細胞または組織を選択するための選択可能マーカー遺伝子を含む。選択可能マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子、ならびに除草性化合物に対する耐性を与える遺伝子などがある。除草剤耐性遺伝子は、一般に、除草剤に非感受性の修飾された標的タンパク質、または除草剤が作用する前に、植物において除草剤を分解または解毒する酵素をコードする。ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１３；ＤｅＢｌｏｃｋｅｔａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：６９１；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３を参照されたい。例えば、グリフォセート除草剤またはスルホニル尿素除草剤に対する耐性は、突然変異体標的酵素、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）およびアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）をコードする遺伝子を使用して得られている。グルホシネートアンモニウム、ボロモキシニル（ｂｏｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）、および２，４−ジクロロフェンオキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する耐性は、それぞれの除草剤を解毒する、ホスフィノスルシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ、または２，４ジクロロフェンオキシアセテートモノオキシゲナーゼをコードする細菌遺伝子を使用することによって得られている。
【００５５】
本発明のために、選択可能マーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ、（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎＰｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４：１）；シアナミドヒドラターゼ（Ｍａｉｅｒ−Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４２５０）；アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリネートシンターゼ（Ｐｅｒｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：７１５）；ｂａｒ遺伝子（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：１５０３；Ｍｅａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．３６：１３６７）；トリプトファンデカルボキシラーゼ（Ｇｏｄｄｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：９０７）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：３２７）；ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）；ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ；Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：４５５２）；ホスフィノスルシンアセチルトランスフェラーゼ（ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１３）；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌｌａｔｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３Ｄ：３３０）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Ａｎｄｅｒｓｏｎらに付与された米国特許第４，７６１，３７３号；Ｈａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２１：２６６）；５−エノールピルビルシキメート−ホスフェートシンターゼ（ａｒｏＡ；Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１７：７４１）；ハロアリールニトリラーゼ（Ｓｔａｌｋｅｒらに付与されたＷＯ ８７／０４１８１号）；アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１２２０）；ジヒドロプテロエイトシンターゼ（ｓｕｌＩ；Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１２７）；および３２ｋＤａの光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：１３４６（１９８３）をコードする遺伝子などがあるが、その限りではない。
【００５６】
ゲンタマイシン（例えば、ａａｃＣ１，Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１７：２０２−２０８）；クロラムフェニコール（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）ＥＭＢＯ Ｊ．２：９８７）；メトトレキセート（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９；Ｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８０７）；ヒグロマイシン（Ｗａｌｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０３；Ｚｈｉｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌｎａｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８：２１９；Ｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８０７）；ストレプトマイシン（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：８６）；スペクチノマイシン（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．５：１３１）；ブレオマイシン（Ｈｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７１）；スルホンアミド（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１５：１２７）；ブロモキシニル（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４１９）；２，４−Ｄ（Ｓｔｒｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：８１１）；ホスフィノスルシン（ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１３）；スペクチノマイシン（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄ ａｎｄ Ｃｈｕｐｅａｕ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：１３１）に対する耐性をコードする遺伝子も含まれる。
【００５７】
ｂａｒ遺伝子は、ホスフィノスルシン（ＰＰＴ）またはビアラホス等のグルホシネート型除草剤に対する除草剤耐性を与える。上記の通り、ベクター構築物に使用し得る他の選択可能なマーカーとしては、やはりビアラホス耐性およびホスフィノスルシン耐性に関するｐａｔ遺伝子、イミダゾリノン耐性に関するＡＬＳ遺伝子、ヒグロマイシン耐性に関するＨＰＨまたはＨＹＧ遺伝子、グリホサート耐性に関するＥＰＳＰシンターゼ遺伝子、Ｈｃ毒素に対する耐性に関するＨｍｌ遺伝子、および日常的に使用され、且つ当業者に既知の他の選択的作用物などがあるが、その限りではない。Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６；Ｃｈｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６３１４；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６３；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９；Ｂａｒｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ１７７−２２０；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５５５；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：６０３；Ｆｉｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：７１３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４００；Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２５４９；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４８０；Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９５２；Ｂａｉｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５０７２；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４６４７；Ｈｉｌｌｅｎａｎｄ−Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０９４；Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：３９７；Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７；Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３；Ｈｌａｖｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７８；およびＧｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２１を参照されたい。このような開示内容を、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００５８】
［Ｂ．ウキクサにおける発現強化のためのヌクレオチド配列の修飾］
本発明は、発現されるヌクレオチド配列の修飾を実現し、ウキクサにおけるその発現を強化する。このような一つの修飾は、ウキクサ優先コドンを使用した、関心のあるヌクレオチド配列の合成である。この方法は、植物優先コドンを含むヌクレオチド配列を合成する技術分野で利用できる。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号および第５，４３６，３９１号；Ｐｅｒｌａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １５：３３２４；Ｉａｎｎａｃｏｍｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：４８５；およびＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：４７７（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。好ましいコドンは、ウキクサで発現されるタンパク質中の最高頻度のコドンから決定される。例えば、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａのコドン使用頻度は、ウェブページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝Ｌｅｍｎａ＋ｇｉｂｂａ＋［ｇｂｐｌｎ］にあり、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒのコドン使用頻度は、ウェブページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝Ｌｅｍｎａ＋ｍｉｎｏｒ＋［ｇｂｐｌｎ］にある。ウキクサおよび他の単子葉植物における発現に合わせて最適化されている遺伝子を、本発明の方法で使用できることが確認されている。例えば、ＥＰ ０ ３５９ ４７２号、ＥＰ ０ ３８５ ９６２号、ＷＯ ９１／１６４３２号；Ｐｅｒｌａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３３２４；Ｉａｎｎａｃｏｍｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：４８５；およびＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：４７７等（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。さらに、遺伝子配列の全部または任意の部分を最適化することが可能であり、または合成の配列であってもよいことが確認されている。換言すれば、完全に最適化された、または部分的に最適化された配列も使用することが可能である。例えば、コドンの４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、ウキクサ優先コドンであってもよい。一つの実施形態では、コドンの９０〜９６％がウキクサ優先コドンである。関心のあるヌクレオチド配列のコード配列は、少なくとも１７％の頻度でＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａに使用されるコドンを含む。一つの実施形態では、修飾されたヌクレオチド配列は、配列番号２に示すヌクレオチド配列をコードするヒトα−２Ｂ−インターフェロンであり、９３％のウキクサ優先コドンを含有する。
【００５９】
他の修飾を、関心のあるヌクレオチド配列に実施して、ウキクサにおけるその発現を強化することもできる。こうした修飾としては、擬似ポリアデニル化シグナル、エキソンイントロンスプライシング部位シグナル、トランスポゾン様反復をコードする配列、および他のこのような十分に特性決定された遺伝子発現に有害な可能性がある配列の除去などがあるが、その限りではない。この配列のＧＣ含量を、宿主細胞で発現される既知の遺伝子を参照することによって算出される、所与の細胞宿主の平均レベルに調整することができる。可能な場合には、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるようにこの配列を修飾してもよい。
【００６０】
動物と植物では、翻訳開始コドンの最適な翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列に既知の差があり、こうした翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列の組成は、翻訳開始の効率に影響する可能性がある。例えば、Ｌｕｋａｓｚｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ１５４：８９−９８；およびＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３５：９９３−１００１を参照されたい。本発明では、関心のあるヌクレオチド配列の翻訳開始コドンの翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列を修飾して、ウキクサでの発現を強化することが可能である。一つの実施形態では、関心のあるヌクレオチド配列の翻訳開始コドンのすぐ上流の３ヌクレオチドが「ＡＣＣ」であるように、ヌクレオチド配列が修飾される。第２の実施形態では、こうしたヌクレオチドは「ＡＣＡ」である。
【００６１】
５’リーダー配列を使用することによって、ウキクサにおける導入遺伝子の発現を強化することもできる。このようなリーダー配列は、翻訳を強化するように作用することができる。翻訳リーダーは当該技術分野で既知であり、また、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳脊髄心筋炎５’非コード領域；Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：６１２６）；ポチウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコ腐食ウイルス（Ｔａｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）；Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５４：９）；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ；Ｍａｃａｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０）；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡからの未翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ ４；Ｊｏｂｌｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｈｒｋｅ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６２２）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ；Ｇａｌｌｉｅ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ，２３：５６）；ジャガイモ腐食ウイルスリーダー（ｐｏｔａｔｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ ｌｅａｄｅｒ）（Ｔｏｍａｓｈｅｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２７１７−２７２４）；Ｆｅｄ−１５’未翻訳領域（Ｄｉｃｋｅｙ（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２３１１−２３１７）；ＲｂｃＳ ５’未翻訳領域（Ｓｉｌｖｅｒｔｈｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９−５８）；およびトウモロコシ黄化斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ；Ｌｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：３８２）などがあるが、その限りではない。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ８４：９６５も参照されたい。トウモロコシデヒドロゲナーゼ１遺伝子、トウゴマカタラーゼ遺伝子、またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ トリプトファン経路遺伝子ＰＡＴ１からのイントロン配列を包含する、植物イントロン配列を含むリーダー配列も、植物における翻訳効率を高めることが示されている（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：１１８３−１２００；Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：９１３−９２０）。本発明の一つの実施形態では、配列番号１に記載の、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０４０４９）のヌクレオチド１２２２〜１７７５に対応するヌクレオチド配列を、関心のあるヌクレオチド配列の上流に挿入して、その翻訳効率を高める。
【００６２】
