CN103609304B - 一种快速提高浮萍淀粉含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水生能源植物培养领域，提供一种利用植物生长调节剂快速提高浮萍淀粉含量的方法，该方法的步骤为：将浮萍种在水体中，然后向生长在水体中的浮萍表面喷洒烯效唑溶液或者多效唑溶液，喷洒所述烯效唑溶液或者多效唑溶液后让浮萍继续生长7～10天收获，即可获得高淀粉含量的浮萍。该方法不受水体条件的限制，无论是在富营养的水体还是寡营养条的水体中，均能大幅度提高浮萍的淀粉含量。
Description
技术领域
本发明属于水生能源植物培养领域，特别涉及一种利用植物生长调节剂快速提高浮萍淀粉含量的方法。
背景技术
化石能源日益匮乏和全球变暖现象日趋严重，许多国家都在积极开发石油替代能源。生物液体燃料是目前唯一适合于现有发动机系统的石油替代能源，其中以燃料乙醇的使用规模最为广泛，但燃料乙醇的生产成本过高，为了降低其生产成本，就需要寻找廉价、可持续的植物材料作为生产原料，水生能源植物以其非粮属性、不占用耕地的优势，成为了理想原料之一。
水生能源植物浮萍(Duckweed)，是世界上最小、最简单的开花植物，也是生长最快的多细胞植物。除最寒冷的地区外，在全球几乎都有分布。其利用废水生长并产生高品质生物质原料的特性，以及将污染治理与生物能源有机结合的优势，正为科学家们所重视。在最佳的营养供给、光照和水温条件下，浮萍在16～48小时内其生物量可以翻倍。在理想的生长环境中养殖浮萍并按科学规律收获，每年的干物质产量可达10～30吨/公顷。
目前利用浮萍生产乙醇的工艺已较为成熟，限制浮萍发酵所得乙醇浓度进一步提高的主要因素是浮萍的淀粉含量，因此大规模培养出高淀粉含量的浮萍对其应用具有重要意义。目前培养高淀粉含量浮萍的方法主要为：在寡营养，即N,P浓度均低于0.1ppm条件下培养浮萍8天(Xu J.,Cui W.,Cheng J.J.,Stomp A.M.Production of high-starch duckweed and itsconversion to bioethanol.Biosystems Engineering.2011,110(2):67-72.)，该方法可使浮萍淀粉含量达到29.8％。但此方法存在以下不足：(1)对水质营养条件要求较高，要求水体中N,P浓度低于0.1ppm，N,P含量较高时浮萍无法积累到高含量的淀粉，随着水体污染日益加重，自然水中的N或P很难达到如此低的水平，因此该方法的适用性不强；(2)该方法虽然能够增加浮萍的淀粉含量，但由于限制了浮萍生长必须的营养条件，从而会限制浮萍生物量的增长。
发明内容
本发明的目的是针对目前培养高淀粉含量浮萍对水体营养条件要求高的不足，提供一种快速提高浮萍淀粉含量的方法，该方法不受水体营养条件的限制，能快速提高浮萍淀粉含量，有利于实现高淀粉含量浮萍的大规模培养。
本发明所述快速提高浮萍淀粉含量的方法，步骤如下：将浮萍种在水体中，然后向生长在水体中的浮萍表面均匀喷洒烯效唑溶液或者多效唑溶液，喷洒所述烯效唑溶液或者多效唑溶液后让浮萍继续生长7～10天收获，即可获得高淀粉含量的浮萍。
上述方法中，所述烯效唑溶液或者多效唑溶液中烯效唑或者多效唑的浓度为100～1000mg/L，所述烯效唑溶液或者多效唑溶液的喷洒量为每平方米浮萍150～300mL。
上述方法中，所述烯效唑溶液或者多效唑溶液中烯效唑或者多效唑的浓度优选为500～1000mg/L。
上述方法中，所述烯效唑溶液是将烯效唑或者烯效唑的可湿性粉剂溶解在溶剂中得到；以烯效唑为溶质时，先将烯效唑溶解于甲醇中，再用水稀释至应用浓度；以烯效唑的可湿性粉剂为溶质时，直接用水将其溶解并稀释至应用浓度。
上述方法中，所述多效唑溶液是将多效唑或者多效唑的可湿性粉剂溶解在溶剂中得到；以多效唑为溶质时，先将多效唑溶解于甲醇中，再用水稀释至应用浓度；以多效唑的可湿性粉剂为溶质时，直接用水将其溶解并稀释至应用浓度。