任意の単一の修飾または組合せることのできる複数の修飾を含む上記のウキクサ発現強化ヌクレオチド配列修飾のいずれかを、本発明で使用できることは確認されている。本明細書で使用される語句「ウキクサにおける発現強化のための修飾」は、こうした修飾の任意の一つまたは任意の組合せを含有するヌクレオチド配列を指す。
【００６３】
［Ｃ．シグナルペプチド］
分泌タンパク質は、通常、内質細網（ＥＲ）の膜上の受容体タンパク質と相互に作用し、細胞から分泌させるために、成長中のポリペプチド鎖が膜を横切って、内質細網内に移行するように指令する、「シグナルペプチド」を含有する前駆体ポリペプチド類から翻訳される。このシグナルペプチドは、しばしば前駆体ポリペプチドから切断されて、シグナルペプチドを欠く「成熟」ポリペプチドを生じる。本発明の実施形態では、培地中へのポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結しているヌクレオチド配列から、生物学的に活性なポリペプチドがウキクサで発現される。内質細網へのタンパク質移行（細胞外部に分泌させるため）を目的とする植物シグナルペプチドは、当該技術分野で既知である。例えば、Ｌｅｅらに付与された米国特許第６，０２０，１６９号を参照されたい。本発明では、ＥＲへの標的ポリペプチド発現に、任意の植物シグナルペプチドを使用することができる。幾つかの実施形態では、このシグナルペプチドは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ塩基性エンドキチナーゼシグナルペプチド（配列番号８；ＮＣＢＩタンパク質寄託番号ＢＡＡ８２８２３のアミノ酸１４〜３４）、エクステンシンシグナルペプチド（Ｓｔｉｅｆｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：７８５−７９３）、コメα−アミラーゼシグナルペプチド（配列番号６；ＮＣＢＩタンパク質寄託番号ＡＡＡ３３８８５のアミノ酸１〜３１）、または修飾コメα−アミラーゼシグナル配列（配列番号７）である。別の実施形態では、シグナルペプチドは、分泌されるウキクサタンパク質のシグナルペプチドに相当する。
【００６４】
あるいは、遺伝子操作されたウキクサで発現される組換えポリペプチド類を分泌させるために、哺乳類シグナルペプチドを使用することができる。植物細胞は、内質細網を標的とする哺乳類シグナルペプチドを認識し、これらのシグナルペプチドは、原形質膜を通過するばかりでなく植物細胞壁も通過するポリペプチド類の分泌を指令できることが証明されている。Ｈｉａｔｔらに付与された米国特許第５，２０２，４２２号および第５，６３９，９４７号を参照されたい。本発明の一つの実施形態では、ポリペプチド分泌を目的とする哺乳類シグナルペプチドは、ヒトα−２ｂ−インターフェロンシグナルペプチド（ＮＣＢＩタンパク質寄託番号ＡＡＢ５９４０２および配列番号４のアミノ酸１〜２３）である。
【００６５】
一つの実施形態では、ウキクサにおける発現増強のために、上記セクションＢに開示されている、関心のあるヌクレオチド配列に対するいずれかの修飾または修飾の組合せを使用して、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を修飾する。別の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３で記載されている修飾されたヌクレオチド配列によってコードされるコメα−アミラーゼであり、およそ９３％のウキクサ優先コドンを含有する。
【００６６】
分泌される生物学的に活性なポリペプチドは、当該技術分野で既知の従来の方法で培地から収穫し、クロマトグラフィ、電気泳動、透析、溶剤溶剤抽出等で精製することができる。
【００６７】
［Ｄ．形質転換されたウキクサ植物体およびウキクサノジュール培養体］
本発明で使用される安定に形質転換されたウキクサは、当該技術分野で既知の任意の方法で得ることができる。一つの実施形態では、安定に形質転換されたウキクサは、Ｓｔｏｍｐらに付与された米国特許第６，０４０，４９８号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている遺伝子導入方法の一つによって得られる。こうした方法としては、関心のあるヌクレオチド配列を含む核酸で被覆された微粒子銃を用いた弾道衝撃による遺伝子導入、エレクトロポレーションによる遺伝子導入、および関心のあるヌクレオチド配列を含むベクターを含むアグロバクテリウムが媒介する遺伝子導入などがある。一つの実施形態では、安定に形質転換されたウキクサは、Ｓｔｏｍｐらに付与された米国特許第６，０４０，４９８号に開示されているアグロバクテリウム媒介方法のいずれか一つによって得られる。使用されるグロバクテリウムは、アグロバクテリウムツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）である。
【００６８】
こうした方法で使用される安定に形質転換されたウキクサ植物が、正常な形態を示し、且つ有性生殖で繁殖可能なことは好ましい。好ましくは、本発明の形質転換植物は、導入された核酸のコピーを一つ含み、導入された核酸は、顕著な再配列を中に持たない。導入された核酸が低コピー数（すなわち、５コピー以下、あるいは、３コピー以下、さらなる代替として、形質転換細胞当たり３コピー未満の核酸）で存在するウキクサ植物もやはり好ましい。
【００６９】
安定に形質転換されたウキクサは、生物学的に活性なタンパク質ホルモン、成長因子、またはサイトカイン、インスリン、または成長ホルモン（特に、ヒト成長ホルモン）を発現する。あるいは、このウキクサは生物学的に活性なβ−グルクロニダーゼを発現する。このウキクサは、生物学的に活性なα−２ｂ−インターフェロン、例えばヒトα−２ｂ−インターフェロン前駆体（ＮＣＢＩタンパク質寄託番号ＡＡＢ５９４０２；配列番号４で記載）または成熟ヒトα−２ｂ−インターフェロン（ＮＣＢＩタンパク質寄託番号ＡＡＢ９４０２のアミノ酸２４〜１８８；配列番号５で記載）またはその生物学的に活性な変異形を発現する。
【００７０】
ヒトα−２ｂ−インターフェロンの「生物学的に活性な変異形」は、一つ以上のアミノ酸の、欠失（いわゆるトランケーション）または自然のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端への付加、自然のタンパク質の一つ以上の部位における一つ以上のアミノ酸の欠失または付加、または自然のタンパク質の一つ以上の部位における一つ以上のアミノ酸の置換によって、自然のポリペプチドから誘導されるポリペプチドを意図する。本発明に含まれる生物学的に活性な変異形α−２ｂ−インターフェロンポリペプチド類は、生物学的に活性である。すなわち、ウイルス感染に対する耐性を高めることができる能力、またはα−２ｂ−インターフェロン−制御遺伝子標的の転写を調整することができる能力を含む自然のα−２ｂ−インターフェロンの所望の生物学的活性を持ちつづける。このような生物学的に活性な変異形は、例えば、遺伝的多形またはヒトの操作に起因することがある。本発明の自然のα−２ｂ−インターフェロンタンパク質の生物学的に活性な変異形は、配列番号４または配列番号５で示すアミノ酸配列に対して、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、一般に少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、９９％またはそれより多い配列同一性を有する。従って、本発明のα−２ｂ−インターフェロンの生物学的に活性な変異形は、わずか１〜１５アミノ酸残基、１〜１０、例えば、６〜１０、わずか５、わずか４、３、２、または１アミノ酸残基だけ、そのタンパク質と異なってもよい。ヒトα−インターフェロンの生物学的に活性な変異形の例は、当該技術分野で既知である。例えば、欧州特許ＥＰ２１１１４８Ｂ１、および米国特許第４，７４８，２３３号、第４，８０１，６８５号、第４，８１６，５６６号、第４，９７３，４７９号、第４，９７５，２７６号、第５，０８９，４００号、第５，０９８，７０３号、第５，２３１，１７６号、および第５，８６９，２９３号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。
【００７１】
配列の比較および２配列間の％同一性および％類似性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行われる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の％同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍにて入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４４−４５３）を使用し、ＢＬＯＳＳＵＭ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよびギャップ重み（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さ重み１、２、３、４、５、または６を使用して、決定される。また別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のギャッププログラムを使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２得点マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）およびギャップ重み４０、５０、６０、７０、または８０および長さ重み（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５、または６を使用して、決定される。特に好ましいパラメーターのセット（および、専門家が、ある分子が本発明の配列同一性限界内であるかどうかを決定するために、どのパラメーターを適用すべきかについて確信がない場合、使用すべきもの）は、ＢＬＯＳＵＭ６２得点マトリックスと共にギャップ重み６０および長さ重み３を使用することである。
【００７２】
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の％同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み残差表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長さペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して決定することもできる。
【００７３】
一つの実施形態では、価格または実施上の制約またはその両者のため、安定に形質転換されたウキクサ植物体またはウキクサノジュール培養体は、既存の遺伝子発現系では効果的に工業的に製造できない生物学的に活性なポリペプチド類を発現する。例えば、一部のタンパク質は、細胞の生存能力、細胞増殖、細胞分化、または哺乳類細胞でのタンパク質アセンブリを妨害するため、哺乳類系で発現させることができない。このようなタンパク質としては、網膜芽腫タンパク質、ｐ５３、アンジオスタチン、およびレプチンなどがあるが、その限りではない。本発明は、哺乳類制御タンパク質を産生するために都合よく利用することができる。高等植物と哺乳動物との間の大きい進化論的距離を考えると、こうしたタンパク質がウキクサにおける制御プロセスを妨害する公算は低い。トランスジェニックウキクサを使用して、既存の発現系の産生能力を刺激する、多量のタンパク質、例えば、血清アルブミン（特に、ヒト血清アルブミン）、ヘモグロビン、およびコラーゲン等を産生することができる。
【００７４】
最後に、生物学的に活性な多量体タンパク質（例えば、モノクローナル抗体、ヘモグロビン、Ｐ４５０オキシダーゼ、およびコラーゲン等）を産生するように、哺乳類系よりはるかに容易に、高等植物系を操作することができる。生物学的に活性な多量体タンパク質をウキクサで産生するための一つの代表的なアプローチは、ポリペプチドサブユニットの全てをコードする遺伝子を含有する発現ベクターを使用する。例えば、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ，１５：２８１およびｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１７０１を参照されたい。次いで、任意の既知の形質転換方法、例えば、弾道衝撃またはアグロバクテリウム媒介形質転換を使用して、このベクターをウキクサ細胞に導入する。この方法を使用した結果として、多量体タンパク質のアセンブリに必要なポリペプチド類の全てを発現するクローン細胞系が得られる。このアプローチに対する変更は、単一遺伝子構築物を作製し、こうした構築物からのＤＮＡを一緒に混合し、次いで、弾道衝撃またはアグロバクテリウム媒介形質転換を使用して、このＤＮＡ混合物を植物細胞に送達する。さらなる変更として、ベクターの一部または全部が、多量体タンパク質の一つより多いサブユニットをコードしてもよい（すなわち、多量体タンパク質中のサブユニット数より少ないウキクサクローンが交差するように）。代替実施形態では、各ウキクサクローンが、多量体タンパク質のサブユニットの少なくとも一つを発現し、各サブユニットを分泌するウキクサクローンが一緒に培養され、培地中で様々な分泌サブユニットから多量体タンパク質が構築される。場合によっては、例えば、工業的または化学的プロセスでは、診断目的、治療目的、またはワクチン接種目的の場合、形質転換ウキクサ植物またはウキクサノジュール培養で、多量体タンパク質のサブユニットの全部より少なく、または単一のタンパク質サブユニットでも、産生することが望ましいこともある。
【００７５】
［実験］
以下の実施例は、例を挙げて説明するために提供するものであり、決して限定するためではない。
【００７６】
［発現ベクター］
実施例の一部で使用する発現ベクターｐＢＭＳＰ−１は、米国特許第５，９５５，６４６号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。ｐＢＭＳＰ−１転写カセットは、３コピーの、アグロバクテリウムツメファシエンス・オクトピンシンターゼ由来の転写活性化ヌクレオチド配列、およびアグロバクテリウムツメファシエンス・マンノピンシンターゼ遺伝子由来のさらなる転写活性化ヌクレオチド配列、アグロバクテリウムツメファシエンス・マンノピンシンターゼ遺伝子由来のプロモーター領域、関心のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入するためのポリリンカー部位、およびアグロバクテリウムツメファシエンス・ノパリン・シンターゼ遺伝子由来の終止配列を含有する。ｐＢＭＳＰ−１発現ベクターは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩをコードするヌクレオチド配列も選択可能マーカーとして含有する。選択可能マーカー配列の転写は、アグロバクテリウムツメファシエンス・ノパリン・シンターゼ遺伝子由来のプロモーターによって推進される。
【００７７】
やはり以下の実施例のいくつかで使用される発現ベクターｐＢＭＳＰ−３は、上記ｐＢＭＳＰ−１発現ベクターの成分を含み、且つ、プロモーターとポリリンカーとの間に挿入された、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０４０４９）のヌクレオチド１２２２〜１７７５に対応するヌクレオチド配列をさらに含む。
【００７８】
［ヒトα−２ｂ−インターフェロンをウキクサで産生するための発現構築物］
当該技術分野で既知の方法を使用して、以下の発現構築物を構築した。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照されたい。
【００７９】
【表１】
【００８０】
［ウキクサの形質転換］
アグロバクテリウム媒介形質転換方法を使用し、上記発現構築物を用いて、ウキクサ葉状体またはウキクサノジュール培養体（これらの実施例では、Ｌｅｍｎａ 系統８６２７に由来する）を形質転換する。これらの実施例では、アグロバクテリウムツメファシエンス菌株Ｃ５８Ｚ７０７（無害の（ｄｉｓａｒｍｅｄ）、広宿主範囲Ｃ５８菌株）（Ｈｅｐｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３１：２９６１−２９６９）を形質転換に使用する。動員プラスミド（ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ）ｐＲＫ２０１３を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（Ｈｏｅｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０３：１７９−１８０；Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３４７−７３５０）を使用し、エレクトロポレーションまたはトリペアレタル・メイティングの手順で、上記発現構築物を、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに動員する。上記発現構築物を含むＣ５８Ｚ７０７菌株を、５００ｍｇ／リットルのストレプトマイシン、５０ｍｇ／リットルのスペクチノマイシンおよび５０ｍｇ／リットルの硫酸カナマイシンを含有する、ＡＢミネラル培地（Ｃｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７１：３６７２−３６７６）上か、またはＹＥＢ培地（１ｇ／リットルの酵母抽出物、５ｇ／リットルのビーフ抽出物、５ｇ／リットルのペプトン、５ｇ／リットルのスクロース、０．５ｇ／リットルのＭｇＳＯ４）中に画線し、２８℃で一晩成長させる。
【００８１】
これらの実施例では、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ系統８６２７を形質転換に使用するが、任意のＬｅｍｎａ系統を使用してもよい。２３℃、１６時間明／８時間暗の光周期、およそ４０μＭ／ｍ２・秒の光強度下で、１％のスクロースおよび１０μＭのインドール酢酸を含有する液体Ｓｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地（Ｓｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（１９７２）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ．５０：１９９）で、葉状体を成長させる。播種の場合、個々の葉状体を集塊から分離し、播種培地中におよそ２〜２０分間浮遊させる。播種培地は、約１×１０９細胞／ｍｌの濃度で存在する発現構築物を含む適切なアグロバクテリウムツメファシエンス菌株を含む、０．６Ｍのマンニトールおよび１００μＭのアセトシリンゴンを加えたＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地（ｐＨ５．６）である。次いで、これらの葉状体を、１％のスクロース、０．９％の寒天、および２０ｍｇ／リットルのアセトシリンゴンを含有するＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地（ｐＨ５．６）に移し、暗所で、２３℃にて３日間または４日間共培養する。
【００８２】
共培養後、２００μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを加えたＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地またはＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３）に回収するために、葉状体を移す。感染した組織を、２〜４日毎に、抗生物質を含む新鮮な培地に移すことによって、感染性アグロバクテリウムから葉状体を除染する。微光（１〜５μＭ／ｍ２・秒）条件で、この葉状体を、この培地上でおよそ４週間インキュベートする。
【００８３】
形質転換用ウキクサノジュール培養体は、以下の通りに作成する。ウキクサ葉状体を分離し、滅菌したメスで根を切断し、５μＭの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、０．５μＭ １−フェニル−３（１，２，３−チアジアゾール−５−イル）尿素チジアズロン（Ｓｉｇｍａ社製 Ｐ６１８６）、３％のスクロース、０．４％のＤｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、および０．１５％のＧｅｌｒｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を加えたＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地（カタログ番号Ｍ−５５１９；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ５．６、上に、葉状体を、下面を下にして載せる。葉状体を５〜６週間成長させる。この時点で、一般に下面の中央部分から、ノジュール（小さい、黄色っぽい細胞塊）が出現する。このノジュール組織を母葉状体から離し、３％のスクロース、０．４％のＤｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ、０．１５％のＧｅｌｒｉｔｅ、１μＭの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、および２Ｍのベンジルアデニンを加えたＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地で培養する。
【００８４】
ウキクサノジュール培養体を以下の通りに形質転換する。適切なアグロバクテリウムツメファシエンス菌株を、５０ｍｇ／リットルのカナマイシンおよび１００μＭのアセトシリンゴンを含むジャガイモデキストロース寒天またはＹＥＢ寒天で培養し、０．６Ｍのマンニトールおよび１００μＭのアセトシリンゴンを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地に再懸濁する。ノジュール培養組織を、再懸濁した細菌溶液中に１〜２分間浸漬することによって播種し、過剰な流体を除去するために拭取り、ノジュール成長を促進するために最適化したオーキシンおよびサイトカイニンおよび１００μＭのアセトシリンゴンを加えたＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地からなる共培養培地上に載せる。
【００８５】
選択する場合、ノジュール培養組織を、３％のスクロース、１μＭの２，４−ジクロロフェンオキシアセテート、２μＭのベンジルアデニン、０．４％のＤｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ、０．１５％のＧｅｌｒｉｔｅ、５００ｍｇ／リットルのセフォタキシム、および２００ｍｇ／リットルの硫酸カナマイシンを含む再生培地Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地に移し、連続的明条件（２０〜４０μＭ／ｍ２・秒）で、およそ４週間培養する。このノジュール組織を７日毎に新鮮な培地に移す。選択物質で、ノジュール組織が勢いよい成長を示すとき、選択は完全である。一部の実施例では、共培養培地で選択する代わりに、形質転換されたウキクサノジュール培養を選択用の再生培地に直接移す。
【００８６】
形質転換されたウキクサを再生する場合、選択されたノジュール培養体を再生培地（０．５×１％のスクロースおよび２００ｍｇ／リットルのカナマイシンを加えたＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地）に移して組織化し、植物を生成する。このノジュール培養体を、完全照明（ｆｕｌｌ ｌｉｇｈｔ）下で、葉状体が現れるまでおよそ３週間、再生培地でインキュベートする。十分に組織化された葉状体を、１〜３％のスクロースを含む液体Ｓｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地に移し、さらなるクローン増殖のために、完全照明下でインキュベートする。
【００８７】
［ノジュール培養により産生された生物学的に活性なインターフェロンの検出］ 生物学的に活性なインターフェロンは、Ｓｔａｅｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ７９：５８９−５９４およびＫｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １１９：５８２−５８７（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載の固相サンドイッチイムノアッセイおよびＴｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７６：２７０−２７２（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載の細胞変性効果阻害アッセイを含む様々な分析法で検出される。分泌されたインターフェロンはウキクサ培地から回収し、非分泌インターフェロンは、摩砕または溶解したウキクサ植物またはウキクサノジュール組織から回収する。
【００８８】
製造業者の説明書に従ってＰＢＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）製のキットを使用して、インターフェロン用の固相サンドイッチイムノアッセイを実施する。簡単に記載すると、微量滴定プレートのウェルに結合させた抗体でインターフェロンを捕捉する。次いで、第２の抗体を使用して、結合した抗体を明らかにする。次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させ抗二次抗体を使用して、インターフェロンをマークする。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が、ペルオキシダーゼに触媒される変色を開始するため、インターフェロンレベルを観測し、標準と比較することができる。本実施例では、α−２ｂ−インターフェロンに特異的なモノクローナル抗体（カタログ番号１１１０５、ＰＢＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、このアッセイに使用する。
【００８９】
Ｔｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７６：２７０−２７２の方法に従って、細胞変性効果阻害アッセイを実施する。簡単に記載すると、米国国立衛生研究所ヒトＩＦＮα国際基準標本（Ｇ−００２−９０１−５２７）の段階的２倍希釈と並行して、９６ウェル微量滴定プレート（Ｆａｌｃｏｎ Ｉｎｃ）で、分析するべき標本の段階的２倍希釈を、２％のウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）を加えたＥａｇｌｅｓ最小培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）１００μｌで希釈する。次いで、ヒトアミノ細胞（ＷＩＳＨ系）２００００個を、２％のウシ胎仔血清を含む培地１００μｌの体積で、微量滴定プレートの各ウェルに加える。細胞を、空気中５％のＣＯ２の雰囲気で、３７℃にて一晩インキュベートし、培地を除去し、感染効率０．１で、水疱性口内炎ウイルスを含有する２％のウシ胎仔血清を含む培地２００μｌを補充する。細胞を、空気中５％のＣＯ２の雰囲気で、３７℃にてさらに一晩インキュベートし、次いで、ウイルス複製による細胞変性効果を光学顕微鏡で評価する。インターフェロン類の力価は、ウイルスの細胞変性効果に対して５０％の保護を与えたＩＦＮ希釈の逆数として表される。インターフェロン力価は、基準標本の力価を参照することにより、国際基準単位で表される。
【００９０】
以下の実施例は、ウキクサにおける生物学的に活性なインターフェロンの発現を証明するものである。
【００９１】
［実施例１］
バッチ式培養で、様々な時点における培地中および組織中の培養ＩＦＮレベルを決定するために、試験を実施した。０日に、一組の２０〜３０ｍｌ １７５オンスの培養ジャーに、検出可能なレベルのヒトα−２ｂインターフェロン（ＩＦＮ）を発現すると事前に確認された系の２０個の葉状体を播種した。植物／水槽蛍光栽培電球（ｇｒｏｗ ｂｕｌｂ）で提供される連続的高照明で、この培養を、独立栄養性の、緩衝条件で成長させた。４つの培養体について、各時点で（５日、７日、１３日、１５日、および１８日に）、生体重および培地体積を測定した。各培養体から、培地サンプルおよび組織サンプルを採取し、植物プロテアーゼインヒビターカクテルを加えた。組織サンプルを摩砕し、回転冷却した。上澄を回収した。全てのサンプルが回収されるまで、培地および組織抽出物を−７０℃で保存した。上述の固相サンドイッチイムノアッセイを使用して、培地中および組織抽出物のＩＦＮレベルを同一日に決定した。測定されたＩＦＮ濃度と、培地の体積および培養の生体重をそれぞれ乗じることによって、培地中および組織中の培養ＩＦＮ総量を算出した。図１は、５日と比較した、７日、１３日、１５日、および１８日における相対的ＩＦＮレベルを示す図である。最後の時点は、１つの培養体を失ったため、４つの培養体ではなく３つの培養体の平均値を表す。
【００９２】
［実施例２］
バッチ式培養で、様々な時点における培地中および組織中の培養ＩＦＮレベルを決定するために、試験を実施した。０日に、一組の２０〜３０ｍｌ １７５オンスの培養ジャーに、実施例１の場合と同じ系の２０個の葉状体を播種した。この培養を、植物／水槽蛍光栽培電球で提供される連続的高照明を用いた、独立栄養性非緩衝条件で成長させた。４つの培養体について、各時点で（７日、１０日、１２日、１４日、１７日、および１９日に）、生体重および培地体積を測定した。各培養から、培地サンプルおよび組織サンプルを採取し、植物プロテアーゼインヒビターカクテルを加えた。組織サンプルを摩砕し、回転冷却した。上澄を回収した。全てのサンプルが回収されるまで、培地および組織抽出物を−７０℃で保存した。上述の固相サンドイッチイムノアッセイを使用して、培地中および組織抽出物のＩＦＮレベルを同一日に決定した。測定されたＩＦＮ濃度と、培地の体積および培養の生体重をそれぞれ乗じることによって、培地中および組織中の培養ＩＦＮ総量を算出した。図２は、１２日と比較した、１４日、１７日、および１９日における相対的ＩＦＮレベルを示す図である。７日および１０日における培地ＩＦＮレベルは、イムノアッセイ用広範囲プロトコールの範囲未満であった。
【００９３】
［実施例３］
上述の方法を使用して、表１に記載の発現構築物で形質転換されたウキクサ系を作成した。これらの形質転換されたウキクサ系を、独立栄養条件で１４日間成長させた。成長培地には、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度のウシ血清アルブミンが含まれていた。１４日に、実施例１に記載の通りに、培地抽出物および組織抽出物を作製し、上述の固相サンドイッチイムノアッセイを使用して、これらの抽出物中のインターフェロンレベルを決定した。表２に、分析したクローンウキクサ系の数、および各発現構築物の、平均インターフェロン濃度を示す。表３に、シグナルペプチドを含有しないインターフェロン発現構築物（ＩＦＮ０１、ＩＦＮ１０、およびＩＦＮ１２）で形質転換されたウキクサ系の、ウキクサ組織内のインターフェロンレベルを示す。明示した構築物ごとに、分析した全てクローン系における平均インターフェロンレベル、および最高の発現系に関するインターフェロンレベルの両者を示す。
【００９４】
【表２】
【００９５】
【表３】
【００９６】
これらの形質転換されたウキクサ系で産生されるインターフェロンの生物学的活性を、上述の細胞変性効果阻害アッセイで分析した。表４に、最高の発現系の結果を、構築物ごとに示す。シグナルペプチドを含有する構築物の場合には培地について、シグナルペプチドを欠く構築物の場合には組織について、インターフェロン活性を示す。
【００９７】
【表４】
【００９８】
この実施例におけるデータについて、以下の特徴を挙げることができる。（１）インターフェロンの分泌は、シグナルペプチドを含有する発現構築物で形質転換されたウキクサ系の場合に限って検出された。例えば、ＩＦＮ０２、ＩＦＮ０３、ＩＦＮ０５、ＩＦＮ０７、ＩＦＮ０８、ＩＦＮ０９およびＩＦＮ０１１の培地インターフェロン濃度を、ＩＦＮ０１、ＩＦＮＩＯ、およびＩＦＮ１２のそれと比較されたい。（２）最高レベルのインターフェロン分泌をもたらす自然のヒトインターフェロンシグナル配列を含むシグナルペプチドを含有する全ての発現構築物で、インターフェロンの分泌が検出された。例えば、ＩＦＮ０２で産生されるインターフェロンレベルを、ＩＦＮ０３およびＩＦＮ０５で産生されるものと比較されたい。（３）ウキクサ優先コドンの使用は、インターフェロン発現増強につながる。例えば、ＩＦＮ０９で産生されるインターフェロンレベルを、ＩＦＮ０５で産生されるものと比較されたい。（４）シグナルペプチド以上のコドン最適化によって、より高い発現レベルが達成された。例えば、ＩＦＮ０８をＩＦＮ０９と比較されたい。（５）トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼイントロン配列が発現構築物に含まれることにより、より高いレベルのインターフェロン発現が得られた。例えば、ＩＦＮ０９をＩＦＮ１１と、ＩＦＮ１０をＩＦＮ１２と比較されたい。（６）野生型α−アミラーゼシグナルペプチドを含有する構築物（ＩＦＮ０７）と比較して、修飾されたα−アミラーゼシグナルペプチド（ＩＦＮ０５）を含有する構築物から発現されるインターフェロンレベルとの間で、統計学的な有意差は認められなかった。
【００９９】
本明細書に記載の全ての出版物および特許出願は、本発明に関連する当業者の水準を表す。各出版物または特許出願が引用することにより本明細書の一部をなすものとすると具体的且つ個々に指示された場合と同程度に、全ての出版物および特許出願を、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１００】
理解を明確にするために、説明するのに役立つ例および実施例として、上述の発明を詳細に説明してきたが、添付のクレームの範囲内で、ある一定の変更および修飾を実行できることが明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
実施例１に記載の、形質転換されたウキクサ培養の培地中および組織中のインターフェロンレベル（固相サンドイッチイムノアッセイで決定した）を示す図である。
【図２】
実施例２に記載の、形質転換されたウキクサ培養の培地中および組織中のインターフェロンレベル（固相サンドイッチイムノアッセイで決定した）を示す図である。
［発明の分野］
本発明は、遺伝子操作されたウキクサから生物学的に活性なポリペプチド類を発現および分泌させる方法および組成物に関する。
【０００２】
［発明の背景］
ウキクサは、単子葉植物ウキクサ（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）科の唯一のメンバーである。４属、３４種は、全て小さく、浮動性の淡水植物であり、その地理的範囲は地球全体に広がる（Ｌａｎｄｏｌｔ（１９８６）ウキクサのファミリーに関するバイオシステマティック調査：ウキクサのファミリーモノグラフ研究（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｕｃｋｗｅｅｄｓ：Ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｔｕｄｙ）Ｇｅｏｂａｔａｎｉｓｃｈｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＥＴＨ，Ｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｒｕｂｅｌ，Ｚｕｒｉｃｈ）。既知の形態学的に最も不完全な植物であるが、ほんどのウキクサ種は、根、幹、花、種子および葉状体を含む、はるかに大きい植物が有する組織および器官を全て具有する。ウキクサ種は広範囲に研究されており、その生態学、系統分類学、生活環、代謝、病気および悪疫易感受性、その生殖生物学、遺伝子構造、および細胞生物学について詳述するかなりの文献が存在する。（Ｈｉｌｌｍａｎ（１９６１）Ｂｏｔ．Ｒｅｖｉｅｗ ２７：２２１；Ｌａｎｄｏｌｔ（１９８６）ウキクサのファミリーに関するバイオシステマティック調査：ウキクサファミリーモノグラフ研究（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｕｃｋｗｅｅｄｓ：Ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｔｕｄｙ）Ｇｅｏｂａｔａｎｉｓｃｈｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＥＴＨ，Ｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｒｕｂｅｌ，Ｚｕｒｉｃｈ）。
【０００３】
ウキクサの成長習性は、微生物学的培養方法にとって理想的である。この植物は、酵母での無性的増殖に似た巨視的様式で、新しい葉状体の無性出芽（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｂｕｄｄｉｎｇ）によって急速に増殖する。この増殖は、成長点の細胞からの無性出芽によって起こる。成長点領域は小さく且つ葉状体の下表面にある。成長点の細胞は、葉状体の中心葉脈（ｍｉｄｖｅｉｎ）の両側の２つのポケット内にある。この小さい中心葉脈領域は、根が始まり、また各葉状体をその母葉状体に連結する茎が生じる部位でもある。成長点のポケットは、組織弁（ｔｉｓｓｕｅ ｆｌａｐ）で保護されている。葉状体は、これらのポケットから交互に出芽する。倍加時間は、種ごとに異なり、２０〜２４時間と短い（Ｌａｎｄｏｌｔ（１９５７）Ｂｅｒ．Ｓｃｈｗｅｉｚ．Ｂｏｔ．Ｇｅｓ．６７：２７１；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｂｕｌｌ．Ｉｎｓｔ．Ｃｈｅｍ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．２４：１９；Ｄａｔｋｏ ａｎｄ Ｍｕｄｄ（１９７０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．６５：１６；Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｚ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ．６２：３１６）。
【０００４】
ウキクサの集中培養によって、単位時間当たり最高率のバイオマス蓄積が得られ（Ｌａｎｄｏｌｔ ａｎｄ Ｋａｎｄｅｌｅｒ（１９８７）ウキクサ科−モノグラフ研究２巻：植物化学、生理学、応用、文献目録（Ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｔｕｄｙ Ｖｏｌ．２：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｂｉｂｌｉｏｇｒａｐｈｙ），Ｖｅｒｏｆｆｅｎｔｌｉｃｈｕｎｇｅｎ ｄｅｓ Ｇｅｏｂｏｔａｎｉｓｃｈｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ＥＴＨ， Ｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｒｕｂｅｌ，Ｚｕｒｉｃｈ）、その乾燥重量蓄積は、生体重の６〜１５％の範囲である（Ｔｉｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．４６：５；Ｌａｎｄｏｌｔ（１９５７）Ｂｅｒ．Ｓｃｈｗｅｉｚ．Ｂｏｔ．Ｇｅｓ．６７：２７１；Ｓｔｏｍｐ、未発表のデータ）。様々な条件で成長した多数のウキクサ種のタンパク質含量は、乾燥重量の１５〜４５％の範囲であると報告されている（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（１９７７）Ｂｕｌｌ．Ｉｎｓｔ．Ｃｈｅｍ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．２４：１９；Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｈｕｉ（１９７８）Ｚ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ． ８９：９１；Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ａｑｕａｔｉｃ Ｂｏｔａｎｙ ７：２７２；Ａｐｐｅｎｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｆｌａｎｚ．１７７：２５１）。これらの値によれば、ウキクサにおける、培地１リットル当たりのタンパク質産生レベルは酵母遺伝子発現系とほぼ同じである。
【０００５】