上述方法中，配制烯效唑或者多效唑溶液所使用的水为蒸馏水、去离子水或者自来水。
上述方法中，为了缩短浮萍的培养时间，最好是将浮萍种在水体中后立即向浮萍表面喷洒烯效唑溶液或者多效唑溶液，喷洒所述烯效唑溶液或者多效唑溶液后，浮萍中的淀粉含量随培养时间的增加而增加，但生长10天后，浮萍中淀粉含量的增加变得缓慢，为了节约时间成本，在喷洒所述烯效唑溶液或者多效唑溶液后让浮萍继续生长7～10天，即可收获浮萍。
上述方法中，最好按照80～100％的覆盖率将浮萍种在水体中。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种快速提高浮萍淀粉含量的新方法，该方法不受水体条件的限制，无论是在富营养的水体还是寡营养条件的水体中，均能大幅度提高浮萍的淀粉含量。
2、本发明所述方法在浮萍表面喷洒烯效唑溶液或者多效唑溶液后继续培养7～10天，生长于寡营养条件下的浮萍淀粉含量高达40wt％以上，而且浮萍干物质积累量也有所增加，生长于富营养条件下的浮萍淀粉含量能达到18～48wt％。
3、本发明所述方法不受水体条件的限制，尤其适合在受到污染的水体中大规模培养高淀粉含量的浮萍，这一方面可降低生产成本，另一方面可得到高淀粉含量的浮萍，同时浮萍直接利用废水中的N、P，可净化水体。
附图说明
图1为实施例4所述浮萍在喷洒烯效唑溶液后淀粉含量随培养时间的变化图。
图2为对比例2所述浮萍在喷洒甲醇溶液后淀粉含量随培养时间的变化图。
图3为对比例4所述喷洒不同浓度矮壮素对浮萍淀粉积累的影响图。
具体实施方式
下面通过实施例及对比例并结合附图对本发明所述快速提高浮萍淀粉含量的方法作进一步说明。
下述各实施例中，浮萍鲜重的测定方法可参见Alicja Piotrowska,Andrzej Bajguz et al.Jasmonic acid as modulator of lead toxicity in aquatic plant Wolffia arrhiza(Lemnaceae).Environmental and Experimental Botany 66(2009)507-513，具体为：将培养一定时间的浮萍取出，用蒸馏水清洗3遍，然后在滤纸上放置5分钟，称重。
浮萍干重的测定方法：将培养一定时间的浮萍取出，用蒸馏水清洗3遍，然后在滤纸上放置5分钟，然后在60℃的烘箱中干燥至恒重，称重。
浮萍淀粉含量的测定方法可参见Zhang L.,Chen Q.,Jin Y.,et al.Energy-saving directethanol production from viscosity reduction mash of sweet potato at very high gravity(VHG).FuelProcessing Technology.2010,91(12):1845-1850。具体测定方法为：将干燥的浮萍粉碎成粉末，称取0.03～0.06g浮萍干粉置于250mL磨口锥形瓶中，加入30mL 6mol/L的HCl溶液和100mL蒸馏水，装上冷凝管，置沸水浴中回流2h。回流完毕，立即用流动水冷却，待浮萍样品水解液冷却至室温后，加入NaOH调节水解液的pH值为7。然后加入20mL 20wt％醋酸铅溶液，摇匀后放置10min，转移至500mL容量瓶中，加蒸馏水定容至500mL，过滤，弃去初滤液，收集5mL滤液过预活化好的反相C18固相萃取小柱，弃去最初的1～2mL，收集后面的3～4mL，再用0.22μm的水系滤膜过滤。利用HPLC测定滤液中葡萄糖含量，根据淀粉含量＝葡萄糖含量/1.1，计算浮萍中的淀粉含量。
下述各实施例中，各种溶液的配制方法如下：