ウキクサにおける有性生殖は、培地成分、および光周期および培養密度を含む培養条件によって調節される。花誘導は、一部の種では、定型的な実験法である。植物は普通に自家受粉し、また、培養体を穏やかに振盪することによって、実験室で自己増殖を行うことができる。この方法によって、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａ（イボウキクサ）の同系繁殖系（ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅ）が開発された。自然突然変異が確認されており（Ｓｌｏｖｉｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８６，５２２）、明確に定められた特徴を備えた突然変異体の作成に、化学的突然変異誘発およびγ線突然変異誘発（ＥＭＳまたはＮＭＵを使用）が使用されてきた。Ｌ．ｇｉｂｂａの外交配は単調であるが、管理された、手による受粉によって行うことができる。ウキクサのゲノムサイズは、０．２５〜１．６３ｐｇ ＤＮＡ／２Ｃの間で変化し、染色体数は、２０〜８０の範囲であり、ウキクサ全体の平均は約４０である（Ｌａｎｄｏｌｔ（１９８６）ウキクサのファミリーに関するバイオシステマティック調査：ウキクサ科モノグラフ研究（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆＤｕｃｋｗｅｅｄｓ：Ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｔｕｄｙ）Ｇｅｏｂａｔａｎｉｓｃｈｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＥＴＨ，Ｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｒｕｂｅｌ，Ｚｕｒｉｃｈ）。倍数性レベルは、２〜１２Ｃ．Ｉｄ．の範囲であると推定される。ウキクサ内の遺伝的多様性は、二次生成物、アイソザイム、およびＤＮＡ配列を使用して調査研究されている（ＭｃＣｌｕｒｅ ａｎｄ Ａｌｓｔｏｎ（１９６６）Ｎａｔｕｒｅ ４９１６：３１１；ＭｃＣｌｕｒｅ ａｎｄ Ａｌｓｔｏｎ（１９６６）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔ．５３：８４９；Ｖａｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｐｌ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．１７７：１３９（１９９１）；Ｃｒａｗｆｏｒｄ ａｎｄ およびＬａｎｄｏｌｔ（１９９３）Ｓｙｓｔ．Ｂｏｔ．１０：３８９）。
【０００６】
ウキクサ植物またはウキクサノジュール培養は、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入、弾道衝撃（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、またはエレクトロポレーションを含む多数の方法のいずれか一つによって、関心のあるヌクレオチド配列を含有する発現カセットを用いて効率よく形質転換することができる。関心のあるヌクレオチド配列および選択物質に対する耐性を与える遺伝子の両者でウキクサ細胞を形質転換し、続いて選択物質を含有する培地で形質転換細胞を培養することにより、安定なウキクサ形質転換体を単離することができる。Ｓｔｏｍｐらに付与された米国特許第６，０４０，４９８号を参照されたい。
【０００７】
ウキクサ遺伝子発現系は、多数の調査研究および商業用途に有用であろう中枢的な技術を提供する。全体として、植物分子生物学の研究については、酵母と同様の研究における利便性を備えて操作することができる分化した植物系は、単離された遺伝子の発生上および生理学的な役割を分析するための非常に速やかなシステムを提供する。価値あるポリペプチド類の商業生産については、ウキクサに基づく系は、既存の微生物培養系または細胞培養系に勝る多数の利点を有する。植物は、生物学的に活性な哺乳類ポリペプチド類の微生物細胞産生と関連した一つの重大な問題を克服して、哺乳類細胞に似た翻訳後プロセッシングを示し、また、植物系は、マルチサブユニットタンパク質を構築する能力（微生物系でしばしば欠けている能力である）を有することが、他の研究者により証明されている（Ｈｉａｔｔ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：４６９）。組換えタンパク質の商業生産に必要なレベルへのウキクサバイオマスのスケールアップは、類似の哺乳類細胞のスケールアップより速く且つより費用効率が高く、また、他の推奨される植物産生系、例えば、大豆およびタバコと違って、ウキクサは、完全に封じられ（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）、管理されたバイオマス産生容器内で成長させることができるため、このシステムを既存のタンパク質産生産業基盤に組み込むことは、より容易である。
【０００８】
こうした特徴があるため、ウキクサは、組換えタンパク質を産生するための、効率のよい、植物に基づく系として開発する理想的な選択である。従って、本発明は、生物学的に活性なポリペプチド類を産生する手段としての、ウキクサ遺伝子発現系の効率を高める方法および組成物を提供する。
【０００９】
［発明の概要］
本発明は、ウキクサを発現系として使用して、生物学的に活性な組換えポリペプチド類を発現し、および回収するための方法および組成物に関する。本発明の一つの態様は、ウキクサにおける生物学的に活性なポリペプチド類の発現レベルを強化し、その結果として、この系での、ポリペプチド収量を増加し、価値ある生物学的に活性なポリペプチド類の有用な量の産生を可能にする方法を提供する。本発明の別の態様では、遺伝子操作されたウキクサ植物体またはウキクサノジュール培養体からの、生物学的に活性なポリペプチド類の指令された分泌方法を開示する。発現されるポリペプチドが分泌されることにより、その回収が容易になり、且つウキクサ組織の機械的粉砕または酵素的溶解によって生じうる活性の損失が防止される。
【００１０】
一つの実施形態では、本発明は、（ａ）ウキクサ培地内で、ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体を培養するステップであって、上記ウキクサ植物培養体または上記ウキクサノジュール培養体が、生物学的に活性な組換えポリペプチドを発現するように安定に形質転換されており、また上記生物学的に活性な組換えポリペプチドが、このポリペプチドに関するコード配列と培地中へのポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチドに関する作動可能に連結されたコード配列とを含むヌクレオチド配列から発現されることを特徴とするステップと、（ｂ）上記生物学的に活性なポリペプチドを、ウキクサ培養体から回収するステップとを含む、ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体で、生物学的に活性な組換えポリペプチドを産生する方法を含む。この方法の幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、（ａ）上記ポリペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、（ｂ）上記シグナルペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、（ｃ）植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列（ｐｌａｎｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｘｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に隣接する（ｆｌａｎｋｅｄ）翻訳開始コドンと、（ｄ）コード配列の上流に挿入された植物イントロンを含む、作動可能に連結されたヌクレオチド配列とからなる群から選択される少なくとも一つの特性を有する。この方法の幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドがウキクサ培地中に分泌される。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）ウキクサ培地内でウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体を培養するステップであって、上記ウキクサ植物培養体または上記ウキクサノジュール培養体が、上記生物学的に活性な組換えポリペプチドを発現するように安定に形質転換されており、また上記生物学的に活性な組換えポリペプチドが、このポリペプチドに関するコード配列と、培地中へのポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチドに関する作動可能に連結されたコード配列とを含むヌクレオチド配列から発現されることを特徴とするステップと、（ｂ）上記生物学的に活性なポリペプチドをウキクサ培地から回収するステップとを含む、ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体において、生物学的に活性な組換えポリペプチドを分泌する方法を含む。この方法の幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、（ａ）上記ポリペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、（ｂ）上記シグナルペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、（ｃ）植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列に隣接する翻訳開始コドンと、（ｄ）コード配列の上流に挿入された植物イントロンを含む作動可能に連結されたヌクレオチド配列とからなる群から選択される少なくとも一つの特性を有する。この方法の幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドがウキクサ培地中に分泌される。
【００１２】
上記方法の幾つかの実施形態では、シグナルペプチドは、（ａ）ヒトα−２ｂ−インターフェロンシグナル配列と、（ｂ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）キチナーゼシグナル配列と、（ｃ）コメα−アミラーゼシグナル配列と、（ｄ）修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コメα−アミラーゼ配列と、（ｅ）ウキクサシグナル配列と、（ｆ）生物学的に活性な組換えポリペプチドに本来備わっているシグナル配列と、からなる群から選択される。この方法の一つの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３に記載の配列を有するコメα−アミラーゼシグナルペプチドである。
【００１３】
上記方法の幾つかの実施形態では、ウキクサ優先コドンはＬｅｍｎａ優先コドン類である。さらなる実施形態では、ウキクサ優先コドンは、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドン類またはＬｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ（コウキクサ）優先コドン類である。さらなる実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドに関するコード配列およびシグナルペプチドに関するコード配列から選択され少なくとも一つのコード配列が、７０〜１００％のＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドン類またはＬｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ優先コドン類を含む。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体を培養するステップであって、上記ウキクサ植物培養体または上記ウキクサノジュール培養体が、上記生物学的に活性な組換えポリペプチドを発現するように安定に形質転換されており、また上記生物学的に活性な組換えポリペプチドが、ウキクサにおける発現強化のために修飾されているヌクレオチド配列によりコードされていることを特徴とするステップと、（ｂ）上記生物学的に活性なポリペプチドを、上記ウキクサ植物培養体または上記ウキクサノジュール培養体から回収するステップとを含む生物学的に活性な組換えポリペプチドを産生する方法を含む。この方法の幾つかの実施形態では、ウキクサにおける発現強化のために修飾されたヌクレオチド配列は、（ａ）上記生物学的に活性な組換えポリペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、（ｂ）植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列に隣接する翻訳開始コドンと、（ｃ）このコード配列の上流に挿入された植物イントロンを含む、作動可能に連結されたヌクレオチド配列とからなる群から選択される、少なくとも一つの特性を有する。
【００１５】
この方法の幾つかの実施形態では、ウキクサ優先コドンはＬｅｍｎａ優先コドンである。さらなる実施形態では、ウキクサ優先コドンはＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドンまたはＬｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ優先コドンである。さらなる実施形態では、コード配列は７０〜１００％のＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドンまたはＬｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ優先コドンを含む。
【００１６】
上記方法の幾つかの実施形態では、植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列「ＡＣＣ」または「ＡＣＡ」からなり、上記コンテクストは、翻訳開始コドンの５’末端のすぐ隣に配置されている。
【００１７】
上記方法の幾つかの実施形態では、上記植物イントロンを含む作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、配列番号１に記載の配列である。
【００１８】
任意の上記方法のうち、幾つかの実施形態では、ウキクサ葉状体培養体またはウキクサノジュール培養体は、生物学的に活性な多量体タンパク質のサブユニットの全てを発現し、構築する。さらなる実施形態では、多量体タンパク質は、コラーゲン、ヘモグロビン、Ｐ４５０オキシダーゼ、およびモノクローナル抗体からなる群から選択される。
【００１９】
任意の上記方法のうち、幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドは哺乳類ポリペプチドである。さらなる実施形態では、哺乳類ポリペプチドは治療用ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、哺乳類ポリペプチドは、インスリン、成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、β−グルコセレブロシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、網膜芽腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンジオスタチン、レプチン、モノクローナル抗体、サイトカイン類、受容体類、ヒトワクチン類、動物ワクチン類、植物ポリペプチド類、および血清アルブミンからなる群から選択される。
【００２０】
任意の上記方法のうち、幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドはα−２ｂ−インターフェロンである。さらなる実施形態では、α−２ｂ−インターフェロンはヒトα−２ｂ−インターフェロンである。さらなる実施形態では、ヒトα−２ｂインターフェロンは、配列番号４または配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
任意の上記方法のうち、幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドは、α−２ｂ−インターフェロンの生物学的に活性な変異形であり、上記生物学的に活性な変異形は、配列番号４または配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【００２２】
任意の上記方法のうち、幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組換えポリペプチドは酵素である。
【００２３】
他の実施形態において、本発明は、上記方法のいずれかの、安定に形質転換されたウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体を含む。さらなる実施形態では、安定に形質転換されたウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体は、Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ属、Ｗｏｌｆｆｉａ属、Ｗｏｌｆｉｅｌｌａ属、およびＬｅｍｎａ属からなる群から選択される。さらなる実施形態では、安定に形質転換されたウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体は、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｉｓｃｕｌａ（ヒメウキクサ）、Ｌｅｍｎａ ａｅｑｕｉｎｏｃｔｉａｌｉｓ（ナンゴクアオウキクサ）、およびＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａからなる群から選択される。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列の、生物学的に活性な変異形のアミノ酸配列であって、該生物学的に活性な変異形が、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号５に示すアミノ酸配列の生物学的に活性な変異形のアミノ酸配列であって、該生物学的に活性な変異形が、配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列がウキクサ優先コドンを含むことを特徴とする核酸分子を含む。さらなる実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列である。
【００２５】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号６に記載のコメα−アミラーゼシグナルペプチドアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７に記載の、修飾されたコメアミラーゼシグナルペプチドアミノ酸配列からなる群から選択されるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列がウキクサ優先コドンを含むことを特徴とする核酸分子を含む。さらなる実施形態では、ヌクレオチド配列は配列番号３に記載のヌクレオチド配列である。
【００２６】
他の実施形態において、本発明は、配列番号３に示す、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と、配列番号５に示す成熟ヒトα−２ｂ−インターフェロンをコードするヌクレオチド配列とを含む、ウキクサでヒトα−２ｂ−インターフェロンを発現および分泌させるための核酸分子を含む。シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列および上記成熟ヒトα−２ｂ−インターフェロンをコードするヌクレオチド配列は作動可能に連結されている。さらなる実施形態では、核酸分子は、配列番号１に示すイントロン包含ヌクレオチド配列をさらに含み、上記イントロン包含配列は、上記シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列および上記成熟ヒトα−２ｂ−インターフェロンをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【００２７】
これらの態様および本発明の他の態様を、以下に示す本発明の説明に、より詳細に開示する。
［発明の詳細な説明］
【００２８】
本発明では、遺伝子操作されたウキクサ植物体およびウキクサノジュール培養体からの、生物学的に活性なポリペプチド類の発現および回収を改良する方法を開示する。これらの方法は以下のステップを含む。
【００２９】
（１）少なくとも一つの生物学的に活性なポリペプチドを発現するように安定に形質転換されたウキクサ植物体またはウキクサノジュール培養体を培養するステップであって、このポリペプチドがウキクサにおける発現増強のために修飾されたヌクレオチド配列によってコードされていることを特徴とするステップと、生物学的に活性な該ポリペプチドをウキクサ培養体から回収するステップ。本発明に包含されるヌクレオチド配列に対する修飾としては、ウキクサ優先コドンをコード配列に使用すること、植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列を翻訳開始コドンに使用すること、およびこのポリペプチドをコードする配列の上流に植物イントロン配列を含むヌクレオチド配列を挿入することなどがあるが、それらに限定されない。