Hoagland培养液的配制方法如下：(1)用蒸馏水按照下表所述的母液配方中各试剂的浓度配制A、B、C、D、E、F六种母液，其中，配制母液A时，先用6N的HCl溶液将Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4溶解，然后加入蒸馏水配制成目标浓度；配制母液D时，先用6N的KOH溶液将EDTA溶解，然后加入蒸馏水配制成目标浓度。(2)按照下表所述的每升Hoagland培养液中各种母液的添加量用蒸馏水配制Hoagland培养液，通过HCl及NaOH调整Hoagland培养液的pH值为6.5。所配制的Hoagland培养液中，N元素的浓度为349.73mg/L，P元素的浓度为154.89mg/L。
1/6浓度Hoagland培养液的配制方法：将一定量的Hoagland培养液与5倍于其体积的蒸馏水混合均匀，即得。
将分析纯的烯效唑或多效唑(由Sigma公司生产)用甲醇溶解，使其浓度为应用浓度的10倍，然后用蒸馏水稀释10倍，使烯效唑或多效唑的终浓度为100～1000mg/L，同时甲醇的终浓度为10％(体积：体积)；将15％的多效唑可湿性粉剂(由成都丰田农业有限公司生产)溶解于蒸馏水中，使多效唑的终浓度为100～1000mg/L。
将矮壮素(由Sigma公司生产)溶解于蒸馏水中，使矮壮素的浓度为1～1000mg/L。
下述各实施例及对比例中，所采用的浮萍均为少根紫萍xj3，采集自中国四川省成都市新津县乌龙村。
实施例1：喷洒烯效唑在蒸馏水中培养浮萍(寡营养条件)
在表面积为0.1m2的培养容器中加入5L蒸馏水，取初始淀粉含量为3.59wt％、初始生物量以干重计为16g/m2的鲜浮萍20g转入所述培养容器中(覆盖率约为100％)，然后立即向浮萍表面均匀喷洒30mL浓度为800mg/L的烯效唑溶液(以分析纯的烯效唑配制)，喷洒完毕后，在光周期为16h、暗周期为8h的条件下培养7天，其中，光周期的培养温度为26℃、光照强度为7000Lx，暗周期培养温度为16℃。培养时间届满后，取浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，然后用在滤纸上放置5分钟，继后将鲜浮萍放在60℃的烘箱中干燥至恒重，再将浮萍粉碎成粉末，用HPLC测定葡萄糖含量，并计算淀粉含量，结果显示：浮萍淀粉含量为46.45wt％，生物量以干重计为49.8g/m2。
实施例2：喷洒多效唑在蒸馏水中培养浮萍(寡营养条件)
本实施例所采用的浮萍、实验条件及操作同实施例1，不同之处是向浮萍表面均匀喷洒30mL浓度为800mg/L的多效唑溶液(以分析纯的多效唑配制)。结果显示：浮萍淀粉含量为41.01wt％，生物量以干重计为49.4g/m2。
实施例3：喷洒多效唑在蒸馏水中培养浮萍(寡营养条件)
本实施例所采用的浮萍、实验条件及操作同实施例1，不同之处是向浮萍表面均匀喷洒30mL浓度为800mg/L的多效唑溶液(以15％的多效唑可湿性粉剂配制)。结果显示：浮萍淀粉含量为46.13wt％，生物量以干重计为53.4g/m2。
对比例1：在蒸馏水中培养浮萍(寡营养条件)
在表面积为0.1m2的培养容器中加入5L蒸馏水，取初始淀粉含量为3.59wt％、初始生物量以干重计为16g/m2的鲜浮萍20g转入所述培养容器中(覆盖率约为100％)，然后立即向浮萍表面均匀喷洒30mL10vol％的甲醇溶液，喷洒完毕后，在光周期为16h、暗周期为8h的条件下培养7天，其中，光周期的培养温度为26℃、光照强度为7000Lx，暗周期培养温度为16℃。培养时间届满后，取浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，然后用在滤纸上放置5分钟，继后将鲜浮萍放在60℃的烘箱中干燥至恒重，再将浮萍粉碎成粉末，用HPLC测定葡萄糖含量，并计算淀粉含量，结果显示：浮萍淀粉含量为23.29wt％，生物量以干重计为43g/m2。