【００３０】
（２）ポリペプチドの培地中への分泌を指令するシグナル配列を含む少なくとも一つの生物学的に活性なポリペプチドを発現する、安定に形質転換されたウキクサ植物またはウキクサノジュール培養体を培養し、続いて該生物学的に活性なポリペプチドを培地から回収するステップ。この方法の一つの実施形態では、ウキクサにおける発現増強のために、生物学的に活性なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が修飾されている。あるいは、別の実施形態では、ウキクサにおける発現増強のために、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が修飾される。一つの実施形態では、ウキクサにおける発現増強のために、生物学的に活性なポリペプチドとシグナルペプチドとの両者をコードするヌクレオチド配列が修飾される。
【００３１】
別の態様として、本発明は、上記方法による生物学的に活性なポリペプチド類を産生する形質転換されたウキクサ植物体またはウキクサノジュール培養体を含む。
【００３２】
別の態様として、本発明は、生物学的に活性なヒトα−２ｂ−インターフェロンをウキクサで産生する方法および核酸配列を開示する。
【００３３】
［定義］
「ポリペプチド」は、単量体または多量体のタンパク質またはペプチドを指す。
【００３４】
「生物学的に活性なポリペプチド」は、通常、生物学的関連でポリペプチドに由来すると考えられる一つ以上の生物学的機能または一連の活性を実施する能力を有するポリペプチドを指す。用語、「生物学的に活性な」は、タンパク質が工業的プロセスまたは化学的プロセスでの、または治療薬、ワクチン、または診断用試薬としての使用に関心のある十分な活性を有する限り、自然のタンパク質と比較して生物学的活性が変化している（例えば抑制または強化されている）ポリペプチド類を含むことを、当業者は理解するであろう。生物学的活性は、当該技術分野で利用できるいずれかの方法で決定することができる。例えばインターフェロンファミリーメンバーのタンパク質の生物学的活性は、インターフェロン特異的抗体との相互作用、ウイルス感染に対する耐性を高める能力、またはインターフェロン制御遺伝子標的の転写を調節する能力を含む、多数の方法で決定することができる。
【００３５】
本明細書で使用される「関心のあるヌクレオチド配列」は、ウキクサにおける発現を企図したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。例えば本発明に従って形質転換されたウキクサを使用して、治療用ポリペプチド類（例えば獣医用または医療用）または免疫原性ポリペプチド類（例えばワクチン接種用）をコードするヌクレオチド配列を発現させることができる。
【００３６】
用語「発現」または「産生」は、遺伝子産物の転写、翻訳、およびアセンブリを含む、遺伝子産物の生合成を指す。
【００３７】
用語「ウキクサ」は、ウキクサ科のメンバーを指す。この科は、現在、以下の通りに４属、３４種のウキクサに分類されている。
Ｌｅｍｎａ属（Ｌ．ａｅｑｕｉｎｏｃｔｉａｌｉｓ、Ｌ．ｄｉｓｐｅｒｍａ、Ｌ．ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｇｉｂｂａ、Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｌ．ｍｉｎｏｒ、Ｌ．ｍｉｎｉｓｃｕｌａ、Ｌ．ｏｂｓｃｕｒａ、Ｌ．ｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ、Ｌ．ｔｅｎｅｒａ、Ｌ．ｔｒｉｓｕｌｃａ、Ｌ．ｔｕｒｉｏｎｉｆｅｒａ、Ｌ．ｖａｌｄｉｖｉａｎａ）；Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ属（Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｓ．ｐｏｌｙｒｒｈｉｚａ、Ｓ．ｐｕｎｃｔａｔａ）；Ｗｏｌｆｆｉａ属（Ｗａ．ａｎｇｕｓｔａ、Ｗａ．ａｒｒｈｉｚａ、Ｗａ．ａｕｓｔｒａｌｉｎａ、Ｗａ．ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｗａ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｗａ．ｃｏｌｕｍｂｉａｎａ、Ｗａ．ｅｌｏｎｇａｔａ、Ｗａ．ｇｌｏｂｏｓａ、Ｗａ．ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａ、Ｗａ．ｎｅｇｌｅｃｔａ）およびＷｏｌｆｉｅｌｌａ属（Ｗｌ．ｃａｕｄａｔａ、Ｗｌ．ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔａ、Ｗｌ．ｇｌａｄｉａｔａ、Ｗｌ．ｈｙａｌｉｎａ、Ｗｌ．ｌｉｎｇｕｌａｔａ、Ｗｌ．ｒｅｐｕｎｄａ、Ｗｌ．ｒｏｔｕｎｄａ、およびＷｌ．ｎｅｏｔｒｏｐｉｃａ）。ウキクサの他の属または種も、もし存在すれば、本発明の態様である。Ｌｅｍｎａ種は、Ｌａｎｄｏｌｔ （１９８６） Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｕｃｋｗｅｅｄｓ：Ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｌｅｍｎａｃｅａｅ−Ａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｔｕｄｙ Ｇｅｏｂａｔａｎｉｓｃｈｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＥＴＨ， Ｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｒｕｂｅｌ， Ｚｕｒｉｃｈに記載の分類表を使用して、分類することができる。
【００３８】
本明細書で使用される用語「ウキクサノジュール培養体」は、細胞の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、９５％、９０％、９５％、または１００％が分化した細胞であるウキクサ細胞を含む培養体を指す。本明細書で使用される「分化した細胞」は、未分化の細胞または他の組織型において見られる細胞と区別する少なくとも一つの表現型の特徴（例えば独特の細胞形態またはマーカー核酸またはタンパク質の発現）を有する細胞である。本明細書に記載のウキクサノジュール培養体の分化した細胞は、近接する細胞壁にて融合した相互接合した細胞のタイル状の平滑面を形成し、組織全体にわたって散在する葉状体原基に組織化し始めたノジュールを有する。ノジュール培養の組織の表面は、原形質連絡（ｐｌａｓｍａｄｅｓｍａｔａ）を介して互いに接合する表皮の細胞を有する。
【００３９】
本明細書で使用される「ウキクサ優先コドン」は、ウキクサにおけるコドン使用頻度が１７％より大きいコドンを指す。
【００４０】
本明細書で使用される「Ｌｅｍｎａ優先コドン」は、Ｌｅｍｎａ属におけるコドン使用頻度が１７％より大きいコドンを指す。
【００４１】
本明細書で使用される「Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドン」は、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａにおけるコドン使用頻度が１７％より大きいコドンを指し、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａにおけるコドン使用頻度は、Ｃｏｄｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｌｅａｓｅ１１３，０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝Ｌｅｍｎａ＋ｇｉｂｂａ＋［ｇｂｐｌｎ］）から入手した。
【００４２】
「翻訳開始コドン」は、関心のあるヌクレオチド配列から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するコドンを指す。
【００４３】
本明細書で使用される「翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列」は、翻訳開始コドンの５’に接した３つのヌクレオチドを指す。
【００４４】
本明細書で使用される「分泌」は、宿主植物細胞の原形質膜および細胞壁の両者を横切るポリペプチドの移行を指す。
【００４５】
ヌクレオチド配列に関連して本明細書で使用される「作動可能に連結された」は、互いに機能的関係に配置されている多数のヌクレオチド配列を指す。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は近接しており、また２つのタンパク質コード領域が接合することが必要な場合にはリーディングフレーム内にある。
【００４６】
［Ａ．発現カセット］
本発明によれば、安定に形質転換されたウキクサは、発現カセット内に含まれる関心のあるヌクレオチド配列を用いた形質転換によって得られる。発現カセットは、関心のある核酸または遺伝子に連結された転写開始領域を含む。このような発現カセットは、調節領域の転写制御下に置かれる関心のある遺伝子（例えば関心のある一つの遺伝子、関心のある二つの遺伝子、等）を挿入するための複数の制限部位を具備する。この発現カセットは、ただ一つの関心のある遺伝子をコードしてもよい。本発明のある特定の実施形態では、導入される核酸は２つ以上の発現カセットを含有し、それぞれが少なくとも一つの関心のある遺伝子をコードする。
【００４７】
転写開始領域、（例えばプロモーター）は、天然のままであってもよく、宿主と相同であっても外来または非相同であってもよく、または天然の配列であっても合成の配列であってもよい。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主に転写開始領域が存在しないことを意図する。本明細書で使用されるキメラ遺伝子は、コード配列に非相同である転写開始領域に作動可能に連結したコード配列を含む。
【００４８】
当該技術分野で既知の適するプロモーターを、本発明に従って使用することができる（細菌プロモーター、酵母プロモーター、真菌プロモーター、昆虫プロモーター、哺乳類、および植物プロモーターを含む）。例えばウキクサプロモーターを含む植物プロモーターを使用してもよい。代表的なプロモーターとしては、カリフラワー・モザイクウイルス３５Ｓプロモーター、オパイン合成酵素プロモーター（例えばｎｏｓ、ｍａｓ、ｏｃｓ、等）、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、リブロースビスフォスフェート（ＲｕｂＰ）カルボキシラーゼ小サブユニットプロモーター、およびアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターなどがあるが、その限りではない。ウキクサＲｕｂＰカルボキシラーゼ小サブユニットプロモーターは、当該技術分野で既知である（Ｓｉｌｖｅｒｔｈｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９）。植物、好ましくはウキクサを感染させるウイルス由来の他のプロモーターも適する。サトイモモザイクウイルス、クロレラウイルス（例えばクロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼプロモーター；Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８５）、トマト黄化壊疽ウイルス、タバコ茎壊疽ウイルス、タバコ壊死ウイルス、タバコ輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、キウリモザイクウイルス、落花生幹ウイルス（ｐｅａｎｕｔ ｓｔｕｍｐ ｖｉｒｕｓ）、アルファルファモザイクウイルス、サトウキビバシリフォーム（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂａｃｉｌｉｆｏｒｍ）バドナウイルス等から単離されたプロモーターなどがあるが、その限りではない。
【００４９】
最後に、所望のレベルの制御を与えるようにプロモーターを選択することができる。例えば場合によっては、構成的発現を与えるプロモーター（例えば、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のマンノピンシンターゼプロモーター）を使用することが有利なこともある。あるいは、他の状況では、特定の環境的刺激に応答して活性化されるプロモーター（例えば熱ショック遺伝子プロモーター、感想誘導性遺伝子プロモーター、病原体誘導性遺伝子プロモーター、創傷誘導性遺伝子プロモーター、および明／暗誘導性遺伝子プロモーター）または植物成長制御因子（例えばアブシジン酸、オーキシン類、サイトカイニン類、およびジベレリン酸によって誘導される遺伝子由来のプロモーター）を使用することが有利であろう。さらなる代替として、組織特異的な発現を与えるプロモーター（例えば根、葉、および花特異的プロモーター）を選択することができる。
【００５０】
所与のプロモーターの総体的な強さは、シス作動性ヌクレオチド配列の組合せおよび上流活性化配列等の空間的組織化による影響を受ける。例えばアグロバクテリウムツメファシエンス・オクトピンシンターゼ遺伝子に由来する活性化ヌクレオチド配列は、アグロバクテリウムツメファシエンス・マンノピンシンターゼプロモーターからの転写を増強することができる（Ｇｅｌｖｉｎらに付与された米国特許第５，９５５，６４６号参照）。本発明では、発現カセットは、関心のあるヌクレオチド配列の発現を増強するために、プロモーター配列の上流に挿入された活性化ヌクレオチド配列を含有することができる。一つの実施形態では、発現カセットは、アグロバクテリウムツメファシエンス・マンノピンシンターゼ遺伝子由来のプロモーターに作動可能に連結されたアグロバクテリウムツメファシエンス・オクトピンシンターゼ遺伝子由来の３つの上流活性化配列を含む（米国特許第５，９５５，６４６号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）参照）。
【００５１】
本転写カセットは、転写の５’−３’方向に、転写および翻訳開始領域、関心のあるヌクレオチド配列、および植物で機能する転写および翻訳終止領域を含む。当該技術分野で既知の任意の適する終止配列を、本発明に従って使用することが可能である。この終止領域は、転写開始領域を含む自然のものであってもよく、関心のあるヌクレオチド配列を含む自然のものであってもよく、または別のソースに由来してもよい。便利な終止領域は、アグロバクテリウムツメファシエンスのＴｉ−プラスミドから入手でき、例えば、オクトピン・シンセターゼ終止領域およびノパリン・シンセターゼ終止領域等である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１；Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１；Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１；Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１；Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９６２７も参照されたい。さらなる代表的な終止配列は、エンドウＲｕｂＰカルボキシラーゼ小サブユニット終止配列およびカリフラワー・モザイクウイルス３５Ｓ終止配列である。他の適する終止配列は、当業者に明白になるであろう。
【００５２】
あるいは、当該技術分野で既知の、任意の他の適する発現カセット上に、関心のある遺伝子を提供してもよい。
【００５３】
本発現カセットは、導入され、形質転換植物で発現される一つより多い遺伝子または核酸配列を含んでもよい。従って、各核酸配列は、５’制御配列および３’制御配列に作動可能に連結される。あるいは、多数の発現カセットを提供してもよい。
【００５４】
一般に、本発現カセットは、形質転換された細胞または組織を選択するための選択可能マーカー遺伝子を含む。選択可能マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子、ならびに除草性化合物に対する耐性を与える遺伝子などがある。除草剤耐性遺伝子は、一般に、除草剤に非感受性の修飾された標的タンパク質、または除草剤が作用する前に、植物において除草剤を分解または解毒する酵素をコードする。ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１３；ＤｅＢｌｏｃｋｅｔａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：６９１；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３を参照されたい。例えば、グリフォセート除草剤またはスルホニル尿素除草剤に対する耐性は、突然変異体標的酵素、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）およびアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）をコードする遺伝子を使用して得られている。グルホシネートアンモニウム、ボロモキシニル（ｂｏｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）、および２，４−ジクロロフェンオキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する耐性は、それぞれの除草剤を解毒する、ホスフィノスルシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ、または２，４ジクロロフェンオキシアセテートモノオキシゲナーゼをコードする細菌遺伝子を使用することによって得られている。
【００５５】
本発明のために、選択可能マーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ、（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎＰｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４：１）；シアナミドヒドラターゼ（Ｍａｉｅｒ−Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４２５０）；アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリネートシンターゼ（Ｐｅｒｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：７１５）；ｂａｒ遺伝子（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：１５０３；Ｍｅａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．３６：１３６７）；トリプトファンデカルボキシラーゼ（Ｇｏｄｄｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：９０７）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：３２７）；ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）；ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ；Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：４５５２）；ホスフィノスルシンアセチルトランスフェラーゼ（ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１３）；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌｌａｔｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３Ｄ：３３０）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Ａｎｄｅｒｓｏｎらに付与された米国特許第４，７６１，３７３号；Ｈａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２１：２６６）；５−エノールピルビルシキメート−ホスフェートシンターゼ（ａｒｏＡ；Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１７：７４１）；ハロアリールニトリラーゼ（Ｓｔａｌｋｅｒらに付与されたＷＯ ８７／０４１８１号）；アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１２２０）；ジヒドロプテロエイトシンターゼ（ｓｕｌＩ；Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１２７）；および３２ｋＤａの光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：１３４６（１９８３）をコードする遺伝子などがあるが、その限りではない。