由实施例1、2、3以及对比例1可知，在寡营养(N,P元素的浓度均低于0.1mg/L)条件下，喷洒烯效唑溶液或者多效唑溶液并培养7天，浮萍淀粉含量能达到41.01wt％～46.45wt％，较对比例1有显著提高，并且喷洒烯效唑溶液或者多效唑溶液后，浮萍的生物量较对比例1也有所提高。
实施例4：喷洒烯效唑在1/6浓度Hoagland培养液中培养浮萍(相对富营养条件)
在表面积为0.033m2的培养容器中加入1L的1/6浓度Hoagland培养液，取初始淀粉含量为3.16wt％、初始生物量以干重计为16g/m2的鲜浮萍6g转入所述培养容器中(覆盖率约为100％)，然后立即向浮萍表面均匀喷洒5mL浓度为800mg/L的烯效唑溶液(以分析纯的烯效唑配制)，喷洒完毕后，在光周期为16h、暗周期为8h的条件下培养，其中，光周期的培养温度为26℃、光照强度为10000Lx，暗周期培养温度为16℃。分别在喷洒烯效唑溶液后的第0天、第1天、第2天、第3天、第5天、第7天以及第8天取浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，然后用在滤纸上放置5分钟，继后将鲜浮萍放在60℃的烘箱中干燥至恒重，再将浮萍粉碎成粉末，用HPLC测定葡萄糖含量，并计算淀粉含量，结果如图1所示。
对比例2：在1/6浓度Hoagland培养液中培养浮萍(相对富营养条件)
在表面积为0.033m2的培养容器中加入1L的1/6浓度Hoagland培养液，取初始淀粉含量为3.16wt％、初始生物量以干重计为16g/m2的鲜浮萍6g转入所述培养容器中(覆盖率约为100％)，然后立即向浮萍表面均匀喷洒5mL 10vol％的甲醇溶液，喷洒完毕后，在光周期为16h、暗周期为8h的条件下培养，其中，光周期的培养温度为26℃、光照强度为10000Lx，暗周期培养温度为16℃。分别在喷洒甲醇溶液后的第0天、第1天、第2天、第3天、第5天、第7天以及第8天取浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，然后用在滤纸上放置5分钟，继后将鲜浮萍放在60℃的烘箱中干燥至恒重，再将浮萍粉碎成粉末，用HPLC测定葡萄糖含量，并计算淀粉含量，结果如图2所示。
由实施例4以及对比例2可知，在1/6浓度Hoagland培养液中，喷洒800mg/L的烯效唑溶液后的8天中，浮萍的淀粉含量一直呈增加的趋势，到第8天，由初始的3.16wt％增加到了36.40wt％；对照实验喷洒10vol％的甲醇溶液后的第2天开始，浮萍的淀粉含量变化不大，到第8天，浮萍的淀粉含量仍然低于10wt％。说明在相对富营养条件下，烯效唑可以有效地促进浮萍淀粉积累。
实施例5：喷洒烯效唑在Hoagland培养液中培养浮萍(富营养条件)
在表面积为0.1m2的培养容器中加入5L的Hoagland培养液，取初始淀粉含量为3.59wt％、初始生物量以干重计为16g/m2的鲜浮萍20g转入所述培养容器中(覆盖率约为100％)，然后立即向浮萍表面均匀喷洒30mL浓度为800mg/L的烯效唑溶液(以分析纯的烯效唑配制)，喷洒完毕后，在光周期为16h、暗周期为8h的条件下培养7天，其中，光周期的培养温度为26℃、光照强度为7000Lx，暗周期培养温度为16℃。培养时间届满后，取浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，然后用在滤纸上放置5分钟，继后将鲜浮萍放在60℃的烘箱中干燥至恒重，再将浮萍粉碎成粉末，用HPLC测定葡萄糖含量，并计算淀粉含量，结果显示：浮萍淀粉含量为35.37wt％，生物量以干重计为51.2g/m2。
实施例6：喷洒多效唑在Hoagland培养液中培养浮萍(富营养条件)
本实施例所采用的浮萍、实验条件及操作同实施例5，不同之处是向浮萍表面均匀喷洒30mL浓度为800mg/L的多效唑溶液(以分析纯的多效唑配制)。结果显示：浮萍淀粉含量为31.41wt％，生物量以干重计为50.4g/m2。