【００５６】
ゲンタマイシン（例えば、ａａｃＣ１，Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１７：２０２−２０８）；クロラムフェニコール（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）ＥＭＢＯ Ｊ．２：９８７）；メトトレキセート（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９；Ｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８０７）；ヒグロマイシン（Ｗａｌｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０３；Ｚｈｉｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌｎａｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８：２１９；Ｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８０７）；ストレプトマイシン（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：８６）；スペクチノマイシン（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．５：１３１）；ブレオマイシン（Ｈｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７１）；スルホンアミド（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１５：１２７）；ブロモキシニル（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４１９）；２，４−Ｄ（Ｓｔｒｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：８１１）；ホスフィノスルシン（ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１３）；スペクチノマイシン（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄ ａｎｄ Ｃｈｕｐｅａｕ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：１３１）に対する耐性をコードする遺伝子も含まれる。
【００５７】
ｂａｒ遺伝子は、ホスフィノスルシン（ＰＰＴ）またはビアラホス等のグルホシネート型除草剤に対する除草剤耐性を与える。上記の通り、ベクター構築物に使用し得る他の選択可能なマーカーとしては、やはりビアラホス耐性およびホスフィノスルシン耐性に関するｐａｔ遺伝子、イミダゾリノン耐性に関するＡＬＳ遺伝子、ヒグロマイシン耐性に関するＨＰＨまたはＨＹＧ遺伝子、グリホサート耐性に関するＥＰＳＰシンターゼ遺伝子、Ｈｃ毒素に対する耐性に関するＨｍｌ遺伝子、および日常的に使用され、且つ当業者に既知の他の選択的作用物などがあるが、その限りではない。Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６；Ｃｈｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６３１４；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６３；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９；Ｂａｒｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ１７７−２２０；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５５５；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：６０３；Ｆｉｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：７１３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４００；Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２５４９；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４８０；Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９５２；Ｂａｉｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５０７２；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４６４７；Ｈｉｌｌｅｎａｎｄ−Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０９４；Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：３９７；Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７；Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３；Ｈｌａｖｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７８；およびＧｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２１を参照されたい。このような開示内容を、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００５８】
［Ｂ．ウキクサにおける発現強化のためのヌクレオチド配列の修飾］
本発明は、発現されるヌクレオチド配列の修飾を実現し、ウキクサにおけるその発現を強化する。このような一つの修飾は、ウキクサ優先コドンを使用した、関心のあるヌクレオチド配列の合成である。この方法は、植物優先コドンを含むヌクレオチド配列を合成する技術分野で利用できる。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号および第５，４３６，３９１号；Ｐｅｒｌａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １５：３３２４；Ｉａｎｎａｃｏｍｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：４８５；およびＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：４７７（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。好ましいコドンは、ウキクサで発現されるタンパク質中の最高頻度のコドンから決定される。例えば、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａのコドン使用頻度は、ウェブページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝Ｌｅｍｎａ＋ｇｉｂｂａ＋［ｇｂｐｌｎ］にあり、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒのコドン使用頻度は、ウェブページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝Ｌｅｍｎａ＋ｍｉｎｏｒ＋［ｇｂｐｌｎ］にある。ウキクサおよび他の単子葉植物における発現に合わせて最適化されている遺伝子を、本発明の方法で使用できることが確認されている。例えば、ＥＰ ０ ３５９ ４７２号、ＥＰ ０ ３８５ ９６２号、ＷＯ ９１／１６４３２号；Ｐｅｒｌａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３３２４；Ｉａｎｎａｃｏｍｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：４８５；およびＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：４７７等（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。さらに、遺伝子配列の全部または任意の部分を最適化することが可能であり、または合成の配列であってもよいことが確認されている。換言すれば、完全に最適化された、または部分的に最適化された配列も使用することが可能である。例えば、コドンの４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、ウキクサ優先コドンであってもよい。一つの実施形態では、コドンの９０〜９６％がウキクサ優先コドンである。関心のあるヌクレオチド配列のコード配列は、少なくとも１７％の頻度でＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａに使用されるコドンを含む。一つの実施形態では、修飾されたヌクレオチド配列は、配列番号２に示すヌクレオチド配列をコードするヒトα−２Ｂ−インターフェロンであり、９３％のウキクサ優先コドンを含有する。
【００５９】
他の修飾を、関心のあるヌクレオチド配列に実施して、ウキクサにおけるその発現を強化することもできる。こうした修飾としては、擬似ポリアデニル化シグナル、エキソンイントロンスプライシング部位シグナル、トランスポゾン様反復をコードする配列、および他のこのような十分に特性決定された遺伝子発現に有害な可能性がある配列の除去などがあるが、その限りではない。この配列のＧＣ含量を、宿主細胞で発現される既知の遺伝子を参照することによって算出される、所与の細胞宿主の平均レベルに調整することができる。可能な場合には、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるようにこの配列を修飾してもよい。
【００６０】
動物と植物では、翻訳開始コドンの最適な翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列に既知の差があり、こうした翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列の組成は、翻訳開始の効率に影響する可能性がある。例えば、Ｌｕｋａｓｚｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ１５４：８９−９８；およびＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３５：９９３−１００１を参照されたい。本発明では、関心のあるヌクレオチド配列の翻訳開始コドンの翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列を修飾して、ウキクサでの発現を強化することが可能である。一つの実施形態では、関心のあるヌクレオチド配列の翻訳開始コドンのすぐ上流の３ヌクレオチドが「ＡＣＣ」であるように、ヌクレオチド配列が修飾される。第２の実施形態では、こうしたヌクレオチドは「ＡＣＡ」である。
【００６１】
５’リーダー配列を使用することによって、ウキクサにおける導入遺伝子の発現を強化することもできる。このようなリーダー配列は、翻訳を強化するように作用することができる。翻訳リーダーは当該技術分野で既知であり、また、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳脊髄心筋炎５’非コード領域；Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：６１２６）；ポチウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコ腐食ウイルス（Ｔａｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）；Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５４：９）；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ；Ｍａｃａｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０）；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡからの未翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ ４；Ｊｏｂｌｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｈｒｋｅ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６２２）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ；Ｇａｌｌｉｅ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ，２３：５６）；ジャガイモ腐食ウイルスリーダー（ｐｏｔａｔｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ ｌｅａｄｅｒ）（Ｔｏｍａｓｈｅｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２７１７−２７２４）；Ｆｅｄ−１５’未翻訳領域（Ｄｉｃｋｅｙ（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２３１１−２３１７）；ＲｂｃＳ ５’未翻訳領域（Ｓｉｌｖｅｒｔｈｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９−５８）；およびトウモロコシ黄化斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ；Ｌｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：３８２）などがあるが、その限りではない。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ８４：９６５も参照されたい。トウモロコシデヒドロゲナーゼ１遺伝子、トウゴマカタラーゼ遺伝子、またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ トリプトファン経路遺伝子ＰＡＴ１からのイントロン配列を包含する、植物イントロン配列を含むリーダー配列も、植物における翻訳効率を高めることが示されている（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：１１８３−１２００；Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：９１３−９２０）。本発明の一つの実施形態では、配列番号１に記載の、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０４０４９）のヌクレオチド１２２２〜１７７５に対応するヌクレオチド配列を、関心のあるヌクレオチド配列の上流に挿入して、その翻訳効率を高める。
【００６２】
任意の単一の修飾または組合せることのできる複数の修飾を含む上記のウキクサ発現強化ヌクレオチド配列修飾のいずれかを、本発明で使用できることは確認されている。本明細書で使用される語句「ウキクサにおける発現強化のための修飾」は、こうした修飾の任意の一つまたは任意の組合せを含有するヌクレオチド配列を指す。
【００６３】
［Ｃ．シグナルペプチド］
分泌タンパク質は、通常、内質細網（ＥＲ）の膜上の受容体タンパク質と相互に作用し、細胞から分泌させるために、成長中のポリペプチド鎖が膜を横切って、内質細網内に移行するように指令する、「シグナルペプチド」を含有する前駆体ポリペプチド類から翻訳される。このシグナルペプチドは、しばしば前駆体ポリペプチドから切断されて、シグナルペプチドを欠く「成熟」ポリペプチドを生じる。本発明の実施形態では、培地中へのポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結しているヌクレオチド配列から、生物学的に活性なポリペプチドがウキクサで発現される。内質細網へのタンパク質移行（細胞外部に分泌させるため）を目的とする植物シグナルペプチドは、当該技術分野で既知である。例えば、Ｌｅｅらに付与された米国特許第６，０２０，１６９号を参照されたい。本発明では、ＥＲへの標的ポリペプチド発現に、任意の植物シグナルペプチドを使用することができる。幾つかの実施形態では、このシグナルペプチドは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ塩基性エンドキチナーゼシグナルペプチド（配列番号８；ＮＣＢＩタンパク質寄託番号ＢＡＡ８２８２３のアミノ酸１４〜３４）、エクステンシンシグナルペプチド（Ｓｔｉｅｆｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：７８５−７９３）、コメα−アミラーゼシグナルペプチド（配列番号６；ＮＣＢＩタンパク質寄託番号ＡＡＡ３３８８５のアミノ酸１〜３１）、または修飾コメα−アミラーゼシグナル配列（配列番号７）である。別の実施形態では、シグナルペプチドは、分泌されるウキクサタンパク質のシグナルペプチドに相当する。
【００６４】
あるいは、遺伝子操作されたウキクサで発現される組換えポリペプチド類を分泌させるために、哺乳類シグナルペプチドを使用することができる。植物細胞は、内質細網を標的とする哺乳類シグナルペプチドを認識し、これらのシグナルペプチドは、原形質膜を通過するばかりでなく植物細胞壁も通過するポリペプチド類の分泌を指令できることが証明されている。Ｈｉａｔｔらに付与された米国特許第５，２０２，４２２号および第５，６３９，９４７号を参照されたい。本発明の一つの実施形態では、ポリペプチド分泌を目的とする哺乳類シグナルペプチドは、ヒトα−２ｂ−インターフェロンシグナルペプチド（ＮＣＢＩタンパク質寄託番号ＡＡＢ５９４０２および配列番号４のアミノ酸１〜２３）である。
【００６５】
一つの実施形態では、ウキクサにおける発現増強のために、上記セクションＢに開示されている、関心のあるヌクレオチド配列に対するいずれかの修飾または修飾の組合せを使用して、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を修飾する。別の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３で記載されている修飾されたヌクレオチド配列によってコードされるコメα−アミラーゼであり、およそ９３％のウキクサ優先コドンを含有する。
【００６６】
分泌される生物学的に活性なポリペプチドは、当該技術分野で既知の従来の方法で培地から収穫し、クロマトグラフィ、電気泳動、透析、溶剤溶剤抽出等で精製することができる。
【００６７】
［Ｄ．形質転換されたウキクサ植物体およびウキクサノジュール培養体］
本発明で使用される安定に形質転換されたウキクサは、当該技術分野で既知の任意の方法で得ることができる。一つの実施形態では、安定に形質転換されたウキクサは、Ｓｔｏｍｐらに付与された米国特許第６，０４０，４９８号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている遺伝子導入方法の一つによって得られる。こうした方法としては、関心のあるヌクレオチド配列を含む核酸で被覆された微粒子銃を用いた弾道衝撃による遺伝子導入、エレクトロポレーションによる遺伝子導入、および関心のあるヌクレオチド配列を含むベクターを含むアグロバクテリウムが媒介する遺伝子導入などがある。一つの実施形態では、安定に形質転換されたウキクサは、Ｓｔｏｍｐらに付与された米国特許第６，０４０，４９８号に開示されているアグロバクテリウム媒介方法のいずれか一つによって得られる。使用されるグロバクテリウムは、アグロバクテリウムツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）である。
【００６８】
こうした方法で使用される安定に形質転換されたウキクサ植物が、正常な形態を示し、且つ有性生殖で繁殖可能なことは好ましい。好ましくは、本発明の形質転換植物は、導入された核酸のコピーを一つ含み、導入された核酸は、顕著な再配列を中に持たない。導入された核酸が低コピー数（すなわち、５コピー以下、あるいは、３コピー以下、さらなる代替として、形質転換細胞当たり３コピー未満の核酸）で存在するウキクサ植物もやはり好ましい。
【００６９】
安定に形質転換されたウキクサは、生物学的に活性なタンパク質ホルモン、成長因子、またはサイトカイン、インスリン、または成長ホルモン（特に、ヒト成長ホルモン）を発現する。あるいは、このウキクサは生物学的に活性なβ−グルクロニダーゼを発現する。このウキクサは、生物学的に活性なα−２ｂ−インターフェロン、例えばヒトα−２ｂ−インターフェロン前駆体（ＮＣＢＩタンパク質寄託番号ＡＡＢ５９４０２；配列番号４で記載）または成熟ヒトα−２ｂ−インターフェロン（ＮＣＢＩタンパク質寄託番号ＡＡＢ９４０２のアミノ酸２４〜１８８；配列番号５で記載）またはその生物学的に活性な変異形を発現する。
【００７０】
ヒトα−２ｂ−インターフェロンの「生物学的に活性な変異形」は、一つ以上のアミノ酸の、欠失（いわゆるトランケーション）または自然のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端への付加、自然のタンパク質の一つ以上の部位における一つ以上のアミノ酸の欠失または付加、または自然のタンパク質の一つ以上の部位における一つ以上のアミノ酸の置換によって、自然のポリペプチドから誘導されるポリペプチドを意図する。本発明に含まれる生物学的に活性な変異形α−２ｂ−インターフェロンポリペプチド類は、生物学的に活性である。すなわち、ウイルス感染に対する耐性を高めることができる能力、またはα−２ｂ−インターフェロン−制御遺伝子標的の転写を調整することができる能力を含む自然のα−２ｂ−インターフェロンの所望の生物学的活性を持ちつづける。このような生物学的に活性な変異形は、例えば、遺伝的多形またはヒトの操作に起因することがある。本発明の自然のα−２ｂ−インターフェロンタンパク質の生物学的に活性な変異形は、配列番号４または配列番号５で示すアミノ酸配列に対して、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、一般に少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、９９％またはそれより多い配列同一性を有する。従って、本発明のα−２ｂ−インターフェロンの生物学的に活性な変異形は、わずか１〜１５アミノ酸残基、１〜１０、例えば、６〜１０、わずか５、わずか４、３、２、または１アミノ酸残基だけ、そのタンパク質と異なってもよい。ヒトα−インターフェロンの生物学的に活性な変異形の例は、当該技術分野で既知である。例えば、欧州特許ＥＰ２１１１４８Ｂ１、および米国特許第４，７４８，２３３号、第４，８０１，６８５号、第４，８１６，５６６号、第４，９７３，４７９号、第４，９７５，２７６号、第５，０８９，４００号、第５，０９８，７０３号、第５，２３１，１７６号、および第５，８６９，２９３号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。
【００７１】
配列の比較および２配列間の％同一性および％類似性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行われる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の％同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍにて入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４４−４５３）を使用し、ＢＬＯＳＳＵＭ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよびギャップ重み（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さ重み１、２、３、４、５、または６を使用して、決定される。また別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のギャッププログラムを使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２得点マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）およびギャップ重み４０、５０、６０、７０、または８０および長さ重み（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５、または６を使用して、決定される。特に好ましいパラメーターのセット（および、専門家が、ある分子が本発明の配列同一性限界内であるかどうかを決定するために、どのパラメーターを適用すべきかについて確信がない場合、使用すべきもの）は、ＢＬＯＳＵＭ６２得点マトリックスと共にギャップ重み６０および長さ重み３を使用することである。
【００７２】
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の％同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み残差表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長さペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して決定することもできる。
【００７３】
一つの実施形態では、価格または実施上の制約またはその両者のため、安定に形質転換されたウキクサ植物体またはウキクサノジュール培養体は、既存の遺伝子発現系では効果的に工業的に製造できない生物学的に活性なポリペプチド類を発現する。例えば、一部のタンパク質は、細胞の生存能力、細胞増殖、細胞分化、または哺乳類細胞でのタンパク質アセンブリを妨害するため、哺乳類系で発現させることができない。このようなタンパク質としては、網膜芽腫タンパク質、ｐ５３、アンジオスタチン、およびレプチンなどがあるが、その限りではない。本発明は、哺乳類制御タンパク質を産生するために都合よく利用することができる。高等植物と哺乳動物との間の大きい進化論的距離を考えると、こうしたタンパク質がウキクサにおける制御プロセスを妨害する公算は低い。トランスジェニックウキクサを使用して、既存の発現系の産生能力を刺激する、多量のタンパク質、例えば、血清アルブミン（特に、ヒト血清アルブミン）、ヘモグロビン、およびコラーゲン等を産生することができる。
【００７４】
最後に、生物学的に活性な多量体タンパク質（例えば、モノクローナル抗体、ヘモグロビン、Ｐ４５０オキシダーゼ、およびコラーゲン等）を産生するように、哺乳類系よりはるかに容易に、高等植物系を操作することができる。生物学的に活性な多量体タンパク質をウキクサで産生するための一つの代表的なアプローチは、ポリペプチドサブユニットの全てをコードする遺伝子を含有する発現ベクターを使用する。例えば、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ，１５：２８１およびｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１７０１を参照されたい。次いで、任意の既知の形質転換方法、例えば、弾道衝撃またはアグロバクテリウム媒介形質転換を使用して、このベクターをウキクサ細胞に導入する。この方法を使用した結果として、多量体タンパク質のアセンブリに必要なポリペプチド類の全てを発現するクローン細胞系が得られる。このアプローチに対する変更は、単一遺伝子構築物を作製し、こうした構築物からのＤＮＡを一緒に混合し、次いで、弾道衝撃またはアグロバクテリウム媒介形質転換を使用して、このＤＮＡ混合物を植物細胞に送達する。さらなる変更として、ベクターの一部または全部が、多量体タンパク質の一つより多いサブユニットをコードしてもよい（すなわち、多量体タンパク質中のサブユニット数より少ないウキクサクローンが交差するように）。代替実施形態では、各ウキクサクローンが、多量体タンパク質のサブユニットの少なくとも一つを発現し、各サブユニットを分泌するウキクサクローンが一緒に培養され、培地中で様々な分泌サブユニットから多量体タンパク質が構築される。場合によっては、例えば、工業的または化学的プロセスでは、診断目的、治療目的、またはワクチン接種目的の場合、形質転換ウキクサ植物またはウキクサノジュール培養で、多量体タンパク質のサブユニットの全部より少なく、または単一のタンパク質サブユニットでも、産生することが望ましいこともある。
【００７５】
［実験］
以下の実施例は、例を挙げて説明するために提供するものであり、決して限定するためではない。
【００７６】
［発現ベクター］
実施例の一部で使用する発現ベクターｐＢＭＳＰ−１は、米国特許第５，９５５，６４６号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。ｐＢＭＳＰ−１転写カセットは、３コピーの、アグロバクテリウムツメファシエンス・オクトピンシンターゼ由来の転写活性化ヌクレオチド配列、およびアグロバクテリウムツメファシエンス・マンノピンシンターゼ遺伝子由来のさらなる転写活性化ヌクレオチド配列、アグロバクテリウムツメファシエンス・マンノピンシンターゼ遺伝子由来のプロモーター領域、関心のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入するためのポリリンカー部位、およびアグロバクテリウムツメファシエンス・ノパリン・シンターゼ遺伝子由来の終止配列を含有する。ｐＢＭＳＰ−１発現ベクターは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩをコードするヌクレオチド配列も選択可能マーカーとして含有する。選択可能マーカー配列の転写は、アグロバクテリウムツメファシエンス・ノパリン・シンターゼ遺伝子由来のプロモーターによって推進される。
【００７７】
やはり以下の実施例のいくつかで使用される発現ベクターｐＢＭＳＰ−３は、上記ｐＢＭＳＰ−１発現ベクターの成分を含み、且つ、プロモーターとポリリンカーとの間に挿入された、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０４０４９）のヌクレオチド１２２２〜１７７５に対応するヌクレオチド配列をさらに含む。
【００７８】
［ヒトα−２ｂ−インターフェロンをウキクサで産生するための発現構築物］
当該技術分野で既知の方法を使用して、以下の発現構築物を構築した。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照されたい。
【００７９】
【表１】
［ウキクサの形質転換］
アグロバクテリウム媒介形質転換方法を使用し、上記発現構築物を用いて、ウキクサ葉状体またはウキクサノジュール培養体（これらの実施例では、Ｌｅｍｎａ 系統８６２７に由来する）を形質転換する。これらの実施例では、アグロバクテリウムツメファシエンス菌株Ｃ５８Ｚ７０７（無害の（ｄｉｓａｒｍｅｄ）、広宿主範囲Ｃ５８菌株）（Ｈｅｐｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３１：２９６１−２９６９）を形質転換に使用する。動員プラスミド（ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ）ｐＲＫ２０１３を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（Ｈｏｅｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０３：１７９−１８０；Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３４７−７３５０）を使用し、エレクトロポレーションまたはトリペアレタル・メイティングの手順で、上記発現構築物を、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに動員する。上記発現構築物を含むＣ５８Ｚ７０７菌株を、５００ｍｇ／リットルのストレプトマイシン、５０ｍｇ／リットルのスペクチノマイシンおよび５０ｍｇ／リットルの硫酸カナマイシンを含有する、ＡＢミネラル培地（Ｃｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７１：３６７２−３６７６）上か、またはＹＥＢ培地（１ｇ／リットルの酵母抽出物、５ｇ／リットルのビーフ抽出物、５ｇ／リットルのペプトン、５ｇ／リットルのスクロース、０．５ｇ／リットルのＭｇＳＯ４）中に画線し、２８℃で一晩成長させる。
【００８１】
これらの実施例では、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ系統８６２７を形質転換に使用するが、任意のＬｅｍｎａ系統を使用してもよい。２３℃、１６時間明／８時間暗の光周期、およそ４０μＭ／ｍ２・秒の光強度下で、１％のスクロースおよび１０μＭのインドール酢酸を含有する液体Ｓｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地（Ｓｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（１９７２）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ．５０：１９９）で、葉状体を成長させる。播種の場合、個々の葉状体を集塊から分離し、播種培地中におよそ２〜２０分間浮遊させる。播種培地は、約１×１０９細胞／ｍｌの濃度で存在する発現構築物を含む適切なアグロバクテリウムツメファシエンス菌株を含む、０．６Ｍのマンニトールおよび１００μＭのアセトシリンゴンを加えたＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地（ｐＨ５．６）である。次いで、これらの葉状体を、１％のスクロース、０．９％の寒天、および２０ｍｇ／リットルのアセトシリンゴンを含有するＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地（ｐＨ５．６）に移し、暗所で、２３℃にて３日間または４日間共培養する。
【００８２】
共培養後、２００μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを加えたＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地またはＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３）に回収するために、葉状体を移す。感染した組織を、２〜４日毎に、抗生物質を含む新鮮な培地に移すことによって、感染性アグロバクテリウムから葉状体を除染する。微光（１〜５μＭ／ｍ２・秒）条件で、この葉状体を、この培地上でおよそ４週間インキュベートする。
【００８３】
形質転換用ウキクサノジュール培養体は、以下の通りに作成する。ウキクサ葉状体を分離し、滅菌したメスで根を切断し、５μＭの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、０．５μＭ １−フェニル−３（１，２，３−チアジアゾール−５−イル）尿素チジアズロン（Ｓｉｇｍａ社製 Ｐ６１８６）、３％のスクロース、０．４％のＤｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、および０．１５％のＧｅｌｒｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を加えたＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地（カタログ番号Ｍ−５５１９；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ５．６、上に、葉状体を、下面を下にして載せる。葉状体を５〜６週間成長させる。この時点で、一般に下面の中央部分から、ノジュール（小さい、黄色っぽい細胞塊）が出現する。このノジュール組織を母葉状体から離し、３％のスクロース、０．４％のＤｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ、０．１５％のＧｅｌｒｉｔｅ、１μＭの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、および２Ｍのベンジルアデニンを加えたＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地で培養する。
【００８４】
ウキクサノジュール培養体を以下の通りに形質転換する。適切なアグロバクテリウムツメファシエンス菌株を、５０ｍｇ／リットルのカナマイシンおよび１００μＭのアセトシリンゴンを含むジャガイモデキストロース寒天またはＹＥＢ寒天で培養し、０．６Ｍのマンニトールおよび１００μＭのアセトシリンゴンを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地に再懸濁する。ノジュール培養組織を、再懸濁した細菌溶液中に１〜２分間浸漬することによって播種し、過剰な流体を除去するために拭取り、ノジュール成長を促進するために最適化したオーキシンおよびサイトカイニンおよび１００μＭのアセトシリンゴンを加えたＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地からなる共培養培地上に載せる。
【００８５】
選択する場合、ノジュール培養組織を、３％のスクロース、１μＭの２，４−ジクロロフェンオキシアセテート、２μＭのベンジルアデニン、０．４％のＤｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ、０．１５％のＧｅｌｒｉｔｅ、５００ｍｇ／リットルのセフォタキシム、および２００ｍｇ／リットルの硫酸カナマイシンを含む再生培地Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地に移し、連続的明条件（２０〜４０μＭ／ｍ２・秒）で、およそ４週間培養する。このノジュール組織を７日毎に新鮮な培地に移す。選択物質で、ノジュール組織が勢いよい成長を示すとき、選択は完全である。一部の実施例では、共培養培地で選択する代わりに、形質転換されたウキクサノジュール培養を選択用の再生培地に直接移す。
【００８６】
形質転換されたウキクサを再生する場合、選択されたノジュール培養体を再生培地（０．５×１％のスクロースおよび２００ｍｇ／リットルのカナマイシンを加えたＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地）に移して組織化し、植物を生成する。このノジュール培養体を、完全照明（ｆｕｌｌ ｌｉｇｈｔ）下で、葉状体が現れるまでおよそ３週間、再生培地でインキュベートする。十分に組織化された葉状体を、１〜３％のスクロースを含む液体Ｓｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地に移し、さらなるクローン増殖のために、完全照明下でインキュベートする。
【００８７】
［ノジュール培養により産生された生物学的に活性なインターフェロンの検出］ 生物学的に活性なインターフェロンは、Ｓｔａｅｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ７９：５８９−５９４およびＫｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １１９：５８２−５８７（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載の固相サンドイッチイムノアッセイおよびＴｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７６：２７０−２７２（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載の細胞変性効果阻害アッセイを含む様々な分析法で検出される。分泌されたインターフェロンはウキクサ培地から回収し、非分泌インターフェロンは、摩砕または溶解したウキクサ植物またはウキクサノジュール組織から回収する。
【００８８】