实施例7：喷洒多效唑在Hoagland培养液中培养浮萍(富营养条件)
本实施例所采用的浮萍、实验条件及操作同实施例5，不同之处是向浮萍表面均匀喷洒30mL浓度为800mg/L的多效唑溶液(以15％的多效唑可湿性粉剂配制)。结果显示：浮萍淀粉含量为37.24wt％，生物量以干重计为53.2g/m2。
对比例3：在Hoagland培养液中培养浮萍(富营养条件)
在表面积为0.1m2的培养容器中加入5L的Hoagland培养液，取初始淀粉含量为3.59wt％、初始生物量以干重计为16g/m2的鲜浮萍20g转入所述培养容器中(覆盖率约为100％)，然后立即向浮萍表面均匀喷洒30mL10vol％的甲醇溶液，喷洒完毕后，在光周期为16h、暗周期为8h的条件下培养7天，其中，光周期的培养温度为26℃、光照强度为7000Lx，暗周期培养温度为16℃。培养时间届满后，取浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，然后用在滤纸上放置5分钟，继后将鲜浮萍放在60℃的烘箱中干燥至恒重，再将浮萍粉碎成粉末，用HPLC测定葡萄糖含量，并计算淀粉含量，结果显示：浮萍淀粉含量为3.99wt％，生物量以干重计为49.4g/m2。
由对比例3可知，在Hoagland培养液中生长7天，浮萍的淀粉含量几乎没有增加，而从实施例5、6、7可知，在喷洒烯效唑或者多效唑溶液后，在Hoagland培养液中生长7天浮萍的淀粉含量由最初的3.59wt％增加到30wt％以上。说明在富营养条件下，喷洒烯效唑溶液或者多效唑溶液能够促进浮萍积累淀粉。
实施例8：喷洒烯效唑在Hoagland培养液中培养浮萍(富营养条件)
本实施例所采用的浮萍、实验条件及操作同实施例5，不同之处是向浮萍表面均匀喷洒烯效唑溶液后，继续培养10天。结果显示：浮萍淀粉含量为48.02wt％，生物量以干重计为52.64g/m2。
实施例9：喷洒烯效唑在Hoagland培养液中培养浮萍(室外富营养条件)
在表面积为0.033m2的培养容器中加入1L的Hoagland培养液，取初始淀粉含量为3.59wt％、初始生物量以干重计为16g/m2的鲜浮萍6g转入所述培养容器中(覆盖率约为100％)，然后立即向浮萍表面均匀喷洒5mL浓度为1000mg/L的烯效唑溶液(以分析纯的烯效唑配制)，喷洒完毕后，置于室外培养7天，室外培养时，白天的温度为22～30℃，正午的光照强度为25400～29100Lx，晚上的温度为13～17℃。培养时间届满后，取浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，然后用在滤纸上放置5分钟，继后将鲜浮萍放在60℃的烘箱中干燥至恒重，再将浮萍粉碎成粉末，用HPLC测定葡萄糖含量，并计算淀粉含量，结果显示：浮萍淀粉含量为24.76wt％。
实施例10：喷洒多效唑在Hoagland培养液中培养浮萍(室外富营养条件)
本实施例所采用的浮萍、实验条件及操作同实施例9，不同之处是向浮萍表面均匀喷洒5mL浓度为1000mg/L的多效唑溶液(以分析纯的多效唑配制)。结果显示：浮萍淀粉含量为23.93wt％。
实施例11：喷洒烯效唑在Hoagland培养液中培养浮萍(室外富营养条件)
本实施例所采用的浮萍、实验条件及操作同实施例9，不同之处是向浮萍表面均匀喷洒的为5mL浓度为500mg/L的烯效唑溶液(以分析纯的烯效唑配制)。结果显示：浮萍淀粉含量为21.82wt％。
实施例12：喷洒多效唑在Hoagland培养液中培养浮萍(室外富营养条件)
本实施例所采用的浮萍、实验条件及操作同实施例9，不同之处是向浮萍表面均匀喷洒5mL浓度为100mg/L的多效唑溶液(以分析纯的多效唑配制)。结果显示：浮萍淀粉含量为18.26wt％。
对比例4：喷洒矮壮素在Hoagland培养液中培养浮萍(室外富营养条件)