製造業者の説明書に従ってＰＢＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）製のキットを使用して、インターフェロン用の固相サンドイッチイムノアッセイを実施する。簡単に記載すると、微量滴定プレートのウェルに結合させた抗体でインターフェロンを捕捉する。次いで、第２の抗体を使用して、結合した抗体を明らかにする。次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させ抗二次抗体を使用して、インターフェロンをマークする。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が、ペルオキシダーゼに触媒される変色を開始するため、インターフェロンレベルを観測し、標準と比較することができる。本実施例では、α−２ｂ−インターフェロンに特異的なモノクローナル抗体（カタログ番号１１１０５、ＰＢＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、このアッセイに使用する。
【００８９】
Ｔｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７６：２７０−２７２の方法に従って、細胞変性効果阻害アッセイを実施する。簡単に記載すると、米国国立衛生研究所ヒトＩＦＮα国際基準標本（Ｇ−００２−９０１−５２７）の段階的２倍希釈と並行して、９６ウェル微量滴定プレート（Ｆａｌｃｏｎ Ｉｎｃ）で、分析するべき標本の段階的２倍希釈を、２％のウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）を加えたＥａｇｌｅｓ最小培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）１００μｌで希釈する。次いで、ヒトアミノ細胞（ＷＩＳＨ系）２００００個を、２％のウシ胎仔血清を含む培地１００μｌの体積で、微量滴定プレートの各ウェルに加える。細胞を、空気中５％のＣＯ２の雰囲気で、３７℃にて一晩インキュベートし、培地を除去し、感染効率０．１で、水疱性口内炎ウイルスを含有する２％のウシ胎仔血清を含む培地２００μｌを補充する。細胞を、空気中５％のＣＯ２の雰囲気で、３７℃にてさらに一晩インキュベートし、次いで、ウイルス複製による細胞変性効果を光学顕微鏡で評価する。インターフェロン類の力価は、ウイルスの細胞変性効果に対して５０％の保護を与えたＩＦＮ希釈の逆数として表される。インターフェロン力価は、基準標本の力価を参照することにより、国際基準単位で表される。
【００９０】
以下の実施例は、ウキクサにおける生物学的に活性なインターフェロンの発現を証明するものである。
【００９１】
［実施例１］
バッチ式培養で、様々な時点における培地中および組織中の培養ＩＦＮレベルを決定するために、試験を実施した。０日に、一組の２０〜３０ｍｌ １７５オンスの培養ジャーに、検出可能なレベルのヒトα−２ｂインターフェロン（ＩＦＮ）を発現すると事前に確認された系の２０個の葉状体を播種した。植物／水槽蛍光栽培電球（ｇｒｏｗ ｂｕｌｂ）で提供される連続的高照明で、この培養を、独立栄養性の、緩衝条件で成長させた。４つの培養体について、各時点で（５日、７日、１３日、１５日、および１８日に）、生体重および培地体積を測定した。各培養体から、培地サンプルおよび組織サンプルを採取し、植物プロテアーゼインヒビターカクテルを加えた。組織サンプルを摩砕し、回転冷却した。上澄を回収した。全てのサンプルが回収されるまで、培地および組織抽出物を−７０℃で保存した。上述の固相サンドイッチイムノアッセイを使用して、培地中および組織抽出物のＩＦＮレベルを同一日に決定した。測定されたＩＦＮ濃度と、培地の体積および培養の生体重をそれぞれ乗じることによって、培地中および組織中の培養ＩＦＮ総量を算出した。図１は、５日と比較した、７日、１３日、１５日、および１８日における相対的ＩＦＮレベルを示す図である。最後の時点は、１つの培養体を失ったため、４つの培養体ではなく３つの培養体の平均値を表す。
【００９２】
［実施例２］
バッチ式培養で、様々な時点における培地中および組織中の培養ＩＦＮレベルを決定するために、試験を実施した。０日に、一組の２０〜３０ｍｌ １７５オンスの培養ジャーに、実施例１の場合と同じ系の２０個の葉状体を播種した。この培養を、植物／水槽蛍光栽培電球で提供される連続的高照明を用いた、独立栄養性非緩衝条件で成長させた。４つの培養体について、各時点で（７日、１０日、１２日、１４日、１７日、および１９日に）、生体重および培地体積を測定した。各培養から、培地サンプルおよび組織サンプルを採取し、植物プロテアーゼインヒビターカクテルを加えた。組織サンプルを摩砕し、回転冷却した。上澄を回収した。全てのサンプルが回収されるまで、培地および組織抽出物を−７０℃で保存した。上述の固相サンドイッチイムノアッセイを使用して、培地中および組織抽出物のＩＦＮレベルを同一日に決定した。測定されたＩＦＮ濃度と、培地の体積および培養の生体重をそれぞれ乗じることによって、培地中および組織中の培養ＩＦＮ総量を算出した。図２は、１２日と比較した、１４日、１７日、および１９日における相対的ＩＦＮレベルを示す図である。７日および１０日における培地ＩＦＮレベルは、イムノアッセイ用広範囲プロトコールの範囲未満であった。
【００９３】
［実施例３］
上述の方法を使用して、表１に記載の発現構築物で形質転換されたウキクサ系を作成した。これらの形質転換されたウキクサ系を、独立栄養条件で１４日間成長させた。成長培地には、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度のウシ血清アルブミンが含まれていた。１４日に、実施例１に記載の通りに、培地抽出物および組織抽出物を作製し、上述の固相サンドイッチイムノアッセイを使用して、これらの抽出物中のインターフェロンレベルを決定した。表２に、分析したクローンウキクサ系の数、および各発現構築物の、平均インターフェロン濃度を示す。表３に、シグナルペプチドを含有しないインターフェロン発現構築物（ＩＦＮ０１、ＩＦＮ１０、およびＩＦＮ１２）で形質転換されたウキクサ系の、ウキクサ組織内のインターフェロンレベルを示す。明示した構築物ごとに、分析した全てクローン系における平均インターフェロンレベル、および最高の発現系に関するインターフェロンレベルの両者を示す。
【００９４】
【表２】
【表３】
これらの形質転換されたウキクサ系で産生されるインターフェロンの生物学的活性を、上述の細胞変性効果阻害アッセイで分析した。表４に、最高の発現系の結果を、構築物ごとに示す。シグナルペプチドを含有する構築物の場合には培地について、シグナルペプチドを欠く構築物の場合には組織について、インターフェロン活性を示す。
【００９７】
【表４】
この実施例におけるデータについて、以下の特徴を挙げることができる。（１）インターフェロンの分泌は、シグナルペプチドを含有する発現構築物で形質転換されたウキクサ系の場合に限って検出された。例えば、ＩＦＮ０２、ＩＦＮ０３、ＩＦＮ０５、ＩＦＮ０７、ＩＦＮ０８、ＩＦＮ０９およびＩＦＮ０１１の培地インターフェロン濃度を、ＩＦＮ０１、ＩＦＮＩＯ、およびＩＦＮ１２のそれと比較されたい。（２）最高レベルのインターフェロン分泌をもたらす自然のヒトインターフェロンシグナル配列を含むシグナルペプチドを含有する全ての発現構築物で、インターフェロンの分泌が検出された。例えば、ＩＦＮ０２で産生されるインターフェロンレベルを、ＩＦＮ０３およびＩＦＮ０５で産生されるものと比較されたい。（３）ウキクサ優先コドンの使用は、インターフェロン発現増強につながる。例えば、ＩＦＮ０９で産生されるインターフェロンレベルを、ＩＦＮ０５で産生されるものと比較されたい。（４）シグナルペプチド以上のコドン最適化によって、より高い発現レベルが達成された。例えば、ＩＦＮ０８をＩＦＮ０９と比較されたい。（５）トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼイントロン配列が発現構築物に含まれることにより、より高いレベルのインターフェロン発現が得られた。例えば、ＩＦＮ０９をＩＦＮ１１と、ＩＦＮ１０をＩＦＮ１２と比較されたい。（６）野生型α−アミラーゼシグナルペプチドを含有する構築物（ＩＦＮ０７）と比較して、修飾されたα−アミラーゼシグナルペプチド（ＩＦＮ０５）を含有する構築物から発現されるインターフェロンレベルとの間で、統計学的な有意差は認められなかった。
【００９９】
本明細書に記載の全ての出版物および特許出願は、本発明に関連する当業者の水準を表す。各出版物または特許出願が引用することにより本明細書の一部をなすものとすると具体的且つ個々に指示された場合と同程度に、全ての出版物および特許出願を、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１００】
理解を明確にするために、説明するのに役立つ例および実施例として、上述の発明を詳細に説明してきたが、添付のクレームの範囲内で、ある一定の変更および修飾を実行できることが明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
実施例１に記載の、形質転換されたウキクサ培養の培地中および組織中のインターフェロンレベル（固相サンドイッチイムノアッセイで決定した）を示す図である。
【図２】
実施例２に記載の、形質転換されたウキクサ培養の培地中および組織中のインターフェロンレベル（固相サンドイッチイムノアッセイで決定した）を示す図である。
Claims (34)
- （ａ）ウキクサ培地内で、ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体を培養するステップであって、前記ウキクサ植物培養体または前記ウキクサノジュール培養体が、生物学的に活性な組換えポリペプチドを発現するように安定に形質転換されており、前記生物学的に活性な組換えポリペプチドが、該ポリペプチドに関するコード配列と、培地中への該ポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチドに関する作動可能に連結されたコード配列とを含むヌクレオチド配列から発現されることを特徴とするステップと、
（ｂ）前記生物学的に活性なポリペプチドを前記ウキクサ培地から回収するステップと
を含む、ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体において、生物学的に活性な組換えポリペプチドを産生する方法。 - 前記生物学的に活性な組換えポリペプチドが前記ウキクサ培地に分泌される、請求項１に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列が、
（ａ）前記ポリペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、
（ｂ）前記シグナルペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、
（ｃ）植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列に隣接する翻訳開始コドンと、
（ｄ）前記コード配列の上流に挿入された植物イントロンを含む、作動可能に連結されたヌクレオチド配列と
からなる群から選択される少なくとも一つの特性を有する、請求項１に記載の方法。 - 前記ウキクサ優先コドンがＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドン類またはＬｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ優先コドン類である、請求項３に記載の方法。
- 前記ポリペプチドに関するコード配列と前記シグナルペプチドに関するコード配列から選択される少なくとも一つのコード配列とが、７０〜１００％のＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドン類またはＬｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ優先コドン類を含む、請求項４に記載の方法。
- 前記植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列「ＡＣＣ」または「ＡＣＡ」からなり、前記コンテクストが前記翻訳開始コドンの５’末端のすぐ隣に配置されている、請求項３に記載の方法。
- 前記作動可能に連結された前記植物イントロンを含むヌクレオチド配列が配列番号１に記載の配列である、請求項３に記載の方法。
- （ａ）ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体を培養するステップであって、前記ウキクサ植物培養体または前記ウキクサノジュール培養体が、生物学的に活性な組換えポリペプチドを発現するように安定に形質転換されており、前記生物学的に活性な組換えポリペプチドがウキクサにおける発現強化のために修飾されているヌクレオチド配列によってコードされていることを特徴とするステップと、
（ｂ）前記生物学的に活性なポリペプチドを前記ウキクサ植物培養体または前記ウキクサノジュール培養体から回収するステップと
を含む、生物学的に活性な組換えポリペプチドを産生する方法。 - ウキクサにおける発現増強のために修飾されている前記ヌクレオチド配列が、
（ａ）前記生物学的に活性な組換えポリペプチドに関するコード配列におけるウキクサ優先コドンと、
（ｂ）植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列に隣接する翻訳開始コドンと、
（ｃ）コード配列の上流に挿入された植物イントロンを含む作動可能に連結されたヌクレオチド配列と
から選択される少なくとも一つの特性を有する、請求項８に記載の方法。 - 前記ウキクサ優先コドンがＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドン類またはＬｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ優先コドン類である、請求項９に記載の方法。
- 前記コード配列が、７０％〜１００％のＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａ優先コドン類またはＬｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ優先コドン類を含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記植物優先翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列「ＡＣＣ」または「ＡＣＡ」からなり、前記コンテクストが前記翻訳開始コドンの５’末端のすぐ隣に配置されている、請求項９に記載の方法。
- 前記植物イントロンを含む前記作動可能に連結されたヌクレオチド配列が、配列番号１に記載の配列である、請求項９に記載の方法。
- 前記ウキクサ葉状体培養体またはウキクサノジュール培養体が、生物学的に活性な多量体タンパク質サブユニットの全てを発現して構築する、請求項１に記載の方法。
- 前記生物学的に活性な多量体タンパク質が、コラーゲン、ヘモグロビン、Ｐ４５０オキシダーゼ、およびモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
- 前記生物学的に活性な組換えポリペプチドが哺乳類ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
- 前記哺乳類ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項１６に記載の方法。
- 前記哺乳類ポリペプチドが、インスリン、成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、β−グルコセレブロシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、網膜芽腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンギオスタチン、レプチン、モノクローナル抗体類、サイトカイン類、受容体類、ヒトワクチン類、動物ワクチン類、植物ポリペプチド類、および血清アルブミンからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
- 前記生物学的に活性な組換えポリペプチドが、α−２ｂ−インターフェロンである、請求項１に記載の方法。
- 前記α−２ｂ−インターフェロンがヒトα−２ｂ−インターフェロンである、請求項１に記載の方法。
- 前記ヒトα−２ｂ−インターフェロンが、配列番号４または配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の方法。
- 前記生物学的に活性な組換えポリペプチドが、α−２ｂ−インターフェロンの生物学的に活性な変異形であり、前記生物学的に活性な変異形が、配列番号４または配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記生物学的に活性な組換えポリペプチドが酵素である、請求項１に記載の方法。
- 前記シグナルペプチド配列が、
（ａ）ヒトα−２ｂ−インターフェロンシグナルペプチドと
（ｂ）シロイヌナズナ・キチナーゼシグナルペプチドと、
（ｃ）コメα−アミラーゼシグナルペプチドと、
（ｄ）修飾されたコメα−アミラーゼペプチドと、
（ｅ）ウキクサシグナルペプチドと、
（ｆ）生物学的に活性な組換えポリペプチドに本来備わっているシグナルペプチドと
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。 - 前記シグナルペプチドが配列番号３に記載の配列を有するコメα−アミラーゼシグナルペプチドである、請求項２４に記載の方法。
- 請求項１に記載の、安定に形質転換されたウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体。
- 前記ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体が、Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ属、Ｗｏｌｆｆｉａ属、Ｗｏｌｆｉｅｌｌａ属、およびＬｅｍｎａ属からなる群から選択される、請求項２６に記載の安定に形質転換されたウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体。
- 前記ウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体が、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｉｓｃｕｌａ、Ｌｅｍｎａ ａｅｑｕｉｎｏｃｔｉａｌｉｓ、およびＬｅｍｎａ ｇｉｂｂａからなる群から選択される、請求項２７に記載の安定に形質転換されたウキクサ植物培養体またはウキクサノジュール培養体。
- （ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列の生物学的に活性な変異形のアミノ酸配列であって、該生物学的に活性な変異形が、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号５に示すアミノ酸配列の生物学的に活性な変異形のアミノ酸配列であって、該生物学的に活性な変異形が、配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と
からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ヌクレオチド配列がウキクサ優先コドン類を含むことを特徴とする核酸分子。 - 前記ヌクレオチド配列が、配列番号２に記載のヌクレオチド配列である、請求項２９に記載の核酸分子。
- （ａ）配列番号６に記載のコメα−アミラーゼシグナルペプチドアミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号７に記載の修飾されたコメアミラーゼシグナルペプチドアミノ酸配列と
からなる群から選択されるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ヌクレオチド配列がウキクサ優先コドンであることを特徴とする核酸分子。 - 前記ヌクレオチド配列が、配列番号３に記載のヌクレオチド配列である、請求項３１に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含み、且つ配列番号３に示すシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、配列番号５に記載の前記ヌクレオチド配列と配列番号３に記載の前記シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とが作動可能に連結されている請求項２９に記載の核酸分子。
- 配列番号１に示すイントロンを含むヌクレオチド配列をさらに含み、該イントロンを含むヌクレオチド配列と、前記シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と、前記成熟ヒトα−２ｂ−インターフェロンをコードするヌクレオチド配列とが作動可能に連結されている請求項３３に記載の核酸分子。
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