分别向6个表面积均为0.033m2的培养容器中加入1L的Hoagland培养液，取初始淀粉含量为3.59wt％、初始生物量以干重计为16g/m2的鲜浮萍6g转入所述培养容器中(覆盖率约为100％)，然后立即向上述6个培养容器中的浮萍表面分别均匀喷洒5mL浓度为0mg/L(即蒸馏水)、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L以及1000mg/L的矮壮素溶液，喷洒完毕后，置于室外培养7天，室外培养时，白天的温度为22～30℃，正午的光照强度为25400～29100Lx，晚上的温度为13～17℃。培养时间届满后，取浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，然后用在滤纸上放置5分钟，继后将鲜浮萍放在60℃的烘箱中干燥至恒重，再将浮萍粉碎成粉末，用HPLC测定葡萄糖含量，并计算淀粉含量，结果如图3所示，由图3可知，喷洒1～1000mg/L的矮壮素的浮萍对淀粉的积累量与喷洒蒸馏水的浮萍对淀粉的积累量相接近，6个培养容器中，浮萍淀粉含量均小于7wt％。
矮壮素与烯效唑和多效唑同属于植物生长调节剂，在农业上均有提高作物产量方面的应用，三者的作用机制均为抑制赤霉素的生物合成过程。但由实施例9、10、11、12以及对比例4可知，同样作为植物生长调节剂的矮壮素、烯效唑以及多效唑对提高浮萍淀粉含量的作用差距巨大，在同样的培养条件下，喷洒烯效唑及多效唑后培养7天，浮萍的淀粉含量可达到18.26～24.76wt％，而喷洒矮壮素后培养7天与喷洒蒸馏水后培养7天的效果相接近，浮萍淀粉含量均小于7wt％。
Claims (5)
1.一种快速提高浮萍淀粉含量的方法，其特征在于步骤如下：将浮萍种在水体中，然后向生长在水体中的浮萍表面均匀喷洒烯效唑溶液或者多效唑溶液，喷洒所述烯效唑溶液或者多效唑溶液后让浮萍继续生长7～10天收获，即可获得高淀粉含量的浮萍；
所述烯效唑溶液或者多效唑溶液中烯效唑或者多效唑的浓度为100～1000mg/L，所述烯效唑溶液或者多效唑溶液的喷洒量为每平方米浮萍150～300mL。
2.根据权利要求1所述快速提高浮萍淀粉含量的方法，其特征在于所述烯效唑溶液或者多效唑溶液中烯效唑或者多效唑的浓度为500～1000mg/L。
3.根据权利要求1或2所述快速提高浮萍淀粉含量的方法，其特征在于将浮萍种在水体中后立即向浮萍表面喷洒烯效唑溶液或者多效唑溶液。
4.根据权利要求1或2所述快速提高浮萍淀粉含量的方法，其特征在于按照80～100％的覆盖率将浮萍种在水体中。
5.根据权利要求3所述快速提高浮萍淀粉含量的方法，其特征在于按照80～100％的覆盖率将浮萍种在水体中。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US4501746A (en) * | 1981-12-18 | 1985-02-26 | Eli Lilly And Company | N,N-disubstituted carboxamide derivatives, and fungicidal use thereof |
| CN1451048A (zh) * | 2000-07-31 | 2003-10-22 | 比奥莱克斯公司 | 在浮萍中表达生物活性多肽 |
-
2013
- 2013-11-22 CN CN201310603781.9A patent/CN103609304B/zh active Active
Patent Citations (2)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103609304A (zh) | 2014-03-05 |
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